MXPA01002120A

MXPA01002120A - Polipeptidos y polinucleotidos de estafilococo negativo a coagulasa.

Info

Publication number: MXPA01002120A
Application number: MXPA01002120A
Authority: MX
Inventors: Magnus Hook
Original assignee: Trinity College Dublin
Priority date: 1998-08-31
Filing date: 1999-08-31
Publication date: 2003-03-27
Also published as: EP2330192A1; NO20010980D0; EP2311944A1; US20040141997A1; US20060171964A1; JP4714342B2; CA2341018C; KR100871330B1; EP1117772B1; US7709008B2; BR9913311A; US20040142348A1; AU772547B2; EP1117772A1; CN1317043A; AU5589099A; KR20010085744A; NO20010980L; US6635473B1; EP1117772A4

Abstract

Se proporcionan proteinas aisladas como SdrF, SdrG y SdrH y sus secuencias de aminoacido y acido nucleico correspondientes, las cuales son utiles en la prevencion y tratamiento de infeccion causada por bacterias estafilocoxicas negativas a coagulasa, tales como S. epidemidis. Las proteinas SdrF, SdrG y SdrH son proteinas asociadas a al pared celular que especificamente unen proteina huesped y cada una tiene un motivo altamente conservado del cual la secuencia de consenso es TYTFTDYVD. Las proteinas, sus porciones antigenicas y los anticuerpos anti-SdrF SdrG y SdrH tambien son utiles para la identificacion y diagnostico de infecciones estafilocoxicas negativas a coagulasa. En particular, las proteinas son ventajosas ya que pueden usadas como componentes de vacuna o anticuerpos de los mismos, y pueden ser administradas a heridas o usarse para cubrir biomateriales para actuar como agentes bloqueadores para prevenir o inhibir la union de estafilococo negativo a coagulasa a heridas o biomateriales.

Description

POLIPEPT DOS Y POLI NUCLEÓTIDOS DE ESTAFI LOCOCO NEGATIVO A COAGU LASA CAM PO DE LA I NVENCIÓ N La presente invención tiene que ver con los campos de microbiología y biolog ía molecular, y más particularmente con el campo de productos biológicos para la prevención , tratamiento o diagnóstico de infecciones por estafilococo negativo a coagulasa en el hombre y animales ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los estafilococos son células esféricas Gram-positivas, usualmente dispuestas en racimos irregulares como uvas. Algunas son miembros de la flora normal de la piel y membranas mucosas de seres humanos, otras ocasionan supuración , formación de abscesos, una variedad de infecciones biogénicas, y aún septicemia fatal . Los estafilococos patogénicos por lo general emolizan la sangre, coagulan el plasma y producen una variedad de enzimas extracelulares y toxinas. El tipo más común de envenenamiento por alimento es causado por una enterotoxina estafilocóxica estable al calor. El género de Staphylococcus tiene por lo menos 30 especies. Las tres especies principales de importancia cl ínica son : Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, y Staphylococcus saprophyticus. Staphylococcus aureus es positivo a coagulasa, que lo diferencia de las otras especies. S. aureus es un patógeno principal para seres humanos. Casi cada persona tiene algún tipo de infección por S. aureus durante su vida, variando en severidad de envenenamiento por alimentos o infecciones menores en ¡a piel a severas infecciones que ponen en riesgo la vida. Los estafilococos negativos a coagulasa son la flora humana normal que algunas veces ocasiona infección, por lo general asociada con dispositivos implantados, especialmente en pacientes muy jóvenes, de edad avanzada e inmunocomprometidos. Aproximadamente el 75% de las infecciones causadas por estafilococos negativos a coagulasa se deben a S. epidermidis. Las infecciones debidas a Staphylococcus warneri, Staphylococcus homi s, y otras especies so.n menos comunes. S. Saprop ylicus es-una causa relativamente común de infecciones dei tracto urinario en mujeres jóvenes. Los estafilococos produce catalasa, la cual los diferencia de los estreptococos. •Tanto Staphylococcus aureus como Staphylococcus epidermidis tienen una propensión característica para invadir la piel y, tejidos adyacentes en el sitio de dispositivos médicos protésicos, incluyendo catéteres intravasculares, derivaciones de fluido cerebroespinal, derivaciones de hemodiálisis, injertos vasculares y lentes de contacto de uso extendido. De 48 a 72 horas, número relativamente grandes de estafilococos son demostrables en el sitio de inserción de estos cuerpos extraños. (Archer, G.L., in Remington, J.S. y otros, Current Ciinical Topics in Infectious Diseases, McGraw-Hiil, NY, 25- V %? 46. 1986.) Staphylococcus epidermidis es un organismo comensal generalmente avirulento de la piel de ser humano, y es el agente etiológico principal de infecciones de catéteres venosos periféricos centrales, válvulas para el corazón protésicas, uniones artificiales y otros dispositivos protésicos. Se ha demostrado que las células de S. epidermidis se unen y proliferan sobre la superficie interna y externa de catéteres, sin considerar su composición, ya sea de base de poiietileno, cloruro de polivinilo, fluoruro de polivinilo o poliéster.

Las infecciones localizadas iniciales y dispositivos médicos residentes pueden conducir a infecciones invasivas más serias*, tales como septicemia, osteomielitis, y endocarditis. Los catéteres vasculares se cree que quedan infectados cuando iot microorganismos tiene acceso al dispositivo y, por lo tanto, la corriente sanguínea, a través de la migración desde la superficie de la pie! por debajo de la porción tranecutánea de! catéter En infecciones asociadas con dispositivos médicos, las superficies de plástico y metálicas quedan cubiertas con plasma de! huésped y proteínas de matriz tales como fibpnógeno, ditronectina y fibronectina justo después del implante. La bacteria por S. ep?dermidis puede resultar en una instancia en el hospital de un exceso de 8 días, lo cual absolutamente costoso. Aunque la virulencia estafilococos negativos a coagulasa se ve mejorada en presencia de un cuerpo extraño, los factores microbianos que permiten que esto~s comensales de ia piel normal * 4 sean patógenos nosocómicos no han sido bien caracterizados. La habilidad de ese punto epidermidis negativa a coagulasa para adherirse a estas proteínas es de importancia_crucia! para iniciar la infección. Ya que la adherencia se cree que es ei primer paso crítico en la patogénesis de infecciones por cuerpos extraños estafilocóxicas negativas a coagulasa, se debe poner atención en las propiedades de superficie de estos organismos que pueden mediar la adherencia a, y después la colonización de, materiales protésicos poliméricos. Un número de factores tiene influencia en la habilidad de! organismo para adherirse al material protésico. Estos incluyen características del microorganismos y el biomatepal, y 'a n,atura!e.za del ambiente circundante. La atracción Inicia! entre el organismo y ei huésped se ve influenciada por fuerzps no específicas tales co o la carga superficiaí, polaridad, fuerzas de Van der Waal e interacciones hidrofóbicas. La etapa crítica de ia adherencia involucra interacciones específicas eníre adhesings de superficie de célula y proteínas huésped inmovilizadas. Hasta la fecha, la investigación, con respecto a ia adherencia de s. epidermidis a biomateriales ha concernido por si misma principalmente con el papel de polisacárido extracelular o glicocalix, también conocida como limosa. Sin embargo, a pesar del intenso estudio, el papel propuesto de limosa en ia patogénesis de enfermedad o aún su composición permanece en debate. (Drewry y otros, Clin. Microbio! 28:1292-1296, 1990). En la actualidad, la limosa extracelular se cree que juega un papel importante en la últimas etapas de adherencia y persistencia de infección. Puede servir como una resina de intercambio de ion para optimizar un ambiente nutricional local, evitar ía penetración de antibióticos en la macrocolonia o proteger a la bacteria de células de defensa huéspedes fagocíticas. Peters y otros, han mostrado, a través de estudios de microscópico electrónico, que el polisacárido extracelular aparece en ¡as últimas etapas de unión y no está presente durante la fase inicial de adherencia. (J. infect. Dis, 65146:479-482, 1982) demostraron que ¡a remoción de la capa de limosa extraceluiar a través de lavados repetidos no disminuye la habilidad de S. epidermiais a adherirse a biomateriales. (J. Gen. Mi-crobiol. 129-2959-2968, 1983). De esta manera, el estudio de exopolisacárido ha producido poca prevención de adherencia inicia! por la bacteria. Vanos otros estudios han identificado otras adhesinas potenciales de S. epidermidis incluyendo la adhesina de polisacárido (PS/A) observada por Tojo y otros, (J. Infecí. Dis 157:713-722, 1998) y la limosa asociada con antígeno (SAA) de Christensen y otros, (¡nfecct. im un, 58:2906-2911, 1990). Se ha demosírado que PS/A es una mezcla compleja de adhesinas de momosacárido que bloquea la adherencia de cepas de producción de PS/A de S. epidermidis. En un modelo de anima! de anticuerpos de endocarditis dirigidos contra PS/A fueron protectivos. Sin embargo, no es evidente si esfe efecío proíector fue específico, relacionado con los efectos anti-adhesivos de anticuerpo o debido a ¥ un incremento más generalizado en la eficiencia de opsonofagocilosis de bacferias llevadas por la sangre Se ha hipotetizado que cada adhesina funciona en diferentes etapas del proceso de adherencia con una o más de estas adnesinas responsables de la atracción inicial, mientras que otras son necesarias para la agregación en ¡as macrocoionias. A pesar de muchos estudios, ¡os facto'res involucrados en la adherencia inicial de S. epidermidis a biomateriales permanece enormemente desconocidos. Otro desconocimiento es un método práctico para evitar la primera etapa de infección, adherencia o adhesión, por io tanto, existe una gran necesidad para el descubrimiento y caracterización de proteínas de adhesina íiacíepana y los genes que las codifican • Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar proteínas de unión a matriz extracelular asociadas con la pared de célula de estafilococos negativos a coagulasa. Es un objeto^ más de ía presente invención proporcionar proteínas de superficie estafilocóxicas negativas a coagulasa que son capaces de inhibir ia adhesión estafilocóxica a la mairiz extraceiular inmovilizada o células huésped presentes sobre la superficie de biomateriales implantados. Es un objeto más de la presente invención promocionar un vacuna de estafilococo negativo a coagulasa, para genera antisueros y anticuerpos para proteína estafilocóxicas negativas a coagulasa, y para aislar anticuerpos para estafilococo negativo a coagulasa.

Es un objeto más de la presente invención proporcionar materiales y métodos mejorados para detectar y diferenciar organismos estafilocóxicos negativos a coagulasa en determinaciones clínicas y de laboratorio. Es otro objeto más de la invención proporcionar sondas e iniciadores de ácido nucleico específicos para estafilococos negativos a coagulasa. Es otro objeto más de la invención proporcionar métodos para detectar, diagnosticar, tratar o verificar el progreso de terapia para infecciones bacterianas que son sensibles y específicas para estafilococos negativos a coagulasa. Esto y otros objetos, .características y ventajas de ¡a presente invención serán evidentes después de revisar la siguiente--descripción detallada de las modalidades descritas y reivindicaciones anexas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN . Se proporcionan proteínas aisladas de estafilococo negativos a coagulasa y sus secuencias de. aminoácido y ácido nucleico correspondientes. Las proteínas son designadas como SdrF, SdrG y SdrH. La secuencia de ADN de sdrF y de la secuencia de aminoácido de la proteína SdrF (en negritas) se muestran en ia figura 2 junto con sus secuencias de flanqueo. La secuencia de ADN de sdrG y la secuencia de aminoácido de ¡a proteína SdrG (en negritas) se muestran en la figura 3 junto con sus secuencias de flanqueo. Finalmente, la región de codificación de SdrH incluyendo ADN y la secuencia de aminoácido se muestra en la_figura 4. También se ha descubierto que en la región A de SdrF y SdrG existe una secuencia de aminoácido altamente conservada que_puede ser usada para derivar un motivo TYTFTDYVD de consenso. El motivo puede ser utilizado en vacunas de componentes múltiples para impartir inmunidad de alto espectro a infecciones bacterianas, y también se puede utilizar para producir anticuerpos monoclonales o policionaies que impartan inmunidad pasiva de amplío espectro. En una modalidad alternativa/ cualquier combinación deí motivo de ia secuencia variable derivado de la famiíia de proteína Sdr, (T) (Y) (!),< '(F) (T). (D/M) (Y) (V) (D), puede ser utilizada para impartir inmunidad o . para inducir anticuerpos protectores, Las proteínas, o sus porciones antigénicas, son utilizadas para producir anticuerpos para e! diagnóstico de infecciones bacterianas estafilocóxicas negativas a coagulasa o para el desarrollo de vacunas esíafilocóxicas negativas a coagulasa para inmunización activa o pasiva. Cuando se administra a una herida o se utiliza para cubrir biomateriales poliméricos in vitro o in vivo , tanto ¡a proteína como sus anticuerpos también son útiles como agentes bloqueadores para evitar e inhibir la unión del estafilococo negativo a coaguiasa al sito de herida o a cualquier biomateria!. Las proteínas SdrF, SdrG y SdrH además son útiles como herramientas de búsqueda científica para entender los mecanismos de la patología bacteriana y el desarrollo de terapias antibacterianas. La secuencia de gen sdrF, sdrG y sdrH son útiles como sondas de ácido nucleico para la detección e identificación de proteínas de superficie de célula estafilocóxica negativas a coaguiasa. Las secuencias de ácido nucleico también pueden ser insertadas en un vector y colocarse en un microorganismo para ¡as producción de proteínas SdrF, SdrG y SdrH recombinantes. Las secuencias de aminoácido de estas proteínas Sdr son útiles también, por ejemplo, en la producción de proteínas SdrF, SdrG y SdrH sintéticas o sus porciones, tales como motivos de aminoácido de consenso o de secuencia variable. Los antisueros y anticuerpos surgidos contra las proteínas SdrF, SdrG y SdrH o - sus 'porciones, tales como motivos de aminoácido de consenso o se secuencia vapable, y vacunas y otras composiciones farmacéuticas que contienen las proteínas, también se proporcionan en la presente. Además, los equipos de diagnóstico que contienen moléculas de ácido nucleico, las proteínas, anticuerpos o antisueros que surgen contra SdrF, SdrG y SdrH o sus porciones, taies como motivos de aminoácido de consenso o de secuencia variable, y ios reactivos apropiados para la reacción con una muestra también se proporcionan. En una primera modalidad de esta invención, el polinucleótido comprende una región de codificación de péptidos SdrF comprendiendo la secuencia establecida en la figura 2, o su variante *- ? 10 De acuerdo con este aspecto de la invención se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido maduro que se puede expresar por la sepa 9491 de Staphylococcus epídermidis. En una segunda modalidad de esta invención el polinucleótido comprende una región que codifica polipéptidos SdrG comprendiendo la secuencia establecida en la figura 3, o una variante de ía misma.

De acuerde con este aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido maduro que se puede expresar por la sepa K28 de Staphyiococcus eptdermidis. > • En una tercera modalidad de esta invención, el polinucleótido compfende una región que codifica polipépüdos SdrH comprendiendo la secuencia presentada en. 'a figura 4 o una vanante de la mi'ma De acuerdo con este aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polip-éptidc maduro que se puede expresar por la sepa 9491 de Staphylococcus epidermidis. En una cuarta modalidad de la invención, se proporciona una proteína novedosa de Staphylococcus epidermidis comprendiendo la secuencia de aminoácido SdrF como se muestra en la figura 2, o una variante de la misma. En una quinta modalidad de la invención, se proporciona una proteína novedosa de Staphylococcus epidermidis comprendiendo ia secuencia de aminoácido SdrG como se muestra en la figura 3, o una 9 S variante de la misma. En un sexta modalidad de la invención, se proporciona una proíeína novedosa de Staphylococcus epidermidis comprendiendo la secuencia de aminoácido SdrH como se muesíra en la figura 4 o una varianíe de la misma. De acuerdo con la cuaría, quinfa y sexfa modalidades de la invención, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican ías proíeínas SdrF, SdrG y SdrH, paríicularmenfe proteínas de Staphylococcus epidermidis, incluyendo ARNms, ADNcs, ADNs genómicos. Otras modalidades de este aspecto de la invención incluyen sus variantes biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles, y composiciones que ¡as comprenden. ••' En una séptima modalidad de ia invención, se proporciona eí Liso de un polinucleótido de la invención para propósitos profil cticos o terapéuticos, en particular inmunización genética. • , En una octava modalidad de la invención, esta son variantes -de! polipéptido SdrF, SdrG y SdrH o sus porciones, tales como motivos de aminoácido de consenso o de secuencia variable, codificados por alelos de existencia natural del gen sdrF, sdrG y sdrH. De acuerdo con esta modalidad de la invención, se proporcionan polipéptidos novedosos de Staphylococcus epidermidis denominados en la preseníe como SdrF, SdrG y SdrH o sus porciones, lales como moíivos de aminoácido de consenso o de secuencia variable, así como sus varianfes, biológica, diagnósfica, 5í- * «i -profiláctica, clínica y terapéuticamente útiles y composiciones que los comprenden. En una novena modalidad de la invención, se proporcionan métodos para producir poiipéptidos SdrF, SdrG y SdrH antes mencionados o sus porciones, tales como motivos de aminoácido de consenso o de secuencia variable. En una décima modalidad de la invención, se proporcionan anticuerpos contra los polipépíidos o poiinucleótidos SdrF, SdrG y SdrH o sus porciones, tales como motivos de aminoácido de consenso o de secuencia variable o los ácidos nucleicos que codifican dichos motivos. En una onceava modalidad de ia invención, se proporcionan pOlinucleótidos que, hibridizan a secuencias de poiinucleótidos SdrF, SdrG y SdrH o sus porciones, tales como motivos dc aminoácido de consenso o de secuencia variable, particularmente bajo condiciones severas. En una doceava modalidad de la invención, se proporcionan composiciones que comprenden un poíinucleótido SdrF, SdrG y SdrH o un polipépíido SdrF, SdrG o SdrH o sus porciones, taíes como motivos de aminoácido de consenso o de secuencia vapable, para administrarse a una célula o a un organismo multicelular. Varios cambios y modificaciones dentro del eepíriíu y alcance la invención serán fácilmeníe evidentes para aquellos expertos en la técnica después de leer las siguientes descripciones y de leer las otras parte de la presente descripción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una representación de la proteína SdrG de la sepa K28 de S. epidermidis. Las regiones están marcadas a lo largo de la parte superior de la construcción, con el número de aminoácido encontrado en cada región de ¡a proteína, descrito inmediaíamente abajo de la región correspondiente en el dibujo. La figura 2 es una secuencia de ADN de sdrF y ¡a secuencia de aminoácido de la proteína SdrF (en negritas) junto con sus secuencias de flanqueo. La figura 3 es una secuencia de ADN de sdrH y la secuencia de aminoácido de ¡a proteína SdrG (en negritas) junto con sus secuencias de flanqueo. La figura 4 es la secuencia de ,ADM de la región de codificación sdrH junto con la secuencia de aminoácido de la proteína SdrH. La figura 5 muestra tas relaciones entre las proteínas Sdr de S. iureus y S. epidermidis como sigue: la figura 5 A • es una representación esquemática de las proteínas Sdr de S aureus previamente descritas; la . figura 5 B es una representación esquemática de SdrF, SdrG y SdrH mostrando la posición y/o tamaño relativo de sus secuencias de señal (S), región As (A), repeticiones de región B (Bn), región de repetición SD (SD), región C(C)(SdrH solamenie), y regiones de extensión de pared/membrana (WM); y la figura 5 C representa ias secuencias de aminoácido C-terminai de SdrF, SdrG y SdrG mostrando las posiciones de las repeíiciones SD, moíivos LPXTG (subrayado), regiones de exíensión de membrana hidrofóbica (negrilas). y residuos terminales cargados.

La figura 6 ilustra la frecuencia de los genes sdr de cepas de S. epidermidis y muesíra tinciones Southern confendiendo ADN genómico de S. epidermidis que hibridiza a sondas ADN que codifican: (A) la región de repeíición SD ; (B) la región A de SdrH; (C) región A SdrG; y (D) la región As de SdrG y SdrF. Las cepas son como siguen; carril 1, ATCC174990; carril 2, KH11; carril 3, K28; carril 4, RP62a; carril 5, TU3298; carril 6, 9142; carril 7 1457; carril 8, 8400; carril 9, N910308; carril 10, N1910160; carril 11, N910102; carril 12, N910173; carril 13, N910191; carril 14, N910231; carril 15, - .950249. La sepa 9491 no se muesíre. Se muestran los marcadores. de tamaño de kilobases (kb) en la parte izquierda de Ios-paneles A- La figura 7 muestra las proteínas de región A de Sdr recombinante y el carácter específico de sus antisueros respecUvos según evidenciado por: (A) SDS-PAGE teñido con Coomassie de proteínas purificadas utilizadas para desarrollar anticuerpos policlonales de conejos. Los carriles 1 y 2, histidina-SdrFA y SdrGA etiquetados, respectivamenfe; carril 3, GST-SdrHA eíiqueíado: (B) panel izquierdo: reacfividad de aníisueros aníi-SdrFA, -SdrGA y -sdrHA combinados en iisafos de E. coli expresando GST-SdrFA eíiqueíado (carril 1), SdrGA (carril 2), y SdrHA (carril 3 . Paneles medio y derecho: reacíividad de aníisueros aníi-SdrFA y -SdrGA, respectivamente, para las mismas proteínas; y (C) pane! izquierdo: TW 15 Reactividad de anticuerpo monoclonai aníi-hisíidina a lisaíos de E. coli expresando hisíidina-SdrFA etiquetado (carril 1), SdrGA (carril 2) y SdrH longitud compleia (carril 3). Panel derecho: Reacíividad del aníisuero anli-SdrFA a ias mismas proleínas. Se muestran ios marcadores de íamaño de kilodaiíon (kDa) a la izquierda de los paneles A, B y C. La figura 8 iiuslra análisis de inmunoíinción de expresión de proteína Sdr de S. epidermidis, incluyendo: (A) Reactividad de antisuero anti-SdrFA a un lisato de S. epidermidis 9491. Carril 1, aníisuero inmune; carril 2, antisuero preinmune; y carril 3, antisuero inmune absorbido ccn SdrFA; (B) Reactividad de antisueros inmunes anli-SdrGA (carril 1); preinmunes (carril 2), 6 inmunes absorbidos can SdrGA (carril 3) a un lisato de la sepa K28 de S. epsríermidis, .y (C) Reactividad de antisueros inmune anti-SdrHA (carril 1) e inmune absorbido con SdrHA (carril 2) a un lisato de S. epidermidis 9491. -Los marcadores con tamaño kDa se muestran a !a izquierda de A, B y C. .. La figura 9 muestra el análisis genético de la variación de íamaño de proíeína de SdrH entre cepas de S. epidermidis, incluyendo: (A) Reactividad de aníisuero anti-SdrHA a diferentes lisatos de la sepa de S. epidermidis, los cuales revelan variaciones de sepa en la masa molecular de SdrH; carriles 1-3; cepas 9491, 8400, y KH11, respectivameníe; y (B) productos de PCR representando ADN que codifica las regiones de repefición SdrH SD (carriles 1-3) o la región Cs (carriles 4-6) de las misma cepas. Los < - ' 16 marcadores de famaño de kDa y kb se muestran a la izquierda de A y B, respectivamenfe. La figura 10 represenía el análisis de proíeínas Sdr en exfracios de pared ceiular y prolopiasíos, incluyendo: (A) Reaclividad del anlisuero aníi-SdrFA de iisatos de la sepa 9491 de S. epidermidis (carril 1), extracíos de pared celular (carril 2), y protoplastos purificados (carril 3); y (B) y (C) Reactividad de los antisueros anli-SdrGA y -SdrHa, respecíivamenfe, a las mismas mueslras. Los marcadores de lamaño kDa se mueslran a ia izquierda de A, B y C. •La figura 11 muestra la reactividad de IgG de pacientes convalecientes de infecciones por S. epidermidis a SdrFA recombinante (barras abiertas), SdrGA (barras en gris), y SdrHA (barras en negro) colocados co o cubiertas en una placa de microtituiación de ELISA. La IgG combinada de niños de 2 años de edad se ulilizó como un conírol comparaíivo. Las barras de error reflejan desviaciones estándares.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las proteínas de Sdr aisladas y sus secuencias de aminoácido y ácido nucleico correspondientes se describen en la presente. Las proteínas son designadas como SdrF, StírG y SdrH. La secuencia de ADN de sdrF y la secuencia de aminoácido de ia proteína SdrF (en negritas) se muestran en la figura 2 junio con sus secuencias de i i 17 flanqueo. La secuencia de ADN sdrG y la secuencia de aminoácido de la proíeína SdrG (en negriías) se mueslran en la figura 3 junto con sus secuencias de flanqueo. Finalmente, la región de codificación SdrH incluyendo ADN y la secuencia de aminoácido, se muesíra en la figura 4. Las proteínas SdrF, SdrG y SdrH están relacionadas con la secuencia primaria y organización esfrucíural para la familia de proteínas Sdr de unión a maíriz extracelular de Staphylococcus aureus y están localizadas sobre la superficie de célula. Las proteínas SdrF, SdrG y SdrH son proteínas asociadas con ¡a. pared céfular, como una secuencia de seria! en el término M y un motivo LPXTG, un dominio hidrofóbjco y residuos positivamente cargados en eí téfinino C. Cada una también íiene una repetición SD que contiene la región R de longitud suficiente para permitir ias expresión eficiente de la región A de dominio de unión de ligando sobre la superficie celular. Con la región A de las proteínas SdrF, SdrG y SdrH localizadas sobre la superficie celular, las proteínas puede interactuar con proteínas en el plasma, la maíriz extracelular o con moléculas sobre la superficie de células huésped. SdrG, por ejemplo, une la mitad N-terminai de la cadena beía de fibrinógeno. -Las proíeínas de unión de matriz extracelular descriías comparten una única región de repetición de dipépíido (región R), incluyendo predominaníemenle residuos de asparfato y serina. Esta repetición DS es codificada por 18 repeticiones de nucleóíido con el consenso GAY TCN GAY TCN GAY AGY, TCN siendo el primer y segundo codones de serina y AGY como el tercer codón de serina. La región R esíá cerca de el íérmino C de las proíeínas y típicamente contiene de entre 40 y 300 residuos de S, o más parlicularmeníe, mas de 60, 80, 100, 120, 150, 200 o 250 unidades de repetición, de 5 las cuales más del 90, 95 u aún 98% son los aminoácidos D o S. La repetición DS de la región R varía en longitud entre proteínas, y aunque la misma región R no une proteínas de maíriz exíracelular, ¡a región R permiíe la presenlación de las regiones de unión de la proteína sobre la superficie celular de S. aureus. De esta manera, 1Q ¡as sondas para el ADN de consenso que codifica la repelición de DS " ' (ver anteriormenle) pueden ser ulilizadas ¡deníificar otros genes que . '. codifican diferentes proteínas de unión S aureus a íejidos huésped.

. ? También se pueden utilizar, anticuerpos para una región R para ' ' 'fdentificar dichas proteínas de unión adicionales. 15 Se han descubierlo que en la región A de SdrF y SdrG existen una secuencia de aminoácido alfamente conservada que -puede ser usada para derivar un motivo TYTFTDYVD de consenso. Ei motivo puede ser utilizado en vacunas de componentes múlíiples para impariir inmunidad de amplio espectro a infecciones bacterianas, y 20 también puede ser uíilizado para producir anticuerpos monoclonales o policlonales que imparten inmunidad pasiva de amplio espectro. En una modalidad alíernaíiva, cualquier combinación del moíivo de secuencia variable derivado de ¡a familia de proíeína Sdr, (T) (Y; (T), (P) (T) (D/N) (Y) (V) (D), puede ser uíilizada para imparíir inmunidad 25 o para inducir aníícuerpos protectores. ?- 19 Se ha descubierío además que SdrG íiene un marco de lectura abierto de 2736 nucleótidos que codifican una proteína 913 residuos de aminoácido. La proteína liene una secuencia de señal de 30 aminoácidos, una región A de unión de ligando de 542 aminoácidos, y dos moíivos repelidos denominados como regiones B. B 1 es de 113 aminoácidos y B 2 es de 110 aminoácidos, y ia región R es de 77 aminoácidos. Las regiones B conliene moíivos manuales EF que significan la unión de Ca + + , y son similares a aquellos encontrados en otras proteínas de unión de Ca + * tales como calmodulina y troponina. Una forma más degenerada adicional del motivo manual EF se encontró en ia región A de SdrG entre los residuos 459--471. Una disminución importaníe en la unión de SdrG A a! fibrinógeno se observó en presencia de EDTA, demosírando una dependencia de ion metálico para la unión.

L Definiciones Los lérminos "proíeína SdrF", "proíeína SdrG" y "proleína SdrH' se definen en la preseníe e incluyen los subdominios de SdrG y SdrH, y fragmentos activos o aptigénicos de las proíeínas SdrF, SdrG y SdrH, lates como moíivos de aminoácido de consenso o secuencia variable. Como se utiliza en la preseníe "pg" significa picogramos, "ng" significa nanogramos, "ug" o "µg" significa microgramos, "mg" significa miligramos, "ul" o "µl" significa microlitros, "m!" significa mililitros, "I" significa litro.

"Fragmeníos acíivos" de las proíeínas SdrF, SdrG y SdrG se definen en la preseníe como péptidos o polipéptidos capaces de bloquear la unión de estafilococos negativos a coagulasa a proteínas huésped inmovilizadas solubles. El término "adhesina" como se utiliza en la présenle, incluye proteína y péptidos de existencia natural y sintéticos o recombinantes, los cuales pueden unirse a proíeínas de matriz extraceiular y/o mediar la adherencia a células huésped. El término "aminoácido" como se utiliza en la presente, incluye aminoácidos de existencia natural y sintéticos e incluye, pero no se limitan, alanina, valina, ieucina, isoleucina, prolina, fenilaianina, triptofano. metionma, glicina, serina, treonina, ciste*na<, - triosjna, a^paragina, glutamato. ácido aspártico, ácido gfuíámico, lisina, arginlna e histidina. Un "anticuerpo" es cualquier inmunoglobuíina, incluyendo anticuerpos y fragmentos de la misma que se une a un epítopo específico, El término, como se utiliza en la presente, incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, quimércos, de cadena individual, bi-específicos, simionizados y humanizados, así como fragmentos Fab, incluyendo los productos de una colección de expresión de inmunoglobulina Fab. La frase "molécula de anticuerpo" en sus varias formas gramaticales como se utiliza en ¡a presente, confempia lanío una molécula de inmunoglobulina inlacta, como una porción inmunológícamente activa de una molécula de Inmunoglobulina.

"Fragmentos antigénicos" de las proteínas SdrF, SdrG y SdrH se definen en la presente como péptidos y polipéptidos capaces de producir una respuesta ¡nmunológica. Como se uíiliza en ia presente, una proteína o péptido "equivalente antigénicamente funcional" es uno que incorpora un epítopo que es inmunológicamente reactivo cruzado con uno o más epitopos de las proteínas particulares descritas. Los equivalentes antigénicamente funcionales, o secuencias epitópicas, primero pueden ser designados o pronosticados y después probados, o simplemente pueden ser probados en forma directa para reactividad cruzada. Una "líneas de cékilas" es un clon de una célula primaria que es capaz de el crecimiento estable in vitro para muchas generaciones. Un "clon" es una pobiación de células derivada de una sola cé(ula ancestro común a íravés de miíosis. Una "secuencia de codificación" de ADN es una secuencia de ADN de estructura de cadena doble, la cua! es transcrita y traducida a un poíipéptido in vivo cuando se coloca bajo el conírol de secuencias reguladoras apropiadas. Los límiíes de las secuencias son determinados por un codón de inicio en el término 5' (amino) y un codón de detención de traducción en el término 3' (carboxilo). Una secuencia de codificación puede incluir, pero no se limiía a, secuencias eucarióíicas, ADNc de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genéticos de ADN eucarióticos ( por ejemplo, mamífero), y aún secuencias de ADN sintéticas. Una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de transcripción usuaimente serán localizadas 3' a la secuencia de codificación. La "molécula de ADN" se refiere a la forma polimérica de desoxirribonucleóíidos (adenina, guanina, timina o citosina) en su forma de estructura de cadena individual o una hélice de estrucíura de cadena doble. Este término se refiere solamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no la ¡imita a ninguna forma terciaria particular. De esta manera, este término incluye un ADN de estructura de cadena doble encontrado en, enlre otros, moléculas de ADN lineal (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. Para discutir la estructura de moléculas e' ADN de estructura de cadena doble paríitíulares, se pueden describir en ¡a presente secuencias de acuerdo con la convención- normal de proporcionar solamente la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la estructura de cadena no transcrita del ADN (es decir, la estructura de cadena que tiene una secuencia homologa a ARNm). Las secuencias de control transcripcional y de traducción son "secuencias reguladoras de ADN", tales como promotores, mejoradores, señales de poliadenilación, terminadores y similares, .que proporcionan la expresión de una secuencia de codificación en una célula huésped- Una "secuencia de control e expresión" es una secuencia de ADN que controla y regula ¡a transcripción y traducción de otra secuencia de ADN. Una secuencia de codificación eslá "bajo el 1 t-, *? 23 control" de secuencias de conlrol transcripcionales y de traducción en una célula cuando la polimerasa de ARN transcribe las secuencia de codificación a ARNm, que después es traducido a la proteína codificada por la secuencia de codificación. Como se util iza en la presente, el término "proteínas de matriz extracelular", o ECM, se refiere a cuatro familias generales de macromolécuias, colágenos, glicoproteínas estruciurales, proteoglícanos y elastinas, incluyendo fibroneclina, y fibrionógeno, que proporciona soporte y modulan el comportamiento celular. Como se utiliza en la presente, una "célula huésped" es una célula que ha sido transformada o transfecíada, o es capaz de transformación o transfección a través de una secuencia de pclinucleótido exógena. "identidad" Como se utiliza en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptido o dos o más secuencias de polinucleótidos, según determinado comparando la secuencia. En la íécnica, "ideníidad" también significa ei grado de relación de secuencia entre secuencias de poüpéptido o polinucleótido, según pueda ser el caso, según determinado por la coincidencia entre las tiras de dichas secuencias. "Identidad" y "similitud" pueden ser fácilmente calculadas a través de métodos conocidos (Computaíional Molecular Biology, Lesk, A.M., ed. Oxford University Press, New York, 1988: Biocomputing: Informalics and Genome Projects, Smith, D.W. ed., Academic Precc, New York, 1993). Aunque existe un número de métodos para medir la identidad y similitud entre dos secuencias, ambos términos son bien conocidos por aquellos expertos en la íécnica. Los méíodos comúnmeníe empleados para determinar ia identidad o simiülud entre secuencias incluyen, pero no se ¡imitan a aquellos descritos por Carrillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1998). Mélodos preferidos para determinar la identidad están designados para proporcionar ¡a coincidencia más grande eníre las secuencias probadas. Los méíodos para deíerminar la identidad y similitud son codificado en programas de computadora públicamente disponibles. Los métodos de programas de Computadora preferidos .para determinar ¡a Identidad y similitud r entre, dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programa GCG (Deveraux y otros, Nucleic Acids Research 12(1):387, -1384), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Atschul y otros, J. Mole. Brol.' 215:403-410, 1990). El programa BLAST X esíá públicamente disponible de NCB! y otras fuenfes (BLAST Manual, Alischul y oíros, NCB! NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Aitschui y oíros, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990). : Por "caníidad inmunológicameníe efecíiva" se quiere dar a enfender una cantidad de una composición de pépíido que es capaz »de generar una respuesta inmune en el animal receptor. Esta incluye tanfo ¡a generación de una respuesta de anticuerpo (respuesta de célula B) y/o la estimulación de una respuesta inmune citotóxica (respuesta de célula T). La generación de dicha respuesta inmune tendrá utilidad tanto en la producción de bioreactivos úíiles, por ejemplo, CTLs y, más particularmeníe anlicuerpos reacfivos, para usarse en modalidades de diagnóstico, y también tendrán utilidad en varias modalidades íerapéuíicas o profilácíicas. Como se uíiliza en la presenfe, el íérmino "vacuna in vivo" se refiere a la inmunización de animales con proteínas con el fin de producir una respuesta inmoral y celular que proíege contra la exposición poslerior ai patógeno. El término "aislado" se identifica en la presente como libre de por lo menos algunos de los componentes con los cuales ocurre naturalmente, "aislada(o)" como se utiliza en la preseníe, también significa aderado o alterada (por la mano del hombre) de su estado-natural, es decir, si' ocurre por • naturaleza, ha sido cambiado o re?ftóvido de su ^ambiente .original, o ambos. Por ejemplo, un póünucieótido • o un' - pdlipépüdo naturalmente presente en un organismo viviente no es "aislado", sino que el mismo polinucleótido s polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natura! es, "aislado" , según el término empleado aquí. Eí término "ligando" se utiliza para incluir moléculas, incluyendo aquellas dentro de tejidos huéspedes, a los cuales se unen bacterias paíogénicas La frase "anlicuerpo monoclonal" es sus varias formas gramáíicas se refiere a un aníicuerpo que íiene solameníe una especie de siíio de combinación de aníicuerpo capaz de inmunoreaccionar con un antígeno particular. El término "oligonucleóíido" como se utiliza en la presente, se defina como una molécula compuesía de uno o más nucleóíidos, preferiblemeníe más de íres. El íamaño exacío dependerá de muchos facíores ¡os cuales, a su vez, dependen de ¡a función y uso finales del oligonucleóíido. Como se utiliza en ia presente la frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y no producen típicameníe una reacción adversa alérgica similar inaceptable cuando se administran 'a un ser humano. "Poiinuc!eóíido(s)" - generalmenfe se refiere a cualquier polirribonucleóíido • o polideeoxirribonucleótido, eí cual puede ser ADN o ARN no modificado o ARN o ADN modificado. "Polinucleótido(s)" incluye, sin limitación, ADN de estructura de cadena individual y doble, ADN que es una mezcla de regiones de estructura de cadena individual y doble o regiones de estructura de cadena individual, doble y triple, ARN de estructura de cadena individual y doble, y ARN que es una mezcla de regiones de estructura de cadena individual y doble, moléculas híbridas comprendiendo ADN y ARN que pueden ser de estructura de cadenB individual o, más típicameníe de eslructura de cadena doble o triple, o una mezcla de regiones de esfruclura de cadena individual y doble. Además, "polinucleóíido" como se utiliza en la presente, se refiere a regiones de estructura de cadena triple comprendiendo ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Las estrucíuras de cadena en dichas regiones pueden ser de la misma moléculas o de diferentes moléculas. Las regiones pueden incluir íodas o una o más de las moléculas, pero más lípicamenle ¡nvolucra solamenfe una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región helicoidal tri p le por lo general es un oligonucleótido. Como se utiliza en la presente, el término "'polinucleófido(s)" incluye ADNs, o ARNs como se describió anferiormenle que coníienen una o más bases modificadas. De esía manera, ADNs o ARNs con esírucíura de base modificadas para esfabilidad o por oirás razones son "polinucleóíidos" ya que ese férmino esíá destinado en la presente. Además los ADNs o ARNs comprendiendo bases inusuales, tales como inosina, o bases modificadas, tales como gases tiríiladas, solo por nombrar dos ejemplos, son polinucleótidos como se utiliza en la preseníe. Se -< apreciará que una gran variedad de modificaciones han sido hechas • para ADN y ARN que sirven para muchos propósiíos úliies conocidos por aquellos experíos en la íécnica. El término " polinucleótido(s)" como se uliliza en la preseníe, abarca dichas formas química, enzimáíica o meíabólicameníe modificadas de polinucleóíidos, así como las formas químicas de ADN y ARN caracíerísíícas de virus y células incluyendo, por ejemplo, células simples y complejas. "Polinucleóíido(s)" abarca polinucleólidos corlos que por lo general denominado como oligonucleófidos. "Polipépíido(s)" se refiere a cualquier pépfido o proleína que comprende dos o más aminoácidos unidos enlre sí a íravés de enlaces pepíídicos o enlaces pepíídicos modificados, "polipéplido(s)" se refiere íanío a cadenas corías, comúnmenfe denominadas como pépíidos, oligopéplidos y oligómeros como a cadenas más largas generalmeníe denominadas proíeínas. Los polipépíidos pueden coníener aminoácidos disíiníos de los 20 generalmeníe codificados. "polipéplido(s)" incluye a aquellos modificados ya sea a íravés de procesos naíurales, lales como procesamienío y oirás modificaciones posf-fransacionales, pero fambién a íravés de técnicas de modificación química que son bien conocidas en el campo. Dichas modificaciones se describen en texlos básicos y en monografías más deíalladas, así como en una liferalura de búsqueda voluminosa, y son bien conocidas por aquellos experíos en la íécnica. Se apreciará que ei mismo lipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o grados variables en varios sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier parte en un polipépíido, incluyendo la eslrucfura de base de! péplido, ¡as cadenas laíerales del aminoácido y los lérminos amino o carboxilo. Las modificaciones incluyen aceíilación, acilación, ribocilacón con ADP, amidación, unión covalenle de flavina, unión covalente de una porción heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covaleníe de un lípido o derivado de lípido, unión covaleníe de fosfaíidilinosiíol, entrelazamiento, ciclización, formación de enlace de disulfuro, desmetilación, formación de enlaces covalenfes cruzados, formación de cisíeína, formación de puloglulamaío, formulación, gama-caboxilación, glicosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, melilación, mírisíoilación, oxidación, procesamienfo proíeolííico, fosforilación, prenilación, racemización, glicosilación, unión de lípídos, sulfafación, gama-carboxilación de residuos de ácido gluíámico, hidroxilación y ribosilación por ADP, selenoilación, sulfaíación, adición de aminoácidos mediada por transferencia de ARN a proteínas fales como arginilación y ubiquilinación. Ver, por ejemplo, Seifíer y oíros, Meih. Enzymol. 182:626-646, 1990 y Ralían y oíros, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62, 1992. Los polipépíidos pueden ser ramificados o cíclicos, con o son ramificación. Los polipéptidos cíclicos ramificados y circulares ramificados pueden resultar de procesos naíurales de fraducclón posíerior, y se pueden hacer a íravés de mélodos compieíamenle sinlélicos también. El término "iniciador" como se ufiliza en la presente, se refiere a un oligonucleótido, ya sea de exisíencia naíurai como en una digesfión de restricción purificada o producido sintéticamente, el cual es capaz de actuar como un punfo de iniciación de sínlesis cuando se coloca bajo condiciones en donde las síntesis de un producto de extensión de iniciador, el cual es complemenlario a una esírucíura de base de ácido nucleico, es inducida, es decir, en presencia de nucleólidos y un agenle de inducción lal como polimerasa de ADN y a una íemperatura y pH adecuados. El iniciador puede ser ya sea de cadena de estructura individual o de cadena de estruclura doble y debe ser suficienfemeníe largo para iniciar la síníesís del producío de exfensión deseado en presencia del agenfe de inducción. La longiíud exacta del iniciador dependerá de muchos facíores, incluyendo íemperafura, fueníe del iniciador y uso del méíodo. Por ejemplo, para aplicaciones de diagnósíico, dependiendo de la complejidad de la secuencia objeíivo, el iniciador de oligonucleóíido íípicamenfe coníiene 15-25 o más nucleóíidos, aunque puede íener menos nucleóíidos. Los iniciadores de la preseníe se seleccionan para ser substancialmente complementarios a diferentes estrucíura de base de una secuencia de ADN objefivo parlicular. Eslo significa que los iniciadores deben ser suficieníemeníe complemenfarios para hibridizar con sus eslrucluras de base respectivas. Por lo tanto, la secuencia de iniciador no necesita reflejar la secuencia exacta de la plantilla. Por ejemplo, un fragmento de nucieótido no complementarlo puede ser unido al extremo 5' de! iniciador, con el resto de la íecuéncía de iniciador siendo complementaria la estructura. de base. Alternativamente, las secuencias de bases no complementarias o más largas pueden ser intercaladas en el iniciador, siempre que la secuencia de iniciador íenga suficiente compiementariedad con la secuencia de la esfrucíura de base para hibridizar con la misma y de esía manera formar la plantilla para la síntesis del producío de exíensión. Una "secuencia promofora" es una región reguladora de ADN capaz de unir polimerasa de ARN en una célula e inciar la íranscripcíón de una secuencia de codificación corrienle abajo (dirección 3'). Con el propósiío de definir la présenle invención, la secuencia promoíora es unida es su férmino 3' a íravés del sifio de iniciación de transcripción y se extiende corrieníe arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elemeníos necesarios para iniciar la iranscripción a niveles detectados por arriba de los antecedeníes. Deníro de la secuencia promoíora se enconírará un sifio de iniciación de transcripción (convenientemeníe definido por el mapa con nucleasa Sl) así como de dominios de unión de proíeína (secuencias de consenso) responsables de la unión de polimerasa ARN. Los promoíores eurcarióficos por lo general, pero no siempre, coníendrán cajas "TATA" y cajas "CAT". Los promoíores procarióficos contiene secuencias de Shine-Dalgarno además de las secuencias de consenso -10 y -35. Un "replicón" es un elemenlo genético (por ejemplo, piásmido, cromosoma, virus) que funciona como una un'dad autónoma de replicación de ADN in vivo; es decir, capaz de repiicación bajo su propio control. Como se utiliza en la presente, los términos "endonucleasis de restricción" y "enzimas de restricción" se refiere a enzimas bacíerianas, cada una de las cuales corla el ADN de estructura de cadena doble en o cerca de una secuencia de nucleótido palindrómica específica. Una "secuencia de señal" puede ser incluida anles de la secuencia de codificación. Esta secuencia codifica un péptido de señal, N-terminal al polipéptido, que se comunica con la célula huésped para dirigir el polipéptido a la superficie celular o secreta el polipéptido en el medio y este péptido de señal es sujetado por la célula huésped antes de que la proíeína deje la célula. La secuencias de señal se pueden enconlrar asociadas con una variedad de proteínas nativas procariotes y eucaríoíes. Una célula ha sido "íransformada" a íravés de ADN exógeno o heíerólogo cuando dicho ADN ha sido iníroducido dentro de la célula. El ADN de transformación puede ser o no puede ser integrado (covalentemente enlazado) al ADN cromosómico que forma el genoma de la célula. En procariotes, células de levadura y de mamífero, por ejemplo, el ADN de íransformación puede ser mantenido en un elemento, episómico tal como un plásmido. Con respecto a células eurcarióticas, una célula establemente transformada es una en donde el ADN de íransformación ha quedado integrado en un cromosoma, de manera que es heredado por células hijas a través de replicación del cromosoma. Esta estabilidad se demuestra a través de la habilidad de la céluia cariótica para esfablecer líneas de célula o clones compuesíos de una población de células hijas conleníendo el ADN de íransformación. "Varianíe(s)" como se uíiliza en la preseníe, es un polinucleóíido o polipépíido que difiere de un polinucléotído o polipéptido de referencia, respectivamenle, pero refiene propiedades esenciales. Una varianíe íípica de un polinucleólido difiere en secuencia de nucieófido de olro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden o no pueden aiíerar la secuencia de aminoácido de un polipépíido codificado por el polinucleóíido de referencia. Los cambios de nucieóíido pueden dar como resulíado subsíiíuciones, adiciones, eliminaciones, fusiones o íruncaciones del aminoácido en el polipépíido codificado por la secuencia de referencia, como se discufe más adeianle. Una variante típica de un polipéptido difiere en una secuencia de aminoácido de otro polipéptido de referencia. En genera! las diferencias son limitadas, de manera que las secuencias del polipéptido de referencia en la varianíe son esírechamenfe similares íofalmente y , en muchas regiones, idéntica. Una variante de polípéptido de referencia pueden diferir en secuencia de aminoácido por una o más substiluciones, adiciones y eliminaciones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácido substituido o insertado puede o no puede ser uno codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o poüpéptido puede ser una de existencia natural. ía! como una variante alélica o puede ser una variante que no se sepa que es de exisíencia natura!. Las variantes de existencia no nalura! de poünucíeóíido y polipépíido pueden hacerse a írasvés de técnicas de mutagénesis, a través de síntesis direcía, o a íravés de oíros méíodos recombinanfes conocidos por aquellos experlos en la lécnica. Un "vecfor" es un replicón, íal como plásmidos, fago o cósmido, al cual oíro segmento de ADN se puede unir con el fin de producir la replicación del segmento unido. ll. Secuencias de Ácido Nucleico y Aminoácido Las secuencias de ácido nucleico que codifican SdrF, SdrG y SdrH (como se muesíra en las figuras 2-4, respecfivamenfe) o sus porciones, íales como mofivos de aminoácido de consenso o secuencia variable, son úíiles para la producción de proíeínas recombinaníes o como sondas de ácido nucieico para la defección de proteínas estafilocóxicas negativas a coagulasa en una muestra o espécimen con alta sensibilidad y carácter especifico. Las sondas pueden usadas para defecar la presencia de esfafilococos negaíivos a coaguíasa en la muesíra, diagnosíicar infección con enfermedad, cuanfificar la canlidad de esfafilococo negalivo a coagulasa en la muestra, o verificar el progreso de terapias usadas para tratar la infección. La secuencias de ácido nucleico y de aminoácido también puecl-jn ser útiles como herramienta de investigación de laboratorio para estudiar el organismo y la enfermedad o para desarrollar •terapias y tratamieníos para ¡a enfermedad. 3e entenderá por aquellos expertos en la técnica que las proteínas SdrF, SdrG y SdrH también son codificadas por secuencias substancialmente similares a ias secuencias de ácido nucleico provistas en ia lisia de secuencias. Dos secuencias de ADN son "subsíancialmente similares" cuando aproximadameníe 70% o más (de preferencia por lo menos aproximadamente 80% y muy preferiblemente al menos 90 o 95%) de los nucleótidos coinciden sobre la longitud definida de las secuencias de ADN. Las secuencias que son substancialmeníe homologas pueden ser ideníificadas comparando las secuencias uíilizando software estándar disponible en bancos de dafos de secuencia, o en un experimento de hibridación Southern bajo, por ejemplo, condiciones severas como se define para ese sisíema particular. La definición de condiciones de hibridación apropiada está dentro de la experiencia de la técnica. Ver, por ejemplo, Maniatis y oíros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982; DNA Cloning, Vols. I & II, supra; Nucelic Acid Hybridization, [B.D. Hames & S. J. Higgins eds. (1685)]. Por "substancialmeníe similar" se quiere dar a eníender además, una secuencia de ADN que, en virtud de la degeneración del código genético, no es idéníica a aquella mosfrada en cualquiera de las secuencias iluslradas en las figuras 2-4, pero la cual sigue codificando la misma secuencia de aminoácido; o una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácido diferente que retiene las actividades de ias proteínas, ya sea porque un aminoácido es reemplazado con un aminoácido similar o porque ei cambio (ya sea substiíución, eliminación o inserción) no afecta ei sitio activo de ¡a proteína. Dos secuencias de aminoácido o dos secuencias de ácido nüt'eico son "substancialmeníe similares" cuando aproximadameníe 70% o más (de preferencia al menos 80%, y más preferiblemeníe por Id menos aproximadameníe 90 o 95%) de ¡os aminoácido coinciden sobre la longitud definida de la secuencias. Se pueden hacer modificaciones y cambios en ¡a estrucíura de los pépíidos de la presente invención y los segmentos de ADN que los codifican y seguir obteniendo una molécula funcional que codifique una proteína pépíido con caracferísíicas deseables. Lo siguieníe es una discusión con base en el cambio de los aminoácidos de una proíeína para crear un equivaleníe, o aún una molécula de segunda generación mejorada. Los cambios de aminoácido pueden lograrse cambiando los codones de la secuencia de ADN, de acuerdo con el cuadro 1. Se deben eníender por aquellos experfos en la técnica que los codones especificados en el cuadro 1 son para secuencias de ARN. Los codones correspondienfes para ADN fienen un subsíiluyenfe T para U. Para esíar de acuerdo con la nomenclafura esíándar (J. Biol. Chem., 243:3552-3559, 1969), las abreviaíuras para los residuos de aminoácido se ilustran además en el cuadro 1 CUADRO 1 Aminoáci dos ..- -, Co dones 'Alanina Aia -A- GCA GCC GCG GCU ,Cisíeína Cys C UGC UGU . , Ácido aspártico Ásp D GAC GAU GAC G?U Áci o glutám ico Glu E GAA GAG Fenilalanina Phe F UUC UUU Glicina Gly •' G GGA GCG GGG GGU Histidina His H CAC CAU í s o l u c i n a lie I AUA AUC AUU Lisina Lys L AAA AAG Leucina Leu M UUA UUG CUA CUC CUG GUU Metionina Met N AUG Asparagina Asn 0 AAC AAU Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU -Glutamina Gln Q CAA CAG Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU Treonina Thr T ACA ACC ACG ACU Valina Val v GUA GUC GUG GUU Triptofano Trp w UGG Tirosina Tyr Y UAC UAU Por ejemplo, cierfos aminoácidos pueden se substituidos para otros aminoácidos en una estruclura de profeína sin pérdida apreciable de capacidad de unión interactiva con estrucíuras íales como, por ejemplo, regiones de unión a anlígeno de aníicuerpo o silos de unión sobre moléculas de subslrato. Ya que es la capacidad interacíiva y la naturaleza de una proteína las que definen la acíividad funcional biológica de esa profeína, ciertas substiíuciones de secuencia de aminoácido pueden hacerse en una secuencia de proteína y, por supuesto, su secuencia de codificación de ADN subyacente, y sin embargo obtener una proíeína con propiedades similares. De está esía manera se coniempla por los inventores que se pueden hacer varios cambios en ias secuencias de péptido de las composiciones descritas, o secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos péptídos sin la perdida apreciable de su uíilidad biológica o acíivldad. Para hacer dichos cambios, se debe considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice tiidropático del aminoácido para conferir función biológica iníeractiva en una proteína es generalmenfe entendida en ia técnica (Kyte y Dooiitíle, J. Mol. Bioi., 157(1):105-132, 1982, incorporada aquí por referencia). Se acepla que el carácler hidropáíico relaíivo del aminoácido coníribuye con la esíructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proíeína con ofras moléculas, por ejemplo, enzimas, subsíraíos, recepíores, ADN, anficuerpos, anlígeno, y similares. A cada aminoácido se le asignado un índice hidropático con su base en su carácter hidrofóbico y caracterísficas de carga (Kyte y Dooliííle, supra, 1982), esías son: isoleuclna (+4.5); valina (+4.2); leucina ( + 3.8); fenilalanina (+2.08); cisíeina/cisíina ( + 2.5); meíionina ( + 1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); íreonina (-0.7); serina (-0.8); íripíofano (-0.9); íirosina (-1.3); prolina (-1.6); hisíidina (-3.2); glufamaío (-3.5); gluíamina (-3.5); asparlato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5). Se sabe en la técnica que cieríos aminoácidos pueden ser subsíiíuidos por otros aminoácidos que tengan un índice hidropático similar o clasificación y sigan dando como resulíado una proíeína con aclividad biológica similar, es decir, sigan obíeniendo una "-proíeína funcionalmeníe equivaleníe biológica. Para hacer dichos cambios, ia substitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos erstán dentro de ±2, se prefiere, 'aquellos que están dentro de ±1 son particularmeníe preferidos, y aquellos dentro ±0.5 aún son muy particularmente muy preferidos. También se entiende en la técnica que las substifución de aminoácidos similares puede hacerse efectivamente con 'base en ei carácter hidrofóbico. La pateníe de E.U.A. 4,554,101 incorporada aquí por referencia esfablece que el carácíer hidrofílico promedio local mayor de una proíeína, según gobernado por el carácfer hidrofílico se sus aminoácidos adyaceníes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proíeína. Como se defalie en la paíenle de E.U.A. 4,554,101, los siguíenfes valores de carácíer hidrofílico han sido asignados a residuos de aminoácido: arginina ( + 3.0); lisina (+1.0); asparfaío ( + 3.0±1); glufamaío ( + 3.0±1); serina ( + 0.3); asparagina (+0.2); glutamina ( + 0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5±1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisíeina (-1.0); melinina (-2.5); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); íirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); íipíofano (-3.4). Se entiende que un aminoácido puede ser substiíuido por oíro valor de carácíer hidrofílico similar y seguir obteniendo una proteína biológicamente equivalente y en particular inmuríológicamenle equivalenfe. En dichos cambios, la subslifución de aminoácidos cuyos valores de carácíer hidrofílico esfán dentro de +2 es preferida, aquellos que esíán de ±1 son parficularmenle preferidos y aquellos deníro de ±0.5 spn aún más particularmenfe preferidos. Como se delineó anteriormente, las substituciones de aminoácido generalmente hasla ahora se basan en la similitud relativa de los substiluyenles de cadena lateral de aminoácido, por ejemplo, su carácter hidrofóbico, carácter hidrofílico, carga, tamaño y similares. La subsfiíuciones ilustrativas que toman varias de las caracterísí?cas anleriores en consideración son bien conocidos por aquellos experíos en la íécnica, e incluyen: arginina y lisina; glufamafo y asparfaío; serina y íreonina; glufamina y aparagina; y valfna, leucina e isoleucina. Los polipépíidos de la présenle invención pueden ser químicamente sintetizados. Los polipéptidos sintéíicos se preparan utilizando técnicas bien conocidas de íécnicas de condensación de fase sólida, de fase líquida o de pépíido, o cualquier combinación de las mismas, y pueden incluir aminoácidos nalurales y no nalurales. Los aminoácidos uíilizados para la sínlesis de péplido pueden ser una resina de aminoácido Boc esíándar (N -bufioxycarbonilo Na-aminoprotegido) con los protocolos esíándares de desprolección, neulralización, acoplamienfo y lavado del procedimienío de fase sólida original de Merrifield (J. Am.Chemm Soc, 85:2149-2154, 1963), de los aminoácidos 9-fluorenilmeloxycarboniio (Fmoc) Na-aminoprolegido de base lábiri primeros descritos por Carpino y Han (J. Org. Chem., 37:3403-3409, 1972). Los aminoácidos tanío Fmoc como Boc Na-aminoproíegidos pueden se obíenidos de Fluka, Bachem, Advanced Chemfech, Sigma, Cambridge Research Biochemicai, Bachem, o Peninsula Labs u ofras compañías química familiares para aquellos quienes practican este campo. Además, el méíodo de la invención puede ser usado con otros grupos Nd-proíecíores que son similares para aquellos experíos en esía lécnica. La síníesis de péplido de fase sólida puede lograrse a íravés de técnicas familiares para aquellos expertos en ¡a técnica y provistos, por ejemplo, por Stewart y Young, 1984, Solid Phase Síntesis, Second Edition, Pierce Chemica! Co., Rockford, IL; Fields y Noble, 1990, Int. J. Pept. Protein Res. 35:161-214. o utilizando sintetizadores automáticos, tales como aquellos vendidos por ABS. De esta manera, los polipéplidos de la invención pueden comprender D-aminoácidos o una combinación de D- y L- aminoácidos y varios aminoácidos "diseñadores" (por ejemplo, ß-metil-aminoácidos, C -metil aminoácidos, y Na-metil aminoácidos, etc.) para transportar propiedades especiales. Los aminoácidos sintéticos incluyen ornitina para lisína, fluorofenilalanina para fenilalanina, y norleucina para leucina o isoleucina. Además, a través de la asignación de aminoácidos específicos es pasos de acoplamienío específicos, se pueden generar hélices a, vuelías ß, láminas ß, vueltas T, y péptidos cíclicos. En una modalidad adiciona!, se seleccionarán subunidades de péptidos que confieren propiedades químicas y estruclurales úíiles. Por ejemplo, los pépíidos que comprenden D-aminoácidos serán resistentes a proteasas específicas para L-aminoácidos, in vivo. Además, la preseníe invención comprende preparar pépíidos que tienen propiedades estructurales más bien definidas, y al uso de pepíidomiméticos y enlaces peptidomiméticos, tales como enlaces ester para preparar pép'tidos con propiedades novedosas. En otra modalidad, un pépíido puede ser generado que incorpore un enlace peplídico reducido, es decir, R1-CH2-NH-R2, en donde R, y R2 son residuos o secuencias de aminoácido. Un enlace de péplido reducido puede ser iníroducido con una subunidad de dipéptido, dicha molécula puede ser resistenle a hidrólisis de unión de péptido, por ejemplo, actividad de proteasa. Dichos péptidos pueden proporcionar ligandos con función de actividad única, tales como vidas medias extendidas in vivo debido a la resistencia a la ruptura metabólica o actividad de proteasa. Además, es bien conocido que en ciertos sistemas los péptidos restringidos muestran acíividad funcional mejorada (Hruby, Life Sciences, 31:189-199, 1982); (Hruby y oíros, Biochem J., 268:249-262, 1990). Los siguientes aminoácidos no clásicos pueden ser incorporados en el pépíido con el fin de ¡nlroducir molivos conformacionales parílculares: 3-carobixilafo de 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (Kamierski y oíros, J. Am.Chem. Soc, 113:2275-2283, 1991); (2S,3S)-meíil-fenilalanina, (2S,3R)-meíi¡-fenilalanina, (2R,3S)-meíil-fenilala.nina y (2R,3R)-metil-fenilalanina (Kazmierski y Hruby, Tetrahedron Leít., 1991); 2-aminoíeírahidronafíalen-2-ácido carboxílico (Landis, Ph.D. Thesis, Universiíy of Arizona, 1989); 3-carboxilafo de hidroxi-1 ,2,3,4-íetrahidroisoquinolina (Miyake y oíros, J. Takeda Res. Labs,, 43:53-76, 1989); ß-carbonüa (D y L) (Kazmierski, Ph. D. Thesis of Arizona,. 1988); HSC (ácido hisfidina-isoquinolina-carboxílico) (Zechel y otros Int. J.Pep. Protein Res., 43:199'i); y HIC (histidina-urea-cíclica) (Dharanipragada). Los siguientes análogos de aminoácido y peptidomiméticos pueden ser incorporados en un péptido para inducir o favorecer estrucíuras secundarias específicas: LL-Acp (LL-3-amino-2~ propenidona-6-carboxílico), un análogo de bipépíido de inducción de ß-vuelta (Kemp y otros, J. Org. Chem., 50:5834-5838 (1985); análogos de inducción de lámina ß (Kemp y oíros, Telrahedron Letf., 29:5081-5082, 1988); análogo de inducción de vuelía ß (Kemp y oíros, Teírahedron Lett., 29:5057-5060, 1988); análogos de inducción de hélice alfa ( Kemp y otros, Tetrahedron Leti., 29:4935-4938, 1988); análogos de inducción de vuelía Y (Kemp y oíros, J. Org.

Chem., 54:109-115, 1989); y análogos provísíos por las siguienles referencias: Nagai y Saío, Teírahedron Leít., 26:647-650 (1985); DiMaio y otros, J. Chem. Soc. Perkin Trans., p. 1687 (1989); íambién un análogo de giro Gly-Ala (Kahn y oíros, Tefrahedron Leít., 30:2317, 1989); isosteres de enlace de amida (Jones y oíros, Teírahedron Lelí., 29:3853-3856, 1989); íefrazol ( (Zabrocki y oíros, J. Am. Chem. Soc, 110:5875-5880, 1988); DTC (Samanen y oíros, Int J. Protein Pep. Res., 35:501:509, 1990); y análogos enseñados por Olson y otros, (J. Am. Chem. Sci., 112:323-333, 1990) y Garvey y otros (J. Org. Chem., 56:436, 1990). Los miméticos con formas conformocionalmente restringidos de vueltas beta y pandeos de tacoma y péplidos que ¡os contienen,' se describen en fa pateníe de E.U, A., No. 5,440,-013, expedida el 8 de agosto de 1995 a Kahn. .-.También se proporcionan en ¡a preseníe secuencias de moléculas de ácido nucleico que selecíivamenle hibridizan con molécula de ácido nucleico que codifican las proíeínas de unión a fibrinógeno o sus porciones, íales como moíivos de aminoácido de consenso o de secuencia variable, de maíerias esíafilocóxicas negaíivas a coagulasa tales como S. epidermidis aquí descrita o sus secuencias complementarias. Por "selectivo" o "selectivamenfe" se quiere dar a enlender una secuencia que no hibridiza con oíros ácidos nucleicos. Esío es para promover la defección específica de sdrF, sdrG o sdrH. Por lo lanío, en el diseño para ácidos nucleicos de hibridación, la selecíividad dependerá de otros componentes presentes en una muestra.

El ácido nucleico de hibridación debe íener por lo menos 70% de complemeníariedad con el segmenío de! ácido nucleico al cual hibridiza. Como se uíiliza en la présenle, para describir ácidos nucleicos, el lérmino "selectivamente hibridiza" excluye los ácidos nucleicos aleatoriamenle de hibridación ocasionales, y de esta manera, tiene el mismo significado como "específicamenfe hibridiza". Los ácidos nucleicos selecfivamenle de hibridación de la invención pueden íener por lo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% y 99% de complemenlariedad con el segmenfo de la secuencia a la cual hibridizan. La invención coníempla secuencias, sondas e iniciadores que selectivamente hibridizan al ADN de codificación o ai complementario, o puesto, o estruclura de cadena del ADN como específicameníe se proporciona en la presente. La hibridación específica con ácido nucleico puede ocurrir con modificaciones o substiíuciones menores en el ácido nucleico, siempre que sea mantenida la capacidad de hibridación específica en la especia, funcional. Por "sonda" se quiere dar a entender secuencias de aminoácidos que pueden ser usadas sondas o iniciadores para la hibridación selectiva con secuencias de ácido nucleico complemeníario para su defección o amplificación, dichas sondas pueden variar en longitud de aproximadamente 5 a 100 nucleótidos, o preferiblemente de alrededor de 10 a 50 nucleótidos, o muy preferiblemente alrededor de 18-24 nucleóíidos. Por lo lanío, los lérminos "sonda" o "sondas" como se utiliza en la presente se define que ¡ncluyen "iniciadores". Se proporcionan ácidos nucleicos aislados en al presente que selectivamente hibridizan con ios ácidos nucleicos específicos en la especie bajo condiciones severas y deben tener por lo menos 5 nucleótidos de complementariedad con la secuencia de inlerés como se describe en Sambrook y otros, 1989. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. Si se utilizan como iniciadores, la composición preferiblemente incluye por lo menos dos moléculas de ácido nucleico, las. cuales hibridizan a diferentes regiones de la molécula objeíivo con el fin de amplificar una región deseada. Dependiendo de la longiíud . de la sonda b iniciador, la región objeíivo puede variar deníro de un 70% de bases de complemeníariedad y una complemeníarieda.d compíeía y seguir hibridizando bajo condiciones severas. Por ejemplo, para el propósito de diagnosticar la presencia de S. epidermidis, el grado de compiementariedad entre el ácido nucleico de hibridación (sonda o iniciador) y la secuencia al cual hibridiza (por ejemplo, ADN estafilocóxico negativo a coagulasa de una muestra) en por lo menos suficientemeníe para distinguir la hibridación con un asido nucleico de otra bacteria. Las secuencias de ácido nucleico codifican las proteínas SdrF, SdrG o SdrH o sus porciones, tales como moíivos de aminoácido de consenso o secuencia variable, pueden ser inseríadas en un vector, tal como un plásmido y expresarse recombinantemente en un organismo viviente para producir proteínas SdrF, SdrG o SdrH recombinantes o sus fragmentos. Por ejemplo, las moléculas de ADN que producen SdrF, SdrG o SdrH recombinaníes han sido producidas en plásmidos de acuerdo con la preseníe invención. Las proíeínas recombinanfes son producidas a fravés de méfodos bien conocidos por aquellos experfos en la íécnica. Un vecfor de clonación, íal como un ADN de plásmido o fago es desdoblado con una enzima de resfricción, y la secuencia de ADN que codifica la proíeína SdrF, SdrG o SdrH o sus fragmentos, tales como molivos de aminoácido de consenso o secuencia variable, es insertada en el sitio de escisión y ligada. El vecíor de clonación después es insertado en un huésped para producir una proteína o fragmento codificado por SdrF. SdrG o SdrH que codifica AON. Los huéspedes adecuados incluyen huéspedes bacterianos tales como Escherichia coli, Bacillus subtilis, levaduras y otros cultivos de células. La producción y purificación el producto de gen puede lograrse y mejorarse utilizando técnicas de biología molecular conocidas. lll. Usos de ácidos nucleicos sdr Se proporcionan métodos para utilizar ácido nucleicos aquí descriíos, para deíeclar e idenfificar la presencia de estafilococo negativo a coagulasa. Los méíodos son úíiles para diagnosticar infecciones estafilocóxicas negativas a coagulasa y otras enfermedades asociadas tales como infecciones relacionadas con catéfer, infecciones relacionadas con biomaíerial, infecciones del tracto respiratorio superior (lales como olifis media, íraqueiíis bacferiana, epigloíilis aguda, liroiditis), infecciones respiratorias inferiores (tales como enfisema, absceso en el pulmón), enfermedades cardíacas (tales como endocarditis infecciosa), gasíroiníeslinales (tales como diarrea de secreción, absceso esplénico, absceso retropeploneal), del sisíema nervioso cenfral (íal como absceso cerebral), oculares (íales como lefariíis, conjuntiviíis, queraíitis, endoftalmiíis, celuliíis preceplal y orbilal, darcriocislilis), del riñon y íracío urinario (íales como epididimifis, absceso ¡nírarenal y perinéfrico, síndrome de choque íóxico), de la piel (fales como impetigo, foliculitis, abscesos cutáneos, cel ul itis, infección en heridas, miositis bacíeriana), huesos y articulaciones (íales como artritis, séptica, osteomielííis), masíiíis bovina y pioderma canino. El méíodo involucra los pasos de obíener una muestra con sospecha de contener estafilococos negativos a coagulasa. La muestra puede ser tomada de un individuo, por ejemplo, de la sangre, saliva, íejidos, hueso, músculo, caríílago o piel de algún individuo. La células después pueden se usadas y el ADN exlraído precipitado y amplificado. La detección del ADN a partir del estafilococo negativo a coagulasa se logra hibridizando el ADN amplificado con una sonda para estafilococo negativo a coagulasa que seleclivamenle hibridiza con el ADN como se describió anteriormente en la descripción detallada de la invención. La defección de hibridación es indicafiva de la presencia de esíafilococo negaíivo a coaguiasa. Preferiblemente, la detección de hibridación de ácido nucleico (por ejemplo, sondas o iniciadores) puede ser faciliíada por el uso de porciones deíecíadas. Por ejemplo, las sondas pueden ser marcadas con biotina y utilizarse en un ensayo de placa de microíiíulación recubíería con esírepíavidina. Ofras porciones defeclables incluyen marcación radioacliva, marcación de enzima, y marcación fluoresceníe, por ejemplo. El ADN puede se deíecíado direcíameníe o puede ser amplificado enzimaíicameníe ulilizandc reacción de cadena de polimerasa (PCR) u oirás íécnicas de amplificación antes del análisis. l ARN o ADNc puede ser detecíado similarmeníe. La expresión elevada o reducida de sdrF,. sdrG o sdrH puede ser medida uíilizando cualquiera de los méfodos; bien conocidos en la íécnica para la cuanfificación de moléculas de ácido nucleico,, tales- como, por ejemplo, amplificación,- PCR, RT-PCR, Rnase protección , tinción de Northern, y otros métodos de hibridación. Los ensayos de diagnosfico para proíeínas SdrF, SdrG o SdrH o sus' porciones, tales como motivos de aminoácidos de consenso o secuencia variable, o aníicuerpos anii-SdrF, SdrG o SdrH, también pueden ser uíilizados para defecíar la presencia de una infección por Síaphylococcus epidermidis. Las íécnicas de ensayo para delerminar los niveles de proíeína o anlicuerpo en una muesíra son bien conocidas por aquellos experlos en el campo e incluyen méíodos tales como radioinmunoensayo, análisis de tinción Western y ensayos de ELISA.

IV. Usos De La Proteína O Anticuerpo Sdr Las proíeínas aisladas, recombinaníes o siníéticas, o sus porciones antigénicas (incluyendo fragmentos que llevan epítopos), o sus proteínas de fusión, pueden ser administradas a animales como inmunógenos o antígenos, solos o en combinación con un auxiliar, por ejemplo para la producción de anlicuerpos reacíivos con las proteínas SdrF, SdrG o SdrH o sus porciones, tales como molivos de aminoácido de consenso o secuencia variable. Además, las proíeínas pueden ser ulilizadas para clasificar aníicuerpos o aníisueros para pacieníes hiperinmunes de quienes se pueden derivar anlicuerpos específicos teniendo una afinidad muy alia para las proíeínas. Los aníicuerpos para SdrF, -SdrG o SdrH o sus porciones, íales co o : motivos de aminoácido de consenso o secuencia variable, pueden ser utilizados para impartir inmunidad pasiva y son útiles para la detección especifica de proteínas estafilocóxicas negativos a coagulasa, para la prevención de una infección estafilocóxica negativos a coagulasa, para el trafamiento de una infección en progreso o para usarse como herramientas de investigación. El término "anticuerpos" como se utiliza en la presente, incluye anticuerpos monoclonales, policlonales, quiméricos, cadena individual, biespecíficos, símionizados y humanizados, o primatizados, así como fragmeníos Fab, incluyendo los producios de una colección de expresión de ¡nmunoglobulina Fab. La generación de cualquiera de esíos íipos de aníicuerpos o fragmeníos de aníicuerpo es bien conocida por aquellos experíos en la técnica.

Los aníicuerpos monoclonales son generados a través de métodos bien conocidos en la técnica. El método preferido es una versión modificada del método de Kearney y oíros, J. Immunol, 123:1548-1558 (1979), que se incorpora aquí por referencia. En resumen, los animales, tales como ratones o conejos, son inoculados con un inmunógeno en auxiliar, y las células del bazo son cosechadas y mezcladas con una línea de célula de mieloma, íal como P3X63Ag,653. Las células son inducidas para fusión a íravés de la adición de glicol polietilénico. Los hibridomas son químicamente seleccionados colocando en placas las células en un mfedio de selección conteniendo hipoxantina, aminopterina y timidina (HAT). Los hibridomas' son subsecuentemeníe clasificados por la habilidad de producir anticuerpos -monoclonales anti-Sdrf, SdrG. o SdrH. Los anticuerpos de producción de hibridoma son clonados, expandidos y almacenados, congelados para producción fulura. Las íécnicas para la producción de aníicuerpos de cadena individual son conocidos por aquellos expertos en la técnica, y se describen en la patente de E.U.A. No. 4,946,778 y pueden utilizarse para producir anticuerpos de cadena individual para ias proteínas aquí descritas. Se puede utilizar tecnología de presentación de fago para seleccionar genes de anticuerpo teniendo acfividades de unión para SdrF, SdrG o SdrH , o sus porciones antigénicas, tales como motivos de aminoácido de consenso o secuencia variable, de genes amplificados por PCR de infocitos de seres humanos clasificados por iener anticuerpos para colecciones de SdrF, SdrG o SdrH, o naturales. Los anlicuerpos biespecíficos íienen dos dominios de unión de anlígeno, en donde cada dominio esíá dirigido contra un epítopo diferente. Cualquiera de los anticuerpos anteriormeníe descrilos puede ser marcado direcíamenle con una eíiqueía deíecíable para la identificación y cuantificación del estafilococo negalivo a coagulasa. Las efiqueías para usarse en inmunoensayos generalmenfe son conocidas por aquellos experíos en la fécnica e incluyen enzimas, radíoisófopos, y subslancias fluoresceníes, luminiscenies y cromogénicas, incluyendo paríículas de color íales como perlas de oro o de látex coloidales. Los inmunoensayos adecuados incluyen ensayos con inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Aiternafivamente, ios anticuerpos puede ser marcado directamente a través de la reacción con substancias marcadas que tienen una afinidad para inmunoglobulina. El anticuerpo puede ser conjugado con una segunda substancia detecíada con una íercera sybsíancia marcada íendiendo una afinidad para la segunda suosfancia conjugada al aníicuerpo. Por ejemplo, el aníicuerpo puede se conjugado a bioíina y el conjugado de anficuerpo-bioíina detectado utilizando avidina o esíreptavidina marcada. Similarmente, el aníicuerpo puede ser conjugado a un hapíeno y el conjugado de aníicuerpo-hapíeno deíeclado ufilizando el anlicuerpo aníi-hapleno marcado. Esíos y oíros mélodos para marcar aníicuerpos y analizar conjugados son bien conocidos por aquellos experlos en la lécnica. Los anficuerpos para las proíeínas de unión a maíriz extracelular SdrF, SdrG o SdrH, o sus porciones, tales como motivos de aminoácido de consenso o secuencia variable, también pueden ser uíilizados en insíalaciones o laboraforios de producción para aislar canfidades adicionales de las profeínas, íal como a fravés de cromatografía de afinidad. Por ejemplo, se pueden utilizar aníicuerpos para la proíeína de unión a fibrinógeno SdrG para aislar caníidades adicionales de fibrinógeno. Las profeínas, o sus fragmeníos acíivos, y anticuerpos para las proteínas son úíiles para el fraíamienío y diagnosíico de infecciones bacterianas de estafilococo negativos a coagulasa como se describió anteriormente con respecto al método de diagnostico, o para el desarrollo de vacunas de esíafilpcoco negativo a anti-coagulasa, para inmunización acíiva o pasiva. Además cuando se adminisfra 'como una composición farraacéulica a una herida o se uíiliza para cubrir disposilivos médicos o biomaferíales poliméricos, in vitro e in vivo, tanto las proteínas como los anticuerpos son útiles como agentes bloqueadores para evitar o inhibir la unión de estafilococo a coagulasa al sitio de la herida o a los mismos biomaleriales. De preferencia , el aníicuerpo es modificado de manera que es menor inmuhogénico en el pacieníe a quien se le adminisírará. Por ejemplo, su el pacieníe es un ser humano el anlicuerpo puede ser "humanizado" írasplanlando las regiones de deíerminación de complemeníariedad del aníicuerpo derivado de hibridoma a un anficuerpo monoclonal humano como se describe o Jones y otros, Nature 321:522-525 (1986) o Tempesí y oíros, Bioíechnology 9:266- 273 (1991) y como se mencionó aníeriormenfe. Los disposifivo médicos o biomaíeriales poliméricos que serán cubieríos con los aníicuerpos, proíeínas y fragmentos activos aquí descrilos, incluyen, pero no se limilan a, grapas, suíuras, válvulas cardíacas de reemplazo, disposiíivo de asisíencia cardiaca, leníes de coñíacto duros y blando, implantes de lente intraocular (cámara aníerior o cámara posíerior) oíros implantes íales como cubierfas corneas, próíesis de querafo, síenís vasculares, disposiíivos de epiqueralofalia, derivaciones de glaucoma, grapas refinales, curvas escleróíicas, próíesis dentales, dispositivos tiroplásticos, dispositivos laringopláslicos,' injerios vasculares, próíesis. de íejido duras y blandas, incluyendo, pero no limilándose a, dispositivos • eléctricos incluyendo estimuladoras y grabadoras, prótesis para la audición, aparatos cardiocinéticos, laringe ariificiai, implantes dentales, implantes mamarios, implantes de pene, tendones craneales/faciales, articulaciones ra.íifícales, tendones, ligamentos, meniscos, y discos, huesos artificiales, órganos artificiales, incluyendo páncreas artificial, corazones artificiales, extremidades artificiales y válvulas para el corazón; stents, cables, cables guía, catéteres intravenosos y venosos centrales, dispositivos de angioplasíía de globo y láser, dispositivos vasculares y del corazón (tubos, catéíeres, globos), ayuda venlricular, componeníes de diálisis sanguínea, oxigenadores de sangre, disposifivos uretrales/ureteral/urinarios (catéteres de Foley, stents, tubos y globos), catéferes de vías respiraíorias (íubos endoíraqueales y Iraqueoslomía y puños), lubos de alimeníación eníeral (incluyendo * lubos nasogásíricos, inlragástricos y yeyunales), tubos de drenaje de herida, tubos utilizados para drenar las cavidades del cuerpo tales como la pleura, las cavidades perilomeal, craneal y pericardiai, bosas sanguíneas, íubos de ensayo, íubos de recolección de sangre, vacuíainers, jeringas, agujas, pipeías, punías de pipefa y íubería para sangre. Se eníenderá por aquellos experíos en ¡a fécnica que el íérmino "recubierfo" o "recubrimienfo", como se ufiliza en la preseníe, significa aplicar la proteína, anticuerpo o fragmenío acíivo a una superficie del disposiíivo, preferiblemenle una superficie externa que podría ser expuesla a infección estafUocóxíca negativos ß coagulasa, la superficie del dispositivo no necesita ser totalmente cubierta por la proteina, anticuerpo o fragmento activo.

V, Composiciones Farmacéuticas i Las composiciones inmunológicas, incluyendo vacunas y otras composiciones farmacéuticas que contiene las proíeínas SdrF, SdrG o SdrH o sus porciones íales como moíivos de aminoácido de consenso o secuencia variable, esíán incluidas deníro del alcance de la preseníe invención. Una o más de las proíeínas Sdrf, SdrG o SdrH, o sus fragmeníos aclivos o anligénicos, o sus proteínas de fusión, pueden ser formuladas o empacadas, solas o en combinación con otros antígenos, ulilizando mélodos y maíeriales conocidos por aquellos experíos en la técnica de vacunas. La respuesta inmunológica puede ser usada íerapéuíica o profiláclicameníe y puede proporcionar inmunidad de anlicuerpo o inmunidad celular, íal como aquella producida por linfocilos T. Las composiciones inmunológicas, íales como vacunas y oirás composiciones farmacéuíicas pueden ser usadas solas o en combinación con otros agentes bloqueadores para proleger coníra infecciones humanas o animales causadas por o exacerbadas por estafilococo negativo a coaguiasa. En particular, las composiciones pueden ser utilizadas para proteger seres humanos contra endocarditis, síndrome de choque tóxico, ostiomieliíis, epididimitis, ceiulitis o muchas oirás infecciones. Las composiciones también pueden proteger a seres humanos o rumiantes contra mas ititis pausada por infecciones por estafilococo negativo a coagulasa. La vacuna además puede ser utilizada para proteger otras .especies de animales, por ejemplo, animales caninos y equinos, contra infecciones estafilocóxicas negativas a coagulasa similares. Para mejorar ia inmunogeneicidad, las proteínas pueden ser conjugadas a una molécula portadora. Los portadores ¡nmunogénicos adecuados incluyen proleínas, polipéptidos o péptidos iales como albúmina, hemocianina, tirogiobulina y sus derivados, particularmente albúmina de suero de bovino (BSA) y hemocianina de limpeto de agujero (KLH), polisacáridos, carbohidratos, polímeros y fases sólidas. Otras substancias derivadas de proteína o derivadas de no proíeína son conocidas por aquellos experfos en la técnica. Un portador inmunogénico típicamente tiene una masa molecular de por lo menos 1000 daltons, preferiblemente mayor que 10,000 daltons. Las moléculas poríadoras por lo general coníienen un grupo reacíivo para facililar la conjugación covalenie al hapíeno. El grupo de ácido carboxílico o grupo de aminoácidos o los grupos de azúcar de glicoproteínas, por lo general son utilizados de esta manera. Los portadores que carecen de dichos grupos por lo general pueden reaccionar con un químico apropiado para producirlo. Preferiblemente, se produce la repuesfa inmune cuando el inmunógeno es inyecfado a animales íales como raíones, conejos, ratas, cabras, ovejas, conejillos de india, pollos, y otros animales, muy preferiblemente ratones y conejos. Alternafivamente, un péptido antigénico múltiple comprendiendo copias múííiples de la proteína o polípéptido, o un polipéptido anligénica o inmunológicameníe equivaleníe, puede ser suficíeníemeníe aníigénico para mejorar la inmunogenicidad sin el uso de un portador. La proteína SdrF, SdrG o SdrH, o sus porciones, íales como motivos de aminoácido de consenso o secuencia variable, o combinación de proteína, pueden ser administrada con un auxiliar en una cantidad efecfiva para mejorar la repuesía inmunogénica contra el conjugado. En ese momento, el único auxiliar ampliamente utilizado en seres humanos ha sido lumbre (fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio). La saponina y su componenfe preferido Quil A, auxiliar compleío de Freund y oíros auxiliares uíilizados en aplicaciones de invesligación y veíerinarias fienen loxicidades que limiían su uso poíencial en vacunas para seres humanos. Sin embargo, las preparaciones químicamente definidas fales como dipépíído de muramilo, lípido A de monofosforilo, conjugados de fosfolípido, íales como los descrilos por Goodman-Snitkoff y otros, J. immunol. 147:410-415 (1991) e incorporado aquí por referencia, encapsulacion del conjugado dentro de un proteoliposoma como se describe por Miller y otros, J. Exp. Med. 176:1739-1744 (1992), incorporada aquí por referencia, y la encapsulacion de la profeína en vesículas de lípido Novasome™ (Micro Vascular Sysíems, Inc., Nashua, NH) íambién pueden ser ulilizadas. El íérmino "vacuna", como se utiliza en ia preseníe, se refiere a vacunas de ADN en donde la moléculas de ácido nucleico que codifica SdrF, SdrG o SdrH, o. "sus porciones aníigénicas, tales como moíivos de aminoácido de consenso o secuencia variable, en una composición farmacéutica, es administrada a un paciente. Para inmunización genética, los métodos de suministro adecuados conocidos por aquellos expertos en la lécnica ¡ncluyen inyección directa del ADN de plásmido en los músculos (Wolff y oíros, Hum Moi. Geneí. 1:363, 1992), suministro de ADN en complejo con portadores de proteína específicos (Wu y otros, J. Biol. Chem. 264:16985, 1989), co-precipitación de ADN con fosfaío de calcio (Benvenisiy y Reshef, Proc. Naíl. Acad. Sci. 83:9551, 1986), encapsulación de AND en liposomas (Kaneda y otros, Science, 243:375, 1989), bombardeo de partículas (Tang y oíros, Naíure 356:152, 1992 y Eisenbraun y oíros, DNA Cell Biol. 12:791, 1993), e infección in vivo ufilizando vecíores reírovirales clonados (Seeger y •-é -„ *¡" oíros, Proc. Naíl. Acad. Sci. 8:5849, 1984). En oíra modalidad, la invención es un polinucleótido que comprende secuencias de ácido nucleico contiguas capaces de ser expresadas para producir un producfo de gen después de la infroducción de dicho polinucleóíido a íejidos eucariólícos, in vivo. El producto de gen codificado preferiblemente ya sea acíúa como un inmunoesfimulaníe o como aníígeno capaz de generar una respuesía inmune. De esía manera, las secuencias de ácido nucleico en esta modalidad codifican un epítopo inmunogéníco y opcíonalmente una citosina o un elementos co-estimulaníe de célula T, íal como un miembro de la familia de proíeínas B7. Exisíen varías venfajas para la inmunización con un gen en Jugar de su producío de gen. La primera es la simplicidad relativa con ia cual el antígeno nativo o casi nativo puede ser expresado a! sistema inmune. Las proteínas de mamífero expresadas recombinantemente es células de bacterias, de levadura o aún de mamíferos por lo general requiere de íraíamienío exíensivo para asegurar una anfigenicidad apropiada. Una segunda de veníaja de inmunización de ADN es el poíencial inmunógeno para enírar a ia trayectoria de la clase l de MHC y evocar una respuesta ciíoíóxica en ia célula T. La inmunización de raíones con ADN que codifica nucleoproteína de influenza A (NP) produjo una respuesía CD8+ para NP que profegió a los raíones confra el aíaque con cepas heterólogas de influenza (Montgomery, D. L. y oíros, Cell Mol. Biol. 43(3):285-92, 1997 y Ulmer J. y oíros, Vaccine, 15(8):792-794, 1997). La inmunidad mediada por células importante para el control de infecciones. Ya que la inmunización de ADN puede evocar íanfo respuestas humorales como inmunes mediadas por célula, su mayor ventaja puede ser aquella que proporciona un método relativamenfe simple para supervisar un gran número de genes S. epidermidis para su poíencial de vacuna.

VI. Métodos de Administración y Dosis de Composiciones Farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas que contienen ias proteínas .QdrF, SdrG o SdrH o sus porciones, lales como molivos de aminoácido de consenso o secuencia variable, moléculas de ácido nucleico, anticuerpos, o sus fragmentos, pueden ser formuladas en una combinación con un portador farmacéutico tai como salina, dextrosa, agua, glicerol, etanol, oíros compuesíos íerapéulicos y sus combinaciones. La formulación debe ser apropiada para el modo de adminisíración. Las composiciones son úliles para iníerferir con, modular o inhibir interacciones de unión entre esíafilococos negaíivos a coagulasa y flbrinógeno en células huésped. La caníidad de ADN expresable o ARN íranscrilo que será iníroducida a un recepíor de vacuna íendrá una escala de dosis muy alia y puede depender de la resistencia de ios promotores transcripcionales y de íraducción utilizados. Además, la magnitud de la respuesía inmune puede depender del nivel de expresión de proleína y de la inmunoge el producío de gen expresado. En general, las escalas de dosis efecíivas de aproximadamenle 1 ng a 5 mg, 100 ng a 2.5 mg, 1 µg a 750 µg, y preferiblemenle alrededor de 10 µg a 300 µg de ADN se adminislra direclamenfe al íejido muscular. También son adecuadas la inyección subculánea, iníroducción intradérmica, impresión a través de la piel y otros modos de administración tales como intraperiloneal, inlravenosa, o suminisíro por inhalación. También se coníempla que se pueden proporcionar vacunaciones de refuerzo. Después de la vacunación con un inmunógeno de polinucleótido, lambién eslá conlemplado el refuerzo con inmunógenos de proíeína íales como el producto de gen SdrH. •El poilnucleótido puede estar "desnudo", es decir, no asociado a ninguna proteína, auxiliares u oíros ageníes que afecfan ef sisfema inmune del recepíor. En esíe caso, es deseable que el polinucieólido esté en una solución fisiológicamente aceptable, tal como, pero no limitándose, salina estéril o salina regulada en su pH estéril.

Alternativameníe, el ADN puede ser asociado con liposomas, íales como iiposomas de lecitina u otros hposomas conocidos en la íécnica, como una mezcla de ADN-lipoeoma o el ADN puede esíar asociado con un auxiliar conocido en la fécnica para fomeníar respuesfas inmunes, tales como una proteína u oíro poríador.

También se pueden uíilizar ageníes ayudan en la incorporación celular de ADN, íales como, pero no limiíándose, iones de calcio.

Eslos agenfes son generalmeníe denominado en la preseníe como ageníes que faciliían la fransfección y porfadores farmaceúticamenfe acepfados. Las íécnícas para recubrir microproyecíiles cubieríos con polinucleófidos son conocidos en al íécnica y lambién son úíiles con relación a esfa invención. Para el ADN desíinado para uso humano, puede ser úlil lener el producto de ADN final en un portador o solución regulada en su pH farmaceúticamenle aceplable. Portadores o soluciones reguladoras de pH farmaceúticamenfe acepíables son conocidas en la fécnica e incluyen aquellas descriías en una variedad de íexíos íales como Remingíon's Pharmaceuíical Sciences.

Aquellos experfos en la fécnica reconocen que un horario de dosis opfimo para un régimen de vacunación de ADN puede incluir íanío como cinco a seis, pero preferiblemente de tres a cinco o aún muy preferiblemente de una a fres administraciones de ia entidad de inmunización dada a infervalos de ian poco como de dos a cuaíro semanas, o lanío como de cinco a diez años y ocasionalmente aún a intervalos más largos. Los métodos . adecuados de administración de cualquier composición farmacéutica descrita en esta solicitud ¡ncluyen, pero no se limitan a, administración tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal e intradérmica.

Para administración tópica la composición es formulada en la forma de un ungüento, crema, gel, loción, gotas (tal como gotas para ios ojos y gotas para los oídos) o solución (tal como enjuagues bucales). Los vendajes, suturas y aerosoles para heridas o quirúrgicos pueden ser impregnados con la composición. La * m f composición puede íener adifivos convencionales, lales como conservadores, solveníes, para promover la penelración, y emolieníes. Las formulaciones íópicas íambién pueden coníener poríadores convencionales íales como bases de crema o ungüenío, elanol o alcohol oleico. En una modalidad preferida, una vacuna es empacada en una dosis individual para inmunización a través de administración parenteral (es decir, iníramuscular, iníradérmica o subcuíánea) o adminisíración nasofaríngea (es decir, infranasal). La vacuna muy preferiblemeníe es inyecíada ¡nlramuscularmente en el músculo deltoide. La vacuna de preferencia es combinada con un vehículo farmacéuticamente aceptable para facilitar la administración. El "vehículo usualmente es agua o salina, regulada en su pH, con o sin un conservador. La vacuna puede ser liotilizada para ¡a resuspensión en el momento de la administración o en solución. La microencapsulación de la proteína dará una liberación cónírolada. Un número de facfores coníribuyen para ia selección de un polímero particular para la microencapsulación. La capacidad de reproducción de síntesis de polímero y el proceso de microencapsuiación, el costo de los materiales de microencapsulación y proceso , el perfil toxicológico, los requerimienfos para genélica de liberación variable y la compafibilidad físico química del polímero y los anfígenos, iodos son facíores que deben ser considerados. Ejemplos de polímeros útiles son policarbonatos, poliésteres, poliureíanos, poliortoésíeres, poliamidas, poli (D, L-lactida-co-glicolida) (PLGA) y otros polímeros biodegradables. El uso de PLGA para la liberación controlada del antígeno es revisado por Eldridge y otros, CURRENT TOPICS IN MiCROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY, 146:59-66 (1989). La dosis preferida para administración a seres humanos es de aproximadamente 0.01 mg/kg a 10 mg/kg, de preferencia alrededor de 1 mg/kg. Con base en esta escala, se pueden determinar dosis equivalentes para, pesos del cuerpo más pesados. La dosis debe ser ajustada para adecuarse al individuo a quien se le administra la composición y variará con la edad, peso y metabolismo del individuo. •La vacuna además puede contener estabilizadores o conservadores farmaceúticamenfe aceptables, • íales como lirnerosal (2-mercaplobenzoaío-S, de eíilo, sal de sodio de mercurio) (Sigma C-hemical Company, Sí. Louis, MO)! VIL Conjugados de Marca de Proteína Cuando se marcan con una biomolécula o químico detectable, las proleínas de unión de fibrinógeno descriías aquí son úíiles para prspósiíos tales como el diagnostico in vivo e in vitro de infecciones esíafilocóxicas o detección de estafilococo negativo a coagulasa. La investigación de laboraforio iambién puede ser facililada a íravés del uso de dichos conjugados de proíeína-marca Sdr. Varios de íipos de marcas y méíodos para conjugar las marcas a las proíeínas son bien conocido por aquellos experlos en la íécnica. Varias marcas específicas esíablecen más adelanfe. Las marcas son particularmeníe útiles cuando se conjugan a una proteína tal como un anticuerpo o receplor. Por ejemplo, la proteína puede ser conjugada a una radiomarca, tal como, pero no limitándose a, 32P, 3H, 1 C, 35S, O 131l. La defección de una marca puede ser a íravés de méíodos íales como conleo por ciníilación, especíromelría de rayos gama o auloradiografía. También son útiles las marcas bioluminiscentes tales como derivados de luciferina de luciérnaga. La subsíancia bioluminiscente está covalentemeníe unida a la proíeína a fravés de métodos Convencionales, y la proteína marcada es detectada cuando una enzima tal como luclferaza cataliza una reacción con ATP ocasionando que la molécula bioluminiscente emita fotones de luz. ' Para marcar proteínas también se pueden uíilizar fluorégenos.

Ejemplos de fluorógenos incluyen fluoresceína y derivados, ficoeriírina, aio-ficocianina, ficocianina, rodamina, y Rojo Tejas. Los fluorógenos generalmente son detectados por un detector de fluorescencia. La proteína alternaíivamente puede ser marcada con un cromógeno para proporcionar una enzima o marca de afinidad. Por ejemplo, la proteína puede ser biolinilada de manera que eslá puede ser uíilizada en una reacción de bioíina-avidina, la cual fambién puede ser acoplada a una marca tal como una enzima o fiuorógeno. Por ejemplo, la proteína puede ser marcada con peroxidasa, fosfatasa alcalina u oirás enzimas dando una reacción cromogénica o fluorogénica después de la adición de subsfrato. Los aditivos tales como 5-amino-2,3-dihidro-1 ,4-píalazindiona (lambién conocida como Luminol) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) y mejoradores de velocidad tales como p-hidroxidifenilo (también conocido como p- fenifenol) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) pueden ser uíilizados para amplificar enzimas lales como peroxidasa de rábano a íravés de una reacción luminiscenfe; y íambién se pueden ufilizar derívados de dioxeíano luminogeneicos o fluorogénicos de substraíos de enzimas. Dichas marcas pueden ser deíecladas ufilizando inmunoensayos enlazados a enzima (ELISA) o delecíando un cambio de color con la ayuda de un especfrofoíómetro. Además, las proteínas pueden ser marcadas ..con oro coloidal para usarse en r. microscopía de inmoelectronés de acuerdo con los métodos bien «''Conocidos por aquellos expéríos en la íécnica. La ubicación . de un ligando' en las células puede ser delermínada marcando un anticuerpo como se describió .. anteriormente y detecíando la marca de acuerdo con méfodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, tales como microscopia de inmunofluorescencia utilizando procedimientos como aquellos descriíos por Warren y Nelson (Mol. Ceil Biol., 7:1326-1337, 1987).

VIII. Aplicaciones Terapéuticas Además de las composiciones ierapéuíicas y los métodos descritos anteriormeníe, las proíeínas SdrF, SdrG o SdrH, o sus porciones, lales como molivos de aminoácido de consenso o de secuencia variable, las moléculas de ácido nucleico o anticuerpos son útiles para interferir con la interacción física inicial enlre un paíógeno y un huésped mamífero responsable de infección, íal como la adhesión de bacferias paríicularmenfe baclerias Gram-negaíivas, a proíeínas de maíriz exíracelular de mamífero en disposiíivos residentes o a proteínas de mafriz extracelular en heridas; para bloquear la invasión de célula de mamífero mediada por la proteína SdrF, SdrG o SdrH; para bloquear la adhesión bacteriana eníre proleínas de matriz extracelular de mamífero y proteínas SdrF, SdrG o SdrH bacterianas o sus porciones, íales como los motivos de aminoácido de consenso o de secuencia variable, que median el daño del tejido; y para bloquear la progresión normal de patogénesis en infecciones iniciadas más bien por la implantación de dispositivos residentes o técnicas quirúrgicas.

IX. Métodos de Clasificación . Las proteínas SdrF, SdrG o SdrH, o sus fragmentos, tales como motivos de aminoácido de consenso o de secuencia variable, son útiles en un método para clasificar compuestos para identificar compuestos que inhiben la unión de estafilococo negativo a coagulasa a moléculas huésped. De acuerdo con el méíodo, el compuesío de inferes es combinado con una o más de las proíeínas SdrF, SdrG o SdrH, o sus fragmeníos y el grado de unión de la proleína a fibrinógeno u oirás proleínas de matriz extracelular es medido u observado. Si la presencia del compuesto da como resultado la inhibición de la unión de proteína-fibrinógeno, por ejemplo, eníonces el contexto puede ser útil para inhibir estafilococo negativo a coagulasa in vivo o in vitro. El método similarmente puede ser usado para identificar compuestos que promueven interacciones de esíafilococo negalivo a coagulasa con moléculas huésped. El méíodo es paríicularmeníe útil para identificar compuestos que tienen propiedades bacteriosíáficas o bacleriocídicas. Por ejemplo, para clasificar agonisfas o aníagonistas de estafilococo negativo a coagulasa, una mezcla de reacción sintética, compartimienlo celular (fai como una membrana, cubiería celular, o pared celular) coníeniendo una o más de las profeínas SdrF, SdrG o SdrH, o sus fragmenlos, íales como moíivos de aminoácido de consenso o de secuencia variable, y un subsfraío ligando marcado de-la proteína es incubado en ausencia o presencia de un compuesto bajo investigación. La habilidad del compuesto para agonizar' o antagonizar la proteína son mosírados por una disminución en la unión del ligando marcado o producción disminuida del producto de substrato. Los compuestos que se unen e incrementan la velocidad de formación de producto a paríir del subsíraío son agonislas. La deiección de la velocidad o nivel de producción del producfo a parlir del subsírafo puede ser mejorada a íravés del uso de un sisfema de reporte, tal como un substrato marcado colorimétrico convertido al producto, un gen de reporíe que es sensible a cambios en ácido nucleico de SdrF, SdrG o SdrH o acfividad de proíeína, y ensayos de unión conocidos por aquellos expertos en la técnica. También se pueden uíilizar ensayos de inhibición compefifivos. Los antagonistas potenciales incluyen moléculas orgánicas pequeñas, pépfidos, polipépíidos y anlicuerpos que se unen a moléculas o proieínas de ácido nucleico SdrF, SdrG o SdrH o sus porciones lales como molivos de aminoácido de consenso o de secuencia variable, y de esta manera inhiben su actividad o unión a una molécula de unión (íal como fibrinógeno) para evifar la unión de las moléculas o proíeínas de ácido nucleico SdrF, SdrG o SdrH a su ligando. Por ejemplo, un compuesfo que inhibe la acíividad de SdrF, SdrG o SdrH puede ser una molécula pequeña que se une a, y ocupa el siíío de unión de la profeína SdrF, SdrG o SdrH, evitando- asi la un?ón a moléculas de unión celular, para evitar la acíividad biológica normal. Ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no se limiían a, moléculas orgánicas . pequeñas, pépíidos o moléculas de tipo péptido. Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas antisentido. Los antagonislas preferidos incluyen compuestos relacionados con y variantes y derivados de proteínas SdrF, SdrG o SdrH o sus porciones, fales como moíivos de aminoácido de consenso o de secuencia variable. Las moléculas de ácido nucleico aquí descriías también pueden ser usadas para clasificar, compuestos para actividad anfibacteriana.

X. Equipos de Detección para Estafilococo Negativo a Coagulasa La invención además contempla un equipo que contiene una o más sondas de ácido nucleico específico en sdrF, sdrG o sdrH, las cuales pueden ser utilizadas para la detección de estafilococo negativo a coagulasa o proteínas Sdr estafilocóxicas negativas a coagulasa o sus porciones, tales como motivos de aminoácido de consenso o de secuencia variable, en una muestra o para el diagnostico de infecciones estafilocóxicas negativas a coagulasa. Dicho equipo también puede contener los reactivos apropiados para hibridizar la sonda a ia muestra y deteclar la sonda unida. En una modalidad allernafiva, el equipo conliene aníicuerpos específicos para una o más proíeínas SdrF, SdrG o SdrH, o sus porciones de pépfido íales como molivos de aminoácido de consenso o dß secuencia variable, que se pueden ufilizar para la deíección de estafilococo negalivo a coaguiasa. En olra modalidad más, el equipo confiene una o más proteínas SdrF, SdrG o SdrH, o fragmentos activos de las mismas, que pueden ser usadas para la detección de organismos estafilocóxicos negafívos a coagulasa o anticuerpos para proteína Sdr estafilocóxicas negafivas a coagulasa en una muesfra. Los equipos aquí descritos además pueden contener un equipo para obtener con seguridad la muestra, un recipiente para contener los reactivos, medios de confrol de íiempo, un regulador de pH para diluir la mezcla y un colorímelro, reflectómetro, o esíándar conlra el cua! se pueda medir un cambio de color. En una modalidad preferida, los reacfivos, incluyendo la proíeína o anticuerpo son liofilizados, muy preferiblemente en un solo recipiente. La adición de muestra acuosa al recipieníe da como resuliado la solubilización de los reaclivos liofilizados, haciendo que esfos reaccionen. Muy preferiblemenfe los reacíivos son secuencialmente liofilizados en un contenedor individual, de acuerdo con métodos bien conocidos por aquellos experíos en la íécnica que reducen al mínimo la reacción a íravés de los reaclivos anles de la adición de la muesíra.

EJEMPLOS Los siguieníes ejemplos se incluyen para demostrar las modalidades preferidas de la preseníe invención. Se debe apreciar por aquellos experlos en la lécnica que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen .representan técnicas descubiertas por los •inventores para trabajar bien en la práctica de la invención,' y de esta manera se pueden considerar como modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquellos experíos en la íécnica deben, a la luz de la présenle descripción, apreciar que se pueden hacer muchos cambios en las modalidades específicas que se describen y que siguen obteniendo un resultado similar o parecido si apartarse del espíritu y alcance de la invención.

Ir- Ejemplo 1 Identificación de genes que codifican Sdr en estafilococo negativo a coagulasa Se identificaron cinco genes (cl/A, cl/B, sdrC, sdrD, sdrE) en Sthaphylococcus aureus que contienen es ácido aspártico de dipépíido y serina (DS), codificado por un motivo de repetición de 18 bp, GAY TCN GAY TCN GAY AGY, en donde Y=pipmidinas y N = cualquier base. Esta familia de proteínas ha sido nombrada como Sdr para la repetición de serina-ácido aspártico. Todos los 5 genes de S. Aureus s r codifican proteínas que coníienen aspectos que las caracterizan como proteínas asociadas a la superficie en bacterias Gram positivas; principalmente en' el íérmino N existe una señal de Secreción y en el término C exisíen, (i) varios residuos cargados posiíivameníe que sirven como una señal de detención para la secreción de proteína, (ii) una región de íransmembrana hidrofóbica y (iii) una región de expansión de pared con un moíivo LPXTG que es requerido para la clasificación exacía y corregir la orie íación de profeína en la pared celular. Para ideníificar genes novedosos que codifican proteínas de superficie de célula en estafilococo negativo a coagulasa se utilizó la región de codificación de DS de cl/A como una sonda de gen para determinar si existen homólogos dentro de varias especies estafilocóxicas negaíivas a coagulasa. Las especies esíafilocóxicas negaíivas a coagulasa que se caracíerizaron fueron (1) S. lugdunensis, (2) S. haemolyíicus, (3) S. schleiferi y (4) S. epidermidis. Cada sepa se lisia a confinuación. Se obtuvieron diez cepas de cada uno de_ S. epidermidis, S. lugdunensis, S. schleiferi y S. haemolyticus de Jerome Eíienne (Lyon, Francia). Además, la colección de la sepa del Dr. Timolhy Fosíer íuvo cepas S-epidermidis donadas de oíros invesíigadores. Se realizó el análisis de hibridación Soulhern uíilizando ADN genómico aislado de íodas las cepas esíafilocóxicas negaíivas a coagulasa. El ADN cromosómico fue separado con HindlW y ia región de codificación DS de cl/A fue marcada con DIG (Boehringer) y uíilizada como una sonda. El análisis de hibridación Souíhern de las diez cepas de S. lugdunensis reveló que un solo fragmenío Hindlll, de 9 kb, hibridizó a ¡a región de codificación DS de ci/A. Ei análisis de cepas de S. haemolyiicus con la secuencia de codificación DS de ' ' c!/A reveló fragmentos de diferente tamaño. Fuera de las diez cepas probadas, seis cepas proporcionaron una banda de hibridación fuerte de entre 18 kb y 10 kb. La posibilidad existe que más de una región de codificación DS esíá preseníe en el fragmenlo Hind\\\. Después de un exposición más larga del auíoradiograma, ¡as cualro cepas resíaníes mosíraron hibridación débil a ¡a región de codificación DS de ci/A. La sonda cl/A no deíecíó una región de codificación DS en el ADN genómico a paríir de S. schleiferi. Todas las cepas S. epidermidis caracferizadas revelaron por lo menos dos fragmenlos HindlW que hibridizaron a la región de codificación de DS de cl/A. Las cepas probadas fueron: Cepas S. lugdunensis 1. S. lugdunensis N940113 2. S. lugdunensis N940164 3. S. lugdunensis N940135 4. S. lugdunensis N950232 5. S. lugdunensis N920143 6. S. lugdunensis N930432 7. S. lugdunensis N940084 8. S. lugdunensis N940025 9. S. lugdunensis N910319 10. S. lugdunensis N910320 Cepas S. Epidermid 1. S. Epidermid s ATCC14990 (Kloos) 2. S. Epidermid s KH11 3. S. Epidermid s K28 4. S. Epidermid s TU3298 5. S. Epidermid s 9142 6. S. Epidermid s 1457 7. S. Epidermid s 8400 8. S. Epidermid s RP62a 9. S. Epidermid s N910102 10. S. Epidermid s N910173 11. S. Epidermid s N910191 12. S. Epidermid s N910231 13. S. Epidermidis N910249 14. S. Epidermidis N910275 15. S. Epldermidis N950190 16. S. Epidermidis N950329 17. S. Epidermidis N910308 18. S. Epidermidis N910160 Cepas S. haemolyí cus 1. S. haemolyl cus N97061 2. S. haemolyl cus N960512 3. S. haemolyf cus N910106 4. S. haemolyl cus N91024 5. S. haemolyl cus N920160 6. S. haemolyt cus N910287 7. S. haemolyt cus N92018 8. S. haemolyí cus N930100 9. S. haemolyt cus N950252 10. S. haemolyt cus N93016 Cepas S. schleiferi 1. S. schleiferi JCM7430 2. S. schleiferi N920247 3. S. schleiferi N910245 4. S. schleiferi N910017 5. S. schleiferi N960518 6. S. schleiferi N950242 7. S. schleiferi N920162 8. S. schleiferi N92017 9. S. schleiferi N930047 10. S. schleiferi N920260 Homólogos de sdrF en oirás cepas de S. epidermidis Se examinaron 17 cepas de S. epidermidis para ia presencia del gen sdrF a través de hibridación Southern. El ADN cromosómico de ías cepas individuales fue separado con HindiW y se proporcionó una sonda con una secuencia de codificación de región A de sdrF como una sonda. Esta sonda de ADN fue marcada con DIG a través de PCR ufilizando pC5 (descrito más adelante en el ejemplo 2) como una plantilla. El gen sdrF estuvo presente en un fragmento HindlW que varió de 4-10 kb y estuvo presente de 12 de las 16 cepas probadas. La uíilización de la secuencia de codificación de región R de cl/A como una sonda íambién identificó una banda del mismo tamaño indicando que los homólogos de sdrF en otras cepas S. epidermidís lambién contiene la secuencia de codificación de región R.

Homólogos de ^_ sdrG en otras cepas S. epidermidis. Se probaron 16 cepas de S. epidermidis para la presencia del gen sdrG utilizando una sonda designada para la secuencia de codificación de región A de sdrG. El análisis de hibridación Southern reveló que sdrG estuvo preseníe en un fragmenlo de Hind W de 16 kb y esfuvo presente en todas las sepas de S. epidermidís examinadas. La secuencia de iniciador utilizada para la amplificación de la secuencia de codificación de región A de sdrG es como sigue: F1-sdrG: 5' GATGATGAATTATCAGAC 3' R.-sdrG: 5' CAGGAGGCAAAGTCACCTTG 3' (abarcando las coordenadas 195 a 1795 de sdrG).

Homólogos de la región de codificación DS en cepas de S. epidermidis El ADN cromosómico fue separado con Hind\\\ y ia región de codificación DS de cl/A fue marcada con DIG (Boehringer) y se utilizó como una sonda.' El análisis de hibridación Southern reveló por lo menos dos fragmentos Hindítt que hibridizaron a la región de codificación DS de cl/A. 10 cepas hibridizaron a tres fragmentos HindWl.

EJEMPLO 2 Estudios de los genes Sdr en Estafilococo negativo a Coagulas, e identificación, Aislamiento, secienciación y Expresión de SdrF, SdrG y SdrH Resumen Las cepas de Staphylococcus epidermidis pueden expresar tres diferentes proteínas asociadas a la superficie de célula que contiene repeticiones dipeptídicas de serina-asparíaío. Las proteínas SdrF y SdrG son similares en secuencia y organización estrucfural a las proíeínas Sdr de S. aureus. Esías comprenden la región única de los residuos 625 y 548, As en sus íérminos N respecíivameníe, seguido por un número variable de 110-119 repeticiones de región B de residuo una región de repetición SD y molivos LPXTG C-íerminales y dominios hidrofóbicos caracíerísíicos de proíeínas de superficie que esíán covaieníemeníe anclados al péplidogllcano. En conlrasfe, SdrH íiene un región de residuo 60 coría A en el férmino N seguido por una región de repeíición SD, una región C del residuo 277 única, y un dominio hidrofóbico C-íerminal. SdrH carece de un motivo LPXTG. El AD.N que codifica cada regjón A de SdrF, SdrG y SdrH fue clonado en vectores de expresión de E. coii, y la proteína recombtnante fue expresada y purificada. Se produjeron antisueros específicos en •conejos y se utilizaron para identificar las proteínas Sdr expresadas por S. epidermidis. Solameníe SdrF fue liberado de proíoplasíos generados por lisosíafina de células desarrolladas para relrasar la base exponencial. SdrG y SdrH permanecieron asociados con la fracción de proíoplasío y de esía manera no se clasificaron ni enlazaron al péptidoglicano. En el análisis de hibridación Soufhern, los genes sdrG y sdrH esíuvieron présenles en las 16 cepas probadas, mlenfras que sdrF estuvo presente en 12 cepas. Los antisueros de 15 pacientes que se recuperaron de infecciones por S. epidermidis conluvieron anlicuerpos que reaccionaron con la región recombinante As de SdrF, SdrG y SdrH, sugiriendo que estas proteínas se expresan duraníe la infección.

ANTECEDENTES S. epidermidis es un habiíanfe común de la piel humana y una causa frecuente de infecciones extrañas en el cuerpo. La patogénesis se ve facilitada por la habilidad del organismo para adherirse primero a, y subsecuentemeníe formar biopelículas sobre disposiíivos médicos residenfes íales como válvulas artificiales, dispositivos ortopédicos y catéteres de diálisis intravenosos y perifonéales. Las infecciones relacionadas con disposilivos ponen en peligro el éxilo del traíamiento médico e incrementan significativamente la morbidez dei paciente (11). " t La adherencia de S. epidermidis ha superficies sintéíicas ha sido correlacionada íanlo con e! carácíer hidrofóbico de la superficie como las proteínas de superficie de célula (2,3). Se ha mostrado que el traíamienío de proteasa de S. epidermidis reduce el carácter hidrofóbico y adherencia (24), y un anticuerpo monoclonal reactivo a una proteína de superficie de célula de 220 kDa de S. epídermidis fue capaz de bloquear parcialmeníe ¡a unión bacferiana a poliesfireno (30). El polisacárido expresado por el operon ica es crucial en la formación de biopelículas. Un grupo sugirió que el polisacárido adhesina (PS/A) es suficieníe íanío para la adhesión como para la interacción de célula-célula asociada con la fase de acumulación de formación de biopelículas. Otra vista es que la adherencia es mediada por una proleína asociada a la superficie, mieníras que el polisacárido es responsable solameníe de la fase de acumulación (5,12,19). Como S. epidermidis, S. aureus fambién puede adherirse a disposilívos de implantes médicos, pero esta unión predominantemeníe mediada por receptores bacterianos específicos para fibrinógeno y fibronectina que cubren la superficie del biomaíeriales solo jusío después de la implaníación. Las adhesinas de S. aureus que median eslas inferacciones incluyen las proleínas de unión de fibrinógeno, ClfA y ClfB, y tas proíeínas de unión de fibrónectina, FnbpA y FnbpB [revisado en (3)]. Aunque S. epidermidis tiene el potencial de interactuar con fibrinógeno, fibronectina, vitronectina y laminina (6, 25, 29), muy poco se sabe de las adhesinas específicas que median estas interacciones o de cómo estas inleracciones tienen influencia en adherencia bacteriana a biomateriales cubiertos con proteínas huéspedes. La proteína del factor de agrupación de unión de fibrinógeno (o ClfA) de S. aureus (figura 1 A) se distingue por la presencia de una región de dipéptido-asparíato (SD), (denominado como la región R en estudios previos) localizada entre una región A de unión de ligando y secuencias C-terminales y asociadas con la unión a la pared de célula (16,17). La región de repeíición SD se pronosíica que exíiende la pared celular y exliende la región de unión de ligando de la superficie de la bacleria (4). ClfA es el predecesor de la familia de proteína de repetición SD (Sdr) enconirada en S. aureus. Los «ß • 80 miembros adicionales incluyen ClfB (un segundo factor de agrupación de unión de fibrinógeno), las proíeínas SdrC, SdrD y SdrE (Figura 5A) (8,21), SrC, SdrD y SdrE coníienen repeíiciones adicionales, denominadas repeíiciones de región B, localizadas entre las repeticiones de la región A y SD. Cada repetición B tiene una longiíud de 110-113 aminoácidos y coníiene un unión puíaíiva Ca2+, moíivo manual EF. La unión de Ca se ha mosírado que es requerida para inlegridad esfrucíural de las repeíiciones de la región B (9). Las funciones de SdrC, SdrD y SdrE son desconocidas, pero se hipoíetiza que las proteínas interactúan con moléculas de matriz huésped a través de su región As. , Esíe ejemplo describe tres proteínas Sdr expresadas por S. epidermidís. Dos tiene similitud de secuencia con, y ia misma organización esírucfural, como las proteínas Sdr de S. aureus, mientras que SdrH es distinta. Los genes que codifican estas proteínas son prevalentes enfre cepas S. epidermidis. La presencia de aníicuerpos reacíivos a cada región A Sdr en antis?eros de pacientes convalecientes sugiere que las proteínas son expresadas duraníe la infección.

MATERIALES Y MÉTODOS Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento Se utilizaron E. coli XL-1-Blue o JM109 como cepas huéspedes. Las cepas de células XL-11-blue o TOPP 3 (Straíagene, La Jolla, CA) * tt w se uíilizaron para la expresión de proíeína. Las bacíerias por rufinas se desarrollaron en caldo de Luria o agar (Gibco BRL, Gaiíhersburg, MD) suplementado con 100 µg mi"1 de ampicilina (USB, Cleveland, OH). Se desarrollaron de S. epidermidis (cuadro 2) en caldo de soya trípíica (TSB) o agar (TSA) (Difco, Detroií, Mi).

Clonación y secuencia de ios genes sdr El gen sdrF fue clonado a parlir de la cepa 9491 de S. epidermidis. Se aislaron fragmentos de ADN-H/n ill con una longitud variando de 6.5 a 7.5 kb de un gel de agarosa y se ligaron a un vecíor de clonación pBluescripí SK+ (Slraíagene) digerido con Hindi y traíado con fosfalasa alcalina de inlestino de becerro (CIAP) (Promega, Madison, Wl). Un plásmido recombinante , pC5, fue identificado a través de clasificación de PCR (27) con iniciadores dirigidos hacia el ADN que codifica la región de repetición SD de ClfA (iniciadores P3 y P4). El gen sdrG fue clonado en una colección de ?Gem®-11 de la cepa K-28 de S. epidermidis generada con el ADN que fue parciaimenie digerido con Sau3A y ligado en los brazos de sifio medio de Xhol de ?Gem®-11 (Promega). Después de empacar, se ideníificó fago positivo, designado como E6-12 a través de hibridación de una sonda de ADN represeníando la región de repeíición SD de ClfA. Un fragmenío de ADN Sacl-Kpnl de E6-2 después fue sublconado en el vecíor de plásmido de E. coli, pZero (Inviirogen, Carisbad, CA): Esfe clon después fue trazado en un mapa con endonucleasas de reslricción, y se subclonó un fragmenlo de EcoRI- nl de 3.5 kb coníeniendo ADN con homología a aquella que codifica aminoácidos de repeíición SD como secuencia a pUC18 (Amersham, Pharmacia Biolech, Piscaíaway, NJ) para crear pE6-2- El gen sdrH fue clonado como sigue. Los fragmeníos de H/ndIII obtenidos de ADN genómico de la cepa 9491 de S. epidermidis fueron fraccionados por tamaño en un gradiente de sacarosa al 5-20%. El ADN de las fracciones coníeniendo fragmentos de 1.5-2.5 kb fue ligado al pBluescript digerido con Hindi y desfosforilado con CiAP (Promega). Los transformantes de E, coli conteniendo ios productos ligados fueron clasificados a través de hibridación de colonia-tinción con una sonda marcada con DIG (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) hecha para el ADN que' codifica ia región de repetición SD de ClfA. Se realizó la secuenciación de didesoxy-ADN automática en ambas estructuras de cadena del ADN clonado. En la mayoría de los casos, se logró la extensión de la secuencia de ADN en un clon dado con el camino del Iniciador. Sin embargo, esíe méfodo no puedo cubrir la longitud del ADN de repetición que codifica que ias repeticiones SD de SdrF. Por lo tanfo, esía región de ADN fue separada de pC5 con Sau3A ligada a pBluescripí, y ufilizada como una plantilla para la construcción de derivados de eliminación de exonucieasa. (Erase-a-base System, Promega). Se identificaron eliminaciones apropiadas en ambas eslructuras de base (no mostradas) a través de clasificación medianíe PCR y formación de mapa de resíricción.

CUADRO 2 CEPAS DE S. epidermidis UTILIZADAS EN ESTE ESTUDIO Fuentes y Cepas Comentarios y propiedades referencias 9491 Cepa de prototipo SdrF y SdrH Cepa ATCC ATCC14990 Cepa de referencia W. Kloos KH11 P. Vaudaux K28 Cepa del prototipo SdrG P. Vaudaux RP62a TU3298 Cepa transformable F. Gotz 9142 Formador de biopelícula O. Mack I 457 Q, Mack 8400 N910308 Cepa de referencia, Lyon, Francia J. Etienns N910160 Cepa de referencia, Lyon, Francia J. Etienne N910102 Cepa de referencia, Lyon, Francia J. Etienne N910173 Cepa de referencia, Lyon, Francia J. Etienne N910191 Cepa de referencia, Lyon, Francia J. Etienne N910231 Cepa de referencia, Lyon, Francia J. Etienne N910249 Cepa de referencia, Lyon, Francia J. Etienne «? CUADRO 3 INICIADORES UTILIZADOS EN LA AMPLIFICACIÓN MEDIANTE PCR PARA SONDAS DE ADN Y CONSTRUCCIONES DE EXPRESIÓN DE PROTEINA na: no aplicable subrayado: sitio de endonucleasa de restricción utilizado para la clonación.

Hibridaciones Southern Se han descrito en cualquier punto (8) íransferencias e hibridaciones de tinción Southern. Se hicieron sondas de ADN a paríir de productos de PCR que codifican la región de repetición SD de ClfA o cada región A de SdrF, SdrG o SdrH (cuadro 3). Los productos de PCR fueron generados con polimerasa de ADN de Taq (Gibco BRL), y las sondas fueron marcadas con digoxigenina (Boehringer Mannheim) o fluoresceína (Amersham).

Expresión y purificación de la proteína para la producción de antisueros. Se obíuvo el ADN que codifica' ia región A de SdrF, SdrG o SdrH recombinaníe a íravés de amplificación de PCR del ADN de plantilla genómica a partir de las cepas 9491 o K28 de S. epidermidis con iniciadores apropiados (cuadro 3). La construcción de la región A SdrF que careció del residuo terminal, prolina. La PCR utilizó poiimerasa de ADN Pfu (Sfraíagene); las especificaciones han sido previameníe descriías (7). Los producios de PCR fueron digeridos endonucleasas de resíricción apropiadas y ligados a vectores de expresión pQE30 (Qiagen, Valencia, CA) para generar proteínas etiquetadas con histidina o pGEX-2T (Pharmacia), o pGEX-KG para generar proteínas etiquefadas con GST. Las proteínas se expresaron en E. coli desarrollando 4 litros de organismos recombinantes a una densidad óptica (OD600) de 0.5 e incubando con 0.3 mM de isopropil-1-tio-ß-D-galactosida (IPTG) (Gibco BRL) durante dos horas. Las células fueron cosechadas en PBS (150 mM NaCI, 4.3 mM Na2HPO4, 1 mM NaH2PO4) y se congelaron a -80°C. Se hizo pasar E. coli a íravés de una prensa francesa y los sobrenadanfes de esíos lisaíos fueron filírados a íravés de una membrana de 0.45 µm. Las profeínas eíiquefadas con hisíidina solubles, presenfes en los sobrenadanfes, inicialmeníe fueron purificadas a través de cromatografía de quelaíación de mefal. Los sobrenadaníes fueron aplicados a una columna de quelaíación de HiTrap cargada con 5 ml Ni2 (Pharmacia Biofech Inc,) y las proíeínas unidas fueron eluidas con 200 ml de gradienles lineales de mM imidazql en 4 mM Tris-HCl, 100 nM NaCI, pJ 7.9 a una velocidad de flujo de 5 ml/minulo. Las fracciones conteniendo proleínas recombinantes se identificaron a través del SDS-PAGE (ver más adelante) se combinaron y se diaiizaron contra 25 nM Tris-HCl, Ph 8.0. Las proteínas dializadas fueron concentradas y además purificadas a través de cromatografía de intercambio de ion aplicando las muestras a una columna de HiTrap Q de 5 ml (Pharmacia Bíotech inc.) y eluyendo las proteínas unidas con 200 mi de gradientes lineales de 0-0.5 M NaCI en 25 mM TrisHCl, pH 8.0 a una velocidad de flujo de 5 ml/minuto. Las fracciones conteniendo las proteínas recombinantes purificadas fueron identificadas a íravés de SDS-PAGE. Las proteínas etiquetadas con GST fueron purificadas dé lisatos de E. coli obtenidos como se describió anteriormente. Los lisatos se hicieron pasar a través de columnas de 10 ml de glutationa-agarosa bajo flujo de gravedad y se lavaron con cinco volúmenes de columna de PBS. Las proteínas fueron eludías de las columnas con la 5 mM de glutationa recibida recientemeníe preparada (Sigma) en 5o nM de Tris-HCl, pHd.O. Se utilizaron proteínas purificadas para incrementaron los antisueros en conejos blancos de Nueva Zelanda utilizando protocolos estándares emiíidos por HTI Bioproducís (Romano, CA) o por Biological Core Faciliíy en Naíional Universiíy of Ireland (Dublín, Irlanda).

SDS-PAGE y transferencia de tinción Western SDS-PAGE utilizó geles de tricina conleniendo acrilamida la 10% (28). Las proíeínas separadas fueron fransfecíadas a la membrana PVDF (Immobilon-P, Millipore, Bedford, MA) con unn célula de íransferencia semiseca (Bio-Rad Laboraíories, Hércules, CA). Todas las muesíras de proíeína fueron desnaíurallzadas con calor bajo condiciones de reducción. Las proíeínas purificadas (I µg cada una) fueron sometidas a SDS-PAGE y se tiñeron con azul brillante de Coomassie. Los lisatos de E. coli o fracciones de lisato fueron obtenidas como sigue: IPTG inducido, E. coli recombinaníe, se desarrollaron a un ODßoo de 2.0, se lavaron y se volvieron a suspender a un volumen original en PBS y se prepararon para SDS- PAGE. Se cargaron 10 µl de cada preparación en cavidades individuales de geles de acrilamida. Se desarrollaron cepas de S. -epidermidis en la fase esfacionaria íemprana en TSB coníeniendo 1.25 U por 10 ml del inhibidor de endoproíeinasa a2-Macroglobulina (Boehringer Mannheim). Las células fueron ajusfadas a un OD6oo de 2, se lavaron, se volvieron a suspender en la milad del volumen original. Los inhibidores de proteasa (4 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 mM de N-etil-maeimida, y 25 mM de ácido aminohexanóico), y DNAse (10 µg mi"1) se agregaron aníes de la lisostafina (100 µg mi"1) y lisocima (100 µg mi"1). Se realizaron digestiones enzimáficas duraníe 30 minuíos a 37°C con agitación. La separación de proteínas de pared celular de protoplasfos utilizó las mismas condiciones en presencia de rafinosa al 30%. Los lisatos de S. epidermidis o fracciones de lisato se trafaron como aquellos para E. coli y se colocaron alícuoías de 30µl de las muesfras en las cavidades de geles de acrilamida. ínmunoensayos Se realizaron inm?noensayos Wesíern como sigue: las tinciones Wesíern fueron incubadas en PBS conteniendo 1% de leche seca sin grasa durante una hora. Las tinciones después se incubaron coh aníisueros (diluidos en PBS-leche) duranle una hora. Se diluyó el aníicuerpo anti-histidina monoclonal (Clonetech, Palo Alto.CA) a una 1:3000. Se diluyeron los antisueros anti-SdrFA (inmune, preinmune y antígeno-absorbído) a 1:30,000, se diluyeron anlisueros aníi-SdrGA a 1:2,000, y se diluyeron antisueros anti-SdrHA a 1:1000. Las absorciones de antisueros se describieron previamente (14). En resumen, los antisueros anli-SdrFA y aníi-SdrGa fueron extensameníe absorbidos, respecfivameníe, con proíeínas SdrGA y SdrFA etiquetadas GST presentes en fracciones insolubles de E. coli inducido a las que se les aplicó sonido y después se centrífugo. Este procedimienío se útil izó para remover anticuerpos de reacción cruzada poíenciales presentes en cada antisuero. La remoción de los anticuerpos anti-SdrFA, -SdrGA y -SdrHA inmunoreacíivos se logró absorbiendo cada aníisuero con lisafos de E. coli conleniendo, respectivameníe, SdrFA, SdrGA, y SdrHA etiqueíadas GST. Después de la incubación de anfisueros, ias íinciones Wesíern se lavaron fres veces con PBS y se incubaron con una dilución de 1:2000 de IgG de anticonejo o antiraíón de cabra, conjugada a fosfaíasa alcalina (BioRad Laboraíories) duraníe 30 minutos. Las tinciones después fueron lavadas y reveladas en un subsfraío cromogénico (150 µg ml"1 sal de p-toluidina de fosfaío de 5-bromo-4-cloro-3-indoli!o y 300 µ mi"! cloruro de íetrazolio de azul de p-nitro en regulador de pH de bicarbonatos) (Bio-RadX-durante 10-15 minutos. - Se describió previamente (1) la reactividad de SgG de paciente convaleciente para proíeínas recombinantes. Los antisueros de 15 individuos recuperados de infecciones por. S. epidermidis se recolectaron y se purificó la IgG utilizando cromafografía de proíeína-A sepharose. Se utilizó- un ensayo con inmunoabosrbente enlazado enzima (ELISA) para demostrar la reactividad de IgG (2µg por cavidad) para proteínas recombínaníes (2 µg por cavidad de SdrFA o SdrGA, etiquetada con histidina, o SdrHA eíiqueíada con GST) colocada como cubiería en placas de microíiiulación.

RESULTADOS Identificación de los genes sdrF, sdrG y sdrH El análisis de hibridación Southern preliminar de ADN de S. epidermidis reveló la presencia varios siíios de hibridación con ADN que codifica las repeliciones SD de la familia de proíeína Sdr de S. aureus (observaciones no publicadas). Para definir adicionalmeníe esíos sitios, se clonaron tres fragmentos de ADN a partir de las cepas 9491 y K28 de S, epidermidis. Se obtuvieron dos clones, pC5 y pC28, a partir de la cepa 9491 a través de ligación directa de fragmentos de ADN-H/ndlII a vectores de plásmido de E. coli. Un tercer clon, E6-2 se obtuvo de una colección genómica ?Gem®-1 i hecha de cepa K28. Un segmento del inserto del ADN de inserto E6-2 fue subclonado en un vector de plásmido de E. coli para formar pE6-2, pC5, pE6-2, y pC28 se encontró que tiene insertos de ADN de 6.8, 6.02.0 kb respectivameníe (no moslrado). El análisis de secuencia de ADN reveló la presencia de marcos de lecíura abieríos individuales (ORF) en cada plásmido. Los ORFs, designados, sdrF, sdrG y sdrH, y íuvieron una longitud de 5199, 2793 y 1461 pares de base (dp) respectivameníe. Una leucina, en un lugar de una metionia, como codón, fue pronosíicado para codón de inicio de traducción para sdrG. Un sitio de unión de ribosoma potencial (GGAG) se identificó como 5' de 7-12 dp de cada ORF. La secuencias de ADN de 500-1000 dp flanqueando los marcos de lectura abieríos de sdrF, sdrG y sdrH no fueron similares, sugirieron que no se enlazaron en íandem como los genes sdrC, sdrD y sdrE de S. aureus (dafos no mosírados).

Las secuencias de aminoácidos deducidas de SdrF, SdrH y SdrH La organización estructural del aminoácido de las proteínas de SdrF y SdrG de S. epidermidis son similares a las proteínas de Sdr de S. aureus y de esta manera íiene caracíerístícas íípicas de superficie de células que esfán covalentemente ancladas al péptídoglicano de bacferia Gram posiíivas. Esías caracíerísticas de superficie de célula ¡ncluyen residuos positivamente cargados en el término C exlremo precedido por una región de expansión de membrana hidrofóbica y un motivo LPXTG. Las regiones de repetición SD están localizadas N-termnales del motivo LPXTG y se propone atravesar la pared celular (4, 10). SdrF y SdrG , contienen secuencias se señal pronosticadas en sus términos N (52 y 50 residuos, respectivamenfe) y los residuos asociados con el enlace de pared de célula en sus lérminos C (figuras 5B, 5C) Las regiones de repefición SD de SdrF y SdrG (ver más adelante) finalizan de siete y frece residuos respecíivameníe, cerca de los moíivos LPXTG, Las regiones de repelición SD de SdrF y SdrG coníienen 558 y 56 residuos, respecíivamenfe (figura 5B). La composición de dipépfido de SdrG no diverge de serina y asparíalo, mienlras que el SdrF ocurren 26 residuos de alanina deníro de la región de repeíición SD. Las masas moleculares pronoslicadas de las profeínas maduras ( con pérdida de las secuencias de señal) son 179 kDa por SdrF y 97.6 kDa por SdrG. Las proíeínas Sdr de S. aureus cada una posee un dominio de unión aligando esírucíuralmeníe disíinto o putaíivo, en el íérmino N denominada como región A (8, 16, 21). Los íérminos N de SdrF y SdrG maduras poseen la región As de aminoácidos 625 y 548 respecfivamenfe. Las comparaciones en pares revelaron que la secuencias de aminoácido de la región As de Sdrf y Sdrg son 22% idénticas enfre sí y 20-35% ( media = 23%) idéníicas a la región As de las proíeínas Sdr de S. aureus. Se han reporíado molivos de secuencia de aminoácidos en la región As de ¡as proteínas Sdr de A. aureus, y estas incluyen un moíivo manual de EF de unión a Ca2+ putaíivo en ClfA un motivo de MiDAS de coordinación con catión en C!fB, y un motivo de proíeína Sd.r común, TYTFTDYVD, de función desconocida (8, 23). La región As de SdrF y SdrG tanto contiene un motivo TYTFTDYVD como un motivo manual EF (DYSEYEDVTNDDY) que fue encontrado en la región A de SdrG. Tres proteínas de Sdr de S. aureus (SdrC, SdrD y SdrE) contienen números variables de segmentos de 110-113 aminoácidos denominados repeticiones de región B (figura 5A) y cada repetición contiene un motivo manual EF de unión a Ca2+ putativa (8,9). Así mismo SdrF contiene cuaíro repeíiciones de ¡a región B (de 119, 110, 111 y 111 residuos), y SdrG coníiene dos repeíiciones de región B (de 113 y 111 residuos), (figura 5B). Cada repetición contiene un motivo manual EF puíaíivo con una secuencia de consenso de DX(N/D)X(D/N)GXX(D/N/G)XX(E/D). Las repeíiciones de la región B de SdrF y SdrG íiene 43-85 % (media = 55%) de ideníidad eníre sí y 39-73% (media = 54%) de ¡deníidad con las repeficiones de región B enconíradas en las proíeínas Sdr de S. aureus. La organización eslrucíural de SdrG a nivel de secuencia de . aminoácido es consíderablemenfe diferenle que aquella de SdrF y SdrG. Después de una secuencia de señal de 30 residuos poíencial - en su íérmino N, SdrH tiene un estiramienío único de 60 residuos (región A) seguido por una región de repelición SD de 120 residuos y un segmepío de 277 residuos, región C, que coníiene una secuencia . hidrofóbica en su lérmino C, pero carece de molivo LPXTG 'apropiadamente colocado. La secuencia LGVTG, sin embargo, ocurre ' - -. ! dentro de la región • hidrofóbica. (figuras 1B, 1C). Sdr no, contuvo .. ' ninguna repetición de- la región B. La región A y la región C de SdrH no tienen similiíudes de secuencia de aminoácido con oirás proíeínas Sdr conocidas o secuencias, de proíeína de las varias bases de datos. No se encontraron molivos comunes a oirás proteínas Sdr. La masa molecular madura de SdrH se pronosticó para ser 50.5 kDa. En conjunto, esios resultados sugieren que S. epidermidis tiene a capacidad de expresar dos proteínas relacionadas con la familia i de proteína Sdr de S. aureus, así como una lercera proteína Sdr con estrucíura novedosa.

Distribución de sdrF, sdrG y sdrH, en cepas de S. epidermidis En análisis de hibridación Southern, una sonda de ADN representado la región de codificación de las repeticiones SD de CIfA hibridizó a varios fragmentos H/pdlII genómicos en dieciséis cepas de S. epidermidis (figura 6A). Se observaron tres fragmentos de hibridación en la mayoría de las cepas, presumiblemeníe represeníando los genes sdrF, sdrG y sdrH. Para confirmar esto y determinar la frecuencia de los genes denfro de esías cepas, se realizaron análisis adicionales con sondas específicas para ADN que codifica cada región A. Las sonda sdrH hibridizó a fragmenío de eníre 1.8-6.5 kb en fodas las cepas (figura 6B). La sonda sdrG hibridizó un fragmenío de 16kb en todas cepas examinadas (figura 6C). Además, la sonda hibridizó a fragmenlo de H/ndl!¡ de 3.4 kb en cuatro de las dieciséis cepas (KH11, K28, RP62a, y N910102). Sin embargo, los mismos fragmentos de 3.4 kb no hibrrdizaron con una sonda especifica para ADN codificando repeticiones de SD (figura 6A), sugiriendo la presencia de un gen con similitud a la región A sdrG que carece de una región, de repetición SD. La figura 6D muesíra una íinción Souíhern- con la sonda íanfo con el ADN de región A sdrF. La sonda sdrF híbridizó a fragmeníos de H/'pdlIl-ADN de eníre 4.5 kb y 10 kb en doce de las dieciséis cepas (cepas K28, RP62a, N910173 y N910191 carecieron de una banda de hibridación), Eslos resullados sugieren que los genes sdrF, sdrG y sdrH son prevaleníes en cepas de S. epidermidis.

Expresión de SdrF, SdrG y SdrH en S. epidermidis Se ufilizaron métodos inmunológicos para determinar si SdrF, SdrG y SdrH se expresaron por S. epidermidis. Se produjeron anfisueros de conejo específicos para profeínas de fusión recombinantes representando difereníes regiones As (designadas como SdrFA, SdrGA y SdrHA). Se fusionaron SdrFA y SdrGA ha polistidina (Hisn), y SdrHA se fusionó A gst (figura 7A). Es carácter monoespecífico de los anficuerpos se confirmó conlra un panel de proíeínas recombinaníes coníeniendo difereníes fusiones de proíeína. Específicameníe, los anticuerpos se desarrollaron para Hisn. SdrFA y -SdrGa no lo hizo respectivameníe, reaccionaron en forma cruzada con GST-SdrGA y -SdrFA (figura 7B). Además, esíos mismos anfisueros no reaccionaron en forma cruzada para GST-SdrHA (figura 7B). Los aníicuerpos desarrollados para GST-SdrHA reaccionaron para una proteína de longifud complefa Hisn-SdrH pero no para ias proíeínas Hisn-SdrFA o -SdrGA (figura 7C). Los anticuerpo específicos de la región A fueron utilizados para identificar SdrF, SdrG y SdrH nativas en lisatos de sus cepas S. -epidermidis consanguíneas a íravés de inmunolinción Weslern. El aníisuero aníi-SdrFA reaccionó con una banda de aproximadamenle 230 kDa de la cepa 9491 (figura 8A). Esla banda no estuvo presente con las tinciones Western que reaccionaron con anlisuero preinmune o aníísuero aníi-SdrFA que fue absorbido con lisalos de E. coli expresando una proteína de fusión de GST-SdrFA (figura 8A). El antisuero aníi-SdrGA reaccionó con una banda de 170 kDa en un lisafo con la cepa K28 de S. epidermidis. Esía banda no esluvo pres.enfe en el aniisuero preinmune o con el anlisuero anfi-SdrGa que había sido absorbido con un lisato de E. coli expresando ia proíeína de fusión GST-SdrGA (figura 8B). El aníisuero para SdrHa reconoció una banda 75 kDa en la cepa 9491, y esía reacíividad pudo ser removida absorbiendo el aníisuero con SdrH recombinanfe preseníe el un lisaío de E. coli (figura 8C). Las masas moleculares apareníes de las bandas inmunoreacíivas anti-SdrFA, -SdrGa y -SdrHA son mayores que ias masas pronosticadas de la secuencias de aminoácido deducidas (179, 97, y 50 kDa, respectivamente). Previamente se observó la migración reducida en SDS-PAGE para dos proteínas de Sdr de A. aureus, CIfA y ClfB, en donde hasta un 50-100% de incremento en la masa pronosticada fue observado. La naíuraieza acida de las profeínas Sdr fue sugerida para represeníar estas observaciones.

Diferencias en masa molecular de SdrH en cepas de S. epidermidis -El análisis de inmunotinción Wesíern, diferepíes cepas de S. epidermidis poseyeron SdrH con masas moleculares aparenfes que variaron de 60 y 75 kDa (figura 9A). Previameníe se correlacionaron las variaciones en la masa molecular de CIfA con la longiíud de la región de repeíición SD (15). El análisis de PCR de los genes sdrH de la cepas de S. epldermidis usados anferiormeníe, revelaron que las variaciones en el tamaño de ADN que codifica las regiones de repetición SD se correlacionaron con las diferentes masas de las proteínas SdrH o tinciones Western. En contrasle, los producios de PCR del ADN que codifica la región C de cada SdrH fueron similares en tamaño (figura 9B).

Análisis de SdrF, SdrG y SdrH en extractos y protoplastos de pared celular La presencia de un motivo LPXTG tanlo en SdrF como SdrG sugieren que esíos proteínas están ancladas en la pared celular y, por lo íanío, podrían esfar preseníes en exíracíos de pared ceiular de S. epidermidis fraíada con lisostafina. Los análisis de tinción Wesíern de la fase fija íemprana, la cepa 9491 de S. epidermidis digerida con iisostafina con antisuero anti-SdrFA reveló la presencia de la banda SdrF de 230 kDa íanfo en el lisato de célula entera como en el exíracío de pared celular, pero no en ia fracción de protoplasto (figura 10A). En contrasíe, el análisis de ¡as mismas muesíras con antisuero anti-SdrGA reveló que la presencia de SdrG (170kDa) en e lisato y fracción de proíoplasfo pero no el exíracfo de pared celular (figura 10B). Se observaron resulíado similares con tinciones contendiendo la cepa K28 tratada con lisostafina (no mostrado). Otro análisis de las fracciones de lisosíafina 9491 con el anfisuero anti-SdrHa revelaron una banda inmunoreactiva tanto en el lisato de pared celular como la fracción de protoplasío (figura 10C). Eslos resulíados sugieren que, bajo esías condiciones in vitro, SdrF es localizado y anclada a la pared celular, y que SdrG (a pesar de su molivo LPXTG) y SdrH ambos están asociados con la membrana citoplásmica o localizado deníro de la célula.

Reactividad de antisueros de paciente convaleciente para SdrF, SdrG y SdrH Recientemente, se ha mostrado que la IgG de pacientes que se recuperan de infecciones por S. aureus reaccionan con la proíeína de unión de fibronectina (FnbpA), sugiriendo que FnbpA es expresada por S. aureus durante infección (1). Aquí, IgG purificada dei antisuero de 15 pacientes que se recuperan de varias infecciones por S. epidermidis, se probó a través de ELISA con la proteínas de la región A SdrF, SdrG y SdrH recombinantes. La figura 11 que IgG de aníisueros de pacieníes íuvo una íiíuíación más alfa para SdrFA, SdrGA y SdrHA comparado con aquella IgG purificada de anlisueros de niños combinados. Las igG de loe pacieníes por lo general es más reactiva con SdrGA y SdrHA, que con SdrFA. Estos resultados sugieren que las proteínas Sdí se expresan durante la infección por S. epidermidis en seres humanos.

DISCUSIÓN Las infecciones por S. epidermidis en seres humanos están asociadas con dispositivos extraños para el cuerpo que quedan rápidamente cubieríos con proíeínas de maíríz cuando se inlroducen en el pacieníe (26). Aunque se han propuesío mecanismos (codificados por el operón ica) para mediar la adherencia y formación de biopelícula sobre superficies de polímero no cubierías, se han definido pobremenfe facíores específicos para mediar la adherencia a superficies cubierías con proíeínas huésped. La presencia de las proíeínas Sdr en S. epidermidis sugiere que S. epidermidis puede unir dispositivo de matriz cubiertos con profeína en una forma similar a S. aureus, que uliliza CIfA y ClfB para mediar la adherencia a disposilivos prostéticos cubiertos con fibrinógeno (21, 31). A este respecto, se ha mostrado que una proteína recombinanfe expresada a paríir del ADN de S. epidermidis clonado y similar a SdrG, para unir fibrinógeno (22). Las proteínas Sdr de S. epidermidis juegan un papel importante en procesos patogénicos además de la adherencia iniciai. Se han propuesío experimeníos que muesfra que la escisión proíolííica de la 'proteína de unión de fibronecíina, Fnbp de ia superficie de S. aureus produce ia proíeína soluble, activa, y esía escisión ha sido propuesla para inciar ia liberación y diseminación de S. aureus de fibroneciina de fase sólida (18). Análogamenle, SdrF y SdrG naíivas experimenlan una rápida degradación en condiciones de cullivo in vitro en ausencia de inhibidores de proíeasa (observaciones no publicadas), y esta proteólisis puede proporcionar un mecanismo a través del cual las bacterias pueden ser separadas del subsíralo. SdrF fracciona con proteína ancladas a la pared celular liberadas a través de la digestión de lisostafina, sugiriendo que esfá présenle sobre la superficie celular. En conlraste, SdrG el cual contiene un motivo de clasificación celular, LPXTG, similar a, SdrF, se enconito solamente en la fracción de protoplasío. La faifa aparente de SdrG en la fracción de pared celular puede verse influenciada por la fase de crecimiento bacteriano o por enzimas proíeolííicas expresadas duraníe varias fases en desarrollo. POr ejemplo, se enconfró que SdrG eslá auseníe o disminuido en lisafos de la cepa K28 en la fase exponencial lemprana. Además, un número de cepas de S. epidermidis desarrolladas en la fase fija posíerior coníuvieron SdrG en exfraclos de pared celular, mieníras que ofras cepas (incluyendo K28 y 9491) coníuvieron solamenle producios de degradación polencial de SdrG (resullados no publicados). Oíros esíudios garaníizan detallar la regulación del anclaje de SdrG la pared celular y la localización en la superficie celular. Similarmente, se requieren de estudios adicional s para SdrH, que contiene características de proteínas de pared celular pero carece de un motivo LPXTG claro. ' Como se mencionó anteriormente, se ha identificado una proteína simiíar a SdrG (designada como Fbe) como una proteína se S. epidermidis capaz de unir fibrinógeno (22), Se reportó que Fbe tiene una región A directamente adyacente a una región de repetición SD, pero no se han descrito estrucíuras similares a las repeticiones de la región B. Se ha encontrado que Fbe contiene dos repeticiones de región B con 99% de identidad de aminoácidos para las repeticiones de la región B de SdrG (resullados no publicados). En la secuencia reportada de Fbe, estas repeticiones comienzan en el aminoácido 601 y finalizan a principio de las repeticiones SD. La región A original de Fbe se reportó que contiene una región de unión de fibrinógeno mínima entre los residuos 269-599. Con respecto a las repeticiones de la región B recientemeníe identificadas, la región de unión de fibrinógeno mínima podría ser colocada en ei extremo del término C de la región A. Esfo es similar para CIfA que conliene una región de unión de fibrinógeno mínima en su íérmino C (McDeviíí, 1995). La región As de Fbe y SdrG son 93% idéníicas en la secuencia de aminoácido, y ias regiones de unión mínimas pronosticadas son 98% idénticas. SdrH es única entre los ocho miembros descrito de la familia de la proteína Sdr (de S. aureus y S. epidermidís) ya que posee una organización del dominio putaíivo divergenle. La posición de la región de repetición SD en el término N, una región novedosa C, y ia falta de secuencias de asociación de pared celular definitivas sugiere que esta proteína funciona en forma diferente que Sdr V?SCRAMMs conocidas. Otros estudios sobre ia • localización bacteriana y unión de ligando potencial SdrH esíán en progreso. Las regiones de repetición SD de SdrF y SdrG represenian ias repeíiciones SD más largas y más corlas (residuos 558 y 56, fespecíivamente) de las ocho proteínas Sdr conocidas. Aunque las repeticiones SD no participan en la unión de fibrinógeno, se encontraron niveles de tipo silvestre de expresión CIfA funcional que requieren de una región de repetición SD con más de 40 residuos (72 residuos desde el fin de la región A ai motivo LPXTG) (4). Esta expansión de aminoácidos fue postulada para extender la pared celular y presentar una región A funcional. Aunque SdrG contiene 73 residuos desde el extremo de las repeíiciones de la región B hacia el moíivo LPXTG, las dos repeficiones de la región B fambién pueden afecíar la esíructura y función de la región A de unión de ligando. El propósito de una región de repetición SD extremadameníe grande en SdrF es desconocida. Dada la ¡níeracción de la región de repeíición SD con la pared celular, las diferencias en longiíud de las regiones de repeíición SD enfre SdrFy SdrG pueden esíar asociadas con las diferencias de localización observadas en las fracciones de pared celular de esías proíeínas. Se han descriío variaciones en la longiíud xle repeíiciones SD en SdrH. La proíeína SdrH de la cepa KH11 (la SdrG más pequeña observada) fue encontrada por análisis de secuencia de ADN y contiene 64 residuos ( resullados no publicados). El papel de las repeticiones SD en SdrH es desconocido pero se especula que esía región, así como oirás proteínas Sdr pueden ser parcialmente asociadas con la pared celular. Los genes que codifican las proteínas Sdr de S. epidermidis están presentes en la mayoría de los aislados clínicos examinados hasta la fecha. Estas cepas fueron aisladas de una amplia escala de enfermedades en pacientes de sitios geográficos diversos. Además, Jos pacientes que se recuperan de una variedad de infecciones por S. epidermidis tienen IgG reactivo a SdrF-, SdrG- y SdrH- en sus antisueros. Se han observado rasgos similares para las 5 proteínas Sdr reportadas de S. aureus [(8,17) y resultados no publicados]. Estos estudios sugieren que las proteínas Sdr son constituyentes importantes en la infección y desarrollo de S. epidermidis. De manera interesante, los sitios con homología para ADN que codifica regiones de repetición SD también son frecuentes en cepas de S. haemolyíicus, S. lugdunensis, y S. iníermedius, esfafilococos adicionales capaces de producir enfermedad en seres humanos y oíros mamíferos (resulíados no publicados).

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proíeína de unión de fibrinógeno, en donde la proíeína de unión de fibrinógeno esíá aislada de Síaphylococcus epidermidis negaíivo a coaguiasa. 2. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proíeína es codificada por la secuencia de aminoácido mostrada en ia Figura

2.

3. El ácido nucleico aislado de acuerdo don la reivindicación 1, que comprende ¡a secuencia mostrada en la Figura 2.

4. Ei ácido nucleico aislado de acuerdo don la reivindicación V, que comprende una secuencia que selectivameníe hibridiza a la secuencia mosírada en la Figura 2.

5. El ácido nucleico aislado de acuerdo don la reivindicación 1, en un vecíor.

6. El vector de acuerdo con la reivindicación 5, en un organismo viviente para la expresión de ácido nucleico aislado.

7. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proíeína de unión de fibrinógeno que esíá asociada a la pared celular, exhibe una unión de ligando dependienle de calión y íiene un moíivo allamenfe conservado del cual la secuencia de consenso es TYTFTDYVD, en donde la proíeína es aislada de Staphylococcus epidermidis negativo a coagulasa.

8. El ácido nucleico aislado de acuerdo don la reivindicación 7, en donde la proteína es codificada por una secuencia de aminoácido seleccionada dei grupo que consiste de las secuencias de aminoácido mosfradas en las Figuras 2-4.

9. El ácido nucleico aislado de acuerdo don la reivindicación 7, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de aquellas secuencias de ácido nucleico mostradas en las Figuras 2-4.

10. El ácido nucleico aislado de acuerdo don ¡a reivindicación 7, que comprende una secuencia que selecíivamenle hibridiza a una secuencia seleccionada del grupo que consisíe de aquellas secuencias de ácido nucleico mostradas en ías Figuras 2-4.

11. El ácido nucleico aislado de acuerdo don ia reivindicación 7 en un vector.

12. ES vector de acuerdo con ¡a reivindicación 11, en un organismo viviente para la expresión dei ácido nucleico aislado.

13. Una proíeína Sdr aislada, recombinante o sintética, ia cual está asociada con la pared celular, se une tanío a fibrinógeno soluble como inmovilizado y unen las cadenas íanío alfa como befa de fibrinógeno.

14. La proleína de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la proíeína tiene una secuencia de aminoácido que comprende la secuencia mostrada en la Figura 2.

15. La proíeína de acuerdo con la reivindicación 13, codificada por un una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia moslrada en la Figura 2.

16. La proteína de acuerdo con la reivindicación 13, codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que selectivamente hibridiza a la secuencia mostrada en la Figura 2.

17. La proíeína de acuerdo con la reivindicación 13, expresada a parfir de un vecfor en un organismo vivienfe, en donde el vecíor tiene una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia mostrada en la Figura 2.

18. Una proteína aislada, recombinaníe o siníélica que está asociada a la pared celular, exhibe unión de ligando dependiente de catión y tiene un mofivo alíameníe conservado de! cual la secuencia de consenso es TYTFTDYVD, en donde la proleína es aislada de Staphylococcus epidermídis negativo a coagulasa.

19. La proteína de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la proteína tiene una secuencia de aminoácido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consisíe de las secuencias de - aminoácido mosíradas en las Figuras 2-4.

20. La proteína de acuerdo con la reivindicación 18, codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada de grupo que consiste de aquellas secuencias de ácido nucleico mostradas en las Figuras 2-4.

21. La proteína de acuerdo con la reivindicación 18, codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia hibridiza selectivamente a una secµencia seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos mosíradas en las Figuras 2- 4.

22. La proteína de acuerdo con la reivindicación 18, expresada a paríir de un vecíor en un organismo vivieníe, en donde el vecíor contiene una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de aquellas secuencia de ácido nucleico mostradas en las Figuras 2-4.

23. La proíeína de acuerdo con la reivindicación 13 en un vehículo farmaceúíicameníe acepíable.

24. La proteína de acuerdo con la reivindicación 18 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

25. La proíeína de acuerdo con la reivindicación 13, inmovilizada sobre una fase sólida. <

26. La proíeína de acuerdo con la reivindicación 18, inmovilizada sobre una fase sólida.

27. Un anticuerpo y antisuero producidos contra la proteína Sdr en donde la proíeína esfá asociada a la pared celular, y se une íanío al fibrinógeno soluble como inmovilizado.

28. En anlicuerpo y aniisuero producidos conlra una proteína que está asociada a la pared celular, y exhibe unión de ligando dependieníe de calión y liene un mofivo allamenfe conservado a paríir del cual la secuencia de consenso es TYTFTDYVD, en donde la proíeína es aislada del Síaphylococcus epidermidis negaíivo a coagulasa.

29. Un equipo de diagnósfico que comprende una proíeína Sdr, en donde la proíeína esíá asociada a la pared celular, y se une lanío al fibrinógeno soluble como inmovilizado.

30. Un equipo de diagnósíico que comprende la profeína que esíá asociada a la pared celular, exhibe unión de ligando dependienle de caíión y liene un motivo altameníe conservado, del cual la secuencia de consenso es TYTFTDYVD, en donde la profeína es aislada del Síaphylococcus negalivo a coagulasa.

31. Un equipo de diagnóslico que comprende anlicuerpos reacíivos con una proíeína Sdr que está asociada con la pared celular y que se une tanto al fibrinógeno soluble como al inmovilizado.

32. El equipo de diagnóstico que comprende anticuerpos reactivos con una proteína que está asociada a la pared celular, exhibe unión de ligando -dependiente de catión y tiene un motivo altameníe conservado del cual la secuencia de consenso es TYTFTDYVD en donde la proteína es aislada de Staphyiococcus negativo a coagulasa. • .

33. Un equipo de diagnósfico que comprende Sdr la cual esíá -asociada a la pared celular y que se une fanío al fibrinógeno soluble como inmovilizado.

34. Un equipo de diagnóstico que comprende una proteína que está asociada a la. pared celular, exhibe unión de ligando ' dependiente de caíión y íiene un molivo alíameníe conservado del cual la secuencia de consenso en TYTFTDYVD, en donde la proíeína es aislada de Slaphy.lococcus epidermidis negaíivo a coagulasa.

35. Un méíodo para íraíar una infección esíafilocóxica negativa a coagulasa en un paciente, que comprende administrar al paciente una caníidad suficiente de una composición farmacéutica que comprende una proíeína seleccionada del grupo que consisíe de SdrF, SdrG y SdrH, y sus fragmentos, para inhibir la unión de fibrinógeno.

36. El método de acuerdo con la reivindicación 35, en donde la infección es septicemia, osteomieliíis o endocardifis.

37. Un méfodo para prevenir una infección eslafilocóxica negaíiva a coagulasa en u pacieníe, que comprende adminisírar al pacieníe una caníidad suficieníe de una composición farmacéuíica que comprende una proíeína seleccionada del grupo que consisíe de SdrF, SdrG y SdrH, y sus fragmeníos, para inhibir la unión de estafilococo negativo a coaguiasa a fibrinógeno. .

38. Un método para prevenir una infección estafilocóxica negativa a coaguíasa en paciente que comprende administrar la paciente una cantidad suficiente de una composición farmacéutica que comprende anficuerpos a una proleína seleccionada de! grupo que consisle de SdrF, SdrG y SdrH y sus fragmentos, para inhibirla en la unión del estafilococo negativo a coagulasa a! fibrinógeno.

39. Un método para reducir la infección estafiiocóxica negativa a coagulasa de un dispositivo médico residente, que comprende cubrir el dispositivo médico con una composición comprendiendo una proteína seleccionada del grupo que consisle de SdrF, SdrG y SdrH, y sus fragmentos.

40. El método de acuerdo con la reivindicación 39, en donde el dispositivo médico se selecciona del grupo que consiste de injertos vasculares, stenls vasculares, catéteres intravenosos, válvulas artificiales para el corazón, y dispositivos de ayuda cardiaca.

41. Un método para inducir una respuesta inmunológica, que comprende administrar a un paciente una composición que comprende una proteína seleccionada del grupo que consiste de SdrF, SdrG o SdrH y fragmentos, subdominios y moléculas de ácido nucleico de la misma.

42. Un método para identificar compuestos que inhiben estafilococo negativo a coagulasa, que comprende combinar el •10 compuesto con u.na proteína seleccionada del grupo que consiste de SdrF, SdrG y SdrH y medir la unión de la proteína a la molécula de unión, en donde el compuesto inhibe esíafilococo negativo a coaau?asa si !a unión a la molécula de unión es inhibida. •15 20 25