NO20181306A1

NO20181306A1 - P-cadherin antistoff

Info

Publication number: NO20181306A1
Application number: NO20181306A
Authority: NO
Inventors: Christopher Todd Bauer; Maureen Jeri Bourner; Melanie Boyle; Gerald Fries Casperson; David William Griggs; Richard David Head; William Dean Joy; Richard Allen Mazzarella; Ralph Raymond Minter; Mark Allen Moffat; Barrett Richard Thiele; Todd Lee Vanarsdale
Original assignee: Pfizer
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2018-10-12
Publication date: 2007-10-25
Also published as: CA2604357C; TW200718712A; PE20061376A1; TWI379838B; KR20070116155A; DOP2006000098A; US7928214B2; CA2763671A1; US7452537B2; AU2006238930A1; US20090118487A1; UY37223A; EP2444421A1; EA012970B1; JP2008538909A; NZ562234A; WO2006114704A3; WO2006114704A2; US8974781B2; US20060240001A1

Abstract

Det beskrives isolerte antistoff eller antigenbindene porsjoner derav som binder til human P-cadherin, samt farmasøytiske sammensetninger inneholdende samme.

Description

P-CADHERIN ANTISTOFF

Denne søknad krever prioritet fra US provisorisk søknad nr.60/675,311 av 26. april 2005, som inkorporeres heri med referanse i sin helhet.

OMRÅDE FOR OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et isolert antistoff og antigenbindende porsjoner derav som binder til P-cadherin, og en farmasøytisk sammensetning omfattende samme.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Cadheriner er en superfamilie transmembranglykoproteiner som regulerer celle-celle adhesjon under utvikling og vevhomeostase (Gumbiner J. Cell. Biol., 148:399-404 (2000); Yagi, et al., Genes Dev., 14:1169-1180 (2000)). De intracellulære domer av cadheriner interagerer med cytoplasmiske proteiner så som cateniner og p120, som danner basis for cadherintilfesting til aktin cytoskjelettet. Cadheriner har fem ekstracellulære ca<2+>-bindende domener og et lite cytoplasmisk domene som er sterkt konservert blant de klassiske cadheriner. Medlemmer av den klassiske cadherinfamilien inkluderer P-cadherin, E-cadherin og N-cadherin. Cellulære adhesjonsmolekyler så som cadheriner vurderes å spille en betydelig funksjon i de cellulære forbindelser av cancer og metastatiske celler (Furukawa, et al., Microscopy Res. Technique 38 (4):343-352 (1997)). P-cadherin ekspresjon i normalt voksent vev er lav og er begrenset i hovedsak til myoepitelceller og det basale sjikt av stratifisert epitelium(Shimoyama, et al. Cancer Res.49:2128-33 (1989)). P-cadherin opp reguleres i inflammatoriske tarmsykdommer så som Crohn’s sykdom og kolitt (Hardy, et al., Gut 50:513-519 (2002)). En stor mengde bevis viser nå også at avvikende P-cadherin ekspresjon er assosiert med celleproliferasjon og med tumorer i tarmen, bryst, lunge, tyreoid og livmorhals (Gamallo, Modern Pathology, 14:650-654, (2001); and Stefansson, et al., J. Clin. Oncol.22(7):1242-1252 (2004)). Human P-cadherin ble rapportert å være antigenet gjenkjent av NCC-CAD-299 monoklonalt antistoff rettet mot vulvar epidermoid karsinom (Shimoyama, et al., Cancer Res., 49:2128-2133 (1989)). Modulering av P-cadherin-mediert adhesjon og intracellulær signalering er forventet å resultere i redusert proliferasjon og overlevelse av tumorceller in vivo. Således, i lys av den sentrale funksjon som P-cadherin synes å oppvise i celleproliferasjon og massiv tumorprogresjon, er det ønskelig å generere antistoff mot P-cadherin som kan tilveiebringe en terapeutisk effekt for pasienter med en rekke cancere.

Sammendrag av oppfinnelsen

I et aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse et isolert antistoff eller antigenbindene porsjon derav som binder til human human P- cadherin, karakterisert ved at nevnte antistoff eller antigenbindene porsjon derav omfatter:

a) en VH CDR1 som angitt i SEQ ID NO: 24;

b) en VH CDR2 som angitt i SEQ ID NO: 25;

c) en VH CDR3 som angitt i SEQ ID NO: 27;

d) en VL CDRl som angitt I SEQ ID NO: 38;

e) en VL CDR2 som angitt i SEQ ID NO: 39; og

f) en VL CDR3 som angitt i enhver av SEQ ID NO: 41.

I en utførelse er omfatter antistoffet eller den antigenbindene porsjon derav et VH domene som angitt i SEQ ID NO: 320.

I en utførelse er omfatter antistoffet eller den antigenbindene porsjon derav et VL domene som angitt i SEQ ID NO: 326.

I en utførelse er omfatter antistoffet eller den antigenbindene porsjon derav et VH domene som angitt i SEQ ID NO: 320 og et VL domene som angitt i SEQ ID NO: 326.

I en utførelse omfatter tungkjede konstant region omfatter SEQ ID NO: 344, og hvor lettkjede konstant region omfatter SEQ ID NO: 345; med den forutsetning at den C-terminale lysinenhet i SEQ ID NO: 344 valgfritt er spaltet.

I en utførelse er antistoffet g-194-b09.

I et andre aspekt vedrører oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning, omfattende et antistoff eller antigenbindende porsjon derav, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Det beskrives også et P-cadherin antistoff eller antigenbindende porsjon derav, hvor antistoffet eller den antigenbindende porsjon derav har minst én eller flere funksjonelle egenskaper som beskrevet nedenfor i A) til K).

A) For eksempel, i én utførelse har antistoffene eller de antigenbindende porsjoner derav en større bindingsaffinitet for P-cadherin (KD(P)) enn for E-cadherin (KD(E)). I én utførelse har antistoffene eller antigenbindende porsjoner derav ifølge foreliggende oppfinnelse en KD(E)/ KD(P) som er større enn eller lik 1,5. I en ytterligere utførelse har antistoffene eller antigenbindende porsjoner derav ifølge foreliggende oppfinnelse en KD(E)/ KD(P) som er større enn eller lik 2, større enn eller lik 3, større enn eller lik 5, større enn eller lik 10, større enn eller lik 20, større enn eller lik 50, større enn eller lik 100, større enn eller lik 200, større enn eller lik 500, eller større enn eller lik 1000. Typisk er der ingen øvre grense på verdien KD(E)/ KD(P) på grunn av at KD(E)-verdien kan være svært liten, så som 0. Av praktiske grunner kan imidlertid en øvre grense for KD(E)/ KD(P) være 1 x 10<6>. Slike KD-verdier for både P-cadherin og for E-cadherin kan måles med enhver teknikk kjent for fagkyndige innen feltet, så som med ELISA, RIA, flow cytometri eller overflateplasmonresonans, så som BIACORE™.

B) I en annen utførelse binder antistoffet eller porsjoner derav til P-cadherin med en KD på 1000 nM eller mindre som målt med overflateplasmonresonans. I en ytterligere utførelse binder antistoffet eller porsjon derav til P-cadherin med en KD på mindre enn 500 nM, mindre enn 100 nM, mindre enn 50 nM, mindre enn 20 nM, mindre enn 10 nM, mindre enn 1 nM, mindre enn 500 pM, eller mindre enn 100 pM, som målt med overflateplasmonresonans. Typisk er der ingen nedre grense for verdien av KD. For praktiske formål er imidlertid den nedre grense antatt å være ca.1 pM.

C) I en ytterligere utførelse har antistoffet eller porsjon derav en off-rate (koff) for P-cadherin på mindre enn eller lik 0,01<s-1>som målt med overflateplasmonresonans. For eksempel, i visse utførelser har antistoffet eller porsjon derav en koff for P-cadherin på mindre enn 0,005<s-1>, mindre enn 0,004<s-1>, mindre enn 0,003<s-1>, mindre enn 0,002<s-1>, eller mindre enn 0,001<s-1>. Typisk er der ingen nedre grense for verdien av koff. For praktiske formål antas det imidlertid at den nedre grense kan være ca. 1x10<-7 s-1>.

D) I en ytterligere utførelse har P-cadherin antistoffet eller porsjon derav en IC50 på 100 nM eller mindre som målt med en P-cadherin-avhengig celleadhesjonsanalyse. I en ytterligere utførelse er nevnte IC50 mindre enn 50 nM, mindre enn 40 nM, mindre enn 20 nM, mindre enn 10 nM, mindre enn 1 nM, mindre enn 500 pM, mindre enn 200 pM, mindre enn 100 pM, eller mindre enn 10 pM, som målt med en P-cadherinavhengig celleadhesjonsanalyse. Typisk er der ingen nedre grense for verdien av IC50 som målt med en P-cadherin-avhengig celleadhesjonsanalyse. For praktiske formål er imidlertid den nedre grense antatt å være ca.1 pM.

E) I en annen utførelse har P-cadherin antistoffet eller del derav en IC50 på 100 nM eller mindre som målt med en P-cadherin-avhengig celleaggregeringsanalyse. I en ytterligere utførelse er nevnte IC50 mindre enn 50 nM, mindre enn 40 nM, mindre enn 20 nM, mindre enn 10 nM, mindre enn 1 nM, mindre enn 500 pM, mindre enn 200 pM, mindre enn 100 pM, eller mindre enn 1 pM, som målt med en P-cadherin avhengig celleaggresjonsanalyse. Typisk er der ingen nedre grense for verdien av IC50 som målt med en P-cadherin-avhengig celleaggregeringsanalyse. For praktiske formål antas det imidlertid at den nedre grense kan være ca.1 pM.

F) I en ytterligere utførelse øker P-cadherin-antistoffet eller porsjon derav sferoidødeleggelse i en P-cadherin-avhengig sferoidødeleggelsesanalyse med en faktor på minst 2 sammenliknet med en kontrollprøve med ingen IgG til stede. I en ytterligere utførelse øker P-cadherin-antistoffet eller porsjon derav sferoidødeleggelse i en P-cadherin-avhengig sferoidødeleggelsesanalyse med en faktor på minst 3, minst 4, minst 6, minst 10, eller minst 15 sammenliknet med kontrollprøve uten IgG til stede.

G) I en ytterligere utførelse vil P-cadherin antistoffet eller porsjon derav konkurrere for binding til P-cadherin med et antistoff valgt blant gruppen omfattende 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; og g-129-1c4.

H) I en ytterligere utførelse vil P-cadherin antistoffet eller porsjon derav krysskonkurrere for binding til P-cadherin med et antistoff valgt blant gruppen omfattende 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06129-1c4; og g-129-1c4.

I) I en ytterligere utførelse binder P-cadherin antistoffet eller porsjon derav til den samme epitop på P-cadherin som et antistoff valgt blant gruppen omfattende 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; og g-129-1c4.

J) I en ytterligere utførelse binder P-cadherin antistoffet eller porsjon derav til P-cadherin med i hovedsak den samme KD som et antistoff valgt blant gruppen omfattende 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; og g-129-1c4.

K) I en ytterligere utførelse binder P-cadherin antistoffet eller porsjon derav til P-cadherin med i hovedsak den samme koff som antistoffet valgt blant gruppen omfattende 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; og g-129-1c4.

Et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse er et antistoff eller antigenbindende porsjon derav med minst én av de funksjonelle egenskaper som beskrevet tidligere i A) til K), omfattende et VH-domene som er minst 90% identisk i aminosyresekvens til en vilkårlig av SEQ ID no 1 til 13 og 320 til 325. I én utførelse er nevnte VH-domene minst 91%, minst 93%, minst 95%, minst 97%, minst 99% eller 100% identisk i aminosyresekvens til en vilkårlig av sekvensene SEQ ID nr.1 til 12 og 320 til 325. I en ytterligere utførelse har antistoffet eller porsjon derav minst én av de funksjonelle egenskaper beskrevet tidligere i A) til K), omfattende et VH-domene som er et vilkårlig av SEQ ID NO: 1 til 13 og 320 til 325, eller som er forskjellig fra vilkårlig fra SEQ ID NO: 1 til 13 og 320 til 325 ved at det har minst én konservativ aminosyresubstituering. For eksempel, VH-domenet kan være forskjellig med 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 konservative aminosyresubstitueringer fra enhver av SEQ ID NO: 1 til 13 og 320 til 325. I en ytterligere utførelse kan enhver av disse konservative aminosyresubstitueringer forekomme i CDR1-, CDR2- og/eller CDR3-regionene. Et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse er et antistoff eller antigenbindende porsjon derav med minst én av de funksjonelle egenskaper beskrevet tidligere i A) til K), omfattende et VL-domene som er minst 90% identisk i aminosyresekvens til en vilkårlig av SEQ ID NO: 14 til 23, og 326 til 331. I én utførelse er nevnte VL-domene minst 91%, minst 93%, minst 95%, minst 97%, minst 99% eller 100% identisk i aminosyresekvens til en vilkårlig av SEQ ID NO: 14 til 23 og 326 til 331. I en ytterligere utførelse har antistoffet eller porsjon derav minst én av de funksjonelle egenskaper beskrevet tidligere i A) til K), og omfatter et VL-domene som er et vilkårlig av SEQ ID no14 til 23 og 326 til 331, eller som avviker fra et vilkårlig SEQ ID NO: 14 til 23 og 326 til 331 ved at det har minst én konservativ aminosyresubstituering. For eksempel kan VL-domenet avvike med 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 konservative aminosyresubstitueringer fra en vilkårlig av SEQ ID NO: 14 til 23 og 326 til 331. I en ytterligere utførelse kan en vilkårlig av disse konservative aminosyresubstitueringer forekomme i CDR1-, CDR2- og/eller CDR3-regionene. Et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse er et antistoff eller antigenbindende porsjon derav med minst én av de funksjonelle egenskaper beskrevet tidligere i A) til K) hvor VL- og VH-domenene er hver minst 90% identiske i aminosyresekvens til VL-og VH-domenet, respektivt, av enhver av antistoffene 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; og g-129-1c4. For eksempel, VL- og VH-domenene er hver minst 91%, 93%, 95%, 97%, 99% eller 100% identiske i aminosyresekvenser til VL- og VH-domener, respektivt, av et vilkårlig av antistoffene 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; og g-129-1c4.

I et ytterligere aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse et antistoff eller antigenbindende porsjon derav som er valgt blant gruppen omfattende: a) et antistoff eller porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 1, og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 14; b) et antistoff eller porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 2, og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 14; c) et antistoff eller porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 2 og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 15; d) et antistoff eller porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 3, og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 16; e) et antistoff eller porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 4 og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 17; f) et antistoff eller porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 4 og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 23; g) et antistoff eller porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 5 og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 18; h) et antistoff eller porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 6 og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 23; i) et antistoff eller porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 7 og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 23; j) et antistoff eller porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 8 og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 23; k) et antistoff eller porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 9 og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 23; l) et antistoff eller porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 10 og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 19; m) et antistoff eller porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 11 og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 20, n) et antistoff eller porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 12 og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 21; o) et antistoff eller porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 13 og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 22; p) et antistoff eller porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 320 og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 326; q) et antistoff eller antigenbindende porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 321 og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 327; r) et antistoff eller porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 322 og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 328; s) et antistoff eller porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 323 og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 329; t) et antistoff eller porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 324 og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 330; og u) et antistoff eller porsjon derav som omfatter et VH-domene som angitt i SEQ ID NO: 325, og et VL-domene som angitt i SEQ ID NO: 331.

I en ytterligere utførelse, for en vilkårlig av antistoffene eller porsjonene derav som beskrevet over i gruppene a) til u) kan VH- og/eller VL-domenene avvike fra de spesifiserte SEQ ID NOer som angitt deri med minst én konservativ aminosyresubstituering. For eksempel, VH- og/eller VL-domenene kan avvike fra de angitte SEQ ID NO: med 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 konservative aminosyresubstitueringer. I en ytterligere utførelse kan en vilkårlig av disse konservative aminosyresubstitueringer forekomme i CDR1-, CDR2- og/eller CDR3-regionene.

I en ytterligere utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et antistoff eller antigenbindende porsjon derav minst én av de funksjonelle egenskaper beskrevet tidligere i A) til K), omfattende et VH-domene som er uavhengig valgt blant enhver av SEQ ID NO: 1 til 13 og 320 til 325, eller en sekvens som avviker fra enhver av SEQ ID NO: 1 til 13 og 320 til 325 med minst én konservativ aminosyresubstituering, og ytterligere omfatter et VL-domene som er uavhengig valgt blant en vilkårlig av SEQ ID NO: 14 til 23 og 326 til 331, eller en sekvens som avviker fra en vilkårlig av SEQ ID NO: 14 til 23 og 326 til 331 med minst én konservativ aminosyresubstituering. For eksempel kan VH- og VL-domenene hver uavhengig avvike fra enhver av SEQ ID NO: 1 til 13, 320 til 325, 14 til 23 og 326 til 331, med 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 konservative aminosyresubstitueringer.

I en ytterligere utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et antistoff eller antigenbindende porsjon derav med minst én av de funksjonelle egenskaper beskrevet tidligere i A) til K), hvor nevnte antistoff eller porsjon omfatter en VH CDR3 valgt blant en vilkårlig SEQ ID NO: 26 til 37 og 91 til 256, eller en sekvens som avviker fra enhver av SEQ ID NO: 26 til 37 og 91 til 256 med minst én konservativ aminosyresubstituering. For eksempel kan VH CDR3 være forskjellig fra en vilkårlig av SEQ ID NO: 26 til 37 og 91 til 256 med 1, 2, 3 eller 4 konservative aminosyresubstitueringer.

I en ytterligere utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et antistoff eller antigenbindende porsjon derav med minst én av de funksjonelle egenskaper beskrevet tidligere i A) til K), hvor nevnte antistoff eller antigenbindende porsjon omfatter en VL CDR3 valgt blant en vilkårlig av SEQ ID NO: 40 til 47 og 257 til 319, eller en sekvens som avviker fra en av SEQ ID NO: 40 til 47 og 257 til 319 med minst én konservativ aminosyresubstituering. For eksempel, VL CDR3 kan avvike fra en vilkårlig av SEQ ID NO: 40 til 47 og 257 til 319 med 1, 2, 3, 4 eller 5 konservative aminosyresubstitueringer.

I en ytterligere utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et antistoff eller antigenbindende porsjon derav hvor nevnte antistoff eller antigenbindende porsjon omfatter: En VH CDR1 som angitt i SEQ ID NO: 24, eller en sekvens som avviker fra SEQ ID NO: 24 med minst én konservativ aminosyresubstituering; en VH CDR2 som angitt i SEQ ID NO 25 eller en sekvens som avviker fra SEQ ID NO: 25 med minst én konservativ aminosyresubstituering; og en VH CDR3 som er uavhengig valgt blant en vilkårlig av SEQ ID NO: 26 til 37 og 91 til 256, eller en sekvens som avviker fra en av SEQ ID NO: 26 til 37 og 91 til 256 med minst én konservativ aminosyresubstituering. For eksempel, VH CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene nevnt over kan hver uavhengig avvike fra de respektive angitt med SEQ ID NOene med 1, 2, 3, 4 eller 5 konservative aminosyresubstitueringer.

I en ytterligere utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et antistoff eller antigenbindende porsjon derav, hvor nevnte antistoff eller antigenbindende porsjon omfatter: En VL CDR1 som angitt i SEQ ID NO: 38, eller en sekvens som avviker fra SEQ ID NO: 38 med minst én konservativ aminosyresubstituering; en VL CDR2 som angitt i SEQ ID NO: 39, eller en sekvens som avviker fra SEQ ID NO: 39 med minst én konservativ aminosyresubstituering; og en VL CDR3 som er uavhengig valgt blant en vilkårlig av SEQ ID NO: 40 til 47 og 257 til 319, eller en sekvens som avviker fra en vilkårlig av SEQ ID NO: 40 til 47 og 257 til 319 med minst én konservativ aminosyresubstituering. For eksempel, VL CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene nevnt over kan hver uavhengig avvike fra de respektive angitte SEQ ID NOene med 1, 2, 3, 4 eller 5 konservative aminosyresubstitueringer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre et antistoff eller antigenbindende porsjon derav, hvor nevnte antistoff eller antigenbindende porsjon omfatter: en VH CDR1 som angitt i SEQ ID NO: 24; en VH CDR2 som angitt i SEQ ID NO: 25; en VH CDR3 valgt blant én av SEQ ID NO: 26 til 37 og 91 til 256; en VL CDR1 som angitt i SEQ ID NO: 38; en VL CDR2 som angitt i SEQ ID NO: 39; og en VL CDR3 valgt blant en vilkårlig av SEQ ID NO: 40 til 47 og 257 til 319. I en ytterligere utførelse kan VH-og VL CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene som er angitt hver uavhengig avvike fra de spesifikke SEQ ID NOer angitt over med minst én konservativ aminosyresubstituering. For eksempel kan CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene hver uavhengig avvike med 1, 2, 3, 4 eller 5 konservative aminosyresubstitueringer fra de respektive spesifikke SEQ ID NOer angitt over.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer ytterligere et antistoff eller antigenbindende porsjon derav hvor nevnte antistoff eller antigenbindende porsjon omfatter VH og VL CDR1, VH og VL CDR2, og VH og VL CDR3 som finnes i et vilkårlig av antistoffene 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; and g129-1c4.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre et antistoff eller antigenbindende porsjon derav omfattende et VH-domene valgt blant et vilkårlig SEQ ID NO: 1 til 13 og 320 til 325, eller som avviker fra et vilkårlig av SEQ ID NO: 1 til 13 og 320 til 325 med 1 til 10 konservative aminosyresubstitueringer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer ytterligere et antistoff eller antigenbindende porsjon derav, omfattende et VL-domene valgt blant et vilkårlig av SEQ ID NO: 14 til 23 og 326 til 331, eller som avviker fra en vilkårlig av SEQ ID NOene 14 til 23 og 326 til 331 med 1 til 10 konservative aminosyresubstitueringer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre et antistoff eller antigenbindende porsjon derav, omfattende et VH-domene som er uavhengig valgt blant en vilkårlig av SEQ ID NOene 1 til 13 og 320 til 325, eller en sekvens som avviker fra en vilkårlig av SEQ ID NOene 1 til 13 og 320 til 325 med 1 til 10 konservative aminosyresubstitueringer, og ytterligere omfatte et VL-domene som er uavhengig valgt blant en vilkårlig av SEQ ID NOene 14 til 23 og 326 til 331, eller en sekvens som avviker fra en vilkårlig av SEQ ID NOene 14 til 23 og 326 til 331 med 1 till 10 konservative aminosyresubstitueringer

.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre et antistoff eller antigenbindende porsjon derav hvor nevnte antistoff eller antigenbindende porsjon omfatter: En VH CDR1 som angitt i SEQ ID NO: 24, eller en sekvens som avviker fra SEQ ID NO: 24 med 1 til 4 konservative aminosyresubstitueringer; en VH CDR2 som angitt i SEQ ID NO: 25, eller en sekvens som avviker fra SEQ ID NO: 25 med 1 til 4 konservative aminosyresubstitueringer; og en VH CDR3 som er valgt blant en av SEQ ID NOene 26 til 37 og 91 til 256, eller en sekvens som avviker fra en vilkårlig av SEQ ID NOene 26 til 37 og 91 til 256 med 1 til 4 konservative aminosyresubstitueringer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre et antistoff eller antigenbindende porsjon derav, hvor nevnte antistoff eller antigenbindende porsjon omfatter: En VL CDR1 som angitt i SEQ ID NO: 38, eller en sekvens som avviker fra SEQ ID NO: 38 med 1 til 4 konservative aminosyresubstitueringer; en VL CDR2 som angitt i SEQ ID NO: 39, eller en sekvens som avviker fra SEQ ID NO: 39 med 1 til 4 konservative aminosyresubstitueringer; og en VL CDR3 som er valgt blant vilkårlig av SEQ ID NOene 40 til 47 og 257 til 319, eller en sekvens som avviker fra en vilkårlig av SEQ ID NOene 40 til 47 og 257 til 319 med 1 til 4 konservative aminosyresubstitueringer.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer ytterligere et antistoff eller antigenbindende porsjon derav med minst én av de funksjonelle egenskaper beskrevet tidligere i A) til K), hvor nevnte antistoff eller antigenbindende porsjon omfatter: En VH FR1 som angitt i SEQ ID NO: 48; en VH FR2 som angitt i SEQ ID NO: 49; en VH FR3 valgt blant en vilkårlig av SEQ ID NOene 50 til 55; en VH FR4 valgt blant en vilkårlig av SEQ ID NOene 56 og 57; En VL FR1 valgt blant en vilkårlig av SEQ ID NOene 58 og 59; en VL FR2 valgt blant en vilkårlig av SEQ ID NOene 60 til 62; en VL FR3 valgt blant en vilkårlig av SEQ ID NOene 63 til 66; og en VL FR4 som angitt i SEQ ID NO: 67. I en ytterligere utførelse kan VH og VL FR1, FR2, FR3 og FR4 sekvensene nevnt også hver uavhengig avvike fra de spesifikke SEQ ID NOene angitt over med minst én konservativ aminosyresubstituering. For eksempel, FR1, FR2, FR3 og FR4 sekvensene kan hver uavhengig avvike med 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 konservative aminosyresubstitueringer fra de respektive spesifikke SEQ ID NOene angitt over. I en ytterligere utførelse kan enhver av FR1, FR2, FR3 og FR4 sekvensene hver uavhengig være mutert for å matche arvelinjerammeverksekvens.

I en ytterligere utførelse vedrører foreliggende oppfinnelse et vilkårlig av antistoffene beskrevet heri, hvor antistoffet er IgG, et IgM, et IgE, et IgA, eller et IgD molekyl, eller er avledet derfra. For eksempel kan antistoffet være et IgG1 eller IgG2. For eksempel, i én utførelse er IgG en IgG1 hvor tungkjede konstant region omfatter SEQ ID NO: 344 og hvor lettkjede konstant region omfatter SEQ ID NO: 345, med den proviso at den C-terminale lysin-enhet av SEQ ID NO: 344 er valgfritt spaltet.

En ytterligere utførelse tilveiebringer et vilkårlig av antistoffene eller antigenbindende porsjoner beskrevet over som er et Fab-fragment, et F(ab’)2-fragment, et FV-fragment, et enkeltkjede Fv-fragment, et enkeltkjede VH-fragment, et enkeltkjede VL-fragment, et humanisert antistoff, et kimerisk antistoff eller et bispesifikt antistoff.

I en ytterligere utførelse tilveiebringes et derivatisert antistoff eller antigenbindende porsjon omfattende en vilkårlig av antistoffene eller porsjonene derav som beskrevet heri og minst én ytterligere molekylenhet. For eksempel, den minst ene ytterligere molekylære enhet kan være et annet antistoff (for eksempel et bispesifikt antistoff eller et diabody), et deteksjonsmiddel, en markør, et cytotoksisk middel, et farmasøytisk middel, og/eller et protein eller peptid som kan mediere assosiering av antistoffet eller antistoffporsjonen med et annet molekyl (så som en streptavidin kjerneregion eller et polyhistidin markør). For eksempel, nyttige deteksjonsmidler med hvilke et antistoff eller antigenbindende porsjon ifølge forbindelsen kan derivatiseres inkluderer fluorescerende forbindelser, inkluderende fluorescein, fluorescein isotiocyanat, rodamin, 5-dimetylamin-1-naftalensulfonylklorid, fykoerytrin, lantanid fosforer, og lignende. Et antistoff kan også merkes med enzymer som er nyttige for deteksjon, så som pepperrotperoksidase, β-galaktosidase, luciferase, alkalisk fosfatase, glukoseoksidase og lignende. I en ytterligere utførelse kan antistoffene eller porsjonene derav ifølge foreliggende oppfinnelse også merkes med biotin, eller med et forutbestemt polypeptidepitop gjenkjent av en sekundær reporter (for eksempel leusin zipperpar sekvensene, bindingsseter for sekundær antistoff, metallbindingsdomener, epitopmarkører). I en ytterligere utførelse ifølge foreliggende oppfinnelse kan en vilkårlig av antistoffene eller porsjoner derav derivatiseres med en kjemisk gruppe så som polyetylenglykol (PEG), en metyl- eller etylgruppe, eller en karbohydratgruppe.

I noen utførelser festes P-cadherin antistoffene eller antigenbindende porsjoner beskrevet heri til et faststoff støttemedium.

I noen utførelser spaltes den C-terminale lysin av tungkjeden av en vilkårlig av P-cadherin antistoffene ifølge oppfinnelsen. I forskjellige utførelser av oppfinnelsen kan tung- og lettkjedene av P-cadherin antistoffene valgfritt inkludere en N-terminal signalsekvens. For eksempel kan tungkjede signalsekvensen være SEQ ID NO: 346, og lettkjede signalsekvensen kan være SEQ ID NO: 347.

I en ytterligere utførelse vedrører foreliggende oppfinnelse et hvert antistoff eller antigenbindende porsjon derav som beskrevet heri hvor antistoffene eller antigenbindende porsjoner derav er av human opprinnelse.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en farmasøytisk sammensetning omfattende et hvert av antistoffene eller antigenbindende porsjoner derav som beskrevet over og en farmasøytisk akseptabel bærer.

I en ytterligere utførelse vedrører foreliggende oppfinnelse et isolert nukleinsyremolekyl omfattende en nukleotidsekvens som koder for et vilkårlig av antistoffene eller antigenbindende porsjoner derav som beskrevet heri. I én bestemt utførelse vedrører oppfinnelsen et isolert nukleinsyremolekyl omfattende en nukleotidsekvens som angitt i SEQ ID NO: 68 til 90 og 332 til 343. Oppfinnelsen vedrører videre en vektor omfattende enhver av nukleinsyremolekylene beskrevet heri, hvor vektoren valgfritt omfatter en ekspresjonskontrollsekvens funksjonelt forbundet med nukleinsyremolekylet.

En annen utførelse tilveiebringer en vertscelle omfattende en vilkårlig av vektorene beskrevet heri eller omfattende en vilkårlig av nukleinsyremolekylene beskrevet heri. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en isolert cellelinje som produserer et vilkårlig et av antistoffene eller antigenbindende porsjoner som beskrevet heri, eller som produserer tungkjeden eller lettkjeden av et vilkårlig av antistoffene eller nevnte antigenbindende porsjoner.

I en ytterligere utførelse vedrører foreliggende oppfinnelse en framgangsmåte for å produsere et P-cadherin antistoff eller antigenbindende porsjon derav, omfattende å dyrke en vilkårlig vertscelle eller cellelinje beskrevet heri under egnete betingelser og gjenvinne nevnte antistoff eller antigenbindende porsjon.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også et ikke-humant transgent dyr eller transgen plante omfattende en vilkårlig av nukleinsyrene beskrevet heri, hvor det ikke-humane transgene dyr eller transgene plante uttrykker nevnte nukleinsyre.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en framgangsmåte for å isolere et antistoff eller antigenbindende porsjon derav som binder til P-cadherin, omfattende trinnene å isolere antistoffer fra de ikke-humane transgene dyr eller transgene planter som beskrevet heri.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en framgangsmåte for å behandle avvikende cellevekst i et pattedyr i behov derav, omfattende trinnene å administrere til nevnte pattedyr et vilkårlig av antistoffene eller antigenbindende porsjoner derav, eller et vilkårlig av de farmasøytiske sammensetninger, som beskrevet heri. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en framgangsmåte for å behandle avvikende cellevekst i et pattedyr i behov derav, med et antistoff eller antigenbindende porsjon derav som binder til P-cadherin omfattende trinnene å administrere til nevnte pattedyr en effektiv mengde av en vilkårlig nukleinsyremolekylene beskrevet heri under egnete betingelser som muliggjør ekspresjon av nevnte nukleinsyremolekyler. I en ytterligere utførelse vedrører framgangsmåten å behandle avvikende cellevekst å administrere en mengde av én eller flere substanser valgt blant antitumormidler, antiangiogenesemidler, signaltransduksjon inhibitorer, og antiproliferative midler, hvilke mengder sammen er effektiv i å behandle nevnte avvikende cellevekst. I bestemt utførelser er nevnte avvikende cellevekst kankrøs.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en framgangsmåte for å redusere P-cadherin-avhengig cellulær aggregering omfattende å sette cellene i forbindelse med et vilkårlig av antistoffene eller antigenbindende porsjoner derav beskrevet heri eller et vilkårlig av de farmasøytiske sammensetninger beskrevet heri.

Et ytterligere aspekt ved foreliggende oppfinnelse er et antistoff eller antigenbindende porsjon derav omfattende en tungkjedevariabel region aminosyresekvens som benytter et humant VH-3 familiegen. I én utførelse, for eksempel, er det humane VH-3 familiegen VH-3-23.

Et ytterligere aspekt ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et av antistoffene eller antigenbindende porsjon derav som beskrevet heri, hvor nevnte antistoff eller antigenbindende porsjon er et humant antistoff. I et ytterligere aspekt er nevnte antistoff eller antigenbindende porsjon et human rekombinant antistoff.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også framgangsmåter for å produsere et P-cadherin antistoff eller antigenbindende porsjon derav omfattende trinnene å syntetisere et bibliotek av humane antistoff på fag, screening av biblioteket med P-cadherin, eller en antigenisk porsjon derav, isolere faget som binder P-cadherin, og oppta antistoffet fra faget.

Definisjoner og generelle teknikker

Med mindre annet er definert skal vitenskapelige og tekniske termer som anvendes i forbindelse med foreliggende oppfinnelse ha de betydninger som vanligvis forstås av ordinært fagkyndige innen feltet. Videre, med mindre annet er nødvendig på grunn av konteksten, skal termer i entallsform inkludere flertallsformer, og flertallsformer skal inkludere entallsformer. Generelt, nomenklatur anvendt i forbindelse med, og teknikker av, celle- og vevskultur, molekylær biologi, immunologi, mikrobiologi, genetikk og protein- og nukleinsyrekjemi og hybridisering beskrevet heri er de som er godt kjente innen fagfeltet.

Framgangsmåtene og teknikkene ifølge forliggende oppfinnelse utføres generelt i samsvar med konvensjonelle metoder godt kjent innen fagfeltet og beskrevet i forskjellige generelle og mer spesifikke publikasjoner som er referert og beskrevet gjennom foreliggende beskrivelse med mindre annet er angitt. Se for eksempel Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); and Coligan, et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003), hvilke vedlegg er inkorporert heri med referanse.

Enzymatiske reaksjoner og renseteknikker utføres i samsvar med leverandørens spesifikasjoner, som vanligvis utføres innen fagfeltet eller som beskrevet heri.

Nomenklaturen som anvendes i forbindelse med, og laboratorieprosedyrene og teknikkene av, analytisk kjemi, syntetisk organisk kjemi, og medisinsk og farmasøytisk kjemi beskrevet heri er de som er vanlige innen fagfeltet. Standardteknikker anvendes for kjemisk syntese, kjemisk analyse, farmasøytisk preparering, formulering, avgivelse og behandling av pasienter.

Antistoff basisstrukturenhet er kjent å omfatte en tetramer. Hver tetramer er sammensatt av to identiske par av polypeptidkjeder, som hver har en ”lett” (ca.25 kDa) og en ”tung” kjede (ca. 50-70 kDa). Den aminoterminale porsjon av hver kjede inkluderer en variabel region på ca.100 til 120, eller flere aminosyrer som primært er ansvarlig for antigengjenkjennelse.

Den karboksyterminale porsjon av hver kjede definerer en konstant region som primært er ansvarlig for effektorfunksjon. Humane lettkjeder klassifiseres som kappa og lambda lettkjeder. Tungkjeder klassifiseres som mu, delta, gamma, alfa eller epsilon, og definerer antistoffets isotype som IgM, IgD, IgG, IgA og IgE, respektivt. Innen lette og tunge kjeder kobles de variable og konstante regioner med en ”J-region” på ca.12 eller flere aminosyrer, hvor tungkjeden også inkluderer en ”D-region” på ca.3 eller flere aminosyrer. Se generelt Fundamental Immunology, Ch.7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (inkorporert heri med referanse i sin helhet for alle formål). De variable regioner av hver tung/lettkjedepar (VH og VL) danner det antistoffbindende sete. Således, et intakt IgG antistoff har for eksempel tobindingsseter. Med unntak av bifunksjonelle eller bispesifikke antistoff er de to bindingsseter de samme.

De variable regioner av tung- og lettkjedene oppviser den samme generelle struktur av relativt konservert rammeverkregioner (FR) koblet med tre hypervariable regioner, også benevnt komplementaritetsbestemmende regioner eller CDRer. Termen ”variabel” refererer til det faktum at visse porsjoner av de variable domener avviker i stor grad i sekvens blant antistoffene og kan anvendes i binding og spesifisitet av hvert bestemte antistoff for dets bestemte antigen. Variabiliteten, imidlertid, er ikke jevnt fordelt gjennom de variable domener og antistoffene, men er konsentrert i CDRene, som separeres av mer sterkt konserverte FRer. CDRene fra de to kjeder av hvert par alignes av FRene, noe som muliggjør binding til en spesifikk epitop. Fra N-terminal til C-terminal, omfatter både lette og tunge kjeder domenene FR1, CDR1, CDR2, FR3, CDR3 og FR4. Tilordningen av aminosyrer til hvert domene er i samsvar med definisjonene av Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), eller Chothia & Lesk J., Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia, et al., Nature 342:878-883 (1989), hvis beskrivelser inkorporeres heri med henvisning.

De følgende termer, med mindre annet er angitt, skal forstås å ha de følgende betydninger:

Med mindre spesifikk indikert på annen måte refererer termen ”P-cadherin” til human P-cadherin, som er et integrert membranprotein og et medlem av den klassiske cadherin-familie av transmembran glykoproteiner som regulerer celle-celle adhesjon. Kloning og sekvens av humant P-cadherin har blitt rapportert, for eksempel i Shimoyama, et al., J. Cell Biol.109 (4 Pt 1), 1787-1794 (1989), hvis beskrivelse inkorporeres heri med henvisning. Termen P-cadherin er tiltenkt å inkludere rekombinant humant P-cadherin og rekombinante kimeriske former av P-cadherin, som kan framstilles med standard rekombinante ekspresjonsmetoder eller innkjøpes kommersielt (R&D Systems 861-PC-100).

Med mindre spesifikt angitt på annen måte, refererer termen ”E-cadherin” som anvendt heri til human E-cadherin, som er et integrert membranprotein og et medlem av den klassiske cadherinfamilien av transmembranglykoproteiner som regulerer celle-celle adhesjon. E-cadherin beskrives for eksempel i Takeichi, Science, 251: 1451-1455 (1991), hvis beskrivelse inkorporeres heri med henvisning. Termen E-cadherin er tiltenkt å inkludere rekombinant humant E-cadherin og rekombinante kimeriske former av E-cadherin, som kan framstilles med standard rekombinante ekspresjonsmetoder eller innkjøpes kommersielt (R&D 648-EC-100).

Termen ”polypeptid” omfatter native eller artifisielle proteiner, proteinfragmenter og polypeptidanaloger av en proteinsekvens. Et polypeptid kan være monomerisk eller polymerisk.

Termen ”isolert protein”, ”isolert polypeptid” eller ”isolert antistoff” er et protein, polypeptid eller antistoff som i forhold til dets opprinnelse eller kilder for derivatisering; (1) ikke er forbundet med naturlige assosierte komponenter som ledsager det i sin native form, (2) er fri for andre proteiner fra den samme art, (3) uttrykkes av en celle fra en forskjellig art eller (4) som ikke forekommer i naturen. Således, et polypeptid som er kjemisk syntetisert eller som syntetiseres i et cellulært system forskjellig fra cellen fra det naturlig har sin opprinnelse vil være ”isolert” fra dets naturlige assosierte komponenter. Et protein kan også gjøres i hovedsak fri for naturlig assosierte komponenter ved isolering, ved anvendelse av proteinrenseteknikker godt kjent innen fagfeltet.

Eksempler på isolerte antistoff inkluderer et P-cadherin antistoff som har blitt affinitetsrenset ved anvendelse av P-cadherin, og et P-cadherin antistoff som har blitt syntetisert med en cellelinje in vitro.

Et protein eller polypeptid er ”i hovedsak ren”, ”i hovedsak homogen” eller ”i hovedsak renset” idet minst ca.60 til 75% av en prøve oppviser en enkelt form av polypeptidet. Polypeptidet eller proteinet kan være monomerisk eller multimerisk. Et i hovedsak rent polypeptid eller protein kan typisk omfatte ca.50%, 60%, 70%, 80% eller 90% vekt/vekt av en proteinprøve, mer vanlig ca.95%, og mer fortrinnsvis over 99% rent. Proteinrenhet eller homogenitet kan indikeres med et spekter av kjente metoder innen feltet, så som polyakrylamid gel elektroforese av en proteinprøve, etterfulgt av visualisering av et enkelt polypeptidbånd ved farging av gelen med en farge godt kjent innen fagfeltet. For visse formål kan høyere oppblåsing tilveiebringes ved anvendelse av HPLC eller andre midler godt kjent innen fagfeltet for rensing.

Termen ”polypeptidfragment” som anvendt heri refererer til et polypeptid som har en aminoterminal og/eller karboksyterminal deletering, men hvor den resterende aminosyresekvens er identisk til de korresponderende posisjoner i den naturlige forekommende sekvens. I noen av utførelsene er fragmentene minst 5, 6, 8 eller 10 aminosyre lange. I andre utførelser er fragmentene minst 14, minst 20, minst 50 eller minst 70, 80, 90, 100, 150 eller 200 aminosyre lange.

Termen ”analog” eller ”polypeptid analog” som anvendt heri refererer til et polypeptid som omfatter et segment som har en vesentlig identitet til en referanse aminosyresekvens og har en i hovedsak den samme funksjon eller aktivitet som referanse aminosyresekvensen. Typisk, polypeptidanaloger omfatter en konservativ aminosyresubstituering (eller innskudd eller deletering) i forhold til referansesekvensen. Analoger kan være minst 20 eller 25 aminosyre lange, eller kan være minst 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 eller 200 aminosyre lange eller lengre, og kan ofte være like lange som fullengde polypeptidet. Noen utførelser av oppfinnelsen inkluderer polypeptidfragmenter eller polypeptid analogantistoffer med 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 eller 17 substitueringer fra arvelinjeaminosyresekvensen. Fragmenter eller analoger av antistoff eller immunoglobulinmolekyler kan enkelt framstilles av fagkyndige innen feltet ved å følge teknikkene i denne beskrivelse.

I visse utførelser er aminosyresubstitueringer til et P-cadherin antistoff eller antigenbindende porsjon derav de som: (1) reduserer mottakelighet for proteolyse, (2) reduserer mottakelighet for oksidering, (3) forandrer bindingsaffinitet for å danne proteinkomplekser, og (4) bevirker eller modifiserer andre fysiokjemiske eller funksjonelle egenskaper av slike analoger, men framdeles opprettholder spesifikk binding til P-cadherin. Analoger kan inkludere forskjellige substitueringer til den normalt forekommende peptidsekvens. For eksempel, enkelt- eller multiple aminosyresubstitueringer fortrinnsvis konservative aminosyresubstitueringer, kan gjøres i den normalt forekommende sekvens, for eksempel i den del av polypeptidet som er på utsiden av domenet(ene) som danner intermolekylære kontakter. Aminosyresubstitueringer kan også gjøres i domenen(e) som danner intermolekylære kontakter som kan forbedre aktiviteten av polypeptidet. En konservativ aminosyresubstituering bør ikke i vesentlig grad forandre de strukturelle karakteristika av morsekvensen; for eksempel en erstatningsaminosyre bør ikke forandre antiparallelle βark som utgjør det immunoglobulinbindende domenet som forekommer i morsekvensen, eller ødelegger andre typer sekundær struktur som karakteriserer morsekvensen. Generelt, glysin og prolin vil ikke bli anvendt i antiparallelle β-ark.

Eksempler på anerkjente polypeptid sekundære og tertiære strukturer er beskrevet i Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); and Thornton, et al., Nature, 354:105 (1991), inkorporert heri med referanse.

Som anvendt heri, termen ”antistoff” er synonym med immunoglobulin og skal forstås som vanlig anvendt innen fagfeltet. Spesielt, termen antistoff er ikke begrenset til enhver bestemt metode for å produsere antistoffet. For eksempel inkluderer termen antistoff, uten begrensning, rekombinante antistoff, monoklonale antistoff og polyklonale antistoff.

Termen ”antigenbindende porsjon” av et antistoff (eller enkelt ”antistoffporsjon”), som anvendt heri, ett eller flere fragmenter av et antistoff som opprettholder evnen til spesifikt å binde til et antigen (for eksempel P-cadherin). Det har blitt vist at den antigenbindende funksjon av et antistoff kan utføres med fragmenter av et fullengde antistoff. Eksempler på bindingsfragmenter som omfattes innen termen ”antigenbindende porsjon” av et antistoff inkluderer; (i) et Fab-fragment, et monovalent fragment bestående av VL, VH, CL og CH1 domener; (ii) et F(ab’)2 fragment, et bivalent fragment omfattende to Fab-fragmenter koblet via en disulfid bro ved hingeregionen; (iii) et Fd-fragment omfattende VH og CH1 domenene; (iv) et Fv-fragment omfattende VL- og VH-domener av en enkel arm av et antistoff; (v) et dAb-fragment (Ward, et al., Nature, (1989) 341:544-546), som består av et VH domene; og (vi) en isolert komplementær bestemmende region (CDR). Videre, selv om de to domener av Fv-fragmentet, VL og VH kodes for av separate gener kan de kobles ved anvendelse av rekombinante metoder, med en syntetisk linker som muliggjør at de kan lages som en enkelt proteinkjede hvor VL- og VH-regionene pares for å danne monovalente molekyler (kjent som enkeltkjede Fv (scFv); se for eksempel Bird, et al., Science (1988) 242:423-426 and Huston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988)). Slike enkeltkjede antistoff er også tiltenkt å omfatte innen termen ”antigenbindende porsjon” av et antistoff. Andre former for enkeltkjede antistoff, så som diabodier er også omfattet. Diabodier er bivalente, bispesifikke antistoff hvor VH- og VL-domenene uttrykkes på én enkelt polypeptidkjede, men anvender en linker som er for kort til å muliggjøre paring mellom de to domener på den samme kjede, og derved presser domenene til å pare med komplementære domener av en annen kjede og etablere to antigenbindende seter (se for eksempel Holliger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993); Poljak, et al.

Structure, 2:1121-1123 (1994)).

Videre, et antistoff eller antigenbindende porsjon derav kan være del av et større immunoadhesjonsmolekyl, formet med kovalent eller ikke-kovalent assosiering av antistoffet eller antistoffporsjonen med én eller flere andre proteiner eller peptider. Eksempler på slike immunoadhesjonsmolekyler inkluderer anvendelse av streptavidin kjerneregion for å framstille en tetramerisk scFv molekyl (Kipriyanov, et al., Human Antibodies and Hybridomas, 6:93-101 (1995)) og anvendelse av en cystein enhet, en markørpeptid og en C-terminal polyhistidinmarkør for å gjøre det bivalent og biotinylerte scFv molekyler (Kipriyanov, et al., Mol. Immunol., 31:1047-1058 (1994)). Andre eksempler inkluderer der hvor én eller flere CDRer fra et antistoff inkorporeres i et molekyl enten kovalent eller ikke-kovalent for å gjøre det til et immunoadhesin som spesifikt binder til et antigen av interesse, så som P-cadherin. I slike utførelser kan CDR(ene) inkorporeres som en del av en større polypeptidkjede, kan kovalent kobles til en annen polypeptidkjede, eller kan inkorporeres ikkekovalent. Antistoffporsjoner, så som Fab og F(ab’)2 fragmenter kan framstilles fra hele antistoff ved anvendelse av konvensjonelle teknikker, så som papain eller pepsinoppkutting, respektivt, av hele antistoff. Videre, antistoff, antistoffporsjoner og immunoadhesjonsmolekyler kan oppnås ved anvendelse av en standard rekombinante DNA-teknikker, som beskrevet heri.

Idet et ”antistoff” refereres til heri i forhold til foreliggende oppfinnelse skal det forstås at en antigenbindende porsjon derav også kan anvendes. En antigenbindende porsjon konkurrerer med det intakte antistoff for spesifikk binding. Se generelt Fundamental Immunology, Ch.7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (inkorporert med referanse i sin helhet for alle formål). Antigenbindende porsjoner kan produseres med rekombinante DNA-teknikker eller med en enzymatisk eller kjemisk spalting av intakte antistoff. I noen utførelser inkluderer antigenbindende porsjoner Fab, Fab’, F(ab’)2, Fd, Fv, dAb, og komplementærbestemmende region (CDR) fragmenter, enkeltkjede antistoff (scFv), kimerisk antistoff, diabodier og polypeptider som inneholder minst én porsjon av et antistoff som er tilstrekkelig til å gi spesifikk antigenbinding til polypeptidet. I utførelser som har mer enn ett bindingssete kan bindingssetene være identiske til hverandre eller de kan være forskjellige.

Som anvendt heri, termen ”humant antistoff” angir ethvert antistoff hvor de variable og konstante domenesekvenser er humane sekvenser. Termen omfatter antistoff med sekvenser avledet fra humane gener, men som har blitt forandret, for eksempel for å redusere mulig immunogenitet, øke affinitet, eliminere cysteiner som kan forårsake uønsket folding, etc. Termen omfatter også slik antistoffprodusert rekombinant i ikke-humane celler, som kan bevirke glykosylering som ikke er typisk for humane celler. Disse antistoff kan framstilles på en rekke måter, som beskrevet nedenfor.

Termen ”kimerisk antistoff” som anvendt heri angir et antistoff som omfatter regioner fra to eller flere forskjellige antistoff, inkluderende antistoff fra forskjellige arter. For eksempel, ett eller flere av CDRene fra et kimerisk antistoff kan avledes fra et humant P-cadherin antistoff. I ett eksempel kan CDRene fra et humant antistoff kombineres med CDRer fra et ikke-humant antistoff, så som mus eller rotte. I et annet eksempel kan alle CDRene være avledet fra humant P-cadherin antistoff. I et annet eksempel kan CDRene fra mer enn ett humant P-cadherin antistoff kombineres i et kimerisk antistoff. For eksempel, et kimerisk antistoff kan omfatte en CDR1 fra lettkjeden av en første human P-cadherin antistoff, en CDR2 fra lettkjeden av et andre humant P-cadherin antistoff og en CDR3 fra lettkjeden av en tredje human P-cadherin antistoff, og CDRer fra tungkjeden kan være avledet fra én eller flere andre P-cadherin antistoff. Videre, rammeverkregioner kan være avledet fra ett av P-cadherin antistoffene hvorfra én eller flere av CDRene er hentet, eller fra én eller flere forskjellige humane antistoff. Videre, termen ”kimerisk antistoff” er tiltenkt å omfatte ethvert av de ovennevnte kombinasjoner hvor kombinasjonene involverer humane og ikke-humane antistoff.

Som anvendt heri, termen ”humanisert antistoff” refererer til antistoff av ikke-human opprinnelse, hvor aminosyreenhetene som er karakteristiske for antistoffsekvenser av ikke-humane arter er erstattet med enheter som finnes i de korresponderende porsjoner i humane antistoff. Denne ”humaniseringsprosess” er tenkt å redusere immunogenisiteten i mennesker av det resulterende antistoff. Det vil anerkjennes at antistoff av ikke-human opprinnelse kan humaniseres ved anvendelse av teknikker godt kjent innen fagfeltet. Se for eksempel Winter, et al., Immunol. Today, 14:43-46 (1993). Det aktuelle antistoff kan konstrueres med rekombinante DNA-teknikker for å substituere CH1, CH2, CH3, hinge-domener og/eller rammeverkdomener med den korresponderende humane sekvens. Se for eksempel WO 92/02190 og US patenter nr. 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350, and 5,777,085. Termen ”humanisert antistoff” som anvendt heri inkluderer innen dets betydning kimeriske humane antistoff og CDR-podete antistoff. Kimeriske humane antistoff ifølge oppfinnelsen inkluderer VH og VL av et antistoff av en ikke-human art og CH og CL domenene av et humant antistoff. CDR-transplanterte antistoff ifølge oppfinnelsen resulterer fra erstatning av CDRer av VH og VL av et humant antistoff med de av VH og VL, respektivt, av et antistoff av et dyr som ikke er et menneske.

Som anvendt heri, termen ”ELISA” refererer til en enzymkoblet immunosorbent analyse. Denne analyse er godt kjent for fagkyndige innen feltet. Eksempler på slike analyser kan finnes i Vaughan, T.J., et al., Nat. Biotech., 14:309-314 (1996), og likeledes i eksempel 7 i foreliggende søknad.

Termen ”overflateplasmonresonans”, som anvendt heri, refererer til et optisk fenomen som muliggjør analyse av samtids biospesifikke interaksjoner med deteksjon av forandringer i proteinkonsentrasjoner innen en biosensor matrix, for eksempel ved anvendelse av BIACORE ™ systemet (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.). For ytterligere beskrivelser se Jonsson et al., Ann. Biol. Clin., 51:19-26 (1993); Jonsson, et al., Biotechniques, 11:620-627 (1991); Jonsson, et al., J. Mol. Recognit., 8:125-131 (1995); and Johnsson, et al., Anal. Biochem., 198:268-277 (1991).

Termen ”KD” refererer til bindingsaffinitet likevektskonstant av et bestemt antistoffantigen interaksjon. Et antistoff sies å spesifikt bindes til et antigen idet KD er ≤ 1 mM, fortrinnsvis ≤ 100 nM og mest fortrinnsvis ≤ 10 nM. En KD bindingsaffinitetkonstant kan måles med overflate plasmonresonans, for eksempel ved anvendelse av BIACORE™ systemet som diskutert i eksempel 6.

Termen ”Koff” refererer til dissosiasjonshastighetskonstanten av en bestemt antistoffantigen interaksjon. En Koff dissosiasjonshastighetskonstant kan måles med overflate plasmonresonans, for eksempel ved anvendelse av BIACORE™ systemet som diskutert i eksempel 6.

Som anvendt heri, termen ”P-cadherin avhengig celleadhesjonsanalyse” refererer til en analyse anvendt for å måle evnen av et P-cadherin antistoff til å blokkere adhesjon av celler til en reseptor P-cadherin som har blitt immobilisert på et faststoff støttemedium. Denne type analyse kan utføres for eksempel ved immobilisering av P-cadherin på et faststoff støttemedium, så som plast. Celler som overuttrykker P-cadherin tillates deretter å adhere til faststoff støttemediet via P-cadherin-P-cadherin interaksjoner. Nivået av adhesjon kan deretter kvantifiseres med og uten et P-cadherin antistoff. Adhesjon som en funksjon av antistoffkonsentrasjon kan deretter anvendes for å bestemme en IC50 verdi. Eksempel 3 tilveiebringer ytterligere detaljer av en P-cadherin-avhengig celleadhesjonsanalyse som ble anvendt for å måle IC50 verdier for P-cadherin antistoff.

Som anvendt heri, termen ”P-cadherin-avhengig celleaggregeringsanalyse” refererer til en analyse for å måle evnen av et P-cadherin antistoff for å blokkere aggregering av celler som uttrykker P-cadherin på deres overflater. For eksempel, denne type analyse kan anvende en cellelinje som overuttrykker P-cadherin, hvor cellene plasseres i suspensjon og tillates å danne P-cadherin-avhengige aggregater.

Aggregeringsanalysen anvendes deretter for å kvantifisere evnen av et P-cadherin antistoff i å hindre denne aggregering ved å måle størrelsen av cellulære aggregater som resulterer med og uten antistoffet. Celleaggregatsstørrelse som en funksjon av P-cadherin antistoffkonsentrasjon kan deretter anvendes for å bestemme en IC50 verdi. Eksempel 4 tilveiebringer ytterligere detaljer på en P-cadherin-avhengig aggregeringsanalyse som ble anvendt for å måle IC50 verdier for flere P-cadherin antistoff.

Som anvendt heri, termen ”P-cadherin-avhengig sfæroid ødeleggelsesanalyse” refererer til en analyse for å måle evnen av et P-cadherin antistoff for å ødelegge predannete P-cadherin-avhengige cellulære aggregeringer. Ved å måle størrelsesreduksjonen av aggregater som en funksjon av antistoffkonsentrasjonen, kan en IC50 verdi bestemmes. Eksempel 5 tilveiebringer ytterligere detaljer på en P-cadherin-avhengig sfæroid ødeleggelsesanalyse som ble anvendt for å måle IC50 verdier for P-cadherin antistoff.

Som anvendt heri, termen ”molekylær selektivitet” refererer til bindingsaffinitet av et antistoff for et spesifikt antigen er større enn for et beslektet antigen. For eksempel, antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være selektive for P-cadherin over E-cadherin, noe som betyr at bindingsaffiniteten av antistoffet for P-cadherin er minst 2 ganger større, for eksempel 4 ganger, eller 10 ganger, eller 50 ganger, eller 100 ganger, enn det for E-cadherin. Slike bindingsaffiniteter kan måles ved anvendelse av standardteknikker kjent for fagkyndige innen feltet.

Termen ”epitop” inkluderer enhver proteindeterminant i stand til spesifikk binding til et immunoglobulin eller T-celle reseptor eller på annen måte interaksjon med et molekyl. Epitopiske determinanter består generelt av en kjemisk aktiv overflategruppering av molekyler så som aminosyrer eller karbohydrat eller sukkersidekjeder og har generelt spesifikt tredimensjonale strukturegenskaper, og likeledes spesifikke ladningskarakteristika. En epitop kan være ”lineær” eller ”konformasjonal”. I en lineær epitop vil alle interaksjonspunktene mellom proteinet og det interagerende molekyl (så som et antistoff) forekomme lineært langs den primære aminosyresekvens av proteinet. I en konformasjonsepitop vil interaksjonspunktene forekomme på aminosyreenheter på proteinet som er separerte fra hverandre. Straks en ønsket epitop på et antigen er bestemt er det mulig å generere antistoff til denne epitop, for eksempel ved anvendelse av teknikker beskrevet ifølge foreliggende oppfinnelse. Alternativt, under oppdagelsesprosessen kan generering og karakterisering av antistoff ikke gi informasjon om ønskede epitoper. Fra denne informasjon er det mulig å kompetitivt screene antistoff for binding til den samme epitop. En løsning for å oppnå dette er å utføre kryss-kompetisjonsstudier for å finne antistoff som kompetitivt binder med et annet, det vil si antistoff som konkurrerer for binding til antigenet. En høy gjennomstrømningsprosess for ”binning” antistoff basert på deres kryss-kompetitivitet er beskrevet i internasjonal patentpublikasjon nr. WO 03/48731.

Termen ”konkurrerer” som anvendt heri med hensyn til et antistoff, betyr at et første antistoff eller en antigenbindende porsjon derav konkurrerer for binding med et andre antistoff eller en antigenbindende porsjon derav, hvor binding av det første antistoff med sitt kognat epitop detekterbart er redusert i nærvær av det andre antistoff sammenliknet med binding av det første antistoff i fravær av det andre antistoff.

Alternativt, hvor binding av det andre antistoff til dets epitop også er detekterbart redusert i nærvær av det første antistoff, kan, men trenger ikke å være tilfelle. Det vil si, et første antistoff kan inhibere binding av et andre antistoff til dets epitop uten at det andre antistoff inhiberer binding av det første antistoff til dets respektive epitop. Imidlertid, hvor hvert antistoff detekterbart inhiberer binding av det andre antistoff med dets kognat epitop eller ligand, enten det er det samme, større, eller i mindre grad, sies antistoffene å være ”kryss-kompetitive” med hverandre for binding av deres respektive epitop(er). Både kompetitive og kryss-kompetitive antistoff er omfattet av foreliggende oppfinnelse. Uavhengig av mekanisme hvorved slik konkurranse eller kryss-kompetisjon forekommer (for eksempel sterisk hindring, konformasjonsforandring, eller binding til en felles epitop, eller porsjon derav, og ligndende), vil den fagkyndige innse, basert på læringen som gis heri, at slik konkurranse og/eller kryss-kompetitivt antistoff er omfattet å være nyttige for framgangsmåtene beskrevet heri.

Som anvendt heri, termen ”utnytte” med referanse til et bestemt gen angir at aminosyresekvensen av en bestemt region i et antistoff var endelig avledet fra dette gen under B-celle modning. For eksempel, frasen ”en tungkjede variabel region aminosyresekvens som utnytter et humant VH-3 familiegen” refererer til situasjonen hvor VH-regionen av antistoffet var avledet fra VH-3 familien av gensegmenter under B-cellemodning. I humane B-celler er der mer enn 30 distinkte funksjonelle tungkjedevariable gener av hvilke man kan generere antistoff. Anvendelse av en bestemt tungkjede variabelt gen, derfor, er indikativ på en foretrukket bindingsmotiv av antistoff-antigen-interakjson med hensyn til de kombinerte egenskaper av binding til antigenet og funksjonell aktivitet. Som det skal innses, genutnyttelsesanalyser tilveiebringer kun en begrenset oversikt over antistoffstrukturen. Idet humane B-celler stokastisk genererer V-D-J tung eller V-J kappa lettkjede transkripter, er der et antall sekundære prosesser som foregår, inkluderende uten begrensning, somatisk hypermodning, n-tilsettinger og CDR3-ekstensjoner. Se for eksempel Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997).

Som anvendt heri, de tjue konvensjonelle aminosyrer og deres forkortelser følger konvensjonell bruk. Se Immunology - A Synthesis (2<nd>Edition, E.S. Golub and D.R.

Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), inkorporert heri med referanse.

Termen ”polynukleotid” som referert til heri, angir en polymerisk form av nukleotider av minst 10 baser i lengde, enten ribonukleotider eller deoksynukleotider eller en modifisert form av enhver type nukleotid. Termen inkluderer enkelt- og dobbeltrådede former.

Termen ”isolert polynukleotid” som anvendt heri angir et polynukleotid av genomisk, cDNA eller syntetisk opprinnelse eller en kombinasjon derav, som på grunn av sin opprinnelse det ”isolerte polynukleotid” (1) ikke er assosiert med eller en porsjon av polynukleotider hvorved det ”isolerte polynukleotid er funnet i naturen, (2) er funksjonelt koblet til et polynukleotid hvortil det ikke er koblet til naturen, eller (3) ikke forekommer i naturen som del av en større sekvens.

Termen ”naturlig forekommende nukleotider” som anvendt heri inkluderer deoksyribonukleotider og ribonukleotider. Termen ”modifiserte nukleotider” som anvendt heri inkluderer nukleotider med modifiserte eller substituerte sukkergrupper og lignende. Termen ”oligonukleotid bindinger” referert til heri inkluderer oligonukleotider så som fosfortioat, fosforditioat, fosforselenoat, fosfordiselenoat, fosforanilotioat, fosforaniladat, fosforamidat, og lignende. Se for eksempel LaPlanche, et al., Nucl. Acids Res., 14:9081 (1986); Stec, et al., J. Am. Chem. Soc., 106:6077 (1984); Stein, et al., Nucl. Acids Res.,16:3209 (1988); Zon, et al., Anti-Cancer Drug Design, 6:539 (1991); Zon, et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); U.S. Patent No.5,151,510; Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews, 90:543 (1990), hvilke beskrivelser inkorporeres heri med henvisning. Et oligonukleotid kan inkludere en markør for deteksjon, dersom hensiktsmessig.

”Funksjonelt koblete” sekvenser inkluderer både ekspresjonskontrollsekvenser som er kontigøse med det aktuelle gen og ekspresjonskontrollsekvenser som virker in trans eller i en avstand for å kontrollere det aktuelle gen.

Termen ”ekspresjonskontrollsekvens” som anvendt heri angir polynukleotidsekvenser som er nødvendige for å effektuere ekspresjon og for å prosessere kodesekvenser hvortil de skal ligeres. Ekspresjonskontrollsekvenser inkluderer egnete transkripsjon initiering, terminering, promoter og enhancer sekvenser; effektive RNA prosesseringssignaler så som spleising og polyadenyleringssignaler; sekvenser som stabiliserer cytoplasmisk mRNA; sekvenser som forsterker translasjonseffektivitet (det vil si Kozak konsensussekvens); sekvenser som forbedrer proteinstabilitet; og dersom ønskelig, sekvenser som forsterker proteinsekresjon. Naturen til slike kontrollsekvenser er forskjellige avhengige av vertorganismen; i prokaryote inkluderer slike kontrollsekvenser generelt promotorer, ribosomalt bindingssete og transkripsjonstermineringssekvens; i eukaryote inkluderer slike kontrollsekvenser promoterer og transkripsjonstermineringssekvens. Termen ”kontrollsekvenser” er tiltenkt å inkludere, i det minste, alle forbindelser hvis nærvær er essensiell for ekspresjon og prosessering, og kan også inkludere ytterligere komponenter hvis nærvær er fordelaktig, for eksempel ledersekvenser og fusjonspartnersekvenser.

Termen ”vektor” som anvendt heri angir et nukleinsyremolekyl i stand til å transportere en annen nukleinsyre til hvilken den har blitt koblet. I noen utførelser er vektoren en plasmid, det vil si et sirkulært dobbelttrådet stykke DNA hvortil ytterligere DNA-segmenter kan være ligerte. I noen utførelser er vektoren en viral vektor, hvor de ytterligere DNA-segmenter kan være ligert til virusgenomet. I noen utførelser er vektorene i stand til autonomreplikasjon i en vertcelle hvori de er introdusert (for eksempel bakterielle vektorer som har en bakteriell opprinnelse av replikasjon og episomal mammalske vektorer). I noen utførelser kan vektorene (for eksempel ikkeepisomale mammalske vektorer) integreres i genomet av en vertcelle ved introduksjon inn i vertcellen, og dermed repliseres sammen med vertgenomen.

Videre, visse vektorer er i stand til å dirigere ekspresjon av gener hvortil de er operativt koblet. Slike vektorer benevnes heri som ”rekombinante ekspresjonsvektorer” (eller for enkelhets skyld ”ekspresjonsvektorer”).

Termen ”rekombinant vertcelle” (eller enkelt ”vertcelle”) som anvendt heri, angir en celle hvori en rekombinant ekspresjonsvektor har blitt introdusert. Det skal forstås at ”rekombinant vertcelle” og ”vertcelle” ikke kun angir den bestemte subjektcelle men også avkommet av slik en celle. På grunn av at visse modifiseringer kan forekomme i påfølgende generasjoner på grunn av enten mutasjon eller miljømessige påvirkninger, kan slike avkom faktisk ikke nødvendigvis være identiske til morcellen, men er fremdeles inkludert innen rammen av termen ”vertcelle” som anvendt heri.

Som anvendt heri, termen ”arvelinje” refererer til nukleotidsekvensene av antistoffgener og gensegmentene idet de passerer fra mor til avkom via arvecellene. Denne arvelinjesekvens skilles fra nukleotidsekvensene som koder antistoff i modne B-celler som har blitt forandret med rekombinasjon og hypermutasjonshendelser under forløpet med B-cellemodning.

Termen ”prosent sekvensidentitet” i konteksten av nukleinsyresekvenser angir enhetene i to sekvenser som er de samme idet de alignes for maksimal overensstemmelse. Lengden av sekvensidentitetssammenlikningen kan være over et strekk på minst ca. ni nukleotider, vanligvis minst ca.18 nukleotider, mer vanligvis minst ca.

24 nukleotider, typisk minst ca.28 nukleotider, mer typisk minst ca.32 nukleotider og fortrinnsvis minst ca.36, 48 eller flere nukleotider. Der er et antall forskjelllige algoritmer kjent innen fagfeltet som kan anvendes for å holde nukleotidsekvensensidentitet. For eksempel, polynukleotidsekvenser kan sammenliknes ved anvendelse av FASTA, Gap eller Bestfit, som er programmer i Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, som inkluderer for eksempel programmene FASTA2 og FASTA3, tilveiebringer alignment og prosentsekvens identitet av regioner av beste overlapp mellom søket og søksekvensene (Pearson, Methods Enzymol., 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol., 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol., 266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol.276:71-84 (1998); inkorporert heri med referanse. Med mindre annet er spesifisert benyttes default parametere for et bestemt program eller algoritme. For eksempel, prosent sekvensidentitet mellom nukleinsyresekvenser kan bestemmes ved anvendelse av FASTA med dets default parametere (en ordstørrelse på 6 og NOPAM-faktor på scoringsmatrix) eller ved anvendelse av Gap med dets default parametere som tilveiebrakt i GCG versjon 6.1, inkorporert heri med referanse.

En referanse til en nukleotidsekvens omfatter dets komplement med mindre annet er spesifisert. Således, en referanse til en nukleinsyre som har en bestemt sekvens skal forstås å omfatte dets komplementære tråd, som dets komplementære sekvens.

Termen ”i hovedsak lik” eller ”vesentlig sekvenslikhet” idet det refereres til en nukleinsyre eller fragment derav, angir at idet de er optimalt alignet med egnete nukleotidinnskudd eller delesjoner med en annen nukleinsyre (eller dets komplementære tråd), er der en nukleotid sekvensidentitet på minst ca.85%, fortrinnsvis minst ca.90%, og mer foretrukket minst ca.95%, 96%, 97%, 98% eller 99% av nukleotidbasene, som målt med godt kjente algoritmer for sekvensidentitet, så som FASTA, BLAST eller Gap, som beskrevet ovenfor.

Termen ”prosent sekvensidentitet” i konteksten av aminosyresekvenser angir enhetene i to sekvenser som er det samme idet de alignes for maksimal overensstemmelse. Lengden av sekvensidentitetssammenlikninger kan være over en strekk på minst ca. fem aminosyrer, vanligvis minst ca.20 aminosyrer, mer vanlig ca.30 aminosyrer, typisk minst ca.50 aminosyrer, mer typisk minst ca.100 aminosyrer, og enda mer typisk ca. 150, 200 eller flere aminosyrer. Der er et antall forskjellige algoritmer kjent innen fagfeltet som kan anvendes for å måle aminosyresekvensensidentitet. For eksempel, aminosyresekvenser kan sammenliknes ved anvendelse av FASTA, Gap eller Bestfit, som er programmer i Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin.

Som anvendt for polypeptider, termen ”i hovedsak identitet” eller ”vesentlig likhet” angir at to aminosyresekvenser, idet de er alignet optimalt, så som programmene GAP eller BESTFIT ved anvendelse av default gap vekting, som levert av programmene, deler minst 70%, 75% eller 80% sekvensidentitet, fortrinnsvis minst 90% eller 95% sekvensidentitet, og mer fortrinnsvis minst 97%, 98% eller 99% sekvensidentitet. I visse utførelser kan enhetsposisjoner som ikke er identiske avvike med konservative aminosyresubstitueringer.

Som anvendt heri, en ”konservativ aminosyresubstituering” er én hvor en aminosyreenhet substitueres av en annen aminosyreenhet som har en sidekjede R-gruppe med like kjemiske egenskaper (for eksempel ladning eller hydrofobisitet). Generelt, en konservativ aminosyresubstituering vil ikke i vesentlig grad forandre de funksjonelle egenskaper til et protein. I tilfeller hvor to eller flere aminosyresekvenser avviker fra hverandre med konservative substitueringer, kan prosent sekvensidentitet justeres oppover for å korrigere for den konservative natur av substitueringen. Midler for å gjøre slik justering er godt kjent for fagkyndige innen feltet. Se for eksempel Pearson, Methods Mol. Biol., 243:307-31 (1994). Eksempler på grupper av aminosyrer som har sidekjeder med like kjemiske egenskaper inkluderer; 1) alifatiske sidekjeder; glysin, alanin, valin, leucin, og isoleucin; 2) alifatisk-hydroksyl sidekjeder: serin og treonin; 3) amidinneholdende sidekjeder: asparagin og glutamin; 4) aromatiske sidekjeder: fenylalanin, tyrosin og tryptofan; 5) basiske sidekjeder: lysin, arginin og histidin; 6) sure sidekjeder; asparaginsyre og glutaminsyre; og 7) svovelinneholdende sidekjeder: cystein og metionin. For eksempel kan konservative aminosyresubstitueringsgrupper være: valin-leusin-isoleusin, fenylalanin-tyrosin, lysin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat, og asparagin-glutamin.

Alternativt, en konservativ erstatning er enhver forandring som har en positiv verdi i PAM250 log-sannsynlighetsmatrix beskrevet i Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992), inkorporert heri med referanse. En ”moderat konservativ” erstatning er enhver forandring som har en ikke-negativ verdi i PAM250 log-sannsynlighetsmatrix.

Sekvensidentitet for polypeptider måles typisk ved anvendelse av sekvensanalyseprogramvare. Proteinanalyseprogramvarer matcher sekvenser ved anvendelse av mål av likhet tilhørende til forskjellige substitueringer, deleteringer og andre modifiseringer, inkluderende konservative aminosyresubstitueringer. For eksempel, CGC inneholder programmer så som ”Gap” og ”Bestfit” som kan anvendes med default parametere som spesifisert av programmene for å bestemme sekvenshomologi eller sekvensidentitet mellom nært beslektede polypeptider, så som homologe polypeptider fra forskjellige species av organismer eller mellom en villtype protein og en analog derav. Se for eksempel GCG versjon 6.1 (University of Wisconsin, WI). Polypeptidsekvenser kan også sammenliknes med anvendelse av FASTA ved anvendelse av default eller anbefalte parametere, se GCG versjon 6.1. FASTA (for eksempel FASTA2 og FASTA3) tilveiebringer alignment og prosent sekvensidentitet av regionene med best overlapp mellom søke- og søksekvensene (Pearson, Methods Enzymol., 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol., 132:185-219 (2000)). En annen foretrukket algoritme ved sammenlikning av en sekvens ifølge oppfinnelsen til en database inneholdende et stort antall sekvenser fra forskjellige organismer er datamaskinprogrammet BLAST, spesielt blastp eller tblastn, ved anvendelse av default parametere som levert av programmet. Se for eksempel Altschul, et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990); Altschul, et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-402 (1997).

Lengden av polypeptidsekvensene sammenliknet med homologi vil generelt være minst ca.16 aminosyreenheter, vanligvis ca.20 enheter, mer vanlig minst 24 enheter, typisk minst ca.28 enheter, og fortrinnsvis mer enn ca.35 enheter. Ved søking av en database inneholdende sekvenser fra et stort antall forskjellige organismer er det foretrukket å sammenlikne aminosyresekvenser.

Som anvendt heri, termene ”markør” eller ”merket” refererer til inkorporering av et annet molekyl i antistoffet. I én utførelse er markøren en detekterbar markør, for eksempel inkorporering av en radiomerket aminosyre eller tilfesting av et polypeptid av biotinylenhet som kan detekteres med markøren avidin (for eksempel streptavidin inneholdende en fluoriserende markør eller en enzymatisk aktivitet som kan detekteres med optiske eller kolorimetriske metoder). I en annen utførelse kan markøren være terapeutisk, for eksempel et medikamentkonjugat eller toksin.

Forskjellige framgangsmåter for å merke polypeptidet og glukoproteinet er kjent innen fagfeltet, og kan anvendes. Eksempler på markører for polypeptider inkluderer, men er ikke begrenset til, følgende: radioisotoper eller radionuklider (for eksempel<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I), fluoriserende markører (for eksempel FITC, rhdamin, lantanid fosfor), enzymatiske markører (for eksempel pepperrot peroksidase, β-galactosidase, luciferase, alkalisk fosfotase), kjemiluminiserende markører, biotinylgrupper, forutbestemte polypeptidepitoper som gjenkjennes av en sekundær reporter (for eksempel leucin zipper parsekvenser, bindingsseter for sekundære antistoff, metallbindingsdomener, epitopmarkører), magnetiske midler, så som gadolinium kelater, toksiner så som pertussis toksin, taksol, cytokalasin B, gramicidin D, etidiumbromid, emetin, mitomycin, etoposid, tenoposid, vinkristin, vinblastin, colkicin, doksorubicin, daunorubicin, dihydroksy antracin dion, mitoksantron, mitramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosteron, glukokorticoider, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, og puromycin og analoger eller homologer derav. I noen utførelser er markørene festet med spacer armer av forskjellig lengde for å redusere potensiell sterisk hindring.

”Terapeutisk effektiv mengde” refererer til mengden av det terapeutiske middel som blir administrert som i noen grad vil lindre ett eller flere symptomer av forstyrrelsen som blir behandlet. Med referanse til behandling av cancer, refererer en terapeutisk effektiv mengde til den mengde som har minst én av følgende effekter: Redusere størrelsen av tumoren, inhibere (det vil si redusere i noen grad, fortrinnsvis stoppe) tumormetastase; inhibere i noen grad (det vil si redusere i noen grad, fortrinnsvis stoppe) tumorvekst, og lindre i noen grad (eller fortrinnsvis eliminere) én eller flere symptomer assosiert med canceren.

”Behandle”, ”behandler” og ”behandling” refererer til en framgangsmåte for å lindre eller oppheve en biologisk forstyrrelse og/eller dets ledsagende symptomer. Med referanse til cancer vil disse termer ganske enkelt bety at livsforlengelsen av et individ som er angrepet av cancer vil øke og at én eller flere av symptomene og sykdommen vil bli redusert.

”Sett i forbindelse med” refererer til å bringe et antistoff eller antigenbindende porsjon derav ifølge oppfinnelsen og et mål P-cadherin, eller epitop derav, sammen på en slik måte at antistoffet kan utvise den biologiske aktivitet av P-cadherin. Og sett i forbindelse på denne måte kan det utføres ”in vitro”, det vil si i et testrør, en petriskål eller lignende. I et testrør vil og sett i forbindelse involvere kun et antistoff eller antigenbindende porsjon derav og P-cadherin eller epitop derav, eller det kan involvere helceller. Celler kan også opprettholdes eller vokse i celledyrkingsskåler og settes i forbindelse med antistoff eller antigenbindende porsjoner derav i dette miljø. I denne sammenheng, evnen av et bestemt antistoff eller antigenbindende porsjon derav til å påvirke en P-cadherin-relatert forstyrrelse, det vil si IC50 av antistoffet, kan bestemmes før anvendelse av antistoffet in vivo med mer komplekse levende organismer. For celler på utsiden av organismen eksisterer flere metoder, og disse er godt kjent for fagkyndige innen feltet, å sette P-cadherin i forbindelse med antistoffene eller antigenbindende porsjoner derav.

”Unormal cellevekst” som anvendt heri, med mindre annet er angitt, refererer til cellevekst som er uavhengig av normale regulatoriske mekanismer (for eksempel tap av kontaktinhibering), inkluderende den avvikende vekst av normale celler og vekst av avvikende celler. Dette inkluderer, men er ikke begrenset til, avvikende vekst av: tumorceller (tumorer) som prolifererer med å uttrykke en mutert tyrosinkinase eller overekspresjon av en reseptor tyrosinkinase; benigne og maligne celler av andre proliferative sykdommer hvor avvikende tyrosinkinase aktivering forekommer; enhver tumor som profilerer med reseptor tyrosinkinaser; enhver tumor som profilerer ved avvikende serin/treonin kinase aktivering; benigne og maligne celler av andre proliferative sykdommer hvor avvikende serin/treonin kinase aktivering forekommer; tumorer, både benigne og maligne, ekspresjon av et aktivert Ras onkogen; tumorceller, både benigne og maligne, hvor Ras-proteinet er aktivert som et resultat av onkogenisk mutasjon i et annet gen; benigne og maligne celler av andre proliferative sykdommer hvor avvikende Ras-aktivering forekommer. Eksempler på slike benigne proliferative sykdommer er psoriasis, benign prostatisk hypertrofi, human papillomavirus (HPV), og restinose. ”Unormal cellevekst” refererer også til å inkludere avvikende vekst av celler, både benign og malign, resulterende fra aktivitet av enzymet farnesyl protein transferase.

Termene ”avvikende cellevekst” og ”hyperproliferativ forstyrrelse” anvendes om hverandre i denne søknad.

”In vitro” refererer til prosedyrer utført i et artifisielt miljø så som, uten begrensning, i et testrør eller dyrkingsmedium.

”In vivo” refererer til prosedyrer utført i en levende organsime så som, uten begrensning, en mus, rotte eller kanin.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser aminosyre- og nukleinsyresekvenser av SEQ ID NO: 1-347.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Humane P-cadherin antistoff

Foreliggende oppfinnelse vedrører isolerte humane antistoff, eller antigenbindende porsjoner derav, som binder til human P-cadherin. Fortrinnsvis, de humane antistoff er rekombinante humane P-cadherin antistoff som har større affinitet for P-cadherin enn for E-cadherin. Forskjellige aspekter av oppfinnelsen vedrører slike antistoff og antigenbindende porsjoner, og farmasøytiske sammensetninger derav, og likeledes nukleinsyrer, rekombinante ekspresjonsvektorer og vertceller for å framstille slike antistoff og antigenbindende porsjoner. Framgangsmåter for å anvende antistoffene og antigenbindende porsjoner ifølge oppfinnelsen for å detektere human P-cadherin eller for å inhibere human P-cadherin-aktivitet, enten in vitro eller in vivo, er også omfattet av oppfinnelsen.

P-cadherin aminosyre- og nukleinsyresekvenser fra flere arter, inkluderende menneske, er kjent, se for eksempel katalog nr. NM_001793.3. Human P-cadherin, eller antigeniske porsjoner derav, kan framstilles i samsvar med framgangsmåter godt kjent innen fagfeltet, eller kan innkjøpes fra kommersielle leverandører (for eksempel R&D Systems 861-PC-100).

I visse utførelser er antistoffene ifølge oppfinnelsen IgGer angitt som: 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; og g-129-1c4. Som diskutert i mer detalj i eksempel 1, høy gjennomstrøminingsscreening av en scFv-fag displaybibliotek ble anvendt for å identifisere 129-1c4 scFv, som deretter ble omdannet til en IgG.129-1c4 representerer ledeantistoffet identifisert under innledende fagdisplayscreening og er morantistoffet av linje hvorfra flere andre antistoff ifølge oppfinnelsen ble avledet. Flere av slike avledete antistoff er angitt som 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; og 200-h06 og representerer optimaliserte antistoff innen morlinjen 129-1c4. g-129-1c4 antistoffet er arvelinjeversjonen av 129-1c4 morantistoffet hvor visse aminosyrer i rammeverkregionene til VH- og VL-domenene ble mutert for å matche de i arvelinjerammeverkregioner. Enhver av antistoffene nevnt over kan også ”arvelinjes” slik at rammeverkregionsekvensene er identiske til arvelinjerammeverksekvensene som i g-129-1c4. For eksempel, i én utførelse av foreliggende oppfinnelse er antistoffene g-194-b09, g-194-g09, g-196-g03, g-196-h02, g-194-e01, g-195-e11, g-200-h06, og g-194-e06 arvelinjeversjonene av 194-b09, 194-g09, 196-g03, 196-h02, 194-e01, 195-e11, 200-h06, and 194-e06, respektivt. De spesifikke aminosyrer som ble mutert for å framkomme til arvelinjeversjonene er åpenbare for fagkyndige innen feltet ved sammenlikning av sekvensene av en arvelinje vs. ikke-arvelinje antistoff. Som diskutert nedenfor, spesifikke aminosyresekvenser av antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet i tabeller 1-3 og figur 1.

Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse ble generert med en sterk tilbøyelighet mot utnyttelse av VH3-genfamilien av tungkjede variable regioner. Spesielt, 129-1c4 morantistoffet avledet fra VH3-23 variabelt gensegment. I humane B-celler er det mer enn 30 forskjellige funksjonelle tungkjede variable gener med hvilke man kan generere antistoff. Bias er derfor indikerende for et foretrukket bindingsmotiv av antistoff-antigen-interaksjon med hensyn til de kombinerte egenskaper av binding til antigenet og funksjonell aktivitet.

Slik det skal innses, genanvendelsesanalyser tilveiebringer kun en begrenset oversikt over antistoffstruktur. Idet humane B-celler stokastisk genererer V-D-J tungeller V-J kappa lettkjede transkripter, er der et antall sekundære prosesser som foregår, inkluderende uten begrensning, somatisk hypermutering, n-addisjoner og CDR3 ekstensjoner. Se for eksempel Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) og US publisert patentsøknad 2003-0070185, av 19. februar 2002. Således, for ytterligere å undersøke antistoffstruktur ifølge oppfinnelsen ble predikerte aminosyresekvenser av antistoffene generert fra cDNAer oppnådd fra klonene. I tillegg ble N-terminale aminosyresekvenser oppnådd gjennom proteinsekvensering. Figur 1 tilveiebringer nukleotid- og aminosyresekvenser for tung- og lettkjede regioner av flere av antistoffene ifølge oppfinnelsen.

Hver av de spesifikke antistoff nevnt over kan beskrives med deres variable domenesekvenser av tung (VH) og lett (VL) kjedene som angitt tabellene 1 og 2. De spesifikke sekvenser referert til av disse SEQ ID NOer er vist i figur 1. Som angitt i tabeller 1 og 2, de korresponderende VH- og VL-aminosyre og DNA-sekvenser av antistoffene nevnt over er beskrevet i SEQ ID NO: 1-23, 68-90, og 320-343.

Tabell 1

Tabell 2

Ytterligere antistoff og antigenbindende porsjoner ifølge foreliggende oppfinnelse kan også beskrives som omfattende de forskjellige CDR- og FR-sekvenser som utgjør tung- og lettkjede variable regioner av antistoffene angitt i tabeller 1 og 2. Således, SEQ ID NOer som korresponderer til forskjellige CDR- og FR-sekvenser av antistoffene ifølge oppfinnelsen er angitt i tabell 3. Videre, et antall randomiserte mutasjoner i tung- og lettkjeden CDR3 regioner av 129-1c4 morantistoff ble også utført, som ga forbedret P-cadherin affinitet i området fra 10 til 417 gangers forbedring som målt med en epitop kompetisjonsanalyse (se eksempel 8). SEQ ID NOene av disse muterte VH og VL CDR3 sekvenser (SEQ ID NO: 91-256 og 257-319) er også inkludert i tabell 3 nedenfor.

Tabell 3

Framgangsmåter for å produsere antistoff

Fagdisplaybibliotek

Antistoffene eller antigenbindende porsjoner ifølge foreliggende oppfinnelse kan framstilles i samsvar med flere metoder kjent innen fagfeltet. For eksempel, fagdisplayteknikker kan anvendes for å tilveiebringe biblioteker inneholdende et repertoar av antistoff med varierende affinitet for P-cadherin. Disse bibliotek kan deretter screenes for å identifisere og isolere antistoff med den ønskete affinitet for P-cadherin.

For eksempel, rekombinante humane P-cadherin-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan isoleres med screening av et rekombinant kombinatorisk antistoffbibliotek. Fortrinnsvis er biblioteket et scFv fagdisplaybibliotek, generert ved anvendelse av human VL og VH cDNAer framstilt fra mRNA isolert fra humane B-celler. Framgangsmåtene for framstilling og screening av slike bibliotek er kjent innen fagfeltet. Kitt for å generere fagdisplaybiblioteker er kommersielt tilgjengelige (for eksempel the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catalog no. 27-9400-01; og the Stratagene SurfZAP<™>fagdisplaykit, katalog nr.240612). Der er også andre framgangsmåter og reagenser som kan anvendes i generering og screening av antistoffdisplaybiblioteker (se for eksempel US patent 5,223,409; PCT publikasjon WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679,

WO 93/01288, WO 92/01047, og WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay, et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 3:81-85 (1992); Huse, et al., Science, 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990); Griffiths, et al., EMBO J., 12:725-734 (1993); Hawkins, et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992); Clackson, et al., Nature 352:624-628 (1991); Gram, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3576-3580 (1992); Garrad, et al., Bio/Technology, 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom, et al., Nuc. Acid Res., 19:4133-4137 (1991); Barbas, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7978-7982 (1991); and Griffiths, et al., EMBO J., 13:3245-3260 (1994); som alle inkorporeres heri med henvisning.

En ytterligere framgangsmåte for å framstille et bibliotek av antistoff for anvendelse i fagdisplayteknikkene omfatter trinnet å immunisere et ikke-humant dyr omfattende human immunoglobulin loci med P-cadherin og en antigenisk porsjon derav for å etablere en immunrespons, ekstrahere antistoff-produserende celler fra det immuniserte dyr; isolere RNA som koder for tunge og lette kjeder av antistoffene ifølge oppfinnelsen fra de ekstraherte celler, revers transkribere RNA for å produsere cDNA, mangfoldiggjøre cDNA ved anvendelse av primere, og innsette cDNA i en fagdisplay vektor slik at antistoffene uttrykkes på fagen. For produksjon av slike repertoarer er det unødvendig å immortaliserte B-cellene fra det immuniserte dyr. I stedet, primære B-celler kan anvendes direkte som en kilde for DNA. Blandingen av cDNAer oppnådd fra B-celler, for eksempel avledet fra milt, anvendes for å framstille et ekspresjonsbibliotek, for eksempel et fagdisplaybibliotek transfektert inn E.coli. Til slutt identifiseres klonene fra biblioteket som produserer bindingsaffiniteter av den ønskede størrelse for antigenet og DNA som koder for produktet som er ansvarlig for slik binding gjenvinnes og manipuleres for standard rekombinant ekspresjon.

Fagdisplaybiblioteket kan også konstrueres ved anvendelse av tidligere manipulerte nukleotidsekvenser, og screenes på tilsvarende måte. Generelt, cDNAene som koder for tunge og lette kjeder forsynes uavhengig, eller koblet for å danne Fvanaloger for produksjon i fagbiblioteket. Fagbiblioteket screenes deretter for antistoffene med høyeste affinitet for P-cadherin, og de genetiske materialer gjenvinnes fra den egnete klon. Ytterligere runder med screening kan øke affiniteten av det opprinnelige antistoff som ble isolert.

I én utførelse, for å isolere og produsere humane P-cadherin antistoff med de ønskete karakteregenskaper, blir et humant P-cadherin antistoff som beskrevet heri, først anvendt for å selektere humane tunge og lette kjedesekvenser som har lignende bindingsaktivitet mot P-cadherin, ved anvendelse epitopprintingsmetoder beskrevet i PCT publikasjon WO 93/06213, inkorporert heri med referanse. Antistoffbibliotekene som anvendes i denne metode er fortrinnsvis scFv biblioteker framstilt og screenet som beskrevet i PCT publikasjon WO 92/01047, McCafferty, et al., Nature, 348:552-554 (1990); and Griffiths, et al., EMBO J.12:725-734 (1993), alle inkorporeres heri med referanse. scFv antistoffbibliotekene kan screenes ved anvendelse av human P-cadherin som antigen. Fagbibliotek screenes for antistoffene med den høyeste affinitet for P-cadherin og det genetiske materiale gjenvinnes fra den egnete klon. Ytterligere runder med screening kan øke affiniteten av det opprinnelse antistoff som blir isolert.

Straks innledende humane VL og VH domener er selektert, kan ”mix and match” eksperimenter deretter utføres, hvor forskjellige par av innledningsvis selektere VL og VH segmenter screenes for P-cadherin-binding for å selektere foretrukne VL/VH-parkombinasjoner. Disse mix and match eksperimenter kan også utføres etter at VH og VL segmentene har blitt vilkårlig mutert for optimalisert binding som beskrevet nedenfor. Videre, for ytterligere å forbedre kvaliteten av antistoffet, kan VL og VH segmentene av foretrukne VL/VH par vilkårlig muteres, fortrinnsvis innen CDR3-regionen av VH og/eller VL, i en prosess analog til in vivo somatisk mutasjonsprosess ansvarlig for affinitetsmodning av antistoffene under naturlig immunrespons. Denne in vitro affinitetsmodning kan utføres for eksempel ved å amplifisere VH og VL domener ved anvendelse av PCR primere komplementære til VH CDR3 eller VL CDR3, respektivt, hvor primerne har blitt ”spiked” med en vilkårlig blanding av de fire nukleotidbaser ved visse posisjoner slik at de resulterende PCR-produkter koder VH og VL-segmenter i områder hvor vilkårlige mutasjoner har blitt introdusert inn i VH og/eller VL CDR3 regioner. Disse vilkårlig muterte VH og VL segmenter kan rescreenes for binding til P-cadherin, og sekvensene som oppviser høyest affinitet og en lav off-rate for P-cadherin kan selekteres. Som diskutert tidligere, flere VH og VL CDR3 sekvenser ifølge foreliggende oppfinnelse som ble vilkårlig mutert og vist forbedret affinitet er angitt med SEQ ID NO: 91-256 og 257-319.

Etter screening og isolering av et P-cadherin antistoff ifølge oppfinnelsen fra et rekombinant immunoglobulin displaybibliotek kan nukleinsyrer som koder for det utvalgte antistoff gjenvinnes fra displaypakken (for eksempel fra faggenomet) og subklones inn i andre ekspresjonsvektorer med standard rekombinante DNA-teknikker. Dersom ønskelig, kan nukleinsyren ytterligere manipuleres for å etablere andre antistoffer ifølge oppfinnelsen, som beskrevet nedenfor. For å uttrykke et rekombinant humant antistoff isolert med screening av et kombinatorisk bibliotek, klones DNA som koder for antistoffet inn i en rekombinant ekspresjonsvektor og introduseres inn i en vertcelle, som beskrevet nedenfor.

Immunisering

I en ytterligere utførelse kan humane P-cadherin antistoff produseres ved å immunisere et ikke-humant, transgent dyr som omfatter i dets genom noen eller alle av humane immunglobulin tungkjede og lettkjede loci med et P-cadherin antigen. For eksempel kan det ikke-humane dyr være et XENOMOUSE™ dyr.(Abgenix, Inc., Fremont, CA).

XENOMOUSE™ mus er konstruerte musestammer som omfatter store fragmenter av human immunoglobulin tungkjede og lettkjede loci og mangler museantistoffproduksjon. Se for eksempel Green, et al., Nature Genetics, 7:13-21 (1994) and U.S. Patent Nos.5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598, 6,130,364, 6,162,963 and 6,150,584. Se også WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560 og WO 00/037504.

Framgangsmåtene beskrevet i disse dokumenter kan modifiseres som beskrevet i US patent 5,994,619, som inkorporeres heri med henvisning. US patent 5,994,619 beskriver framgangsmåter for å produsere nye dyrkete indre cellemasseceller (CICM) og cellelinjer, avledet fra griser og kyr, og transgene CICM-celler hvori heterolog DNA har blitt innsatt. CICM transgene celler kan anvendes for å produsere klonete transgene embryoer, fetus og avkom. ’619-patentet beskriver også framgangsmåter for å produsere transgene dyr som er i stand til å overføre heterolog DNA til deres avkom. Eksempler på ikke-humane dyr som kan anvendes for disse framgangsmåter inkluderer rotter, sauer, griser, geiter, kveg, kylling og hester.

XENOMOUSE™ mus produserer en voksenlignende humant repertoar av fullstendige humane antistoff og genererer antigenspesifikke humane antistoff. I noen utførelser inneholder XENOMOUSE™ musen ca.80% av det humane antistoff V-gen repertoar gjennom introduksjon av megabasestørrelse, arvelinjekonfigurasjonsfragmenter av den humane tungkjede loci og kappa lettkjede loci i gjær artifisielt kromosom (YAC). I andre utførelser inneholder XENOMOUSE™ musen tilnærmet alle av de humane lambda lettkjede locus. Se Mendez, et al., Nature Genetics, 15:146-156 (1997), Green and Jakobovits, J. Exp. Med., 188:483-495 (1998), og WO 98/24893, hvis beskrivelse inkorporeres med henvisning.

I noen utførelser er det ikke-humane dyr som omfatter humane immunoglobulingener dyr som har et humant immunoglobulin ”minolocus”. I minilocus tilnærmingen etterliknes en eksogen lg-locus gjennom inkludering av individuelle gener fra lg-locus. Således, én eller flere VH-gener, én eller flere DH-gener, én eller flere JH-gener, et mu-konstant domene, og et andre konstant domene (fortrinnsvis et gamma konstant domene) formes til et konstrukt for innsetting inn i et dyr. Denne løsningen er beskrevet i US patenter 5,545,807, 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591,669, 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215, and 5,643,763, hermed inkorporert med referanse.

Ikke-humane dyr som beskrevet over kan deretter immuniseres med et P-cadherin antigen som beskrevet under, under betingelser som muliggjør produksjon av antistoff. Antistoffproduserende celler isoleres fra dyrene, og nukleinsyrer som koder for tung- og lettkjede av det aktuelle P-cadherin-antistoff isoleres fra de isolerte antistoffproduserende cellene eller fra en immortalisert cellelinje produsert av slike celler. Disse nukleinsyrer konstrueres deretter ved anvendelse av teknikker kjent av fagkyndige som beskrevet ytterligere nedenfor for å redusere mengden av ikkehuman sekvens, det vil si for å humanisere antistoffet for å redusere immunrespons i mennesker.

I noen utførelser kan P-cadherin antigenet være isolert og/eller renset P-cadherin. I noen utførelser er P-cadherin antigenet humant P-cadherin. I andre utførelser kan P-cadherin antigenet være en celle som uttrykker eller overuttrykker P-cadherin. I andre utførelser er P-cadherin antigenet et rekombinant protein uttrykt for gjær, insektcelle, bakterier så som E.coli, eller andre ressurser med rekombinant teknologi. Immunisering av dyrene kan være med enhver kjent metode innen fagfeltet, se for eksempel Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press (1990). Framgangsmåter for immunisering av ikkehumane dyr så som mus, rotter, sau, geit, gris, kveg og hester er godt kjent innen fagfeltet. Se for eksempel Harlow and Lane, supra, and U.S. Patent No.5,994,619. For eksempel, P-cadherin antigen kan administreres med en adjuvant for å stimulere immunresponsen. Representative adjuvanter inkluderer komplett eller ukomplett Freund’s adjuvant, RIBI (muramyl dipeptider) eller ISCOM (immunstimulerende komplekser). Slike adjuvanter kan beskytte polypeptidet fra hurtig dispergering ved å dispergere det i et lokalt depot, eller de kan inneholde substanser som stimulerer verten til å utskille faktorer som er kjemotaktiske for makrofager og andre komponenter i immunsystemet. Fortrinnsvis, dersom et polypeptid administreres, vil immuniseringsrutinen involvere to eller flere administreringer av polypeptidet, spredd med en avstand på flere uker.

For eksempel, ved å følge immunisering av et transgent dyr som beskrevet over med P-cadherin, kan primære celler (for eksempel milt eller perifere blod B-celler) isoleres fra det immuniserte transgene dyr, og individuelle celler som produserer antistoff som spesifikke for det ønskete antigen kan identifiseres. Polyadenylert mRNA fra hver individuelle celle isoleres deretter, og revers transkripsjon polymerase kjedereaksjon (RT-PCR) utføres ved anvendelse av senseprimere som annealer til forskjellige regionsekvenser (for eksempel degenererte primere som gjenkjenner de fleste eller alle av FR1-regionene av humane tung og lettkjede variable regiongener og ant-sense primere som annealer til konstante eller koblingsregionsekvenser). dDNAer av tung- og lettkjede variable domener klones deretter og uttrykkes i enhver egnet vertcelle, for eksempel en myelomcelle, som kimerisk antistoff med respektive immunoglobulin konstante regioner, så som tungkjede eller κ eller λ konstante domener. Se Babcook, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7843-48, (1996), inkorporert heri med referanse. P-cadherin antistoff kan deretter identifiseres og isoleres som beskrevet heri.

Rekombinante framgangsmåter for å produsere antistoff

Et antistoff, eller antistoffporsjon, ifølge oppfinnelsen, kan framstilles med rekombinant ekspresjon av immunoglobulin lett- og tungkjedegener i en vertcelle. For eksempel, for å uttrykke et antistoff rekombinant, transfekteres en vertcelle med én eller flere rekombinante ekspresjonsvektorer som bærer DNA-fragmenter som koder for immunoglobulin lett- og tungkjeder av antistoffet slik at lett- og tungkjedene uttrykkes i vertcellen og, fortrinnsvis utskilles i medium hvori vertcelle dyrkes, hvorfra dette medium antistoffene kan gjenvinnes. Standard rekombinante DNA-metoder anvendes for å oppnå antistoff tung- og lettkjedegener, og å inkorporere disse gener i rekombinante ekspresjonsvektorer, og å introdusere vektorene inn i vertcellene, så som de som er beskrevet i Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M., et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) and in U.S. Patent No.4,816,397, hvilke beskrivelser inkorporeres heri med referanse.

Mutasjoner og modifiseringer

For å uttrykke P-cadherin antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan DNA-fragmenter som koder for VH og VL regioner først oppnås ved anvendelse av enhver av metodene beskrevet over. Forskjellige mutasjoner, deleteringer og/eller tilføyinger kan også introduseres inn i DNA-sekvensene ved anvendelse av standard metoder kjent for fagkyndige innen feltet. For eksempel, mutagenese kan utføres ved anvendelse av standardmetoder, så som PCR-mediert mutagenese, hvor de muterte nukleotider inkorporeres inn i PCR-primerne slik at PCR-produktet inneholder de ønskete mutasjoner eller seterettet mutagenese. Én type substituering, for eksempel, som kan framstilles er å forandre én eller flere cysteiner i antistoffet, som kan være kjemisk reaktive, til andre enheter, så som, uten begrensning, alanin eller serin. For eksempel kan det være en substituering av en ikke-kanonikal cystein. Substitueringen kan utføres i en CDR eller rammeverkregion av et variabelt domene eller i det konstante domenet av et antistoff. I noen utførelser er cysteinet kanonikalt.

Antistoffene kan også muteres i de variable domener av tung- og/eller lettkjedene, for eksempel for å forandre en bindingsegenskap av antistoffet. For eksempel, en mutasjon kan utføres i én eller flere av CDR-regionene for å øke eller redusere KD av antistoffet til P-cadherin, for å øke eller redusere Koff, eller for å forandre bindingsspesifisiteten av antistoffet. Teknikker for seterettet mutagenese er godt kjent innen fagfeltet. Se for eksempel Sambrook, et al. and Ausubel, et al., supra, som inkorporeres heri med referanse. For eksempel, som diskutert i mer detalj i eksempel 8, kan flere variant VH og VL CDR3 sekvenser av 129-1c4 moren framstilles i samsvar med prosedyrene som beskrevet over, og disse indikeres som SEQ ID NO: 91 til 256 (VH CDR3 varianter) og SEQ ID NO: 257 til 319 (VL CDR3 varianter) i figur 1.

En mutasjon kan også etableres i en rammeverkregion eller konstant domene for å øke halveringstiden for et P-cadherin antistoff. Se for eksempel PCT publikasjon WO 00/09560, inkorporert heri med henvisning. En mutasjon i en rammeverkregion eller konstant domene kan også konstrueres for å forandre immunogenisiteten av antistoffet, for å tilveiebringe et sete for kovalent eller ikke-kovalent binding til et annet molekyl, eller for å forandre slike egenskaper som komplementfiksering, FcR-binding og antistoffavhengig celle-mediert cytotoksisitet (ADCC). I samsvar med oppfinnelsen kan ett enkelt antistoff ha mutasjoner i én eller flere av CDRene eller rammeverkregionene av det variable domene eller i det konstante domenet.

I en prosess kjent som ”germlining” kan visse aminosyrer i VH- og VL-sekvensene muteres for å matche de som finnes naturlig i arvelinje VH og VL-sekvensene.

Spesielt, aminosyresekvensene av rammeverkregioner i VH og VL-sekvensene kan muteres for å tilpasse seg til arvelinjesekvensene for å redusere risiko for immunogenisitet idet antistoffet administreres. Arvelinje DNA-sekvenser for human VH og VL gener er kjent innen fagfeltet (se for eksempel the "Vbase" human germline sequence database; se også Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242; Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol.

227:776-798; og Cox, et al. Eur. J. Immunol.24:827-836 (1994), hvilket innhold uttrykkelig inkorporeres heri med henvisning.

En annen type aminosyresubstituering som kan etableres er å fjerne potensielle proteolytiske seter i antistoffet. Slike seter kan forekomme i en CDR eller rammeverkregion av et variabelt domene eller i det konstante domenet av et antistoff.

Substituering av cysteinenheter og fjerning av proteolytiske seter kan redusere risiko for heterogenisitet i antistoffproduktet, og således øke dets homogenisitet. En annen type aminosyresubstituering er å eliminere asparaginglysinpar, som danner potensielle deamineringsseter, ved å forandre én eller begge av enhetene. I et annet eksempel kan C-terminal lysin av tungkjeden av et P-cadherin antistoff ifølge oppfinnelsen avbrytes. I forskjellige utførelser av oppfinnelsen kan tung- og lettkjedene av P-cadherin antistoffene valgfritt inkludere en N-terminal signalsekvens, så som de som er angitt med SEQ ID NO: 346 og 347.

Straks DNA-fragmentene som koder for VH- og VL-segmentene ifølge foreliggende oppfinnelse er oppnådd, kan disse DNA-fragmenter ytterligere manipuleres med standard rekombinante DNA-teknikker, for eksempel for å omdanne variable regiongenene til fullengde antistoffkjedegener, til Fab fragmentgener eller til et scFvgen. I disse manipuleringer blir et VL eller VH kodende DNA-fragment funksjonelt koblet til et annet DNA-fragment som koder for et annet protein, så som et antistoff konstant region eller en fleksibel linker. Termen ”funksjonelt koblet” som anvendt i denne kontekst, er tiltenkt å bety at det to DNA-fragmenter er koblet slik at aminosyresekvensene som kodes av de to DNA-fragmenter forblir i ramme.

Den isolerte DNA-kodende VH-region kan omdannes til en fullengde tungkjedegen ved operativt å koble VH-kodende DNA til et annet DNA-molekyl som koder for tungkjede konstante regioner (CH1, CH2 og CH3). Sekvensene av human tungkjede konstantregion gener er kjent innen fagfeltet (se for eksempel Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242) og DNA-fragmenter som omfatter disse regioner kan oppnås ved standard PCR-mangfoldiggjøring.

Tungkjede konstantregion kan være en IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM eller IgD konstantregion, eller mer fortrinnsvis en IgG1 eller IgG2 konstantregion. Den IgG1 konstante regionsekvens kan være enhver av de forskjellige alleler eller allotyper kjent å forekomme blant forskjellige individer, så som Gm(1), Gm(2), Gm(3), og Gm(17). Disse allotyper representerer naturlig forekommende aminosyresubstitueringer i IgG1 konstante regioner. For eksempel kan tungkjede IgG1 konstantregion være SEQ ID NO: 344. For et Fab-fragment tungkjedegen kan VH-kodende DNA funksjonelt være koblet til et annet DNA molekyl som koder kun for tungkjede CH1 konstantregion. CH1 tungkjede konstantregion kan være avledet fra enhver av tungkjedegenene.

Det isolerte DNA som koder for VL-regionen kan omdannes til en fullengde lettkjedegen (og likeledes et Fab lettkjedegen) ved funksjonelt å koble VL-kodende DNA til et annet DNA-molekyl som koder for lettkjede konstantregion, CL.

Sekvensene av human lettkjede konstante regiongener er kjent innen fagfeltet (se for eksempel Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) og DNA-fragmentet som omfatter disse regioner kan oppnås ved standard PCR mangfoldiggjøring. Lettkjede konstantregion kan være en kappa aller lambda konstantregion. Kappa konstantregion kan være enhver av de forskjellige alleler kjent å forekomme blant forskjellige individer, så som Inv(1), Inv(2) og Inv(3).

Lambda konstantregion kan være avledet fra enhver av de tre lambdagener. For eksempel kan lettkjede IgG1 konstantregion være SEQ ID NO: 347.

For å etablere et scFv gen, blir VH- og VL-kodende DNA-fragmenter funksjonelt koblet til et annet fragment som koder for en fleksibel linker, for eksempel som koder for aminosyresekvensen (Gly4-Ser)3, slik at VH- og VL-sekvensene kan uttrykkes som et kontigøst sidekjedeprotein, med VL- og VH-regioner koblet av den fleksible linker (se for eksempel Bird et al. Science 242:423-426 (1988); Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); McCafferty, et al., Nature, 348:552-554 (1990)). Enkeltkjede antistoffet kan være monovalent, det vil si kun én enkel VH og VL anvendes, bivalent, dersom to VH og VL anvendes, eller polyvalent, dersom mer enn to VH og VL anvendes. Bispesifikke eller polyvalent antistoff kan genereres som binder spesifikt til P-cadherin og til et annet molekyl.

I en annen utførelse kan et fusjonsantistoff eller immunoadhesin framstilles som omfatter hele eller en porsjon av et P-cadherin antistoff ifølge oppfinnelsen koblet til et annet polypeptid. I en ytterligere utførelse er kun de variable domener av P-cadherin antistoffet koblet til polypeptidet. I en ytterligere utførelse er VH-domenet av et P-cadherin antistoff koblet til et første polypeptid, mens VL-domenet av et P-cadherin antistoff er koblet til et andre polypeptid som assosierer med det første polypeptid på en måte slik at VH- og VL-domenene kan interagere med hverandre for å danne et antigenbindende sete. I en ytterligere foretrukket utførelse separeres VH-domenet fra VL-domenet med en linker slik at VH- og VL-domenene kan interagere med hverandre. VH-linker-VL antistoffet kobles deretter til det aktuelle polypeptid. I tillegg, fusjonsantistoff kan etableres hvor to (eller flere) enkeltkjede antistoff er koblet til hverandre. Dette er nyttig dersom man ønsker å etablere et divalent eller polyvalent antistoff på en enkel polypeptidkjede, eller dersom man ønsker å etablere et bispesifikt antistoff.

I ytterligere utførelser kan andre modifiserte antistoff framstilles ved anvendelse av P-cadherin antistoff-kodende nukleinsyremolekyler. For eksempel ”Kappa bodies” (Ill, et al., Protein Eng.10: 949-57 (1997)), “Minibodies” (Martin, et al., EMBO J., 13: 5303-9 (1994)), “Diabodies” (Holliger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)), eller “Janusiner” (Traunecker, et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) and Traunecker, et al., Int. J. Cancer, (Suppl.) 7:51-52 (1992)) kan framstilles ved anvendelse av standard molekylære biologiske teknikker ved å følge læren av denne beskrivelse.

Bispesifikke antistoff eller antigenbindende fragmenter kan produseres med en rekke framgangsmåter, inkluderende fusjonering av hybridomaer eller kobling av Fab’-fragmenter. Se for eksempel Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990), Kostelny, et al., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992). I tillegg, bispesifikke antistoff kan dannes som ”diabodies” eller ”Janusiner”. I noen utførelser binder de bispesifikke antistoff til to forskjellige epitoper for P-cadherin. I noen utførelser framstilles de modifiserte antistoff beskrevet over ved anvendelse av én eller flere av de variable domener eller CDR-regioner fra et humant P-cadherin antistoff tilveiebrakt heri.

Vektorer og vertceller

For å uttrykke antistoffene og antigenbindende porsjoner ifølge oppfinnelsen, blir DNAer som koder for partiell eller fullengde lett og tungkjeder, oppnådd som beskrevet over, innsatt i ekspresjonsvektorer slik at genene er funksjonelt koblet til transkripsjons- og translasjons-kontrollsekvenser. I denne kontekst, termen ”funksjonelt koblet” er tiltenkt å bety at et antistoffgen ligeres inn i en vektor slik at transkripsjons- og translasjons-kontrollsekvenser i vektoren gir deres tiltenkte funksjon og regulering av transkripsjon og translasjon av antistoffgenet. Ekspresjonsvektoren og ekspresjonskontrollsekvenser er valgt slik at de er kompatible med ekspresjonsvertcellen som anvendes. Ekspresjonsvektorer inkluderer plasmider, retrovirus, adenovirus, adeno-assosierte virus (AAV), plantevirus så som mosaikkvirus fra blomkål, tobakkmosaikkvirus, kosmider, YACer, EBV-avledete episomer, og lignende. Antistoffgenene ligeres inn i en vektor slik at transkripsjons- og translasjons-kontrollsekvenser innen vektoren gir deres tiltenkte funksjon for regulering av transkripsjon og translasjon av antistoffgenet. Ekspresjonsvektoren og ekpsresjonskontrollsekvensene velges slik at de er kompatible med ekspresjonsvertcellen som anvendes. Antistoff lettkjedegen og antistoff tungkjedegen kan innsettes inn i separate vektorer. I én foretrukket utførelse innsettes begge gener i den samme ekspresjonsvektor. Antistoffgenene innsettes inn i ekspresjonsvektoren med standardmetoder (for eksempel ligering av komplementære restriksjonsseter på antistoff genfragmenter og vektoren, eller blunt ende ligering dersom ingen restriksjonsseter foreligger).

En hensiktsmessig vektor er en som koder et funksjonelt komplett humant CH eller CL immunoglobulinsekvens, med egnete restriksjonsseter konstruert slik at enhver av VH- eller VL-sekvensen enkelt kan innsettes og uttrykkes, som beskrevet over. I slike vektorer foregår spleising vanligvis mellom spleisedonorsete i den innsatte J-region og spleise akseptorsetet som kommer foran det humane C-domenet, og også ved spleiseregioner som forekommer innen de humane CH-eksoner.

Polyadenylering og transkripsjonsterminering foregår ved native kromosomale seter nedstrøms for koderegionene. Den rekombinante ekspresjonsvektor kan også kode for et signalpeptid som fremmer sekresjon av antistoffkjeden fra en vertcelle. Antistoff kjedegenet kan klones inn i vektoren slik at signalpeptidet er koblet i ramme til aminoterminus av immunoglobulinkjeden. Signalpeptidet kan være et immunoglobulin signalpeptid eller et heterologt signalpeptid (det vil si et signalpeptid fra et ikke-immunoglobulinprotein).

I tillegg til antistoffkjedegenene, kan de rekombinante ekspresjonsvektorer ifølge oppfinnelsen bære regulatoriske sekvenser som kontrollerer ekspresjon av antistoffkjedegenene i enhver celle. Det skal innses av fagkyndige innen fagfeltet at konstruksjon av ekspresjonsvektoren, inkluderende seleksjon av regulatoriske sekvenser, kan avhenge av slike faktorer som valg av vertcelle som skal transformeres, nivå av ekspresjon av protein som er ønsket og så videre. Foretrukne regulatoriske sekvenser for pattedyr vertcelleekspresjon inkluderer virale elementer som dirigerer høyt nivå av proteinekspresjon i pattedyrceller, så som promotorer og/eller forsterkere avledet fra retroviral LTRer, cytomegalovirus (CMV) (så som CMV promoter/enhancer), Simian Virus 40 (SV40) (så som SV40 promoter /enhancer), adenovirus, (for eksempel adenovirus major late promoter (AdMLP)), polyoma og sterke mammalske promotorer så som native immunoglobulin og aktin promoterer. For ytterligere beskrivelse av virale regulatoriske elementer, og sekvenser derav, se US patent 5,168,062, US patent 4,510,245 og US patent 4,968,615. Framgangsmåter for å utvikle antistoff i planter, inkluderende en beskrivelse av promotorer og vektorer, og likeledes transformasjon av planter er kjent innen fagfeltet. Se for eksempel US patent 6,517,529, inkorporert heri med referanse. Framgangsmåter for å uttrykke polypeptider i bakterielle celler eller fungiceller, for eksempel gjærceller, er også godt kjent innen fagfeltet.

I tillegg til antistoffkjedegener og regulatoriske sekvenser kan de rekombinante ekspresjonsvektorer ifølge oppfinnelsen bære ytterligere sekvenser, så som sekvenser som regulerer replikasjon av vektoren i vertceller (for eksempel replikasjonsstartere) og selekterbare markørgener. De selekterbare markørgener fremmer seleksjon av vertceller som vektoren har blitt introdusert inn i (se for eksempel US patenter 4,399,216, 4,634,665 og 5,179,017 inkorporert heri med henvisning). For eksempel, typisk gir den selekterbare markørgen resistens til medikamenter, så som G418, hygromycin eller metotreksat, på en vertcelle som vektoren har blitt introdusert inn i. Foretrukne selekterbare markørgener inkluderer dihydrofolat reduktase (DHFR) genet (for anvendelse i dhfr-vertceller med metotreksat seleksjon/mangfoldiggjøring), neomycin fosfotransferasegen (for G418 seleksjon) og glutamat syntasegen.

Nukleinsyremolekyler som koder for P-cadherin antistoff og vektorer som omfatter disse nukleinsyremolekyler kan anvendes for transfeksjon av et egnet pattedyr, plante, bakterie eller gjærvertcelle. Transformasjon kan være ved enhver kjent metode for å introdusere polynukleotider inn i en vertcelle. Framgangsmåter for introduksjon av heterologe polynukleotider i mammalske celler er godt kjent innen fagfeltet og inkluderer dekstran-mediert transfeksjon, kalsiumfosfat presipitering, polybrenemediert transfeksjon, protoplastfusjon, elektroporering, innkapsling av polynukleotid(er) i liposomer, og direkte mikroinjeksjon av DNA inn i kjernen. I tillegg, nukleinsyremolekyler kan introduseres inn i mammalske celler med virale vektorer. Framgangsmåter for transformering av celler er godt kjent innen fagfeltet. Se for eksempel US patenter 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, og 4,959,455, inkorporert heri med henvisning. Framgangsmåter for å transformere planteceller er godt kjent innen fagfeltet, og inkluderer for eksempel agrobakterium-mediert transformasjon, biolistisk transformasjon, direkte injeksjon, elektroporering og viral transformasjon. Framgangsmåter for å transformere bakterie- og gjærceller er også godt kjent innen fagfeltet.

Mammalske cellelinjer tilgjengelig som verter for ekspresjon er godt kjent innen fagfeltet og inkluderer mange immortaliserte cellelinjer tilgjengelig fra American Type Culture Collection (ATCC). Disse inkluderer for eksempel kinesisk hamstereggstokk (CHO) celler, NSO celler, SP2 celler, HEK-293T celler, NIH-3T3 celler, HeLa celler, babyhamsternyre (BHK) celler, afrikansk grønnape nyreceller (COS), humane hepatocellulære karsinomceller (for eksempel Hep G2), A549 celler og et antall andre cellelinjer. Cellelinjer av spesiell preferanse velges gjennom å bestemme hvilke cellelinjer som har de høyeste ekspresjonsnivåer. Andre cellelinjer som kan anvendes er insektcellelinjer, så som Sf9 eller Sf21 celler. Idet rekombinante ekspresjonsvektorer som koder for antistoffgener introduseres inn i mammalske vertceller, produseres antistoffene ved å dyrke vertcellene for en periode som er tilstrekkelig til å muliggjøre ekspresjon av antistoffet inn i vertcellene, eller, mer fortrinnsvis, sekresjon av antistoffet inn i et dyrkingsmedium hvor vertcellene vokser. Antistoffene kan fjernes fra dyrkingsmedium ved anvendelse av standard proteinrensningsmetoder. Plantevertceller inkluderer for eksempel nikotiana, arabidopsis, planter i andematfamilien, mais, hvete, potet og så lignende. Bakterielle vertceller inkluderer E.coli og Streptomyces arter. Gjærceller inkluderer Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae og Pichia pastoris.

Videre, ekspresjon av antistoffene ifølge oppfinnelsen fra produksjonscellelinjer kan forbedres ved et antall kjente teknikker. For eksempel kan glutamin syntetase (GS-systemet) og DHFR-genekspresjonssystemer benyttes for å forsterke ekspresjon under visse betingelser. Høytuttrykkende cellekloner kan identifiseres ved anvendelse av konvensjonelle teknikker, så som begrenset fortynningskloning og mikrodrop teknologi. GS-systemet diskuteres i europeiske patenter 0216 846, 0256 055, 0323 997 og 0338 841.

Det er sannsynlig at antistoffene uttrykt av forskjellige cellelinjer eller i transgene dyr vil ha forskjellig glykosylering fra hverandre. Imidlertid, alle antistoffene som kodes av nukleinsyremolekylene gitt heri, eller som omfatter aminosyresekvensene tilveiebrakt heri, er del av foreliggende oppfinnelse, uavhengig av glykosyleringen av antistoffene.

Transgene dyr og planter

P-cadherin antistoff ifølge oppfinnelsen kan også produseres transgenisk gjennom generering av et pattedyr eller plante som er transgent for immunoglobulin tung og lettkjedesekvensene av interesse, og produksjon av antistoffet kan gjenvinnes derfra. I forbindelse med transgen produksjon i pattedyr kan P-cadherin antistoff produseres i, og gjenvinnes fra, melk til geit, kyr eller andre pattedyr. Se for eksempel US patent 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172, og 5,741,957, inkorporert heri med referanse. I noen utførelser blir ikke-humane transgene dyr som omfatter human immunoglobulin loci immunisert med P-cadherin eller en immunogenisk porsjon derav, som beskrevet over. Framgangsmåter for å framstille antistoff i planter er beskrevet for eksempel i US patenter 6,046,037 og 5,959,177, inkorporert heri med referanse.

I noen utførelser produseres de ikke-humane transgene dyr og planter ved å introdusere én eller flere nukleinsyremolekyler som koder for et P-cadherin antistoff, eller antigenbindingsporsjon derav, ifølge oppfinnelsen inn i dyret eller planten med standard transgeniske teknikker. Se Hogan and United States Patent 6,417,429, supra. De transgene celler som anvendes for å framstille de transgene dyr kan være embryoniske stamceller eller somatiske celler eller et fertilisert egg. De transgene ikke-humane organismer kan være kimeriske, ikke-kimeriske heterozygoter, og ikkekimeriske homozygoter. Se for eksempel Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 2<nd>ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson, et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); og Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999), alle inkorporert heri med henvisning. I noen utførelser har de transgene ikke-humane dyr en målrettet ødeleggelse og erstatning av et målrettet konstrukt som koder for en tungkjede og/eller en lettkjede av interesse. P-cadherin antistoffene kan framstilles i ethvert transgent dyr. I en foretrukket utførelse er de ikke-humane dyr mus, rotter, sau, griser, geiter, kveg eller hester. De ikke-humane transgene dyr uttrykker nevnte kodete polypeptider i blod, melk, urin, spytt, tårer, mucus og andre kroppsfluider.

Omkobling av klasser

Klassene (for eksempel IgG, IgM, IgE, IgA, eller IgD) og subklassene (for eksempel IgG1, IgG2, IgG3, eller IgG4) av P-cadherin antistoff kan bestemmes med enhver kjent metode innen fagfeltet. Generelt, klassen og subklassen av et antistoff kan bestemmes ved anvendelse av antistoff som er spesifikke for en bestemt klasse eller subklasse av antistoff. Slike antistoff er kommersielt tilgjengelig. Klassen og subklassen kan bestemmes med ELISA, eller Western Blot, og også andre teknikker. Alternativt kan klassen og subklassen bestemmes ved sekvensering av hele eller en porsjon av de konstante domener av tung- og lettkjedet av antistoffene, og sammenlikne deres aminosyresekvenser til kjente aminosyresekvenser av forskjellige klasser og subklasser av immunoglobuliner, og bestemme klasser og subklasser av antistoffene. P-cadherin antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være en IgG, en IgM, en IgE, en IgA eller et IgD molekyl. For eksempel kan P-cadherin antistoffene være et IgG som er en IgG1, IgG2, IgG3 eller en IgG4 subklasse. I én utførelse kan P-cadherin antistoffene ha en tungkjede konstant region angitt med SEQ ID NO: 344 og en lettkjede konstant region angitt av SEQ ID NO: 345.

Ett aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en framgangsmåte for å omdanne klassen eller subklassen av et P-cadherin antistoff til en annen klasse eller subklasse. I noen utførelser blir et nukleinsyremolekyl som koder for en VL eller VH som ikke inkluderer sekvensen som koder for CL eller CH isolert ved anvendelse av framgangsmåter godt kjent innen fagfeltet. Nukleinsyremolekylet blir deretter funksjonelt koblet til en nukleinsyresekvens som koder for en CL eller CH fra den ønskete immunoglobulinklasse eller subklasse. Dette kan oppnås ved anvendelse av en vektor eller nukleinsyremolekyl som omfatter en CL eller CH kjede, som beskrevet over. For eksempel, et P-cadherin antistoff som opprinnelig var IgM kan ombytte klasser til et IgG. Videre, klasseombyttingen kan anvendes for å omdanne en IgG subklasse til en annen, for eksempel fra IgG1 til IgG2, En annen framgangsmåte for å produsere et antistoff ifølge oppfinnelsen som omfatter et ønsket isotype omfatter trinnene å isolere en nukleinsyre som koder for en tungkjede av et P-cadherin antistoff og en nukleinsyre som koder for en lettkjede av et P-cadherin antistoff, isolere sekvensen som koder for VH-regionen, ligere VH-sekvensen til en sekvens som koder for en tungkjede konstant domene av den ønskete isotype, uttrykke lettkjedegenet og tungkjedekonstruktet i en celle, og gjenvinne P-cadherin antistoffet med den ønskete isotype.

Deimmuniserte antistoff

I et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse kan antistoffene eller antigenbindende porsjon derav deimmuniseres for å redusere deres immunogenisitet ved anvendelse av teknikkene beskrevet for eksempel i PCT publikasjoner WO98/52976 og WO00/34317 (inkorporert heri med referanse).

Derivatiserte og merkete antistoff

Et P-cadherin antistoff eller antigenbindende porsjon ifølge oppfinnelsen kan derivatiseres eller kobles til et annet molekyl (for eksempel et annet peptid eller protein). Generelt, antistoffene eller porsjonen derav derivatiseres slik at P-cadherinbindingen ikke påvirkes skadelig av derivatiseringen eller merkingen. Således, antistoffene og antistoffporsjonene ifølge oppfinnelsen er tiltenkt å inkludere både intakte og modifiserte former av de humane P-cadherin antistoffene beskrevet heri. For eksempel, et antistoff eller antistoffporsjon ifølge oppfinnelsen kan funksjonelt forbindes (med kjemisk kobling, genetisk fusjon, ikke-kovalent assosiering eller på annen måte) til én eller flere ytterligere molekylenheter, så som et annet antistoff (for eksempel et bispesifikt antistoff eller et diabody), et deteksjonsmiddel, en markør, et cytotoksisk middel, et farmasøytisk middel, og/eller et protein eller peptid som kan mediere assosiering av antistoffet eller antistoffporsjonen med et annet molekyl (så som en streptavidin kjerneregion eller en polyhistidin markør).

Én type derivatisert antistoff produseres med kryssbinding av to eller flere antistoff (av den samme type eller av forskjellige typer, for eksempel for å etablere bispesifikke antistoff). Egnete kryssbindere inkluderer de som er heterobifunksjonelle, som har to forskjellige reaktive grupper separert av en egnet spacer (for eksempel m-maleimidobenzoyl-N-hydroksysuccinimid ester) eller homobifunksjonelle (for eksempel disukkinimidyl suberat). Slike linkere er tilgjengelig fra Pierce Chemical Company, Rockford, IL.

En annen type derivatiserte antistoff er et merket antistoff. Nyttige deteksjonsmidler ved hvilke et antistoff eller antigenbindende porsjon ifølge oppfinnelsen kan derivatiseres inkluderer fluoriserende forbindelser, inkluderende fluorescein, fluorescein isotiocyanat, rodamin, 5-dimetylamin-1-naftalensulfonylklorid, fykoerytrin, lantanidfosor og lignende. Et antistoff kan også merkes med enzymer som er nyttige for deteksjon, så som pepperrotperiksidase, β-galaktosidase, luciferase, alkalisk fosfotase, glukoseoksidase og lignende. Idet et antistoff er merket med et detekterbart enzym, kan det detekteres med ytterligere reagenser som enzymer anvender for å produsere et reaksjonsprodukt som kan skjelnes. For eksempel, idet middelet pepperrotperiksidase er til stede kan av hydrogenperoksid og diaminobenzidin føre til et farget reaksjonsprodukt, som kan detekteres. Et antistoff kan også merkes med biotin, og detekteres gjennom indirekte måling av avidin eller straptavidin-binding. Et antistoff kan også merkes med et forutbestemt polypeptidepitop som gjenkjennes av en sekundær reporter (for eksempel leucin zipper par sekvenser, bindingsseter for sekundære antistoff, metallbindingsdomener, epitopmarkører). I noen utførelser tilfestes markører med spacerarmer av forskjellige lengder for å redusere potensiell sterisk hindring. Et P-cadherin antistoff kan også derivatiseres med en kjemisk gruppe så som polyetylenglykol (PEG), en metyl- eller etylgruppe, eller en karbohydratgruppe. Disse grupper er nyttige for å forbedre de biologiske karakteristika av antistoffet, for eksempel for å øke serumhalveringstid.

Bindingsaffinitet av P-cadherin antistoff til P-cadherin

Bindingsaffinitet (KD) og dissosiasjonshastighet (Koff) av et P-cadherin antistoff eller antigenbindende porsjon derav til P-cadherin kan bestemmes med framgangsmåter godt kjent innen fagfeltet. Bindingsaffinitet kan måles med ELISAer, RIAer, flow cytometri, eller overflate plasmonresonans, så som BIACORE™. Dissosiasjonshastighet kan måles med overflate plasmonresonans. Fortrinnsvis, bindingsaffinitet og dissosiasjonsrate måles med overflate plasmonresonans. Mer foretrukket, bindingsaffinitet og dissosiasjonsrate måles ved anvendelse av BIACORE™. Man kan bestemme om et antistoff har i hovedsak den samme KD som et P-cadherin antistoff ved å anvende framgangsmåter kjent innen fagfeltet. Slike framgangsmåter for å bestemme KD og Koff kan anvendes i en innledende screeningsfase, og likeledes under påfølgende optimaliseringstrinn.

Identifisering av P-cadherin epitoper gjenkjent av P-cadherin antistoff Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer humane P-cadherin antistoff som binder til P-cadherin og konkurrerer eller kryss-konkurrerer med og/eller binder til den samme epitop som noen av antistoffene beskrevet i tabell 1 eller 2. Man kan bestemme om et antistoff binder til den samme epitop eller kryss-konkurrerer for binding med et P-cadherin antistoff ifølge oppfinnelsen ved anvendelse av framgangsmåter kjent innen fagfeltet. I én utførelse tillater man at P-cadherin antistoffet ifølge oppfinnelsen binder til P-cadherin under metningsbetingelser og deretter måle evnen av testforbindelsen til å binde til P-cadherin. Dersom testantistoffet er i stand til å binde til P-cadherin samtidig som P-cadherin antistoffet, da vil testantistoffet binde til en forskjellig epitop enn P-cadherin antistoffet. Imidlertid, dersom testantistoffet ikke er i stand til å binde til P-cadherin samtidig, da binder testantistoffet til den samme epitop, en overlappende epitop, eller en epitop som er i nær nærhet til epitopen bundet av det humane P-cadherin antistoff. Dette eksperiment kan uføres ved anvendelse av ELISA, RIA, BIACORE ™ eller flow cytometri. I en foretrukket utførelse utføres eksperimentet ved anvendelse av ELISA.

Inhibering av P-cadherin aktivitet med P-cadherin antistoff

P-cadherin antistoff som inhiberer P-cadherin aktivitet kan identifiseres ved anvendelse av en rekke analyser. Et celleaggregeringsanalyse, for eksempel, tilveiebringer en framgangsmåte for å måle P-cadherin-avhengig cellulær aggregering. Denne type analyse anvender en cellelinje som overuttrykker P-cadherin, hvor cellene plasseres i suspensjon og tillates å danne P-cadherinavhengige aggregater. Aggregeringsanalysen anvendes deretter for å kvantifisere evnen av et P-cadherin antistoff til å hindre denne aggregering ved å måle størrelsen av cellulære aggregater som resulterer med og uten antistoff. Celleaggregatstørrelse som en funksjon av P-cadherin antistoffkonsentrasjon kan deretter anvendes for å bestemme en IC50-verdi. Eksempel 4 tilveiebringer ytterligere detaljer av en P-cadherin avhengig aggregeringsanalyse som ble anvendt for å måle IC50-verdier for flere P-cadherin antistoff.

Celleadhesjonsanalyser kan også anvendes for å måle evnen av et P-cadherin antistoff til å blokkere adhesjon av celler til en reseptor P-cadherin som er blitt immobilisert på et faststoff støttemedium. Denne type analyse kan utføres for eksempel ved å immobilisere P-cadherin på et faststoff støttemedium, så som plast. Celler som overuttrykker P-cadherin tillates å adhere til faststoff støttemediet via P-cadherin-P-cadherin interaksjoner. Nivået av adhesjon kan deretter kvantifiseres med og uten et P-cadherin antistoff. Adhesjon som en funksjon av antistoffkonsentrasjon anvendes deretter for å bestemme en IC50-verdi. Eksempel 3 tilveiebringer ytterligere detaljer av en P-cadherin-avhengig celleadhesjonsanalyse som ble anvendt for å måle IC50-verdier for P-cadherin antistoff.

Inhibering av P-cadherin-aktivitet kan også måles ved anvendelse av et P-cadherinavhengig sfæroid ødeleggelsesanalyse. Denne type analyse måler evnen av et P-cadherin antistoff til å ødelegge predannete P-cadherin-avhengige cellulære aggregeringer. Ved å måle størrelsesreduksjon av aggregatene som en funksjon av antistoffkonsentrasjon kan en IC50-verdi bestemmes. Eksempel 5 tilveiebringer ytterligere detaljer av en P-cadherin-avhengig sfæroid ødeleggelsesanalyse som ble anvendt for å måle IC50-verdier for P-cadherin antistoff. Framgangsmåtene og analysene som er beskrevet over for å bestemme inhibering av P-cadherin aktivitet med forskjellige antistoff eller antigenbindende porsjoner derav, kan anvendes under den innledende screeningsfase, og likeledes under påfølgende optimaliseringstrinn.

Molekylær selektivitet

Selektiviteten av P-cadherin antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse over andre cadheriner, så som E-cadherin, kan bestemmes ved anvendelse av framgangsmåter godt kjent innen fagfeltet. For eksempel kan man bestemme selektiviteten ved anvendelse av Western blot, flow cytometry, ELISA, immunpresipitering eller RIA. Eksempel 7 tilveiebringer ytterligere detaljer av en ELISA analyse som ble anvendt for å måle selektiviteten av spesifikke antistoff til P-cadherin over E-cadherin.

Framgangsmåtene og analysene beskrevet over for å bestemme selektiviteten for P-cadherin for forskjellige antistoff eller antigenbindende porsjoner derav, kan anvendes under innledende screeningsfase, og likeledes under påfølgende optimaliseringstrinn.

Farmasøytiske sammensetninger, og administrering

Foreliggende oppfinnelse vedrører også en farmasøytisk sammensetning for behandling av avvikende cellevekst i et pattedyr, inkluderende et menneske, omfattende en mengde av et P-cadherin antistoff eller antigenbindende porsjon derav, som beskrevet heri, som er effektiv i å behandle avvikende cellevekst, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Antistoffene og antigenbindende porsjoner ifølge foreliggende oppfinnelse kan inkorporeres i farmasøytiske sammensetninger egnet for administrering til et individ. Typisk omfatter de farmasøytiske sammensetninger et antistoff eller antigenbindende porsjon ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer. Som anvendt heri, ”farmasøytisk akseptabel bærer” angir ethvert og alle oppløsningsmidler, dispergeringsmedier, belegginger, antibakterielle og antifungale midler, isotoniske og absorpsjonsforsinkende midler, og lignende som er fysiologisk kompatible. Noen eksempler på farmasøytisk akseptable bærere er vann, saltløsning, fosfatbufret saltløsning, dekstrose, glyserol, etanol og lignende, og likeledes kombinasjoner derav. I mange tilfeller vil det være foretrukket å inkludere isotoniske midler, for eksempel sukkere, polyalkoholer så som mannitol, sorbitol eller natriumklorid i sammensetningen. Ytterligere eksempler på farmasøytisk akseptable substanser er fuktningsmidler, eller mindre mengder av hjelpesubstanser så som fukting eller emulsifiserende midler, konserverende midler eller buffere, som forbedrer lagringstid eller effektivitet av antistoffet.

Sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan være i forskjellige former, for eksempel væske, semi-faststoff eller faststoff doseringsformer, så som væskeformige løsninger (for eksempel injiserbare og infuserbare løsninger), dispersjoner eller suspensjoner, tabletter, piller, pulvere, liposomer og stikkpiller. Den foretrukne form er avhengig av det tiltenkte administrasjonsmodus og terapeutiske applikasjon.

Typisk foretrukne sammensetninger er i form av injiserbare eller infuserbare løsninger, så som sammensetninger tilsvarende de som anvendes for passiv immunisering av mennesker. Den foretrukne administrasjonsmodus er parenteral (for eksempel intravenøs, subkutanøs, intraperitoneal, intramuskulær). I en foretrukket utførelse administreres antistoffet ved intravenøs infusjon eller injeksjon. I en ytterligere foretrukket utførelse administreres antistoffet med intramuskulær eller subkutanøs injeksjon. Formuleringer for injeksjon kan presenteres i enhets doseringsformer, for eksempel i ampuller eller i multidoseringsbeholdere, med eller uten et tilsatt konserverende middel. Sammensetningene kan ha form av suspensjoner, løsninger eller emulsjoner i olje- eller vandige vehikler, og kan inneholde formuleringsmidler så som suspenderende, stabiliserende og/eller dispergerende midler. Alternativt kan det aktive ingrediens være i pulverform for konstituering med en egnet vehikkel, for eksempel sterilt pyrogenfritt vann, før anvendelse.

Terapeutiske sammensetninger må typisk være sterile og stabile under betingelsene for framstilling lagring. Sammensetningen kan formuleres som en løsning, mikroemulsjon, dispersjon, liposom, eller annen ordnet struktur egnet for høy medikamentkonsentrasjon. Sterile injiserbare løsninger kan framstilles ved inkorporere P-cadherin antistoffet i den nødvendige mengde i et egnet oppløsningsmiddel med én, eller en kombinasjon av ingredienser angitt over, som nødvendig, etterfulgt av filtrert sterilisering. Generelt, dispersjoner framstilles ved å inkorporere den aktive forbindelse i en steril vehikkel som inneholder et basisdispersjonsmedium, og de nødvendige andre ingredienser fra de som er angitt over. I tilfellet sterile pulvere for framstilling av sterile injiserbare løsninger er de foretrukne framgangsmåter for framstilling vakuumtørking og frysetørking som gir et pulver av den aktive ingrediens pluss enhver ytterligere ønsket ingrediens fra en tidligere sterilfiltrert løsning derav. Den egnete fluiditet av en løsning kan opprettholdes for eksempel ved anvendelse av et coating så som lecitin, ved opprettholdelse av den nødvendige partikkelstørrelse i tilfelle dispersjon, og ved anvendelse av surfaktanter. Forlenget absorpsjon av injiserbare sammensetninger kan tilveiebringes ved å inkludere i sammensetningen et middel som forsinker absorpsjon, for eksempel monostearatsalter og gelatin.

Antistoffene eller antistoffporsjonene ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres med en rekke framgangsmåter kjent innen fagfeltet, men for mange terapeutiske applikasjoner er den foretrukne rute/administrasjonsmodus subkutanøs, intramuskulær eller intravenøs infusjon. Som det vil innses av den fagkyndige vil administrasjonsrute- og modus variere avhengig av det ønskete resultatet.

I visse utførelser kan antistoffsammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse framstilles med en bærer som vil beskytte antistoffet mot hurtig frigivelse, så som en kontrollert frigivelsesformulering, inkluderende implantater, transdermale lapper, og mikroinnkapslingsavgivelsessystemer. Bionedbrytbare, biokompatible polymerer kan anvendes, så som etylenvinylacetat, polyanhydrider, polyglykolisk syre, collagen, polyortoestere og polylaktisk syre. Mange framgangsmåter for framstilling av slike formuleringer er generelt kjent for fagkyndige innen feltet. Se for eksempel Sustained og Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978), som inkorporeres heri med henvisning.

Ytterligere aktive forbindelser kan også inkorporeres i sammensetningene. I visse utførelser blir et inhibitorisk P-cadherin antistoff ifølge oppfinnelsen ko-formulert med og/eller co-administrert med én eller flere ytterligere terapeutiske midler. Disse midler inkluderer, uten begrensning, antistoff som binder til andre mål, antitumormidler, anti-angiogenesemidler, signaltransdukjson inhibitorer, anti-proliferative midler, kjemoterapeutiske midler, eller peptidanaloger som inhiberer P-cadherin. Slike kombinasjonsterapier kan kreve lavere doseringer av det inhibitoriske P-cadherin antistoff og likeledes de ko-administrerte midler, slik at man unngår mulige toksisiteter eller komplikasjoner assosiert med de forskjelle monoterapier.

Sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan inkludere ”en terapeutisk effektiv mengde” eller en ”profylaktisk effektiv mengde” av et antistoff eller antigenbindende porsjon ifølge oppfinnelsen. En ”terapeutisk effektiv mengde” refererer til en mengde som er effektiv, ved doseringer og for tidsperioder som er nødvendig, for å oppnå det ønskete terapeutiske resultat. En terapeutisk effektiv mengde av antistoffet eller antigenbindende porsjon kan variere i samsvar med faktorer så som sykdomstilstand, alder, kjønn og vekt individet, og evnen av antistoffet eller antistoffporsjonen til å utløse en ønsket respons i individet. En terapeutisk effektiv mengde er også en hvor ethvert toksisk eller skadelig effekt av antistoffet eller antigenbindende porsjon oppveies av de terapeutiske nyttige effekter. En ”profylaktisk effektiv mengde” refererer til en mengde som er effektiv, ved doseringer og tidsperioder som er nødvendig, til å oppnå det ønskete profylaktiske resultat. Typisk, siden en profylaktisk dosering anvendes i individet før, eller ved et tidlig trinn av sykdommen, kan den profylaktiske effektive mengde være mindre enn den terapeutiske effektive mengde.

Doseringsregimer kan justeres for å tilveiebringe den optimale ønskete respons (for eksempel en terapeutisk eller profylaktisk respons). For eksempel kan én enkelt bolus administreres, flere oppdelte doseringer kan administreres over tid, eller doseringen kan proporsjonalt doseres eller økes som indikert i henhold til de krav som stilles av den terapeutiske situasjon. Det er spesielt fordelaktig å formulere parenterale sammensetninger i doseringsenhetsform for enkel administrering og uniformitet av dosering. Doseringsenhetsform som anvendt heri refererer til fysikalske forskjellige enheter tilpasset som enhetsdoseringer for mammalske individer som skal behandles; hver enhet inneholder en forutbestemt mengde av aktiv forbindelse beregnet for å produsere den ønskete terapeutiske effekt i forbindelse med den nødvendige farmasøytiske bærer. Spesifikasjon for doseringsenhetsformene ifølge oppfinnelsen dikteres av og er direkte avhengig av; (a) de unike karakteristika av P-cadherin antistoffet eller porsjon derav og den bestemte terapeutiske eller profylaktiske effekt som skal oppnås, og (b) begrensninger som finnes innen sammenblandingsteknologien for et slikt antistoff for behandling av sensibilitet i individer.

Et representativt ikke-begrensende område for en terapeutisk eller profylaktisk effektiv mengde av et antistoff eller antistoffporsjon ifølge oppfinnelsen er 0,025 til 50 mg/kg, mer foretrukket 0,1 til 50 mg/kg, mer foretrukket 0,1-25, 0,1 til 10 eller 0,1 til 3 mg/kg. I noen utførelser inneholder en formulering 5mg/ml antistoff i en buffer av 20 mM natriumcitrat, pH 5,5 , 140 mM NaCl og 0,2 mg/ml polysorbat 80. Det skal bemerkes at doseringsverdier kan variere med type og alvorlighet av tilstanden som skal lindres. Det skal videre forstås at for et bestemt individ kan spesifikke doseringsregimer justeres over tid i samsvar med individets behov og den profesjonelle vurdering av personen som administrerer og overvåker administreringen av sammensetningene, og at doseringsområdene angitt heri er representative, og er ikke tiltenkt å begrense rammen eller praktiseringen av de sammensetninger som er angitt i patentkravene.

Et ytterligere aspekt ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringer kitt omfattende et P-cadherin antistoff eller antigenbindende porsjon ifølge oppfinnelsen eller en sammensetning omfattende et slikt antistoff eller porsjon. Et kitt kan inkludere, i tillegg til antistoffet eller sammensetningen, diagnostiske eller terapeutiske midler. Et kit kan også inkludere instruksjoner for anvendelse i en diagnostisk eller terapeutisk metode. I en foretrukket utførelse inkluderer kittet antistoff eller en sammensetning omfattende denne og et diagnostisk middel som kan anvendes i en framgangsmåte beskrevet nedenfor. I en annen foretrukket framgangsmåte inkluderer kittet antistoffet eller en sammensetning omfattende av dette, og én eller flere terapeutiske midler som kan anvendes i en framgangsmåte beskrevet nedenfor.

Diagnostiske framgangsmåter for anvendelse

P-cadherin antistoffene eller antigenbindende porsjoner derav kan anvendes i diagnostiske framgangsmåter for å detektere P-cadherin i en biologisk prøve in vitro eller in vivo. For eksempel kan P-cadherin antistoffene anvendes i en konvensjonell immunoanalyse, inkluderende, uten begrensning, en ELISA, en RIA, en flow cytometri, vevsimmunohistokjemi, Wester blot eller immunpresipitering. P-cadherin antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å detektere P-cadherin fra mennesker. P-cadherin antistoffene kan også anvendes for å detektere P-cadherin fra mus, rotter og cynomolgusaper.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en framgangsmåte for å detektere P-cadherin i en biologisk prøve omfattende å sette den biologiske prøve i forbindelser med et P-cadherin antistoff ifølge oppfinnelsen, og detektere det bundne antistoff. I én utførelse er P-cadherin antistoffet direkte merket med en detekterbar markør. I en ytterligere utførelse er P-cadherin antistoffet (det første antistoff) umerket, og et andre antistoff eller annet molekyl som kan binde til P-cadherin antistoffet er merket. Som det vil være kjent for fagkyndige innen feltet, velges et andre antistoff som er i stand til spesifikt å binde til det bestemte form og klasse av det første antistoff. For eksempel, dersom P-cadherin antistoffet er et humant IgG, kan det andre antistoff være et antihumant IgG. Andre molekyler som kan binde til antistoffer inkluderer, uten begrensning, protein A og protein G, som begge er kommersielt tilgjengelige, for eksempel fra Pierce Chemical Co.

Egnete markører for antistoffene eller sekundære antistoff har blitt beskrevet tidligere, og inkluderer forskjellige enzymer, prostetiske grupper, fluoriserende materialer, luminserende materialer og radioaktive materialer. Eksempler på egnete enzymer inkluderer pepperrotperoksidase, alkalisk fosfatase, β-galaktosidase, eller acetylkolinesterase; eksempler på egnete prostetiske gruppekomplekser inkluderer streptavidin/biotin og avidin/biotin; eksempler på egnet fluoriserende materialer inkluderer umbelliferon, fluorescein, fluoresceinisotiocyanat, rodamin, diklortriazinylamin fluorescein, dansylklorid eller fykoerytrin; et eksempel på et luminiserende materiale inkluderer luminol; og eksempler på egnete radioaktive materialer inkluderer<125>I,<131>I,<35>S eller<3>H.

I andre utførelser kan P-cadherin analyseres i en biologisk prøve ved en kompetisjonsimmunoanalyse ved anvendelse av P-cadherin standarder merket med en detekterbar substans og et umerket P-cadherin antistoff. I denne analyse kombineres den biologiske prøve, de merkete P-cadherin standarder og P-cadherin antistoffet, og mengden av merket P-cadherin standard bundet til umerket antistoff bestemmes. Mengden av P-cadherin i den biologiske prøve er invers proporsjonal til mengden av merket P-cadherin standard bundet til P-cadherin antistoff.

Man kan anvende immunoanalyser beskrevet over for en rekke formål. For eksempel kan P-cadherin antistoffet anvendes for å detektere P-cadherin i dyrkete celler. I en foretrukket utførelse anvendes P-cadherin antistoffene for å bestemme mengden av P-cadherin produsert av celler som har blitt behandlet med forskjellige forbindelser. Denne metode kan anvendes for å identifisere forbindelser som modulerer P-cadherin proteinnivåer. I samsvar med denne metode behandles en prøve av celler med en testforbindelse for en tidsperiode, mens en annen prøve er ubehandlet. Dersom det totale nivå av P-cadherin som skal måles, doseres cellene og det totale P-cadherinnivå måles ved anvendelse av én eller flere immunanalyser beskrevet over. Det totale nivå av P-cadherin i behandlete versus ubehandlete celler sammenliknes for å bestemme effekten av testforbindelsen.

En foretrukket immunoanalyse for å måle total P-cadherinnivåer er flow cytometry eller immunhistokjemi. Framgangsmåter så som ELISA, RIA, flow cytometry, Western blot, immunhistokjemi, celleoverflatemerking av integrerte membranproteiner og immunpresipitering er godt kjent innen fagfeltet. Se for eksempel Harlow and Lane, supra. I tillegg, immunoanalyser kan skaleres opp for høy gjennomstrømningsscreening for å teste et stor antall forbindelser for enten aktivering eller inhibering av P-cadherin ekspresjon.

P-cadherin antistoffene ifølge oppfinnelsen kan også anvendes for å bestemme nivåene av P-cadherin i et vev eller celle avledet fra vevet. I noen utførelser er vevet et sykdomsvev. I noen utførelser ifølge framgangsmåten utskjæres et vev eller en biopsi fra en pasient. Vevet eller biopsien anvendes deretter i en immunanalyse for å bestemme, for eksempel totalt P-cadherin-nivåer eller lokalisering av P-cadherin med framgangsmåtene beskrevet over.

Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes in vivo for å identifisere vev og organer som uttrykker P-cadherin. En fordel med anvendelse av humane P-cadherin antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse er at de sikkert kan anvendes in vivo uten å utløse en vesentlig immunrespons til antistoffet ved administrering, i motsetning til antistoff av ikke-human opprinnelse eller med humaniserte eller kimerisk antistoff.

Framgangsmåten omfatter trinnene å administrere et detekterbart merket P-cadherin antistoff eller en sammensetning omfattende slike til en pasient i behov av slik diagnosetest, og underlegge pasienten for imaging analyse for å bestemme lokalisering av P-cadherin uttrykkende vev. Imaging analyser er godt kjent innenfor det medisinske fagfelt, og inkluderer, uten begrensning, røntgenanalyse, magnetisk resonans imaging (MRI) eller kalkulert tomografi (CT). Antistoffene kan merkes med ethvert egnet middel egnet for in vivo imaging, for eksempel et kontrastmiddel så som barium, som kan anvendes røntgenanalyser, eller et magnetisk kontrastmiddel så som gadolinium kelat, som kan anvendes for MRI eller CT. Andre merkemidler inkluderer, uten begrensning, radioisotoper så som<99>Tc. I en annen utførelse kan P-cadherin antistoffet være umerket og vil images med administrering av et andre antistoff eller annet molekyl som er detekterbart og som kan binde til P-cadherin antistoffet. I én utførelse opptas en biopsipasient for å bestemme om det aktuelle vev uttrykker P-cadherin.

Terapeutiske framgangsmåter for anvendelse

I en ytterligere utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en framgangsmåte for å inhibere P-cadherin aktivitet ved å administrere et P-cadherin antistoff til en pasient i behov derav. Enhver av antistoffene eller antigenbindende porsjoner derav beskrevet heri kan anvendes terapeutisk. I en foretrukket utførelse er P-cadherin antistoffet et humant, kimerisk eller humanisert antistoff. I en annen foretrukket utførelse er P-cadherin humant, og pasienten er et menneske. Alternativt, pasienten kan være et pattedyr som uttrykker et P-cadherin som P-cadherin antistoffet kryssreagerer med. Antistoffet kan administreres til et ikke-humant pattedyr som uttrykker P-cadherin med hvilket antistoffet kryssreagerer (for eksempel en rotte, en mus eller en cynomolgusape) for veterinæriske formål eller som en dyremodell på human sykdom. Slike dyremodeller kan være nyttige for å vurdere terapeutisk effektivitet av antistoff ifølge oppfinnelsen.

I en ytterligere utførelse kan et P-cadherin antistoff eller antistoffporsjon derav administreres til en pasient som uttrykker uegnete høye nivåer av P-cadherin.

Antistoffet kan administreres én gang, administreres mer fortrinnsvis flere ganger. Antistoffet kan administreres fra tre ganger daglig til én gang hver sjette måned eller lengre. Administreringen kan være tre ganger per dag, to ganger per dag, én gang per dag, én gang annenhver dag, én gang hver tredje dag, ukentlig, én gang annenhver uke, én gang hver måned, annenhver måned, hver tredje måned og én gang hver sjette måned. Antistoffet kan også administreres kontinuerlig via en minipumpe. Antistoffet kan administreres via mucosal, bukal, intranasal, inhalerbar, intravenøs, subkutanøs, intramuskulær, parenteral eller intratumorrute. Antistoffet kan administreres én gang, minst to ganger eller i det minste en tidsperiode inntil tilstanden er behandlet, lindret eller helbredet. Antistoffet vil generelt bli administrert så lenge tilstanden foreligger. Antistoffet vil generelt administreres som del av en farmasøytisk sammensetning som beskrevet supra. Dosering av antistoff vil generelt være i området 0,1 til 100 mg/kg, mer fortrinnsvis 0,5 til 50 mg/kg, mer fortrinnsvis 1 til 20 mg/kg, enda mer foretrukket 1 til 10 mg/kg. Serumkonsentrasjon av antistoffet kan måles med enhver metode kjent innen fagfeltet.

Oppfinnelsen vedrører også en framgangsmåte for å behandle avvikende cellevekst i et pattedyr, inkluderende et menneske, omfattende å administrere til nevnte pattedyr en terapeutisk effektiv mengde av et P-cadherin antistoff eller antigenbindende porsjon derav, som beskrevet heri, som er effektiv i å behandle avvikende cellevekst.

I én utførelse av denne framgangsmåte er den avvikende cellevekst cancer, inkluderende men ikke begrenset til, mesoteliom, hepatobillari (lever og gallekanal), primær eller sekundær CNS tumor, en primær eller sekundær hjernetumor, lungecancer (NSCLC og SCLC), bencancer, pankreatisk cancer, hudcancer, cancer i hodet og hals, kutanøs eller intraokular melanom, eggstokkcancer, tarmcancer, rektalcancer, cancer i endetarmsregionen, magecancer, gastrointestinal (gastrisk, kolorektal og duodenal), brystcancer, livmorcancer, karsinom i eggleder, karsinom i endometrium, karsinom i livmorhals, karsinom i vagina, karsinom i vulva, Hodgkins sykdom, spiserørcancer, tynntarmcancer, cancer i det endokrine system, cancer i skjoldbrukskjertel, cancer i bukspyttkjertel, cancer i binyresystemet, sarkom i mykvev, cancer i urinrør, cancer i penis, prostatacancer, testikkelkreft, kronisk og akutt leukemi, kronisk myeloid leukemi, lymfocytisk lymfomaer, cancer i blære, cancer i nyre eller urinleder, renal cellekarsinom, karsinom i renal pelvis, neoplasma i det sentrale nervesystem (CNS), primær CNS lymfom, ikke-hodgkins lymfom, spinalaksetumorer, hjernestammegliom, hypofyseadenom, adrenokortikal cancer, galleblærecancer, multiple myelom, kolangiokarsinom, fibrosarkom, neuroblastom, retinoblastom eller en kombinasjon av én eller flere av de foregående cancer.

I en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse er cancerformen valgt blant lungecancer (NSCLC og SCLC), cancer i hodet eller hals, eggstokkcancer, tarmcancer, rektalcancer, cancer i endetarmsregionen, magecancer, brystcancer, cancer i nyre- eller urinleder, renal cellekarsinom, karsinom av renal pelvis, neoplasma i sentralnervesystem (CNS), primær CNS lymfom, ikke-hodgkins’ lymfom, spinal axis tumorer, eller en kombinasjon av en av ovennevnte cancere.

I en ytterligere foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse er cancere valgt blant lungecancer (NSCLC og SCLC), eggstokkcancer, tarmcancer, rektalcancer, cancer i endetarmsregionen eller en kombinasjon av én eller flere av foregående nevnte.

I en ytterligere utførelse av nevnte framgangsmåte er nevnte avvikende cellevekst en benign proliferativ sykdom, inkluderende men ikke begrenset til, psoriasis, benign prostatisk hypertrofi eller restinose.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også en framgangsmåte for behandling av avvikende cellevekst i et pattedyr som omfatter administrert til nevnte pattedyr en mengde av et P-cadherin antistoff eller antigenbindende porsjon derav, som beskrevet heri, som er effektiv i å behandle avvikende cellevekst i kombinasjon med et antitumormiddel valgt blant gruppen omfattende mitotiske inhibitorer, alkylerende midler, antimetabolitter, interkelaterende antibiotika, vekstfaktor inhibitorer, cellesyklus inhibitorer, enzymer, topoisomerase inhibitorer, modifiserere av biologiske responser, antistoff, cytotoksiske midler, antihormoner og antiandrogener.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også en farmasøytisk sammensetning for behandling av avvikende cellevekst i et pattedyr, inkluderende et menneske, som omfatter en mengde av et P-cadherin antistoff eller antigenbindende porsjon derav som beskrevet heri, som er effektiv i å behandle avvikende cellevekst i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer og et antitumormiddel valgt blant gruppen omfattende mitotiske inhibitorer, alkylerende midler, antimetabolitter, interkalerende antibiotika, vekstfaktor inhibitorer, cellesyklus inhibitorer, enzymer, topoisomerase inhibitorer, modifiserere av biologiske responser, antihormoner og antiandrogener.

Oppfinnelsen vedrører også en framgangsmåte for behandling av en hyperproliferativ forstyrrelse i et pattedyr som omfatter å administrere til nevnte pattedyr en terapeutisk effektiv mengde av et P-cadherin antistoff eller antigenbindende porsjon derav, som beskrevet heri, i kombinasjon med et antitumormiddel valgt blant gruppen omfattende antiproliferative midler, kinase inhibitorer, angiogenese inhibitorer, vekstfaktor inhibitorer, cox-I inhibitorer, cox-II inhibitorer, mitotiske inhibitorer, alkylerende midler, antimetabolitter, interkelaterende antibiotika, vekstfaktor inhibitorer, bestråling, cellesyklus inhibitorer, enzymer, topoisomerase inhibitorer, biologiske responsmodifiserere, antistoff, cytotoksiske midler, antihormoner, statiner og antiandrogener.

I én utførelse av foreliggende oppfinnelse er antitumormidlene anvendt i kombinasjon med et P-cadherin antistoff eller antigenbindende porsjon derav, og farmasøytiske sammensetninger beskrevet heri, et anti-angiogenesemiddel, kinase inhibitor, pan kinase inhibitor eller vekstfaktor inhibitor. Foretrukne pan kinase inhibitorer inkluderer SU-11248, beskrevet i US patent 6,573,293 (Pfizer, Inc, NY, USA).

Anti-angionesemidler, inkluderende men ikke begrenset til følgende midler, så som EGF inhibitorer, EGFR-inhibitorer, VEGF-inhibitorer, VEGFR-inhibitorer, TIE2-inhibitorer, IGF1R-inhibitorer, COX-II (syklooksygenase II) inhibitorer, MMP-2 (matrix-metalloprotienase 2) inhibitorer, og MMP-9 (matrix-metalloprotienase 9) inhibitorer. Foretrukne VEGF-inhibitorer, inkluderere for eksempel avastin (bevacizumab), et anti-VEGF monoklonalt antistoff fra Genentech, Inc. of South San Francisco, California.

Ytterligere VEGF-inhibitorer inkluderer CP-547,632 (Pfizer Inc., NY, USA), AG13736 ((Pfizer Inc.), ZD-6474 (AstraZeneca), AEE788 (Novartis), AZD-2171), VEGF Trap (Regeneron,/Aventis), Vatalanib (også kjent som PTK-787, ZK-222584: Novartis & Schering AG), Macugen (pegaptanib oktanatrium, NX-1838, EYE-001, Pfizer Inc./Gilead/Eyetech), IM862 (Cytran Inc. of Kirkland, Washington, USA); og angiozym, et syntetisk ribozym fra Ribozyme (Boulder, Colorado) og Chiron (Emeryville, California) og kombinasjoner derav. VEGF-inhibitorer som er nyttige i praktiseringen av foreliggende oppfinnelse er beskrevet i US patentet 6,534,524 og 6,235,764, som begge inkorporeres heri i sin helhet for alle formål. Spesielt foretrukne VEGF-inhibitorer inkluderer CP-547,632, AG13736, Vatalanib, Macugen og kombinasjoner derav.

Ytterligere VEGF-inhibitorer er beskrevet for eksempel i WO 99/24440 (publisert 20. mai 1999), PCT internasjonal søknad PCT/IB99/00797 (av 3. mai 1999), WO 95/21613 (publisert 17. august 1995), WO 99/61422 (publisert 2 desember 1999), US patent 6, 534,524 (beskriver AG13736), US patent 5,834,504 (utstedt 10. november 1998), WO 98/50356 (publisert 12. november1998), US patent 5,883,113 (utstedt 16. mars 1999), US patent 5,886,020 (utstedt 23. mars 1999), US patent 5,792,783 (utstedt 11. august 1998), US patent 6,653,308 (utstedt 25. november 2003), WO 99/10349 (publisert 4. mars 1999), WO 97/32856 (publisert 12. september 1997), WO 97/22596 (publisert 26. juni 1997), WO 98/54093 (publisert 3. desember 1998), WO 98/02438 (publisert 22. januar 1998), WO 99/16755 (publisert 8. april 1999), og WO 98/02437 (publisert 22. januar1998), og alle disse inkorporeres heri i sin helhet med henvisning.

Andre antiproliferative midler som anvendes med antistoffene, eller antigenbindende porsjoner derav, ifølge oppfinnelsen, inkluderer inhibitorer av enzym farnesyl protein transferase og inhibitorer av reseptor tyrosinkinase PDGFr, inkludert forbindelsene beskrevet og gjort krav på i følgende US patentsøknader: 09/221946 (av 28. desember 1998); 09/454058 (av 2. desember 1999); 09/501163 (av 9. februar 2000); 09/539930 (av 31. mars 2000); 09/202796 (av 22. mai 1997); 09/384339 (av 26. august 1999); og 09/383755 (av 26. august 1999); og forbindelsene beskrevet i og gjort krav på i følgende US provisoriske patentsøknader: 60/168207 (av 30. november 1999); 60/170119 (av 10. desember 1999); 60/177718 (av 21. januar 2000);

60/168217 (av 30. november 1999), og 60/200834 (av 1. mai 2000). Enhver av de foregående patentsøknader og provisoriske patentsøknader inkorporeres heri med referanse i sine helheter.

PDGRr inhibitorer inkluderer, men er ikke begrenset til de som er beskrevet i WO 01/40217, publisert 7. juli 2001 og WO 2004/020431, publisert 11. mars 2004, hvis innhold inkorporeres heri i sin helhet for alle formål. Foretrukne PDGFr inhibitorer inkluderer Pfizers CP-673/451 og CP-868,596 og dets farmasøytisk akseptable salter.

Foretrukne GARF-inhibitorer inkluderer Pfizers AG-2037 (pelitreksol og dets farmasøytiske akseptable salter). GARF-inhibitorer nyttige i praktiseringen av foreliggende oppfinnelse er beskrevet i US patent 5,608,082, som inkorporeres heri i sin helhet for alle formål.

Eksempler på nyttige COX-II inhibitorer som kan anvendes i forbindelse med et P-cadherin antistoff eller antigenbindende porsjon derav, som beskrevet heri, og farmasøytiske sammensetninger beskrevet heri inkluderer CELEBREX™ (celekoksib), parekoksib, derakoksib, ABT-963, MK-663 (etorikoksib), COX-189 (Lumirakoksib), BMS 347070, RS 57067, NS-398, Bextra (valdekoksib), parakoksib, Vioxx (rofekoksib), SD-8381, 4-metyl-2-(3,4-dimetylfenyl)-1-(4-sulfamoyl-fenyl)-1H-pyrrol, 2-(4-etoksyfenyl)-4-metyl-1-(4-sulfamoylfenyl)-1H-pyrrol, T-614, JTE-522, S-2474, SVT-2016, CT-3, SC-58125 og Arcoxia (etorikoksib). Ytterligere, COX-II inhibitorer er beskrevet i US patentsøknader 10/801,446 og 10/801,429, og innholdende av disse inkorporeres heri i sin helhet for alle formål.

I én foretrukket utførelse er antitumormiddelet celekoksib som beskrevet i US patent 5,466,823, hvis innhold inkorporeres med henvisning i sin helhet for alle formål.

Strukturen for celekoksib er vist nedenfor:

I én foretrukket utførelse er antitumormiddelet valdekoksib som beskrevet i US patent 5,633,272, hvis innhold inkorporeres heri med henvisning i sin helhet for alle formål. Strukturen for valdekoksib er beskrevet nedenfor:

I én foretrukket utførelse er antitumormiddelet parekoksib som beskrevet i US patent 5,932,598, hvis innhold inkorporeres heri med henvisning i sin helhet for alle formål. Strukturen for parakoksib er vist nedenfor:

I én foretrukket utførelse er antitumormiddelet derakoksib som beskrevet i US patent 5,521,207, hvis innhold inkorporeres heri med henvisning i sin helhet for alle formål. Strukturen for derakoksib er vist nedenfor:

I én foretrukket utførelse er antitumormiddelet SD-8381 som beskrevet i US patent 6,034,256, hvis innhold inkorporeres heri med henvisning i sin helhet for alle formål. Strukturen for SD-8381 er vist nedenfor:

I én foretrukket utførelse er antitumormiddelet ABT-963 som beskrevet i internasjonal publisering nr. WO 2002/24719, hvis innhold inkorporeres heri med henvisning i sin helhet for alle formål. Strukturen for ABT-963 er vist nedenfor:

I én foretrukket utførelse er antitumormiddelet rofekoksib som vist nedenfor:

I én foretrukket utførelse er antitumormiddelet MK-663 (etorikoksib) som beskrevet i internasjonal publisering nr. WO 1998/03484, hvis innhold inkorporeres heri med henvisning i sin helhet for alle formål. Strukturen for etorikoksib er vist nedenfor:

I én foretrukket utførelse er antitumormiddelet COX-189 (lumirakoksib) som beskrevet i internasjonal publisering nr. WO 1999/11605, hvis innhold inkorporeres heri med henvisning i sin helhet for alle formål. Strukturen for lumirakoksib er vist nedenfor:

I én foretrukket utførelse er antitumormiddelet BMS-347070 som beskrevet i US patent 6,180,651, hvis innhold inkorporeres heri med henvisning i sin helhet for alle formål. Strukturen for BMS-347070 er vist nedenfor:

I én foretrukket utførelse er antitumormiddelet NS-398 (CAS 123653-11-2).

Strukturen for NS-398 (CAS 123653-11-2) er vist nedenfor:

I én foretrukket utførelse er antitumormiddelet RS 57067 (CAS 17932-91-3).

Strukturen for RS 57067 (CAS 17932-91-3) er vist nedenfor:

I én foretrukket utførelse er antitumormiddelet 4-metyl-2-(3,4-dimetylfenyl)-1-(4-sulfamoyl-fenyl)-1H-pyrrol. Strukturen for 4-metyl-2-(3,4-dimetylmenyl)-1-(4-sulfamoyl-menyl)-1H-pyrrol er vist nedenfor:

I én foretrukket utførelse er antitumormiddelet 2-(4-toksyfenyl)-4-metyl-1-(4-sulfamoylfenyl)-1H-pyrrol. Strukturen for 2-(4-etoksyfenyl)-4-metyl-1-(4-sulfamoylfenyl)-1H-pyrrol er vist nedenfor:

I én foretrukket utførelse er antitumormiddelet meloksikam. Strukturen for meloksikam er vist nedenfor:

Andre nyttige inhibitorer som antitumormidler anvendt i forbindelse med antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse og farmasøytiske sammensetninger beskrevet heri inkluderer aspirin, og ikke-steroidale antiinflammatoriske medikamenter (NSAIDer) som inhiberer enzymet som lager prostaglandiner (syklooksygenase I og II), resulterende i lavere nivåer av prostaglandiner, inkluderende men ikke begrenset til følgende, salsalat (Amigesic), diflunisal (Dolobid), ibuprofen (Motrin), ketoprofen (Orudis), nabumeton (Relafen), piroksikam (Felden), naproksen (Aleve, Naprosyn), diklofenak (Voltaren), indometacin (Indocin), sulindak (Clinoril), tolmetin (Tolectin), etodolak (Lodine), ketorolak (Toradol), oksaprozin (Daypro) og kombinasjoner derav. Foretrukne COX-I inhibitorer inkluderer ibuprofen (Motrin), nuprin, naproksen (Aleve), indometacin (Indocin), nabumeton (Relafen) og kombinasjoner derav.

Utvalgte midler anvendt i kombinasjon med et P-cadherin antistoff eller antigenbindende porsjon derav, som beskrevet heri, og farmasøytiske sammensetninger derav som beskrevet heri, inkluderer EGFer inhibitorer så som iressa (gefitinib, AstraZeneca), tarceva (erlotinib eller OSI-774, OSI Pharmaceuticals Inc.), erbituks (cetuximab, Imclone Pharmaceuticals, Inc.), EMD-7200 (Merck AG), ABX-EGF (Amgen Inc. og Abgenix Inc.), HR3 (Cuban Government), IgA antistoff (University of Erlangen-Nuremberg), TP-38 (IVAX), EGFR fusjonsprotein, EGF-vaksine, anti-EGFr immunoliposomer (Hermes Biosciences Inc.), og kombinasjoner derav.

Foretrukne EGFer inhibitorer inkluderer iressa, erbituks, tarceva og kombinasjoner derav.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også antitumormidler valgt blant pan erb reseptorinhibitorer eller ErbB2 reseptorinhibitorer så som CP-724,714 (Pfizer, Inc.), CI-1033 (canertinib, Pfizer, Inc.), Herceptin (trastuzumab, Genentech Inc.), Omitarg (2C4, pertuzumab, Genentech Inc.), TAK-165 (Takeda), GW-572016 (lonafarnib, GlaxoSmithKline), GW-282974 (GlaxoSmithKline), EKB-569 (Wyeth), PKI-166 (Novartis), dHER2 (HER2 vaksine, Corixa og GlaxoSmithKline), APC8024 (HER2 vaksine, Dendreon), anti-HER2/neu bispespesifikt antistoff (Decof Cancer Center), B7.her2.IgG3 (Agensys), AS HER2 (forskingsinstituttet til Rad Biology & Medicine), trifunksjonelle bispesifikke antistoff (University of Munich) og mAB AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc) og mAB 2B-1 (Chiron) og kombinasjoner derav. Foretrukne erb selektive antitumormidler inkluderer Herceptin, TAK-165, CP-724,714, ABX-EGF, HER3 og kombinasjoner drav. Foretrukne pan erbb reseptorinhibitorer inkluderer GW572016, CI-1033, EKB-569, og Omitarg og kombinasjoner derav.

Ytterligere erbB2 inhibitorer inkluderer de som er beskrevet i WO 98/02434 (publisert 22. januar 1998), WO 99/35146 (publisert 15. juli 1999), WO 99/35132 (publisert 15. juli 1999), WO 98/02437 (publisert 22. januar 1998), WO 97/13760 (publisert 17.april 1997), WO 95/19970 (publisert 27. juli 1995), US patent 5,587,458 (utstedt 24. desember 1996), og US patent 5,877,305 (utstedt 2. mars 1999), hvor hver av disse inkorporeres med henvisning i sine helheter. ErbB2 reseptorinhibitorer nyttige ifølge foreliggende oppfinnelse er også beskrevet i US patenter 6,465,449, og 6,284,764, og internasjonal søknad WO 2001/98277, og hver av disse inkorporeres heri med henvisning i sine helheter.

Ytterligere, andre antitumormidler kan utvelges fra følgende midler, BAY-43-9006 (Onyx Pharmaceuticals Inc.), genasense (augmerosen, Genta), panitumumab (Abgenix/Amgen), zevalin (Schering), beksar (Corixa/GlaxoSmithKline), abareliks, alimta, EPO 906 (Novartis), diskodermolid (XAA-296), ABT-510 (Abbott), neovastat (Aeterna), enzastaurin (Eli Lilly), kombrestatin A4P (Oxigene), ZD-6126 (AstraZeneca), flavopiridol (Aventis), CYC-202 (Cyclacel), AVE-8062 (Aventis), DMXAA (Roche/Antisoma), thymitaq (Eximias), temodar (temozolomid, Schering Plough) og revilimd (Celegene) og kombinasjoner derav.

Andre antitumormidler kan utvelges fra følgende midler, CyPat (cyproterone acetat), Histerelin (histrelin acetat), Plenaixis (abareliksdepot), atrasentan (ABT-627), Satraplatin (JM-216), talomid (Thalidomide), teratop, temilifene (DPPE), ABI-007 (paklitaksel), Evista (raloksifen), Atamestane (Biomed-777), Xyotax (polyglutamat paklitaksel), Targetin (beksarotin) og kombinasjoner derav.

Ytterligere, andre antitumormidler kan utvelges fra følgende midler, Trizaone (tirapazamin), Aposyn (eksisulind), Nevastat (AE-941), Ceplene (histamindihydroklorid), Orathecin (rubitecan), Virulizin, Gastrimmune (G17DT), DX-8951f (eksatecanmesylat), Onconase (ranpirnase), BEC2 (mitumoab), Xcytrin (moteksafingadolinium) og kombinasjoner derav.

Ytterligere antitumormidler kan velges fra følgende midler, CeaVac (CEA), NeuTrexin (trimetresatglukuronat) og kombinasjoner derav. Ytterligere antitumormidler kan velges fra følgende midler, OvaRex (oregovomab), Osidem (IDM-1), og kombinasjoner derav. Ytterligere antitumormidler kan velges fra følgende midler, Advexin (ING 201), Tirazone (tirapazamin), og kombinasjoner derav. Ytterligere antitumormidler kan velges fra følgende midler, RSR13 (efaproksiral), Cotara (131I chTNT 1/b), NBI-3001 (IL-4) og kombinasjoner derav. Ytterligere antitumormidler kan velges fra følgende midler, Canvaxin, GMK vaksine, PEG Interon A, Taxoprexin (DHA/pakiltaksel) og kombinasjoner derav. Andre foretrukne antitumormidler inkluderer Pfizers MEK1/2 inhibitor PD325901, Array Biopharms MEK inhibitor ARRY-142886, Bristol Myers’ CDK2 inhibitor BMS-387,032, Pfizers CDK inhibitor PD0332991 og AstraZenecas AXD-5438 og kombinasjoner derav. Ytterligere, mTOR inhibitorer kan også benyttes så som CCI-779 (Wyeth) og rapamycinerivativer RAD001 (Novartis) og AP-23573 (Ariad), HDAC inhibitorer SAHA (Merck Inc./Aton Pharmaceuticals) og kombinasjoner derav. Ytterligere antitumormidler inkluderer aurora 2 inhibitor VX-680 (Vertex), Chk1/2 inhibitor XL844 (Exilixis).

De følgende cytotoksiske midler, for eksempel én eller flere valgt blant gruppen omfattende epirubicin (Ellence), docetaksel (Taxotere), paclitaksel, Zinecard (deksrazoan), rituksimab (Rituxan) imatinib mesylat (Gleevec), og kombinasjoner derav kan anvendes sammen med et P-cadherin antistoff eller antigenbindende porsjon derav, som beskrevet heri, og farmasøytiske sammensetninger derav, som beskrevet heri.

Foreliggende oppfinnelse vurderer også anvendelse av antistoffene og antigenbindende porsjoner derav ifølge foreliggende oppfinnelse sammen med hormonterapi, inkluderende men ikke begrenset til, eksemestan (Aromasin, Pfizer Inc.), leuprorelin (Lupron eller Leuplin, TAP/Abbott/Takeda), anastrozol (Arimidex, Astrazeneca), gosrelin (Zoladex, AstraZeneca), dokserkalsiferol, fadrozol, formestan, tamoksifencitrat (tamoksifen, Nolvadex, AstraZeneca), Casodex (AstraZeneca), Abarelix (Praecis), Trelstar, og kombinasjoner derav.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også hormonterapimidler så som antiøstrogener inkluderende men ikke begrensende til fulvestranter, toremifen, raloksifen, lasofoksifen, letrozol (Femara, Novartis), anti-androgener så som bicalutamid, flutamid, mifepriston, nilutamid, Casodex®(4'-cyano-3-(4-fluorfenylsulfonyl)-2-hydroksy-2-metyl-3'-(trifluormetyl) propionanilid, bicalutamid) og kombinasjoner derav.

Videre, oppfinnelsen tilveiebringer antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse alene eller i kombinasjon med ett eller flere pleieprodukter, for eksempel et produkt valgt blant gruppen omfattende filgrastim (Neupogen), ondansetron (Zofran), fragmin, prokrit, aloksi, emend, eller kombinasjoner derav.

Spesielt foretrukne cytotoksiske midler inkluderer Camptosar, Erbitux, Iressa, Gleevec, Taxotere og kombinasjoner derav.

De følgende topoisomerase I inhibitorer kan benyttes som antitumormidler, kamptotecin, irinotekan HCl (Camptosar), edotekarin, oratecin (Supergen), eksatecan (Daiichi), BN-80915 (Roche) og kombinasjoner derav. Spesielt foretrukne toposimerase II inhibitorer inkluderer epirubicin (Ellence).

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes med antitumormidler, alkylerende midler, antimetabolitter, antibiotika, planteavledete antitumormidler, kamptotecin derivater, tyrosin kinase inhibitorer, andre antistoff, interferoner og/eller biologiske responsmodifiserere.

Alkylerende midler inkluderer, men er ikke begrenset til, nitrogensennep N-oksid, cyklofosfamid, ifosfamid, melfalan, busulfan, mitobronitol, carboquone, tiotepa, ranimustin, nimustin, temozolomid, AMD-473, altretamin, AP-5280, apaziquone, brostallicin, bendamustin, carmustin, estramustin, fotemustin, glufosfamid, ifosfamid, KW-2170, mafosfamid, og mitolactol; platina-koordinerte alykerende forbindelser inkluderer men er ikke begrenset til, cisplatin, Paraplatin (karboplatin), eptaplatin, lobaplatin, nedaplatin, eloksatin (oksaliplatin, Sanofi) eller satrplatin og kombinasjoner derav. Spesielt foretrukne alkylerende midler inkluderer Eloxatin (oksaliplatin).

Antimetabolittene inkluderer, men er ikke begrenset til metotreksat, 6-merkaptopurinribosid, merkaptopurin, 5-fluoruracil (5-FU) alene eller i kombinasjon med leukovorin, tegafur, UFT, doksifluridin, karmofur, cytarabin, cytarabin okfosfat, enocitabin, S-1, Alimta (premetreksert dinatrium, LY231514, MTA), Gemzar (gemcitabin, Eli Lilly), fludarabin, 5-azacitidin, kapecitabin, kladribin, klofarabin, decitabin, eflornitin, etynylcytidin, cytosinarabinosid, hydroksyurea, TS-1, melfalan, nelarabin, nolatreksed, oksfosfat, dinatrium premetreksert, pentostatin, pelitreksol, raltitreksert, triapin, trimetreksat, vidarabin, vinkristin, vinorelbin; eller for eksempel én av de foretrukne antimetabolitter beskrevet i europeisk patentsøknad nr.239362 så som N-(5-[N-(3,4-dihydro-2-metyl-4-oksoquinazolin-6-ylmetyl)-N-metylamino]-2-tenoyl)-L-glutaminisk syre og kombinasjoner derav.

Antibiotika inkluderer interkalerende antibiotika men er ikke begrenset til: aklarubicin, aktinomycin D, amrubicin, annamycin, adriamycin, bleomycin, daunorubicin, doksorubicin, elsamitrucin, epirubicin, galarubicin, idarubicin, mitomycin C, nemorubicin, neocarzinostatin, peplomycin, pirarubicin, rebeccamycin, stimalamer, streptozocin, valrubicin, zinostatin og kombinasjoner derav.

Planteavledete antitumorsubstanser inkluderer for eksempel de som er valgt blant mitotiske inhibitorer, for eksempel vinblastin, docetaksel (Taxotere), paklitaksel og kombinasjoner derav.

Cytotoksiske topoisomeraseinhiberende midler inkluderer én eller flere midler valgt blant gruppen omfattende aklarubicn, amonafid, belotekan, kamptotecin, 10-hydroksykamptotecin, 9-aminokamptotecin, diflomotekan, irinotekan HCl (Camptosar), edotekarin, epirubicin (Ellence), etoposid, eksatekan, gimatekan, lurtotekan, mitoksantron, pirarubicin, piksantron, rubitekan, sobuzoxan, SN-38, tafluposid, topotekan, og kombinasjoner derav.

Foretrukne cytotoksiske topoisomeraseinhibrende midler inkluderer én eller flere midler valgt blant gruppen omfattende kamptotecin, 10-hydroksykamptotecin, 9-aminokamptotecin, irinotekan HCl (Camptosar), edotekarin, epirubicin (Ellence), etoposid, SN-38, topotekan og kombinasjoner derav.

Immunologiske midler inkluderer interferoner og et antall andre immunforsterkende midler. Interferoner inkluderer interferon alfa, interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, interferon beta, interferon gamma-1a, interferon gamma-1b (Actimmune), eller interferon gamma-n1 og kombinasjoner derav. Andre midler inkluderer filgrastim, lentinan, sizofilan, TheraCys, ubenimex, WF-10, aldesleukin, alemtuzumab, BAM-002, dacarbazine, daclizumab, denileukin, gemtuzumab ozogamicin, ibritumomab, imiquimod, lenograstim, lentinan, melanomvaksine (Corixa), molgramostim, OncoVAX-CL, sargramostim, tasonermin, tekleukin, tymalasin, tositumomab, Virulizin, Z-100, epratuzumab, mitumomab, oregovomab, pemtumomab (Y-muHMFG1), Provenge (Dendreon) og kombinasjoner derav.

Biologiske responsmodifiserere er midler som modifiserer forsvarsmekanismer i levende organismer eller biologiske responser, så som overlevelse, vekst eller differensiering av vevsceller for å dirigere disse til å ha antitumoraktivitet. Slike midler inkluderer krestin, lantinan, sizofiran, picibanil, ubenimeks og kombinasjoner derav. Andre anticancermidler inkluderer alitretinoin, ampligen, atrasentan beksaroten, bortezomib. Bosentan, kalsitriol, eksisulind, finasterid, fotemustin, ibandronisk syre, miltefosin, mitoksantron, l-asparaginase, procarbazin, dacarbazin, hydroksykarbamid, pegaspargase, pentostatin, tazarotne, Telcyta (TLK-286, Telik Inc.), Velcade (bortemazib, Millenium), tretinoin, og kombinasjoner derav.

Andre anti-angiogeniske forbindelser inkluderer acitretin, fenretinid, talidomid, zoledronisk syre, angiostatin, aplidin, cilengtid, kombretastatin A-4, endostatin, halofuginon, rebimastat, removab, Revlimid, squalamine, ukrain, Vitaxin og kombinasjoner derav.

Platiakoordinerte forbindelser inkluderer, men er ikke begrenset til cisplatin, karboplatin, nedaplatin, oksaliplatin og kombinasjoner derav.

Camptotecin derivater inkluderer, men er ikke begrenset til camptotecin, 10-hydroksycamptotecin, 9-aminocamptotecin, irinotekan, SN-38, edotekarin, topotekan og kombinasjoner derav.

Andre antitumormidler inkluderer mitoksantron, l-asparaginase, procarbazin, dacarbazin, hydroksykarbamid, pentostatin, tretinoin og kombinasjoner derav.

Antitumormidler i stand til å forsterke antitumor immunrespons, så som CTLA4 (cytotoksisk lymfocyt antigen 4) antistoff, og andre midler i stand til å blokkere CTLA4 kan også benyttes, så som MDX-010 (Medarex) og CTLA4 forbindelser beskrevet i US patent 6,682,736; og anti-proliferative midler så som andre farnesyl protein transferase inhibitorer, for eksempel farnesyl protein transferase inhibitorer.

Ytterligere, spesifikke CTLA4 antistoff som kan anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer de som er beskrevet i US provisorisk søknad 60/113,647 (av 23. desember 1998), US patent 6, 682,736, og begge disse inkorporeres heri med henvisning i sine helheter.

Spesifikke IGF 1R antistoff som kan anvendes i foreliggende oppfinnelse inkluderer de som er beskrevet i internasjonal patentsøknad WO 2002/053596, som herved inkorporeres med referanse i sin helhet.

Spesifikke CD40 antistoff som kan anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer de som er beskrevet i internasjonal patentsøknad WO 2003/040170, som inkorporeres heri med referanse i sin helhet.

Genterapimidler kan også benyttes som antitumormidler så som TNFerade (GeneVec), som uttrykker TNFalfa i respons til radioterapi.

I én utførelse ifølge foreliggende oppfinnelse kan statiner benyttes i sammen med P-cadherin antistoff eller antigenbindende porsjon derav, som beskrevet heri, og farmasøytiske sammensetninger derav. Statiner (HMG-CoA reduktase inhibitorer) kan utvelges fra gruppen omfattende Atorvastatin (Lipitor, Pfizer Inc.), Provastatin (Pravachol, Bristol-Myers Squibb), Lovastatin (Mevacor, Merck Inc.), Simvastatin (Zocor, Merck Inc.), Fluvastatin (Lescol, Novartis), Cerivastatin (Baycol, Bayer), Rosuvastatin (Crestor, AstraZeneca), Lovostatin og Niacin (Advicor, Kos Pharmaceuticals), derivater og kombinasjoner derav.

I én foretrukket utførelse er statiner valgt blant gruppen omfattende Atovorstatin og Lovastatin, derivater og kombinasjoner derav.

Andre midler nyttige som antitumormidler inkluderer Caduet.

For enhver av framgangsmåtene for å behandle en hyperproliferativ forstyrrelse eller avvikende cellevekst som beskrevet heri ved anvendelse av en kombinasjon av et P-cadherin antistoff eller antigenbindende porsjon med minst ett ytterligere terapeutisk middel, kan P-cadherin antistoffet være konjugert, eller derivatisert, med det ytterligere terapeutiske middel. Det minst ene ytterligere terapeutiske middel kan også administreres separat, eller på en ikke-derivatisert eller ikke-konjugert måte. Idet minst ett ytterligere terapeutisk middel ikke er derivatisert eller konjugert til antistoffet kan det administreres med den samme farmasøytiske formulering som antistoffet, eller det kan administreres i en separat formulering.

Genterapi

Nukleinsyremolekyler som koder for antistoffene og antistoffporsjoner ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres til en pasient i behov derav via genterapi.

Terapien kan være enten in vivo eller ex vivo. I en foretrukket utførelse administreres nukleinsyremolekyler som koder både for en tungkjede og en lettkjede til en pasient. I en mer foretrukket utførelse administreres nukleinsyremolekylene slik at de stabilt integrereres i kromosomer av B-celler på grunn av disse celler er spesialisert for å produsere antistoff. I en foretrukket utførelse kan forløper B-celler transfekteres eller infiseres ex vivo og retransplanteres inn i en pasient i behov derav. I en ytterligere utførelse kan forløper B-celler eller andre celler infiseres in vivo ved anvendelse av et virus kjent til å infisere den aktuelle celletype. Typiske vektorer anvendt for genterapi inkluderer liposomer, plasmider og virale vektorer. Representative virale vektorer er retrovirus, adenovirus og adeno-assosierte virus. Etter infeksjon enten in vivo eller ex vivo, kan nivået av antistoffuttrykking monitoreres ved å oppta en prøve fra den behandlete pasient og anvende enhver immunanalyse kjent innen fagfeltet eller beskrevet heri.

I en foretrukket utførelse omfatter genterapimetoden trinnene å administrere et isolert nukleinsyremolekyl som koder for tungkjeden eller en antigenbindende porsjon derav av et P-cadherin antistoff og uttrykker nukleinsyremolekylet. I en annen utførelse omfatter genterapimetoden trinnene å administrere et isolert nukleinsyremolekyl som koder for lettkjeden eller en antigenbindende porsjon derav av et P-cadherin antistoff og uttrykker nukleinsyremolekylet. I en mer foretrukket framgangsmåte omfatter genterapimetoden trinnene å administrere et isolert nukleinsyremolekyl som koder for tungkjeden eller en antigenbindende porsjon derav og et isolert nukleinsyremolekyl som koder for lettkjeden eller antigenbindende porsjon derav av et P-cadherin antistoff ifølge oppfinnelsen og uttrykker nukleinsyremolekylene. Genterapimetoden kan også omfatte trinnene å administrere andre terapeutiske midler, så som ethvert av de midlene beskrevet tidligere i forbindelse med kombinasjonsterapi.

For at oppfinnelsen skal bedre forstås angis påfølgende eksempler. Disse eksempler er kun for å illustrere og skal ikke vurderes som begrensende for rammen av oppfinnelsen på noen måte.

Eksempler

I de følgende eksempler for framstillinger betyr ”BSA” bovin serumalbumin, ”EDTA” betyr etylendiamintetra eddiksyre; “DMSO” angir dimetylsulfoksid; “MOPS” angir 3-(N-morfolino) propanesulfonisk syre; “MES” angir 2-(N-morfolino)etansulfonisk syre;

“PBS” betyr fosfatbuffret saltløsning; “dPBS” betyr Dulbecco’s fosfatbuffrete saltløsning; “HEMA” betyr 2-hydroksy-etylmetakrylat; “DMEM” angir Dulbecco’s modifiserte Eagle’s medium; “FBS” angir fetalt bovinserum; “NEAA” betyr ikkeessensielle aminosyrer; “HEPES” betyr N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-2-etansulfonisk syre; og “DMF” betyr dimetylformamid.

Eksempel 1: Screening av scFv fagdisplaybibliotek

Rekombinant humant P-cadherin (R&D Systems 861-PC-100) ble anvendt som antigenet for å screene et scFv fagdisplaybibliotek. Stort scFv humant antistoffbibliotek klonet inn i en fagemidvektor ble anvendt for seleksjon (Vaughan, T.J. et al., Nat.

Biotech. 14:309-314 (1996)). ScFv som gjenkjenner P-cadherin ble isolert fra fagdisplaybibliotekene i en serie av repetertt seleksjonssykluser på rekombinant human P-cadherin og konfluente monosjikt av HCT116-celler som uttrykker P-cadherin. Kort forklart, etter inkubering med biblioteket, ble bundet fag gjenvunnet fra P-cadherin, og ubundet fag ble vasket bort. Bundet fag ble deretter berget som beskrevet i Vaughan, T.J. et al., Nat. Biotech.14:309-314 (1996) og seleksjonsprosessen ble repetert. En representativ andel av klonene fra utvalget av seleksjonsrunder ble underlagt fagenzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA) for å teste for binding til P-cadherin, i hovedsak som beskrevet i Vaughan, T.J. et al., Nat. Biotech.

14:309-314 (1996). To forskjellige antigen ble anvendt i ELISA; rekombinant humant P-cadherin (R&D Systems) og konfluente monosjikt av A431 celler som uttrykker P-cadherin. ELISA-positive kloner ble underlagt DNA-sekvensering som beskrevet i Vaughan, T.J. et al., Nat. Biotech.14:309-314 (1996) og i Osbourn, J.K. et al., Immunotechnology 3:293-302 (1998). Unike ELISA-positive kloner ble omdannet til hele IgG-molekyler og testet for deres evne til å nøytralisere P-cadherin i P-cadherinavhengig adhesjonsanalyse beskrevet i eksempel 4. Basert på resultatene av denne screening ble antistoffet 129-1c4 (IC50 på 1-3 µM i A431 adhesjonsanalysen) selektert som ledende morlinje for ytterligere optimalisering.

Eksempel 2: Ledende optimalisering

Fagdisplaybibliotek avledet fra 129-1c4 ble etablert med oligonukleotid-rettet mutagenese av antistoff variabel tung (VH) og variabel lett (VL) kjede CDR3-regioner. Bibliotekene ble konstruert ved anvendelse av standard molekylærbiologiske teknikker som beskrevet i Clackson and Lowman, Phage Display – A Practical Approach (Oxford University Press 2004). Affinitetsbaserte eseleksjoner ble utført hvor: Etter inkubering med biblioteket ble rekombinant humant P-cadherin (R&D Systems) opptatt fra protein G-coatede magnetiske kuler (Dynal 100.03) og bundet fag ble gjenvunnet med magnetisk separering mens ubundne komplekser ble vasket bort. Seleksjonsprosessen ble repetert med reduserende konsentrasjoner av rekombinant humant P-cadherin (25 nM til 10 pM i løpet av 4 runder) til stede under seleksjonen. I tillegg, seleksjonsutganger fra VH CDR3 og VL CDR3-bibliotek ble rekombinert i ytterliger fagdisplaybibliotek og selektert over to ytterligere runder av affinitetsbasert seleksjon. Representative proporsjoner av kloner fra utgangene av seleksjonsrundene ble underlagt screening som scFv i 129-1c4 epitop konkurranseanalyse, som beskrevet i eksempel 8.

Eksempel 3: P-cadherinavhengig adhesjonsanalyse

Den følgende protokoll ble anvendt for å bestemme IC50 verdier i en P-cadherinavhengig adhesjonsanalyse ved anvendelse av flere optimaliserte scFv’er som ble omdannet til IgG under optimaliseringsfasen av antistoffoppdagelser som beskrevet over i eksempel 2. Gjennomsnittlige målte IC50-verdier for disse antistoff er vist nedenfor i tabell 4.

Rekombinant humant P-cadherin er Fc (R&D Cat.861-PC) ble rekonstituert til en konsentrasjon av 1 mg/ml med 2 mM CaCI2 i MilliQ vann 24 timer før anvendelse, og lagret ved 4<0>C. A431 celler ble dyrket, og prefaset som følger. A431 celler (ECACC No. 85090402) ble rutinemessig dyrket i Nunc triple flasker (3 x 175 cm<2>areal) i minimalt essensielt medium (MEM) (Invitrogen Cat 31095), inneholdende 10% fetalt bovin serum (Invitrogen Cat.10100-147) og 1% ikke-essensielle aminosyrer (Invitrogen Cat.11140-035). De dyrkete celler var omtrent 80% konfluente ved tid for høsting for anvendelse i analysen. For å sikre mulige passasjerelaterte effekter ble cellene rutinemessig anvendt mellom passasje 4 og 8, og høstet etter 48 eller 72 timers dyrking. A431 celler ble høstet med 0,25% trypsin / 1 mM EDTA (Gibco Cat 25200-056) i akkurat tilstrekkelig tid til at cellene dissosierer (7-10 min), og deretter umiddelbart fortynnet i vevskulturmedium til en tetthet på ca.2 x 10<6>celler/ml. A431 cellene ble deretter sentrifugert (1200 rpm), resuspendert i analysebuffer (Hanks balanserte saltløsning (uten Mg<2+>og Ca<2+>, og uten fenolrødt) (Invitrogen Cat.14175-053) tilsatt til en final CaCl2 final konsentrasjon på 1 mM) resentrifugert og resuspendert i analysebuffer igjen til en final tetthet på 2 x 10<6>celler/ml.

Framstilling av IgG serielle fortynninger og preinkubering med A431 cellene ble utført som følger.180 µl av hver test IgG, eller porsjon derav, ble tilsatt 20 µl analysebuffer inneholdende 10% BSA (Sigma Cat. A-9576) for å standardisere BSA-konsentrasjonen til 1%. Et antimurin/humant P-cadherin referanse polyklonalt antistoff (R&D Cat. AF-761) ble innledningsvis resuspendert i MilliQ vann for å gi en 1 mg/ml forrådsløsning. 40 µl av denne forrådsløsning ble deretter ytterligere fortynnet i 140 µl analysebuffer. 20 µl analysebuffer inneholdende 10% BSA ble deretter tilsatt for å gi 200 µl ved 0,2 mg/ml antistoff og 0,1% BSA. Duplikatet seriell fortynninger ble framstilt ved først å tilsette 2 x 90 µl av AF-761 polyklonalt antistoff eller test IgG til kolonne 1 av en Greiner 96 brønns polypropylen fortynningsplate (Greiner Cat.780271).60 µl analysebuffer ble deretter tilsatt til kolonnene 2-11. En 30 µl i 60 µl (1:3) fortynning ble deretter framstilt over platen fra venstre til høyre fra kolonnene 1-11.60 µl analysebuffer alene ble deretter tilsatt til brønnene 12A-D for å definere maksimumsadhesjon. Maksimal adhesjon ble definert ved tilsetting av 60 µl 25 mM EDTA (i analysebuffer) til brønnene 12 E-H.60 µl av A431 cellesuspensjon (2 x 10<6>celler/ml i analysebuffer, framstilt som beskrevet over) ble deretter tilsatt til alle brønner, og, etter agitering, ble platene preinkubert i 1 t ved 37<0>C.

Parallelt med framstilling av test IgG serielle fortynninger og preinkubering med A431 celler ble P-cadherin-belagte analyseplater framstilt som følger. Rekombinant humant P-cadherin Fc ble fortynnet i coatingsbuffer (PBS uten Mg<2+>og Ca<2+>- Invitrogen Cat.

14190-094) til en konsentrasjon på 10 µg/ml og dispensert på Fluoronunc 96 (Nunc Cat. 437958) brønns analyseplater (100 µl/brønn). Platene ble deretter inkubert i 1 t 30 min. ved romtemperatur. Platene ble deretter vasket 3 ganger med PBS ved anvendelse av en Tecan 96 platevasker.200 µl/brønn analysebuffer ble deretter tilsatt for blokkering, og platene ble inkubert ved ytterligere 1 t ved romtemperatur. Platene ble deretter vasket 3 ganger med PBS som beskrevet tidligere.

100 µl/brønn av det preinkuberte IgG / A431 materiale ble deretter transformert fra Greiner 96 brønns fortynningsplater til P-cadherin-belagte analyseplater. Ved tid for overføring av IgG / A431-materiale ble dette blandet ved pipettering for å sikre at cellene var homogene. Adhesjonsprosessen fikk deretter foregå ved å inkubere analyseplatene ved 37<0>C i 30-35 minutter. Ved slutten av inkuberingen ble ikkeadherente celler fjernet ved forsiktig aspirering av media fra platene, og ved å refylle brønnene med cellevaskerbuffer (Hanks balanserte saltløsning (uten Mg<2+>og Ca<2+>, og uten fenolrødt – Invitrogen Cat.14175-053) supplert til 1 mM CaCl2 final konsentrasjon). Platene ble deretter invertert på et bad av cellevaskebuffer i 15 min. for å fjerne restmengde ikke-adherente celler. Ved slutten av denne inkubering ble innholdet av brønnene forsiktig aspirert.

Kvantifisering av adherente celler ble utført som følger. Adherente celler ble detektert ved tilsetting av 100 µl/brønn kombinert lysering / alkalisk fosfatase deteksjonsreagens (dietanolaminsubstrat buffere 5X konsentrat (Pierce Cat.34064) fortynnet 1:5 med vann, hvoretter en 15 mg PNPP tablett (Sigma Cat. N-2640) ble oppløst per 25 ml 1X-løsning) etterfulgt av inkubering i 30-60 min. ved 37<0>C. Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetting av 1 M NaOH (50 µl/brønn), for å gi et maksimum OD-verdi på ca. 0,8 i fravær av inhibering. Absorbance ved 405 nm ble deretter målt ved anvendelse av en standard plateleser.

Resultatene ble deretter analysert som følger. Ved å bruke kolonne 12, brønnene A-D som 100% adhesjon og kolonne 12, brønnene E-H som 0% adhesjon, ble rådata først omdannet til % adhesjonsverdier som følger:

% adhesjon = {(verdi-min adhesjon) / (maks. – min adhesjon)}*100. ;% adhesjon versus konsentrasjon av IgG inhibitor ble deretter plottet, og IC50-verdier bestemt ved anvendelse av Prism-programvare. Der hvor partiell inhibering ble observert ble IC50 beregnet som konsentrasjonen av IgG som gir en sann 50% inhibering i motsatt til kurve midtpunkt. IC50-verdier er rapportert i tabell 4. ;;Tabell 4 ;;; ;;; To separate A431 adhesjonsanalyser ble utført for å undersøke flere arvelinjeoptimaliserte IgGer fra 129-1c4 linjen i sammenlikning med deres ikke-arvelinjeekvivalenter. For disse eksperimenter var det nødvendig å forandre til en ny batch P-cadherin (CFR-134041), som synes å være assosiert med noe økede IC50-verdier sammenliknet med andre data. Gjennomsnittlige data for flere arvelinje IgGer fra de to eksperimenter er vist i tabell 5. Som angitt tidligere, g-194-b09 refererer til arvelinjeversjon 194-b09, og så videre. ;;Tabell 5 ;;; ; Eksempel 4: P-cadherin-avhengig celleaggregeringsanalyse ;;Den følgende protokoll ble anvendt for å bestemme IC50-verdier i en P-cadherinavhengig aggregeringsanalyse ved anvendelse av flere optimaliserte scFv’er som ble omdannet til IgG under optimaliseringsfasen av antistoffoppdagelse som beskrevet over i eksempel 2. På grunn av at P-cadherin overuttrykker cellelinjer fra tette multicellulære aggregater idet de plasseres i substensjonsvekst, kan celleaggregering måles i nærvær av P-cadherin antistoff som interfererer med cellulær aggregering. Gjennomsnittlige målte IC50-verdier for flere antistoff er vist nedenfor i tabell 6. ;;Framstilling av plater ble utført som følger. Hver 96-brønns analyseplate ble belagt med 50 µl polyHEMA (12 mg/ml i 90% etanol, 10% metanol) og deretter evaporert i 6 t natten over etterfulgt av vasking 3 x 100 µl sterilt H2O før bruk. Cellen ble deretter dyrket som følger. Celler fra human cellelinje SW480 (som stabilt uttrykker P-cadherin G418<r>) ble det utført passasje på i fult vekstmedium (qs DMEM (inVitrogen 11995-065), 10% FBS (Omega Scientific FB-02), 1:100 NEAA (InVitrogen 11140-050), 1:100 natrimpyruvat (InVitrogen 11360-070), 1:100 glutamin (InVitrogen 25030-051), 1:100 penicillin/streptolysin (InVitrogen 15070-063), 1:100, geneticin 50 mg/ml (Invitrogen 10131-035)) G418 (500 µg/ml , og deretter splittet 1:3-4 to ganger per uke. Kulturene ble deretter frosset i vekstmedium 10% DMSO. ;;Ved dag 1 ble SW480-pCAD-cellene og kontroll SW480:pCLNX (kontroll stabil vektor) utsådd med 5 x 10<6>celler/100 mm skål, med ikke mer enn 1:3 fortynning. Cellene fikk deretter vokse i 48 timer i kultur. Hver 100 mm skål ga ca.10 x 10<6>celler, eller tilstrekkelig for 2 x 96 brønns plater. ;;Ved dag 3 ble medium fjernet, etterfulgt av vasking med dPBS (Dulbeccos PBS (InVitrogen 14040-133)), hvoretter cellene ble trypsinert i 3 ml/100 mm skål. ;Nøytralisering ble deretter utført etter frigivelse av to volum (6 ml) for full vekstmedium. Platene ble deretter vasket tre ganger ved anvendelse av en pipette med 10 ml for å ødelegge clusterene. Cellene ble deretter talt, og en pellet ble oppnådd ved anvendelse av en Beckman sentrifuge ved 1000 rpm i 5 minutter. Medium ble deretter aspirert, pellet ble resuspendert først i < 1 ml fullt vekstmedium med fingervortexing, deretter p1000 pipette, og deretter ble cellekonsentrasjonen normalisert til 1,3 M/ml. Enkeltcelle dispersjon ble sikret med mikroskopi. ;;En reagensplate ble deretter framstilt ved blokkering av en 96 brønns plate med dPBS og 5% FBS i 30 min. Platen ble deretter vasket ved anvendelse av 1 x 100 µl dPBS, etterfulgt av aspirering og knipsing for å tørke. En fortynningsserie av test IgG ble framstilt med dPBS, ved anvendelse av 4x [IgG]-konsentrasjon, tilstrekkelig for 3 brønner av behandlingsplate i én brønn i 96 brønnsplaten.40.000 celler i 30 µl / brønn ble aliquotert til en 96 brønns, vasket, poly-HEMA belagt Costar3590 ikkevevskulturplate (Corning 3590).10 µl reagens ble deretter overført til hver brønn i 96 brønnsplaten. Triplikatprøver per behandling ble utført ved anvendelse av en 8 kanals pipette. Inkubering foregikk deretter ved 250 rpm, ble ristet, i en humidifisert 37<0>C, 5% CO2 inkubator natten over (16-18 t). ;;Ved dag 4 ble 40 µl av ristede celler overført til en poly-lysin-belagt 96 brønns plate (BioCoat poly-lysin-belagte 96 brønns plater: BD 356516). Brønnene ble deretter skylt med 60 µl fullstendig vekstmedium, platene ble ristet med lett banking, og overført til poly-lysin-belagt plate. Dersom nødvendig ble ytterligere 50 µl vasking utført. Inkubering fulgte i 60 minutter i en humidifisert 37<0>C, 5% CO2 inkubator. ;Forsiktighet ble utvist ved dette trinn for å kvantitativt overføre alle cellene, så forsiktig som mulig, uten overskuddspipettering. Cellene ble deretter fiksert ved å tilsette 100 µl fikseringsløsning (7,4% formaldehyd (37% vekt/vol. – Sigma F15587)) i en damphette, etterfulgt av inkubering for >30 minutter ved romtemperatur. ;;For å vaske cellene ble væske dekantert inn i et samlekar eller brett og smekket forsiktig på et papirhåndkle. 100 µl per brønn dPBS ble deretter applisert for å vaske etterfulgt av inkubering i 15 min. Cellene ble deretter farget ved å dekantere som over og applisere 100 µl Hoescht (1 µg/ml Hoescht i dPBS – Hoescht 10 mg/ml molekylære prober 33342), etterfulgt av inkubering i 30 min. Cellene ble deretter vasket to ganger, ved å etterlate resterende 100 µl dPBS i brønnen for mikroskopi. ;Antallet aggregerte objekter per brønn ble deretter målt (Cellomics) og et gjennomsnittlig objekttall (med test IgG) ble sammenliknet til det for IgG (for eksempel Gt-anti-P-cadherin R&D Systems AF761) eller mediumkontroll alene. Objekttall versus konsentrasjon av IgG inhibitor ble deretter plottet, og IC50-verdier ble bestemt. IC50-verdiene for flere antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse er rapportert i tabell 6. ;;Tabell 6 ;;; ;;; Eksempel 5: P-cadherin-avhengig sfæroid ødeleggelsesanalyse ;;Den følgende sfæroid ødeleggelsesanalyse er en variasjon av aggregeringsanalysen (beskrevet i eksempel 4) hvor celleaggregater dannes over natten før tilsetting av P-cadherin og kontroll antistoff. Testreagensene tilsettes deretter for en ytterligere 24 timer før analyse. ;;Plateframstilling ble utført på følgende måte. Hver 96 brønns analyseplater ble belagt med 50 µl polyHEMA (12 mg/ml i 90% etanol, 10% metanol), og ble deretter evaporert i 6 timer natten over, etterfulgt av vasking 3 x 100 µl sterilt H2O før bruk. Cellene ble deretter talt som følger. Cellene fra den humane cellelinje SW480 (som stabilt uttrykker P-cadherin G418<r>) ble gitt passasje i fult vekstmedium (qs DMEM (InVitrogen 11995-065), 10% FBS (Omega Scientific FB-02), 1:100 NEAA (InVitrogen 11140-050), 1:100 natriumpyruvat (InVitrogen 11360-070), 1:100 glutamin (InVitrogen 25030-051), 1:100 penicillin/streptolysin (InVitrogen 15070-063), 1:100, geneticin 50 mg/ml (Invitrogen 10131-035)) G418 (500 µg/ml ), og deretter splittet 1:3-4 to ganger per uke. Kulturene ble deretter frosset i vekstmedium 10% DMSO. ;;Ved dag 1 ble SW480:pCAD-cellene og kontroll SW480:pCLNX (kontrollvektorstabil) utsådd med 5 x 10<6>celler/100 mm skål, med ikke mer enn 1:3 fortynning. Cellene fikk deretter vokse i 48 timer i kultur. Hver 100 mm skål ga ca. 10 x 10<6>celler, eller tilstrekkelig for 2 x 96 brønns plater. ;;Ved dag 3 ble medium fjernet etterfulgt av vasking med dPBS (Dulbeccos PBS (InVitrogen 14040-133)), hvoretter cellene ble trypsinert i 3 ml/100 mm skål. ;Nøytralisering ble deretter utført etter frigivelse med to volumer (6 ml) av fullt vekstmedium. Platene ble deretter vasket 3 ganger ved anvendelse av en pipette med 10 ml for å ødelegge clusterne. Cellene ble deretter talt, og det ble oppnådd en pellet ved anvendelse av en Beckman sentrifuge ved 1000 rpm i 5 minutter. Media ble deretter aspirert, pelletene ble resuspendert først i < 1 ml fullt vekstmedium med fingervorteksing, og deretter p1000 pipette, og deretter ble cellekonsentrasjonen normalisert til 1,0 x 10<6>/ml. Enkelcelledispersjon ble sikret med mikroskopi. ;;40.000 celler i 40 µl/brønn ble alikvotert til 96 brønn, vasket, poly-HEMA belagt Costar3590 ikke-vevskulturplate (Corning 3590). Inkubering fikk deretter foregå ved 250 rpm, ristende i en humidifisert 37<0>C, 5% CO2 inkubator natten over (16-18 t). ;;Ved dag 4 ble en reagensplate deretter framstilt ved blokkering av en 96 brønns plate med dPBS og 5% FBS i 30 min. Platen ble deretter vasket ved anvendelse av 1 x 100 µl dPBS, etterfulgt av aspirering og smekking for å tørke. En fortynningsserie av test IgG ble framstilt med dPBS, ved anvendelse av 5x [IgG] konsentrasjon, tilstrekkelig for 3 brønner av behandlingsplate i en brønn op 96 brønnsplaten.10 µl reagens ble deretter overført til hver brønn i 96 brønnsplaten. Duplikatprøver per behandling ble utført ved anvendelse av en 8 kanals pipette. Inkubering fikk deretter foregå ved 250 rpm, ristende, i en humidifisert 37<0>C, 5% CO2 inkubator (20-24 t). ;;Ved dag 5 ble 50 µl av ristede celler overført til en poly-lysin-belagt 96 brønnsplate (BioCoat poly-lysin-belagt 96 brønns plate: BD 356516). Brønnene ble deretter skylt med 50 µl fullstendig vekstmedium, platene ble ristet med forsiktig banking, og overført til poly-lysin-belagt plate. Dersom nødvendig ble ytterligere 50 µl vasking utført. Deretter inkubering i 60 minutter i en humidifisert 37<0>C, 5% CO2 inkubator. Forsiktighet ble utvist ved dette trinn for kvantitativt å overføre alle cellene, så forsiktig som mulig, uten overskuddspipettering. Cellene ble deretter fiksert ved tilsetting av 100 µl fikseringsløsning (7,4% formaldehyd (37% vekt/vol. – Sigma F15587)) i inndampingshette, etterfulgt av inkubering i > 30 minutter ved romtemperatur. ;;For å vaske cellene ble væske deretter dekantert inn i et oppsamlingskar eller brett, og smekket for å fjerne resterende væske, og forsiktig tappet på et papirhåndkle. 100 µl per brønn dPBS ble deretter applisert for å vaske, etterfulgt av inkubering i 15 min. Cellene ble deretter farget med dekantering som over, og ved å applisere 100 µl Hoescht (1 µg/ml Hoescht i dPBS – Hoescht 10 mg/ml molekylære prober (33342), etterfulgt av inkubering i 30 min. Cellene ble deretter vasket to ganger, og det resterende 100 µl dPBS ble igjen i brønnen for mikroskopi. Antallet aggregerte objekter per brønn ble deretter målt (Cellomics), og et gjennomsnittlig objekttall (med test IgG) ble sammenliknet til det for IgG (for eksempel Gt-anti-P-cadherin R&D Systems AF761) eller medium alene kontroll. Objekttall versus konsentrasjon av IgG inhibitor kan plottes for å bestemme IC50-verdier. Alternativt ble objekttall uttrykt som gangers ødeleggelse vs. kontroll ved én definert konsentrasjon som vist i tabell 7. ;Tabell 7 ;;; ;;; Eksempel 6: Måling og KD og Koff for P-cadherin antistoff ;;Affinitetsmålinger (KD og Koff) for P-cadherin scFv enkeltkjede antistoff med overflate plasmonresonans ved anvendelse av BIACORE™ 3000 instrument ble utført som følger ved anvendelse av leverandørens protokoller. ;;For å utføre kinetiske analyser ble rekombinant humant P-cadherin/Fc fusjonsprotein (hCad/Fc) og mus P-cadherin/Fc fusjonsprotein (mCad/Fc) immobilisert på separate flowceller på en CM5 BIACORE™ sensorchip ved anvendelse av rutinemessig aminkobling. Overflatene ble preparert ved anvendelse av 10 mM acetatbuffer, pH 4,5 med 2,0 mM CaCl2 som immobiliseringsbuffer og proteintettheter på 5800 og 1600 RU ble oppnådd for hCad/Fc og mCad/Fc fusjonsproteiner, respektivt. ;Deaktivering av ikke-reagert N-hydroksysuccinimid estere ble utført ved anvendelse av 1 M etanolaminhydroklorid, pH 8,5. En aktivert/deaktivert blank overflate ble anvendt som en kontrolloverflate. ScFv antistoffprøver i kjørebuffer ble framstilt ved konsentrasjoner i områder fra 200 til 0,78 nM (en 0 nM løsning omfattende kjørebuffer alene ble inkludert som en 0-referanse). Prøvene ble randomisert og injisert i triplikat i 1 minutt hver over flowcellene ved anvendelse av HBS-P (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,005% Surfactant P20) med 2,0 mM CaCl2 som kjørebuffer. En strømningsrate på 25 µl/min. ble anvendt for å bestemme affinitetskonstanter. Dissosiering av antistoff ble monitorert i 5 minutter, overflaten ble regenerert med en 12 sekunders injeksjon av 10 mM glycin-HCl pH 1,5 (25 µl/min.). Rådata ble prosessert ved anvendelse av Scrubber (©BioLogic Software) programvarepakke, og analysert ved anvendelse av CLAMP (©BioLogic Software) programvarepakke. Dataene ble tilpasset globalt til en enkelt 1:1 Langmuir bindingsmodell. ;;Tabell 8 angir affinitetskonstanter for enkeltkjede anti-P-cadherin antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. ;;Tabell 8 ;;; ;;; Eksempel 7: Bestemmelse av selektivitet for P-cadherin antistoff ;;Den følgende protokoll ble anvendt for å bestemme selektiviteten av forskjellige antistoff til P-cadherin over E-cadherin. ;;Rekombinant humant P-cadherin (R&D Systems 861-PC-100) og rekombinant humant E-cadherin (R&D Systems 648-EC-100) ble belagt på brønner av Exiqon proteinimmobilisererplater (WR International) ved 1 µg/ml i PBS 0,5 mM CaCl2. Prøve IgG’er ble blokkert i 3% Marvel/PBS 0,5 mM CaCl2 i 1 time før titrering fra 50 nM (7,5 µg/ml) ned til 0,64 nM (0,096 µg/ml) og tilsatt i duplikat til brønner belagt med de to forskjellige antigener. Etter ekvilibrering natten over ved 4<0>C ble platene vasket tre ganger med 1 x PBS / 0,1% Tween 0,5 mM CaCl2, og deretter tre ganger med 1 x PBS 0,5 mM CaCl2.50 µl antihuman Fab peroksidase konjugat fortynnet 1:5000 i 3% Marvel / PBS 0,5 mM CaCl2 ble deretter tilsatt til hver brønn og satt til ekvilibrering ved romtemperatur i 1 timer. Platene ble vasket tre ganger med 1 x PBS / 0,1% Tween 0,5 mM CaCl2 og tre ganger med 1 x PBS 0,5mM CaCl2. 50µl 3,3’, 5, 5’-tetrametylbenzidin (TMB; Sigma) ble tilsatt til hver brønn, og reaksjonene fikk utvikle seg i 20 minutter før de ble stoppet med tilsetting av 25 µl/brønn 0,5M H2SO4. Etter avlesing av absorbansverdier ved 450 nm, ble data analysert ved anvendelse av Graphpad Prism programvare for å beregne relative KD verdier for hvert antistoff for binding til P-cadherin og E-cadherin. De resulterende data er summert i tabell 9. ;;Tabell 9 ;; ;;; Eksempel 8: Epitop kompetitiv analyse ;;Den følgende protokoll ble anvendt for å måle IC50 verdier i et epitop kompetitiv analyse for å måle evne av en variant scFv’er i en parental linje for å erstatte mor IgG fra nativ P-cadherin på overflaten av A431 celler. Mengden av bundet biotinylert mor IgG i nærvær av inhibitorisk scFv detekteres med europium streptavidin og DELFIA kvantifisering. De målte IC50 verdier for flere scFv’er er vist i tabell 10. ;;A431 celler (ECACC No.85090402), dyrket i samsvar med standard metoder, deretter høstet ved tilnærmet 80% konfluens, ble utsådd med 2,5 x 10<4>celler per brønn i 96 brønns Beckton Dickenson (BD Cat.6407) kollagenbelagte plater dagen før anvendelse. Platene ble deretter igjen vasket tre ganger med neddykking i en PBS buffer (Gibco Cat.14190-094, uten kalsium, magnesium og natriumbikarbonat) reservoar før tilsetting av 200 µl per brønn av blokkeringsbuffer (PBS Gibco Cat. 14190-094, pluss 3% Marvel (Premier International Foods Ltd.)) og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Platene ble deretter vasket 3 ganger med PBS som over. ;;For både høygjennomstrømingsscreening og IC50 profilering ble scFv / IgG materialer først framstilt i Greiner fortynningsplater (Greiner 96 brønns polypropylenplater (Greiner Cat.780271)) i et totalt volum av 60 µl analysebuffer.50 µl ble deretter overført fra slave Greiner plate direkte på analyseplate, og bindingsreaksjonen fikk fortsette i 2 timer og 30 minutter ved romtemperatur. Ved slutten av bindingsreaksjonen ble platene vasket 3 ganger i PBS før tilsetting av europiummerket streptavidin (Perkin Elmer Cat.1244-3601:1000 fortynning i DELFIA analysebuffer (Perkin Elmer Cat.4002-0010)) og inkubert i ytterligere 1 time ved romtemperatur. ;;Platene ble deretter vasket 7 ganger med DELFIA vaskebuffer (Perkin Elmer Cat. 4010-0010) med repeterende neddykking av platene i et bufferreservoar. Til slutt, etter tilsetting av DELFIA forsterker (Perkin Elmer Cat.4001-0010 – 100 µL/brønn) ble platene avlest ved anvendelse av en standard DELFIA protokoll på en kompatibel leser (for eksempel Wallac eller Envision). ;;Greiner fortynningsplateoppsett – HTS ;Høy gjennomstrømmingsscreening (HTS) betingelser ble konfigurert direkte avhengig av trinnet i optimaliseringen. For HTS av utganger fra individuelle VH og VL kjedeoptimalisering ble final [peri-prep] fiksert ved 12,5% slik at mor scFv ga partiell inhibering. For de senere HTS fra utganger fra VH:VL rekombinasjonsbibliotek ble final peri-prep konsentrasjon redusert til 1,7%, og under disse betingelser ga VH optimalisert benchmark scFv (TOP-108-C01) partiell inhibering. Optimaliseringen av peri-prep konsentrasjon slik at den relevante benchmark scFv ga partiell inhibering ga et vindu hvori man kunne identifisere forbedrete kloner. ;For å oppnå disse finale scFv peri-prep konsentrasjoner ble følgende prosedyre tilpasset: ;;i. Anvende et Cybiwell instrument, det nødvendige volum (se nedenfor) av peri-prep prøvemateriale ble overført fra en dypbrønns prøveplate til en Greiner fortynningsplate i kolonnene 1-11. ;;[Final peri-prep] Overføringsvolum ;[12,5%] = 7,5 µl ;[ 1,7%] = 10,0 µl (av 1:10 fortynnet peri-prep) ;;(1:10 prefortynnet peri-prep ble framstilt ved å overføre 10 µl av ublandet peri-prep fra prøveplaten til en Greiner fortynningsplate 90 µl analysebuffer (ved anvendelse av Cybiwell)). ;;ii. Volumet i kolonnene 1-11 ble deretter justert opp til 30 µl ved tilsetting av et egnet volum av analysebuffer ;;iii. 30 µl analysebuffer ble deretter tilsatt kolonne 12 (A-D) (totale bindingsbrønner). ;;iv. 30 µl av overskudd umerket mor IgG (129-1c4) i analysebuffer ble tilsatt til kolonne 12 (E-H) for å definere ikke-spesifikk binding. Dette ble tilsatt ved 1000 nM konsentrasjon for å gi 500 nM finalt. ;;v. 129-1c4 IgG ble biotynilert ved anvendelse av det vannuløselige reagens EZ-link-NHS-LC- Biotin (Perbio/Pierce product no.21336). IgG-løsningen ble tilsatt et 1/10<del>volum av 1 M NaHCO3 og 1/10<del>volum av dimetylformamid. EZ-link-NHS-LC-Biotin reagenser ble oppløst DMF og deretter tilsatt til en fem-gangers molart overskudd over IgG, og reaksjonen ble tillatt å foregå ved romtemperatur i 20 minutter. Det biotinylerte IgG ble deretter stabilisert ved tilsetting av BSA (0,1%).30 µl biotinylert mor 129-1c4 IgG i analysebuffer ble deretter tilsatt til alle brønner for å gi en final konsentrasjon på 1,5 nM i det finale 60 µl volum (det vil si europium merket IgG tilsatt ved 2x final konsentrasjon). ;vi. Etter blanding av Greinerplateinnholdene med agitering ble 50 µl direkte overført til analyseplater, og bindingsreaksjon fikk foregår i 2 timer og 30 min. ved romtemperatur (som beskrevet tidligere). ;;Greiner fortynningsplateoppsett – IC50profilering. ;;I. 30 µl/brønn av analysebuffer ble tilsatt til kolonner 2-11 og brønner 12A til 12D i standard Greiner fortynningsplater. ;;II. 30 µl overskudd av umerket129-1c4 mor IgG i analysebuffer ble tilsatt til kolonne 12 (E-H) for å definere ikke-spesifikk binding. Dette skal tilsettes ved 1000 nM konsentrasjon for å gi 500 nM final konsentrasjon. ;;III. Til kolonne 1 ble 2 x 45 µl av hver ufortynnet scFv His-prep tilsatt slik at 4 duplikater 11-punkt IC50-titretinger kunne settes opp per 96 brønns analyseplater. 1:3 duplikatet serielle fortynninger ble deretter utført ved å ta 15 µl fra kolonne 1 og blande inn i kolonne 2 etterfulgt av å ta 15 µl fra kolonne 2 og blande inn i kolonne 3, etc. Etter blanding inn i kolonne 11, ble 15 µl fjernet (det vil si for å gi et totalt finalt volum på 30 µl). ;;IV. 30 µl biotinylert 129-1c4 mor IgG i analysebuffer ble deretter tilsatt til alle brønner for å gi en final konsentrasjon på 1,5 nM i det finale 60 µl volum (det vil si europium merket IgG tilsatt ved 2x final konsentrasjon). ;;V. Etter blanding av Greinerplateinnholdene ved agitering ble 50 µl deretter direkte overført til analyseplaten, og bindingsreaksjonen fikk foregå i 2 timer og 30 minutter ved romtemperatur som tidligere beskrevet. ;;For HTS, ble scFv uttrykt i 96 brønnsformat som ubehandlet ekstrakt fra bakteriell periplasma (scFv peri-prep) i en basebuffer inneholdende MOPS / EDTA /Sorbitol pH 7,4 (MES pH 7,4). For IC50-profilering ble scFv uttrykt i en lavere gjennomstrømningsrensing ved anvendelse av scFv His-tag for affinitetsrensing (scFv His-prep) i en basebuffer av PBS. ;For både HTS og IC50 analyser ble rådata først omdannet til % bindingsrate i samsvar med følgende likning: ;;% binding = {(verdi-ikke-spesifikk binding) / (total binding-ikke-spesifikk binding)}*100

HTS-data ble deretter ytterligere analysert ved anvendelse av Excel templater for å identifisere hits som gir større inhibering (lavere % binding) enn relevante benchmark scFv. For IC50 analyser ble % prosent bindingsdata analysert ved anvendelse av Prism versjon 4.0 kurvetilpassingsprogramvare. scFv’er er varianter av 129-1c4 mor IgG, hvor VH og VL CDR3-regioner vilkårlig ble mutert, som beskrevet i eksempel 2. VH CDR3 varianssekvenser er vist i figur 1 som SEQ ID NO: 91 til 256. VL CDR3 varianssekvenser er vist i figur 1 som SEQ ID NO: 257 til 319. IC50-verdiene for flere scFv’er som viste forbedret binding over mor 129-1c4 IgG er vist i tabell 10. Hver av scFv-variantene av 129-1c4 mor er indentifisert med to SEQ ID NOer: En VH CDR3 og en VL CDR3. For referanse, IC50 for mor 129-1c4 IgG var 108,3 nM.

Tabell 10

Alle publikasjoner, patenter og patentsøknader angitt i denne spesifikasjon inkorporeres heri med referanse som om hver individuelle publikasjon eller patentsøknad spesifikt og individuelt var indikert til å være inkorporert med referanse. Selv om foregående oppfinnelse har blitt beskrevet i detalj med illustrering og eksempler for formål å klargjøre forståelsen, er det åpenbart at fagkyndige innen feltet, i lys av beskrivelsen av oppfinnelsen, kan utføre forandringer og modifiseringer uten å avvike fra oppfinnelsens ramme og idé som gitt i de medfølgende patentkrav.

Claims

Patentkrav

1. Et isolert antistoff eller antigenbindene porsjon derav som binder til human P-cadherin, karakterisert ved at nevnte antistoff eller antigenbindene porsjon derav omfatter:

a) en VH CDR1 som angitt i SEQ ID NO: 24;

b) en VH CDR2 som angitt i SEQ ID NO: 25;

c) en VH CDR3 som angitt i SEQ ID NO: 27;

d) en VL CDR1 som angitt I SEQ ID NO: 38;

e) en VL CDR2 som angitt i SEQ ID NO: 39; og

f) en VL CDR3 som angitt i enhver av SEQ ID NO: 41.

2. Antistoff eller antigenbindene porsjon derav i samsvar med krav 1, karakterisert ved at det omfatter et VH domene som angitt i SEQ ID NO: 320.

3. Antistoff eller antigenbindene porsjon derav i samsvar med krav 1, karakterisert ved det omfatter et VL domene som angitt i SEQ ID NO: 326.

4. Antistoff eller antigenbindene porsjon derav i samsvar med krav 1, karakterisert ved det omfatter et VH domene som angitt i SEQ ID NO: 320 og et VL domene som angitt i SEQ ID NO: 326.

5. Antistoff eller antigenbindene porsjon derav i samsvar med krav 4, karakterisert ved tungkjede konstant region omfatter SEQ ID NO: 344, og hvor lettkjede konstant region omfatter SEQ ID NO: 345; med den forutsetning at den C-terminale lysinenhet i SEQ ID NO: 344 valgfritt er spaltet.

6. Antistoff eller antigenbindene porsjon derav i samsvar med krav 1, karakterisert ved antistoffet er g-194-b09.

7. En farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter antistoffet eller antigenbindende porsjon derav ifølge krav 1 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

8. En farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter antistoffet eller antigenbindende porsjon derav ifølge krav 6 og en farmasøytisk akseptabel bærer.