NO20200044A1 - Setedirigert modifikasjon av FVIII - Google Patents

Description

Kryssreferanse til relatert anvendelse

Søknaden krever fordel av førsterett til US patentsøknads serienr.60/627,277 innlevert 12. november 2004, og som herved er inkorporert heri ved referanse i dets helhet.

Oppfinnelsens målområde

Oppfinnelsen relaterer til Faktor VIII (FVIII) muteiner som tillater kobling ved et definert sete, til en eller flere biokompatible polymerer slik som polyetylenglykol. I tillegg er relaterte formuleringer, doseringer og fremgangsmåter for administrasjon derav for terapeutiske formål gitt. Disse modifiserte FVIII-varianter, og assosierte sammensetninger og fremgangsmåter er nyttige for å gi en behandlingsmulighet med redusert injeksjonsfrekvens og redusert immunogenisk respons for individer som er plaget med hemofilia A.

Oppfinnelsens bakgrunn

Hemofilia A er den mest vanlige arvelige koagulasjonsforstyrrelsen med en estimert innsidens på 1 per 5000 mem. Det er forårsaket av mangel eller strukturelle defekter i FVIII, en kritisk komponent av den indre blodkoagulasjonsveien. Den nåværende behandling for hemofilia A involverer intravenøs injeksjon av humant FVIII. Humant FVIII har blitt produsert rekombinant som et enkeltkjedemolekyl på ca 300 kD. Det består av de strukturelle domenene A1-A2-B-A3-C1-C2 (Thompson, 2003, Semin, Hematol.29, s.11-22). Forløperproduktet er prosessert over i to polypeptidkjeder på 200 kD (tung) og 80 kD (lett) i Golgi-apparatet, der de to kjedene er holdt sammen av metallioner (Kaufman et al., 1988, J. Biol. Chem., 263, s.6352; Andersson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83, s. 2979).

B-domenet av FVIII ser ut til å være uunnværlig siden B-domenedeletert VFIII (BDD, 90 kD A1-A2 tung kjede pluss 80 kD lettkjede) også har vist seg å være effektiv som en erstatningsterapi for hemofilia A. Den B-domenedeleterte FVIII-sekvensen inneholder en delesjon av alle bortsett fra 14 aminosyrer av B-domenet.

Hemofilia A-pasienter er for øyeblikket behandlet ved intravenøs administrasjon av FVIII på forlangende eller som en profilaktisk terapi administrert flere ganger per uke. For profilaktisk behandling er 15-25 IU/kg kroppsvekt gitt av faktor VIII tre ganger per uke. Det er konstant påkrevet i pasienten. På grunn av dets korte halveringstid i mennesket må FVIII ofte bli administrert. Til tross for dets store størrelse på større enn 300 kD for fullengdeproteinet, har FVIII en halveringstid i mennesker på kun ca 11 timer. (Ewenstein et al., 2004, Semin, Hematol. 41, s. 1-16). Behovet for ofte intravenøs injeksjon skaper voldsomme barrierer til pasientsamtykket. Det vil være mer bekvemt for pasientene hvis et FVIII-produkt kunne bli utviklet som har en lengre halveringstid og derfor krever mindre frekvent administrasjon. Videre kunne behandlingskostnaden bli redusert hvis halveringstiden ble økt fordi mindre doseringer da vil være påkrevd.

En ekstra ulempe til den nåværende terapien er at ca 25-30% av pasientene utvikler antistoff som inhiberer FVIII-aktivitet (Saenko et al., 2002, Haemophilia 8, s. 1-11). Hovedepitopene på inhibitoriske antistoff er lokalisert innen A2-domene ved residuene 484-508, A3-domene ved residuene 1811-1818 og C2-domene. Antistoffutvikling forhindrer bruken av FVIII som en erstatningsterapi, noe som tvinger denne pasientgruppen å søke en enda dyrere behandling med høydoserekombinant Faktor VIIa og immuntoleranseterapi.

De følgende studier identifiserte FVIII-epitoper av inhibitoriske antistoffer. I en studie på 25 inhibitoriske plasmaprøver ble 11 funnet å binde til det trombingenererte 73 kD lette kjedefragmentet A3C1C2, 4 ble vist å binde til A2-domene, og 10 ble funnet å binde til begge (Fulcher, C. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 2(22), s.7728-32). I en annen studie ble seks av åtte A2-domeneinhibitorer fra pasienter nøytralisert ved et rekombinant A2-polypeptid (Scandella, D. et al., 1993, Blood 82(6), s.1767-75). Epitopene for seks av ni inhibitorer fra pasienter ble kartlagt til A2-residuene 379-538 (Scandella, D. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci.85(16), s.6152-6). En epotop for 18 tung-kjedeinhibitorer ble lokalisert til den samme N-terminale 18.3 kD-området av A2-domene (Scandella, D. et al., 1989, Blood 75(5), s.1618-26).

Et aktivt, rekombinant hybrid human/gris FVIII-molekyl, generert ved å erstatte residuene 387-604 av det humane A2-domene med den homologe grisesekvensen, var resistent for en pasient A2-inhibitor (Lubin, I. et al., 1994, J. Biol. Chem.269(12), s.

8639-41) og resistent til et murint monoklonalt antistoff mAB 413 IgG som kokurrerer med pasient A2-inhibitorer for binding til A2 (Scandella, D. et al., 1992, Thromb Haemost. 67(6), s.665-71). Dette A2-domeneepitopet ble videre lokalisert til A2-domeneresiduene 484-508 når eksperimentene viste at mAB 413 IgG og fire pasientinhibitorer ikke inhiberte et hybrid human/gris FVIII der A2-domeneresiduene 484-508 var erstattet med det til gris (Healey, J. et al., 1995, J. Biol.Chem.270(24), s.

14505-9). Hybridet VFIII ble også mer resistent til minst halvparten av de 23 pasientplasmaene screenet (Barrow, R. et al., 2000, Blood 95(2), s.564-8). Alanin scanningmutagenese identifiserte residue 487 til å være kritisk for binding til alle fem pasientinhibitorene testet, mens residuene 484, 487, 489 og 492 var alle viktige for interaksjonen med mAB 413 IgG (Lubin, I., J. Biol. Chem.272(48), s.30191-5).

Inhibitorisk antistofftiter i mus som mottar R484A/R489A/P492A mutant, men ikke R484A/R489A-mutant, var signifikant lavere enn i mus som mottar kontrollhuman BDD FVIII (Parker, E. et al., 2004, Blood 104(3), s.704-10). Området 484-508 av A2-domene ser ut til å være et bindingssete for inhibitorer av FVIII-aktivitet.

I tillegg til utviklingen av en immunrespons til FVIII er et annet problem ved konvensjonell terapi at det krever frekvente doseringer på grunn av den korte halveringstiden av FVIII in vivo. Mekanismene for utskillelse av FVIII fra sirkuleringen har blitt studert.

FVIII-utskillelse fra sirkuleringen har blitt delvis tilskrevet til spesifikk binding til lavtetthetslipoprotein reseptorrelatert protein (LRP), en hepatisk utskillelsereseptor med bred ligandspesifisitet (Oldenburt et al., 2004, Haemophilia 10 Suppl.4, s.133-139). Nylig var lavtetthetslipoprotein (LDL) reseptoren også vist å spille en rolle i FVIII-utskillelse, slik som ved å samarbeide med LRP i å regulere plasmanivåer av FVIII (Bovenschen et al., 2005, Blood 106, s.906-910). Begge interaksjoner er fremmet ved binding til celleoverflate heparinsulfatproteoglykaner (HSPG’er). Plasma halveringstid i mus kan bli forlenget 3.3 ganger når LRP er blokkert eller 5.5 ganger når både LRP og celleoverflate HSPG’er er blokkert (Sarafanov et al., 2001, J. Biol. Chem.276, s.

11970-11979). HSPG’er er antatt å konsentrere FVIII på celleoverflaten og presentere den for LRP. LRP-bindingsseter på FVIII har blitt lokalisert til A2-residuene 484-509 (Saenko et al., 1999, J. Biol. Chem.274, s. 37685-37692), A3-residuene 1811-1818 (Bovenschen et al., 2003, J. Biol. Chem. 278, s. 9370-9377) og et epitop i C2-domene (Lenting et al.,1999, J. Biol. Chem.274, s.23734-23739).

FVIII er også utskilt fra sirkuleringen ved hjelp av proteaser. For å forstå denne effekten må man forstå mekanismen hver FVIII er involvert i blodkoagulering. FVIII sirkulerer som en heterodimer av tunge og lette kjeder, bundet til vWF. VWF-binding involverer FVIII-residuene 1649-1689 (Foster et al., 1988, J. Biol. Chem.263, s.5230-5234) og deler av C1 (Jacquemin et al., 2000, Blood 96, s. 958-965) og C2-domener (Spiegel, P. et al., 2004, J. Biol. Chem.279(51), s. 53691-8). FVIII er aktivert ved trombin, som kløyver peptidbindinger etter residuene 372, 740 og 1689 for å danne en heterotrimer av A1, A2 og A3-C1-C2-domener (Pittman et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci.276, s. 12434-12439). Ved aktivering dissosierer FVIII fra vWF og er konsentrert til celleoverflaten av blodplater ved å binde til fosfolipider. Fosfolipidbinding involverer FVIII-residuene 2199, 2200, 2251 og 2252 (Gilbert et al., 2002, J. Biol. Chem.277, s.

6374-6381). Der binder det til FIX gjennom interaksjoner med FVIII-residuene 558-565 (Fay et al., 1994, J. Biol. Chem.269, s.20522-20527) og 1811-1818 (Lenting et al., 1996, J. Biol. Chem.271, s.1935-1940) og FX gjennom interaksjoner med FVIII-residuer 349-372 (Nogami et al., 2004, J. Biol. Chem.279, s. 15763-15771) og fungerer som en kofaktor for FIX-aktivering av FX, en essensiell komponent i den indre koaguleringsveien. Aktivert FVIII (FVIIIa) er delvis inaktivert ved proteaseaktivert protein C (APC) gjennom kløyving etter FVIII-residuene 336 og 562 (Regan et al., 1996, J. Biol. Chem.271, s.3982-3987). Den predominerende inaktiveringsfaktoren er imdlertid dissosieringen av A2-domene fra A2 og A3-C1-C2 (Fay et al., 1991, J. Biol. Chem.266, s. 8957-8962).

En fremgangsmåte som har vist å øke in vivo halveringstiden til et progein er PEGylering. PEGylering er den kovalente festingen av langkjedede polyetylenglykol (PEG) molekyler til et protein eller andre molekyler. PEG kan være i en lineær form eller i en grenet form for å produsere ulike molekyler med ulike egenskaper.Ved siden av å øke halveringstiden til peptider eller proteiner har PEGylering blitt benyttet for å redusere antistoffutvikling, beskytte prteinet fra proteasefordøying og holde materialet vekk fra nyrefiltratet (Harris et al., 2001, Clinical Pharmakokinetisk 40, s.539-51). I tillegg kan PEGylering også øke den samlede stabiliteten og løseligheten av proteinet. Endelig kan den opprettholdte plasmakonsentrasjonen av PEGylerte proteiner redusere omfanget av ugunstige bieffekter ved å redusere gjennom til maksimalverdier av et medikament, og på denne måten eliminere behovet for å introdusere superfysiologiske nivåer av protein ved tidlige tidspunkt.

Tilfeldig modifikasjon av FVIII ved å targette primær aminer (N-terminale og lysiner) med store polymerer slik som PEG og dekstran har vært forsøkt med varierende grad av suksess (WO94/15625, US patent 4970300, US patent 6048720). Den mest dramatiske forbedringen, publisert i en patentsøknad (WO94/15625), viser en 4-gangers forbedring i halveringstid, men ved en kostnad på to gangers aktivitetstap etter at men har latt fullengde FVIII reagere med 50 ganger molart overskudd av PEG. WP2004/075923 omtaler konjugater av FVIII og polyetylenglykol som er dannet gjennom tilfeldig modifikasjon. Tilfeldig PEGylerte proteiner, slik som interferon-� (Koziowski et al., 2001, BioDrugs 15, s.419-429) har blitt godkjent som terapi i det siste.

Denne tilfeldige tilnærmingen imidlertid har mye mer problematisk for heterodimer FVIII. FVIII har hundrevis av potensielle PEGyleringsseter, inkludert 158 lysiner, de to N-terminale og mange histidiner, seriner, treoniner og tyrosiner, der alle potensielt kan bli PEGylert med reagenser som primært targeter primære aminer. For eksempel var hovedposisjonsisomeren for PEGylert interferon�-2b vist å være en histidin (Wang et al., 2000, Biochemistry 39, s.10634-10640). Videre kan heterogen prosessering av fullengde FVIII føre til en blanding av startmaterialet som fører til videre kompleksitet i de PEGylerte produktene. En ekstra ulempe med å ikke kunne kontrollere sete for PEGylering på FVIII er en potensiell aktivitetsreduksjon hvis PEG skulle festes ved eller nær kritisk aktive seter, spesielt hvis mer enn en PEG eller en enkel stor PEG er konjugert til FVIII. Fordi tilfeldig PEGylering stadig vil produsere store mengder av multipliserte PEGylerte produkter, vil rensing for å oppnå kun mono-PEGylerte produkter drastisk senke samlet utbytte. Endelig vil den enorme heterogeniteten i produktprofilen lage konsekvent syntese og karakterisering av hver mengde nærmest umulig. Siden god fremstilling krever et konsistent velkarakterisert produkt, er produktheterogenitet en barriere for kommersialisering. På grunn av alle disse årsakene er en mer spesifikk fremgangsmåte for PEGylering av FVIII ønskelig.

Ulike setedirigerte protein PEGyleringsstrategier har blitt oppsummert i en nylig review (Kochendoerfer, G., Curr. Opin. Chem. Biol.2005, tilgjengelig online som av 15. oktober 2005 direkte objektidentifiserer doi:10.1016/j.cbpa.2005.10.007). En tilnærming involverer inkorporering av en unaturlig aminosyre inn i proteiner ved kjemisk syntese eller rekombinant ekspresjon etterfulgt av en tilsetning av et PEGderivat som vil reagere spesifikt med den unaturlige aminosyren. For eksempel kan den unaturlige aminosyren være en som inneholder en ketogruppe som ikke er funnet i native proteiner. Imidlertid er kjemisk syntese av proteiner ikke gjennomførbart for et protein så stort som FVIII. Nåværende begrensning på peptidsyntese er ca 50 residuer. Flere peptider kan bli ligert for å danne en større bit av polypeptid, men selv for å produsere B-domene deletert FVIII ville man kreve mer enn 20 ligeringer, som vil resultere i mindre enn 1% gjenvinning til under ideell reaksjonsbetingelse. Rekombinant ekspresjon av proteiner med unaturlige aminosyrer har hittil hovedsakelig vært begrenset til ikke-mammalske ekspresjonssystem. Denne tilnærmingen er ment å være problematisk for et stort og komplekst protein slik som FVIII som trengs å uttrykkes i mammalske systemer.

En annen tilnærming til setespesifikk PEGylering av proteiner er ved å targete N-terminal ryggradamin med PEG-aldehyder. Den lave pH påkrevd under denne prosessen for å oppnå spesifisitet over andre amingrupper er imidlertid ikke kompatibel med den smale nær-nøytrale pH-rekkevidden nødvendig for stabiliteten av FVIII (Wang et al., 2003, International J. Pharmaceutics 259, s.1-15). Videre kan N-terminal PEGylering av FVIII ikke føre til forbedret plasmahalveringstid hvis dette området ikke er involvert i plasmautskillelse. Faktisk har det N-terminale området av FVIII-lette kjeden vært involvert i bindingen til von Willebrand faktor (vWF), et bærerprotein som er kritisk for FVIII-overlevelse i sirkulering. Ved N-terminal modifikasjon av faktor VIII, kan den kritisk viktige assosiasjonen med vWF bli ødelagt eller svekket. Derfor kan N-terminal PEGylernig av FVIII ha den motsatte effekt av å redusere plasmahalveringstid av FVIII.

WO90/12874 redegjør for setespesifikk modifikasjon av human IL-3, granulocytt kolonistimulerende faktorer og erytropoetin polypeptider ved å sette inn eller erstatte en cystein med en annen aminosyre, så tilsette en ligand som har en sulfydryl reaktiv gruppe. Liganden kobler selektivt til cysteinresiduer. Modifikasjon av FVIII eller hvilke som helst variant derav er ikke redegjort for.

På grunn av årsakene redegjort for over eksisterer det et behov for en forbedret FVIII-variant som innehar større funksjonsvarighet in vitro og redusert immunogenisitet, mens det beholder funksjonell aktivitet. Videre er det ønskelig at slikt et protein kan produseres som et homogent produkt på en konsistent måte.

Sammendrag av oppfinnelsen

Hensikten til foreliggende oppfinnelse er å gi et biokompatibelt polymerkonjugert funksjonelt FVIII-polypeptid som har forbedrede farmakokinetikkarakteristika og terapeutiske karakteristika.

En annen hensikt til foreliggende oppfinnelse er å gi et biokompatibelt polymerkonjugert B-domenedeletert FVIII-protein som har forbedrede farmakokinetikkegenskaper.

Enda en annen hensikt med oppfinnelsen er å gi et biokompatibelt polymerkonjugert funksjonelt FVIII-polypeptid som har redusert binding til lavtetthetslipoprotein reseptorrelatert protein (LRP), lavtetthet lipoprotein (LDL) reseptor, heparan sulfat proteoglykaner (HSPG’er) og/eller inhibitoriske antistoff mot FVIII.

Enda en annen hensikt til foreliggende oppfinnelse er å gi en forbedret FVIII-variant som innehar større funksjonsvarighet in vivo og redusert immunogenisitet, og som er mulig å bli produsert som et homogent produkt på en konsistent måte.

I et aspekt av oppfinnelsen er det gitt et konjugat som har faktor VIII-prokoagulantaktivitet som består av et funksjonelt faktor VIII polypeptid kovalent festet til en eller flere predefinerte seter på polypeptidet til en eller flere biokompatible polymerer, hvori det predefinerte setet ikke er et N-terminalt amin. Oppfinnelsen inkluderer også en fremgangsmåte for fremstilling av dette konjugatet som består av å mutere en nukleotidsekvens som koder for det funksjonelle faktor VIII-polypeptider for å erstatte en kodende sekvens for en cysteinresidue ved et predefinert sete; uttrykke den muterte nukleotidsekvensen for å produsere et cysteinforsterket mutein; rense muteinet; la muteinet reagere med den biokompatible polymeren som har blitt aktivert for å reagere med polypeptider hovedsakelig kun ved de introduserte cysteinresiduene slik at konjugatet er dannet; og renser konjugatet. Oppfinnelsen er også rettet mot farmasøytiske sammensetninger som består av konjugatet og et farmasøytisk aksepterbart hjelpemiddel og fremgangsmåte for å behandle hemofilia ved å administrere terapeutiske effektive mengder av disse farmasøytiske sammensetninger til et pattedyr i behov derav.

Oppfinnelsen relaterer også til en fremgangsmåte for setedirigert PEGylering av en faktor VIII-mutein som består av (a) uttrykking av et setedirigert faktor VIII-mutein hvori muteinet har en cysteinerstatning for en aminosyreresidue på den eksponerte overflaten av faktor VIII-muteinet og at cysteinet er kappet; (b) kontakting av cysteinmuteinet med en reduktant under betingelser for å mykt redusere cysteinmuteinet og å frigjøre kappen; (c) fjerning av kappen og reduktanten fra cysterinmuteinet; og (d) ved minst ca 5 minutter etter fjerning av reduktanten, og behandle cysteinmuteinet med PEG som består av en sulfydrylkoblingsenhet under betingelser slik at PEGylert faktor VIII-mutein er produsert.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1. Vektorkart og mutagenesestrategier for PEG-muteiner.

Fig. 2. En UV-absorbansprofil ved 280 nm med hensyn til tid for PEG2-protein renses over en monoklonal FVIII-antistoffkromatografikolonne. Kromatografien ble utført ved å benytte et AKTA® Explorer 100 kromatografisystem fra Amersham Bioscience.

Fig. 3. Tretrinns setedirigert PEGyleringsfremgangsmåte. PEG representerer et cysteinreaktivt PEG slik som PEG-maleimid. Lukkede stolper representerer disulfiddannelse mens åpne stolper representerer reduserte cysteiner.

Fig. 4. Setedirigert PEGylering av PEG2.

Fig. 5. Setedirigert PEGylering av PEG6.

Fig. 6a. Setedirigert PEGylering av BDD, PEG2, 4, 5 og 6. Øvre panel ble farget med tung (H) kjedeantistoff mens nedre panel ble farget med lett (L) kjedeantistoff. ”U” er uprosessert materiale som inneholder både H&L.

Fig. 6b. PEGylering av PEG15 og PEG7 med PEG2 og PEG6 som kontroller.

Startrensede PEG-muteiner (”S”) er redusert med TCEP og PEGylert med en 12 kD (”12”) eller en 22 kD (”22”) PEG etter fjerning av reduktanten (”R”). Prøvene ble kjørt på en 6% trisglycin SDS PAGE og farget med et tungt kjede antistoff på venstre panel eller lett kjede antistoff på høyre panel. ”U” er uprosessert materiale som inneholder både stor HC & LC. PEGylerte bånd er merket med punkter.

Fig. 6c. PEGylering av PEG2+6 med PEG2 og PEG6 som kontroller. PEG2, PEG6 eller PEG2-+6 er redusert med TCEP og PEGylert med en 5 kD (”5”) eller en 43 kD (”43”) PEG etter fjerning av reduktanten (”R”). PEG2+6 ble også PEGylert med 12, 22 og 33 kD PEG’er. Prøver ble kjørt på 6& trisglycin SDS PAGE og farget med ”coomassie” for proteiner på venstre eller tungkjede (H) eller lettkjede (L) antistoff. ”U” er et uprosessert materiale inneholdende både H & L. PEGylerte bånd er merket med punkter.

Fig. 6d. PEGylering av villtype fullengde FVIII (KG-2) med PEG2 som en kontroll. Venstre gel ble farget med coomassie farget for proteiner og høyre gel med iodin for PEG. ”BDD U” er uprosessert BDD-materiale som inneholder både H & L. PEGylerte bånd er merket med punkter.

Fig. 7. Trombinkløyving av PEGylert PEG2. Den N-terminale halvdelen av A2-domene er farget i blått og den C-terminale halvdelen i grønt, med R8B12-antistoffepitoper merket i mørk grønn (høyre FVIII-modell). PEG2 (spor 1) og 22 kD PEGylert PEG2 (spor 2) ble behandlet med trombin (spor 3 og 4 henholdsvis) og så kjørt på en 7% trisacetatgel (Invitrogen) og farget med R8B12-antistoffet. Hvert spor inneholder ca 50 ng av FVIII.

Fig. 8. Trombinkløyving av PEGylert villtyp fullengde FVIII (KG-2). ”S” = start KG-2-materiale. ”R” = redusert KG-2 og reduktant fjernet. ”P” er lik ”R” PEGylert med 43 kD PEG. ”Ren” = ”P” renset vekk fra overskugg av PEG. ”L” = lettkjede. PEGylerte bånd er merket med punkter.

Fig. 9. Iodfarging av PEGylert PEG2. 22 eller 43 kD PEGylert PEG2 blir kjørt på en 6% TrisGlycingel og farget med R8B12 FVIII antistoff (spor 1 og 2) eller iod (spor 3 og 4). De to fargingene ble stilt opp ifølge deres molekylære vektmarkørspor. Sporene 1 og 2 inneholder hver ca 30 ng av FVIII mens sporene 3 og 4 inneholder ca 2 µg.

Fig. 10. MALDI massespektrometrianalyse av PEGylert og UPEGylert PEG2. MALDI massespektrometri ble utført på PEG2 (fig.10a) eller 22 kD PEGylert PEG2 (fig.10b). Ved PEGylering, er tung (H) kjedetoppen av PEG2 sterkt redusert og en ny topp (H+PEG), sentrert ved 111 kD( 22 kD PEG 89 kD tungkjede) dukker opp. Ikke noe PEGylert lett (L) kjedetopp, forventet å være sentrert ved 100 kD (22 kD PEG 83 kD lettkjede) er detektert.

Fig. 11. MALDI massespektrometri av PEGylert og uPEGylert Peg2 etter trombinkløyving.

Fig. 12. MALDI massespektrometrianalyse av PEGylert PEG6 før og etter trombinkløyving.

Fig. 13. UV-absorpsjonsprofil ved 280 nm av PEGylert PEG2 renset på størrelsesutestengningskolonne.

Fig. 14. UV-absorpsjonsprofil ved 280 nm av PEGylert og UPEGylert PEG6 renset på kationsutvekslingskolonne.

Fig. 15. UV-absorpsjonsprofil ved 280 nm av PEGylert og UPEGylert PEG6 renset på størrelsesutestengningskolonne.

Fig. 16. Aktivitet av PEGylert protein er sammenlignet med aktivitet av UPEGylert protein som målt ved et kromogenisk allay og et koagulasjonsassay. Renset fullengde FVIII er representert som KG-2. Prosentaktivitet rapportert ble bestemt ved å dele verdien av prøve behandlet med PEG etter reduksjon og reduktantfjerning med den til prøven behandlet med bufferkontroll og der det er tatt hensyn til PEGyleringsutbytte.

Fig. 17. Kanin PK-studie av PEGylert PEG2 sammenlignet med PEG2.

Fig. 18. Kanin PK-studie av PEGylert PEG2 sammenlignet med BDD og PEG2. P-verdier er sammenligninger mellom PEGylert PEG2 og BDD.

Fig. 19. Kanin PK-studie av PEGylert PEG6 sammenlignet med BDD og PEG6.

Fig. 20. Kanin PK-studie av PEGylert villtype fullengde (”fl”) FVIII sammenlignet med umodifisert fl FVIII.

Fig. 21. Hemofilisk mus PK-studie av PEGylert PEG6 sammenlignet med PEG6 og BDD.

Fig. 22. Normal mus PK-studie av 22 og 43 kD PEGylert PEG2 sammenlignet med BDD.

Fig. 23. Normal mus PK-studie av 22 kD PEGylert PEG2 sammenlignet med BDD, fulltidskurs.

Fig. 24. Hemofilisk mus (BDD) faktor VIII recoveri histogram som viser et farmkokentisk (PK) bedømmelse av halveringstiden av to arter av BDD faktor VIII i et hemofilisk museassay.

Fig. 25. Hemofilisk musenyre lacerationstudie av 22 kD PEGylert PEG2 sammenlignet med BDD. Vehikkelbehandlede mus har et blodtap på 25 µl/gram kroppsvekt.

Fig. 26. Kromogenisk aktivitet av PEGylert PEG2 og BDD i nærvær av økende mengder av FVIII-antistoff. Antistoffepitopet er angitt i parenteser.

Fig. 27. Kromogenisk aktivitet av PEGylert PEG2 i nærvær av økende mengder av FVIII mAB 413 antistoff.

Fig. 28. Kromogenisk aktivitet av BDD, 43 kD PEGylert PEG2, 33 kD PEGylert PEG6, og 33 kD diPEGylert PEG2+6 i nærvær av humant plasma derivert fra pasienter som har utviklet inhibitorer mot FVIII. Inhibitortiter og dato for blodsamling ble notert på toppen. De to øverste panelene inkluderer data samlet ved pasientplasmafortynninger på 5- til 405- ganger. Nedre venstre panel fokuserer på 1:15 ganger fortynning for pasient HRF-828 plasma. Nedre høyre panel bekrefter at 0.064 IU/ml benyttet for hver FVIII-prøve i de øvre to paneler ikke var en metningsdose.

Fig. 29. PEGylerings screeningsfremgangsmåte og validering. Øvre panel viser en skjematisk fremstilling av PEGyleringsscreening av transientuttrykkede PEGmuteiner. Nedre panel viser en Westernanalyse av PEGylerte produkter ved å benytte et tungkjede (”H”)-spesifikt antistoff (venstre) eller et lettkjede (”L”) spesifikt antistoff (høyre). PEGylerte bånd er merket med punkter. ”U” er uprosessert materiale som inneholder både H og L.

Fig. 30. PEGylert screening av PEG15-17. Westernanalyse av PEGylerte produkter ved å benytte et tungkjede (”H”)-spesifikke antistoff (R8B12 og 58.12) eller lettkjede (”L”) spesifikke antistoff (C7F7 og GM). Alle 3 muteiner er selektiv for tungkjeden, med relativt PEGyleringseffektivitet av PEG15 omtrent lik PEG16 større enn PEG17.

PEGylerte bånd er merket med punkter. ”U” er uprossesert materiale som inneholder både H og L.

Fig. 31. Gel som viser PEGylering av PEG2+14 som en funksjon av reduktantkonsentrasjon. PEG2+14 ble behandlet med 67 til 670 µM av TCEP i 30 minutter ved 4ºC. Reduktanten ble fjernet ved spinnkolonne etterfulgt av PEGylering med en 12 kD PEG. Tunge og lette kjeder av FVIII er merket med ”H” og ”L”, henholdsvis. De to punktene peker på de PEGylerte tunge og lette kjedene.

Fig. 32. Sammenfattet massespektra av PEG2+14 behandlet med 67 til 670 µM av TCEP etterfulgt av reduktantfjerning.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse er basert på oppdagelsen at polypeptider som har FVIII-aktivitet kan bli kovalent festet ved et predefinert sete til en biokompatibel polymer som ikke er ved et N-terminalt amin, og at slike polypeptider vesentlig holder på sin koagulasjonsaktivitet. Videre har disse polypeptidkonjugatene forbedret sirkulasjonstid og redusert antigenisitet. Konjugatene til oppfinnelsen er fordelaktig over de tidligere konjugatene innen fagfeltet som hadde tilfeldige polymerfester til FVIII eller fester ved en N-terminal ende. Setedirigert feste tillater at man designer modifikasjoner som unngår områder påkrevd for biologisk aktivitet, og på denne måten opprettholder vesentlig stor FVIII-aktivitet. Designing tillater også å feste polymerer for å blokkere binding av setet involvert i FVIII-utskillelse. Setedirigert feste tillater også et uniformt produkt i stedet for de heterogene konjugatene produsert innen fagfeltet ved tilfeldig polymerkobling. Ved å unngå feste ved et N-terminalt amin til den lette kjeden unngår konjugatene til foreliggende oppfinnelse det mulige tap av aktivitet fra å feste en ligand ved et aktivt sete til FVIII-polypeptidet. Det N-terminale området til den lette kjeden er antatt å være involvert i assosiasjonen av vWF-faktor til FVIII, som er en stabiliseringsassosiasjon i sirkuleringen.

Definisjoner

Biokompatible polymerer. En biokompatibel polymer inkluderer polyalkylenoksider slik som, uten begrensning, polyetylenglykol (PEG), dekstraner, kolominicsyrer eller andre karbohydratbaserte polymerer, polymerer av aminosyrer, biotinderivater, polyvinylalkohol (PVA), polykarboksylater, polyvinylpyrrolidon, polyetylen-komaleinsyreanhydrid, polystyren-ko-malinsyreanhydrid, polyoksazolin, polyakryloylmorfolin, heparin, albumin, celluloser, hydrosylater av chitosan, stivelser slik som hydroksyetylstivelser og hydroksypropylstivelser, glykogen, agaroser og derivater derav, guargummi, pullulan, inulin, xantangummi, carragenan, pektin, alginsyrehydrosylater, andre biopolymerer og hvilke som helst ekvivalenter derav. Foretrukket er polyetylenglykol, og enda mer foretrukket er metoksypolyetylenglykol (mPEG). Andre nyttige polyalkylenglykolsammensetninger er polypropylenglykoler (PPG), polybutylenglykoler (PBG), PEG-glycidyletere (Epox-PEG), PEG-oksykarbonylimidazol (CDI-PEG), grenede polyetylenglykoler, lineære polyetylenglykoler, forgrenede polyetylenglykoler og multiarmede eller ”supergrenede” polyetylenglykoler (sterjne-PEG).

Polyetylenglykol (PEG). ”PEG” og ”polyetylenglykol” som benyttet heri kan benyttes om hverandre og inkludere et hvilket som helst vannløselig polyetylenoksid. Typisk omfatter PEG’er for bruk ifølge oppfinnelsen den følgende struktur ”-- (OCH2CH2)n --” hvor (n) er 2 til 4000. Som benyttet heri inkluderer også PEG ” – CH2CH2-O(CH2CH2O)n -- CH2CH2 --” og ”-- (OCH2CH2)nO --”, avhengig av hvorvidt eller ikke endeoksygenet har blitt erstattet. Gjennom spesifikasjonen og kravene bør det huskes at betegnelsen ”PEG” inkluderer strukturer som har ulike ender eller ”endekappings”grupper slik som uten begrnsninger en hydroksyl eller en C1-20 alkoksygruppe. Betegnelsen ”PEG” betyr også en polymer som inneholder en hovedandel, det vil si, større enn 50%, av –OCH2CH2-repeterende subenheter. Med hensyn til spesifikke former kan PEG ta et hvilket som helst antall av et utvalg av molekylære vekter, likeså som strukturer eller geometrier slik som grenede, lineære, forgrenede og multifunksjonelle.

PEGylering. PEGylering er en prosess hvorved et polyetylenglykol (PEG) er kovalent festet til et molekyl slik som et protein.

Aktivert eller aktiv funksjonell gruppe. Når en funksjonell gruppe slik som en biokompatibel polymer er beskrevet som aktivert, reagerer den funksjonelle gruppen lett med en elektrofil eller en nukleofil på et annet molekyl.

B-domenedeletert FVIII (BDD). Som benyttet heri er BDD karakterisert ved å ha aminosyresekvensen som inneholder en delesjon av alle bortsett fra 14 aminosyrer av B-domene av FVIII. De første 4 aminosyrene av B-domenet (SFSQ, SEQ IDnr. 1) er linket til de 10 siste residuene på B-domenet (NPPVLKRHQR, SEQ IDnr.2) (Lind, P. et al., 1995, Eur. J. Biochem.232, s.19-27). BDD benyttet heri har aminosyresekvensen av SEQ IDnr.3.

FVIII. Blodkoaguleringsfaktor VIII (FVIII) er et glykoprotein syntetisert og frigjort inn i blodstrømmen av leveren. I det sirkulerende blodet er det bundet til von Willebrand faktor (vWF, også kjent som faktor VIII-relatert antigen) for å danne et stabilt kompleks. Ved aktivering av trombin, dissosierer fra komplekset for å interagere andre blodproppfaktorer i koaguleringskaskaden, som til slutt fører til dannelsen av en blodpropp. Human fullengde FVIII har aminosyresekvensen SEQ IDnr.4, selv om alleliske varianter er mulig.

Funksjonell faktor VIII-polypeptid. Som benytter heri betyr funksjonell faktor VIII polypeptid et funksjonelt polypeptid eller kombinasjon av polypeptider som er i stand til, in vivo eller in vitro, å korrigere human faktor VIII-defekter, karakterisert, for eksempel ved hemofilia A. Faktor VIII har multiple degragerte eller prosesserte former i den naturlige tilstand. Disse er proteolytisk derivert fra en forløper, enkjedeprotein, som demonstrert heri. En funksjonell faktor VIII-polypeptid inkluderer slike enkeltkjedeprotein og gir også for disse ulike degraderingsprodukt som har den biologiske aktiviteten til å korrigere human faktor VIII-defekter. Aneliske variasjoner eksisterer sansynligvis. De funksjonelle faktor VIII-polypeptidene inkluderer alle slike aneliske variasjoner, glycysylerte variasjoner, modifikasjoner og fragmenter som resulterer i derivater av faktor VIII så lenge som de inneholder det funksjonelle pigmentet av human faktor VIII og den essensielle, karakteristiske humane faktor VIII funksjonelle aktiviteten forblir upåvirket in natura. De derivater av faktor VIII som innehar den nødvendige funksjonelle aktivitet kan lett bli identifisert ved direkte in vitro-tester beskrevet heri. Videre er funksjonell faktor VIII polypeptid i stand til å katalysere omdannelsen av faktor X til Xa i nærvær av faktor IXa, kalsium, og fosforlipid, likeså som å korrigere koagulasjonsdefekt i plasma derivert fra hemofilia A påvirkede individer. Fra redegjørelsen av sekvensen til den humane faktor VIII aminosyresekvensen og de funksjonelle ormådene heri, vil fragmentene som kan bli derivert via restriksjonsenzymkutting av DNA eller proteolytisk eller andre degraderinger av human faktor VIII-protein være tidlig til de som er trent innen fagfeltet.

FIX. Som benyttet heri betyr FIX koaguleringsfaktor IX, som også er kjent som human blodproppsfaktor IX, eller plasmatromboplastinkomponent.

FX. Som benyttet heri betyr FX koaguleringsfaktor X, som også er kjent ved navnene human blodproppsfaktor X og ved eponyme Stuart-Prower-faktor.

Farmakokinetikk. ”Farmakokinetikk” (”PK”) er en betegnelse benyttet for å beskrive egenskapene til absorpsjon, distribusjon, metabolisme og eliminering av et medikament i en kropp. En forbedring til et medikaments farmakokinetikk betyr en forbedring i de karakteristika som gjør medikamentet mer effektivt in vivo som et terapeutisk virkemiddel, spesielt dets nyttige varighet i kroppen.

Mutein. Et mutein er et genetisk konstruert protein som oppstår som et resultat av en laboratorieindusert mutasjon til et protein eller polypeptid.

Protein. Som anvendt heri er protein og polypeptid synonyme.

FVIII-utskillelsesreseptor. En FVIII-utskillelsesreseptor som benyttet heri betyr et reseptorområde på et funksjonelt FVIII-polypeptid som binder eller assosierer med en eller flere andre molekyler til å resultere i FVIII-utskillelse fra sirkulasjonen. Faktor VIII utskillelsesreseptor inkluderer uten begrensning områdene av FVIII-molekyler som binder LRP, LDL-reseptor og/eller HSPG.

Diskusjon

Det er sett for seg at hvilket som helst funksjonelt faktor VIII-polypeptid kan bli mutert ved et prebestemt sete og så kovalent festet ved det setet til en biokompatibel polymer ifølge fremgangsmåtene til oppfinnelsen. Nyttige polypeptider inkluderer, uten begrensning, fullengdefaktor VIII som har aminosyresekvens som vist i SEQ IDnr.4 og BDD FVIII som har aminosyresekvensen som vist i SEQ IDnr.3. Foretrukket er BDD FVIII.

Den biokompatible polymeren benyttet i konjugatene til oppfinnelsen kan være av hvilken som helst av polymerene diskutert over. Den biokompatible polymeren er valgt ut for å gi den ønskede forbedring i farmakokinetikk. For eksempel er identiteten, størrelsen og strukturen til polymeren selektert slik at det skal forbedres den sirkulerende halveringstiden til polypeptidet som har FVIII-aktivitet eller minke antigenisiteten av polypeptidet uten en uakseptabel minking i aktiviteten. Fortrinnsvis omfatter polymeren PEG, og enda mer fortrinnsvis har det minst 50 vekt-% av sin molekylvekt som PEG. I en utførelsesform er polymeren en polyetylenglykol terminalt kappet med en endekappingsenhet slik som hydroksyl, alkoksy, substituert alkoksy, alkenoksy, substituert alkenoksy, alkynoksy, substituert alkynoksy, aryloksy og substituert aryloksy. Enda mer foretrukket har polymerer som består av metoksypolyetylenglykol. Enda mer foretrukket er polymerer som omfatter metoksypolyetylenglykol som har en størrelsesrekkevidde fra 3 kD til 100 kD, og enda mer fortrinnsvis fra 5 kD til 64 kD eller fra 5 kD til 43 kD.

Fortrinnsvis har polymeren en reaktiv enhet. For eksempel i en utførelsesform har polymeren en sulfidril reaktiv enhet som kan reagere med et fritt cystein på en funksjonell faktor VIII-polypeptid til å danne en kovalent kobling. Slike sulfidrylreaktive enheter inkluderer tiol, triflat, tresylat, asiridin, oksiran, S-pyridyl eller maleimidenheter. Foretrukket er en maleimidenhet. I en utførelsesform er polymeren lineær og har en ”cap” på en ende som ikke reagerer sterkt mot sulfidriler (slik som metoksy) og en sulfidryl reaktiv enhet på den andre enden. I en foretrukket utførelsesform omfatter konjugatet PEG-maleimid og har en størrelsesrekkevidde fra 5 kD til 64 kD.

Videre veiledning for å velge nyttige biokompatible polymerer er gitt i eksemplene som følger.

Setedirigert mutasjon av en nukleotidsekvens som koder for polypeptid som har FVIII-aktivitet kan skje ved en hvilken som helst fremgangsmåte kjent innen fagfeltet.

Foretrukne fremgangsmåter inkluderer mutagenese for å introdusere en cysteinkodon ved det valgte setet for kovalent feste av polymeren. Dette kan bli utført ved å benytte et kommersielt tilgjengelig setedirigert mutagenesekit slik som Strategene cQuickChange<TM>II setedirigert mutagenesekit, Clontech Transformer setedirigert mutagenesekit nr. K1600-1, Invitrogen GenTaylor setedirigert mutagenesesystem nr.

12397014, Promega Altered Sites II in vitro mutagensesystem kit nr. Q6210, eller Takara Mirus Bio LA PCR mutagenesekit nr. TAK RR016.

Konjugatene til oppfinnelsen kan bli fremstilt ved å først erstatte kodonet for en eller flere aminosyrer på overflaten av det funksjonelle FVIII-polypeptidet med et kodon for cystein, noe som produserer et cysteinmutein i et rekombinant ekspresjonssystem, la muteinet reagere med en cysteinspesifikk polymerreagens, og rense muteinet.

I dette systemet kan tilførselen av en polymer på cysteinsetet gjennomføres gjennom en maleimidaktiv funksjonalitet på polymeren. Eksempler på denne teknologien er gitt infra. Mengden av sulfidryl reaktiv polymer benyttet bør være minst ekvimolar til molare mengder av cysteiner som skal derivatiseres og fortrinnsvis er tilstede i overskudd. Fortrinnsvis er minst en 5 gangers molar overskudd av sulfidryl reaktiv polymer benyttet, og enda mer fortrinnsvis er minst et 10 gangers overskudd av slik polymer benyttet. Andre betingelser nyttig for kovalent feste er innen teknikkene til de som er trenet innen fagfeltet.

I eksemplene som følger er muteinene navngitt på en måte konvensjonelt innen fagfeltet. Konvensjonen for å navngi mutanter er basert på aminosyresekvensen for den modne, fullengdefaktor VIII som gitt i SEQ IDnr.4. Som et utskilt protein inneholder FVIII en signalsekvens som er proteolytisk kløyvet under transelasjonsprosessen. Etter at den 19 aminosyresignalsekvensen er fjernet, er den første aminosyren av det utskilte FVIII-produktet en alanin.

Som er konvensjonelt og benyttet heri, når man refererer til muterte aminosyrer i BDD FVIII, er den muterte aminosyren angitt ved dens posisjon i sekvensen av fullengde FVIII. For eksempel er PEG6 muteinet diskutert under angitt som K1808C fordi det forandrer lysin (K) ved posisjonen analog til 1808 i fullengdesekvensen til cystein (C).

Det predefinerte sete for kovalent festing av polymeren er best valgt ut fra seter eksponert på overflaten av polypeptidet som ikke er involvert i FVIII-aktivitet eller involvert i andre mekanismer som stabiliserer FVIII in vivo, slik som binding til vWF. Slike seter er også best selektert fre de setene kjent å være involvert i mekanismer der FVIII er deaktivert eller utskilt fra sirkuleringen. Seleksjon av disse setene er diskutert i detalj under. Foretrukne seter inkluderer en aminosyreresidu i eller nær et bindingssete for (a) lav tetthet lipoproteinreseptorrelatert protein, (b) en heparinsulfatprotoglykan, (c) lav tetthet lipoproteinreseptor og/eller (d) faktor VIII-inhibitoriske antistoffer. Ved ”i eller nær et bindingssete” betyr et residue som er tilstrekkelig nær til et bindingssete slik at kovalent feste av et biokompatibelt polymer til det sete ville resultere i sterisk hindring av bindingssetet. Slikt et sete er forventet å være innen for eksempel 20 Å av et bindingssete.

I en utførelsesform av oppfinnelsen er den biokompatible polymeren kovalent festet til det funksjonelle faktor VIII-polypeptidet ved en aminosyreresidue i eller nær (a) en faktor VIII utskillelsesreseptor som definert supra, (b) et bindingssete for en protease som er i stand til å degradere faktor VIII og/eller (c) et bindingssete for faktor VIII inhibitoriske antistoffer. Proteasen kan være aktivert protein C (APC). I en annen utførelsesform er den biokompatible polymeren kovalent festet ved et predefinert sete på det funksjonelle faktor VIII-polypeptidet slik at binding av lavtetthet lipoprotein reseptorrelatert protein til polypeptidet er mindre enn til polypeptidet når det ikke er konjugert, og fortrinnsvis mer enn to ganger mindre. I en utførelsesform er den biokompatible polymeren kovalent festet ved et predefinert sete på det funksjonelle faktor VIII-polypeptidet slik at binding av heparinsulfat proteoglykaner til polypeptidet er mindre enn til polypeptidet når det ikke er konjugert, og fortrinnsvis er mer enn to ganger mindre. I en videre utførelsesform er den biokompatible polymeren kovalent festet ved predefinerte seter på det funksjonelle faktor VIII-polypeptidet slik at binding av faktor VIII inhibitoriske antistoffer til polypeptidet er mindre enn til polypeptidet når det ikke er konjugert, og fortrinnsvis mer enn to ganger mindre enn bindingen til polypeptidet når det ikke er konjugert. I en annen utførelsesform er den biokompatible polymeren kovalent festet ved det predefinerte setet på det funksjonelle faktor VIII-polypeptidet, slik at binding av lavtetthetlipoproteinreseptor til polypeptidet er mindre enn til polypeptidet når det ikke er konjugert. Fortrinnsvis mer enn to ganger mindre. I en annen utførelsesform er den biokompatible polymeren kovalent festet ved det predefinerte setet på det funksjonelle faktor VIII-polypeptidet slik at en plasmapute degraderer polypeptidet mindre enn når polypeptidet ikke er konjugert. I en videre utførelsesform er degraderingen av polypeptidet ved plasmaproteasen mer enn to ganger mindre enn degraderingen av polypeptidet når det ikke er konjugert som målt under de samme betingelsene over den samme tidsperioden.

LRP, LDL-reseptor eller HSPG-bindingsaffinitet for FVIII kan bli bestemt ved å benytte overflateplasmaresonansteknologi (Biacore). For eksempel kan FVIII bli direkte lagt eller indirekte lagt gjennom et FVIII antistoff til en Biacore<TM>chip, og varierende konsentrasjoner av LRP kan føres over chipen for å måle både on-rate og off-rate av interaksjonen (Bovenchen N. et al., 2003, J. Biol. Chem.278 (11), s.9370-7). Ratioen av de to hastighetene gir et mål på affinitet. En to gangers, fortrinnsvis fem gangers, mer fortrinnsvis ti ganger, og enda mer fortrinnsvis 30 gangers minking i affinitet ved PEGylering vil være ønskelig.

Degradering av FVIII ved proteasen APC kan bli målt ved en hvilken som helst av fremgangsmåtene kjent for de trenet innen fagfeltet.

I en utførelsesform er den biokompatible polymeren kovalent festet til polypeptidet ved en eller flere av faktor VIII aminosyreposisjonene 81, 129, 377, 378, 468, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 og 2284. I en annen utførelsesform er den biokompatible polymeren kovalent festet til polypeptidet ved en eller flere av faktor VIII aminosyreposisjonene 377, 378, 468, 491, 504, 556, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911 og 2284 og (1) bindingen av konjugatet til lavtetthet lipoproteinreseptorrelatert protein er mindre enn bindingen av det ukonjugerte polypeptidet til lavtetthetlipoproteinreseptorrelatert protein; (2) bindingen av konjugatet til lavtetthetlipoproteinreseptor er mindre enn bindingen av det ukonjugerte polypeptidet til den lavtettede lipoproteinreseptoren; eller (3) bindingen av konjugatet til både lavtetthet lipoproteinreseptorrelatert protein og lavtetthetlipoproteinreseptor er mindre enn bindingen av det ukonjugerte polypeptidet til lavtetthetlipoproteinreseptorrelatert protein og lavtetthetlipoproteinreseptor.

I en videre utførelsesform er den biokompatible polymeren kovalent festet til polypeptidet ved en eller flere av faktor VIII aminosyreposisjoner 377, 378, 468, 491, 504, 556 og 711 og bindingen av konjugatet til heparin sulfat proteoglykan er mindre enn bindingen av det ukonjugerte polypeptidet til heparinsulfat proteoglykan. I en videre utførelsesform er den biokompatible polymeren kovalent festet til polypeptidet ved en eller flere av faktor VIII aminosyreposisjoner 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 og 2284 og konjugatet har mindre binding til faktor VIII inhibitoriske antistoff enn det ukonjugerte polypeptidet. I en videre utførelsesform er den biokompatible polymeren kovalent festet til polypeptidet ved en eller flere av faktor VIII aminosyreposisjoner 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 og 2284, og fortrinnsvis ved en eller flere av posisjonenene 377, 378, 468, 491, 504, 556 og 711 og konjugatet har mindre degradering fra en plasmaprotease som er i stand til å degradere faktor VIII enn det ukonjugerte polypeptidet. Mer foretrukket er plasmaproteasen aktivert protein C.

I en videre utførelsesform er den biokompatible polymeren kovalent festet til B-domenedeletert faktor VIII ved aminosyreposisjon 129, 491, 1804 og/eller 1808, mer fortrinnsvis ved 491 eller 1808. I en videre utførelsesform er den biokompatible polymeren festet til polypeptidet ved faktor VIII aminosyreposisjon 1804 og omfatter polyetylenglykol. Fortrinnsvis er det ene eller flere predefinerte seter for biokompatibel polymerfeste kontrollert ved setespesifikk cysteinmutasjon.

En eller flere seter, fortrinnsvis en eller to, på det funksjonelle faktor VIII polypeptidet kan være de predefinerte setene for polymerfestet. I bestemte utførelsesformer er polypeptidet monoPEGylert eller diPEGylert.

Oppfinnelsen relaterer også til en fremgangsmåte for fremstillingen av konjugatet som består av å mutere en nukleotidsekvens som koder for det funksjonelle faktor VIII polypeptidet til å erstatte en kodende sekvens for en cysteinresidue ved et predefinert sete. Uttrykking av den muterte nukleotidsekvensen for å produsere en cysteinforsterket mutein; rensing av muteinet; la muteinet reagere med den biokompatible polymeren som har blitt aktivert til å reagere med polypeptider hovedsakelig kun på reduserte cysteinresiduer slik at konjugatet er dannet; og rensing av konjugatet. I en annen utførelsesform gir oppfinnelsen en fremgangsmåte for setedelegert PEGylering av et faktor VIII-mutein som omfatter: (a) uttrykking av setedirigert faktor VIII-mutein hvor muteinet har en cysteinerstatning for en aminosyreresidue på den eksponerte overflaten av faktor VIII-muteinet og at cysteinet er kappet; (b) kontakte cysteinmuteinet med en reduktant under betingelser for å mildt redusere cysteinmuteinet og å frigjøre kappen; (c) fjerne kappen og reduktanten fra cysteinmuteinet; og (d) ved minst ca 5 minutter, og fortrinnsvis ved minst 15 minutter, og enda mer fortrinnsvis ved minst 30 minutter etter fjerning av reduktanten, og behandle cysteinmuteinet med PEG som omfatter en sulfidryl koblingsenhet under betingelser slik at PEGylert faktor VIII-mutein blir produsert. Sulfidryl koblingsenheten på PEG er valgt fra gruppen bestående av tiol, triflat, trisylat, aziridin, oksiran, S-pyridyl og maleimidenheter, fortrinnsvis maleimid.

Oppfinnelsen angår også farmasøytisk sammensetning for parenteral administrering som består av terapeutisk effektive mengder av konjugatet av oppfinnelsen og et farmasøytisk aksepterbart hjelpemiddel. Farmasøytiske aksepterbare hjelpemidler er substanser som kan tilsettes til de aktive ingrediensene for å hjelpe og formulere eller å stabilisere fremstillingen og forårsaker ingen signifikante uheldige toksikologiske effekter til pasienten. Eksempler på slike hjelpemidler er velkjent for de trenet inne fagfeltet og inkluderer vann, sukkere slik som maltose eller sukrose, albumin, salter, etc.

Andre hjelpemidler er beskrevet for eksempel i Remington’s Pharmaceutical Sciences av E.W. Martin. Slike sammensetninger vil inneholde en effektiv mengde av konjugatet herav sammen med en passende mengde av vehikkel for å fremstille farmasøytiske aksepterbare sammensetninger passende for effektiv administrering til verten. For eksempel kan konjugatet bli parenteralt administrert til emner som lider av hemofilia A ved en dosering som kan variere med alvorlighetsgraden av de blødende episodene. De gjenomsnittlige dosene administrert intravenøst er i rekkevidden på 40 enheter per kg for preoperative indikasjoner, 15-20 enheter per kg for mindre blødning og 20-40 enheter per kg administrert over en 8 timers periode for en vedlikeholdsdose.

Ved en utføelsesform involverer oppfinnelsesfremgangsmåten å erstatte en eller flere overflate BDD aminosyrer med en cystein, slik at man produserer cysteinmuteinet i et mammalsk ekspresjonssystem, reduserer et cystein som har blitt kappet under ekspresjonen ved cystein fra vektmediet, fjerne reduktanten for å tillate BDD disulfider å gjendannes, og reagere med et cystein spesifikt biokompatibelt polymerreagens, slik som PEG-maleimid. Eksempler på slike reagenser er PEG-maleimid med PEG-størrelser slike som 5, 22 eller 43 kD tilgjengelig fra Nektar Therapeutics of San Carlos, CA med Nektar katalognr.2D2M0H01 mPEG-MAL MW 5000 Da, 2D2M0P01 mPEG-MAL MW 20 kD, 2D3X0P01 mPEG2-Mal MW 40 kD, henholdsvis, eller 12 eller 33 kD tilgjengelig fra NOF Corporation, Tokyo, Japan med NOF katalognr.

Sunbright Me-120MA og Sunbright ME-300MA, henholdsvis. Det PEGylerte produktet er renset ved å benytte ioneutbyttekromatografi for å fjerne ureagert PEG og bruke størrelsesutestegningskromatografi for å fjerne ureagert BDD. Denne fremgangsmåten kan bli benyttet for å identifisere og selektivt beskytte hvilke som helst ugunstige interaksjoner med FVIII slik som reseptormediert utskillelse, inhibitorisk antistoffbinding, og degradering ved proteolytiske enzymer. De merket at PEG-reagenset levert av Nektar eller NOF som 5 kD testet som 6kD i vårt laboratorium, og lignende testet PEG-reagenset levert som lineært 20 kD som 22 kD, ble levert som 40 kD testet som 43 kD og ble levert som 60 kD testet som 64 kD i vårt laboratorium. For å unngå misforståelser brukte vi den molekylære vekten som testet i vårt laboratorium i diskusjonen heri, bortsett fra 5 kD PEG, som vi rapporterte som 5 kD slik som fremstilleren identifiserte den.

I tillegg til cysteinmutasjoner ved posisjoner 491 og 1808 i BDD (redegjort for ovenfor), ble posisjonene 487, 496, 504, 468, 1810, 1812, 1813, 1815, 1795, 1796, 1803 og 1804 mutert til cystein for potensielt å tillate blokkering av LRP-binding ved PEGylering. Posisjonene 377, 378 og 556 ble også mutert til cystein for å tillate blokkering av både LRP- og HSPG-binding ved PEGylering. Posisjonene 81, 129, 422, 523, 570, 1864, 1911, 2091 og 2284 ble valgt å være likt plassert på BDD slik at setedirigert PEGylering med PEG’er (større enn 40 kD) ved disse posisjonene sammen med PEGylering ved de native glykosyleringssetene (41, 239 og 2118) og LRP-bindingsseter skulle fullstendig dekke overflaten av BDD og identifisere nye utskillelsesmekanismer.

I en utførelsesform inneholder cellekulturmediene cysteiner som ”kapper” cysteinresiduene på muteinet ved å danne disulfidbindinger. De fremstillinger av konjugatet er cysteinmuteinet produsert i det rekombinante systemet kappet med et cystein fra mediumet, og denne kappen er fjernet ved mild reduksjon som frigjør kappen før tilsetning av det cysteinspesifikke polymerreagenset. Andre fremgangsmåter kjente innen fagfeltet for setespesifikk mutasjon av FVIII kan også bli benyttet, noe som vil være klart for en som er trenet innen fagfeltet.

EKSEMPLER

Strukturaktivitetsforholdanalyse av FVIII

FVIII og BDD VFIII er veldig store kompleksmolekyler med mange ulike seter involvert i biologiske reaksjoner. Tidligere forsøk på å kovalent modifisere de for å forbedre farmakokinetikkegenskaper har gitt blandede resultater. At molekylene kunne bli spesifikt muterte og at en polymer så kunne tilsettes på en setespesifikk måte var overraskende. Videre var resultatene av forbedret farmakokinetikkegenskaper og bibeholdt aktivitet overraskende også, gitt problemene med tidligere polymeriske konjugater som forårsaker ikke-spesifikk tilsetning og redusert aktivitet.

I en utførelsesform angår oppfinnelsen setedirigert mutagenese ved å benytte cysteinspesifikke ligander slik som PEG-maleimid. En umutert BDD har ikke noen tilgjengelige cysteiner for å reagere med et PEG-maleimid, så kun den muterte cysteinposisjonen vil være sete for PEGylering. Mer spesifikk har BDD FVIII nitten cysteiner, der 16 av de danner disulfider og de andre tre er frie cysteiner.

Strukturmodellen av BDD foreslår at alle tre frie cysteinene er nedgravd. Fordi oksyderte cysteiner ikke kan bli PEGylert med PEG-maleimider, kan ikke de 16 cysteinene som danner disulfider i BDD bli PEGylert uten først å bli redusert. Basert på strukturmodellene til BDD, kan ikke de tre frie cysteinene i BDD bli PEGylert uten først å denaturere proteinet for å eksponere disse cysteinene til PEG-reagenset. Derfor ser det ikke ut til å være gjennomførbart å oppnå spesifikk PEGylering av BDD ved PEGylering ved native cysteinresiduer uten dramatisk å forandre BDD-strukturen som høyst sansynlig vil ødelegge dets funksjon.

Redoxtilstanden til de fire cysteinene i B-domene av fullengde FVIII er ukjent.

PEGylering av de fire cysteinene i B-domenet kan være mulig hvis det ikke danner disulfider og er overflateeksponert. Imidlertid fordi fullengde FVIII og BDD har en lik farmakokinetikk (PK) profil og lik halveringstider in vivo (Gruppo et al., 2003, Haemophilia 9, s. 251-260), B-domenet PEGylering usansynlig å resultere i forbedret plasmahalveringstid hvis ikke PEG også ser ut til å beskytte ikke-B domeneområder.

For å bestemme det predefinerte setet på et polypeptid som har FVIII-aktivitet for polymerfestet som vil beholde faktor VIII-aktivitet og forbedre farmakokinetikk er de følgende retningslinjer presentert basert på BDD FVIII. Modifkasjoner bør være rettet mot utskillelse, inaktivering og immunogeniske mekanismer slik som LRP, HSPG, APC og inhibitorisk antistoffbindingsseter. Stoilova-McPhie.S.et al., 2002, Blood 99(4), s.

1215-23 viser strukturen av BDD. For eksempel for å forlenge halveringstiden kan en enkel PEG bli introdusert ved et spesifikt sete ved eller nær LRP bindingssete i A2-residuene 484-509 og A3-residuene 1811-1818. Introduksjon av den svære PEG ved disse setene skulle ødelegge FVIII’ets evne til å binde LRP og redusere utskillelsen av FVIII fra sirkulasjonen. Det er også antatt at å forringe halveringstiden uten signifikant å påvirke aktiviteten at en PEG kan bli introdusert ved residue 1648, som er ved koblingen av B-domene og A3-domene i fullengdemolekylet og i 14-aminosyrelinkeren i BDD mellom A2- og A3-domenene.

Spesifikitet av PEGylering kan bli oppnådd ved å konstruere enkeltcysteinresiduer inn i A2- eller A3-domenene ved å anvende rekombinant DNA mutagenseteknikker fulgt av setespesifikk PEGylering av det introduserte cysteinet med en cysteinspesifikk PEG-reagens slik som PEG-maleimid. En anne fordel av PEGylering ved 484-509 og 1811-1818 er at disse to epitopene representerer to av de tre hovedklassene av inhibitoriske antigenseter i pasienter. For å oppnå maksimal effekt av forbedringssirkuleringshalveringstid og reduksjonen av immunogeniske responser kan både A2 og A3 LRP bindingsseter bli PEGylert for å gi et diPEGylert produkt. Det bør merkes at PEGylering innen 1811-1818-området kan medføre signifikant tap av aktivitet siden dette området også er involvert i FIX-binding. Setedirigert PEGylering innen 558-565 skulle oppheve HSPG-binding, men kan også redusere aktivitet siden dette området også binder til FIX.

Ekstra overflateseter kan bli PEGylert for å identifisere nye utskillelsesmekanismer av FVIII. PEGylering av A2-domene kan tilby ekstra fordeler ved at A2-domene dissosierer fra FVIII ved aktivering og er antageligvis fjernet fra sirkuleringen raskere enn resten av FVIII-molekylet på grunn av dets mindre størrelse. PEGylert A2, på den annen side kan være stor nok til å unnslippe nyreutskillelse og kan ha en sammenlignbar plasmahalveringstid til resten av FVIII, og derfor kan rekonstituere den aktiverte FVIII in vivo.

Identifikasjon av PEGyleringssete i A2- og A3-områder.

Fem posisjoner (Y487, L491, K496, L504 og Q468 korresponderende til PEG1-5-posisjoner) ved eller nær det antatte A2 LRP-bindingsområdet ble selektert som eksempler for setedirigert PEGylering basert på høyoverflateeksponering og utvendig rening av deres C α til C β bane. Videre er disse residuene røft ekvidistant fra hverandre i den tredimensjonale strukturen av molekylet, slik at sammen kan de representere dette hele området. Åtte posisjoner (1808, 1810, 1812, 1813, 1815, 1795, 1796, 1803, 1804 korrseponderende til PEG6-14) ved eller nær det antatte A3 LRP bindingsområdet ble selektert som eksempler for setedirigert PEGylering. PEG6 (K1808) er tilstøtende til 1811-1818 og det naturlige N-kjedede glykosyleringssetet ved 1810. PEGylering ved posisjon 1810 (PEG7) vil erstatte sukkeret med en PEG. Mutasjonen ved PEG8-posisjonen T1812 vil også avskaffe glykosyleringssetet. Selv om PEG9-posisjonen (K1813) er antatt å være rettet innover, ble den selektert i tilfelle strukturmodellen ikke er korrekt. PEG10 (Y1815) er en stor hydrofobisk aminosyre innen LRP bindingsloopen, og kan være et kritisk interaksjonsresidue siden hydrofobiske aminosyrer er typisk funnet ved senteret for protein-proteininteraksjoner. Fordi 1811-1818-området har vært rapportert å være involvert i både LRP- og FIX-binding, ble PEGylering innen denne loopen antatt mulig å resultere i redusert aktivitet. Derfor ble PEG11-PEG14 (1795, 1796, 1803, 1804) designet for å være nær 1811-1818-loopen, men ikke innen loopen slik at den kan dissosiere LRP- og FIX-binding med ulik PEG-størrelser.

For å blokkere begge LRP-bindingsseter samtidig, kan dobbelt PEGylering ved, for eksempel, PEG2- og PEG6-posisjoner bli generert.

Siden 558-565-området har vært vist å binde til både HSPG og FIX, ble ingen seter designet innen dette området. I stedet ble PEG15-PEG17 (377, 378 og 556) designet innimellom A2 LRP- og HSPG-bindingsområdene slik at en festet PEG kan interferere både interaksjoner og ødelegge mulige interaksjoner mellom dem. Ekstra seter som er overflateeksponert og peker utover kan også bli selektert innen eller nær LRP- og HSPG-bindingsområder. For å identifisere nye utskillelsesmekanismer kan FVIII bli systematisk PEGylert. I tillegg til PEG1-17, kan de tre andre naturlige glykosyleringssetene, nemlig N41, N239 og N2118 korrsponderende til PEG18-20 bli benyttet som bindingspunkter for PEGylering siden de skulle være overflateeksponert. Overflateområder innen 20 angstrøm radius fra C β-atomene av PEG2, PEG6 og de fire glykosyleringssetene ble kartlagt på BDD-modellen i tillegg til funksjonelle interaksjonsseter for vWF, FIX, FX, fosfolipid og trombin.

PEG21-29 som korresponderer til Y81, F129, K422, K570, N1864, T1911, Q2091 og Q2284 ble så valgt basert på deres evne til å dekke nesten hele den gjenværende BDD-overflaten med en 20 angstrøm radius fra hver av deres C β-atomer. Disse posisjonene ble også valgt fordi de er fullt eksponert, utvendig pekende og langt av gårde fra naturlige cysteiner for å minimalisere mulige ukorrekte disulfiddannelser.20 angstrømradiusen er valgt fordi et stort PEG, slik som en 64 kD genet PEG, er forventet å ha potensiale å dekke en sfære med ca en 20 angstrøms radius. PEGylering av PEG21-29 sammen med PEG2 og PEG6 og glykosyleringsseter PEG18, 19 og 20 er sansynlig å beskytte nesten hele den ikke-funksjonelle overflaten av FVIII.

PEGyleringsposisjoner som fører til forsterkede egenskaper slik som forbedret PK-profil, større stabilitet eller redusert immunogenisitet kan bli kombinert for å generere multi-PEGylerte produkter med maksimalt forsterkede egenskaper. PEG30 og PEG31 ble designet ved å fjerne de eksponerte disulfidene i A2- og A3-domene henholdsvis. PEG30 eller C630A, bør frigjøre dets disulfidpartner C711 for PEGylering. På lignende måte skal PEG31, C1899A tillate stor C1903 og bli PEGylert.

Mutagenese.

Subartater for setedirikgert PEGylering av FVIII kan bli generert ved å introdusere et cysteinkodon ved sete valgt for PEGylering. Stratagene cQuickChange<TM>II setedirigert mutagenesekit ble valgt for å lage alle av PEG-mutantene (Stratagene kit 200523 fra Stratagene Corporation, La Jolla, CA). cQuickChange<TM>setedirigert mutagenesefremgangsmåte er gjennomført ved å benytte PfuTurbo, DNa-polymerase og en temperaturcykler. To komplimentære oligonukleotidprimere som inneholder den ønskede mutasjonen er forlenget ved å benytte PfuTurbo, som ikke vil fortrenge primerne. dsDNA som inneholder villtype FVIII-genet er benyttet som et templat. Etter flere elongeringssykluser, er produktet fordøyd med DpnI endonuklease som er spesifikk for metylert DNA. Det nysyntetiserte DNA, som inneholder mutasjonen, er ikke metylert, mens foreldrevilltyp-DNA er metylert. Det fordøyde DNA blir deretter anvendt for å transfomere XL-1 blå superkompetente celler.

Mutageneseeffektiviteten er nesten 80%. Mutagenesereaksjonene ble utført i enten pSK207 BDD C2.6 eller pSK207+BDD (figur 1). Suksessfull mutagenese ble bekreftet ved DNA-sekvensering og passende fragmenter, som inneholder mutasjonen, ble overført over til FVIII i ryggraden i den mammalske ekspresjonsvektoren pSS207+BDD. Etter overførselen ble alle av mutasjonene igjen sekvensbekreftet. For stor A3-muteiner PEG6, 7, 8, 9 og 10, var mutagenesen gjort i vektoren pSK207+BDD C2.6. Etter å ha blitt bekreftet ved sekvensering ble det mutante fragmentet KpnI/Pme subklonet over i pSK207+BDD. BDD-muteinet ble så subklonet over i pSS207-BDD-ekspresjonsvektor. For A3-muteiner PEG 11, 12, 13, 14, ble mutagenesen gjort direkte i vektoren pSK207+BDD og sekvensbekreftet mutant BDD ble så subklonet over i pSS207+BDD. For A2-muteiner Peg 1, 2, 3, 4, 5 ble mutagenesen gjort i pSK207+BDD C2.6 vektor. Den sekvensbekreftede mutanten ble subklonet over i pSK207+BDD og deretter til pSS207+BDD.

Primerne (kun senstråd) benyttet for mutagenese er listet opp for hver reaksjon.

PEG 1, Y487C: GATGTCCGTCCTTTGTGCTCAAGGAGATTACCA (SEQ IDnr.5)

PEG2, L491C: TTGTATTCAAGGAGATGCCCAAAAGGTGTAAAAC (SEQ IDnr.

6)

PEG3, K496C: TTACCAAAAGGTGTATGCCATTTGAAGGATTTTC (SEQ IDnr.7)

PEG4, L604C: AAGGATTTTCCAATTTGCCCAGGAGAAATATTC (SEQ IDnr.8)

PEG5, Q468C: GATTATATTTAAGAATTGCGCAAGCAGACCATAT (SEQ IDnr.9)

PEG6, K1808C: TAGAAAAAACTTTGTCTGCCCTAATGAAACCAAAAC (SEQ IDnr. 10)

PEG7, N1810C: AACTTTGTCAAGCCTTGCGAAACCAAAACTTAC (SEQ IDnr.

11)

PEG8, T1812C: GTCAAGCCTAATGAATGCAAAACTTACTTTTGGA (SEQ IDnr.

12)

PEG9, K1813C: CAAGCCTAATGAAACCTGCACTTACTTTTGGAAAG (SEQ IDnr. 13)

PEG10, Y1815C: CTAATGAAACCAAAACTTGCTTTTGGAAAGTGCAAC (SEQ IDnr. 14)

PEG11, D1795C: ATTTCTTATGAGGAATGCCAGAGGCAAGGAGCA (SEQ IDnr.

15)

PEG12, Q1796C: TCTTATGAGGAAGATTGCAGGCAAGGAGCAGAA (SEQ IDnr.

16)

PEG13, R1803C: CAAGGAGCAGAACCTTGCAAAACTTTGTCAAGCCT (SEQ IDnr. 17)

PEG14, K1804C: GGACAGAACCTAGATGCAACTTTGTCAAGCCT (SEQ IDnr.

18)

PEG15, K2777C: CGCTCAGTTGCCAAGTGTCATCCTAAAACTTGG (SEQ IDnr.

19)

PEG16, H378C: TCAGTTGCCAAGAAGTGTCCTAAAACTTGGGTA (SEQ IDnr.

20)

PEG17, K556C: CTCCTCATCTGCTACTGCGAATCTGTAGATCAA (SEQ IDnr.21)

PEG18, N41C: CAAATCTTTTCCATTCTGCACCTCAGTCGTCGTGTAC (SEQ IDnr. 22)

PEG19, N239C: GTCAATGGTTATGTATGCAGGTCTCTGCCAGGT (SEQ IDnr. 23)

PEG20, N2118C: CAGACTTATCGAGGATGTTCCACTGGAACCTTA (SEQ IDnr.

PEG21, Y81C: ATCCAGGCTGAGGTTTGTGATACAGTGGTCATT (SEQ IDnr.25)

PEG22, F129C: GAAGATGATAAAGTCTGTCCTGGTGGAAGCCAT (SEQ IDnr.

26)

PEG23, K422C: CAGCGGATTGGTAGGTGTTACAAAAAAGTCCGA (SEQ IDnr.

27)

PEG24, K523C: GAAGATGGGCCAACTTGCTCAGATCCTCGGTGC (SEQ IDnr.

28)

PEG25, K570C: CAGATAATGTCAGACTGCAGGAATGTCATCCTG (SEQ IDnr.

29)

PEG26, n1884c: CACACTAACACACTGTGTCCTGCTCATGGGAGA (SEQ IDnr.

30)

PEG27, T1911C, CAGATGGAAGATCCCTGCTTTAAAGAGAATTAT (SEW IDnr.

31)

PEG28, Q2091C: ACCCAGGGTGCCCGTTGCAAGTTCTCCAGCCTC (SEQ IDnr.

32)

PEG29, Q2284C: AAAGTAAAGGTTTTTTGCGGAAATCAAGACTCC (SEQ IDnr.

33)

PEG30, C630A: TTGCAGTTGTCAGTTGCTTTGCATGAGGTGGCA (SEQ IDnr.

34)

PEG31, C1899A: AATATGGAAAGAAACGCTAGGGCTCCCTGCAAT (SEQ IDnr.

35)

Muteinekspresjon

Etter innsesjon i en vektor som har resistens mot Hygromycin B, ble PEG-muteinet transfektert over i HKB11-celler, US patent 6,136,599) sammensatt med 293 Fectin transfeksjonsreagens (invitrogen Corp. katnr.12347-019) per fremstillerens instruksjoner. FVIII-ekspresjon ved tre dager posttransfeksjon ble bedømt ved Coatest kromogenisk assay (Chromogenix Corp. katnr. 821033, se eksempel 12 kromogenisk assay) (tabell 1). De transfekterte cellene ble så plassert under selektivt press med 50 mg/ml Hyg B i et vekstmedium supplementert med 5% FBS. Når Hyg B-resistente kolonier dukker opp ble de manuelt plukket og screenet for FVIII-ekspresjon ved Coatest kromogenisk assay. FVIII-uttrykkende stabile celler ble så adaptert til et medium som inneholder HPPS-supplement. Cellene ble ekspandert og sådd ved 1 X 10<6>celler/ml i ristende flasker med friskt media. Vevskulturvæske (TCF), høstet etter 3 dager ble benyttet for opprensing av FVIII BDD-muteiner. FVIII-aktivitet av TCF ble assayet ved Coatest (tabell 1).

Tabell 1

Sammendrag av PEG-muteintiter

Tabell 1. Ekspresjonsnivå av PEG-muteiner fra transient og stabile transfeksjoner.

Muteinopprensing.

Ved oppsamling av cellekultursupernatanten som inneholder det utskilte mutein FVIII-proteinet, er supernatanten filtrert gjennom et 0.2 µmembranfilter for å fjerne hvilke som helst gjenværende celler. Supernatanten blir så konsentrert ved enten ultrafiltrering eller anionutbytting. Det blir så satt på en immunoaffinitetskolonne hvor cellekulturmediakomponentene og hovedparten av vertscelleproteinurenheter blir fjernet. Immunoaffinitetskolonneeluatet blir så bufferbyttet ved diafiltrering over i en formuleringsbuffer som inneholder sukkrose og fryst. Utbytte og gjenvinning av protein over en monoklonal FVIII-antistoffkolonne ble bedømt ved kromogenisk assay. Prøver av load, gjenomstrømning, ulike eluatfraksjoner, strip og det diafiltrerte eluatet av en kromatografikjøring ble assayet for FVIII-aktivitet (tabell 2). Tabell 2 viser gjenvinningen av PEG2-mutein fra en monoklonal antistoffkolonne. Antistoffene er C7F7 antistoff. Prosent gjenvinning i tabell 2 er bestemt ved kromogenisk assay. Det endelige utbytte var 73%. Vist i figur 2 er et plot av UV-absorbans ved 280 nm med hensyn til tid for PEG2-protein renset over en monoklonal FVIII-antistoffkromatografikolonne. Kromatografien ble utført ved å benytte et AKTA® Explorer 100 kromatografisystem fra Amersham Bioscience. Instrumentet benytter en multibølgelengde UV-synlig monitor og en 2 mm flowcelle. PEG2-muteinet er eluert fra kolonnen i nærvær av høysalt og elueringstopp er indikert ved både absorbanse ved 280 nm og FVIII-aktivitetsassay.

Tabell 2

Tabell 2. Gjenvinning av PEG2-mutein fra monoklonal FVIII-antistoffkolonne.

Pegylering.

Nativ fullengde FVIII eller BDD kan ikke bli PEGylert ved cysteinspesifikke PEG’er uten reduksjon og denaturering ved over 100 ganger overskudd PEG:proteinratio (data ikke vist), noe som bekrefter hypotesen basert på BDD-strukturmodell at alle native cysteiner danner disulfider eller er begravet innen FVIII. FVIII-cysteinmuteiner uttrykt og renset ved å benytte standardprotokoller nevnt over kunne ikke bli PEGylert med en cysteinspesifikk PEG-maleimidreagens, antageligvis fordi det introduserte FVIII-cysteinet er ”kappet” ved å reagere med sulhydrylgrupper slik som cystein og�-merkaptoetanol tilstede i cellevekstmediet. Denne saken kan potensielt bli løst ved å eliminere cysteiner og�-merkaptoetanol fra kulturmediet, men dette kan føre til lavere FVIII-produksjon og vil ikke forebygge sulfydryler frigjort av cellene fra å blokkere det introduserte FVIII-cysteinet.

I et annet aspekt av oppfinnelsen ble en tretrinns fremgangsmåte utviklet for å tillate setespesifikk PEGylering av FVIII (figur 3). I trinn 1, er det rensede FVIII-cysteinmuteinet ved ca 1 µM mildt redusert ved reduktanter slik som ca 0.7 mM Tris(2-karboksyetyl)fosfin (TCEP) eller 0.07 mM ditiotreitol (DTT) i 30 minutter ved 4ºC for å frigjøre ”kappen”. I trinn 2 er reduktanten fjernet sammen med ”kappen” ved en størrelsesutskillingskromatografi (SEC) fremgangsmåte slik som å kjøre prøven gjennom en spinnkolonne (BioRad<®>) for å tillate FVIII-disulfider til å dannes på ny mens det etterlater det introduserte cysteinet fri og redusert. I trinn 3 ved minst 30 min. etter fjerning av reduktanten er det frigjorte FVIII-cysteinmuteinet behandlet med minst 10 gangers molart overskudd av PEG-maleimid med størrelser som rekker fra 5 til 64 kD (Nektar Therapeutics og N.O.F. Corporation) for minst 1 time ved 4ºC. Denne fremgangsmåten resulterer i høyt konsistente produktprofiler med retroduserbare data for dusinvis av reaksjoner gjentatt av ulike individer.

Fordi spinnkolonnefremgangsmåten for fjerning av TCEP ikke er skalerbar, ble gelfiltreringskromatografi valgt. Imidlertid ved testing av denne fremgangsmåten ved å benytte en TCEP spikeprøve ble det vist at TCEP eluerte ved målbare nivåer i kolonnedødvolumet og ikke bare i saltfraksjonen som ville være forventet fra et molekyl med dets lave molekylære vekt. Western Blot assay viste signifikant bakgrunnsPEGylering sansynligvis på grunn av ufullstendig fjerning av TCEP. I mellomtiden viste separate eksperimenter at C7F7 renset materiale kunne bli signifikant renset videre fra andre proteinurenheter ved å benytte anionutvekslingskromatografimedia kombinert med en saltgradient. Det ble så bestemt å redusere C7F7-materialet med TCEP som beskrevet over og så prosessere materialet over anionutbyttekolonnen. På grunn av ladningsforskjell ville FVIII-proteinet bli holdt tilbake mens TCEP ville strømme gjennom kolonnen og ikke bli holdt tilbake. På samme tid under gradient saltelueringen ville FVIII-proteinet bli renset vekk fra hoveddelen av de gjenværende proteinurenhetene. Dette betyr at den senere hendelsen med PEGylering ville teoretisk være mer homogent med renerer startmateriale.

Imidlertid ved testing med en spikeprøve av TCEP ble bevist at målbare nivåer av TCEP ble funnet å eluere i gradienten med FVIII. Derfor ble det bestemt å implementere gelfiltreringsdelsaltingskromatografi etter anionutbyttekromatografi slik at disse to trinnene, når de ble benyttet i rekkefølge, kunne resultere i fullstendig fjerning av TCEP og eliminere uspesifikk PEGylering.

Pegyleringsanalyse ved SDS-page og WesternBlot.

Det PEGylerte produktet kan bli analysert ved elektroforese på en reduserende 6% TrisGlycin SDS polyakrylamidgel (Invitrogen). Etter elektroforese kan gelen bli farget med Coomassie blå for å identifisere alle proteiner eller utsettes for en standard WesternBlot-protokoll for å identifisere PEGyleringsmønstere på ulike områder av FVIII. Farging av blottet med musemonoklonalt R8B12 eller C7F7-antistoff laget mot det C-terminale området av FVIII-tunge kjeden eller det N-terminale område av VIII lette kjeden henholdsvis kunne identifisere PEGylering av de respektive kjeder. Farging med 413 antistoff mot 484-509-området av FVIII vil bestemme hvorvidt PEGylering er virkelig setespesifikk eller ikke for muteinet slik som PEG1-4. På lignende måte vil farging med CLB-CAg A-antistoff som gjenkjenner 1801-1823-området av FVIII bestemme hvis PEGylering er setespesifikk eller ikke for muteiner slik som PEG6-10.

PEG2 (L491C) PEGylering var vist å være selektiv for tungkjeden fremfor lettkjeden, og spesielt selektiv for 484-509-området (figur 4) mens PEG6 (K1808C) ble vist å være selektiv for lettkjeden fremfor tungkjeden (figur 5).

For studien fremstilt i figur 4, er PEG2-mutein (spor 1 og 8) redusert med TCEP fulgt av TCEP-fjerning (spor 2 og 9) og behandling med 5, 12, 22, 33 eller 43 kD PEG-maleimid (spor 3-7 og 10-14). UPEGylert FVIII kjører som uprosessert (H+L) og prosessert tung (H) og lett (L) kjedebånd. Alle tre båndene er detekterbare på den Coomassie blå fargede gelen (nedre høyre) mens Westernfarging med kjedespesifikke antistoffer avdekker kun den uprosesserte og den korresponderende kjeden. Ved å benytte R8B12-farging (øvre venstre), er tungkjeden (H)-båndet dramatisk redusert i intensitet når PEG2 er behandlet med PEG-maleimid og et nytt bånd er dannet som kjører høyere enn foreldre H-båndene proporsjonalt til størrelsen av PEG. Ved å benytte C7F7-farging (nedre venstre), vil de lette kjede (L)-båndene (multiple bånd på grunn av heterogenglykosylering) ikke forandre intensitet. Det uprosseserte H+L-båndet for begge farginger er forskjøvet fordi H-kjeden er del av den uprosseserte FVIII.

Coomassiefarging bekrefter også mye mer PEGylering av den tunge kjeden, det vil si reduksjon av H-båndintensitet, enn den lette kjeden. Endelig mister de PEGylerte båndende relativt mer intensitet på 413 antistoffargingen (øvre høyre) enn R8B12-fargingen i PEGstørrelsesavhengig måte antagelig på grunn av setespesifikk PEGylering av 491, som blokkerer bindingen av 413-antistoff til 484-509. Mengder av FVIII loadet per spor er ca 30 ng for de to venstre gelene, omtrent 1000 ng for den øvre høyre gelen og ca 2000 ng for den nedre høyre gelen.

Reduksjon fulgt av fjerning av reduktanten fører ikke til forandring i migrasjonen av FVIII (spor 1 vs.2 og 8 vs.9). Tilsetting av 22 kD PEG til PEG2 blokkerer bindingen av 413 antistoffet, noe som er konsistent med spesifikk PEGylering ved 491-posisjonen (figur 4 øvre høyre gel). Dette foreslår også at PEGylert PEG2 vil ha lavere immunogenisitet i mennesket på grunn av at 413-antistoffet har blitt vist å dele den samme epitopen som human A2-inhibitoriske antistoffer (Scandella et al., 1992, Thromb. Haemost. 67, s.665-71).

For studien fremstilt i figur 5 er PEG6-mutein redusert med TCEP-etterfulgt av TCEP-fjerning (spor 1 og 6) og behandling med 5, 12, 22 eller 33 kD PEG-maleimid (spor 2-5 og 7-10). UPEGylert FVIII kjører som uprosessert (H+L) og prosessert tung (H)- og lett (L)-kjedebånd. Fordi PEG6 (K1808) mutasjon befinner seg på den lette kjeden ble PEGylering detektert kun på den lette kjeden, og ikke på den tunge kjeden. Mengden av FVIII loadet per spor er ca 100 ng for venstre gel og ca 30 ng for den høyre gel.

BDD som ble kjørt som en kontroll viste ikke noen signifikant PEGylering ved behandling med større enn 100 gangers molart overskudd av PEG-maleimid selv etter reduksjon og reduktantfjerningsprosedyrer beskrevet over (figur 6a). Den samme fremgangsmåten ble også benyttet for PEG4 og PEG5 (figur 6a). Sammenlignet med PEG2, ble disse meteinene ikke PEGylert så effektivt, men de ble selektert for tungkjede lik PEG2 (L491C). PEG6 (K1808C) PEGylering-effektivitet er relativt lav, kanskje på grunn av at den er veldig nær den N-koblede glykocyleringssetet ved N1810, som kan blokkere PEGylering ved posisjon 1808. Derfor designet vi PEG7 (N1818C) for å fjerne det native glykosyleringssetet ved 1810. PEG7 viste forbedret PEGyleringseffektivitet sammenlignet med PEG6 i en hode-mot-hodesammenligning (figur 6b). På lignende måte viste PEG15 litt bedre PEGyleringseffektivitet enn PEG2. PEG2+6, en dobbeltmutant av BDD, kan bli pegylert med PEG på både tunge og lette kjeder siden PEG2 er en tom kjedecysteinmutasjon mens PEG6 er en lettkjedemutasjon (figur 6c). Denne fremgangsmåten ble også benyttet på villtype fullengde FVIII (figur 6d). PEGylering ble detektert for det største fragmentet av tungkjede som inkluderer A1, A2 og mesteparten av B-domenet. PEGyleringsmønstere foreslår monoPEGylering og at det er kun en enkel cysteinPEGylert.

Pegyleringsanalyse ved trombinkløyving og WesternBlot.

Det PEGylerte produktet kan bli behandlet med trombin (40 IU/ug FVIII) ved 37ºC i 30 minutter. Trombinen benyttet inneholder også APC som en kontaminant.

Trombinkløyving vil generere 50 kD A1- og 43 kD A2-domenene fra tungkjeden, mens APC-kløyving vil splitte A2-domene videre over i 21 og 22 kD-fragmenter (figur 7). Farging med R8B12-antistoff, som gjenkjenner C-enden av den tunge kjeden, vil identifisere kun det intakte A2-domenet og det 21 kD C-endefragmentet (FVIII 562-740). Derfor, hvis PEG2 PEGylering var spesifikk for posisjon 491, skulle 43 kD A2-domenet være PEGylert, men ikke det 21 kD C-endefragmentet. Dette ble faktisk bekreftet ved WesternBlot for 22 kD PEGylert PEG2 vist på figur 7. Derfor ved eliminering har PEG2 PEGylering blitt lokalisert til N-ende 22 kD-fragmentet (FVIII 373-561) av A2-domenet. Siden PEG-maleimid er fullstendig selektiv for cysteiner ved pH 6.8 og de eneste native FVIII-cysteinene innen 373-561 kommer fra en begravd disulfid mellom 528 og 554, er PEG2 veldig sansynlig PEGylert på det introduserte cysteinet ved posisjon 491. Westerfarging av trombinbehandlet PEGylert PEG2 med en FVIII-tungkjede N-endeantistoff viser ingen PEGylering av A1-domenet (data ikke vist). Selektiv PEGylering av PEG2 ved å benytte trombinkløyvingsfremgangsmåten har også blitt bekreftet for PEG’er av 5, 12, 33 og 43 kD’er (data ikke vist).

Trombinkløyving av PEGylert villtype fullengde FVIII viser at kun B-domene er PEGylert (figur 8).

PEGyleringsanalyse ved iodfarging.

For å bekrefte at de nydannede båndende på Coomassie blå og Westerfarging faktisk var PEGylerte bånd, ble barium-iodfarging, som er spesifikk for PEG, benyttet (figur 9). PEGylert PEG2 ble kjørt på en 6% TrisGlycingel (Invitrogen) og farget med R8B12-tungkjedeantistoff eller en barium-iodløsning (Lee et al., Pharm Dev. Technol. 1999 4:269-275). De PEGylerte båndende matchet mellom de to fargingene ved å benytte den molekylære vektmarkøren for å line de opp, og dermed bekrefte FVIII tungkjedePEGylering.

PEGyleringsanalyse ved maldi-massespek.

For å bekrefte PEGylering av A2-domenet i den tunge kjeden, ble rFVIII-prøven før og etter PEGylering analysert ved matriksassistert laser desorpsjon/ionisering (MALDI) massespektrometri. Prøvene ble blandet og krystallisert på MALDI-målplaten med en sinapinisk syrematriks i 30% acetonitril, 0.1% TFA. De ble så analysert i et Voyager DE-PRO-spektrometer i positiv, lineær måte. Resultatene vist i figur 10, viste lettkjeden av PEG2 sentrert ved 83 kD og tungkjeden (HC) ved 89 kD. Spektrumet oppnådd for de PEGylerte prøvene viste et drop i den HC-toppen og en ny topp, sentrert ved 111 kD ble dannet. Dette bekrefter PEGylering av tungkjeden. Ingen PEGylert lettkjede (ved 105 kD) ble observert over deteksjonsgrensen.

Prøvene ble så begge utsatt for trombinfordøying ved 20 enheter av trombin/mg FVIII ved 37ºC i 30 minutter, etterfulgt av FVIII-konsentrasjonsbestemmelse ved aminiosyreanalyse (Commonweath Biotechnologies, Inc.). Tungkjeden ble kløyvet over i 46 kD (A1) N-endefraksjon og en 43 kD (A2) fraksjon. MALDI-spektrumet oppnådd for den PEGylerte prøven (figur 11) viser tapet av 43 kD-toppen og utviklingen av en ny 65 kD-topp, på grunn av det PEGylerte A2-domene. PEGylering av LC er igjen ikke observert over deteksjonsgrensen. Disse resultatene bekrefter igjen PEGylering av A2-domene av FVIII. Den samme analysen ble benyttet for PEGylert PEG6, noe som bekrefter PEGylering av lettkjede A3C1C2-fragment (figur 12).

Aktivitetsmåling.

Koagulasjonsassay.

Klumping FVIII:C-testfremgangsmåten er et ettrinnsassay basert på den aktiverte delvis tromboplastintiden (aPTT). FVIII fungerer som en kofaktor i nærvær av faktor IXa, kalsium og fosfolipider i den enzymatiske omdannelsen av faktor X til Xa. I dette assayet er de fortynnede testprøvene inkludert ved 37ºC med en blanding av FVIII defekt plasmasubstrat og aPTT-reagens. Kalsiumklorid er tilført til den inkuberte blandingen, og klumping er initiert. En invers sammenheng eksisterer mellom tiden (sekunder) det tar for en klump å dannes og lokarytmen til konsentrasjonen av FVIII:C. Aktivitetsnivåer for ukjente prøver er interpolert ved å sammenligne klumpingstiden av ulike fortynninger av testmaterialet med en kurve konstruert fra en rekke fortynninger av standardmateriale med kjent aktivitet, og er rapportert i internasjonale units per ml (IU/ml).

Kromogenisk assay.

Den kromogeniske assayfremgangsmåten består av to etterfølgende trinn hvor intensiteten av farge er proporsjonal til FVIII-aktiviteten. I det første trinnet er faktor X aktivert til FXa ved FIXa med dets kovaktor, FVIIIa, i nærværet av optimale mengder av kalsiumioner og fosfolipider. Overskuddsmengder av faktor X er tilstede slik at hastigheten av aktivering av faktor X er kun avhengig av mengden av FVIII. I den andre trinnet hydrolyserer faktor Xa det kromogeniske substratet for å gi en kromofor og fargeintensiteten er lest fotometrisk ved 405 nm. Potensen av den ukjente er beregnet og validiteten av assayet er kontrollert med fallrate statistisk fremgangsmåte. Aktivitet er rapportert i internasjonale enheter per ml (IU/ml).

1811-1818-loopen er involvert i binding til FIX, men viktigheten av individuelle posisjoner innen denne loopen har ikke blitt bestemt. PEG7-10-muteiner viser nær identisk, spesifikk kromogenisk aktivitet relativ til nativ FVIII (tabell 3). Tabell 3 viser prosent spesifikk aktivitet (S.A.) av PEG-muteiner og PEGylert PEG2 eller PEG6 relativ til BDD. S.A. ble bestemt ved å dele den kromogeniske, koaguleringen eller vWF-bindingsaktivitet med den totale antigen ELISA (TAE)-verdien. S.A. av PEGylerte muteiner ble så delt med S.A. av BDD (8 IU/ug kromogenisk, 5 IU/ug koagulering, og 1 vWF/TAE) og multiplisert ved 100 for å oppnå prosenten S.A. oppført i tabell 3 under overskriftene kromogenisk, koagulering og vWFT/TAE.

Tabell 3.

Tabell 3. Prosentspesifikk aktivitet (S.A.) av PEG-muteiner og PEgylert PEG2 og PEG6 relativt til BDD.

Som anvendt i tabell 3, er ”PEG2 rød” PEG2-mutein som har blitt behandlet med reduktant etterfulgt av fjerning av reduktanten. Denne reduksjonsfremgangsmåten forandrer ikke signifikant de tre funksjonelle aktivitetene av FVIII. PEG2-mutein konjugert til PEG’er med rekkevidde fra 5 kD (PEG2-5kD) til 43 kD (PEG2-43kD) mistet ikke en signifikant mengde av kromogenisk aktivitet, men hadde i stor grad klar koaguleringsaktivitet ettersom PEG-størrelsen økte over 5 kD. Det kan være en beskjeden reduksjon i vWF-binding for større størrelser PEGylert PEG2 også.

Total antigen ELISA (TAE).

FVIII er fanget på en mikrotiterplate som har blitt dekket med et polyklonalt FVIII-antistoff. Bundet FVIII er detektert med et biotinylert polyklonalt rFVIII-antistoff og streptavidin horseradish peroksidase (HRP) konjugat. Peroksidasestreptavidinkomplekset produserer en fargereaksjon ved tilsetningen av tetrametylbenzidin (TMB) substrat. Prøvekonsentrasjoner er interpolert fra en standardkurve ved å benytte fire parameter tilpasningsmodeller. FVIII-resultater er rapportert i µg/ml.

vWF bindings ELISA.

FVIII er tillatt å binde til vWf i alvorlig hemofilisk plasma i løsning. FVIII-vWfkompleks ble så fanget på en mikrotiterplate som har blitt dekket med et vWf-spesifikt monoklonalt antistoff. FVIII bundet til vWF er detektert med et FVIII polyklonalt antistoff og et horseradish peroksidase-anti-kaninkonjugat. Peroksidase-konjugert antistoffkompleks produserer en fargereaksjon ved tilførsel av substratet.

Prøvekonsentrasjoner er interpolert fra en standardkurve ved å benytte fire parameter tilpasningsmodell. FVIII-bindingsresultatet er rapportert i µg/ml. Det var ingen signifikant innvirkning på noen av aktivitetene ved PEGylering, som kan være konsistent med PEGylering ved B-domenet.

Tabell 4.

Tabell 4. Spesifikk aktivitet (S.A.) av villtype fullengde FVIII (KG-2) før og etter PEGylering med forskjellige størrelser av PEG.

Rensing av PEGylert FVIII ved ioneutbyttingskromatografi.

PEGylert FVIII er satt på en anionutbyttingskolonne eller kationsutbyttingskolonne hvor proteinet binder til kolonnen mens hvilke som helst overskudd av PEG-reagens ikke binder og er fjernet i gjenomstrømningen. PEG-muteinet blir så eluert fra kolonnen med en natriumkloridgradient. En barium-iodfarget 4-12% Bis-Trisgel av load, gjenomstrømning og gradientfraksjoner ble benyttet for å bekrefte at fraksjonene fra kolonneelueringen har PEGylert mutein.

Rensing av PEGylert FVIII ved størrelsesutestegningskromatografi.

Anoinutbyttefraksjoner som inneholder hoveddelen av PEG2-mutein har samlet sammen og konsentrert ved ultrafiltrering og så satt på en størrelsesutestegningskolonne. Kolonnen blir så eluert ved å benytte formuleringsbuffere. Grunnet forskjellen i størrelsen og formen til proteinet avhenger av hvorvidt PEG er bundet til proteinet, separerer denne kolonnen PEGylert PEG2-mutein fra det av hvilke som helst gjenværende PEG2, som ikke er PEGylert. PEGylert mutein FVIII-fraksjoner er samlet sammen på grunnlag av å ha det meste FVIII-aktiviteten og så frosset ned for etterfølgende dyrestudier og molekylær karakterisering. Figur 13 sammenlignet elueringen av ikke-PEGylert PEG2-mutein versus det til 43 kD PEGylert PEG2-mutein. PEGylert PEG2 eluerer signifikant tidligere, som indikerer en økning i dets størrelse og form fra den kovalent festede PEG.

Med muteiner slik som PEG6 som viser lavere effektivitet av PEGylering, det vil si mindre enn 50%, er det mest effektive rensingsskjemaet for å gi høyt, rent mono-PEGylert produkt og benytte en kombinasjon av kationutbyttekromatografi fulgt av størrelsesutestegningskromatografi. For eksempel med PEG6, renser kationutbyttekromatografi den PEGylerte PEG6 (tidligere elueringsfraksjon, fig.14) vekk fra hoveddelen av UPEGylert PEG6 (senere elueringsfraksjon, fig 15).

Størrelsesutestegningskromatografi renser så det PEGylerte proteinet (tidligere elueringsfraksjon, PEG15) fra det gjenværende av UPEGylert protein (senere elueringsfraksjon fig.15).

Effekt av PEG-størrelse på aktivitet.

For å teste hvorvidt PEG-størrelser har en effekt på både koagulering og kromogeniske aktiviteter av FVIII ved PEGylering, ble renset fullengde FVIII, PEG2, PEG6 og PEG14 redusert ved PCEP etterfulgt av reduktantfjerning og reaksjon med en bufferkontroll eller PEG’er som strekker seg fra 6 kD til 64 kD. Det resulterende PEGylerte FVIII ble direkte undersøkt uten fjerning av overskudd PEG eller UPEGylert FVIII. Kontrolleksperiment viser at overskuddet av PEG ikke har noen effekt på FVIIII-aktivitet.

Fig. 16 viser resultatene av denne studien. Renset fullengde FVIII er representert som KG-2 i fig.16. Prosent aktivitet rapportert i fig.16 ble bestemt ved å dele verdien av prøven behandlet med PEG etter reduksjon og reduktantfjerning med den til prøven behandlet med bufferkontroll, og der men tar i betraktning PEGyleringsutbytte.

PEGyleringsutbyttet ble sammenlignet over alle PEG’er for hvilket som helst gitt FVIII-konstrukt. De er ca 80% for KG-2, PEG2 og PEG14 og ca 40% for PEG6. For eksempel har PEG14 bufferkontroll behandlet med en koaguleringsaktivitet på 6.8 IU/ml vs.3.2 IU/ml for 12 kD PEGylert PEG14-prøve. Imidlertid har PEGyleringseffektiviteten ca 80%, noe som betyr at 3.2 IU/ml representerer agregataktiviteten av ca 80% PEGylert og ca 20% UPEGylert. Hvis man antar at den UPEGylerte prøven har den samme aktivitet som bufferkontrollbehandlet PEG14, utarbeides prosentaktiviteten av UPEGylert i forhold til PEGylert PEG14 å være 34% = (3.2-6.8 ganger 20%) / (6.8 ganger 80%)

PEGylering innen A2- eller A3-domenet ved PEG2-, PEG6- eller PEG14-posisjoner av BDD førte til dramatisk tap av koaguleringsaktivitet når PEG-størrelsen økte over 6 kD. Imidlertid hadde PEGylering innen B-domene ved et nativt B-domenecystein av fullengde FVIII ingen effekt på koaguleringsaktiviteten. Interessant er den kromogeniske aktiviteten ikke påvirket for alle PEGylerte konstrukter. Dette kan skilles forskjeller i assayer. Det er mulig at det lille kromogeniske peptidsubstratet har en lettere tilgang til et PEGylert FVIII/FIX/FX-kompleks enn det større proteinsubstratet benyttet i koaguleringsassayet. Alternativt kan PEG påvirke aktiveringen av muteinet. Dette ville være lettere detekterbart ved ettrinnskoaguleringsassayet enn det 2-trinns kromogeniske assayet.

For å bekrefte observasjonen av PEG-effekter på koaguleringsaktiviteten av PEG2, 6 og 14, ble flere PEGylerte konstrukt renset vekk fra overskuddsPEG og UPEGylert. Siden PEG ikke har noen effekter på kromogenisk aktivitet, er den kromogeniske til koaguleringsaktivitetsratioen et godt estimat på den relative effekten av PEG på koagulasjonsaktivitet (tabell 5). Større PEG’er ved en gitt posisjon slik som PEG2 og et høyere antall av PEG’er som i tilfelle med PEG2+6-konstrukt induserer et større tap av koaguleringsaktivitet.

Tabell 5

Tabell 5. Ratsio av kromogenisk i forhold til koagulering for renset PEGylert BDD.<*>forgrenet PEG. ;;Kanin PK-studie. ;For å forstå effekten av PEGylering på farmakokinetikk (PK) av FVIII, ble PK-studier utført i en rekke arter. NZW SPF-kaniner ble benyttet for studium: 10 hunder, 5 kaniner per gruppe, 2 grupper (PEG2 FVIII og 22 kD PEGylert PEG2). Prøvene ble fortynnet i steril PBS med en sluttkonsentrasjon på 100 IU/ml (kromogeniske enheter). Hver kanin mottok en dose på 1 ml/kg (100 IU/kg) ved fortynningstesten eller kontrollsubstans via marginal ørevene. Ved ulike tider postinjeksjon, ble blodrøver (1 ml) dratt over i 1 ml sprøyte (fylt med 100 µL av 3.8% Na-citrat) fra sentralørearterien ved definerte tidspunkt etter dosering. Plasmaprøver ble inkubert med R8B12 tungkjedeantistoff dekket på en 96-brønners plate for spesifikt å fange den doserte humane FVIII. ;Aktiviteten av den fangede FVIII ble bestemt ved kromogeniske assayer (figur 17). PEGylert PEG2 og PEGylert PEG6 ble også sammenlignet med BDD (figur 18 og 19), med PEGylerte muteiner som viser en forbedring i plasmagjenvinning sammenlignet med BDD. PEGylert villtype fullengde FVII så ikke ut til å vise mye forbedring (figur 20). ;;Muse PK-studie. ;Som en andre art, ble ICR normal eller hemofile, FVIII-defekte mus (Taconic, Hudson, NY) benyttet i PK-studiene. Normale mus ble benyttet for studium, 5 mus per gruppe per tidspunkt. Testmaterialet ble fortynnet i formuleringsbuffer til en nominell endelig kosentrasjon på 25 IU/ml. Hver mus kan bli administrert 4 ml/kg (~0.1 ml totalt volum) av det fortynnede testmateriale via halevenen. Blodprøver (0.45 eller 0.3 ml for normal eller hemofil musestudie, henholdsvis) er dratt over i en 1 ml sprøyte (fylt med 50 eller 30 µL av 3.8% Na-citrat for normal eller hemofil musestudie, henholdsvis) fra inferior vena cava ved de indikerte tidspunkt (et dyr per prøve). Plasmaprøver er analysert for FVIII-konsentrasjon ved å benytte den kromogeniske assayfremgangsmåten beskrevet over. PEGylert PEG6 viser større plasmagjenvinning sammenlignet med BDD eller PEG6 (figur 21). PEGylert PEG2 viser større plasmagjenvinning sammenlignet med BDD (figurene 22 og 23). ;Tabell 6. ;; ;;; Tabell 6. PK-studieoppsummering av PEGylert FVIII som viser plasmahalveringstider i timer. * Initiell preparering av 33 kD PEGylert PEG6 med halveringstid på 9.6 timer i kaniner var ikke så ren som en senere prep som ga 17.4 timer.

Tabell 7.

Mutein PEG Ganger

PEG6 12 kD 2.9

PEG6 33 kD 2.9

PEG2+6 33 kD 3.3

PEG14 33 kD 2.5

PEG2+6 33 kD 4.4

PEG2+14 33 kD 2.1

PEG22 64 kD 3.2

Tabell 7. Plasmagjenvining av PEGylert PEG-muteiner i hemofile mus. Ganger forbedring i plasmagjenvinning ved 16 timers postinjeksjon sammenlignet med BDD-kontroll utført på samme dato er rapportert.

Hemofile mus (BDD) faktor VIII-gjenvinning.

Det hemofile muse (BDD) faktor VIII-gjenvinningshistogrammet vist i figur 24 fremstiller en farmakokinetikk (PK) bedømmelse av halveringstiden av to arter av BDD-faktor VIII i et hemofilisk museassay. Dette assayet ble designet for å måle plasmakonsentrasjoner av både BDD-faktor VIII (referert til i figur 24 som ”wt” eller villtype BDD-faktor VIII) og PEG 2+6 dobelt PEGylert variant av BDD-faktor VIII (og identifisert et annet sted heri som L491C, K1808C dobbeltvariant av BDD-faktor VIII) ved tre tidspunkter postintravenøst administrert i en musemodell. Mens PK-bedømmelsen ved både 0.8 og 4 timer tidspunktene var sammenlignbare, er 16 timers bedømmelsen spesielt bemerkelsesverdig. Ved 16 timer er ca 4 ganger (400%) så mye som den doble PEGylerte BDD-faktor VIII-varianten (PEG2+6) igjen i museplasma 16 timer etter administrasjon sammenlignet med det UPEGylerte molekylet.

Nyreriftmodell.

For å bestemme hvis PEGylert FVIII-muteiner var effektive til å stoppe en blødning i en hemofil mus, ble nyreriftmodellen benyttet. Hemofile mus (C57/BL6 med et ødelagt FVIII-gen) er bedøvet under isofluoran og veid. Inferioer vena cava ble eksponert og 100 µl av enten salt eller FVIII ble injisert ved å benytte en 31 gauge nål. Nålen ble forsiktig fjernet og press ble tilført ved injeksjonsstedet i 30-45 sekunder for å forebygge blødning. Etter 2 min. ble høyre nyre eksponert og holdt mellom tengene langs den vertikale aksen. Ved å benytte en nr.15 skalpell, ble nyren kuttet horisontalt til en dybde på 3 mm. For å forsikre en jevn dybde av skaden ble nyren holdt forsiktig i midten for å ekspnere likt ved begge sider av tengene. Den eksponerte overflaten av nyrer ble kuttet til dybden av tengene. Blodtap ble kvantifisert som beskrevet over. Ulike doser av FVIII ble testet på mus for åkarakteriseredoseresponssammenhengen av FVIII på nyreblødning. PEGylert PEG2 viser sammenlignbar potens til BDD ved å redusere blodtap etter musenyreskade (figur 25). Derfor, selv om koagulasjonsaktiviteten av PEGylert PEG2 er lavere enn den til BDD, viser denne nyreriftmodellen at in vivo-effekten av PEGylert PEG2 ikke var målbart redusert sammenlignet med BDD, konsistent med mikromogeniske assaydata.

Antistoff inhiberingsassay.

Tilførsel av en høymolekylær vektpolymer slik som polyetylenglykol (PEG) spesifikt ved posisjon 491 (det vil si PEG2) skulle redusere binding og sensitivitet til mAB 413, og i utstrakt betydning til en stor andel av pasientinhibitoriske antistoff siden mange pasienter utvikler inhibitoriske antistoff rettet mot det samme mAB413-epitopen. For å teste dette ble økende mengder av mAB413 inkubert med umettede mengder (0.003 IU/ml) av BDD eller 43 kD PEGylert PEG2 og testet for funksjonell aktivitet i et kromogenisk assay (figur 26). R8B12, et ikke-inhibitorisk antistoff, og ESH4, et inhibitorisk antistoff som retter seg mot C2-domene ble benyttet som kontroller.

PEGylert PEG2 er faktisk mer resistent til mAB 413-inhibisjon enn BDD og viser et likt inhibisjonsmønster i nærvær av kontrollantistoffer som ikke binder nær 491-posisjonen. Videre er beskyttelseseffekten av PEG mot mAB413-inhibering avhengig av PEG-størrelse, med større PEG’er er effekten større (figur 27). For å teste hvorvidt PEGylert FVIII er mer resistent til inhibitoriske antistoff fra pasienter, var kromogenisk aktivitet målt i nærvær av et panel av plasma derivert fra hemofilia A-pasienter som har utviklet inhibitorer mot FVIII. Av de 8 pasientplasmaene testet var 43 kD PEGylert PEG2 mer resistent til pasientplasmainhibering enn BDD i 4 pasientplasmaprøver. For eksempel viste PEGylert PEG2, PEG6 eller PEG2+6 større gjenværende aktivitet enn BDD i en pasientplasma men ikke i en annen plasma (figur 28). diPEGylert PEG2+6 ser ut til å være mer resistent enn monoPEGylert PEG2 eller PEG6. Disse resultatene foreslår at PEGylert PEG-muteiner kan være mer effektive i å behandle pasienter som utvikler inhibitorer mot FVIII.

Høy gjennomløps pegyleringsscreening.

PEGyleringseffektivitet av et spesielt PEGmutein er uforutsigbar, spesielt siden det ikke er noen direkte strukturell informasjon av BDD. For eksempel basert på strukturmodellen av BDD ville man anslå pegyleringseffekt av PEG4 og PEG5 skulle være veldig høy, lik den til PEG2 og PEG15 siden alle tre posisjonene er overflateeksponert og peker utover ifølge strukturen. Derfor vil det å benytte PEG for å søke for nye utskytingsmekanismer via systematisk PEGylering kreve at et stort antall av muteiner må screenes.

For raskt å screene et stort antall PEG-muteiner, har en ny høy gjenomstrømningsfremgangsmåte blitt utviklet som kan teste PEGyleringseffektivitet og funksjonell aktivitet av PEGylerte produkter fra transienttransfekterte muteiner. Så lite som 5-10 ml av transientuttrykte PEG-muteiner med en FVIII til homogenisk verdi så lav som 0.1-0.2 IU/ml er konsentrert ved ca 50 ganger ved å benytte Amicon-centra Ultra device MWCO 30K slik at konsentrasjonen av FVIII når over 1 nM, nær affinitetsrekkeviden av antistoff til FVIII-interaksjon. Det konsentrerte PEG-muteinet (~ 300 µL) er inkubert med ~ 30 µL av C7F7 FVIII-antistoffresin over natt ved 4ºC, vasket, eluert, dialysert og redusert. Reduktanten er fjernet og de reduserte PEG-muteinene er PEGylert og kjørt på en Westernanalyse som beskrevet over (figurene 29 og 30). Relativ PEGyleringseffektivitet av transientuttrykte PEG-muteiner matcher eksakt til det av rensede PEG-muteiner.

Dusinvis av PEG-muteiner kan bli screenet ved denne fremgangsmåten iløpet av 1 til 2 måneder. For eksempel hadde PEG14 (K1804C BDD) minst ca 80% PEGylering av lettkjede med et 12 kD PEG og ingen PEGylering av tungkjede (data ikke vist), noe som er konsistent med at K1804C-mutasjonen er lokalisert på den lette kjeden. C? til C?-distanse mellom K1804 og K1808 (PEG6-posisjon) er kun 8.4 angstrøm basert på BDD-strukturen, noe som foreslår at introduksjonen av en 43 kD PEG ved denne posisjonen har en gitt forbedring i PK som 33 kD PEGylert PEG6, med fordelen av mye høyere PEGyleringsutbytte. Relativ PEGyleringsutbytte for alle PEG-muteiner testet er oppsummert i tabell 8. PEGylering var høyt selektivt for den bestemte FVIII-kjeden hvor cysteinmutasjonen var introdusert, det at hver mutein med cysteinet i den tunge kjeden kun fikk PEGylert på den tunge kjeden mens hver mutein med cysteinet i den lette kjeden ble PEGylert på den lette kjeden. Muteinnr. 2-31 representerer cysteinmutasjoner i BDD som erstatter den native aminosyren ved posisjonen listet med et cystein. PEG2+6 er et dobbeltmutein av BDD hvor posisjon 491 og 1808 ble erstattet med cysteiner. A1 og A2, (og B-domene for KG-2, fullengde FVIII) tilhører tungkjeden mens A3, C1 og C2 tilhører den lette kjeden. PEGyleringseffektivitet ble estimert fra kjøring av de PEGylerte produktene på en SDS PAGE som sammenligner intensiteten av de PEGylerte båndene med UPEGylerte bånd: ++ ~ <80% PEGyleringsutbytte, + ~30-70% utbytte, ~ 10-30% utbytte og ~ <10% utbytte.

Tabell 8. PEGyleringseffektivitet for ulike PEGylerte FVIII.

Massespektrometrianalyse av reduserte PEGmuteiner.

For å bestemme identiteten av den ”kappen” som forebygger direkte PEGylering av PEG-muteiner eller fullengde FVIII, var PEG2+14 redusert med TCEP ved konsentrasjoner som strekker seg fra 67 µM til 670 µM. PEGyleringsutbytte økte i samsvar med økende mengder av TCEP (figur 31). De samme prøvene ble også analysert ved massespektrometri før PEGylering (figur 32). For å ha et proteindomene som kunne bli direkte studert, ble prøvene fordøyd med trombin ved en ratio på 20 enheter/mg FVIII i 30 minutter ved 37ºC. Trombinkløyving produserer et A2-fragment som inkluderer residuene 372 til 740 og ingen okkuperte glykosyleringsseter. Den fordøyde prøven ble injisert på et C4-reversfasevæskekromatografisystem og eluenten fra kolonnen ble introdusert direkte på det kvadropole flytidspunktet massespektrometer via en elektrospraygrenseflate. Massespektrumet fra under den kromatografiske toppen kan korrespondere til A2-domene ble opprullet for å gi en intakt proteinmasseverdi. Før reduksjonen ga A2-domenet av PEG2+14 en masse som er 118 dalton større enn teoretisk anslått. Ettersom TCEP-konsentrasjonen er økt, dukker det frem en ny topp som har den presise anslåtte massen på A2-domene. Andelen av denne nye toppen øker etter hvert som TCEP-konsentrasjonen er økt. 118 dalton forskjellen kan bli redegjort for ved cysteinilering av residue cis 491 via disulfiddannelse med et cystein (119 Da) og instrumentell nøyaktighet. Derfor viser dette at PEG-muteiner er kappet ved et cystein som forhindrer direkte PEGylering.

Alle av referansene redegjort for heri er herved inkorporert heri i deres helhet.

Claims (1)

1. Patentkrav

   1.

   Et konjugat som har faktor VIII prokoagulant aktivitet, karakterisert ved et funksjonelt faktor VIII polypeptid kovalent festet ved en eller flere predefinerte seter på polypeptidet til en eller flere biokompatible polymerer, k a r a k t e r i -s e r t v e d at det predefinerte setet ikke er et N-terminalt amin.

   2.

   Konjugatet i krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at det biokompatible polymere omfatter polyetylenglykol.

   3.

   Konjugatet i krav 2, k a r a k t e r i s e r t v e d at polyetylenglykol omfatter metoksypolyetylenglykol.

   4.

   Konjugatet i krav 3, k a r a k t e r i s e r t v e d at metoksypolyetylenglykol har en størrelsesrekkevidde fra 5 kD til 64 kD.

   5.

   Konjugatet i krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at det biokompatible polymeret er kovalent festet til det funksjonelle faktor VIII-polypeptidet ved en aminosyreresidu i eller nær (a) et bindingssete for en faktor VIII-utskillelsesreseptor, (b) bindingssete for en protease som er i stand til å degradere faktor VIII og/eller (c) et bindingssete for faktor VIII-inhibitoriske antistoffer.

   6.

   Konjugatet i krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at det biokompatible polymeret er kovalent festet på det predefinerte setet på det funksjonelle faktor VIII-polypeptidet slik at binding av lavtetthetlipoproteinreseptorrelatert protein til polypeptidet er mindre enn til polypeptidet når det ikke er konjugert.

   7.

   Konjugatet i krav 6, k a r a k t e r i s e r t v e d at binding av lavtetthetlipoproteinreseptorrelatert protein til konjugatet er mer enn to ganger mindre enn bindingen til polypeptidet når det ikke er konjugert.

   Konjugatet i krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at den biokompatible polymeren er kovalent festet på det predefinerte setet på det funksjonelle faktor VIII-polypeptidet slik at binding av heparansulfat proteoglykaner til polypeptidet er mindre enn til polypeptidet når det ikke er konjugert.

   9.

   Konjugatet i krav 8, k a r a k t e r i s e r t v e d at binding av heparinsulfat proteoglykaner til konjugatet er mer enn to ganger mindre enn bindingen til polypeptidet når det ikke er konjugert.

   10.

   Konjugatet i krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at den biokompatible polymeren er kovalent festet på det predefinerte setet på det funksjonelle faktor VIII-polypeptidet slik at binding av faktor VIII inhibitoriske antistoffer til polypeptidet er mindre enn til polypeptidet når det ikke er konjugert.

   11.

   Konjugatet i krav 10, k a r a k t e r i s e r t v e d at binding av faktor VIII inhibitoriske antistoffer til konjugatet er mer enn to ganger mindre enn bindingen til polypeptidet når det ikke er konjugert.

   12.

   Konjugatet i krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at den biokompatible polymeren er kovalent festet på det predefinerte setet på det funksjonelle faktor VIII-polypeptidet slik at binding av lavtetthet lipoproteinreseptor til polypeptidet er mindre enn til polypeptidet når det ikke er konjugert.

   13.

   Konjugatet i krav 12, k a r a k t e r i s e r t v e d at binding av lavtetthetlipoproteinreseptor til konjugatet er mer enn to ganger mindre enn bindingen til polypeptidet når det ikke er konjugert.

   14.

   Konjugatet i krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at den biokompatible polymeren er kovalent festet på det predefinerte setet på den funksjonelle faktor VIII-polypeptidet slik at en plasmaprotease degraderer polypeptidet mindre enn når polypeptidet ikke er konjugert.

   15.

   Konjugatet i krav 14, k a r a k t e r i s e r t v e d at degraderingen av polypeptidet ved plasmaproteasen er mer enn to ganger mindre enn degraderingen av polypeptidet når det ikke er konjugert og målt under de samme betingelser over den samme tidsperioden.

   16.

   Konjugatet i krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at den biokompatible polymeren er kovalent festet til polypeptidet ved en av faktor VIII aminosyreposisjoner 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 og 2284.

   17.

   Konjugatet i krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at den biokompatible polymeren er kovalent festet til polypeptidet ved en eller flere av faktor VIII-aminosyreposisjoner 377, 378, 468, 491, 504, 556, 1795, 1796, 1803, 1804, 1810, 1864, 1903, 1911 og 2284 og videre karakterisert ved at (1) bindingen av konjugatet til lavtetthetlipoproteinreseptorrelatert protein er mindre enn bindingen av det ukonjugerte polypeptidet til lavtetthet lipoproteinreseptorrelaterte proteiner; (2) bindingen av konjugatet til lavtetthetlipoproteinreseptor er mindre enn bindingen av det ukonjugerte polypeptidet til lavtetthetlipoproteinreseptorer; eller (3) bindingen av konjugatet til både lavtetthetlipoproteinreseptorrelatert protein og lavtetthetlipoproteinreseptor er mindre enn bindingen av det ukonjugerte polypeptidet til det lavtetthetlipoproteinreseptorrelaterte proteinet og lavtetthetlipoproteinreseptoren.

   18.

   Konjugatet i krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at den biokompatible polymeren er kovalent festet til polypeptidet ved en eller flere av faktor VIII aminosyreposisjoner 377, 378, 468, 491, 504, 556 og 711 og videre karakterisert ved at bindingen av konjugatet til heparinsulfatproteoglykan er mindre enn bindingen av det ukonjugerte polypeptidet til heparinsulfatproteoglykan.

   Konjugatet i krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at den biokompatible polymeren er kovalent festet til polypeptidet med en eller flere av faktor VIII-aminosyreposisjoner 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1903, 1911, 2091, 2118 og 2284 og konjugatet har mindre binding til faktor VIII-inhibitoriske antistoffer enn ukonjugert polypeptid.

   20.

   Konjugatet i krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at den biokompatible polymeren er kovalent festet til polypeptidet ved en eller flere av faktor VIII-aminosyreposisjoner 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1903, 1911, 2091, 2118 og 2284 og konjugatet har mindre degradering fra en plasmaprotease i stand til å degradere faktor VIII enn det ukonjugerte polypeptidet.

   21.

   Konjugatet i krav 20, k a r a k t e r i s e r t v e d at plasmaproteasen er aktivert protein C.

   22.

   Konjugatet i krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at det funksjonelle faktor VIII-polypeptidet er B-domenedeletert faktor VIII.

   23.

   Konjugatet i krav 22, k a r a k t e r i s e r t v e d at den biokompatible polymeren er kovalent festet til B-domenedeletert faktor VIII ved aminosyreposisjon 129, 491, 1804 og/eller 1808.

   24.

   Konjugatet i krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at den biokompatible polymeren er festet til polypeptidet ved faktor VIII-aminosyreposisjon 1804 og omfatter polyetylenglykol.

   25.

   Konjugatet i krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at en eller flere predefinerte seter for bikompatibel polymert feste er kontrollert ved setespeisifikk cysteinmutasjon.

   Fremgangsmåte for fremstilling av konjugatet i krav 1, k a r a k t e r i -s e r t v e d å:

   - mutere en nukleotidsekvens som koder for det funksjonelle faktor VIII-polypeptidet for å erstatte en kodende sekvens for et cysteinresidue ved et predefinert sete;

   - uttrykke den muterte nukleotidsekvensen for å produsere et cysteinforsterket mutein;

   - rense muteinet;

   - la muteinet reagere med den biokompatible polymeren som har blitt aktivert for å reagere med polypeptider ved hovedsakelig kun reduserte cysteinresiduer slik at konjugatet er dannet; og

   - rense konjugatet.

   27.

   Fremgangsmåte i krav 26, k a r a k t e r i s e r t v e d at den biokompatible polymeren omfatter polyetylenglykol.

   28.

   Fremgangsmåte i krav 27, k a r a k t e r i s e r t v e d at polyetylenglykol er aktivert ved tilsettingen av en maleimidgruppe som kan reagere spesifikt til cysteiner i proteiner.

   29.

   Farmasøytisk sammensetning for parenteral administrasjon, k a r a k -t e r i s e r t v e d en terapeutisk effektiv mengde av konjugatet i krav 1 og et farmasøytisk aksepterbart hjelpemiddel.

   30.

   Fremgangsmåte for behandling av hemofilia, k a r a k t e r i s e r t v e d å administrere til en pasient i behov derav en effektiv mengde av sammensetningen i krav 29.

   31.

   Fremgangsmåte for setedirigert PEGylering av et faktor VIII-mutein, k a r -a k t e r i s e r t v e d at:

   (a) uttrykke et setedirigert faktor VIII-mutein hvori muteinet har en cysteinerstatning for en aminosyreresidue på den eksponerte overflaten av faktor VIII-muteinet og at cysteinet er kappet;

   (b) kontakte cysteinmuteinet med en reduktant under betingelser for mildt å redusere cysteinmuteinet og å frigjøre kappen;

   (c) fjerne kappen og reduktanten fra cysteinmuteinet; og

   (d) ved minst ca 5 min. etter fjerning av reduktanten å behandle cysteinmuteinet med PEG som består av en sulfidryl koblingsenhet under betingelser slik at PEGylert faktor VIII-mutein er produsert.

   32.

   Fremgangsmåte i krav 31, k a r a k t e r i s e r t v e d trinnene (c) kappen og reduktanten er fjernet fra cysteinmuteinet ved størrelsesutestegning eller ioneutbyttingskromatografi.

   33.

   Fremgangsmåte i krav 31, k a r a k t e r i s e r t v e d at faktor VIII-muteinet er et mutein av B-domene deletert faktor VIII.

   34.

   Fremgangsmåte i krav 31, k a r a k t e r i s e r t v e d at PEG-meleimid har en størrelsesrekkevidde fra 5 kD til 64 kD.

   35.

   Fremgangsmåte i krav 31, k a r a k t e r i s e r t v e d at sulfydrylenheten av PEG er selektert fra gruppen bestående av tiol, triflat, tricylat, aziridin, oksiran. S-pyridyl og maleimidenheter.