NO329791B1 - Transposon-mediert multipleks sekvensering - Google Patents

Description

OPPFINNELSESOMRÅDE

Den foreliggende oppfinnelse angår en automatisert fremgangsmåte for transposon-mediert multipleks sekvensering av DNA-fragmenter innsatt i en vektor. Den angår mer spesielt økt effektivitet i slike automatiserte metoder, når den økte effektiviteten er oppnådd ved å selektere før sekvensering de konstruktene hvor transposonet er innsatt i vektorsekvensen. Ved dette unngår man sløseri av tid og ressurser som sekvensering av vektoren istedenfor det aktuelle DNA-fragmentet innebærer.

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Den enorme mengde informasjon som har blitt oppnådd gjennom genomisk og "expressed sequence tag" (EST) sekvensering de siste 10 år har vært et betydelig bidrag til å klone fullengde-cDNA. Selv om det er forventet at de genomiske sekvenseringspro-sjekter på menneske og mus vil bli fullført i nær fremtid, så vil transkriptomet for disse artene forbli usikre for en tid. Vanskeligheter med å forutsi med sikkerhet splice-programmet for mRNA-genomiske sekvenser har tvunget frem ytterligere genomisk forsk-ning som fokuserer på å oppnå sekvensen til fullengde-cDNA. I tillegg er fullengde-DNA-sekvensering også nødvendig for å bekrefte cDNA-sekvenser oppnådd ved amplifisering av cDNA i kloningsforsøk. Dette scenario er spesielt vanlig ved genomiske sentre som fokuserer på validering av gentargets ved utvikling av nye legemidler. Det er åpenbart at etter store utgifter og anstrengelser, så er det hensiktsløst at valideringsprosessen feiler for et mulig target kun fordi den kodende sekvens av target-genet var ukorrekt. Av denne grunn er det nødvendig med tilnærminger ved genomiske sentre som gjør det mulig å sekvensere store antall av fullengdekloner raskt, billig og presist. Til dette formål har søkerne oppfunnet en ny, integrert high-throughput-prosess kalt "transposon expedited multiplex sequencing" (TEMS).

I de siste tjue år har mange fremgangsmåter blitt utviklet for sekvensering av store inserts i plasmider. Mange av disse fremgangsmåtene var imidlertid tungvinte og kunne ikke overføres til high-throughput-automatiserte systemer. Sekvensering ved primer walking er sakte, dyr og mislykkes ofte fordi primerne er designet til sekvensen i en dårligkarakterisertregion. På samme måte er sekvensering ved å danne en samling av kloner ved eksonuklease-behandling av endene til targetklonen sakte, klonspesifikk og ekstremt sensitiv i forhold til renheten og integriteten av templat-DNA'et. I tillegg er suksessraten for denne tilnærmingen meget variabel. Shotgun-sekvensering av kloner er en high-throughput-metode, men den krever isolering av insersjoner fra hver klon og så rekloning av mindre fragmenter generert ved forskjellige metoder. I tillegg resulterer shotgunbibliotek som utnytter restriksjonskutting i en klonskjevhet og senere en ikke-randomisert distribusjon av DNA-sekvensdata.

Transposon-mediert sekvensering kan bli gjort ved å samle et stort antall vektorer inneholdende target DNA-sekvenser, og tilfeldig innsette et transposon med sekvenserings-primere på hver ende inn i konstruktet. Se Devine, S.E., Boeke, J.E. (1994) Efficient integration of artificial transposons into plasmid targets in vitro: a useful tool for DNA mapping, sequencing andgenetic analysis, Nucleic Acis Research, s. 3765-3772; eller Kimmel, B., M.J. Palazzola, C, Martin, J.D. Boeke og S.E. Devine, 1997, Transposon-mediated DNA sequencing. In Genomic Analysis: A laboratory manual (ed. E. Green, B. Birren, R. Myers og P. Hieter), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., for en beskrivelse av fremgangsmåten. Tradisjonelt har denne metoden vært besværlig ettersom den krever flytting av plasmider gjennom forskjellige verts-organismer for kloning og transposon-innsettingstrinnet. Flere kommersielle moleky-lærbiologileverandører har imidlertid nylig utviklet in vitro transposisjonssystemer for å utnytte random insersjon av modifiserte transposons (for eksempel Tn5 etc). Uheldig-vis gir noen av disse systemene en høy bakgrunn av falske positive og er vanskelige å bruke sammen med fremgangsmåter for screening av positive kloner ved polymerase chain reaction ("PCR"). Oppfinnerne har utnyttet flere av disse transposon-baserte sek-venseringsmetodene og har ikke opplevd noen av disse problemene med en modifisert versjon av in vitro GPS-1 transposisjonssytemet fra New England Biolabs. Transposon-insersjoner kan imidlertid ikke bli rettet utelukkende mot det aktuelle target DNA og dukker opp i vektoren med høy frekvens. I et forsøk på å løse dette problemet og øke effektiviteten av transposon-fasilitert sekvensering, har oppfinnerne utviklet en unik high-throughtput-prosedyre kalt "transposon expedited multiplex sequencing" (TEMS).

IWO 9837205 A beskrives en fremstilling av et transposabelt system som enkelt og effektivt kan inkorporeres i et hvert tilfeldig sete av et hvert DNA fragment. Dette systemet er frembrakt ved en mutasjon i en transposons-drevet ATP-trengende regulatorisk protein. Mutasjonen forårsaker reduksjon i i mål-spesifikk insersjon av villtype transposon.

W09746714 A er rettet mot en metode for overvåking av DNA-hybridisering under PCR ved å observere fluorescence signaler som et resultat av hybrididering. Denne metoden omfatter kvantifisering av fluorescence signaler fira dsDNA-fargestoffer eller spesifikke hybridiserende prober.

Hensikten med den foreliggende oppfinnelsen er følgelig å fremskaffe en high-throughput, effektiv og rimelig prosess for sekvensering av DNA-fragmenter.

Det er videre en hensikt med den foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en high-throughput, effektiv og rimelig prosess for transposon-mediert sekvensering av target DNA-fragmenter som minimaliserer dannelsen av non-target DNA-sekvenser. Det er også hensikten med denne oppfinnelsen å fremskaffe en PCR-basert seleksjon for å skille mellom de ønskede konstrukter med transposons innsatt i target DNA-sekvensen, og de uønskede konstrukter med transposons innsatt andre plasser.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelsen møter de nevnte hensiktene ved å frembringe den føl-gende metode, som kan bli automatisert for større anvendelighet. Multiple DNA-target-sekvenser, hver av dem klonet inn i en vektor, er samlet og selektive transposons med sekvenseringsprimers på hver side er innsatt tilfeldig i den DNA-target-inneholdende vektoren. Selekterte transposon- og DNA-target-sekvensinneholdende vektorer er så individuelt gjennomsøkt ved å anvende en PCR-reaksjon for å identifisere de vektorer som har transposons lokalisert i DNA-targetsekvensen. I PCR-reaksjonen anvendes primers lokalisert ved hver ende av vektorsekvensen og den er optimalisert til å gi tilstrekkelig ekstensjonstid slik at PCR-polymerasen effektivt kan produsere et produkt på lengde med vektoren, men samtidig utilstrekkelig ekstensjonstid til at PCR-polymerasen effektivt kan produsere et produkt med lengde tilsvarende vektoren pluss transposonet. Av denne grunn vil betydelige mengder av PCR-produkt bare bli produsert for vektorer inneholdende transposons i DNA-targetsekvensen og ikke i selve vektoren. Tilstedeværelsen eller fraværet av en signifikant mengde av PCR-produkt for hver PCR-reaksjon kan raskt bli bestemt ved bruk av et kvantitativt fluorescent fargemiddel selektivt for dobbeltrådet DNA ("dsDNA"). Vektorer bestemt ved en betydelig mengde PCR-produkt i den første seleksjonen er så individuelt sekvensert ved å benytte sekvenserings-primerne på hver side av transposonet for å avlese hver DNA-targetsekvens. Den rå DNA-targetsekvensen av hver individuelle sekvenseringsreaksjon kan bli kombinert for å bestemme hele sekvensen av hvert DNA-target i samlingen.

Parallellprosessering av kloner øker hastigheten som reaksjoner kan bli satt opp og sekvensert betydelig. I tillegg er ikke prosessen avhengig av noen spesiell vektor og krever ikke noen omkloningstrinn. Det viktigste for den generelle effektivitet er at sekvense ring av vektorstammen er minimalisert eller eliminert ved seleksjonstrinnet. Automati-sering av hvert trinn i prosessen kan enkelt oppnås ved å anvende utstyr tilgjengelig for de som er kyndig i automatisert DNA-sekvensering.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for parallell, transposon-mediert sekvensering av DNA, kjennetegnet ved at den omfatter: i) frembringelsen av én eller flere target DNA-sekvenser, hver innsatt i en

vektor i et insersjonssete;

ii) amplifisering av hver target DNA-inneholdende vektor og samling av dem,

hvori hver target DNA-sekvens er representert i samlingen i en vesentlig lik mengde per kb;

iii) eksponering av samlingen av target DNA-inneholdende vektorer til et selek-terbart transposon, hvori det selekterbare transposonet integrerer inn i de target DNA-inneholdende vektorene i vesentlig vilkårlige seter for å danne en samling av target DNA- og transposon-inneholdende vektorer;

iv) transformering av celler med samlingen av target DNA- og transposon-inneholdende vektorer og isolering og vekst av et representativt antall av individuelle transformanter i kulturer under selektive betingelser;

v) utførelse av en polymerase-kjedereaksjon på DNA fra hver kultur,karakterisert vedat polymerase-kjedereaksjonen bruker et primer-par komplementært til 3'-endene av vektorsekvensen ved insersjonssetet og har en ekstensjonstid i løpet av reaksjonssyklus tilstrekkelig til å effektivt produsere en fullengde-kopi av vektorsekvensen, men for kort til effektivt å produsere en fullenge-kopi av vektorsekvensen med transposonet innsatt;

vi) måling av mengde DNA produsert i hver polymerase-kjedereaksjon; og

vii) sekvensering av de transposonflankerte regionene av de target DNA-inneholdende vektorene fira de kulturene tilsvarende til polymerase-kjedereaksjo-nene som produserte vesentlige mengder av DNA.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 er et diagram over trinnene i TEMS.

Figur 2 viser sekvensen til GPS-Apra transposonvektor.

Figur 3 viser sekvensen til GPS-Apra-2um-URA3 transposonvektor.

Figur 4 er et bilde av en farget elektroforesegel for å vise produktene av PCR-reaksjoner hvor forskjellige polymeraser er anvendt til å multiplisere vektordelen av de transposon-og target-DNA-inneholdende vektorer. Figur 5 er et bilde av en farget elektroforesegel for å vise produktene av PCR-reaksjoner som har for lang ekstensjonstid til å eliminere et tilnærmelsesvis 9 kb-produkt. Figur 6 er et bilde av en farget elektroforesegel for å vise produktene av PCR-reaksjoner ved forskjellige ekstensjonstemperaturer og forskjellige antall sykler. Figur 7 er et bilde av en farget elektroforesegel for å vise produktene av PCR-reaksjoner og en tabell av POCOGREEN®-resultater for de samme PCR-reaksjonene.

DEFINISJONER

Som brukt her:

En "vektor" er en hvilken som helst DNA-konstruksjon som replikerer i en celle og har et insersjonspunkt hvor ukjente DNA-sekvenser kan bli innsatt.

"Selekterbar" i forbindelse med en vektor eller et transposon betyr at vektoren eller transposonet er en fenotype som kan bli brukt til å identifisere celler transformert med vektoren eller transposonet. Fortrinnsvis skal fenotypen tillate de transformerte cellene å overleve under forhold hvor de ikke-transformerte cellene ikke overlever.

Et "target DNA" eller "target DNA-sekvens" er et DNA-molekyl av kjent eller ukjent sekvens som anvenderen av metoden ønsker å sekvensere.

Et "representativt antall av individuelle transformanter" er det minimale antall individuelle transformanter som sikrer at for hvert target DNA i samlingen, så vil det være et tilstrekkelig antall av transformanter inneholdende transposon-insersjoner i dette target DNA, for å frembringe det ønskede antall uavhengige sekvensbestemmelser av hver base i dette target DNA.

"Vesentlige mengder av dsDNA" i forhold til PCR-produkter er en mengde dsDNA som overskrider en forhåndsbestemt terskelverdi. Den forhåndsbestemte terskelverdi kan bli bestemt ved å evaluere PCR-produktenes variabilitet funnet i PCR-reaksjoner med flere konstrukter som er kjent å inneholde transposonet innenfor eller utenfor vektorsekvensen.

DETALJERT BESKRIVELSE AV DE FORETRUKNE UTFØRELSESFORMER

Den foreliggende oppfinnelse er en metode som effektivt kan bli automatisert for sekvensering av multiple target DNA i parallell. I fremgangsmåten er hver target DNA-sekvens innsatt i en selekterbar vektor, fortrinnsvis et plasmid, på identiske insersjonspunk-ter i vektorsekvensen. Det er viktig at alle target DNAer er innsatt i den samme vektor eller, hvis forskjellige vektorer er benyttet, at hver vektor er av vesentlig samme stør-relse og har identiske sekvenser rundt insersjonspunktet slik at ett sett av primers kan bli brukt til å amplifisere alle vektorene ved PCR-reaksjon.

Vektorene inneholdende hver av de multiple target DNA-sekvensene, er samlet i forhold basert på lengden av hver target DNA-sekvens, slik at samlingen inneholder hovedsakelig like mengder av hver kb, for hver target DNA-sekvens. Forhold av hver vektor som inkluderes i samlingen kan bli bestemt ved å avgjøre lengden av hver target DNA-sekvens (for eksempel ved elektroforese mot standard størrelsesmarkører på agarosegel), og legge til samlingen en gitt mengde av hver vektor for hver kb-parlengde av target DNA-sekvensen i den vektoren.

En transposon-insersjonsreaksjon er så utført på samlingen for å tilfeldig sette inn et se-lekterbart transposon inn i de target DNA-inneholdende vektorer. Selvom dette trinnet kan bli utført ved tradisjonell, in vivo, transposon-insersjon, så vil dette kreve at plasmi-det måtte flyttes gjennom mer enn én celletype. In v/Vro-transposon-insersjonsreaksjoner er enklere og raskere. Transposonet må bære en selekterbar markør og må være av tilstrekkelig størrelse til å muliggjøre bestemmelsen av PCR-betingelser som effektivt multipliserer et dsDNA-fragment på størrelse med vektoren, men hvor ingen signifikant multiplikasjon av et dsDNA-fragment på størrelse med vektoren pluss transposonet foregår. Fortrinnsvis er transposonets lengde omtrent lik eller større enn vektorlengden. Det er mer foretrukket at transposonet er likt eller større enn 5/4 av vektorlengden. Det er særlig foretrukket at transposonet er likt eller større enn 5/3 av vektorlengde. Hvis vektoren er et bakterielt plasmid så er det foretrukket at transposonet er minst omtrent 3 kb, mer foretrukket at det er minst omtrent 4 kb og særlig foretrukket at det er større eller likt med omtrent 5 kb.

Samlingen av vektorer fra transposon-insersjonsreaksjonen er så benyttet til å transfor-mere celler og transformantene er dyrket under betingelser som selekterer for transposonet. Selekterte transformanter er isolert og dyrket til kulturer. Antallet av isolerte transformanter som danner kulturer avhenger av antallet på størrelsen av target DNA-sekvensen i samlingen. Tilstrekkelige transformanter må bli isolert og dyrket for å sikre at for hver target DNA-sekvens, så vil de isolerte transformantene inkludere nok individuelle insersjoner av transposonet i den aktuelle target DNA-sekvensen, for å sikre fler-foldige uavhengige sekvensdetermineringer av hver eneste base i denne DNA-sekvensen. For å sikre mot feil, så vil de kyndige i feltet ofte søke å oppnå en seksdobbel dekning av sekvensdata, skjønt de kan velge mer eller mindre hvis situasjonen krever det. Når man prøver å oppnå seksdobbel dekning så vil, som en generell tommerfingerregel, 18 kloner være nødvendig å være sekvensert per 1 kb av nukleotider for å oppnå denne teknikken. For å faktisk sekvensere 18 kloner så må imidlertid et stort antall transformanter være isolert og dyrket fordi transposonet vil ikke ha integrert inn i target DNA'et i hvert eneste tilfell, men vil være vilkårlig innsatt over hele den target DNA-inneholdende vektor. Derfor er nummeret 18 multiplisert med sannsynligheten for at transposonet ble innsatt i target DNA-sekvensen. For å oppnå 6 dobbel sekvenserings-dekning, må for hver target DNA-sekvens i samlingen antallet transformanter isolert være lik med: lengden av target DNA-sekvensen i kb ganger 18, ganger forholdet (stør-relse av vektor)/(størrelse av DNA-targetsekvensen).

Hver kultur fira en selektert transformant får utført en PCR-reaksjon på sitt DNA. PCR-reaksjonen bruker primere komplementære til 3' enden av vektorsekvensen ved innser-sjonspunktet, som tillater PCR-multiplisering av et fragment på størrelse med hele vektorsekvensen. Reaksjonsbetingelsene for PCR-reaksjonen er optimalisert for å effektivt produsere et fragment på lengde med vektoren, men ikke effektivt produsere et fragment på lengden av vektoren pluss transposonet. Optimaliseringen av PCR-betingelser for en hvilken som helst vektor og transposon-kombinasjon i henhold til denne oppfinnelsen kan bli bestemt av en kyndig i feltet gjennom rutineeksperimenteringer, veiledet i referansearbeider som Kimmel, B., M.J. Palazzola, C. Martin, J.D. Boeke og S.E. Devine, 1997, Optimizing PCR Assays, Methods for Improving PCR, Detecting and Characterizing PCR products, Protocols for Detecting and Characterizing PCR Products. In Genomic Analysis: A laboratory manual (ed. E. Green, B. Birren, R. Myers og P. Hieter), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; og Cha, R.S. og Thilly, W.G. (1995) i: PCR Primer, Dieffenbach, C.W. og Dveksler, G.S. (eds), CSH Press, New York. Generelt er elongeringstemperaturen og/eller PCR-tid variert for å oppnå den ønskede eksklusjonen av produkter på lengde med vektor pluss transposon. For en demonstrasjon av optimalisering, se eksempel 2.

Mengden av produkt produsert i hver PCR-reaksjon er så målt, fortrinnsvis optisk. Optisk måling kan bli gjort ved en hvilken som helst metode som skiller dsDNA fra nukleotider, men er fortrinnsvis utført ved å anvende et fluorescent fargestoff spesifikt for dsDNA. dsDNA-spesifikke fargestoffer innbefatter bis-benzimid-fargestoffet Hoechst 33528 og cyaninfargestoffene fra Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, inkludert PICOGREEN®. PICOGREEN® er foretrukket pga. dens sensitivitet og selek-tivitet for dsDNA. Den målte fluorescensverdien er sammenlignet med en forhåndsbestemt terskelverdi for å bestemme hvorvidt en signifikant mengde av dsDNA-PCR-produkt er til stede. Fluorescensterskelverdien er bestemt eksperimentelt ved å bruke positive og negative kontroll-PCR-templater på størrelse med vektoren alene og vektoren pluss transposonet under de samme PCR-betingelser som vil bli brukt til å screene de isolerte transformantene.

De transformantene som tilsvarer de PCR-reaksjonene som ikke produserer vesentlige

mengder av dsDNA er ikke sekvensert fordi de inneholder transposonet i vektorsekvensen. Transformanter tilsvarende PCR-reaksjoner som produserer vesentlige mengder av dsDNA inneholder transposonet i target DNA-sekvensen og er sekvensert. To sekvense-ringsreaksjoner er utført for hver transformant ved å bruke primerere fra hver ende av transposonet for å lese sekvensen av target DNA-sekvensen som omgir transposonet. Sekvenseringsreaksjon kan bli utført ved alle de kjente metodene innen faget.

Når sekvensdata har blitt samlet fra alle transformantene som ble plukket ut i PCR-screen, så må alle sekvensene bli samlet i alle de individuelle elementene i samlingen av target DNA-sekvenser. Dette kan bli oppnådd ved computersekvensanalysemetoder kjent innen feltet.

Fordelene med den hurtige metoden er hastighet, effektivitet og muligheten til å auto-matisere prosessen. Den hurtige metoden fremskaffer spesielt en rask PCR-screen som tillater eliminering av de uproduktive transformantene som har transposonet innsatt i vektorsekvensen og vil hovedsakelig gi vektorsekvenser hvis sekvensert. PCR-screen er rask, kan bli automatisert og krever ikke noen isolering av PCR-produktet, slik som kjø-ring av agarosegel for å bestemme dets størrelse. Anvendelsen av en samling av target DNA muliggjør gjennomføringen av en enkel transposon-reaksjon og en enkel transfor-masjon, i stedet for en reaksjon for hver target DNA-sekvens.

EKSEMPLER

Eksempel 1 - Valg av et transposon for en high- throughput- screeningprosess

Original transposon fra New England Biolabs

Genom-primingsystemkitet fra New England Biolabs, 32 Tozer Road, Beverly MA 01915 ("NEB") ble initielt brukt til å bevise at et transposon innsatt vilkårlig inn i en DNA-sekvens kunne være en effektiv måte å helsekvensere targetsekvensene med en stor grad av nøyaktighet. Kitet var forsynt med én av to transposons som inneholdt kanamycin-resistensgenet. Kanamycin er imidlertid en nokså vanlig resistensmarkør, og hvis en target DNA-sekvens allerede var klonet inn i en kanamycin-selekterbar vektor, så ville enten et annet transposon eller omkloning av target DNA-sekvensen være nød-vendig. Kitet var forsynt med et annet transposon som inneholdt kloramfenikol-resi-stensmarkøren, men også denne er nokså vanlig. Av denne grunn burde transposonet være modifisert til å inneholde en uvanlig resistensmarkør, slik som apramycin, for å unngå ekstra kloningstrinn og redusere menneskelig feil ved valg av det rette transposon for hvert DNA-target. GPS-Apra-transposonet (figur 2) var konstruert ved å modifisere NEB pGPSl-transposonet.

Screeningmetode for anvendelse av det modifiserte transposonet, GPS-Apra

Innledende forsøk viste at en screeningprosess kunne identifisere fra transformanter selektert for transposonet transformantene inneholdende transposonet i target DNA-sekvensen og ikke i vektoren. Dette reduserer kostnader ved å eliminere uproduktive sek-venseringer av vektorsekvensen. Det originale NEB pGPSl-transposonet var 2614 kb med~1,7 kb av det, med priming-seter på hver ende innsatt vilkårlig i target DNA'et. Ved PCR-amplifisering av 3,0 kg-vektoren ved å bruke komplementerende M13F og komplementerende M13R-primere, så kunne to distinkte PCR-produkter bli visualisert på en slab-gel. Et 3,0 kb PCR-produkt indikerte at transposonet måtte være i target DNA-sekvensen, siden vektoren er 3,0 kb. Et 4,7 kb PCR-produkt indikerte en vektor (3,0 kb) inneholdende transposonet (1,7 kb). Av denne grunn kunne kloner inneholdende transposonet i target DNA-sekvensen bli identifisert ved tilstedeværelsen av 3,0 kb PCR-produkter på gelen.

For å vise identifikasjon av kloner inneholdende transposonet i insertet, så ble kolonier selektert fra transformasjonen etter transposon-reaksjonen og inokulert i media inneholdende begge antibiotika for seleksjon, apramycing og plasmidantibiotikum. Kulturen ble dyrket over natten og PCR ble gjort den følgende dagen ved å legge til ca. 1 ul kultur i en PCR-cocktail i en 96 brønners plate. PCR-cocktailen innbefattet amplitaq-enzymet og reagenser fra PE Corporation, PE Corporation, 761 Main Avenue, Norwald, CT 06859. PCR-betingelsene var standard {95° i 5 minutter, (95° i 30 sekunder, 54° i 1 minutt, 72° i 6 minutter, 30 sykler), 72° i 1 minutt, 4° for alltid}. Etter ferdiggjøring av sykelen (ca. 2,5 timer) ble gelelektroforese utført ved å bruke 8 ul av den 50 ul store PCR-reaksjonen på en standard størrelse gel. Det var klart detekterbar størrelsesforskjell mellom PCR-produktene fra vektorsekvens uten transposonet og vektorsekvens med transposonet.

For å vedlikeholde en high-throughput for sekvenseringsreaksjonen, måtte elektroforese imidlertid skje på store geler som kunne ta hundrevis av prøver på samme tid. På disse store gelene ville forskjellen mellom et 3 kb og et 4,7 kb fragment være vanskelige å de-tektere reproduserbart med et automatisert system. Gelelektroforese ville også være meget tidskrevende og ville interferere med utførelsen av screen på en high-throughput-måte.

I søken etter andre high-throughputmetoder, så falt man på fluorescentdeteksjon av dsDNA som reproduserbart og mindre tidskrevende. PICOGREEN® assayet virket særlig passende. Fluorescentdeteksjon av dsDNA kan imidlertid ikke skille mellom fragmenter av forskjellig størrelse, så PCR-reaksjonen måtte bli endret slik at tilstedeværelsen eller fraværet av noe PCR-produktet indikerte transposonets posisjon i den target DNA-inneholdende vektor. Hvis noen kloner med transposonet i target DNA-sekvensen produserte et dsDNA PCR-produkt, så ville PICOGREEN® dsDNA-fargestoffet fluore-scere på et høyt nivå bare for de ønskede klonene. Brønnen som inneholder transposonet i vektoren ville ikke amplifisere et signifikant dsDNA-produkt og ville resultere i et lavt nivå av fluorescens. Et cutoff-nivå for fluorescens mellom ønskede og uønskede kloner kan bli bestemt ved å benytte kjente prøver.

Flere PCR-betingelser ble testet ved å senke elongeringstemperaturen, men 4,7 kb-båndet ville ikke falle ut konsekvent uten å få en økning i falske positive. Det ble bestemt at hvis transposonet igjen kunne bli modifisert for å drastisk øke dets størrelse, så kunne PCR-betingelser bli utviklet som konsekvent ville miste det øvre transposon-innehol dende båndet, og derved minske raten av falske positive. Et stort "fyll"-gen som ikke ville innvirke på transposonreaksjonen på noen negativ måte, ble søkt. Et 2 um plasmid fra gjær med URA3-genet, møtte størrelseskriteriet og kunne også bli brukt i gjærekspe-rimenter i fremtiden. Av denne grunn ble et GPS-Apra-2 um-URA-3 transposonplasmid (figur 3) konstruert som hadde en total størrelse på 6,1 kb, inkludert transposonet på~5,0 kb. PCR-betingelsene ble endret med hell slik at klonene med transposonet i vektoren falt ut og transposisjonsreaksjonen ikke ble påvirket. Se eksempel 2.

Eksempel 2 - Optimalisering av PCR- betingelser for å redusere falske negative og falske positive resultater

GRUNNLEGGENDE PCR-BEGREP

Denne screen er basert på PCR-sykelbetingelser som har blitt spesifikt optimalisert for å amplifisere et 3,9 kbp-fragment av hele vektor DNA. I dette tilfelle var vektoren PCR4Blunt-TOPO fra Invitrogen, 1600 Faraday Ave3, Carlsbad, CA 92008. Hvis vektoren har 5 kbp transposonet innsatt så vil størrelsen øke til 8,9 kbp, som er for stort til å bli amplifisert med de optimaliserte PCR-betingelsene.

Primersekvensene utvalgt til å amplifisere vektordelen av klonene er de komplementære sekvensene av de universale primerne M13F(-20) og M13R. Sekvensene er som følger: 5 '-ACTGGCCGTCGTTTTAC-3' og 5 '-CATGGTCATAGCTGTT-3'. Denne amplifi-kasjonen er illustrert i figur 1.

BAKGRUNN FOR UTVIKLINGEN AV 384-BRØNNS FORMATET

For å screene transposonreaksjoner fira samlinger som inneholder multiple kloner så var det nødvendig å utvikle en screen som var både rask og kosteffektiv. Innledende utvik-lingsforsøk var basert på 96-brønners protokollen. For å endre til en 384-brønners plate, ble alle reagensvolumer halvert for å passe til de mindre brønnenes volum. Disse betingelsene viste seg å være mindre ideelle grunnet det høye antallet av PCR-feil som ble observert. Et søk etter PCR-reagenser og betingelser som var mer robuste for dette format ble foretatt. Resultatene av eksperimenter som testet en lang rekke enzymer og ter-mosykelbetingelser vil bli beskrevet i de følgende avsnitt.

384-BRØNNERS PCR-OPTMALISERINGSPROSESS

Polymeraseseleksjon

En rask screening av en rekke PCR-kit fra forskjellige leverandører ble gjort for å finne en 384-brønners erstatning for PE Corporation AmpliTaq-polymerasen som hadde blitt brukt i 96-brønners formatet. De følgende PCR-kits ble testet: Clontechs Advantage Cdna pcr-KIT, Epicentres Failsafe PCR-system og tre kits fira Takara; LA Taq, Ex Taq og Z Taq. (Clontech Laboratories Inc. holder til på 1020 East Meadow Circle Palo Alto, CA 94303-4230; Epicentre Technologies er lokalisert i 1402 Emil Street, Madison, WI 53713; og Takara Shuzo Co., LTD har forretningsadressen Biomedical Group Seta 3-4-1, Otsu, Shiga, 520-2193, Japan.) Prøvene testet representerte 30 oppsamlede DNA-targets. De ble klonet inn i pBluescript SK-(3,0kb) fra Stratagene , 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037. Dyrkningstiden var 20 timer i 384-brønners format. Basert på preliminære data ble Z-taq-systemet valgt som enzymet å fortsette med pga. egenskaper den hadde som gjorde den ideell for bruk i high-throughput-systemer som TEMS. Se figur 4, som viser en farget elektroforesegel hvor PCR-produkter fira prøvene har blitt kjørt.

Reagensoptimalisering

Det var også ønskelig å minske kostnadene per reaksjon i PCR-screen. Tabell 2, som vist nedenfor, oppsummerer de forskjellige eksperimentene som ble gjort for å teste den mengde som hvert av reagensene kunne bli senket med, uten å gå på akkord med resultatene.

Tabell 2. Tabellen 2 oppsummerer de forskjellige PCR-cocktailingrediensene som ble testet i optimaliseringsprosessen.

Basert på de nevnte eksperimentene ble den følgende optimaliserte reaksjons-cocktail-miksen (per prøve) bestemt: ddH20: 17,875 ul

10xZ-Taq-buffer: 2,5 ul

dNTP-miks: 1,5 ul

templat DNA: 1 ul (tilsatt ved å bruke en Kerplunker # 96/384, produsert av Nalge Nunc International, 75 Panorama Creek Drive, Rochester, NY 14625 og Pin Replicator # 250520/250393)

Z-Taq DNA-polymerase: 0,125 ul (0,3125 enheter)

cM13f(5 pmol/ul): 1 ul

cM13r(5 pmol/ul): 1 ulO,

Optimalisering av termosyklerbetingelser

Termosyklerbetingelser brukt innledningsvis var basert på anbefalinger funnet i Takara-litteraturen. Disse betingelsene var:

1. denaturering: 98°C i 5 sekunder

2. annealing: 55°C i 10 sekunder

3. ekstensjon: 72°C i 60 sekunder (15,4 sekunder/kb)

4. gå til 1, 30 repetisjoner

5. 4°C frem til evaluering av PCR-reaksjon.

Resultatene av å bruke disse betingelsene er vist i figur 2. Fra disse dataene ble det bestemt at annealing-temperaturen skulle reduseres for å forsøke å minske reaksjonsspesi-fisiteten og dermed øke antall av positive som ble amplifisert. I det neste eksperimentet ble annealing-temperaturen satt ned til 52°C. Selv om dette hjalp på det generelle reak-sjonsresultatet, så ble det oppdaget at ved å bruke en ekstensjonstid på 15,4 sekunder per kbp, resulterte i amplifikasjon en av vektor inneholdende transposoninsersjon. Se figur 5, som viser en farget elektroforesegel hvor PCR-produkter fra 47 transformanter selektert etter transposoninsersjon i target DNA-inneholdende pBluescript-SK- og dyrket i 20 timer i brønner til en 384 brønners plate er kjørt. Tilstedeværelsen av et 9 kbp- bånd, som er trodd å være det amplifiserte produktet av vektor inneholdende transposonet, er resultatet av en overdreven ekstensjonstid.

I tillegg ble en annealing-temperaturgradient mellom 48°C og 68°C testet for å bekreftet at 52°C faktisk var den optimale temperaturen for bruk i denne PCR. I det samme eksperimentet ble antall sykler også testet. 30, 35, 40 og 45 sykler ble testet. På bakgrunn av resultatene fra dette eksperimentet ble det bestemt at antall sykler må holdes lavt for å unngå bakgrunnsstøy. På bakgrunn av 48°C- og 36°C-gradienten, ble 52°C annealing-temperatur igjen konfirmert som optimal. Temperaturen er ikke for lav til at den blir non-spesifikk, og ikke for høy til å risikere at man nærmer seg temperaturen 56°C, hvor PCR begynner å feile. Disse resultatene er vist i figur 6, et bilde av en farget elektroforesegel, hvor hvert avbildet produkt representerer amplifikasjon av kontroll pBluescript SK-vektoren med 2,5 ng per brønn, i et 384 brønners format med 25 ul PCR-cocktailvo-lum. Basert på ovenstående data, ble termosyklerbetingelsene fastsatt til å yte optimalt ved å bruke den følgende syklus.

1. denaturering: 98°C i 5 sekunder

2. anneal: 52°C i 10 sekunder

3. ekstensjon: 72°C i 30 sekunder (7,7 sekunder/kb)

4. gå til 1, 35 repetisjoner

5. 4°C inntil evaluering av PCR-reaksjon.

Siden fordamping ble funnet å være et problem i 384 brønners platene, så ble gummi "P" pakninger fira MJ Research, 590 Lincoln Street, Waltham, MA 02451, plassert over forseglede plater før termosyklingen begynte. Med dette, som anbefalt av produsenten, ble lokktemperaturen satt til 85°C.

Tabell 3. Oppsummering av PCR-termosyklerbetingelser som ble testet under optimaliseringen.

SCREENING AV POSITIVE KLONER VED ANVENDELSE AV

dsDNA-KVANTIVISERING-REAGENSET PICOGREEN®

For å omgå den arbeidsintensive oppgaven å kjøre gelelektroforese, så benyttes dsDNA-kvantiviseringsreagenset PICOGREEN® i TEMS PCR-screen. PICOGREEN® er for-tynnet til en arbeidsfortynning til 1:150 i lx TE-buffer. Denne fortynningen ble funnet å være optimal, selv om den er litt mer konsentrert enn 1:200 fortynningen anbefalt i pro-dusentens protokoll. 25 (il per brønn av 1:150 PICOGREEN® er alikvotert i sorte 384-brønners plater ved å bruke en Robbins Hydra 96 Dispenser fra Robbins Scientific, 1250 Elko Drive, Sunnyvale, CA 94089-2213. 5 ul per brønn av hver PCR-reaksjon er så lagt til PICOGREEN®, igjen ved å benytte Hydra-disperseren. Platen er så umiddelbart satt inn i en Molecular Dynamics Gemini fluorescensplateleser og platen er så blandet i 10 sekunder før dets fluorescenssignal er målt.

For at assayet skal fungere som en screen, så må det være en klar forskjell i fluorescenssignal mellom positive og negative brønner. PCR-produktmengder på 1,3, 2,5, 5 og 10 ul ble testet for å fastsette den største assay-rekkevidden av positivt signal til bakgrunn. Resulter som viser at 5 ul av PCR-produkt i 25 ul PICOGREEN® er den optimale be-tingelsen å anvende er vist i tabell 4. Signalene generert av fluorescensleseren er så eksportert til en histogramfremviser og en cutoff-verdi for positive kloner er utpekt på grunnlag av histogrammet. Ved å anvende de aktuelle betingelsene så vil cutoff-verdien generelt falle mellom 1000 og 1500.

En Genesis RSP 150 TECAN robotics-stasjon (TECAN U.S. INC., P.O.Box 13953, Research Triangle Park, NC 27709) ble benyttet for å generere 96 dyp-brønnsplater inneholdende celler fra kloner identifisert av screenen til å ha transposonet i target DNA-sekvensen. Celler fra hver positive klon er lagt i Superbroth og de egnede antibiotika (dobbelseleksjon) i én av brønnene. Disse platene er dyrket og kulturene er så underlagt automatisert sekvensering.

EKSEMPEL PÅ DEN OPTIMALISERTE PCR-SCREEN-TEKNIKKEN FOR 384-BRØNNERS PLATER

Bruk Q-Bot for å plukke kolonier av de transposon-inneholdende klonene til Genetix 384-brønners grunne brønnplater inneholdende 65 ul per brønn av Superbroth pluss egnet antibiotikum. Sett platene i en humidifsert 37°C inkubator i 19 - 22 timer. Alikvoter 25 ul per brønn av sterilt 50% glycerol på vekstplatene ved å bruke en Multidrop 384 115V liquid dispenser (Labsystems In., 8 East Forge Parkway, Franklin MA 02038). Sett opp PCR ved å bruke glycerolplaten som templat ved å bruke den følgende oppskriften:

<*>For å sikre at Kerplunkeren er steril, så bør den bli oppbevart i 70% etanol og flambert før bruk.

Sett PCR-reaksjonsplaten inn i en termosykler og start den følgende syklus:

Total syklustid: 1 time, 18 minutter, 30 sekunder.

Mens reaksjonen er underveis, tin PICOGREEN®-reagenset ved romtemperatur.

Forbered l:150-fortynning av PICOGREEN® i 1 x TE-buffer. Forbered 10 ml per 384-brønners plate. Bruk Robbins Hydra for å alikvotere 25 (il per brønn til en hel 384-brøn-ners sort plate. Bruk Robbins Hydra for å fordele 5 ul per brønn av PCR-reaksjonen på PICOGREEN®-platen. Plassér platen umiddelbart inn i fluorescensplateleseren og bland ved å riste i 10 sekunder. Eksporter fluorescenssignaldata til en floppy-disk. Im-porter data inn i en Excel-makro og generer en rearray-liste av positive kloner ved å bruke 1500 som terskel. Se figur 7 for et eksempel på endelig PICOGREEN®-data oppnådd fra en PCR-screen. Åpne rearray-listen i TECAN-roboten og rearray-kloner fra glycerol-stokkplaten på en 96-brønners dypbrønn plate inneholdende Superbroth og egnede antibiotika. Etter at platene har blitt inkubert så er kulturene i dem sekvensert i en automatisert prosess.

Eksempel 3 - Transposonfremskvndet multiplekssekvensering av ukjente sekvenser i vektoren PCR4Blunt- TOPO

TRANSPOSONRE AKSJON

Transposonreaksjonen ble utført ved å benytte Genom primingsystemet (GPS)-kitet fra New England BioLabs. Alle bestanddelene av kitet ble brukt med unntak av transposonet GPS1. Transposonet benyttet var en modifisert versjon av GPS1. To variasjoner ble laget. I én variant, pGPS-Apra, er den eksisterende resistensmarkøren byttet ut med apramycin-resistensgenet. Dette var gjort for å sikre at vektoren kunne bli benyttet for å sekvensere en hvilken som helst vektor uten hensyn til resistensmarkør. I en annen variant, pGPS-Apra-Y2um, ble en "stuffer"-region inneholdende gjær2um replikasjons-originet klonet inn i transposonet for derved å øke dets størrelse til 5 kb (figur 6). Denne endringen ble gjort for å bedre effektiviteten av prosessen ved å screene ut transposisjo-ner inn i vektor-backbone. Reaksjonen ble utført ved elektroporering av DH10B E. coli kompetente celler og platet på Luria-Bertani (1,0% bacto-trypton, 0,5% bacto-gjærekstrakt, 1,0% NaCl, pH 7,0) agarplater inneholdende de dertil egnede antibiotika (apra mycin (100 ug/ml)/kanamycin (50 ug/ml)) for seleksjon av kloner som rommer transposonet. Vekstperoden er 20 til 22 timer.

TEMS (Transposon Expedited Multiplex Sequencing)

Størrelsen av alle target DNA-sekvenser underlagt TEMS ble evaluert ved restriksjonskutting av de target DNA-inneholdende vektorene med Noti. Plasmidsett inneholdende target DNA-sekvenser av varierende størrelser i samme vektor-backbone ble samlet. Ekvimolare konsentrasjoner ble kalkulrt for hver target DNA-sekvens før samlingen. Transposonreaksjonen ble utført ved å behandle de samlede DNA-templatene som ett enkelt templat. For å seksdoble dekning av hver base for hver target DNA-sekvens, så ble totalstørrelsen for hver target DNA-sekvens multiplisert med vår standardfaktor på 18 kloner per 1 kb sekvens for å bestemme antall av vilkårlig selekterte kloner som skal sekvenseres. Basert på den totale størrelsen av vektoren og den totale størrelsen av target DNA-sekvensen, så ble sannsynligheten for lokaliseringen av transposoninsersjon kalkulert. Ved å multiplisere denne faktoren med antallet kloner for seksdobbel dekning bestemmer man hvor mange kloner som må vilkårlig selekteres og underlagt PCR-screen.

Det kalkulerte antall kolonier ble utvalgt og inokulert i Superbroth (baco-trypton, gjærekstrakt, NaCl, NaOH) medium inneholdende egnede antibiotika på 96 eller 384 brøn-ners kulturplater. Disse kulturplatene ble dyrket over natten uten risting i 18 til 22 timer, avhengig av formatet på vekstplaten (96/384 brønners). Glycerol-stocks ble laget for midlertidig lagring av platen. 50% glycerol ble lagt til direkte i platen og blandet. Dette muliggjorde uendelig lagring ved -80°C.

UTSCREENING AV VEKTORINSERSJONER VED PCR

Primersekvensen utvalgt til å amplifisere vektordelen av klonene til screening var de komplementære sekvensene av de universale primerne M13F(-20) og M13R. Sekvensen er som følger: 5' -ACTGGCCGTCGTTTTAC-3' og 5' -CATGGTCATAGCTGTT-3'. Kultur-PCR ble satt sammen med de følgende betingelser: templatet ble avlevert til PCR-reaksjons-reagenstilberedningen ved å bruke en "pin replicator tool" som alikvo-terte omtrent 1 ul. 196 brønners-formatet besto 10x PCR-bufferen av 100 mM Tris-HCl pH 8,3; 500 mM KC1; 15 mM MgC12; 0,01% vekt/volum gelatin. Fem picomol av forward primer og 5 pmol av revers primer ble brukt i hver reaksjon. dNTP-konsentra-sjonen i reaksjonen var 2,5 mM endelig konsentrasjon. Mengden Taq-polymerase lagt til hver reaksjon var 0,1 units. Alle reaksjoner ble utført i et totalvolum på 50 ul. 384 brønnersformat PCR ble gjort i et totalt volum på 25 ul ved å bruke TaKaRa Z-Taq-kit fra Panvera Corporation, 545 Science Drive, Madison, WI53711. Dette kit består av Z-taq-polymerase (2,5 enheter/ ul), 10x Z-Taq-buffer inneholdende en 30 mM konsentrasjon på Mg2+ og en dNTP-miks (2,5 mM av hver). Termosyklene ble kjørt med var-met lokk (MJ Research). Denne PCR-syklus var designet til å amplifisere bare vektoren uten transposonet pga. den korte elongeringstiden. Sorte PCR-plater ble brukt slik at fluorescensanalyse senere kunne bli utført direkte i platene.

ANALYSEBETINGELSER VED ANVENDELSE AV PICOGREEN®

Ved ferdiggjøring av PCR så ble 25 ul av PICOGREEN® tilsatt PCR-platen. 50 ul av en 1:200 PICOGREEN®-fortynning i lx TE (tris-acetat, EDTA)-buffer ble blandet med 10 (il av PCR-reaksjonen. Platen ble lest i et spektrofluorometer hvor molekylene ble eksitert ved 480 nm og signalet emittert ved 540 nm. PCR-produktene som fluorescerte over en forhåndsbestemt terskel var de positive klonene som skulle sekvenseres. Ter-skelen ble eksperimentelt bestemt ved å bruke kjente konstrukter inneholdende transposonet enten i vektoren eller i et insert til vektoren. De positive klonene ble sortert og komprimert i et format egnet for array med en TECAN robotarm. Glycerol-stocks ble inokulert i den 96 brønners dype platen inneholdende 1,5 ml av Superbroth (bacto-trypton, gjærekstrakt, NaCl, 5N NaOH) og egnede antibiotika. Disse kulturene ble dyrket i en 24 timers periode og DNA-targets fra kulturen ble så sekvensert ved å benytte primerne ved begge ender av transposonet.

SEKVENSSAMMENSETNING

Etter vektortrimming og base-calling av råsekvensene ved å bruke Phred software, så ble sekvensene satt sammen ved å benytte Phrap software (se Brent Ewing, LaDeana Hillier, Michael C. Wendl og Phil Green. Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. 1998. Genome Research 8: 175-185 og Brent Ewing og Phil Green Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. 1998. Genome Research 8: 186-194). Kriteriene for ferdigstillelse er høy kvalitet, seksdobbel dekning av hele fullengde-genet. Den forventede feilraten per 10 kb sekvens bør være < 0,1. Hvis disse kriteriene ikke er oppfylt er primere utvalgt sammen med templater for primer walking-sekvensering av den feilutsatte delen av target DNA-sekvensen. Primer walking-sekvensering er utført med ABI 310 sekvenseringsmaskin eller ved high-throughput-sekvensering med ABI 3700 avhengig av det nødvendige sekvenseringsvolum, og disse sekvensene er deretter lagt til sammenstillingen. BLAST-analyse er gjort for sammenligning spesielt for kjente gener.

(Se: Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J.Moi. Biol. 215:403 - 410; Gish, W. & States, D.J. (1993) "Identification of protein coding regions by database similarity search". Nature Genet. 3: 266-272; Madden, T.L., Tatusov, R.L. & Zahng, J. (1996) "Applications fo network BLAST server" Meth. Enzymol. 266: 131-141; Altschul, S.F., Madden, T.L., Schåffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z,., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs". Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; og Zhang, J. & Madden, T.L. (1997)"PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation". Genome Res. 7: 649-656. Den genererte fullengdesekvensen er importert

inn i et annet sammenstillingsprogram kalt Sequencher. (Se Cash, H., Clark, B., Galt, J., Garb, C, Goebel III, C.J., & Singer, J. Sequencher User Guide " The complete Software Solution for Sequencing DNA". Gene Codes Corporation. 1999.) Med dette programmet er det lett å se åpne leserammer for å være sikker på at eventuelle mutasjoner ikke har

forårsaket et fram shift.

Claims (16)

1. En fremgangsmåte for parallell, transposon-mediert sekvensering av DNA,karakterisert vedat den omfatter: i) frembringelsen av én eller flere target DNA-sekvenser, hver innsatt i en vektor i et insersjonssete; ii) amplifisering av hver target DNA-inneholdende vektor og samling av dem, hvori hver target DNA-sekvens er representert i samlingen i en vesentlig lik mengde per kb; iii) eksponering av samlingen av target DNA-inneholdende vektorer til et selek-terbart transposon, hvori det selekterbare transposonet integrerer inn i de target DNA-inneholdende vektorene i vesentlig vilkårlige seter for å danne en samling av target DNA- og transposon-inneholdende vektorer; iv) transformering av celler med samlingen av target DNA- og transposon-inneholdende vektorer og isolering og vekst av et representativt antall av individuelle transformanter i kulturer under selektive betingelser; v) utførelse av en polymerase-kjedereaksjon på DNA fra hver kultur,karakterisertved at polymerase-kjedereaksjonen bruker et primer-par komplementært til 3'-endene av vektorsekvensen ved insersjonssetet og har en ekstensjonstid i løpet av reaksjonssyklus tilstrekkelig til å effektivt produsere en fullengde-kopi av vektorsekvensen, men for kort til effektivt å produsere en fullenge-kopi av vektorsekvensen med transposonet innsatt; vi) måling av mengde DNA produsert i hver polymerase-kjedereaksjon; og vii) sekvensering av de transposonflankerte regionene av de target DNA-inneholdende vektorene fra de kulturene tilsvarende til polymerase-kjedereaksjo-nene som produserte vesentlige mengder av DNA.

2. Fremgangsmåten ifølge krav 1,karakterisert vedat ett eller flere av trinnene i) til vii) er automatisert.

3. Fremgangsmåten ifølge krav 1,karakterisert vedat trinnet for måling av mengde DNA produsert i hver polymerase-kjedereaksjon omfatter tilsettelsen av et fluorescent fargestoff selektivt for dsDNA til den fullførte polymerase-kjedereaksjon og måling av den resulterende mengde fluorescens.

4. Fremgangsmåten ifølge krav 3,karakterisert vedat én eller flere av trinnene i) til vii) er automatisert.

5. Fremgangsmåten ifølge krav 3,karakterisert vedat det fluorescerende fargestoffet selektivt for dsDNA er valgt fra gruppen omfattende PICOGREEN® og bisbenzimid-fargestoffer.

6. Fremgangsmåten ifølge krav 3,karakterisert vedat det fluorescerende fargestoffet selektivt for dsDNA er PICOGREEN®.

7. Fremgangsmåten ifølge krav 1,karakterisert vedat vektoren og transposonet bærer forskjellige selekterbare markører.

8. Fremgangsmåten ifølge krav 1,karakterisert vedat transposonet er minst 3 kb.

9. Fremgangsmåten ifølge krav 8,karakterisert vedat transposonet er minst 4 kb.

10. Fremgangsmåten ifølge krav 9,karakterisert vedat transposonet er GPS-Apra-2um-URA3.

11. Fremgangsmåten ifølge krav 8,karakterisert vedat transposonet er minst 5 kb.

12. Fremgangsmåten ifølge krav 1,karakterisert vedat transposonet er likt med eller større enn vektoren i lengde.

13. Fremgangsmåten ifølge krav 12,karakterisert vedat transposonet er minst omtrent 5/4 av lengden til vektoren.

14. Fremgangsmåten ifølge krav 13,karakterisert vedat transposonet er omtrent 5 kb og at vektoren er omtrent 4 kb.

15. Fremgangsmåten ifølge krav 12,karakterisert vedat transposonet er minst omtrent 5/3 av lengden til vektoren.

16. Fremgangsmåten ifølge krav 15,karakterisert vedat transposonet er omtrent 5 kb og at vektoren er omtrent 3 kb.