NO321621B1 - Colchinolderivater og fremgangsmate for fremstiling derav, samt farmasoytisk sammensetning - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører Colchinolderivater og fremgangsmåte for fremstilling derav, samt farmasøytisk sammensetning.

Dannelse av ny vaskulatur ved angiogenese er et viktig patologisk trekk ved flere sykdommer (J. Folkman, New England Journal of Medicine 333,1757 (1995). For eksempel, for at en fast tumor skal vokse må den utvikle egen blodtilførsel som den er helt avhengig av for tilveiebringing av oksygen og næringsstoffer. Dersom denne blod-tilførselen blir mekanisk avbrutt gjennomgår tumoren nektrotisk død. Neovaskularisering er også et klinisk trekk ved hudlesjoner i psoriasis, invasiv pannus i ledd til pasienter med leddgikt og aterosklerotiske plakk. Retinal neovaskularisering er patologisk ved makulær degenerasjon og ved diabetisk retinopati. I alle disse sykdommene er det antatt at reversering av neovaskularisering ved skading av nylig dannet vaskulært endotelium antas å ha en fordelaktig terpeutisk effekt

Colchinolderivater, for eksempel N-acetyl-colchinol, er kjent. Anti-tumoreffekter er blitt oppdaget i dyremodeller (se for eksempel -JNCI (Journal National Cancer Institute)

s. 379-392 1952, vol. 13). Effekten som ble studert var store skader (blødninger, bløt-gjøring og nekrose) og det er ingen forslag på behandling av uhensiktsmessig angiogenese ved ødeleggelse av neovaskulaturen.

En undersøkelse i Chemical Abstracts (post 1955) basert på substrukturen

viste et antall colchinolrelaterte strukturer.

I den grad noen av disse forbindelsene er blitt studert for anti-cancer aktivitet skyldes dette at tubulinbindingsmidlene kan ventes å være anti-mitotiske og derfor ha en direkte virkning på tumorcellene.

I løpet av arbeidet med foreliggende oppfinnelse var temaet som omfatter relevansen av tubulin-bindende egenskaper som mulig effektivitet som anti-vaskulært middel studert, men ingen forutsigbarhet ble funnet. Docetaksel (Lancet, 344,1267-1271,1994) som er et tubulin-bindende middel, hadde ingen vaskulær-skadende effekter selv når administrert ved maksimalt tolerert dose. Selv når foreliggende oppfinnere testet noen forbindelser strukturelt relatert til foreliggende oppfinnelse, ble det terapeutiske vinduet (forholdet mellom MTD (Maksiamalt tolerert dose) og MED (minimal effektiv dose)) funnet å være for lite for potensiell klinisk effektivitet.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt forbindelse, kjennetegnet ved at den har formel I:

hvor:

Ri, R2, Ra og Re er hver uavhengig H, PO3H2, cykloalkyl, (1-7C)alkyl eller (1-7C)alkanoyl, idet (1-7C)alkylgruppen eventuelt bærer en eller flere substituenter valgt fra hydroksy, karboksyl og metoksykarbonyl;

X er karbonyl (CO), metylen (CH2) eller en gruppe CHFL,;

R4 er OH, 0-(1-7C)alkyl eller NR8R9;

R5 og R7 er hver uavhengig H, (1-7C)alkoksy eller nitro;

Re er H, (1-7C)alkyt, cykloalkyl, (1-7C)alkanoyl, fenyl, fenylkarbonyl, benzyloksykarbonyl, (1-7C)alkoksykarbonyl, aminokarbonyl, (1-7C)alkylaminokarbonyl,

di-[(1 -7C)alkyl]aminokarbonyl, fenylaminokarbonyl, (1 -7C)alkylsulfonyl, fenylsulfonyl, aminosulfonyl, (1-7C)alkylaminosulfonyl, eller

di[(1-7C) alkyijaminosulfonyl,

og hvori en hvilken som helst (l-7C)alkyl eller (1-7C)alkanoylgruppe i R8 eventuelt bærer en eller flere sustituenter valgt fra halogen, amino, mono(1-7C)alkylamino, di[(1-7C)alkyl]amino, hydroksy og karboksyl;

og hvor en hvilken som helst fenylring i R8 eventuelt bærer en eller flere substituenter valgt fra halogen;

og R9 er H eller (1-7C)alkyl;

og hvor minst en av R1f R2, R3 og R6er PO3H2;

eller et farmasøytisk akseptabelt salt, solvat eller hydrat derav.

Det antas, til tross for at dette ikke er begrensende for oppfinnelsen, at anvendelse av forbindelsen ifølge oppfinnelsen skader nylig-dannet vaskulatur, for eksempel vaskulaturen til tumorer, som dermed effektivt reverserer prosessen av angiogenese sammenlignet med kjente anti-angiogeniske midler som pleier å være mindre effektive når vaskulaturen først er blitt dannet.

Visse av disse forbindelsene er nye. I en utførelsesform utgjør de nye forbindelsene forbindelser med formel I hvor R6 er P03H2, eller et farmasøytisk akseptabelt salt, solvat eller hydrat derav.

I en spesielt foretrukket utførelsesform er Ri, R2 og R3 alkyl og R4 er acylamino, eller et farmasøytisk akseptabelt salt, solvat eller hydrat derav.

Spesielt foretrukket er forbindelser definert ved formelen

hvori

Ri, R2. og R3 hver er uavhengig H, eller (1-7C)alkyl;

R6 er PO3H2;

R4 er NR8R9;

R5 og R7 er H, (1-7C)alkoksy eller nitro;

R8 er H, (1-7C)alkyl, cykloalkyl, (1-7C)alkanoyl, fenyl, fenylkarbonyl, benzyloksykarbonyl, (1-7C)akoksykarbonyl, aminokarbonyl, (1-7C)alkylaminokarbonyl, di-[(1-7C)alkyl]aminokarbonyl, fenylaminokarbonyl, (1-7C)alkylsulfonyl, fenylsulfonyl, aminosulfonyl, (1-7C)alkylaminosulfonyl eller di-[(1-7C)alkylaminosulfonyl,

hvor en hvilken som helst (1-7C)alkyl eller (1-7C)alkanoyl gruppe i Re eventuelt bærer en eller flere substituenter valgt fra halogen, amino, mono-(1-7C)alkylamino, di-[(1-7C)alkyl]amino, hydroksy og karboksyl,

og hvor en hvilken som helst fenylring i R<8> eventuelt bærer en eller flere substituenter valgt fra halogen;

og R9 er H eller (1-7C)alkyl;

eller et farmasøytisk akseptabelt salt, solvat eller hydrat derav.

I et annet aspekt av oppfinnelsen har de nye forbindelsene formelen

hvori

Ri, R2, og R3 hver er uavhengig H eller (1-7C)alkyl,

R6 er H, P03H2, cykloalkyl eller (1-7C)alkyl, idet (1-7C)alkyl gruppen eventuelt bærer en eller flere substituenter valgt fra hydroksy, karboksyl og metoksykarbonyl;

R4 er H eller NR9R9;

R5 og R7 er hver uavhengig H eller nitro;

Re er H, (1-7C)alkyl, cykloalkyl, (1-7C)alkanoyl, fenyl, fenylkarbonyl, benzyloksykarbonyl, (1-7C)alkoksykarbonyl, aminokarbonyl, (1-7C)alkylaminokarbonyl, di-[(1-7C)alkyl]aminokarbonyl, fenylaminokarbonyl, (1-7C)alkylsulfonyl, fenylsulfonyl, aminosulfonyl, (1-7C)alkylaminosulfonyl eller di-[(1-7C)alkylaminosulfonyl.

og hvor en hvilken som helst (1-7C)alkyl eller (1-7C)alkanoyl gruppe i R8 eventuelt bærer en eller flere substituenter valgt fra halogen, amino, mono-(1-7C)alkylamino, di-[1-7C)alkyl]amino, hydroksy og karboksyl,

og hvor en hvilken som helst fenylring i R8 eventuelt bærer en eller flere

substituenter valgt fra halogen;

og Rg er H eller (1-7C)aikyl med den forutsetningen at når Ri, R2 og R3 alle er metylgrupper og R4 er hydrogen, acetylamino, amino, metylamino eller dimetylamino er R6 ikke hydrogen, metyl eller hydroksyetyl;

eller et farmasøytisk akseptabelt salt, solvat eller hydrat derav.

Foretrukne forbindelser anvendt ifølge oppfinnelsen er de hvori Ri, R2 og R3 er

hver (1-7C)alkyl, eller et farmasøytisk akseptabelt salt, solvat eller hydrat derav.

Som anvendt heri betyr betegnelsen "alkyl" (inkludert en hvilken som helst alifatisk strukturkjede relatert til alkyl) en lineær elter forgrenet gruppe inneholdende fra 1-7, fortrinnsvis maksimalt 4, karbonatomer så som metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl, sec-butyl, t-butyl og pentyl. Eventuelle substituenter som kan være tilstede på alkyl-gruppene innbefatter en eller flere substituenter valgt fra halogen, amino, monoalkyi-amino, dialkylamino, hydroksy, alkopksy, alkyltio, alkylsulfonyl, acylamino, alkoksy-karbonylamino, alkanoyl, acyloksy, karboksyl, sulfat eller fosfatgrupper.

Eksempler på alkoksygrupper er metoksy, etoksy, propoksy, isopropoksy, butoksy og t-butoksy. Betegnelsen "halogen" betyr fluor, klor, brom eller iod.

En alkenylgruppe er en olefinisk gruppe inneholdende fra 2-7 karbonatomer for eksempel metylen, etylen, n-propylen, i-propylen, n-butylen, i-butylen, s-butylen og t-butylen. En alkynylgruppe er en gruppe med 2-7 karbonatomer for eksempel etynyl, propynyl eller butynylgruppe.

Betegnelsen aryl alene eller i kombinasjon betyr en usubstituert fenylgruppe eller en fenylgruppe som bærer en eller flere, fortrinnsvis en til tre, substituenter for eksempel utgjør halogen, alkyl, halogenalkyl, hydroksy, nitro, cyano, amino og alkoksy. En halogenalkylgruppe kan være en eller flere halogenatomer hvor eksempler på slike grupper utgjør trifluormetyl og diklormetyi.

Betegnelsen heteroaryl definert heri som en mono- eller bicyklisk aromatisk gruppe inneholdende 1-4 heteroatomer valgt i en hvilken som helst kombinasjon fra N, S eller O atomer og maksimalt 9 karbonatomer. Eksempler på heteroarylgrupper innbefatter pyridyl, pyrimidyl, furyl, tienyl, pyrrolyl, pyrazolyl, indolyl, benzofuryl, benzotienyl, benzotiazolyl, oksazolyl, isoksazolyl, tiazotyl, isotiazolyl, imidazolyf, triazolyl, kinolyl og isokinolylgrupper.

Betegnelsen aralkyl er definer heri som en alkylgruppe, som tidligere definert, hvor en av hydrogenatomene er erstattet av en aryl eller heteroarylgruppe som definert heri.

Hvor en eller flere funksjonelle grupper i forbindelsene ifølge formlene I, II, HA er tilstrekkelig basiske eller sure er dannelsen av salter mulig. Egnede salter innbefatter farmasøytisk akseptable salter, for eksempel syreaddisjonssalter innbefattende hydroklorider, hydrobromider, fosfater, sulfater, hydrogensulfater, alkylsulfonater,

arylsulfonater, acetater, benzoater, citrater, maleater, fumarater, succinater, laktater og tartrater, salter avledet fra uorganiske baser inkludert alkalimetallsalter så som natrium eller kaliumsalter, alkalisk jordmetallsalter så som magnesium eller kalsiumsalter, salter avledet fra organiske aminer så som morfolin, piperidin eller dimetylaminsalter.

Fagfolk innenfor dette området vet at forbindelsene ifølge formlene I, II og HA kan eksistere stereoisomerer og/eller geometriske isomerer og foreliggende oppfinnelse innbefatter følgelig alle slike isomerer og blandinger derav.

Spesielt nyttige forbindelser ifølge oppfinnelsen innbefatter:

N-acetylcolchinol-O-fosfat dg salter derav, solvater og hydrater.

Forbindelser ifølge formlene I, Il eller HA kan bli fremstilt ifølge et antall fremgangsmåter som generelt beskrevet nedenfor og spesifikt som angitt i eksemplene nedenfor. De nedenfor angitte fremgangsmåter angir symbolene Ri, R2, R3. R», Rs> Re og R7 når anvendt i formlene de gruppene som er beskrevet ovenfor i relasjon til formlene I, II eller MA dersom ikke annet er angitt. I skjemaene angitt nedenfor kan det være nødvendig å anvende beskyttelsesgrupper som deretter blir fjernet i løpet av de siste syntesetrinnene. Hensiktsmessig anvendelse av slike beskyttelsesgrupper og fremgangsmåter for fjerning derav vil lett være kjent for fagfolk innenfor dette området.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig videre fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 -8 og 11, kjennetegnet ved at den omfatter behandling av en forbindelse ifølge formel (2) med alkalisk hydrogenperoksid

hvori:

R5. Re og R7 er H; og

Ri- R2. R3 og R4 er som definert i hvilke som helst av kravene 1 til 8; eller

ved kjemisk modifikasjon av en annen forbindelse ifølge formlene I, II eller NA som definert i kravene 1, 4 og 6.

Det er videre beskrevet fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsen N-acetylcolchinol-O-fosfat eller et salt, solvat eller hydrat derav, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: (i) behandling av N-acetylcolchinol med di-tert-butyl dietylfosforamedit i nærvær av en egnet katalysator og et løsningsmiddel, etterfulgt av behandling med et oksydasjonsmiddel; og (ii) behandling av mellomproduktet fosfat triester blandet i trinn (i) med en syre i nærvær av et løsningsmiddel.

Forbindelser med formlene II og NA hvor R5, R6 og R7 hver er hydrogen kan følgelig bli fremstilt ved behandling av en forbindelse ifølge formel (2) med alkalisk hydrogenperoksid. Reaksjonen kan hensiktsmessig bli utført i vandig natriumhydroksidløsning i fravær eller nærvær av et kooppløsningsmiddel så som en alkohol, for eksempel etanol, ved en temperatur i området på for eksempel 0-100°C, fortrinnsvis ved eller nære 60°C

Mellomprodukter ifølge formlene (2) kan bli fremstilt ved sur hydrolyse av forbindelsene ifølge formel (3). Reaksjonen blir hensiktsmessig utført i en vandig syre så som saltsyre ved en forhøyet temperatur, for eksempel ved eller nære ved 100°C.

Forbindelser ifølge formel (3) er enten kjente eller kan bli fremstilt fra colchicine ifølge konvensjonelle fremgangsmåter.

Forbindelsene ifølge formlene I, II eller MA kan også bli fremstilt fra andre forbindelser ifølge formlene I, II eller HA ved kjemisk modifikasjon. Eksempler på slike

kjemiske modifikasjoner som kan bli anvendt er standardalkylering. arylering, heteroarylering, acylering, tioacylering, sulfonylering, sulfatering, fosforylering, aromtaisk halogenering og koblingsreaksjoner. Disse reaksjonene kan bli anvendt for å tilsette nye substituenter eller modifisere eksisterende substituenter. Alternativt kan eksisterende

substituenter i forbindelser ifølge formlene 1,11 eller HA bli modifisert ved for eksempel oksidasjon, reduksjon, eliminering, hydrolyse eller annen spaltningsreaksjon for å tilveiebringe andre forbindelser ifølge formlene 1,11 eller I IA.

En forbindelse ifølge formlene II eller MA inneholdende en aminogruppe kan for eksempel bli acylert på aminogruppen ved behandling med for eksempel et acylhalid eller anhydrid i nærvær av en base, for eksempel en tertiær aminobase så som trietylamin, i for eksempel, et løsningsmiddel så som hydrokarbonløsningmiddel, for eksempel diklormetan ved en temperatur i området på for eksempel -30°C til 120°C, hensiktsmessig ved eller nær ved romtemperatur.

I et annet generelt eksempel på en fremgangsmåte for omdannelse kan en aminogruppe i en forbindelse ifølge formel II eller I IA bli sulfonylert ved behandling med for eksempel alkyl eller arylsulfonylklorid eller alkyl eller arylsulfonanhydrid i nærvær av en base, for eksempel en tertiær aminbase så som trietylamin, i for eksempel et løsningsmiddel så som et hydrokarbonløsningsmiddel for eksempel diklormetan i en temperatur i området på for eksempel -30° til 120°C, hensiktsmessig ved eller nær ved romtemperatur.

I et ytterligere generelt eksempel kan en forbindelse ifølge formlene II eller I IA inneholdende en hydroksygruppe bli omdannet til tilsvarende dihydrogenfosfatester ved behandling med for eksempel di-tert-butyldietylfosforamidit i en egnet katalysator, for eksempel tetrasol i et oppløsningsmiddel så som et eterløsningsmiddel, for eksempel tetrahydrofuran, ved en temperatur i området -40 til 40°C, hensiktsmessig ved eller nær ved romtemperatur, etterfulgt av behandling med et oksideringsmiddel, for eksempel 3-klorperoksybenzosyre ved en temperatur i området -78 til 40°C, fortrinnsvis -40 til -10°C. Den resulterende intermediære fosfattriesteren blir behandlet med en syre, for eksempel trifluoreddiksyre, i et løsningsmiddel så som et klorinert løsningsmiddel, for eksempel diklormetan, ved en temperatur i området -30 til 40°C, hensiktsmessig ved eller nære ved 0°C for å tilveiebringe en forbindelse ifølge formel (2) inneholdende en dihydrogenfosfatester.

I et ytterligere generelt eksempel kan en forbindelse ifølge formel (2) inneholdende et amid bli hydrolisert ved behandling med for eksempel en syre som saltsyre i et løsningsmiddel så som en alkohol, for eksempel metanol ved en forhøyet temperatur, hensiktsmessig ved tilbakeløpstemperatur.

I et annet generelt eksempel kan en O-alkylgruppe spaltes tit tilsvarende alkohol (OH) ved omsetning med bortribromid i et løsningsmiddel så som klorinert løsnings-iddel, for eksempel diklormetan ved en lav temperatur, for eksempel rundt -78°C. 1 et ytterligere generelt eksempel kan forbindelser ifølge formlene II eller HA bli kalkulert ved omsetning med et egnet alkyleringsmiddel så som et alkylhalid, et alkyl-oluensulfonat, et alkylmetansulfonat eller alkyltriflat. Alkyleringsreaksjonen kan bli utført i nærvær av en base, for eksempel en uorganisk base så som karbonat, for eksempel cesium eller kaliumkarbonat, et hydrid så som natriumhydrid eller et alkoksid, så som kalium t-butoksid i et egnet løsningsmiddel så som et aprotisk løsningsmiddel, for eksempel dimetylformamid eller et eterholdig løsningsmiddel så som tetrahydrofuran ved en temperatur rundt -10 til 8°C.

Fremstilling av en forbindelse ifølge formlene II eller IIA som en enkelt enantiomer eller, hvor hensiktsmessig, kan diastereomeren bli oppnådd ved syntese fra et entanio-merisk rent utgangsmateriale eller mellomprodukt eller ved oppløsning av sluttproduktet på konvensjonell måte.

Syreaddisjonssalter av forbindelsene ifølge formlene II eller IIA blir fremstilt på konvensjonell måte ved behandling av en løsning eller suspensjon av fri base II eller IIA med en omtrent en ekvivalent av en farmasøytisk akseptabel syre. Salter av forbindelsene ifølge formlene I, II eller IIA avledet fra uorganiske eller organiske baser blir fremstilt på konvensjonell måte ved behandling av en løsning eller suspensjon av fri syre I, II eller IIA med omtrent en ekvivalent av en farmasøytisk akseptabel organisk eller uorganisk base. Alternativt kan både syreaddisjonssalter og salter avledet fra baser bli fremstilt ved behandling av opphavsforbindelsen med hensiktsmessig ionebytte-harpiks på standard måte. Konvensjonelle konsentrasjons- og omkrystallinserings-teknikker blir anvendt for isolering av saltene.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen har evne til å ødelegge tumorvaskulatur og vaskulatur som nylig er blitt dannet, mens lar normalt, modent vaskulatur være upåvirket. Evnen som forbindelsene har til å virke på denne måten kan bli bestemt ut i fra tester beskrevet i eksemplene nedenfor.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan derfor spesielt anvendes for profylakse og behandling av kreft som innbefatter faste tumorer og for profylakse og behandling av sykdommer hvor uhensiktsmessig angiogenese oppstår, så som diabetisk retinopati, psoriasis, leddgikt, aterosklerose og makulær degenerasjon.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig videre en farmasøytisk sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-8 og eksipient.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan bli administrert som eneste terapi eller i kombinasjon med andre behandlinger. For behandling av faste tumorer kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen bli administert i kombinasjon med radioterapi eller i kombinasjon med andre anti-tumorforbindelser, for eksempel de som er valgt fra mitotiske inhibitorer, for eksempel vinblastin, paklitaksel og docetaksel; alkylerings-midler, for eksempel cisplatin, karboplatin og cyklofosfamid, antimetabolitter, for eksempel 5-fluoracil, cytosinarabinosid og hydroksyurea; interkallerende midler som for eksempel adriamycin og bleomycin; enzymer, for eksempel aspariginase;

topoisomeraseinhibitorer som for eksempel etoposid, topotekan og irinotekan;

tymidylatsyntaseinhibitorer for eksempel ralitetreksed; biologiske responsmodifiserende midler for eksempel interferon; antistoffer for eksempel endrekolomab; og anti-hormoner for eksempel tamoksifen. Slik kombinasjonsbehandling kan innbefatte samtidig eller sekvensiell applikasjon av de individuelle komponentene med behandlingen.

For profylakse og behandling av sykdommen kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen bli administrert som farmasøytiske blandinger valgt med hensyn på antatt administreringsvei av standard farmasøytisk praksis. Slik farmasøytiske blandinger kan være i en form egnet for oral, bukal, nasal, topisk, rektal eller parenteral administrering og kan bli fremstilt på konvensjonell måte ved anvendelse av konvensjonelle eksipienter. For eksempel for oral administrering kan de farmasøytiske blandingene være i form av tabletter eller kapsler. For nasal administrering eller administering ved inhalering kan forbindelsene hensiktsmessig bli levert som et pulver eller i løsning. Topisk administering kan være som en salve eller krem og rektal administering kan være som en suppositorie. For parenteral injeksjon (inkludert intravenøs, subkutan, intramuskulær, intravaskulær eller infusjon) kan blandingen ta form av for eksempel en steril løsning, suspensjon eller emulsjon.

Dosen av en forbindelse ifølge oppfinnelsen nødvendig for profylakse eller behandling av en bestemt tilstand vil variere avhengig av forbindelsen som blir valgt, admintsteringsvei, form og hvor alvorlig tilstanden er og om forbindelsen skal bli administert alene eller i kombinasjon med et annet medikament. Nøyaktig dose vil følgelig bli bestemt av behandlende lege, men generelt kan daglige doser være i området 0,001 til 100 mg/kg, fortrinnsvis 0,1 til 50 mg/kg.

BIOLOGISK AKTIVITET

Følgende tester ble anvendt for å demonstrere aktiviteten og selektiviteten til forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

Aktivitet over tumorvaskulatur målt med radioaktiv markør

Følgende eksperiment demonstrerer evnen som forbindelsene har til å skade

selektivt tumorvaskulatur.

Subkutane CaNT tumorer ble initiert ved injisering av 0,05 ml rå tumorcelle-suspensjon, omtrent 10<6> celler, under huden som ligger over den nedre delen av ryggen til 12-16 uker gamle mus. Dyrene ble valgt for behandling etter omtrent 3-4 uker når deres tumorer nådde en geometrisk gjennomsnittlig diameter på 5,5-6,5 mm. Forbindelsene ble oppløst i sterilt saltvann og injisert intraperitonealt i et volum på 0,1 ml pr 10 g kroppsvekt. Tumorperfusjonen ble målt seks timer etter den intraperitoneale administreringen i tumor, nyre, lever, hudmuskel, mave og hjerne ifølge <86>RbCI ekstraksjonsteknikken. Radioaktiviteten i vevet ble målt ett minutt etter en intravenøs injeksjon av 86RbCI bie anvendt for å beregne relativ blodstrømning som en proposjon av hjertebelastningen (Hill og Denekamp, Brit J. Radiol, 55,905-913,1982). Fem dyr ble anvendt i kontroll og behandlet i grupper. Resultatene ble uttrykt som en prosentandel av blodstrømningen i tilsvarende vev i bærerbehandtede dyr.

Aktivitet overfor tumorvaskulatur målt med fluorescensfargestoff

Det følgende eksperiment demonstrerer ytterligere evnen som forbindelsene har til å skade tumorvaskulatur.

Tumorfunksjonelt vaskulært volum i CaNT tumor-bærende mus ble målt ved anvendelse av fluorescensfargestoffet Hoechts 33342 ifølge fremgangsmåten til Smith et al (Brit J Cancer 57, 247-253,1988). Fem dyr ble anvendt i kontroll og behandlings-grupper. Fluorescensfargestoffet ble løst opp i saltvann med 6,25 mg/ml og injisert intravenøst med 10 mg/kg seks timer etter intraperetoneal medikamentbehandling.

Ett minutt senere ble dyrene drept og tumorene tatt ut og frosset ned. 10 um snitt ble kuttet ved tre forskjellige nivået og observert under UV bestrålning ved anvendelse av et Olympus mikroskop utstyrt med epifluorescens. Blodårene ble identifisert ved deres fluorescenslinjer og vaskulært volum ble kvantifisert ved anvendelse av et punkt-registreringssystem basert på det som er beskrevet av Chalkley, (J Nati Cancer Inst. 4, 47-53,1943). Alle beregningene var basert på opptelling av minst 100 felt fra snitt spaltet ved tre forskjellige nivåer. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen reduserte tumorfunksjonelt vaskulært volum med mer enn 20% ved doser på 50 mg/kg eller lavere.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen. I eksemplene ble alle <1>H-NMR kjørt ved 300MHz dersom ikke annet er spesifisert. Kolonnekromatografi ble utført på silikagel. Alle temperaturer er i °C. Følgende forkortelser blir anvendt: THF - tetrahudrofuran; DMSO - dimetylsulfoksid; MCPBA - 3-klorperoksybenzosyre.

EKSEMPEL 1

N-Acetylcolchinol-O-fosfat

En løsning a N-acetylcolchinol (260 mg, 0,76 mmol) i vanfri THF (2 ml) under en nitrogenatmosfære ble behandlet med di-t-butyl dietylfosforamidit (189 mg, 0,75 mmol) og 1 (H)-tetrazol (0,14 g, 1,99 mmol) og løsningen ble omrørt ved 20° i 0,5 timer. Løsningen ble avkjølt til -40° og en løsning av 85% MCPBA (202 mg, 0,99 mmol) i vanfri diklormetan (2 ml) ble tilsatt i en slik rate at temperaturen forble under -10°. Løsningen ble varmet til romtemperatur, dietyleter (30 ml) ble tilsatt og den resulterende løsningen ble sukksessivt vasket med 10% vandig natriummetabisulfit (to 25 ml porsjoner), 5% vandig natriumbikarbonat (to 25 ml porsjoner), 5% vandig sitronsyre (30 ml), 5% vandig natriumbikarbonat og saltvann. Den organiske løsningen ble konsentrert under redusert trykk og resten ble utsatt for kolonnekromatografi for å tilveiebringe et hvitt skum (170 mg) inneholdende N-acetylcolchinol-O-di-t-butylfosfat som på ny ble oppløst i diklormetan (5 ml), avkjølt til 0° og behandlet med trifluoreddiksyre (0,5 ml).

Løsningen ble varmet til romtemperatur og omrørt i en time før den ble konsentrert under redusert trykk og triturert med eter for å tilveiebringe tittelforbindelsen (110 mg) som et hvitt fast stoff, smp. 233-235°. 8H (d6-DMSO) 8,38 (d, 1H, J=8Hz), 7,27 (d, 1H, J=7Hz), 7,12 (d, 1H, J=8Hz), 7,10 (s, 1H), 6,77 (s, 1H), 4,48 (m, 1H), 3,81 (s, 3H), 3,76 (s, 3H), 3,49 (s, 3H), 2,5 (signal delvis forstyrret av DMSO topp), 1,9-2,2 (m, 2H), 1,86 (s, 3H).

Aktiviteten til fosfatforbindelsen ble målt med radioaktiv sporanalyse beskrevet ovenfor: forbindelsen ifølge dette eksemplet ga en 65% reduksjon i blodstrømningen til tumoren ved en dose på 125 mg/kg uten betydelig reduksjon i blodstrømningen i hud, muskel, lever, nyre, mage eller hjerte.

Fosfatforbindelsen ble sammenlignet med opprinnelig N-acetylcolchinol for maksimalt tolerert dose (MTD) (ingen dødsfall av tre dyr), minimal effektiv dose (MÉD) målt ifølge fluorescensfargestoffteknikken som allerede er beskrevet og terapeutisk vindu (MTD/MED).

Til tross for at fosfat hadde en noe høyere MED var "vinduet" betydelig høyere. Dette var uventet. Fosfat ga også en høyere oppløselighet.

For sammenligning er "terapeutisk vindu" for colchicin (nærmeste struktur i forhold til foreliggende forbindelser og docetaksel) et tubulin-bindende medikament, markedsført som "Taxotere", som ikke har noen vaskulær-skadende aktivitet) og presentert i følgende tabell:

EKSEMPEL 2

N-etylcolchinol

En løsning a vN-acetylcolchinol (500 mg, 1,4 mmol) i THF (15 ml) ble tilsatt dråpevis i løpet av 15 minutter til en suspensjon av litiumaluminiumhydrid (106 mg, 2,74 mmol) i THF (10 ml) med is-badavkjøling. Blandingen ble oppvarmet ved tilbakeløp i 15 timer, avkjølt og behandlet med ytterligere litiumaluminiumhydrid (53 mg, 1,4 mmol) før oppvarming ved tilbakeløp i ytterligere tre timer. Blandingen ble avkjølt (is-bad) og vann (10 ml) ble dråpevis tilsatt før ekstrahering med tre porsjoner etylacetat. Kombinerte, tørkede (MgS04) ekstrakter ble konsentrert under redusert trykk til en grønn gummi som ved triturering med eter ga tittelforbindelsen som et lyse-grønt fast stoff, smp. 185°

(dek.), m/e 343 (M+). Anal. beregnet tor C20H2SNO4 H20: C, 66,46; H, 7,53; N, 3,88. Funnet: C, 66,50; H, 7,17; N, 3,79.

EKSEMPEL 3

N-(fenylkarbamoyl)colchinol

En løsning av colchinol (400 mg, 1,27 mmol) i tørr pyridin (10 ml) ble behandlet dråpevis med fenylisocyanat (0,151 ml, 1,39 mmol) og blandingen ble omrørt i 16 timer. Løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk, vann ble tilsatt og den resulterende blandingen ble ekstrahert med tre porsjoner kloroform. Kombinerte, tørkede (MgSCU) ekstrakter ble konsentrert under redusert trykk til en mørkebrun gummi som ble utsatt for kolonnekromatografi på silikagel eluerende med 50% etylacétat/petroleumseter. Den resulterende orangefargede gummien ble krystallisert fra eter/petroleumseter for å tilveiebringe tittelforbindelsen (346 mg) som et svakt gult fast stoff. smp. 79-81 °C, m/e 449 (M+). Anal. beregnet for C26H27NO6 0,33H2O; c, 68,57; H, 6,07, N, 3,08. Funnet: C, 68,71; H, 6,18; N, 2,91.

EKSEMPEL 4

N-(fenylkarbamoyl)colchinol

En løsning av colchinol (400 mg, 1,27 mmol) i tørr pyridin (10 ml) ble behandlet dråpevis med fenylisocyanat (0,151 ml, 1,39 mmol) og blandingen omrørt i 18 timer før oppvarming ved tilbakeløp i to timer. Løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk, vann ble tilsatt og den resulterende blandingen ekstrahert med tre porsjoner kloroform. Kombinerte, tørkede (MgS04) ekstrakter ble konsentrert under redusert trykk til en mørkebrun gummi som ble utsatt for kolonnekromatografi på silikagel eluerende med 35% etylacétat/petroleumseter. Den resulterende gummi ble krystallisert fra eter/petroleumseter for å tilveiebringe tittelforbindelsen(261 mg) som et lyse orange fast stoff. Smp. 145-146°C m/e 434 (M+).

EKSEMPEL 5

N-mesylcolchinol

En løsning av N,0-dimesylcolchinol (234 mg, 0,5 mmol) i metanol (8 ml) ble behandlet med natriumhydroksid (40 mg, 1 mmol) og blandingen ble oppvarmet ved tilbakeløp i tre timer. Oppløsningsmidlet ble fjernet med redusert trykk og vann (5 ml) ble tilsatt. Løsningen ble gjort nøytral ved tilsetning av 1M saltsyre og ekstrahert med tre porsjoner diklormetan. Kombinerte, tørkede (MgS04) ekstrakter ble konsentrert under redusert trykk for tilveiebringing av tittelforbindelsen (123 mg) som et rosafarget fast stoff. Smp. 234-236"<>>C, m/e 393 (M+).

N.O-dimesylcolchinol anvendt som utgangsmateriale ble fremstilt som følger: En løsning av colchinol (500 mg, 1,6 mmol) i tørr pyridin (15 ml) ble behandlet med mesylklorid (0,135 ml, 1,7 mmol) og blandingen omrørt ved romtemperatur i 16 timer. En ytterligere porsjon mesylklorid (0,135 ml, 1,7 mmol) ble tilsatt og omrøringen fortsatt i 16 timer. Løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk og vann (5 ml) ble tilsatt. Løsningen ble ekstrahert med tre porsjoner kloroform og kombinerte, tørkede (MgS04) ekstrakter ble konsentrert under redusert trykk for å tilveiebringe en brun gummi som ble utsatt for kolonnekromatografi på silikagel eluerende med etylacetat for å tilveiebringe N.O-dimesylcolchinol (292 mg) som et lyseorangefarget fast stoff.

EKSEMPEL 6

N-dimetylsulfamoylcolchinol

En løsning av colchinol (50 mg, 0,16 mmol) i tørr acetonitril (3 ml) og trietylamin (0,022 ml, 0,16 mmol) ble behandlet med dimetylsulfamoylklorid og blandingen ble omrørt i 30 minutter før oppvarming med tilbakeløp i 15 timer. Løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk, vann ble tilsatt og den resulterende blandigen ble ekstrahert med tre porsjoner kloroform. Kombinerte, tørkede (Na2S04) ekstrakter ble konsentrert under redusert trykk til en mørkebrun gummi som ble utsatt for kolonnekromatografi på silikagel eluerende etylacetat for tilveiebringing av tittelforbindelsen (46 mg) som en lyseorangefarget gummi som stivnet. Smp. 82-85°C m/e 422 (M+).

EKSEMPEL 7

N-acetyl-O-metoksylarbonylmetylcolchinol

En løsning av N-acetylcolchinol (500 mg, 1,4 mmol) i tørr DMF (5 ml) ved 0° ble behandlet med metylbromacetat (322 mg, 2,1 mmol) og natriumhydrid (84 mg av en 60% suspensjon i olje, 2,1 mmol) og blandingen omrørt i 30 minutter. Vann (50 ml) ble tilsatt og blandingen ekstrahert med fire porsjoner etylacetat. Kombinerte ekstrakter ble suksessivt vasket med fire porsjoner vann og to porsjoner mettet vandig natriumklorid-løsning, tørket (MgS04) og løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk for tilveiebringing av tittelforbindelsen (280 mg) som et hvitt fast stoff. Smp. 82-83°C. m/e 429 2 (M+). Anal. beregnet for C23H27NO7 0,33H2O; C 63,45; H, 6,40; N, 3,22. Funnet: C, 63,53; H, 6,29; N, 3,17.

EKSEMPEL 8

N-acetyl-O-karboksymetylcolchinol

En løsning av N-acetyl-O-metoksykarbonylmetylcolchinol (140 mg, 0,33 mmol) i acetonitrol (5 ml) ble behandlet med vandig kaliumhydroksidløsning (1,05 ml, 5 ml) og blandingen oppvarmet ved 80°C i 30 minutter. Den avkjølte blandingen ble justert til pH 3 ved tilsetning av 2M saltsyre og ekstrahert med fire porsjoner etylacetat. Kombinerte ekstrakter ble vasket med to porsjoner mettet vandig natriumkloridløsning, tørket (MgS04) og konsentrert under redusert trykk. Tilsetning av aceton (2 ml) og heksan (1 ml) produserte tittelforbindelsen (58 mg) som et hvitt fast stoff smp. 220-221 °C. m/e 415,3 (M+). Anal. beregnet for C22H25NO7 0,33H2O; C, 62,71; H, 6,14; N, 3,32. Funnet: C, 62,63; H, 6,02; N, 3,26.

EKSEMPEL 9

N-acetyl-O-cyklopentylcolchinol

En løsning av N-acetylcolchinol (200 mg, 0,56 mmol) i tørr DMF (2 ml) ved 0°C ble behandlet med natriumhydrid (33 mg av en 60% suspensjon i olje, 0,84 mmol) etterfulgt av cyklopentylbromid (125 mg, 0,84 mmol) og blandingen ble omrørt i en time. En ytterligere porsjon av natriumhydrid (17 mg av en 60% suspensjon i olje, 0,42 mmol) og cyklopentylbromid (125 mg, 0,84 mmol) og blandingen ble omrørt over natt ved romtemperatur. Vann (10 ml) ble tilsatt og blandingen ekstrahert med fire porsjoner etylacetat. Kombinerte ekstrakter ble vasket med to porsjoner mettet vandig natrium-kloridløsning, tørket (MgS04) og konsentrert under redusert trykk. Tittelforbindelsen (160 mg) ble oppnådd som et hvitt fast stoff smp. 89-94°C. m/e 425,3 (M+). Anal. beregnet for C25H31NOS: C, 70,54; H, 7,35; N, 3,29. Funnet: C, 70,55; H, 7,35; N, 3,25.

EKSEMPEL 10

N-acetyl-10-nitrocolchinol

En løsning av N-acetylcolchinol (100 mg, 0,27 mmol) i iseddiksyre (20 ml) ble sakte behandlet med 20 ml av en løsning av konsentert saltsyre (0,34 ml) i eddiksyre (100 ml) ved å holde temperaturen på omtrent 12°C. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer og ytterligere 1 ml salpetersyre/eddiksyreløsning ble tilsatt og omrøringen fortsatt i to timer. Blandingen ble helt på is og ekstrahert med tre porsjoner etylacetat. Kombinerte ekstrakter ble vasket med to porsjoner mettet vandig natrium-kloridløsning, tørket (MgS04) og konsentrert under redusert trykk. Rensing på silikagel eluerende med etylacetat ga tittelforbindelsen (50 mg) som et lysegult fast stoff smp. 117-8°C. m/e 401,9. (M+) Anal. beregnet for C20H22N2O7 0,33H2O; C, 58,82; H, 5,56; N, 6,86. Funnet: C, 58,87; H, 5,66; N, 6,55.

EKSEMPEL 11

Aktivitet overfor tumorvaskulatur ble målt ved fluorescensfargeteknikken beskrevet ovenfor for forbindelsene ifølge eksemplene 1-10 administrert 50 mg/kg og N-acetylcolchinol

Claims (13)

1. Forbindelse, karakterisert ved at den har formel I: hvor: Ri, R2, R3 og R6 er hver uavhengig H, PO3H2, cykloalkyl, (1-7C)alkyt eller (1-7C)alkanoyl, idet (1 -7C)a!kyigruppen eventuelt bærer en eller flere substituenter valgt fra hydroksy, karboksyl og metoksykarbonyl; X er karbonyl (CO), metylen (CH2) eller en gruppe CHR4; R4 er OH, 0-<1-7C)alkyl eller NRBR9; R5 og R7 er hver uavhengig H, (1-7C)alkoksy eller nitro; R8 er H, {1-7C)alkyl, cykloalkyl, (1-7C)alkanoyl, fenyl, fenylkarbonyl, ben2yloksykarbonyl, <1-7C)alkoksykarbonyl, aminokarbonyl, (1-7C)alkylaminokarbonyl, di-[(1-7C)alkyl]aminokarbonyl, fenylaminokarbonyi, (1-7C)alkylsulfonyl, fenylsulfonyl, aminosulfonyl, (1-7C)alkylaminosulfonyl, eller di[(1-7C) alkyl]aminosulfonyl, og hvori en hvilken som helst <1-7C)alkyl eller {1-7C)alkanoyigruppe i R8 eventuelt bærer en eller flere sustituenter valgt fra halogen, amino, mono(1-7C)alkylamino, di[{1-7C)alkyl]amino, hydroksy og karboksyl; og hvor en hvilken som helst fenyl ring i R8 eventuelt bærer en eller flere substituenter valgt f ra halogen; og R» er H eller (1-7C)alkyl; og hvor minst en av Ri, R2, R3 og Re er PO3H2; eller et farmasøytisk akseptabelt salt, solvat eller hydrat derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R6 er PO3H2, eller et farmasøytisk akseptabelt salt, solvat eller hydrat derav.

3. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at Ri, R2 og R3 er alkyl og R4 er acylamino, eller et farmasøytisk akseptabelt salt, solvat eller hydrat derav.

4. Forbindelse, karakterisert ved at den har formel II: hvori 'Rii R2. og R3 hver er uavhengig H, eller (1-7C)alkyl; Re er P03H2; R4 er NReRfl; Rs og R7 er H, (1 -7C)alkoksy eller nitro; Re er H, (1-7C)aikyl, cykloalkyl, (1-7C)alkanoyl, fenyl, fenylkarbonyl, benzyloksykarbonyl, (1-7C)akpksykarbonyl, aminokarbonyl, (1-7C)alkylaminokarbonyt, di-[(1-7C)a!kyl]aminokarbonyl, fenylaminokarbonyl, (1-7C)alkytsulfonyl, fenylsulfonyl, aminosulfonyl, (1-7C)alkylaminosulfonyl eller di-[(1-7C)alkylaminosulfonyl, hvor en hvilken som helst (1-7C)alkyl eller (1-7C)alkanoyl gruppe i Re eventuelt bærer en eller flere substituenter valgt fra halogen, amino, mono-{1-7C)aikylamino, di-[(1-7C)alkyl]amino, hydroksy og karboksyl, og hvor en hvilken som helst fenylring i R<8> eventuelt bærer en eller flere substituenter valgt fra halogen; og Rg er H eller (1-7C)alkyl; eller et farmasøytisk akseptabelt satt, solvat eller hydrat derav.

5. Forbindelse ifølge krav 4, karakterisert ved at Ri, R2 og R3 er hver (1-7C)alkylt eller et farmasøytisk akseptabelt salt, solvat etler hydrat derav.

6. Forbindelse, karakterisert ved at den har formelen hvori Ri, R2, og R3 hver er uavhengig H eller (1-7C)alkyl, R6 er H, PO3H2, cykloalkyl eller (1-7C)alkyl, idet {1-7C)alkyl gruppen eventuelt bærer en eller flere substituenter valgt fra hydroksy, karboksyl og metoksykarbonyl; R4 er H eller NR9R9; Rs og R7 er hver uavhengig H eller nitro; R8 er H, (1-7C)alkyi, cykloalkyl, (1-7C)alkanoyl, fenyl, fenyl karbonyl, benzyloksykarbonyl, (1 -7C)alkoksykarbonyl, aminokarbonyl, (1 -7C)alkylaminokarbonyl, di-[(1-7C)atkyl]aminokarbonyl, fenylaminokarbonyl, (1-7C)alkylsulfonyl, fenylsulfonyl, aminosulfonyl, (1 -7C)alkylaminosuifonyl eller di-[(1 -7C)alkylaminosulfonyl. og hvor en hvilken som helst (1-7C)alkyl eller (1-7C)alkanoyl gruppe i R8 eventuelt bærer en eller flere substituenter valgt fra halogen, amino, mono-(l-7C)alkylamino, di-[1 -7C)alkyl]amino, hydroksy og karboksyl, og hvor en hvilken som helst fenylring i R8 eventuelt bærer en eller flere substituenter valgt f ra halogen; og Rg er H eller (1 -7C)alkyl med den forutsetningen at når Ri, R2 og R3 alle er metylgrupper og R4 er hydrogen, acetylamino, amino, metylamino eller dimetylamino er R6 ikke hydrogen, metyl eller hydroksyetyl; eller et farmasøytisk akseptabelt salt, solvat eller hydrat derav.

7. Forbindelse ifølge krav 6, karakterisert ved at Ri, R2 og R3 er (1-7C)alkyl og R4 er acylamlno, eller et farmasøytisk akseptabelt salt, solvat eller hydrat derav.

8. Forbindelse ifølge krav 6, karakterisert ved at Ri, R2og R3 er metyl; R5 og R7 er hydrogen; og Re er hydrogen, (1-7C)alkyl eller P03H2, eller et farmasøytisk akseptabelt salt, solvat eller hydrat derav.

9. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-8 og eksipient.

10. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 9, karakterisert ved at forbindelsen er N-acetylcolchinol-O-fosfat.

11. Forbindelse, karakterisert ved at den er N-acetylcolchinol-O-fosfat eller et salt, solvat eller hydrat derav.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-8 og 11, karakterisert ved at den omfatter behandling av en forbindelse ifølge formel (2) med alkalisk hydrogenperoksid II eller IIA hvori: Fis- Re og R7 er H; og Ri- R2, R3 og R4 er som definert i hvilke som helst av kravene 1 til 8; eller ved kjemisk modifikasjon av en annen forbindelse ifølge formlene I, II eller IIA som definert i kravene 1, 4 og 6.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsen N-acetylcolchinol-O-fosfat eller et salt, solvat eller hydrat derav, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: (i) behandling av N-acetylcolchinol med di-tert-butyl dietylfosforamedit i nærvær av en egnet katalysator og et løsningsmiddel, etterfulgt av behandling med et oksydasjonsmiddel; og (ii) behandling av mellomproduktet fosfat triester blandet i trinn (i) med en syre i nærvær av et løsningsmiddel.