AT400723B - Rekombinante alternaria alternata allergene - Google Patents

Description

AT 400 723 B

DieErfindung bezieht sich auf rekombinante DNA Moleküle, die für Polypeptide kodieren, die die Antigenität der Allergene Alta53, Alta22 und Altai 1 besitzen, oder für Peptide, die mindestens ein Epitop dieser Allergene aufweisen.

Die genannten Allergene von Alternaria alternata, sowie die von den cDNA-Primärsequenzen dieser Allergene abgeleiteten Peptidsequenzen führen bei Pilzallergikern zu einer pathologischen Immunantwort mit einem Überschießen von IgE-Antikörpern. Rekombinante Allergene bzw. immunogen wirkende Teilpeptide können neben einer verbesserten Diagnostik auch zu einer in vivo oder in vitro Induktion einer Immuntoleranz bzw. Anergie von T-Lymphozyten Verwendung finden.

Allergien nehmen nach epidemiologischen Untersuchungen in den letzten Jahren an Häufigkeit zu. Die Ursachen der allergischen Krankheiten sind vielfältig. Allergene wie Pollen, Tierhaare und Exkremente von Hausstaubmilben sind heute wohl jedem schon eine Begriff (Wüthrich 1991, Miyamoto 1992). Schimmelpilze lassen aber für Fachleute hinsichtlich ihrer biologischen und allergologischen Bedeutung viele Fragen offen. Es sind nicht zuletzt die äußerst große Variabilität und Adaptionsfähigkeit auf unterschiedliche Lebensbedingungen, die die Forschungsarbeit mit diesen Pilzen erschweren. 98% der bekannten Pilze sind Landbewohner. Für die meisten Pilze stellen klimatische Verhältnisse mit einer Luftfeuchtigkeit von 80% und Temperaturen um 20 * C ideale Lebens- und Fortpflanzungsbedingungen dar.

Die Mechanismen bei Schimmelpilzallergien sind nicht genau bekannt und scheinen komplexer und komplizierter als bei üblichen Inhalationsallergien vom Soforttyp zu sein. Möglichkeiten einer Sensibilisierung über den Verdauungstrakt und nicht nur über den Respirationstrakt werden diskutiert und sind Gegenstand intensiver Forschungsarbeit.

Allergien vom Soforttyp (Typ1-Allergie) werden durch IgE Antikörper ausgelöst, die Effektorzellen (Mastzellen des Schleimhaut- und Bindegewebstypus sowie Basophile Granulozyten des Blutes) mit ihren Fc-Teil über Rezeptoren kontaktieren und bei Allergenkontakt zu einer Freisetzung von Entzündungsstoffen (Histamin, Heparin, Arachidonsäuremetaboliten etc.) führen (Roitt 1991, Klein 1990). Die Bildung solcher IgE-Antikörper erfolgt durch B-Lymphozyten, die durch lösliche Stoffe (Lymphokine), die von aktivierten T-Lymphozyten sezerniert werden, zur Sekretion der Antikörper stimuliert werden (Parronchi et al. 1991).

Am Beginn jeder Immunantwort stehen Zellen, die vorhandenes Antigen aktiv phagozytieren. Aus diesem Grund werden diese Zellen auch "Freßzellen" genannt. Es handelt sich hierbei um dendritische Zellen aber auch um Monozyten, die im späteren Stadium zu Makrophagen differenzieren. Alle diese Zellen besitzen die Fähigkeit der DIAPEDESE, was ihnen ermöglicht, das Blutsystem zu verlassen und in Körperhohlräume etc. vorzudringen. Den Hauptanteil der Antigenvernichtung tragen die Makrophagen. Sie zerlegen das Antigen nach der Phagocytose in hochimmunogene Peptide (Durchschnittsgröße ca. 15 Aminosäuren) und präsentieren diese zusammen mit dem auf den Makrophagen exprimierten MHC-Proteinen (major histocompatibility), den T-Lymphocyten. Die zentrale Rolle der T-Lymphocyten wird an diesem Punkt unterstrichen. Nur an diesem Punkt der Immunantwort kann unterschieden werden, und das ist die zentrale Rolle der T-Lymphozyten, ob das dargebotene Antigen "fremd" oder "eigen” ist. Erfolgt hier die Entscheidung "fremd", so steht der weiteren Bekämpfung des Antigens nichts mehr im Wege. Die Erkennung des Fremdproteins im Kontakt mit eigenem MHC führt zur weiteren Differenzierung der T-Lymphozyten zu Plasmazellen, die schließlich Interleukine sezernieren. Diese Interleukin-Sekretion führt zur Aktivierung von B-Lymphozyten, die ihrerseits das lösliche Antigen erkannt haben, aber erst die "Mitteilung" der T-Lymphozyten über die Interleukine für die eigene Differenzierung benötigen. Es folgt die Differenzierung der B-Lymphozyten zu Plasmazellen, wo nun beim Atopiker größere Mengen Antikörper der IgE-Klasse sezerniert werden.

Wurde noch auf T-Zellebene das Antigen als "eigen" erkannt, wird die Immunantwort unter normalen Umständen an diesem Punkt abgebrochen. Die komplexe Regulationskaskade des Immunsystems birgt jedoch eine Menge möglicher Fehler in sich. Zeuge dieses Umstandes sind die vielen, meist tödlich verlaufenden, klinischen Fälle von Autoimmunkrankheiten, bei denen das körpereigene Immunsystem nicht zwischen "selbst" und "nicht-selbst” unterscheiden kann.

Bis zum heutigen Zeitpunkt ist die Diagnose und somit auch die Therapie von allergischen Erkrankungen nicht zufriedenstellend. Die molekulare Charakterisierung der Hauptallergene von Alternaria mittels cDNA-Klonierung, Sequenzierung, Sequenzvergleich des allergenen Proteins mit Proteindatenbanken, sowie die Produktion von rekombinanten Allergenen wird mehr Aufschluß über die in vivo Funktion der Proteine geben, die die falschen Immunreaktionen auslösen. Diese Informationen sind aus folgenden Gründen interessant: 1) Hochreine rekombinante Allergene können für eine sorgfältigere Diagnose, besser als es heute mit Rohextrakten möglich ist, herangezogen werden. 2) Die Sequenz der Allergene wird dabei helfen, tolerogene Peptide zu definieren und eventuell auch den "IgE-Class-switch”, der bei der Immunisierung mit dem Allergen passiert, verstehen zu lernen. 2

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Seit Jahrzehnten werden IgE bedingte Allergien, so z.B. auch Allergien gegen Pilzsporen, durch Hyposensibilisierung therapiert (Bousquet et al. 1991). Diese Therapie besteht in der Zufuhr von Allergenextrakten in Form von Injektionen oder peroraler Applikation in wässriger Form als Tropfen in steigender Dosierung, bis eine Erhaltungsdosis über mehrere Jahre erreicht ist. Resultat dieser Therapie ist das Erreichen einer Toleranz gegenüber den eingesetzten Allergenen, was sich in einer Abnahme der Krankheitssymptome äußert (Birkner et al. 1990). Das Problem bei dieser Art der Behandlung liegt in der Vielzahl der dadurch auftretenden Nebenwirkungen. Bei der Hyposensibilisierungstherapie sind Fälle von anaphylaktischem Schock während der Behandlung aufgetreten. Das Problem hierbei liegt in der schweren Standardi-sierbarkeit der Pilzprotein-Isolate. Bei einem Einsatz von Allergen-abgeleiteten, aber nicht anaphylaktisch wirkenden Peptiden, könnten risikolos höhere Dosen verabreicht werden, wodurch eine wesentliche Verbesserung der Hyposensibilisierung erreicht werden kann.

Alternaria alternata ist praktisch überall in der Natur anzutreffen. Beliebte Standorte, bzw. Lebensräume des Pilzes sind verschiedene Bodentypen, Getreidesilos, verottetes Holz, aber auch lebende Pflanzen, Kompostplätze und Vogelnester. Findet man auf Tomaten schwarze Flecken, so rühren auch sie mit großer Wahrscheinlichkeit von Alternaria her. Aber nicht nur in freier Natur ist Alternaria alternata anzutreffen. Sehr häufig findet man den Pilz in feuchten Innenräumen und an Fensterrahmen. Warme Temperaturen und hohe Luftfeuchtigkeit begünstigen das Wachstum des Pilzes im allgemeinen.

Man zählt heute Alternaria alternata zu den wichtigsten Allergie auslösenden Pilzen. Yunginger et al. (1989) charakterisierten die erste allergene Fraktion und isolierten das erste als Allergen wirkende Protein Altai. Ein großes Problem bei Alternaria alternata ist die Variationsbreite des Pilzes: Variationen im Proteinmuster aber auch variable Potenz der Allergieauslösung sind des öfteren beschrieben worden. Nyholm et al. (1983) zeigten, daß es sich bei Agl und Alt-1 um dasselbe Allergen handelt, daß aber in unterschiedlichen Stämmen von Alternaria alternata eine Variationsbreite des Proteins möglich ist. Der Reviewartikel von Budd (1986) beschreibt die Isolierung des allergenen Proteins Alt-1, nun Altai. Vollständige cDNA Sequenzen von allergenen Proteinen von Alternaria alternata sind bis heute nicht publiziert worden. Verschiedene Studien zeigen jedoch starke Kreuzreaktionen zwischen Alternaria alternata, Stemph-ylium und Curvularia (Agarwal 1982).

Erfindungsgemäß werden Rekombinante DNA Moleküle der eingenags geannten Art geschaffen, die Nucleinsäuresequenzen aufweisen, die mit dem Sequenzen 1, 3-5, 7-9 sowie 12 und 13, oder mit Teilbereichen dieser Sequenzen in homologer Weise übereinstimmen, bzw. Nucleinsäuresequenzen, die mit den genannten Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Die DNA Moleküle können auch Nucleinsäuresequnzen aufweisen, die durch Degeneration aus den vorgenannten Sequenzen ableitbar sind.

Weitere Merkmale des Erfindungsgegenstandes gehen aus den nachstehenden Darlegungen hervor. Beispiele: a) Beschreibung der allergenen Proteine von Alternaria alternata mittels Western-Blotting Für die Klonierung der vorliegenden Allergene von Alternaria alternata standen 142 Patientensera zur Verfügung. Um die Reaktivität der Patienten mit Pilzproteinextrakt zu testen, wurde Alternaria alternata (Sammlung Prof. Windisch Berlin Nummer: 08-0203) auf festem Medium (2% Glukose, 2% Pepton, 1% Hefeextrakt) gezüchtet. Für die Proteinextraktion wurde die Pilzmatte nach 3 Tagen Wachstum bei 28 *C abgezogen und mit flüssigem Stickstoff aufgebrochen. Die Auftrennung der extrahierten Proteine erfolgte auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel, das anschließend geblottet, mit Patientenserum inkubiert und mit l2Sl-markiertem anti human IgE detektiert wurde. In Prozentzahlen ausgedrückt reagierten die Patienten auf die allergenen Proteine wie folgt:

Alta53 44,8% Alta22 3.4% Altai 1 10,3%

Wurde Protein aus gekauftem Pilzmaterial der Firma Allergon (Schweden) isoliert und für den Immunblot verwendet, konnte nahezu dasselbe Bandenmuster detektiert werden. Wie aus diesen Zahlen ersichtlich ist, handelt es sich bei Alta53 um ein Haupt-, bei Alta22 und Altai 1 um ein Nebenallergen.

Figur 1 zeigt einen Überblick über das zur Klonierung der beschriebenen Allergene zur Verfügung gestandene Patientenspektrum. Das Bild zeigt ein 12,5 %iges Polyacrylamidgel. Die Patienten mit der 3

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Nummer 35 und 40 (es handelt sich hier auch um die Patienten die für das spätere Screenen verwendet wurden) zeigen Banden in der Größenordnung 53kD, 22kD und 11kD.

Fig.1 zeigt dabei ein Westernblotting eines 12,5%iges Polyacrylamidgels, nach Auftrennung von Alternaria alternata Proteinextrakt; Inkubation mit Sera verschiedener Patienten; Detektion mit 125 l-markier-tem anti human IgE. b) Konstruktion der cDNA Expressionsbank

Gesamt RNA wurde nach der sauren Guanidium-Phenol-Extraktionsmethode aus selbst gezüchtetem Pilzmaterial gewonnen. poly(A)plus Anreicherung erfolgte mit Oligo(dT) Cellulose der Firma Böhringer. Die cDNA Synthese (1. und 2. Strang) wurde durchgeführt, wie im Manual des Lambda ZAP-Systems der Firma Stratagene beschrieben. Die cDNA wurde anschließend (3'- seitig) mit EcoRI und (5'-seitig) mit Xbal Linkern versehen, in vorverdaute Lambda-ZAP-Arme ligiert und verpackt. Der Titer der Primärbank betrug 900000 Klone. c) Screening der cDNA Genbank mit Patientensera, in vivo Excision, Sequenzierung

Das Screenen der Expressionsbank erfolgte mittels Inkubation der "gelifteten" Phagenplaques mit einem Seragemisch aus 2 Patienten, von denen man durch das Westernblotting wußte, daß sie das Spektrum der detektierten Antigene abdecken. Die Detektion erfolgte wieder mit anti human IgE RAST Antikörper der Firma Pharmacia. Nach Sekundär- und Tertiärscreening blieben 150 positive Klone übrig. Aus 12 Klonen wurde mit Hilfe eines Helferphagen der bereits fertig sequenzierbare Bluescriptvektor mit cDNA exzisiert (Durchführung wie im Manual des Lambda ZAP-Kits). Restriktionsverdaue der exzisierten Plasmide zeigten (EcoRI-Xbal Doppelverdaue) 3 verschiedene Inserttypen. Diese 3 Klone wurden nach der Sangermethode (Sänger 1977) sequenziert. d) Expression der Alta53, Alta22 und Altai 1 cDNAs als /S-Galaktosidasefusionsprotein

Mit Hilfe des vorher beschriebenen IgE-Screenings konnten 3 vollständige cDNA-Klone erhalten werden. Die jeweiligen rekombinanten Plasmide wurden in den E.coli Stamm XL1-Blue transformiert und mit IPTG (isopropyl-jS-D-thiogalactopyranosid) induziert. Der E.coli Gesamtproteinextrakt wurde anschließend elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrozellulose geblottet. Das Fusionsprotein wurde mittels Serum IgE von Pilzallergikern und einem jodmarkiertem Kaninchen anti human IgE Antikörper (Pharmacia, Uppsala Schweden) detektiert.

Die nachfolgenden zwei Figuren zeigen die rekombinanten /S-Galaktosidasefusionsproteine nach Inkubation mit Patientenserum und Detektion mit jodmarkiertem anti-human IgE. Der ß-Galaktosidaseanteil des Fusionsproteins beträgt 36 Aminosäuren, was einem Molekulargewicht von 3800 Dalton gleichkommt. Unter Berücksichtigung dieser "Vergrößerung" des allergenen Proteins sind auch die nachfolgenden Figuren 3 und 4 zu sehen. Spuren (Klone) 1,2,4,5,6,7 zeigen das rekombinante Fusionsprotein Altai 1, Spuren 3 und 12 zeigen das rekombinante Fusionsprotein Alta22 und Spuren 8 und 10 das um den Fusionsanteil größer gewordene rekombinante Alta53.

Fig.2 und 3 zeigen somit eine Expression der rekombinanten Protine Alta52, Alta22 und Altai 1 in Bluescript nach IPTG Induktion. e) Bestimmung von B- und T-Zell Epitopen bei den rekombinanten Allergenen

Die abgeleitete Aminosäuresequenz der Allergene bietet die Voraussetzung für die Vorhersage von B-und T-Zellepitopen mittels geeigneter Computerprogramme. Mit diesen Untersuchungen können spezifische T- und B-Zell-Epitope definiert werden, die die Fähigkeit besitzen, zB. T-Lymphozyten zu stimulieren und zur Proliferation anzuregen, aber die Zellen (bei genau definierter Dosis) auch in einen Zustand der Toleranz bzw. Nicht-Reaktivität (Anergie) zu versetzen (Rothbard et al. 1991). Die bestimmten Epitope werden jeweils bei der Beschreibung des rekombinanten Proteins in eigenen Figuren angeführt.

Die Suche nach B-Zellepitopen wurde mit Hilfe des GCG-Programmes (Genetics Computer Group) "PROTCALC”, das jedoch von der Arbeitsgruppe um Prof. Modrow mit wesentlichen Parametern erweitert wurde, durchgeführt. Die Bestimmung beruht auf einer Abwägung der Parameter Hydrophilität (Kyte-Doolittle), Sekundärstruktur (Chou-Fasman), Oberflächenlokalisation (Robson-Garnier) und Flexibilität, wodurch die Antigenität von Teilpeptiden errechnet wird. 4

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Das Prinzip der T-Zellepitop-Voraussage erfolte im Prinzip nach dem Algorithmus von Margalit et al. (1987). Das Prinzip besteht in der Suche nach amphipathischen Helices laut Primärsequenz des zu bestimmenden Proteins, flankiert von hydrophilen Bereichen. Der berechnete Score muß für relevante T-Zellepitope größer als 10 sein. Bei MHC II assoziierten Peptiden kann kein Konsensus, weder der Sequenz noch der Länge des Peptids nach, wie bei HLA-A2 (human leucocyte antigen) (MHC I) assoziierten definiert werden. Bei HLA-A2 assoziierten Peptiden beträgt die Länge des Peptids 10 Aminosäuren, wobei die 2. Aminosäure ein Tyrosin und die letzte Aminosäure ein Leucin darstellt (Rammensee et al. 1993). Die berechneten Epitope werden bei der Beschreibung der einzelnen allergenen Sequenzen getrennt angeführt. Molekulare Charakterisierung der klonierten Pilzallergene (Sequenzprotokolle)

Im folgenden werden nun die cDNA Sequenzen und die mit ihnen durchgeführten Analysen der Reihe nach angeführt. Die Computerauswertung der nachfolgenden Sequenzen wurden auf einer Ultrix-DEC 5000 Workstation unter Zuhilfename des GCG-Softwarepaketes ( = Wisconsin Paket: die Algorithmen dieses Paketes wurden von der "University of Wisconsin" entwickelt) durchgeführt. A. Alta53

Die nachfolgende Sequenz 1 zeigt die vollständige cDNA-Sequenz von Alta53 beginnend mit dem Start-ATG. Die Länge der cDNA beträgt 1488bp, was einem berechneten Molekulargewicht von 53543 Dalton entspricht. Die beobachtete Bande im Westernblot bei 53kD korreliert somit dem Molekulargewicht nach mit dem klonierten und sequenzierten Allergen. Dem reifen Protein dürfte nach bisheriger Analyse kein Signalpeptid voranstehen.

Sequenz 1: Alta53 = ALDH_alt - > 1-phasen Translation 53543 Dalton (1) ANGABEN ZU SEQ ID NO:1 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 1488 Basenpaare / 496 Aminosäurereste (B) ART: Nukleinsäure / Protein (C) STRANGFORM: ds (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA / Protein (iii) HYPOTHETISCH: nein (iv) ANTISENSE: nein (v) ART DES FRAGMENTS: Gesamtsequenz (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Alternaria alternans (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen 5 ΑΤ 400 723 Β DNA sequence 1488 b.p. ATGACATCTGTA ... CTGTTCGGTTAA linear 1 / 1 31 / 11 ATG ACA TCT GTA AAG CTC TCA ACC CCT CAG ACG GGC GAG TTC GAG CAG CCC ACC GGA CTC met thr ser val lys leu ser thr pro gln thr gly glu phe glu gln pro thr gly leu 61 / 22 91 / 31 TTC ATC AAC AAT GAG TTC GTA AAG GCT GTT GAC GGC AAG ACC TTT GAT GTT ATC AAC CCC phe ile asn asn glu phe val lys ala val asp gly lys thr phe asp val ile asn pro 122 / 41 151 / 51 TCC ACT GAG GAG GTC ATC TGC AGT GTT CAG GAG GCC ACC GAG AAG GAT GTT GAC ATT GCT ser ehr glu glu val ile cys ser val gln giu ala thr glu lys asp val asp ile ala 181 / 61 221 / 71 GTT GCT GCC GCC CGC AAA GCC TTC AAC GGC CCA TGG gcA AAG GAG ACA CCA GAG AAC AGG val ala ala ala arg lys ala phe asn gly pro trp ala lys glu thr pro glu asn arg 241 / 81 271 / 91 GGA AAG CTG CTT AAC AAG CTT GCC GAT CTG TTC GAG AAG AAT GCC GAC CTC ATT GCT GCT gly lys leu leu asn lys leu ala asp leu phe glu lys asn ala asp leu ile ala ala 301 / 101 331 / 111 GTC GAG GCT CTC GAC AAC GGC AAG GCC TTC AGC ATG GCC AAG AAC GTC GAT GTT CCC GCC val glu ala leu asp asn gly lys ala phe ser met ala lys asn val asp val pro ala 361 / 122 391 / 131 GCC GCT GGT TGC CTG AGG TAC TAC GGA GGA TGG GCC GAC AAG ATT GAG GGC AAG GTC GTC ala ala gly cys leu arg tyr tyr gly gly trp ala asp lys ile glu gly lys val val 422 / 141 451 / 151 GAC ACA GCA CCC GAC AGC TTC AAC TAC ATC CGC AAG AGC CTA TTG GTG TTT GCG GTC AGA asp thr ala pro asp ser phe asn tyr ile arg lys ser leu leu val phe ala val arg 481 / 161 511 / 171 TCA TCC ATG GAA CTT CCT ATT CTC ATG TGG TCA TGG AAG ATT GGT CCT GCC ATC GCC ACT sec ser met glu leu pro ile leu met trp ser trp lys ile gly pro ala ile ala thr 541 / 181 571 / 191 GGT AAC ACC GTC GTC CTG AAG ACT GCT GAG CAG ACA CCT CTC TCC GCA TAC ATT GCC TGC gly asn thr val val leu lys thr ala glu gln thr pro leu ser ala tyr ile ala cys 601 / 201 631 / 221 AAG CTG ATC CAG GAG GCC GGT ttc CCA CCA GGT GTC ATC AAC GTC ATC ACT GGT TTC GGA lys leu ile gln glu ala gly phe pro pro gly val ile asn val ile thr gly phe gly 661 / 222 691 / 231 AAG ATC GCC GGT GCT GCC ATG TCC GCT CAC ATG GAC ATT GAC AAG ATT GCC TTT ACT GGT lys ile ala gly ala ala met ser ala his net asp ile asp lys ile ala phe thr gly 6

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722 / 241 751 / 251 TCA ACC GTT GTC GGC CGT CAA ATC ATG AAG TCT GCc GCT GGC TCC AAC TTG AAG AAG GTC ser thr val val gly arg glr. ile met lys ser ala ala gly ser asn leu lys lys val 781 / 261 811 / 271 ACT CTT GAG CTC GGA GGC AAG AGC CCC AAC ATT GTC TTC GCC GAC GCA GAT CTT GAC GAG thr leu glu leu gly gly lys ser pro asn ile val phe ala asp ala asp leu asp glu 841 / 281 871 / 291 * GCT ATC CAC TGG GTC AAC TTT GGT ATT TAC TTC AAC CAC GGA CAG GCT TGT TGT GCT GGT ala ile his trp val asn phe gly ile tyr phe asn his gly gln ala cys cys ala gly 901 / 301 931 / 311 TCG CGT ATC TAC GTC CAA GAA GAG ATC TAC GAC AAG TTC ATC CAG CGC TTC AAG GAG CGG ser arg ile tyr val gln glu glu ile tyr asp lys phe ile gln arg phe lys glu arg 961 / 322 991 / 331 GCT GCT CAG AAC GCT GTT GGT GAC CCA TTC GCC GCG ACA CTC CAG GGT CCT CAA GTC TCG ala ala gln asn ala val gly asp pro phe ala ala thr leu gln gly pro gln val ser 1022 / 341 1053 . / 351 CAG CTC CAG TTC GAC CGT ATC ATG GGC TAC ATC GAG GAG GGC AAG AAG TCT GGC GCG ACC gln leu gln phe asp arg ile met gly tyr ile glu glu gly lys lys ser gly ala thr 1081 / 361 1111 . / 371 ATC GAG ACT GGT GGC AAC CGT AAG GGT GAC AAG GGT TAC TTC ATC GAG CCC ACA ATC TTC ile glu thr gly gly asn arg lys gly asp lys gly tyr phe ile glu pro ehr ile phe 1141 / 381 1171 . / 391 TCC AAC GTA ACC GAG GAC ATG AAG ATT CAG CAA GAA GAG ATC TTC GGC CCC GTC TGC ACA ser asn val thr glu asp met lys ile gln gln glu glu ile phe gly pro val cys thr 1201 t 401 1231 . / 411 ATC TCC AAG TTC AAG ACA AAG GCC GAC GTC ATC AAG ATT GGC AAC AAC ACC ACA TAC GGT ile ser lys phe lys thr lys ala asp val ile lys ile gly asn asn thr thr tyr gly 1261 / 422 1291 . / 431 Ctt tcG GCC GCT GTA CAC ACA TCC AAC CTC ACC ACT GCC ATC GAA GTT GCC AAC GCG CTC leu ser ala ala val his thr ser asn leu thr thr ala ile glu val ala asn ala leu 1322 / 441 1351 . / 451 CGT GCA GGA ACT GTC TGG GTC AAC TCC TAC AAC ACT CTT CAC TGG CAG CTT CCC TTC GGA arg ala gly thr val trp val asn ser tyr asn thr leu his trp gln leu pro phe gly 1381 / 461 1411 . / 471 GGG TAC AAG GAG TOT GGT ATT GGG CGC GAG TTG GGA GAG GCG GCG CTG GAC AAC TAC ATC gly tyr lys glu ser gly ile gly arg glu leu gly glu ala ala leu asp asn tyr ile 1441 / 481 147’ . / 4 91 CAG ACC AAG ACC GTG TCT ATT CGT CTT GGC CAT GTT CTG TTC GGT TAA gln thr lys thr val ser ile arg leu gly asp val leu phe gly OCH

Homologiesuchen mit Alta53 in der SWISSPROT-Proteindatenbank ergaben, daß es sich bei Alta53, wie auch bei Clah53, um eine Aldehyddehydrogenase handelt. Als Beweis der hohen Homologie (über viele Strecken handelt es sich um Identitäten) zeigt die folgende Sequenz 2 ein paarweises Alignment zwischen Alta53 und Clah53. Die Identität (identische Aminosäuren) der beiden Proteine (Allergene) untereinander 7

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beträgt 78%. Der Homologiegrad (Identitäten plus homologe Aminosäureaustausche) liegt sogar bei 86%. Sequenz 2: ALDH 1 MTSVKLSTPQTGEFEQPTGLFINNEFVKAVDGKTFDVINPSTEEVICSVQ 50

Ii II.I.II:.I.:IIII I I I I I II I I I s : I 1 I I I I I I II · 1 · ! I · I : 1 MTSVQLETPHSGKYEQPTGLFINNEFVKGQEGKTFDVINPSDESVITQVH 50 51 EATEKDVDIAVAAARKAFNGPWAKETPENRGKLLNKLADLFEKNADLIAA 100

IIIIIIII IIIIII I · I I : I . I I I I I I I I I I I I · I I : I ill I · I I : I I 51 EATEKDVDIAVAAARQAFEGSWRLETPENRGKLLNNLANLFEKNTDLLAA 100 101 VEALDNGKAFSMAKNVDVPAAAGCLRYYGGWADKIEGKWDTAPDSFNYI 150 II.IIIIII III: I. :.I.IIIIII I I I I I I I · I I I : II . I I. I I I : 101 VES LDNGKAT SMAR. VT S ACAS GCLRY Y GGWADKITGKVIDTT P DT FN YV 149

151 RK. SLLVFAVRSSMELPILMWSWKIGPAIATGNTWLKTAEQTPLSAYIA 199 : I · : I I:II I:I1 I .I I I I I I I I · I I I III I I I I I I I I I 150 ΚΚΕΡIGVCRSDHSLELPLLMWAWKIGPAIACGNTWLKTAEQTPLGGLVA 199 200 CKLIQEAGFPPGVINVITGFGKIAGAAMSAHMDIDKIAFTGSTWGRQIM 249 . · I : . I I I I I I I I I III . I I I I : I i I I : I . I Μ : I I : l I I I I I I I I I I : 200 ASLVKEAGFPPGVINVISGFGKVAGAALSSHMDVDKVAFTGSTWGRTIL 249 250 KSAAGSNLKKVTLELGGKSPNIVFADADLDEAIHWVNFGIYFNHGQACCA 299 I · I I : I I I I I I I I I I I I I I I l I I I . I I I : I : I I I I I I I I : I I I I I . I I I 250 KAAASSNLKKVTLELGGKSPNIVFEDADIDNAISWVNFG1FFNHGQCCCA 299 300 GSRIYVQEEIYDKFIQRFKERAAQNAVGDPFAA.TLQGPQVSQLQFDRIM 348

I I I : I II I I I II I : I : Μ I I I·.I·I I I I 1II I:IlII I I . : I I I I I I 8

AT 400 723 B 300 GSRVYVQESIYDKFVQKFKERAQKNWGDPFAADTFQGPQVSKVQFDRIM 349 349 GYIEEGKKSGATIETGGNRKGDKGYFIEPTIFSNVTEDMKIQQEEIFGPV 398 : I I II .. I I i : I I I I . I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ! I I .1111111 350 EYIQAGKDAGATVETGGSRKGDKGYFIEPTIFSNVTEDMKIVKEEIFGPV 399

399 CTISKFKTKADVIKIGNNTTYGLSAAVHTSNLTTAIEVANALRAGTVWVN 448 I .I.IIIII.I.II : I I .. I I II . I I I I I . I I . I I I II . I I I : I I II I I I 400 CSIAKFKTKEDAIKLGNASTYGLAAAVHTKNLNTAIEVSNALKAGTVWVN 449

449 SYNTLHWQLP FGGYKESGlGRELGEAALDNYIQTKTVSIRLGDVLFGZ 496 .11111 I : I I I I I I II I I I I I II I.II.II· I IIIIII I I I I · I I I I 450 TYNTLHHQMPFGGYKESGIGRELGEDALANYTQTKTVSIRLGDALFGZ 497

Die NAD-abhängige ALDH ist das Hauptenzym, das an der Oxidation von Azetaldehyd, einem Primärprodukt des Alkoholmetabolismus, im Menschen beteiligt ist. Isoenzyme sind hierbei oft zu finden (Harada et al. 1982). Beim Menschen z.B. findet man das Isoenzym ALDH I in Mitochondrien, ALDH II im Zytoplasma. Interessanterweise ist die Abwesenheit von ALDH I bei Asiaten keine Seltenheit (Harada et al. 1982). Die Defizienz von ALDH I resultiert in einem hohen Spiegel von Acetaldehyd, was sich als sogenanntes "flushing syndrome", sowie anderen vasomotorischen Symptomen nach Alkoholgenuß bemerkbar macht. Der Isoenzymverlust läßt sich auf eine Mutation zurückführen, die das native Protein in seiner Struktur verändert (Hsu et al. 1987). Der Zusammenhang zwischen ALDH und Allergieauslösung ist zum Zeitpunkt noch nicht bekannt.

Die nachfolgende Sequenz 3 zeigt die mit Computersuche identifizierten Bereiche mit hohem, antige-nen Index. Diese Bereiche stellen hochpotente B-Zellepitope dar.

Sequenz 3: Alta53-ALDH_alt B-Zellepitope (1) ANGABEN ZU SEQ ID NO:3 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: einzeln angeführt (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptide (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Alternaria alternans (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen 9

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Val Lys Leu Ser Thr Pro Gin Thr Gly Glu Phe Glu Gin Pro Thr Gly (4-19) Ala Val Asp Gly Lys Thr Phe (29-35) Ile Asn Pro Ser Thr Glu Glu (38-44) Gly Pro Trp Ala Lys Glu Thr Pro Glu Asn Arg Gly Lys Leu Leu Asn (70-85) Leu Arg Tyr Tyr Gly Gly Trp Ala Asp Lys Ile Glu Gly (125-137) Asp Thr Ala Pro Asp Ser Phe Asn Tyr Ile Arg Lys Ser (141-153) Glu Ala Gly Phe Pro Pro Gly Val (205-212) Gly Ser Asn Leu Lys Lys Val Thr Leu (254-262) Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Asn Ile (263-271) Tyr Ile Glu Glu Gly Lys Lys Ser Gly Ala Thr (350-360) Ile Glu Thr Gly Gly Asn Arg Lys Gly Asp Lys Gly Tyr Phe Ile Glu (361-376) Ile Gly Asn Asn Thr Thr Tyr Gly (413-420) Ala Val His Thr Ser Asn Leu Thr (424-431)

Die nachfolgende Sequenz 4 zeigt die mit Hilfe des Computerprogrammes bestimmten amphipathi-schen Helices, die von hydrophilen Bereichen flankiert werden. Solche Bereiche, mit einem Score höher als 10, stellen mögliche T-Zellepitope dar.

Sequenz 4: Vorausgesagte amphipathatische Segmente T-Zellepjtope

EFEQ

FVKAVD

KTFDVI

KAFNGPWA

KLLNKLADLFE

IAAVEALDNGKA

MAKNVDVP

AAGCLRYYGGWADKIEGK

VDTAPDSFNY

GVINVITGFGKI

IYDKFIQRFKERAA

NAVGDPFAAT

QFDRIMGYI

GPVCTI

AIEVANALR

RELGEAALD (1) ANGABEN ZU SEQ ID NO:4 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: einzeln angeführt (B) ART: Protein 10

AT 400 723 B (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptide (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Alternaria alternans (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen

Glu Phe Glu Gin (11- 16) Phe Val Lys Ala Val Asp (26- -31) Lys Thr Phe Asp Val Ile (33- -38) Lys Ala Phe Asn Gly Pro Trp Ala (66- •73) Lys Leu Leu Asn Lys Leu Ala Asp Leu Phe Glu (82-92) Ile Ala Ala Val Glu Ala Leu Asp Asn Gly Lys Ala (98- 109) Met Ala Lys Asn Val Asp Val Pro (112 >119) Ala Ala Gly Cys Leu Arg Tyr Tyr Gly Gly Trp Ala Asp Lys Ile Glu (121-138) Val Asp Thr Ala Pro Asp Ser Phe Asn Tyr (140-149) Gly Val Ile Asn Val Ile Thr Gly Phe Gly Lys Ile (211 -222) Ile Tyr Asp Lys Phe Ile Gin Arg Phe Lys Glu Arg Ala Ala (309-322) Asn Ala Val Gly Asp Pro Phe Ala Ala Thr (324-333) Gin Phe Asp Arg Ile Met Gly Tyr Ile (343 -351) Gly Pro Val Cys Thr Ile (396-401) Ala Ile Glu Val Ala Asn Ala Leu Arg (433 -441) Arg Glu Leu Gly Glu Ala Ala Leu Asp (469 -477}

Die T-Zellepitope errechnen sich aus den Aminosäurepositionen der Midpoints, die N-terminal von einem Lysin (K), C-terminal von einem Prolin (P) flankiert werden ( = Flags). Es sind nur dann potentielle T-Zellepitope vorhanden, wenn der "Score-Index" größer als 10 ist. B. Altai 1

Die folgende Sequenz 5 zeigt die vollständige cDNA-Sequenz von Altai 1 und der von ihr abgeleiteten Aminosäuresequenz. Der offene Leserahmen umfaßt 342bp b2w. 114 Aminosäuren. Das berechnete Molekulargewicht bertägt 11127 Dalton und entspricht somit dem 11 kD großen antigenen Protein, das im Westernblot von 10,3% der Patienten erkannt wird. 11

AT 400 723 B

Sequenz 5: Altai 1 =rla2_alt - > 1-phasen Translation 11127 Dalton (1) ANGABEN ZU SEQ ID NO:5 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 342 Basenpaare /114 Aminosäurereste (B) ART: Nukleinsäure / Protein (C) STRANGFORM: ds (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA / Protein (iii) HYPOTHETISCH: nein (iv) ANTISENSE: nein (v) ART DES FRAGMENTS: Gesamtsequenz (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Alternaria alternans (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen DNA Sequenz 342 b.p. ATGAAGCACCTC ... CTCTTCGACTAA linear

1 / 1 31 / 11 ATG AAG CAC CTC GCG GCA TAC CTC CTC CTC GGC CTT GGT GGC AAC ACc TCG CCC TCC GCT met lys his leu ala ala tyr leu leu leu gly leu gly gly asn thr ser pro ser ala 61 / 22 91 / 31 GCC GAC GTC AAG GCC GTC CTT GAG TCC GTT GGT ATC GAG GCT GAC TCC GAC CGT CTT GAC ala asp val lys ala val leu glu ser val gly ile glu ala asp ser asp arg leu asp 122 / 41 151 / 51 AAG CTG ATC TCC GAG CTT GAG GGC AAG GAC ATC AAC GAG CTC ATC GCT TCC GGT TCC GAG lys leu ile ser glu leu glu gly lys asp ile asn glu leu ile ala ser gly ser glu 181 / 61 221 / 71 AAG CTT GCT TCC GTT CCC TCC GGT GGT GCC GgT GGT GCT GCC GCT TCC GGT GGT GCT GCT lys leu ala ser val pro ser gly gly ala gly gly ala ala ala ser gly gly ala ala 241 / 81 271 / 91 GCC GCT GGT GGC TCC GCT CAG GCT GAG GcC GCT CCT GAG GCc GCC AAG GAG GAG GAG AAG ala ala gly gly ser ala gln ala glu ala ala pro glu ala ala lys glu glu glu lys 301 / 101 331 / 111 GAG GAG TCT GAC GAG GAC ATG GGT TTC GGT CTC TTC GAC TAA glu glu ser asp glu asp met gly phe gly leu phe asp OCH

Homoiogiesuchen in der SWISSPROT-Proteindatenbank ergaben hier Homologien zum ribosomalen Protein P2. Dieses ribosomale Protein ist an der Bildung der großen Untereinheit der Ribosomen beteiligt. Somit ist auch zwangsläufig eine Homologie zu Clahll, dem Gegenstück von Altall in Cladosporium herbarum, vorhanden. Die Identitäten und Homologien zwischen Altai 1 und Clah11 werden aus der folgenden Sequenz 6 heraus ersichtlich. Die Identität der beiden Proteine liegt bei 74%, der Homologiegrad wächst auf 84%, was zweifelsohne auf eine ähnliche Funktion dieser beiden Proteine hinweist. 12

AT 400 723 B

Sequenz 6: rla2 alt x rla2 clado 1 MKHLAAYLLLGLGGNTSPSAADVKAVLESVGIEADSDRLDKLISELEGKD 50 11.111:11111 I I. II I I.I:I.Ί I.IIII:II.:. : I :· I I I I I I 1 MKYLAAFLLLGL. GNSSPSAEDIKTVLSSVGIDADEEPSQLLLKELEGKD 4 9 51 INELIASGSEKLASVPSGGAGGAAASGGAAAAGGSAQAEAAPEAAKEEEK 100 I · I I · I I · I AEEKAEEEKK 92 I II I I · II I I I I i I I I I I I I I : I . I : I : I I I : I 50 INELZSSGSEKLASVPSGGAGAASAGGAAAAGG. 101 EESDEDMGFGLFDZ 114 I I I I : I I I I I II I I 93 EESDDDMGFGLFDZ 106

Saure ribosomale Proteine (wie PO, P1 und P2) von verschiedenen Organismen wurden mit einer Vielzahl von Techniken analysiert.Man unterscheidet A-Proteine (acidic) oder P-Proteine (phosphorylierte A-Proteine). Ein Merkmal der A-Proteine sind die große Zahl hydrophober Aminosäuren. Sie können deshalb relativ leicht vom Ribosom dissoziiert werden (50% Ethanol und hohe Salzkonzentration). Das am besten charakterisierte A-Protein in Prokaryonten ist das L7/L12 Protein von Escherichia coli. Die eukaryontischen Homologen sind die Proteine P1 und P2, die wie auch das L7/L12 Protein mit dem Elongationsfaktor EF1 und EF2 interagiert. Die C-terminale Sequenz beinhaltet ein Epitop, das von Autoantikörpern von Lupuspatienten erkannt wird (Francoeur et al. 1985, Rieh et al. 1987 , Hines et el. 1991). Das P2 Protein entspricht in seiner Homologie dem allergenen Protein Altai 1.

Die gezeigten B-Zellepitope in der nächsten Sequenz 7 sind unter Berücksichtigung von Sekundärstruktur, Oberflächenlage, Hydrophilität, Flexibilität etc. berechnet worden.

Sequenz 7: Altai 1*rla2_alt B-Zellepitope (1) ANGABEN ZU SEQ ID NO:7 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: einzeln angeführt (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptide (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Alternaria alternans (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen 13

AT 400 723 B

Leu Gly Gly Asn Thr Ser Pro Ser Ala Ala Asp (12-22)

Ile Glu Ala Asp Ser Asp Arg Leu Asp Lys Leu Ile Ser 132—44)

Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Asn Glu Leu (45-54)

Ala Ser Gly Ser Glu Lys Leu Ala Ser (56*64)

Pro Glu Ala Ala Lys Glu Glu Glu Lys Glu Glu Ser Asp Glu Asp Met Gly Phe (92-109)

Die folgende Sequenz 8 zeigt die berechneten T-Zellepitope und stellt die Aminosäuren im 1-Lettercode dar.

Sequenz 8: Vorausgesagte amphlpathatische Segmente T-Zellepjtope

RLDKLISELEGKDINEUASG

EKLASVPSGG (1) ANGABEN ZU SEQ ID NO:8 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: einzeln angeführt (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptide (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Alternaria alternans (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen

Arg Leu Asp Lys Leu Ile Ser Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Asn Glu Leu Ile Ala Ser Gly (38-58) Glu Lys Leu Ala Ser Val Pro Ser Gly Gly (60-69!

Die T-Zellepitope errechnen sich aus den Aminosäurepositionen der Midpoints, die N-terminal von einem Lysin (K), C-terminal von einem Prolin (P) flankiert werden (= Flags). Es sind nur dann potentielle T-Zellepitope vorhanden, wenn der "Score-Index" größer als 10 ist. C. Alta22

Die nachfolgende Sequenz 9 zeigt die vollständige cDNA Sequenz von Alta22. Die daraus abgeleitete Protein Primärsequenz ist ebenfalls aus der Sequenz ersichtlich. Der offene Leserahmen des allergenen Proteins beträgt 6l5bp, was einer Aminosäurelänge von 205 Aminosäuren entspricht. Das errechnete Molekulargewicht des rekombinanten Proteins beträgt 22041 Dalton. Laut bisheriger Analyse steht dem reifen Protein keine Signalseqenz voran.

Sequenz 9: YCP4_alt - > 1-phasen Translation 22041 Dalton (1) ANGABEN ZU SEQ ID NO:9 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 615 Basenpaare / 205 Aminosäurereste (B) ART: Nukleinsäure / Protein 14

AT 400 723 B (C) STRANGFORM: ds (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA / Protein (iii) HYPOTHETISCH: nein (iv) ANTISENSE: nein (v) ART DES FRAGMENTS: Gesamtsequenz (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Alternaria alternans (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen DNA sequence 615 b.p. ATGGCTCCCAAG ... GCGCATCAGTGA linear 1 / 1 31 / 11 ATG GCT CCC AAG ATC GCG ATT GTG TAC TAC TCC ATG TAC GGC CAC ATC AAG AAG ATG GCC met ala pro lys ile ala Ile val tyr tyr ser met tyr gly his ile lys lys met ala 61 / 22 91 / 31 GAT GCT GAG TTG AAG GGT ATC CAA GAG GCT GGC GGT GAT GCC AAG CTC TTC CAA GTC GCC asp ala glu leu lys gly ile gln glu ala gly gly asp ala lys leu phe gln val ala 122 / 41 151 / 51 GAS ACC CTG CCT CAG GAA GTC CTC GAC AAG ATG TAC GCG CCC CCC AAG GAC TCA TCG GTC glu thr leu pro gln glu val leu asp lys met tyr ala pro pro lys asp ser ser val 181 t 61 221 / 71 CCC GTC CTC GAG GAC CCA GCC GTC CTC GAA GAA TTT GAC GGC ATC CTC TTC GGC ATC CCC pro val leu glu asp pro ala val leu glu glu phe asp gly ile leu phe gly ile pro 241 / 81 271 / 91 ACC CGC TAC GGC AAC TTC CCC GCA CAA TTC AAG ACC TTC TGG GAC AAG ACA GGC AAG CAA thr arg tyr gly asn phe pro ala gln phe lys thr phe trp asp lys thr gly lys gln 301 / 101 331 / 111 TGG CAA CAA GGC GCC TTT TGG GGA AAG TAC GCC GGT GTC rrc GTT TCG ACG GGC ACC CTG trp gln gln gly ala phe trp gly lys tyr ala gly val phe val ser thr gly thr leu 361 / 122 391 / 131 GGCGGGT GGC CAG GAG ACG ACT GCC ATT ACC AGC ATG AGC ACG CTT GTC GAC CAC GGT TTC gly gly gly gln glu thr thr ala ile thr ser met ser thr leu val asp his gly phe 422 / 141 4 51 / 151 ATC TAC GTT CCC CTT GGC TAC AAG ACT GCG TTT AGC ATG TTG GCC AAC TTG GAC GAG GTC Ile tyr val pro leu gly tyr lys thr ala phe ser met leu ala asn leu asp glu val 481 / 161 511 / 171 CAC GGT SGA AGC CCA TGG GGT GCT GGT ACC TTC TCT GCC GGC GAT GGA TCG AGG CAG CCC hi s gly gly ser pro trp gly ala gly thr phe ser ala gly asp gly ser arg gln pro 541 / 181 571 / 191 AGT GAG crr GAG CTC AAC ATT GCG CAG GCT CAG GGT AAG GCT TTC TAC GAG GCT GTT GCC ser glu leu glu leu asn ile ala gln ala gln gly lys ala phe tyr glu ala val ala 15

AT 400 723 B 601 / 201

AAG GCG CAT CAG TGA

lys ala his gln OPA

Homologiesuchen mit dem sequenzierten Protein in der SWISSPROT-Proteindatenbank zeigten, daß das Allergen Alta22 signifikante Homologie zu dem Hefeprotein YCP4 aufweist. Die Identität der beiden Proteine beträgt 56%, die Homologie steigt sogar auf 72% an. Eine so hohe Ähnlichkeit läßt wohl eine gemeinsame Funktion dieser beiden Proteine annehmen. Die nachfolgende Sequenz 10 spiegelt die hohe Homologie von Alta22 und YCP4 wieder.

Sequenz 10: ycp4_alt x ycp4_yeast 1 MAPKIAIVYYSMYGHIKKMAOAELKGIQEAGGDAKLFQVAETLPQEVLDK 50 I . || II: II I III. :I:I | I : : . I I I . I . :: . I . I III : I I I . 1 1 MV.KIAIITYSTYGHIDVLAQAVKKGVEAAGGKADIYRVEETLPDEVLTK 4 9

51 MYAPPKDSSVPVLEDPAVLEEFDGILFGIPTRYGNFPAQFKTFWDKTGKQ 100 I 11.1...:11 .:..:11 : I :: II I : I I I : I I : I I I : - - I I I I I I 50 MNAPQKPEDIPVATEKTLLE.YDAFLFGVPTRFGNLPAQWSAFWDKTGGL 98 101 WQQGAFMGKYAGVFVSTGTLGGGQETTAITSKSTLVDHGFIYVPLGYKTA 150 [..1.: II I I : I I I I :. . I 1 I I I . i . .::1 1..11:1::11111.. 99 WAKGSLNGKAAGIFVSTSSYGGGQESTVKACLSYLAHHGIIFLPLGYKNS 148

151 FSMLANLDEVHGGSPWGAGTFSAGDGSRQPSELELNIAQAQGKAFYE.A. 198 I . I I . :: I I I I I I I I I I I I : - : . I I I I :1.111.11: I I I - I I I I 149 FAELASIEEVHGGSPWGAGTLAGPDGSRTASPLELRIAEIQGKTFYETAK 196 199 ...VAK...............AHQ2 205 -II I . . : 199 KLFPAKEAKPSTEKKTTTSOAAKRQ 223

Was ist aber nun die Funktion von YCP4: Die Sequenz, bzw. der offene Leserahmen von YCP4, wurde im Rahmen des Hefegenomprojektes am Chromosom 3 von Saccharomyces cerevisiae lokalisiert und publiziert (Biteau et al. 1992). Eine Disruption von YCP4 zeigte nach Biteau et al. (1992) keinen Phänotyp. Durchgeführte verfeinerte Phänotypanalysen deuten aber darauf hin, daß Hefe YCP4 eine Funktion als Hitzeschockprotein besitzen könnte. Dieser Versuch zeigt nebenbei, wie wichtig Saccharomyces cerevisiae für die Funktionsanalyse von Allergenen sein kann. Die leichte Transformierbarkeit, verbunden mit ausgereiften Methoden der Molekulargenetik ermöglichen es, Gene in Hefe zu disruptieren und den daraus resultierenden Phänotyp zu analysieren.

Es hat sich auch gezeigt, daß auch Alta22 seinen homologen Partner in Cladosporium herbarum besitzt. Die folgende Sequenz 11 zeigt ein "multiple sequence alignment" zwischen dem Hefe YCP4 und den Allergenen Alta22 und Clah22. 16

AT 400 723 B

Sequenz 11: pileup.msf{YCP4_altpro) 1 MAPKIAIVYY SmYGHIkkMA DAElKGIqEA GGdAkLFqVa 50 ETLPQEVLdK pileup.ms £(YCP4_cladoprοI MAPKIAIIFY STWGKVqtLA EAEaKGIrEA GGsvOLYRVp ETLtQEVLTK pi1eup.ms £{ycp4_yeast} .mvKIAlItY STYGKIdvLA qAvkKGVeaA GGkADiYRVe ETLPdEVLTK Consensus ---XIAI—Y S—GH----A -A—KG---A GG------V- ETL—EVL-K pileup.rtsf {YCP4_altpro) 51 MyAPPKDsSV PVleOPaVLE eFDgiLFGIP TRiGNFPAQF 100 kTFWDKTGkC pileup.ms£IYCP4_cladopro) MhAPPKDDSI PeiTDPfILE qYDrFphGhP TRYGNFPAQW rTFWDrTGGQ pi1eup.ms f{ycp4_yea st J MnAPqKpEdl PVaTEktlLE .YDaFLFGVP TRFGNLPAQW saFWDKTGGl Consensus M-AP-K---- P-------LE — D----G-P TR-GN-PAQ- — FWD-TG— pileup.msf(YCP4_altproj 101 WQqGAFWGKY AGVFVSTGT1 GGGQEtTAit sMSTLvdHGf 150 IYVPLGYKTa pileup.ms£ < YCP4_cladopro J WQtGAFWGKY AGlFISTGTq GGG0ESTA1A aMSTLsHHGI lYVPLGYKTt pileup.msflycp4_yeast) WakGsLnGKa AGIFVSTssy GGGQESTvtcA CLSyLaHHGI IFIPLGYKns Consensus W—G---GK- AG-F-ST--- GGGQE-T--- —S-L—HG- I—PLGYK— pileup.msf(YCP4_altpro· 151 FsMLAnlDEV HGGSPWGAGT FSaGDGSRQP SeLELnlAqA 200 QGKAFYEAVA pileup.msf(YCP4_cladopro) FhLLgdnsEV rGaavWGAGT FSGGDGSRQ? SqkELelt.A QGKAFYEAVA pileup.msf{ycp4_yeast | FaeLAsiEEV HGGSPWGAGT LaGpDGSRta SpLELrlAei QGKtFYEtafc Consensus F—L——EV -G---KGAGT ----DGSR— S—EL----- QGK-FYE--- pileup.msf!YCP4_altpro) 201 KahqZ..... 249 pileup.msf!YCP4_cladopro) KvnfQz..., pileup.msf!ycp4_yeast) Klfpakeakp stekktttsd aakrqtkpaa attaekkedk - gllscctvm

Consensus K·

Die mit Computerunterstützung gefundenen B-Zellepitope sind in der nächsten Sequenz 12 zu sehen. Sequenz 12: Alta22=YCP4_alfc B-Zeflepitope (1) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: einzeln angeführt (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptide (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: 17

AT 400 723 B (A) ORGANISMUS: Alternaria alternans (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen

Lys Met Tyr Ala Pro Pro Lys Asp Ser Ser Val (SO—60}

Ile Pro Thr Arg Tyr Gly Asn phe Pro (79-87)

Gin Phe Lys Thr Phe Trp Asp Lys Thr Gly Lys Gin Trp Gin Gin Gly Ala Phe Trp Gly Lys Tyr Ala Gly 189-112)

Gly Thr Leu Gly Gly Gly Gin Glu Thr Thr Ala Ile Thr Ser (118-131)

Leu Asp Glu Val His Gly Gly Ser Pro Trp Gly Ala Gly Thr (157-170)

Phe Ser Ala Gly As? Gly Ser Arg Gin Pro Ser Glu Leu Glu Leu (171-185)

Die nachfolgende Sequenz 13 zeigt die berechneten T-Zellepitope. Amphipathische Bereiche mit einem Score geringer als 10 werden als nicht relevant angenommen.

Sequenz 13:Vorausgesagte amphipathatische Segmente T-Zellepitope

SMYGHIKKMAD

GIQEA

LFQVAETLPQEVLDKMYA

AVLEEFDGI

TRYGNFPAQFKTFWDKTGKQW

TAITSMSTL

FSMLANLDEVHG

QGKAFYEAVA (1) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: einzeln angeführt (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptide (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Alternaria alternans (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen 18

AT 400 723 B

Ser Met Tyr Gly His Ile Lys Lys Met Ala Asp ( 11-21)

Sly Ile Gin Glu Ala (26-30) 5

Leu Phe Gin Val Ala Glu Thr Leu Pro Gin Glu Val Leu Asp Lys Met Tyr Ala (36-53)

Ala Val Leu Glu Glu Phe Asp Gly Ile (6*7—"75) 10 Thr Arg Tyr Gly Asn Phe Pro Ala Gin Phe Lys Thr Phe Trp Asp Lys Thr Gly Lys Gin Trp 181-101)

Thr Ala Ile Thr Ser Met Ser Thr Leu (121-135) 15

Phe Ser Met Leu Ala Asn Leu Asp Glu Val His Gly (151-162)

Gin Gly Lys Ala Phe Tyr Glu Ala Val Ala (191-200)

Die T-Zellepitope errechnen sich aus den Aminosäurepositionen der Midpoints, die N-terminal von einem Lysin (K), C-terminal von einem Prolin (P) flankiert werden (= Flags). Es sind nur dann potentielle T-Zellepitope vorhanden, wenn der "Score-Index" größer als 10 ist. 25 Agarwal, M.K., Jones, R.T., Yunginger, J.W. (1982).

Shared allergenic and antigenic determinants in Alternaria and Stemphylium extracts. J. Allergy Clin. Immunol. 70 (6), 437.

Birkner, T., Rumpold, H., Jarolim, E. Ebner, H., Breitenbach, M„ Skarvil, F„ Scheiner, 0., Kraft, D. (1990). Evaluation of immunotherapy-induces changes in specific IgE, IgG and IgG subclasses in birch pollen 30 allergic patients by means of immunoblotting. Correlation with clinical response.

Allergy 45, 418.

Biteau, N., Fremaux, C., Hebrard, S., Menara, A., Aigle, M„ Crouzet, M. (1992).

The complete sequence of a I0.8kb fragment to the right of the chromosome III centromere of Saccharomyces cerevisiae. 35 Yeast8,61.

Bousquet, J., Becker, W.M., Hejjaoudi, A. (1991).

Differences in clinical and immunologic reactivity of patients allergic to grass pollens and to multiple-pollen species. II. Efficacy of a double blind, placebo-controlled, specific immunotherapy with standardized extracts. 40 J. Allergy Clin. Immunol. 88, 43.

Budd, T.W. (1986).

Allergens of Alternaria.

Grana 25, 147.

Francoeur, A.M., Peebles, C.L., Heckman, K.J., Lee, J.C., Tan, E.M. (1985). 45 Identification of ribosomal protein autoantigens. J. Immunol. 135, 1767.

Harada, S., Agarwal, D.P., Goedde, H.W. (1982).

Mechanism of alcohol sensitivity and disulfiram-ethanol reaction.

Subst. Alco. Act. Misuse. 3, 107. so Hines, J.J., Weissbach, H„ Brot, N., Elkon, K. (1991).

Anti-P autoantibody production requires P1/P2 as immunogens but is not driven by exogenous self-antigen in mrl mice. J. Immunol.. 146, 3386.

Klein, J. (1991). 55 VCH Verlagsgesellschaft Weinheim, New York, Basel, Cambridge.

Immunologie.

Margalit, H., Spogue, J.L., Cornette, J.L., Cease, K.B., Delisi, C., Berzofsky, J.A. (1987).

Pre'diction of immunodominant Helper T cell antigenic Sites from the primary sequence. 19

Claims (12)

1. AT 400 723 B J. Immunol. 138, 2213. Miyamoto, T. (1992). Advances in Allergology and Clinical Immunology. Eds. Ph Godard, J. Bousquet, F.B. Miches. EAACI Congress Paris, 10-15, May 1992. The Parthenon Publishing Group, Casterton Hall U.K., New Jersey, USA p.343. Nyholm, L., Löwenstein, H., Yunginger, J.W. (1983). Immunochemical partial Identity between two independently identified and isolated major allergens from Alternaria alternata (Alt-1 and Ag1). L. Allergy Clin. Immunol. 71 (5), 461. Parronchi, P., Macchia, D„ Piccinni, M.P. (1991). Allergen- and bacterial antigen-specific T-cell clones established from atopic donors show a different profile of cytokine production. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 4538. Rammensec, H.G., Falk, K„ Rötzschke, O. (1993). MHC molecules as peptide receptors. Current Opinion in Immunol. 5, 35. Rieh, B.E., Steitz, J.A. (1987). Human acidic ribosomal phosphoproteins PO, P1 and P2: analysis of cDNA clones, in vitro synthesis and assembly. Mol. Cell. Biol. 7, 4065. Roitt, I. (1991). Essential Immunology 7th Edition. Oxford Blackwell scientific publications. London Edinburgh Boston Melbourne Paris Berlin Vienna Rothbard, J.B., Gefter, M.L. (1991). Interactions between immunogenic peptides and MHC proteins. Ann. Rev. Immunol. 9, 527. Sänger, F„ Nicklen, S., Coulson, A.R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating Inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5468 Wüthrich, B. (1991). Allergy and Clin. Immunol. News 3, 41. Yunginger, J.W., Jones, R.T., Nesheim, M.E., Geller, M. (1980). Studies on Alternaria allergens III. Isolation of a major allergenic fraction (Alt-1). J. Allergy Clin. Immunol. 66 (2), 138. Patentansprüche 1. Rekombinante DNA Moleküle, die für Polypeptide kodieren, die die Antigenität der Allergene Alta53, Alta22 und Altai 1 besitzen oder für Peptide, die mindestens ein Epitop dieser Allergene aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß sie Nukleinsäuresequenzen aufweisen, die mit den Sequenzen 1, 3-5, 7-9, 12 und 13, oder mit Teilbereichen dieser Sequenzen in homologer Weise übereinstimmen, bzw. Nucleinsäuresequenzen, die mit den genannten Nucleinsäuresequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
2. 2. Rekombinante DNA-Moleküle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Nukleinsäuresequenzen aufweisen, die durch Degeneration aus den Sequenzen 1, 3-5, 7-9, 12 und 13 ableitbar sind.
3. 3. Rekombinante DNA Moleküle nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie Nukleinsäuresequenzen aufweisen, die für Polypeptide kodieren, die als Antigene kreuzreaktiv mit den Allergenen Alta53, Alta22 und Altai 1 sind und zu diesen eine hohe Homologie aufweisen.
4. 4. Rekombinante DNA-Moleküle nach Ansprüchen 1 bis 3. dadurch gekennzeichnet, daß sie funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz zu einem Expressionskonstrukt verbunden sind.
5. 5. Wirtssystem zur Expression von Polypeptiden, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem rekombin-anten Expressionskonstrukt nach Anspruch 4 transformiert ist. 20 AT 400 723 B
6. 6. Aus einem ONA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 abgeleitetes rekombinantes oder synthetisches Protein oder Polypeptid, dadurch gekennzeichnet daß es die Antigenität von Alta53, Alta22 oder Altai 1, oder zumindest von einem Epitop dieser Proteine, aufweist.
7. 7. Rekombinantes oder synthetisches Protein oder ein Polypeptid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Aminosäuresequenz aufweist, die den gezeigten Sequenzen 1, 3-5, 7-9, 12 und 13 zur Gänze oder teilweise entspricht.
8. 8. Rekombinantes oder synthetisches Protein oder Polypeptid nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Fusionsprodukt darstellt, das die Antigenität der Allergene Alta53, Alta22 oder Altai 1, oder zumindest eines Epitops davon, aufweist und einen zusätzlichen Polypeptidanteil besitzt, wobei das gesamte Fusionsprodukt von der DNA eines Expressionskonstrukts gemäß Anspruch 4 kodiert wird.
9. 9. Rekombinantes oder synthetisches Protein oder Polypeptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der besagte zusätzliche Polypeptidanteil ß-Galaktosidase oder ein anderes zur Fusion geeignetes Polypeptid ist.
10. 10. Diagnostisches oder therapeutisches Reagens, dadurch gekennzeichnet, daß es ein synthetisches Protein oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9 enthält.
11. 11. Verfahren zum in vitro -Nachweis der Allergie eines Patienten gegen die Allergene Alta53, Alta22 oder Altai 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion der IgE Antikörper im Serum des Patienten mit einem rekombinanten oder synthetischen Protein oder Polypeptid nach einem der Anprüche 6 bis 9 gemessen wird.
12. 12. Verfahren, zum in vitro - Nachweis der zellulären Reaktion auf die Allergene Alta53, Alta22 oder Altai 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes oder synthetisches Protein oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 6 bis 9 zur Stimulierung oder Hemmung der zellulären Reaktion eingesetzt wird. Hiezu 1 Blatt Zeichnungen 21