BG64681B1 - Подобрен метод за получаване на алкохолни питиета от малцови семена - Google Patents
Подобрен метод за получаване на алкохолни питиета от малцови семена Download PDFInfo
- Publication number
- BG64681B1 BG64681B1 BG103199A BG10319999A BG64681B1 BG 64681 B1 BG64681 B1 BG 64681B1 BG 103199 A BG103199 A BG 103199A BG 10319999 A BG10319999 A BG 10319999A BG 64681 B1 BG64681 B1 BG 64681B1
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- malt
- beer
- enzyme
- enzymes
- seeds
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 7
- 235000013334 alcoholic beverage Nutrition 0.000 title claims description 6
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 71
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 title description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 131
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 131
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 claims abstract description 77
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 claims abstract description 22
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 129
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 69
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 36
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 33
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 claims description 5
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims description 3
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 29
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 abstract description 10
- 235000015041 whisky Nutrition 0.000 abstract description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 abstract 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 52
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 41
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 37
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 238000013124 brewing process Methods 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 13
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 11
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 11
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 9
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 8
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 7
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 7
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 6
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 6
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 6
- 241000959173 Rasamsonia emersonii Species 0.000 description 6
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 238000004890 malting Methods 0.000 description 6
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 108010001817 Endo-1,4-beta Xylanases Proteins 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 5
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 241000131386 Aspergillus sojae Species 0.000 description 4
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 4
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N Thr-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 4
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 4
- 230000003625 amylolytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 4
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 4
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 3
- 101001090725 Leuconostoc gelidum Bacteriocin leucocin-A Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 3
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- XDMACMMTPGFUCZ-UHFFFAOYSA-N Tetra-Ac-Benzyl glucopyranoside Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(COC(=O)C)OC1OCC1=CC=CC=C1 XDMACMMTPGFUCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- SYUXAJSOZXEFPP-UHFFFAOYSA-N glutin Natural products COc1c(O)cc2OC(=CC(=O)c2c1O)c3ccccc3OC4OC(CO)C(O)C(O)C4O SYUXAJSOZXEFPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002573 hemicellulolytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- LWTDZKXXJRRKDG-KXBFYZLASA-N (-)-phaseollin Chemical compound C1OC2=CC(O)=CC=C2[C@H]2[C@@H]1C1=CC=C3OC(C)(C)C=CC3=C1O2 LWTDZKXXJRRKDG-KXBFYZLASA-N 0.000 description 2
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROLXPVQSRCPVGK-XDTLVQLUSA-N Ala-Glu-Tyr Chemical compound N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O ROLXPVQSRCPVGK-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 2
- OBVSBEYOMDWLRJ-BFHQHQDPSA-N Ala-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N OBVSBEYOMDWLRJ-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 2
- YJHKTAMKPGFJCT-NRPADANISA-N Ala-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O YJHKTAMKPGFJCT-NRPADANISA-N 0.000 description 2
- SYFHFLGAROUHNT-VEVYYDQMSA-N Arg-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SYFHFLGAROUHNT-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 2
- SJUXYGVRSGTPMC-IMJSIDKUSA-N Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O SJUXYGVRSGTPMC-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- JGIAYNNXZKKKOW-KKUMJFAQSA-N Asn-His-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N JGIAYNNXZKKKOW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- UOUHBHOBGDCQPQ-IHPCNDPISA-N Asn-Phe-Trp Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N UOUHBHOBGDCQPQ-IHPCNDPISA-N 0.000 description 2
- DPSUVAPLRQDWAO-YDHLFZDLSA-N Asn-Tyr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N DPSUVAPLRQDWAO-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 2
- WSGVTKZFVJSJOG-RCOVLWMOSA-N Asp-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O WSGVTKZFVJSJOG-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 2
- IDDMGSKZQDEDGA-SRVKXCTJSA-N Asp-Phe-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IDDMGSKZQDEDGA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N Asp-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N 0.000 description 2
- LOEKZJRUVGORIY-CAMMJAKZSA-N Asp-Phe-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 LOEKZJRUVGORIY-CAMMJAKZSA-N 0.000 description 2
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 2
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 2
- CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N Gly-Leu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- CUVBTVWFVIIDOC-YEPSODPASA-N Gly-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)CN CUVBTVWFVIIDOC-YEPSODPASA-N 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- RAVLQPXCMRCLKT-KBPBESRZSA-N His-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O RAVLQPXCMRCLKT-KBPBESRZSA-N 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HYMLKESRWLZDBR-WEDXCCLWSA-N Leu-Gly-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HYMLKESRWLZDBR-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 2
- RUTZUJXAVNWLQP-BVSLBCMMSA-N Met-Tyr-Trp Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 RUTZUJXAVNWLQP-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 2
- WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N N-L-alanyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 2
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- WFUAUEQXPVNAEF-ZJDVBMNYSA-N Thr-Arg-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)CCCN=C(N)N WFUAUEQXPVNAEF-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 2
- XDARBNMYXKUFOJ-GSSVUCPTSA-N Thr-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XDARBNMYXKUFOJ-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 2
- KBBRNEDOYWMIJP-KYNKHSRBSA-N Thr-Gly-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N)O KBBRNEDOYWMIJP-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 2
- IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N 0.000 description 2
- OGOYMQWIWHGTGH-KZVJFYERSA-N Thr-Val-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OGOYMQWIWHGTGH-KZVJFYERSA-N 0.000 description 2
- UPUNWAXSLPBMRK-XTWBLICNSA-N Trp-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O UPUNWAXSLPBMRK-XTWBLICNSA-N 0.000 description 2
- XKTWZYNTLXITCY-QRTARXTBSA-N Trp-Val-Asn Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 XKTWZYNTLXITCY-QRTARXTBSA-N 0.000 description 2
- YGKVNUAKYPGORG-AVGNSLFASA-N Tyr-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O YGKVNUAKYPGORG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- AKLNEFNQWLHIGY-QWRGUYRKSA-N Tyr-Gly-Asp Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O AKLNEFNQWLHIGY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- GULIUBBXCYPDJU-CQDKDKBSSA-N Tyr-Leu-Ala Chemical compound [O-]C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 GULIUBBXCYPDJU-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 2
- CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 2
- JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N Tyr-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 2
- KKHRWGYHBZORMQ-NHCYSSNCSA-N Val-Arg-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N KKHRWGYHBZORMQ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- WPSXZFTVLIAPCN-WDSKDSINSA-N Val-Cys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O WPSXZFTVLIAPCN-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- GBESYURLQOYWLU-LAEOZQHASA-N Val-Glu-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N GBESYURLQOYWLU-LAEOZQHASA-N 0.000 description 2
- GVRKWABULJAONN-VQVTYTSYSA-N Val-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GVRKWABULJAONN-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 2
- GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N Val-Tyr-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)NCC(O)=O GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 108010035534 tyrosyl-leucyl-alanine Proteins 0.000 description 2
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 238000003466 welding Methods 0.000 description 2
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 description 2
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 description 2
- -1 β-glucans Chemical class 0.000 description 2
- PKZFFNJDFBBUIS-ZSCHJXSPSA-N (2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;4-nitroaniline Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O.NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 PKZFFNJDFBBUIS-ZSCHJXSPSA-N 0.000 description 1
- BKUKXOMYGPYFJJ-UHFFFAOYSA-N 2-ethylsulfanyl-1h-benzimidazole;hydrobromide Chemical compound Br.C1=CC=C2NC(SCC)=NC2=C1 BKUKXOMYGPYFJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- WIDVAWAQBRAKTI-YUMQZZPRSA-N Asn-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O WIDVAWAQBRAKTI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- RTFXPCYMDYBZNQ-SRVKXCTJSA-N Asn-Tyr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RTFXPCYMDYBZNQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 101710130006 Beta-glucanase Proteins 0.000 description 1
- 108700038091 Beta-glucanases Proteins 0.000 description 1
- 101000726146 Brassica napus Cruciferin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- JVWPPCWUDRJGAE-YUMQZZPRSA-N Gly-Asn-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O JVWPPCWUDRJGAE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002704 Leucyl aminopeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010004098 Leucyl aminopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- CIDICGYKRUTYLE-FXQIFTODSA-N Met-Ser-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CIDICGYKRUTYLE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 101710163504 Phaseolin Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 1
- 240000003834 Triticum spelta Species 0.000 description 1
- 235000004240 Triticum spelta Nutrition 0.000 description 1
- GFHYISDTIWZUSU-QWRGUYRKSA-N Tyr-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GFHYISDTIWZUSU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- VTFWAGGJDRSQFG-MELADBBJSA-N Tyr-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)C(=O)O VTFWAGGJDRSQFG-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- NRFTYDWKWGJLAR-MELADBBJSA-N Tyr-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)C(=O)O NRFTYDWKWGJLAR-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- 229920002494 Zein Polymers 0.000 description 1
- JUGOREOARAHOCO-UHFFFAOYSA-M acetylcholine chloride Chemical compound [Cl-].CC(=O)OCC[N+](C)(C)C JUGOREOARAHOCO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010050181 aleurone Proteins 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010076955 arabinogalactan endo-1,4-beta-galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 229920000617 arabinoxylan Polymers 0.000 description 1
- 108010052439 arabinoxylanase Proteins 0.000 description 1
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000005340 bisphosphate group Chemical group 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930002868 chlorophyll a Natural products 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 229930002869 chlorophyll b Natural products 0.000 description 1
- NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M chlorophyll b Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C=O)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 description 1
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 230000002478 diastatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 108010036895 endo-alpha-sialidase Proteins 0.000 description 1
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 108010041969 feruloyl esterase Proteins 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 201000011243 gastrointestinal stromal tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 230000005499 meniscus Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- LWTDZKXXJRRKDG-UHFFFAOYSA-N phaseollin Natural products C1OC2=CC(O)=CC=C2C2C1C1=CC=C3OC(C)(C)C=CC3=C1O2 LWTDZKXXJRRKDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 230000002786 root growth Effects 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- MFFIRXGJJPPAMA-QLYHWAPBSA-N ulein Chemical compound C1=CC=C2C([C@@H]3N(C)CC[C@@H](C4=C)C3CC)=C4NC2=C1 MFFIRXGJJPPAMA-QLYHWAPBSA-N 0.000 description 1
- FCWXLJIBTVFAQF-UHFFFAOYSA-N uleine Natural products CCC1C2CCN(C)C1C3C(Nc4ccccc34)C2=C FCWXLJIBTVFAQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000005418 vegetable material Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 239000005019 zein Substances 0.000 description 1
- 229940093612 zein Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01073—Licheninase (3.2.1.73)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
- C12C5/00—Other raw materials for the preparation of beer
- C12C5/004—Enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
- C12C5/00—Other raw materials for the preparation of beer
- C12C5/004—Enzymes
- C12C5/006—Beta-glucanase or functionally equivalent enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
- C12C7/00—Preparation of wort
- C12C7/04—Preparation or treatment of the mash
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
- C12C7/00—Preparation of wort
- C12C7/04—Preparation or treatment of the mash
- C12C7/047—Preparation or treatment of the mash part of the mash being unmalted cereal mash
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
- C12N9/248—Xylanases
- C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01001—Alpha-amylase (3.2.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Alcoholic Beverages (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Distillation Of Fermentation Liquor, Processing Of Alcohols, Vinegar And Beer (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Изобретението се отнася до метод за получаване на бира или уиски със смес от ензими, включваща ендо- (1,4)-ксиланаза, арабинофуранозидаза, -малтаза, ендопротеаза и -(1,3; 1,4)-глюканаза и, по желание, озахаряваща амилаза и/или екзопептидаза. Предпочитат се смеси, в които нужните за процеса на варене на бирата ензими се осигуряват от трансгенни семена. Необходимо е минимално количество малц запридаване на вкус и цвят.
Description
Област на техниката
Настоящото изобретение се отнася до метод за получаване на алкохолни питиета, по-специално на бира и уиски.
Предшестващо състояние на техниката
Алкохолни питиета като бира могат да се получават от малцови и/или не малцови семена ечемик. Малцът, като добавка към дрождите, допринася за цвета и вкуса на бирата. Освен това малцът действа като източник на ферментируеми захари и ензими. Дали малцът ще се използва в процеса на варене на бирата зависи от вида на бирата и от страната, където се произвежда бирата. В африканските страни, например, традиционно не се използва малц.
Общият метод за малцуване и варене на бирата е наскоро описан от R.C. Hoseney (Cereal Foods World, 39(9), 675-679,1994). Малцуването е процес на контролирано покълване, следван от контролирано сушене на ечемичените зърна. Зърната се обвиват с малц чрез последователни етапи на накисване, покълване, прорастване и сушене (убиване). В този смисъл етапът на покълване е важен за получаване на експресия на серия ензими, които позволяват модификация на ендосперма. Тази модификация води до получаване на ферментативни въглехидрати.
Следващият етап на сушене/нагряване от процеса на малцуване продуцира вкус и цвят, дължащи се на неензимни реакции на потъмняване (Millard).
Процесът на малцуване е много сложна и скъпа част от процеса на производство на бира. Могат да се споменат някои недостатъци на процеса на малцуване:
- ензимното ниво на малца е променливо, което води до непредвидими резултати,
- не се достига всяка желана ензимна активност или се образува в недостатъчно количество по време на покълването, което прави необходимо добавянето на ензими,
- условия, които благоприятстват добрия вкус и цвят, могат да се окажат пагубни за ензимната активност на малца,
- процесът е скъп,
- получават се 10 - 20% загуби в теглото по време на покълването, дължащо се на дишането и растежа на коренчетата (които се отстраняват по време на почистването на малца),
- не е възможно да се продуцира малц на всяко желано място, поради неблагоприятни климатични условия
- използването на малц може да доведе до колоидална нестабилност поради разтварянето на протеина от присъстващата в малца протеиназа,
- може да се получи образуване на биогенни амини (J, Food Science 59 (5), 1104-1107,1994), коиго могат да доведат до, например, хистаминова интоксикация.
Традицонно малцът е единственият източник на ферментируеми въглехидрати, и в много страни все още е. Въпреки това, до сега все повече и повече бира се произвежда при използване на други източници на въглехидрати, вместо малц и/или ечемик, например, фактически всяка скорбяла или вгечнена/разградена скорбяла, тъй наречените добавки. Освен това малцът придава на бирата вкус и цвят.
При продуцирането на малц има зависимост между вкус и цвят и ензимна активност. Малцът, осигуряващ висококачествен вкус и тъмен цвят, може да бъде продуциран единствено след продължително сушене при сравнително високи температури. Тези условия са вредни за активността на ензимите. Добавянето на ензими от външен източник е необходимо от няколко гледни точки. С оглед на това използването на микробиални ензими е било всеобща практика за известно време. При вареното на бира, например, зърната и/или малцуваните зърна се втечняват и озахаряват, с цел да дадат ферментеруеми захари. Етапът на втечняване може да се реализира чрез използване на термостабилна амилаза, както е описано, например, в US 4 285 975 или US 5 180 669. Използват се също и протеази за увеличаване на количеството на свободно достъпен азот в неферментиралата бира за осъществяване на ферментацията.
Освен нишестето, в зърновите култури присъстват и други полизахариди, например β-глюкани (Henry, R.J. et al., J. Sci. Food Agric. 36,1243-1253). Присъстващите в малца β-шюкани не са достатъчно термостабилни, за да са ефективни по време на процеса на варене на бирата. Тези β-глюкани са високо вискозни и дават проблеми с неферментиралата бира и филтруването на бирата. Това е причината, поради която β-глюканазите широко се използват в процеса на варене на бира.
Нескорбялните полизахариди включват, също така, пентозани, чиято структура наскоро е широко изследвана (Gruppen, Н. et al., Carbohydr. 233,
45-64,1992), а по-специално тези на ечемика и мал2 ца (Vietor, R.J. et al., 254-255,1994). За пентозана от Penicillium emersonii се твърди, че подобрява продукцията и екстракцията на ферментеруеми захари при варенето на бира (GB 2 150 933).
Използването на ксиланаза В за подобряване качеството на неферментиралата бира също се споменава във WO1994/014965.
Въпреки направения напредък в тази област, все още съществува необходимост от методи за варене на бира с ензимно получаване, използвани тук.
Техническа същност на изобретението
Настоящото изобретение се отнася до метод за получаване на алкохолни питиета, като например бира, към които се добавя смес от ензими, като ензимната смес съдържа най-малко ендо-β (1,4)-ксиланаза, арабинофуранозидаза, α-амилаза, ендо-протеаза и β-( 1,3; 1,4)-глюканаза, по желание може също да съдържаозахаряваща амилаза и/или екзопептидаза. За предпочитане ензимите, необходими за процеса на производство на бира, се доставят от трансгенетични семена.
Настоящото изобретение описва освен това, трансгенетични растения, експресиращи ензимите, необходими за процеса на производство на бира.
Установено е, че процесът на варене на бира може да се осъществи в присъствието на ензимната смес, както се посочва в патентните претенции, с минимално количество малц. Този процес се осъществява при производството на класическа малцова бира, но може също така, добре да се изпълни в който и да процес, в който малцът се използва за осигуряване на ензимна активност.
Ензимите, които предстои да бъдат използвани, се избират от групата ензими, които задължително са в процеса на варене на бира. Те включват ензими, които са избрани от групата на амилолитичните ензими, от групата на целулотичните ензими, от групата на хемицелулотичните ензими и от групата на протеолитичните ензими.
Амилолитичните ензими включват ензими като α-амилаза, озахаряваща амилаза, амилоглюкозидаза, екзо-амилаза, пулуланаза.
Целулолитичните ензими включват ензими като β-1,4-ендоглюканаза, целобиохидролаза, β-глюкозидаза.
Хемицелулолитичните ензими включват ензими като β-1,3-1,4-ппокоаназа, ксиланаза, ендо-арабинаназа, арабинофура-нозидаза, арабиноксиланаза, арабиногалактаназа, естераза на феруловата киселина.
Протеолитичните ензими включват ензими като екзопептидази и ендопептидази (също наречени проте(ин)ази.
Във връзка с това, изборът на специфичен амилолитичен, целулолитичен, хемицелулолитичен или протеолитичен ензим не е критичен за настоящето изобретение, освен това, че изборът на ензима трябва да е такъв, че свойствата на ензима (като pH и температурен обхват) да са съвместими със специфичните условия на процеса на варене на бира.
Многобройни гени, кодиращи амилолитичен, целулолитичен, хемицелулолитичен или протеолитичен ензим, са на разположението на специалистите в областта. Гените, кодиращи ензимите, представляващи интерес, могат да се получат от какъвто и да е източник, растителен, животински или микробиапен. За предпочитане гените се получават от микробиален източник.
β-( 1,4-)-ксиланаза може да се получи от култура на Aspergillus niger (ЕР 0 463 706). Арабинофуранозидаза се получава във вид на изоензим А или изоензим В (ЕР 0 506190)илинаарабиноксиланхидролаза (ЕР 0 730 653) от култура на Aspergillus niger. Термостабилна амилаза може да се получи като производно на Bacillus licheniformis (WO1991/014772, WO 1992/005259) и се намира в търговската мрежа, например, под търговско наименование Brewers Amyliq Thermostable (B.A.T.S.). Активността на термостабилната амилаза се изразява в TAU единици. Ендопротеазата може да произлиза от Bacillus amyloliquefaciens, и също е достъпна на пазара под търговското наименование Brewers protease (+) и активността й се изразява в PC единици. От същата бактерия може да се получи и β-( 1,3; 1,4-)-ппоканаза (Hofemeisteretal.,Gene49,177,1986), която също е достъпна на пазара под търговското наименование Filtrase 300(+). Активността на пиоканазата се изразява в BGLU единици. Допълнителната озахаряваща амилаза също може да се получи от достъпни на пазара източници (амилаза от Aspergillus orizae под търговското наименование Brewers Fermex, за която активността се изразява в FAU единици), но също така, да се получи от чиста култура на Penicillium emersonii (на разположение от ATCC (American Type Culture Collection) под номер ATCC 16479). Допълнителната екзопептидаза може да се получи от чиста култура Aspergillus sojae, който е депозиран в Centrel Bureau for Schimmelcultures (CBS) Oosterstraat 1, Baam, The Netherlands,под номер CBS 209.96 (A.sojae (DS 8351) на 12 февруари 1996).
Ензимните активности, които са всеизвестни като необходими за производството на бира са а- и β-амилаза за конвертиране на скорбялата на ендосперма във ферментируеми захари, протеаза за разграждане на протеина в разтворими азотни съединения, които действат като храна на дрождите, и βглюканаза и ксиланаза за хидролиза на β-1,3-1,4-ппоканите и ксиланите на ечемика, съответно в олигозахариди, което води до намаляване на вискозитета и подобряване на филтрираемоста. И така, за осигуряване на всички необходими ензими от външен източник, т.е. микробиален източник, ще е необходимо добавянето на поне 5 различни ензима. Въпреки че може да се използва един микроорганизъм за получаването на всичките ензими, ще са необходими различни ферментациони условия за оптималната продукция на всичките ензими.
Чрез използването на ензими с микробиален произход, могат да се преодолеят недостатъците на процеса на малцуване, които бяха споменати погоре. Въпреки това, използването на микроорганизми като източник на ензими има също своите недостатъци :
- необходими са серии от различни ферментации на поне, един микроорганизъм за получаването на всеки ензим в достатъчно количество,
- ензимните препарати могат да включват нежелани странични активности,
- консуматорите не одобряват добавки, различни от, растителен материал, вода и дрожди,
- ограничена стабилност на ензимния препарат по време на съхранението при стайна температура.
Общата употреба на трансгенетичните семена съдържащи увеличено количество ензим при промишлени ензим-катализирани процеси, се описва в заявка за международен патент WO 1991/014772. Директното използване на ензимсъдържащи семена при промишлените процеси дава възможност да се избегне необходимостта от първо екстрахиране и/или изолиране на ензима. Зърното може да действа като стабилна и лесна за обработване форма на депо за съхранение на ензима.
За един единствен ензим 3-1,3-1,4-шюканаза, експресията в ечемичните зърна бе спомената като алтернатива за екзогенно прибавяне.
В заявка за патент DD 275704 се описва конструкцията на експресионен вектор, който да позволи специфичната за зърното експресия на Bacillus β-1,3-1,4-πποκ3Η833 в ечемик. Въпреки това, в настояще време, ефективната трансформация на ечемика още не е проучена. При използване на семена, експресиращи (β-шюканаза от Bacillus, едно достатъчно голямо количество семена може да замести малца без това да причинява сериозни проблеми при филтруването. Все пак, остава да се постигнат от малца или при външна добавка, други ензимни активности, които са необходими за процеса на варене на бира.
Mannonen et al., (1993) предлагат инкорпорирането на плесенна 3-1,3-1,4-глюканаза в зърна от ечемик. По този начин процесът на варене на бирата ще се подобри чрез експресията на β-1,3-1,4-глюканаза в зърната, която притежава по-висока термостабилност, отколкото ендогенния ензим на ечемика. При този случай, все пак, желанието е да се преведе зърното през нормалния процес на малцуване. Освен това, също при този случай, от малца или доставени отвън, трябва да се постигнат други ензимни активности, необходими за процеса на варене на бира.
При един предпочитан метод на настоящето изобретение, ензимите, необходими при процеса на варене на бирата, се експресират в трансгенетични зърна. Така получените трансгенетични зърна, експресиращи посочените необходими ензими, на свой ред се използват в процеса на варене на бира. По този начин се намалява използването на малц, докато прибавянето на екзогенни микробиални ензими може да се избегне.
Трансгенетичните зърна, експресиращи ензими, необходимите при процеса на варене на бира се обхващат от общото наименование малцови семена (MaltSeed).
Растителните видове, способни да продуцират интересуващия ни ензим в техните семена, включват видовете, в семената на които или чиито продукти на семената исторически се използват в процеса на варене на бира. Въпреки това могат да се използват и растителни видове, които не са традиционни при варенето на бира, като източник на трансгенетични семена, експресиращи ензим, представляващ интерес, по-специално в тези случаи, когато единствено минимално количество от тези трансгенетични зърна се добавя при процеса на варене на бирата. Растителните видове, които отговарят на тези критерии, са например ечемик, царевица, ориз, пшеница, сорго, просо, овес, тропически растения от рода на маниоката и други подобни.
Генът, кодиращ ензим, представляващ интерес, се експресира в семената на растението чрез използване на регулаторни последователности, функционални в растението или в семената на растението. Тези регулаторни последователности включват промоторни последователности, терминаторни последователности и, по желание, транскрипционен енхансер на последователности.
Могат да се използват транскрипционни последователности, които водят до конструктивна ексресия на гена в цялото растение. Могат да се използват промоторни последователности, които са активни при директна ексресия на гена в семената на растението.
Освен това, експресията на един ензим, представляващ интерес, може да се насочи или към точно определен клетъчен участък, като цитозола, ендоплазматичния ретикулум, вакуолата, протеинови телца, или към извънклетъчното пространство, чрез използване на специфични насочващи се последователности.
Изборът за специфичен клетъчен участък или за извънклетъчното пространство зависи от способностите на ензима, представляващ интерес, и трябва да се направи така, че да се създаде една оптимална обкръжаваща среда за ензима. Представляващият интерес ензим трябва, например, да бъде в обкръжаваща среда, позволяваща оптимална стабилност на протеина по време на зреенето на зърното. Освен това, ензимът, представляващ интерес, трябва да е в обкръжаваща среда, където експресията на ензима не инхибара основните метаболитни процеси на растението или не води до вредни ефекти върху растението или върху жизнеспособноста на семената.
С цел да е способна да бъде експресирана в растителната клетка, ДНК кодиращата последователност на ензима, представляващ интерес, трябва да се достави с регулаторни елементи, позволяващи да бъде разпозната от биохимичнния механизъм на гостоприемника и трябва да позволява отворената рамка на разчитане да бъде транскрибирана и транслирана в гостоприемника. Обикновено тя включва област за иницииране на транскрипцията, която може подходящо да произлиза от който и да е ген, способен да бъде експресиран в растителните клетки, така както и област за иницииране на транслацията за разпознаване и прикрепяне на рибозомата. При еукариотните растителни клетки една такава експресионна касета включва обикновено в добавка и област за край на транскрипцията, локализирана в посока downstream от посочената отворена рамка на разчитане, позволяваща завършването на транскрипцията и полиаденилацията на първичния транскрипт. Освен това използването на кодон може да се адаптира към използване на приетия кодон на избраното растение гостоприемник. Принципите, командващи експресията на ДНК структурата в растителната клетка, са добре известни на специалистите в областта, а конструирането на експресиращи химерични ДНК структури, също са рутинни.
Специален тип репликон е този, способен сам да се трансферира, или да трансферира негова част, в друга клетка гостоприемник, като растителна клетка, като по този начин се котрансферира отворената рамка на разчитане кодираща за ензима(ите), съгласно изобретението, в посочената растителна клетка. Репликони с такива способности тук се посочват като вектори. Пример за такъв вектор е Ti- плазмиден вектор, който, ако присъства в подходящ гостоприемник, като Agrobacterium tumefaciens, е способен да трансферира част от себе си, тъй-наречената Т-област, в растителната клетка. Различни видове Tiплазмидни вектори (ЕР 0116718В1) сега вече рутинно се използват за трансфер на химерични ДНК последователности в растителни клетки, или протопласти, от които могат да се генерират нови растения, със стабилно инкорпорирана посочената химерна ДНК в техния геном. Особено предпочитана форма на Ti-плазмидни вектори са тьй-наречените бинарни вектори, посочени в претенциите на ЕР 0 120 516 В1 и US 4 940 838. Други подходящи вектори, които могат да се използват за въвеждане на ДНК, съгласно изобретението, в гостоприемник растение, могат да се селекционират от вирусните вектори, например, неинтегративни растителни вирусни вектори, като тези, произлизащи от двойно верижни растителен вируси (например СаМ V) и едноверижни вируси, двойните вируси и други подобни. Използването на такива вируси може да се окаже предимство, особено когато е трудно стабилно да се трансформира растението гостоприемник, както например е случая с дървесните видове, а по-специално дърветата и лозите.
Изразът “клетки гостоприемници, инкорпориращи химерна ДНК последователност съгласно изобретението, в техния геном” означава, че се включват клетки, както и многоклетъчни организми, съдържащи такива клетки, или основно съставени от такива клетки, в които стабилно се инкорпорира посочената химерна ДНК в техния геном, като по този начин се поддържа химерната ДНК, и за предпочитане предаващи копие от такава химерна ДНК на поколението от клетки чрез митоза или мейоза. Съгласно един предпочитан вариант за изпълнение на изобретението се осигуряват растения, които по същество са съставени от клетки, инкорпориращи едно или повече копия от посочената химерна ДНК в техния геном, и които са способни да предадат копие или копия на тяхното поколение, за предпочитане по начина на Mandelian. Посредством транскрипцията и транслацията на химерната ДНК съгласно изобретението, тези клетки ще продуцират ен зимите. Въпреки че принципите, управляващи транскрипцията на ДНК в растителните клетки, не винаги са добре разбрани, създаването на ДНК, която може да се експресира вече, са рутинни. Областите за инициация на транскрипцията, които обикновено се използват при експресията на трансформирания полинуклеогид по конститутивния начин, са промотори, които могат да се получат от вируса на мозайката по карфиола, а именно 35s РНК и 19s РНК промотори на транскрипти и тъй-наречените Т-ДНК промотори от Agrobacterium tumefaciens. Трябва, в частност, да се споменат нопалин синтазният промотор, октопин синтазният промотор (както е описанвЕРО 122791В1) и манопин синтазният промотор. Могат да се използват, освен това, растителни промотори, които са конститутивни по същество, като актинония генен промотор на ориза. За специфична за семената експресия, ген от представляваща интерес ДНК може да се инсерира след промоторите, произлизащи от гени, които специфично се експресират в растителните семена. Тези промотори включват промотори от гени, кодиращи протеини, съхранявани в семената, като круцифериновия промотор на Brassica napus, фазеолиновия промотор на Phaseolus vulgaris, глутелиновия промотор на Oryza sativa, зеиновия промотор на Zea mays и хордеинобия промотор на Hordeum vulgare.
Известно е, освен това, че удвояването на някои елементи, тъй-наречените енхансери, може значително да усили степента на експресия на ДНК под негов контрол (виж например: Kay R. et al., (1987), Science 236q 1299-1302: the duplication ofthe sequence between -343 and -90 of the CaMV 35s promotor increases the activity of that promotor). Освен конститутивния 35s промотор, единично или двойно усилен, примери за промотори с висока степен на усилване са малката подеденица на промотора на слабо индуцируемата риболозо бифосфат карбоксилаза (rbcSSU) и промотора на хлорофил а/b свързващия протеин (Cab). В настоящото изобретение се имат предвид, също така, и хибридни промотори, които включват елементи от различни промоторни области свързван физически. Добре известен пример за такъв промотор е тъй-наречения CaMV подсилен манопин синтазен промотор US 5 106 739), който включва елементи от манопин синтезния промотор, свързва към CaMV енхансер.
Специфично, при трансформацията на едносемеделни растения, използването на интрони между промотора и гена за маркера за селекция засилва експресията
Терминът “промотор” се отнася до област от ДНК в посока upstream от структурния ген и се включва при разпознаването и свързването на РНК полимеразата и други протеини, за иницииране на транскрипцията. “Растителен промотор” представлява промотор, способен да инициира транскрипцията в растителни клетки. “Конститутивен промотор” представлява промотор, който е активен при повечето условия на средата и състояния на развитие или на клетъчна диференциация.
С оглед необходимостта от транскрипционната терминаторна област се счита, по принцип, че такава област засилва надеждността, както и ефикастностга на транскрипцията в растителните клетки. Използването на такава област е, следователно, строго предпочитано в контекста на настоящето изобретение.
Въпреки че някои варианти за изпълнение на настоящото изобретение може да не са възможни за изпълнение в настоящето, например, някои растителни видове са все още трудно податливи на генетична трансформация, изпълнението на изобретението в такива растения е единствено въпрос на време, а не въпрос на принцип, тъй като подчинеността на генетичната трансформация като такава не е очевидна за точно посочения вариант за изпълнение на изобретението.
Трансформацията в растителни видове е вече рутинна операция за внушително количество растителни видове, включващи и двете, както Dicotyledoneae, така и Monocotyledonede. По принцип може да се използва който и да е метод на трансформация, за въвеждане на химерна ДНК, съгласно изобретението, в подходяща родителска клетка. Могат да се подберат подходящи методи измежду калций/полиетилен гликол метода за прогопласти (rens, F.A. et al., 1982, Nature 296,72-74; Negrutiu I. Et al., June 1987, Plant Mol. Biol 8,363-373), елекгропорация на прогопласти (ShillitoR-D.etal., 1985 Bio/Technol. 3,1099-1102),микроинжектиране в растителния материал (Crossway А. etal., 1986,Mol Gen. Genet 102,179-185), бомбардиране c частици (обвити с ДНК или РНК) на различни растителни материали (Ulein Т.М. et al., 1987, Nature 327,70), инфектиране c (неинтегративни) вируси, в растения, при които генният трансфер е медииран от (Agrobactericum tumefaciens инфилтриране на възрастни растения или трансформиране на зрял полен или микроспори(ЕР0301316) и други подобни. Предпочитаният метод съгласно изобретението включвамедииран посредством Agrobactericum трансфер на ДНК. Особено предпочитано е използването на тъй наречената технология на бинарния в вектор както се описва в ЕР А120 516 и US 4 940 838).
Въпреки че се считат за малко по-упорити по отношение на генната трансформация, едносемеделните растения се подчиняват на трансформация и от трансформираните клетки и зародиши, или от друг растителен материал могат да се регенерират кълняеми растения. В настоящото изобретение, предпочитани методи за трансформиране на едносемеделни растения са бомбадирането с микроснаряди, на зародиши, експланти или клетки в суспензия, и директно взимане на ДНК или (тъкан), електропорация (Shimmamoto, et al., 1989, Nature 338,274276). Получени са трансгенетични царевични растения чрез въвеждане на bar-ген от Streptomyces hygroscopicus, който кодира фосфинотрицин ацетилтрансфераза (ензим, който инактивира фосфинтрицина от хербициди), в ембриогенни клетки в суспенсионна култура от царевица, чрез бомбардиране с микроснаряди (Gordon-Kamm, 1990, Plant Cell, 2,603-618). Въвеждането на генетичен материал в алейронови протопласти на други едносемеделни зърнени растения, като пшеница и ечемик, се докладва от (Lee, 1989, Plant: Mol. Biol. 13,21-30). Пшенични растения са регенерирани от ембриогенна суспенсионна култура чрез селекция на ембриогенен калус за установяване на ембриогенните суспензионни култури (Vasil, 1990 Bio/Technol., 8,429434). Комбинирането със система за трансформиране при тези зърнени растения дава възможност за прилагане на настоящото изобретение за едносемеделни растения.
Едносемеделните растения, включително промишлено важните растения, като ориз и царевица, също се подчиняват на трансфера на ДНК чрез щамове на Agrobacterium (виж ЕРО 159418В; Gould
J.Michael D. Hasegawa 0., Lilian EC., Peterson G, Smith RH, (1991) Plant. Physiol. 95,426-434).
За ечемика предпочитаният метод за трансформация е описан от Tingay, S. et al., (The Plant J. 11(6),1369-1376,1997).
За получаване на трансгенетични растения, способни конститутивно да експресират повече от един химерен ген, разполагаме с голям брой алтернативи, включително и следното:
A. Използване на ДНК, например Т-ДНК от бинарен плазмид с множество модифицирани гени, физически куплирани с втори маркерен ген за селекция. Предимството на този метод е, че химерните гени са физически свързвани и следователно мигрират като единичен локус на Mendelian.
B. Кръстосано опрашване на трансгенетичните растения, като всяко е вече способно да експресира един или повече химерни гени, за предпо читане куплирани със селекционен маркерен ген, с прашец от трансгенетично растение, който съдържа един или повече химерни гени, куплирани към друг маркер за селекция. Впоследствие семената, които се получават от кръстосването, могат да се селекционират на основата на присъствието на двата маркера за селекция, или на основата на присъствието на самите химерни гени, Растенията, получени от селекционираните семена, могат след това да се използват за кръстосване. По принцип химерните гени не са разположени на един локус и гените могат, следователно, да се разделят като независими локуси.
C. Използването на известен брой множествени химерни ДНК молекули, например плазмиди, всеки от които притежава един или повече химерни гени и маркери за селекция. Ако степента на котрансформация е висока, тогава е достатъчно селекционирането на основата на само един маркер. В противен случай се предпочита селекция на основата на повече от един маркер.
D. Последователно трансформиране на растения, които вече включват първи, втори (и т.н.) химерни гени с нова химерна ДНК, включваща по желание маркерен ген за селекция. Както при метод В, химерните гени не са, по принцип, върху един локус и, следователно, химерните гени могат да се разделят като независими локуси.
E. Комбиниране на гореспоменатите стратегии.
Настоящата стратегия може да зависи от няколко обстоятелства, като например целесъобразността на родителската линия (директен растеж, използване в програмата на варене на бира, използване за получаване на хибриди), но не критично по отношение на описаното изобретение.
Известно е, че практически всички растения могат да бъдат регенерирани от култивирани клетки или тъкани. Методите за регенерация варират според растенията, но обикновено първо се осигурява суспензия от трансформирани протопласти или петриево блюдо, съдържащо трансформирани експланти. Младите растения могат да се индуцират директно или индиректно от калус, чрез органогенезис или ембриогенезис и впоследствие да се вкоренят. След маркера за селекция, културалната среда обикновено включва различни аминокиселини и хормони, като например ауксини и цитокини. Благоприятно е към средата да се добавят, също така, глутаминова киселина и пролин. Ефикастностга на регенерирането зависи от средата, от генотипа и от историята на културата. Ако тези три променливи се контро64681 лират, е възможно, обикновено, регенерацията да е репродуцируема и повтаряема.
След стабилно инкорпориране на трансформационните генни последователности в трансгенетичните растения, признаците, придадени от тях, могат да се прехвърлят на други растения чрез полово кръстосване. Може да се използва която и да е стандартна техника за кръстосване, в зависимост от видовете, които ще бъдат кръстосани.
В един конкретен вариант за изпълнение на изобретението се използват трансгенетични семена, които са конструирани по такъв начин, че да продуцират един индивидуален ензим, позволяващи една пластична продукция на ензимни смеси с желаното съотношение на ензимна активност. При един друг вариант за изпълнение на изобретението, повече от една ензимна активност могат да се включват В семената на индивидуалната трансгенетична растителна линия.
Трансгенетичните семена, съдържащи ензимите, представляващи интерес, могат заедно да се добавят при желания етап на процеса на варене на бира. Алтернативно, трансгенетичните семена, съдържащи представляващ интерес ензим, могат индивидулно да се добавят, всеки в желания момент на процеса.
Процесът от настоящето изобретение дава възможност за развитието на малц с високо качество на вкуса и цвета, без да се притесняваме за активността на малца. В настоящето изобретение се избягва използването на малц. Може да е все още необходимо само едно малко количество малц за осигуряване на вкус и цвят на бирата.
Трансгенетичните семена, съдържащи желаните ензими, могат да се прилагат в най-оптимално съотношение със семената и, по желание, с достатъчно количество малц за вкус и цвят. Трансгенетичните семена могат преди това да се смесят със зърното и малца. Алтернативно, всяко съединение, зърно, трансгенетични семена и малц, могат да се добавят при отделните етапи от процеса на варене на бира.
За предпочитане отделните съединения, трансгенетични семена, зърното и малца, или смес от трансгенетични семена, зърното и малца се смилат, преди да са добавят в процеса на варене на бирата.
Трансгенните семена съдържат желаните ензими при средно ниво, вариращо между 0,001 - 2,5%, за предпочитане от 0,01 -1,0%, по за предпочитане от 0,05 - 0,25% от теглото на семето. В зависимост от степента на експресия в семената, единствено част от целия брой семена използвани в процеса на ва рене на бира се заменят от трансгенетични семена. Когато се стремим към високи нива на експресия, тогава е възможно да са добавят трансгенетични семена от други родове растения, които обикновено не се използват в процеса на варене на бира, без да се променя значително сместа за варене на бирата.
При този случай за предпочитане част от малца получава специална обработва, при сравнение с традиционния малц, където малцът се загрява по време на убиването, за да се намалят до минимум продуцирането на оцветителни и овкусителни съединения. След тази обработка оставащата ензимна активност е нищожна.
Експресията на ензими в семената се описва в настоящето изобретение, като се има предвид възможността да се избегне прибавянето на екзогенни микробиални ензими към в процеса на варене на бирата. Разходите за продукцията на трансгенетични семена, съдържащи ензимите, са значително пониски от разходите за продуциране на ензими чрез ферментативни процеси. Освен това, трансгенетичните семена са по-лесни за употреба, тъй като те предоставят стабилна и лесно достъпна форма за съхранение на ензимите и се борави лесно с тях. Намаляването на разходите, както и улеснението при употреба, които се свързват с използването на трансгенетични семена, са специално релевантни при процеса на настоящето изобретение, тъй като се избягва необходимостта от прилагане на няколко различни ензима от няколко микфобиални ферментации 6 процеса на варене на бирата.
Курсът на процеса на настоящето изобретение е много по-предсказуем, отколкото на процеса, използващ малц като източник на ензими, тъй като трансгенетичните семена не включват други ензимни активности при високи нива, освен тези експресирани в следствие на интродуцираните гени. В допълнение, курсът на процеса на настоящето изобретение е много по-предсказуем, отколкото курса на процеса, използващ микробиални ензими, тъй като приготвянето на микробиалните ензими дава неопределени и вариращи нива на странични активности.
Един от районите, в които може специално да се използва, са Африканските страни, където е забранено внасянето на малц. Ензимите в този случай могат да се експресират в сорго, което след това може да се добави в процеса на варене на бира.
Заедно с приложението при варене на алкохолни питиета, могат да бъдат разгледани и други приложения, в които MaltSeed (малцовите семена) могат да заменят малцуваното зърно.
Малцуваният ечемик и/или малцуваната пшеница се изполват от мелничарите за стандартизиране на диастатичната сила на брашното. Освен това се добавят хемицелулази (като например ксиланаза) към брашното за подобряване способността за ретенация на газ на тестата, приготвени от брашното. Прибавянето или използването на ензими в брашното може да се замени с използването на MaltSeed, което и много подходящо, тъй като ензимите могат да се добавят под формата на зърна, които могат да се използуват по всякакъв начин.
Идентично, също в пекарния процес, могат да се прибавят ензими, като заместители на малца, който присъства в много теста. Ензими подобряващи пекарния процес са ксиланазата, амилазата, арабинофуранозидазата, екзопептидазата. Освен това, глюкозооксидазата от Aspergillus niger може да бъде експресирана в семена за използване в лекарската индустрия.
Примери за конкретно изпълнение
Пример 1.
Измерване на активността на ендо-β-1,4-ксиланаза
Ендосиланаза се получава от чиста култура Aspergillus niger в стерилен реактор и среда. Културалната среда съдържа подходящи източници на въглерод и азот, като минерални соли. Ферментацията се провежда при постоянна температура между ЗО-4О°С, a pH се провежда в границите между 3-5.
Активността на ензима се измерва чрез хидролизиране на ксилана от овес и от лимец (Triticum spelta) суспендиран в (35 g/Ι) в 1М глицинов буфер с pH 2,75. Вискозитетът на тази суспензия се определя чрез използване на капилярен вискозиметър (тип Ubbelhode) при 47°С. Времето dt, необходимо за горната мениска на течността да спадне между две контролни точки, се измерва във времето Т. Наклонът на плот Т спрямо 1 /dt дава явна кинетична константа. 1 Lyx единица е количеството ензим, необходимо за достигане на стойност от 1 мин-1 за тази кинетична константа.
Пример 2.
Измерване на активността на екзопептидазата Култивира се работен щам от Aspergillus sojae (DS 8351). Екзопептидазната активност се изразява като Левцин аминопептидазни единици (LeuА): 1 Leu-A е количеството ензим, необходим за продуциране на 1 pmol р-нитроанилин за min при pH 7,2 и 20°С от L-левцин-р-нитроанилин. Тестът се осъществява както следва:
Левцин паранитроанилид (SIGMA) се разтваря във вода при концентрация от 9 mM. 1 ml от разтвора се смесва с 1,5 ml 0,1М фосфатен буфер с pH 7,2. В момента t=0 се въвежда 0,5 ml ензим и се оставя да реагира при 20°С. 15 min по-късно се прибавя IN НС1, за да се спре реакцията. Пуска се празна проба, като се въвежда 1NHC1 във времето t=0. Определя се оптичната плътност за празната проба (OD ) и за изследването (OD ~) при 400 пт. Активността се пресмята, както следва:
(OD -OD J 4 ' празна изследване7
А=--------------- х ----- Leu-A/ml
9,8 х 15 0,5
Пример 3.
Измерване на активността на арабинофуранозидаза
Получени са изоензим А или изоензим В или арабиноксилан-хидролаза от култура на щамове на Aspergillus niger или Aspergillus nidulans. Активността на изоензимите А и В се измерва чрез хидролиза на р-нитрофенил- a-L-арабинофуранозид. 1 ARF единица е количеството ензим, необходимо за освобождаване на 1 μτηοΐ р-нитрофенол за min при тестовите условия, описани от Gunata Z. et al., (J. Agric. Food Chem. 38q772pl989).
Пример 4.
Измерване на активноста на озахаряваща амилаза
Озахаряваща амилаза се получава от чиста култура Penicillium emersonii в стерилен ферментатор и среда, съдържаща подходящи източници на въглерод и азот, във вид на минерални соли. Ферментаторът се пълни с малтодекстрини 10-30 h (за предпочитане 24 h) след началото на ферментационния процес. Температурата се поддържа в границите на 40-50°С за предпочитане 45°С), a pH се поддържа в границите между 4,5 - 5,5 (за предпочитане 5,0). Ферментацията се спира 40-55 h (за предпочитане 48 h) след началото.
Активността на озахаряващата амилаза се измерва съгласно теста BETAMYL, на разпространен в търговската мрежа от MEGAZYME, Ireland. 1BTU е количеството ензим, необходимо за получаване на 1 μτηοΐ р-нитрофенол при pH 6,2 и 40°С от достъпният от търговската мрежа субстрат на MEGAZYME.
Пример 5.
Приготвяне на неферментирала бира чрез използване на микробиални ензими
Неферментиралата бира се приготвя от сурови зърна, вариетет PLAISANT. Ечемикът се смила с ЕВС MIAG мелница, с цел да се достигне фил9 тьрна преса тип гранулометрична. 57 g от полученият смлян ечемик се суспендират 6 300 ml топла вода (50°С) и съдържаща: 650 Lyx единици ендо-^-1,4-ксиланаза 850 ARF единици арабинофуранозидаза mg B.A.T.S. (термостабилна амилаза) 6 mg протеаза за варене на бира (+) (ендо-протеаза) 1 mg филтраза L3OOO (+) (β-( 1,3; 1,4)-п1юканаза) Температурата се поддържа при 50°С в продължение на 30 min, след което се повишава на 63°С (скорост 1 °C/min); понататък температурата се подържа при 63 °C в продължение на 30 min, след което се повишава на 72°С (скорост l°C/min) и се поддържа при тази температура в продължение на 30 min. Последно се повишава до 76°С (скорост 1 °C/min) и се поддържа при тази температура в продължение на 5 min. Добавя се вода, която да компенсира изпаряването на водата. След това сместа се налива във фуния, съдържаща хартиен филтър тип Schleicher and Schul. От гъстотата на неферментиралата бира се определя добива, както се прави при всяко варене на бира; определят, също така, стойностите на вискозитета и свободните аминокиселини (FAA), съгласно стандартни ЕВС процедури.
Измерени са добив от 71,5%, вискозитет 2,52 mPa.s и 66 mg/Ι свободни аминокиселини.
Пример 6.
Сравнение на озахаряващите амилази
Неферментирала бира се приготвя от сурови ечемични зърна, вариетет PLAISANT. Ечемикът се смила с ЕВС M1AG мелница, с цел да се достигне филтърна преса тип гранулометрична. 57 g от полу10 чения смлян ечемик се суспендират в
300 ml топла вода (50°С), съдържаща:
650 Lyx единици ендо-β-1,4-ксиланаза
850 ARF единици арабинофуранозидаза mg В. A.T.S. (термостабилна амилаза)
6 mg протеаза за варене на бира (+) (ендопротеаза)
100 Leu-А единици ендопептидаза mg филтраза L3OOO (+) (β-( 1,3; 1,4)-глк>каназа)
Озахаряващите ензими се прибавят към сместа за варене на бира съгласно таблица 1.
ТАБЛИЦА 1
Дози на озахаряващи ензими
| номер на поредното варене на бира 1 2 3 | Озахаряващи ензими | |
| няма Fermex за варене на бира амилаза от Р. emersonii | 0 510 FAU 10 | |
| 4 | Fermex за варене на бира + амилаза от Р. emersonii | 510 FAU + BTU |
Температурата се поддържа при 50°С в продължение на 30 min, след което се повишава на 63°С (скорост l°C/min); по-нагатък температурата се поддържа при 63°С в прод ължение на 30 min, след което се повишава на 72°С (скорост 1 °C/min) и се поддържа при тази температура в продължение на 30 min. Накрая се повишава до 76°С (скорост 1 °C/min) и се поддържа при тази температура в продължение на 5 min. Добавя се вода, която да компенсира изпарената вода. След това сместа се налива във фуния, съдържаща хартиен филтър тип Schleicer and Schul. От гъстотата на неферментиралата бира се опреде ля добива, както се прави при всяко варене на бира; определят се, също така стойностите на вискозитета и свободните аминокиселини (FAA) съгласно стандартни ЕВС процедури.
Резултатите от измерените добив, вискозитет и FAA, дадени в таблица 2, показват ефектите на озахаряващия ензим от Penicillium emersonii като заместител на Fermex за варене на бира, като не може да се очаква истински синергизъм от използването на двата ензима. Особено неочаквано е сравнително положителния ефект наамилазатаотРепюПйитemersonii върху повишаването на FAA, и намаляването на вискозитета.
ТАБЛИЦА 2
Резултати
| номер на | Добив (%) | Вискозитет | FAA (12 Plato) |
| поредното варене на бира | (mPa.s) | (mg/1) | |
| 1 | 71,2 | 3,12 | 116 |
| 2 | 74,6 | 2,73 | 114 |
| 3 | 78,2 | 1,99 | 153 |
| 4 | 79,6 | 1,99 | 152 |
Пример 7.
Конструиране на бинарен вектор, съдържащ експресионна касета, специфична към семето
Конструира се експресионна структура, така че се получава специфична към семето експресионна касета, чрез използване на последователности от Oryza sativa L. гпутелин запасен протеин (Zheng et al., Plant Physiol (1995) 109] 77-786). Тези последователности могат да бъдат заменени с такива от подобни специфични за семената гени, за постигане на същата цел, каквато е целта на настоящето изобретение.
За конструирането на експресионна структура за специфична към семето експресия се синтезират промоторната и терминаторната последователност от глутелин (Gtl) гена на Oryza sativa L., при използване на PCR техника с геномен клон Gt 1 (Okitaet al., J. Biol. Chem. 264,12573-12581,1989) като матрица. Този ген проявява специфична към семената експресия, а неговите кодираща и гранични последователности са определени (EMBL, Genbank Nucleotide Sequence Database accession number D00584)) B00584)). Сентизирагсе два комплекта олигонуклеотиди. Един, който да позволи амплификациятана2,4 КЬ фрагмент, сдържащGtl 5' граничната област, кодираща като XhoI/SphI фрагмент:
5’Gtl.l 5' GCACAATTCICGAGGAGACCG3’ 5’Gtl .2 5' ATGGATGGCATGCTGTTGTAG3'
Другата амплификация на 3' граничните последователности като BamHI/EcoRl фрагмент(725 Ьр):
3’Gtl35’CCTCTTAAGGATCCAATGCGG3’ 3’Gt 1.4 5’ CITATCTGAATTCGGAAGCAC3’
Олигонуклеоидите са конструирани така, че да включват подходящи рестрикционни сайтове в краищата си, за да позволят директното сглобяване на експресионната структура след смилането на фрагментите с рестрикционни ензими. Гени за ен15 зимите в сместа, съгласно изобретението, могат да се получат от литературата за ендо-ксиланаза (Mol. Microbiol., 12,479-190,1994), за арабинофуранозидазния изоензим А и изоензим В (ЕР 0 506 190), за амилазата от Bacillius licheniformis ЕР 0 449 376), за протеазата от Bacillus amyloliquefaciens (J. Bact. 159, 811-819) и за ппоканаза Bacillus amyloliquefaciens (Gene 49,177-187,1986). Гените за озахаряващата амилаза от Penicillium и за екзопептидазите от Aspergillus sojae могат лесно да се изяснят за специалистите в областта от чистия ензим, получен от културите, посочени в описанието.
Използването на кодони от гените, кодиращи ензимите, които трябва да се експресират в семената, се оптимизира за експресия в едносемеделни семена. С цел да се осъществи това, целият ген се изработва синтетично, въвежда се BspHI сайт в ATG стартовия кодон, a BamHI сайт се въвежда в посока downstream от ТАА стоп кодона, и двата сайта за целите на клонирането.
Продуктът на PCR от 2,4 кЬ, съдържащ 5' граничната област на Gtl, се смила с XhoI/SphI и се клонира във вектор pSL 1180, линеаризиран с Xhol/ Sphl. Полученият вектор се линеаризира с SphI/ BamHI и се използва като вектор за тройно лигиране със синтетичния ген, кодиращ ензима и, по желание, един олигонуклеотиден дуплекс, кодиращ насочващия сигнал. Насочването може да се осъществи във вакуолата, в апопласта, в амилопласта или (с т.н. сигнал за KDEL-ретенация) в ендоплазматичния ретикулум.
От този вектор се изолира фрагмент, съдържащ сливанията на Gtl глутелиновия промотор, по желания сигнална последователност и синтетичния ген. Този ген се клонира при тройно лигиране с 725 bp PCR продукт, съдържащ 3 ’ терминаторната последователност на Gtl, смляна с BamHI/EcoRl в бинарния вектор pMOG22 ( в Е. coli К-12 щам DH5-, депозиран в Central Bureau voor Schimmelcultures на 29.01.1990, под номер CBS 101.90).
Пример 8.
Конструиране на бинарен вектор, съдържащ гена за ендоксиланазата в специфичната за семената експресионна касета
Генът на ендоксиланазата от Aspergillus niger се използва за оптимизиране при използване на кодони в ечемика. Получената ДНК последователност е изобразена на SEQ ID NO: 1.
За експресията на гена на ендоксиланазата се осъществява извънклетъчно насочване чрез олигонуклеотидния дуплекс
PRS.1
S'AACnXZCTCAAGAGClTCCCinTTTATGCCTl’CCITTGTTTTGGCCAATACT ТТСТАССГСГГАСССАЗХХЗ’
PRS.2
3,GTACri'GAAGGAGTTCTCGAAGGGGAAAATACGGAAGGAAACAAAACCGGTTAT GAAACATCGACAATGCGTACGGTACC5'
Кодиращ сигналния пептид на PR-S протеина на тютюна и тройното лигиране се използва синтетичния ксиланазен ген, смлян с BspHI/BamHI. 20
От този вектор се изолира 3,1 КЬ фрагмент, съдържащ сливанията на Gt 1 гпутелиновия промотор, PR-S сигнална последователност и синтетичната ксиланаза. Този фрагмент се клонира при тройно лигиране с 725 bpPCR продукт, съдържащ З'терми- 25 наторната последователност на Gt 1, смляна с BamHI/ EcoRI в бинарния вектор pMOG22. Полученият вектор се отбелязва като pMOG 1265.
Пример 9. Трансформиране на ечемик
Методът, използван за трансформиране на 30 незрял ембрион от Hordeum vulgare cv. Golden Promise чрез използване на Agrobacterium tumefaciens е както е описано от Tingay, S. et al., Tthe Plant J. 11 (6), 1369-1376,1997. Накратко, протоколът е както следва:
Донорни растения за изходен материал се отг- 35 леждат върху фитотрон при 10-20°С с 16-часов период на осветление при 10 000-30 000 lux и 50-90% RH. Незрелите семена се събират 10-15 дни след опрашването и се стерилизират в разтвор на хлорна вар за 20-40 min. Незрелите ембриони се изрязват от 40 младите кариопси и ембрионалната ос се отстранява със скалпел. Експлантите се поставят със страната на скутелума нагоре върху среда, индуцираща калус, и се инкубират при 24°С на тъмно за период от 16 h до 7 дни. 45
Ембрионите се потопят в суспензия от Agrobacterium, приблизително 0,1-1 ОхН 109 бактерии на милилитър, в която Agrobacterium съдържа структурите, включващи ДНК кодираща избраният ензим, за 5 до 20 min, след което се прехвърля върху среда, индуцираща калус. След това ембрионите се инкубират в продължение на 2 или 3 дни при 24° С на тъмно. След кокултивирането, ембрионите се прехвърлят на средата, индуцираща калус, съдържаща антибиотици, за да се убият Agrobacteria, директно комбинирана с агент за селекция за започване на процеса на селекция на трансгенетичните клетки. Процесът на селекция се осъществява до 8 седмици. Резистентните ембрионални калусни линии се прехвърлят на среда за регенерация и се инкубират при засилващ се интензитет на осветеност (500 до 3000 lux) с 16 часов период на осветеност при 24°С. Регенериралите растениица се прехвърлят на среда без хормони или на среда за индуциране на калус с високо съдържание на цитокинин, с или без агенти за селекция. След развитието на коренната система, младите растения се прехвърлят в почва и се отглеждат до зрялост със самоопрашване.
Пример 10.
Осъществяват се три пилотни опита за варене на бира. Правят се две тестови сварявания със силно намалено количество малц (20% от суровия продукт) и контрола с нормално количество малц (виж таблица 3). Двете тестови варенета се различават по технологията на смилане и филтриране (виж таблица 3). Диаграмата на варене на бира при всички случаи на варене е показана на фигура 1.
ТАБЛИЦА3 Състав, филтриране и смилане на суровия материал
| контрола | тест на варене 1 | тест на варене 2 | |
| малц | 75% | 20% | 20% |
| царевичен грис | 25% | 25% | 25% |
| немалцуван ечемик | - | 55% | 55% |
| филтър | лаутертум | лаутертум | Меига 20001 |
| смилане | цилиндър | цилиндър | чук |
Използват се 8% малц от контролния разтвор гите 47% немалцуван ечемик се прибавят към съда в зърнените варива заедно с царевичния грис, дру- за конверсия заедно с малца.
Таблица 4
Кодове на ензимите и количества прибавени на 100 kg суров материал
| код на ензима | ензим | зърнени варива | съд за конверсия |
| 1 | ендо-β- 1,4-ксиланаза | 117,000 Lyx | |
| 2 | арабинофуранозидаза | 112,500 ARF | |
| 3 | B.A.T.S. | 16,5 | |
| 4 | Регтех за варене на бира | 75 g | |
| 5 | протеаза за варене на бира(+) | 75 g | |
| 6 | екзо пептидаза | ||
| 7 | филтраза L3000 (+) | 23 g |
Ензими 1,2,4,5 и 7 се прибавят към съда за конверсия, докато ензим 3 се добавя към стерилизатора за зърнения материал (Виж таблица 4 за ензимните кодове и прибавените количества).
Завършването на процеса на неферментиралата бира (смесване и лаутеринг) са подобни за тестовото варене на бира и за контролата. Двете тестови варенета на бира се провеждат по подобен начин в пивоварната. Тестовите варенета на бира дават почти същата неферментирала бира, което показва, че разликите във филтруването и смилането не са основни. От сравнението между тестовата и контроланата бира се стигна до извода, че всичките три бири имат почти еднакъв профил. По-силна разлика във вкуса се наблюдава между тестовото варене на бира и контролното. Това може да се дължи на по-високото ниво на декстрин, което бе установено при анализа на неферментиралата бира. Нивото на аминокиселини в неферментиралата бира е въпреки това приемливо, по-ниско при тестовото варене на бира, отколкото при контролата. Нивото на аминокиселини се увеличава чрез прибавяне на екзопептидаза (виж пример 11). Бирите от тестовото варене се класифицират по тестовия панел като добри бири от пилзенски тип, като по този начин показват, че частичната замяна на малца от ензимната смес води до получаване на бира, която е сравнима с бира, произведена с такова количество малц, което се използва обикновено в пивоварната индустрия.
Пример 11.
Провеждат се два пилотни опита на варене на бира. Тестовото варене се осъществява с намалено количество малц, а контролното варене с нормално количество малц (виж таблица 5). Филтруването се извършва на Lautertun. Виж фигура 2 за диаграмите на варене на тестовото варене 1 и на конт5 родното.
Таблица 5
Състав на суровия продукт
| контрола | тестово варене 1 | |
| малц | 75% | 20% |
| царевичен грис | 25% | 25% |
| несмлян ечемик | - | 55% |
От контролната смес се използват 8% малц в зърнените варива заедно с малцовия грис, другите 67% малц се прибавят към съда за конверсия. За тестовото варене се използват 8% несмлян ечемик в зърнените варива, заедно с царевичния грис, другите 47% несмлян ечемик се прибавят към съда за конверсия заедно с малца.
При тестовото варене на бира, ензими 1-7 се прибавят в съда за конверсия, докато ензим 3 се прибавя също и към съдържанието на зърнените варива (виж таблица 6 за кодовете на ензимите и количествата използвани ензими).
Резултатите от завършването на процеса на 3θ неферментиралата бира (смесване и лаутеринг) са
Кодове на ензимите и количества материал в при тестовото варене ι подобни за тестовото варене на бира и за контролата. Съдържанието на свобден аминокиселинен азот в неферментиралата бира е подобно за тестовото варене на бира и за контролното. Тестовото варене на бира дава бира, която чрез проба се счита, че има почти същия профил, както контролата. Бирата от тестовото варене се класифицира по тестовия панел като добра бира от пилзенски тип, като по този начин се показва, че частичната замяна на малца с ензимна смес води до получаване на бира, която е сравнима с бира произведена с такова количество малц, което се използва обикновено в пивоварната индустрия.
Таблица 6 прибавени на 100 kg суров а бира
| код на ензима | ензим | зърнени варива | съд за конверсия |
| 1 | ендо-β- 1,4-ксиланаза | 117,000 Lyx | |
| 2 | арабинофуранозидаза | 112,500 ARF | |
| 3 | B.A.T.S. | 16,5 g | 33,5 g |
| 4 | Fermex за варене на бира | 75 g | |
| 5 | протеаза за варене на бира (+) | 75 g | |
| 6 | екзо пептидаза | 105,000 LeuA | |
| 7 | филтраза L3000 (+) | 23 g |
Пример 12.
Трансгенетични семена от ечемик от седем линии, всяка експресираща един от ензимите, показани на таблица 9, се смесват в такова съотношение, че получените малцови семена (MaltSeed), когато се смесят като 1-% от суровия ечемик, да осигурят ензимна активност, каквато е показана на таблица 9. Препаратът от малцови семена се смесва и се смила заедно с нетрансгенетичен ечемик, като заедно съставят 55% от суровия материал при тестовото 1 варене на бира. Съставът на суровия материал в зърненото вариво и съдът за конверсия за тестовото варене на бирата са показани на таблица 8. За контролата се използват 8% малц в зърненото вариво
Състав на суровия материал заедно с царевичен грис. Останалият суров материал се използва в съда за конверсия. Разпределението на малцовите семена дава ензимните активности, както са показани на таблица 10 в съда за конверсия 5 и зърнените варива.
Осъществяват се опити за варене на бира. Тестовото варене се извършва с намалено количество малц, а за контролата с нормално количество малц (виж таблица 7). За тестовото варене на бира се из10 ползва по-висока температура на озахаряване (виж таблица 7). Филтруването се извършва на Lautertun. За диаграмате на варене на бира на контролното и на тестовото варене на бирата виж фигура 2.
Таблица 7
| контрола | тестово варене 1 | |
| малц | 75% | 20% |
| царевичев грис | 25% | 25% |
| несмлян ечемик + малцови семена | - | 55% |
Таблица 8
Състав на суровия материал за 100 kg общо за тестовото варене на бирата
| суров материал | зърнени варива (kg) | съд за конверсия (kg) |
| малц | 20 | |
| несмлян ечемик | 7,2 | 42,3 |
| малцови семена | 0,8 | 4,7 |
| царевичен грис | 25 | |
| тотал (kg) | 33 | 67 |
Завършването на процеса на неферментиралата бира (смесване и лаутеринг) са подобни за тестовото варене на бира и за контролата. Тестовото варене на бира дава бира, която чрез проба се счита, че има подобен профил, както контролата. Бира та от тестовото варене се класифицира като класическа малцова бира чрез изпробване на вкуса, като по този начин се показва, че малцът може да бъде заменен (частично) с ензими, доставени чрез трансгенетични семена, които ги експресират.
Таблица 9.
Количество ензимна активност, добавено чрез прибавяне на малцови семена (единици за 100 kg суров материал) при тестовото варене на бира
| код на ензима | ензим | зърнени варива | съд за конверсия |
| 1 | ендо-β- 1,4-ксиланаза | 19,915 Lyx | 117,000 Lyx |
| 2 | арабинофуранозидаза | 19,149 ARF | 112,500 ARF |
| 3 | B.A.T.S. | 107,250 TAU | 33,5 TAU |
| 4 | Fermex за варене на бира | 57,872 FAU | 75 FAU |
| 5 | протеаза за варене на бира (+) | 115,745 PC | 75 PC |
| 6 | екзо-пептидаза | 17,872 LeuA | 105,000 LeuA |
| 7 | филтраза L3000 (+) | 11,701 BGLU | 23 BGLU |
СПИСЪК НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ (1) Обща информация:
(i) Заявител:
(A) име: MOGEN Imtemational nv (B) улица: Einsteinweg 97 (D) град : Leiden (E) страна: The Netherlands (F) пощенски код (ZIP) : 2333 CB (G) телефон: 31-(0)71-5258282 (H) факс: 31-(0)71-52221471 (A) име : GIST-brocades nv (B) улица: Postbus 1 (D) град : Delft (E) страна: The Netherlands (F) пощенски код (ZIP) : 2600 MA (G) телефон : 31-(0)15-2799111 (H) факс: 31-(0)15-2793957 (ii) Заглавие на изобретението : ПОДОБРЕН МЕТОД ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА АЛКОХОЛНИ ПИТИЕТА ОТ МАЛЦОВИ СЕМЕНА (iii) Брой на по последователностите: 8 (iv) компютърен интерфейс:
(A) вид на устройството: флопи диск (B) компютър: IBM PC съвместим (C) операционна система: PC-DOS / MS DOS (D) софтуер: Patentin Release #1.0, версия #1.25 (EPO) (vi) данни за предходни заявки:
(A) номер на заявката: ЕР 96202195.2 (B) дата на подаване: 05.08.1996 (2) Информация за SEQ ID No : 1:
(A) дължина: 558 базови двойки (B) тип : нуклеинова киселина (C) верижност: двойна (D) топология: линейна (ii) тип на молекулата: сДНК (iii) хипотетичност: не (iii) противоположност: не (ix) характеристики (A) име/ключ CDS (B) локализация : 1..558 (D) друга информация : /продукт = зрял протеин (xi) описание на последователноста: SEQ ID NO: 1:
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:
| ATG Met 1 | AGC GCG | GGA Gly | ATC AAC | TAC GTC CAG AAC TAC AAT GGC AAC CTC GGC | 48 | |||||||||||
| Ser | Ala | lie 5 | Asn | Tyr Val Gin | Asn 10 | Tyr | Asn | Gly | Asn Leu Gly 15 | |||||||
| GAC | TTT | ACT | TAC | GAC | GAG | TCA | GCG | GGA | ACT | TTC | AGC | ATG | TAT | TGG | GAG | 96 |
| Asp | Phe | Thr | Tyr | Asp | Glu | Ser | Ala | Gly | Thr | Phe | Ser | Met | Tyr | Trp | Glu | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| GAT | GGC | GTG | TCC | TCA | GAC | TTC | GTC | GTG | GGA | CTG | GGC | TGG | ACC | ACT | G0A | 144 |
| Asp | Gly | Val | Ser | Ser | Asp | Phe | Val | Val | Gly | Leu | Gly | Trp | Thr | Thr | Gly | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| TCA | TCC | AAT | GCG | ATC | ACC | TAC | AGC | GCC | GAG | TAC | TCC | GCG | TCA | GGA | TCA | 192 |
| Ser | Ser | Asn | Ala | He | Thr | Tyr | Ser | Ala | Glu | Tyr | Ser | Ala | Ser | Gly | Ser | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| GCC | TCC | TAT | CTG | GCC | GTG | TAC | GGA | TGG | GTG | AAC | TAC | CCG | CAG | GCC | GAG | 240 |
| Ala | Ser | Tyr | Leu | Ala | Val | Tyr | Gly | Trp | Val | Asn | Tyr | Pro | Gin | Ala | Glu | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
| TAC | TAC | ATC | GTG | GAG | GAT | TAC | GGA | GAT | TAC | AAC | CCA | TGC | AGC | TCA | GCG | 288 |
| Tyr | Tyr | lie | Val | Glu | Asp | Tyr | Gly | Asp | Tyr | Asp | Pro | Cys | Ser | Ser | Ala | |
| 85 | $0 | 95 | ||||||||||||||
| ACC | TCC | CTC | GGA | ACT | GTG | TAC | AGC | GAC | GGC | TCC | ACC | TAC | CAG | GTC | TGC | 336 |
| Thr | Ser | Leu | Gly | Thr | Val | Tyr | Ser | Asp | Gly | Ser | Thr | Tyr | Gin | Val | Cys | |
| 100 | 105 | HO | ||||||||||||||
| ACC | GAC | ACC | CGC | ACT | AAC | GAG | CCG | TCA | ATC | ACC | GGC | ACT | TCC | ACC | TTC | 384 |
| Thr | Asp | Thr | Arg | Thr | Asn | Glu | Pro | Ser | He | Thr | Gly | Thr | Ser | Thr | Phe | |
| 115 | 120 | • | 125 | |||||||||||||
| ACC | CAG | TAC | TTC | AGC' | •GTG | CGC | GAG | TCC | AQT | CGC | ACC | TCA | GGA | ACC | GTG | 432 |
| Thr | Gin | Tyr | Phe | Ser | Val | Arg | Glu | Ser | Thr | Arg | Thr | Ser | Gly | Thr | Val | |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
| ACC | GTC | GCG | AAC | CAC | TTC | AAC | TTC | TGG | GCG | CAG | CAC | GGA | TTC | GGC | AAC | 480 |
| Thr | Val | Ala | Asn | His | Phe | Asn | Phe | Trp | Ala | Gin | His | Gly | Phe | Gly | Asn | |
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
| AGC | GAC | TTT | AAC | TAC | CAG | GTG | GTC | GCA | GTG | GAG | GCA | TGG | TCA | GGA | GCG | 528 |
| Ser | Asp | Phe | Asn | Tyr | Gin | Val | Val | Ala | Val | Glu | Ala | Trp | Ser | Gly | Ala | |
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
| GGC | TCA | GCG | TCC | GTC | ACT | ATC | AGC | TCC | TG | 558 | ||||||
| Gly | Ser | Ala | Ser | Val | Thr | lie | Ser | Ser | ||||||||
| 180 | 185 |
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 185 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:
| Met Ser Ala Gly lie Asn Tyr | Val | Gin Asn Tyr Asn Gly Asn Leu Gly | |||||||||||||
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Asp | Phe | Thr | Tyr | Asp | Glu | Ser | Ala | Gly | Thr | Phe | Ser | Met | Tyr | Trp | Glu |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Asp | Gly | Val | Ser | Ser | Asp | Phe | Val | Val | Gly | Leu | Gly | Trp | Thr | Thr | Gly |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Ser | Ser | Asn | Ala | lie | Thr | Tyr | Ser | Ala | Glu | Tyr | Ser | Ala | Ser | Gly | Ser |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Ala | Ser | Tyr | Leu | Ala | Val | Tyr | Gly | Trp | Val | Asn | Tyr | Pro | Gin | Ala | Glu |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Tyr | Tyr | He | Val | Glu | Asp | Tyr | Gly | ASP | Tyr | Asn | Pro | Cys | Ser | Ser | Ala |
| 85 | do | 95 | |||||||||||||
| Thr | Ser | Leu | Gly | Thr | Val | Tyr | Ser | Asp | Gly | Ser | Thr | Tyr | Gin | Val | Cys |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Thr | Asp | Thr | Arg | Thr | Asn | Glu | Pro | Ser | lie | Thr | Gly | Thr | Ser | Thr | Phe |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Thr | Gin | Tyr | Phe | Ser | Val | Arg | Glu | Ser | Thr | Arg | Thr | Ser | Gly | Thr | Val |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Thr | Val | Ala | Asn | His | Phe | Asn | Phe | Trp | Ala | Gin | His | Gly | Phe | Gly | Asn |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Ser | Asp | Phe | Asn | Tyr | Gin | Val | Val | Ala | Val | Glu | Ala | Trp | Ser | Gly | Ala |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Gly | Ser | Ala | Ser | Val | Thr | He | Ser | Ser |
180 185 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 71 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (2) Информация за SEQ ID No: 2 :
(A) дължина: 185 базови двойки (B) тип: аминокиселина (D) топология: линейна (ii) тип на молекулата: протеин (xi) описание на последователноста: SEQ ID NO: 2:
(2) Информация за SEQ ID No : 3:
(A) дължина : 71 базови двойки (B) тип : нуклеинова киселина (C) верижност; единична (D) топология: линейна (ii) тип на молекулата : сДНК (iii) хипотетичност: не (iii) противоположност: не (vi) първоначален източник:
(А) организъм: Nicotiana tabacum (xi) описание на последователноста : SEQ ID NO: 3:
ААСГТССТСА AGAGCTTCCC CTTTTATGCC TTCCTTTGTT 40 TTGGCCAATA CTTTGTAGCT GTTACGCATG С 71 (2) Информация за SEQ ID No : 4:
(A) дължина : 80 базови двойки (B) тип: нуклеинова киселина (C) верижност: единична (D) топология: линейна (ii) тип на молекулата : сДНК (iii) хипотетичност: не (ш)противоположност : ga (xi) описание на последователноста : SEQ ID NO: 4:
CCATGGCATG CGTAACAGCT ACAAAGTATT GGCCAAAACA AAGGAAGGCA TAAAAGGGGA AGCTCTTGAG GAAGTTCATG (2) Информация за SEQ ID No: 5:
(A) дължина : 21 базови двойки (B) тип : нуклеинова киселина (C) верижност: единична (D) топология: линейна (ii) тип на молекулата: сДНК (iii) хипотетичност: не (iii) противоположност: не (xi) описание на последователноста : SEQ ID NO: 5 :
ATGGATGGCATGCTGTTGTAG 21 (2) Информация за SEQ ID No: 6:
(A) дължина: 21 базови двойки (B) тип: нуклеинова киселина (C) верижност: единична (D) топология: линейна (ii) тип на молекулата: сДНК (iii) хипотетичност: не (iii) противоположност: не (xi) описание на последователноста : SEQ ID NO: 6: GCACAATTCT CGAGGAGACC G 21 (2) Информация за SEQ ID No : 7 :
(A) дължина: 21 базови двойки (B) шип: нуклеинова киселина (C) верижност: единична (D) топология: линейна (ii) тип на молекулата : сДНК (iii) хипотетичност: не (iii) противоположност: не (xi) описание на последовашелносша: SEQ ID NO: 7:
CCTCTTAAGG ATCCAATGCG G 21 (2) Информация за SEQ ID No: 8:
(A) дължина: 21 базови двойки (B) тип: нуклеинова киселина (C) верижност: единична (D) топология: линейна (ii) тип на молекулата: сДНК (iii) хипотетичност: не (iii) противоположност: не (xi) описание на последователноста: SEQ ID NO: 8:
СТТATCTGАА TTCGGAAGCT С 21
Claims (8)
- Патентни претенции1. Метод за получаване на алкохолни питиета, към които се добавя ензимна смес, характеризиращ се с това, че сместа съдържа най-малко ендо- 5 Р(1,4)-ксиланаза, арабинофуранозидаза, а-амилаза, ендо-протеаза и β-( 1,3; 1,4)-глюканаза.
- 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че сместа съдържа и озахаряваща амилаза
- 3. Метод съгласно претенция 1 или 2, характеризиращ се с това, че сместа съдържа и екзопептидаза.
- 4. Метод съгласно коя да е претенция от 1 до3, характеризиращ се с това, че питието е бира.
- 5. Метод съгласно която и да е претенция от 1 до 4, характеризиращ се с това, че всеки от тези ензими се доставя от отделна трансгенетична растителна линия.
- 6. Метод съгласно която и да е претенция от 1 до 4, характеризиращ се с това, че един ензим се доставя от семена от трансгенетична растителна линия.
- 7. Метод съгласно която и да е претенция от 1 до 6, характеризиращ се с това, че поне един ензим се доставя от семена на отделна растителна линия.
- 8. Метод съгласно коя да е претенция от 5 до 7, характеризиращ се с това,че трансгенетичната растителна линия е растителна линия от ечемик.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP96202195 | 1996-08-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG103199A BG103199A (bg) | 2000-05-31 |
| BG64681B1 true BG64681B1 (bg) | 2005-11-30 |
Family
ID=8224258
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG103199A BG64681B1 (bg) | 1996-08-05 | 1999-02-23 | Подобрен метод за получаване на алкохолни питиета от малцови семена |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6361808B1 (bg) |
| EP (1) | EP0915985A1 (bg) |
| JP (1) | JP2000515381A (bg) |
| CN (1) | CN1230225A (bg) |
| AU (1) | AU720139B2 (bg) |
| BG (1) | BG64681B1 (bg) |
| BR (1) | BR9711620A (bg) |
| CA (1) | CA2262436A1 (bg) |
| CZ (1) | CZ296732B6 (bg) |
| MX (1) | MXPA99001239A (bg) |
| PL (1) | PL191456B1 (bg) |
| WO (1) | WO1998005788A1 (bg) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7033627B2 (en) * | 1990-03-23 | 2006-04-25 | Syngenta Mogen B.V. | Production of enzymes in seeds and their use |
| JP5044067B2 (ja) * | 1997-04-30 | 2012-10-10 | ケー．ユー． ルヴァン リサーチ アンド ディヴェロプメント | キシラン分解酵素の阻害剤 |
| EP0979830A1 (en) * | 1998-08-12 | 2000-02-16 | Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno | A novel class of xylanase inhibitors |
| AU2001236826A1 (en) * | 2000-02-10 | 2001-08-20 | Washington State University Research Foundation | Methods and compositions that utilize barley as a foodstuff for animals |
| AU2001255797A1 (en) | 2000-05-02 | 2001-11-12 | Applied Phytologics, Inc. | Enhanced gene expression in plants using transcription factors |
| US7417178B2 (en) | 2000-05-02 | 2008-08-26 | Ventria Bioscience | Expression of human milk proteins in transgenic plants |
| US6991824B2 (en) | 2000-05-02 | 2006-01-31 | Ventria Bioscience | Expression of human milk proteins in transgenic plants |
| AU7242200A (en) * | 2000-06-12 | 2001-12-13 | Academia Sinica | Protein production in transgenic plant seeds |
| US20030091691A1 (en) * | 2000-06-23 | 2003-05-15 | Olsen Hans Sejr | Stepping process |
| CA2438668A1 (en) * | 2001-02-19 | 2002-08-29 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Method of preparing yeast for fermentation test |
| US20040115779A1 (en) * | 2002-03-19 | 2004-06-17 | Olsen Hans Sejr | Fermentation process |
| US7008652B2 (en) * | 2002-06-14 | 2006-03-07 | Brown-Forman Corporation | Method for production of a flavorless malt base |
| CN1918277A (zh) | 2003-12-19 | 2007-02-21 | 诺维信公司 | 糖化工艺 |
| ES2487440T3 (es) * | 2004-01-30 | 2014-08-20 | Dsm Ip Assets B.V. | Carboxipeptidasa para maduración del queso |
| EP1812547A1 (en) * | 2004-06-03 | 2007-08-01 | Novozymes A/S | Mashing process and enzyme composition useful therein |
| US20080028486A1 (en) * | 2004-07-07 | 2008-01-31 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Aluminium Tolerant Barley |
| GB2418431A (en) * | 2004-09-27 | 2006-03-29 | Multigerm Uk Entpr Ltd | Metabolically active micro organisms and methods for their production |
| JP2006288379A (ja) * | 2005-03-18 | 2006-10-26 | Suntory Ltd | 分画したコーンを用いた発酵飲料 |
| US20090068309A1 (en) * | 2006-03-06 | 2009-03-12 | Lakefront Brewery, Inc. | Gluten-free beer and method for making the same |
| JP4627296B2 (ja) * | 2006-10-27 | 2011-02-09 | キリンホールディングス株式会社 | 発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造方法 |
| GB0702844D0 (en) * | 2007-02-14 | 2007-03-28 | Leuven K U Res & Dev | Improving taste of beer |
| KR101556813B1 (ko) | 2008-07-23 | 2015-10-01 | 아트리오 메디컬, 아이엔씨. | 심폐소생술을 수행하는 동안, 압박 파라미터들을 측정하는 심폐소생술 보조 장치 |
| JP5658489B2 (ja) * | 2010-06-16 | 2015-01-28 | アサヒビール株式会社 | 発酵麦芽飲料の製造方法 |
| ES2645921T3 (es) | 2011-09-14 | 2017-12-11 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Composiciones que comprenden enzimas con actividad de endo-1,4-beta-xilanasa y enzimas con actividad de endo-1,3(4)-beta-glucanasa |
| RU2014150072A (ru) * | 2012-05-11 | 2016-07-10 | Новозимс А/С | Способ пивоварения |
| DK2958437T3 (da) * | 2013-02-21 | 2020-03-30 | Direvo Ind Biotechnology Gmbh | Præbiotiske dyrefoderprodukter |
| US20160215244A1 (en) * | 2013-09-05 | 2016-07-28 | Novozymes A/S | Method for Production of Brewers Wort |
| CA3022530C (en) * | 2016-05-02 | 2024-01-09 | Carlsberg Breweries A/S | Beverages containing barley .beta.-glucan |
| KR102615916B1 (ko) * | 2017-05-09 | 2023-12-19 | 산토리 홀딩스 가부시키가이샤 | 위스키용 증류액의 제조방법과 이에 의한 위스키용 증류액 및 위스키 |
| CA3085987A1 (en) * | 2017-12-28 | 2019-07-04 | Carlsberg A/S | Cereal plants with improved cell wall properties |
| JP2020061988A (ja) * | 2018-10-18 | 2020-04-23 | サッポロビール株式会社 | ビールテイスト飲料の製造方法及びビールテイスト飲料の香味向上方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4285975A (en) * | 1980-01-29 | 1981-08-25 | Miles Laboratories, Inc. | Production of brewer's wort |
| GB2150933A (en) * | 1983-11-28 | 1985-07-10 | Glaxo Group Ltd | Pentosan-degrading enzyme |
| US5180669A (en) * | 1991-03-27 | 1993-01-19 | Genencor International, Inc. | Liquefaction of granular-starch slurries using alpha-amylase in the presence of carbonate ion |
| WO1994014965A1 (en) * | 1992-12-24 | 1994-07-07 | Gist-Brocades N.V. | Cloning and expression of xylanase b |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE275704C (bg) | ||||
| CA961432A (en) | 1969-07-08 | 1975-01-21 | Martin F. Walmsley | Process for making a brewers' wort and beer derived therefrom |
| CH572519A5 (bg) * | 1972-10-25 | 1976-02-13 | Ciba Geigy Ag | |
| ZA821071B (en) | 1981-03-03 | 1983-01-26 | Flogates Ltd | Improvements in the pouring of molten metals |
| JPS57152888A (en) | 1981-03-14 | 1982-09-21 | Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd | Alcoholic fermentation of raw potato by enzymatic process |
| CA1280704C (en) * | 1985-12-03 | 1991-02-26 | Paul Ducroo | Production of beer |
| US5487989A (en) * | 1988-08-31 | 1996-01-30 | Bioenergy International, L.C. | Ethanol production by recombinant hosts |
| DD275704A1 (de) * | 1988-09-23 | 1990-01-31 | Akad Wissenschaften Ddr | Verfahren zur herstellung von gerstenpflanzen |
| AU638695B2 (en) | 1989-02-16 | 1993-07-08 | Akademie Der Wissenschaften Der Ddr | A thermostable (1,3-1,4)-beta-glucanase |
| IL97645A (en) * | 1990-03-23 | 1997-03-18 | Gist Brocades Nv | Production of enzymes in seeds and their use |
| IE913215A1 (en) | 1990-09-13 | 1992-02-25 | Gist Brocades Nv | Transgenic plants having a modified carbohydrate content |
| BR9407752A (pt) * | 1993-10-04 | 1997-03-04 | Novo Nordisk As | Preparaçao de enzima aditivo detergente composiçao detergente processo para o tratamento de fibras lignocelulósicas |
| US5849559A (en) | 1994-08-26 | 1998-12-15 | Gist-Brocades, B.V. | Arabinoxylan degrading enzymes |
| US6265000B1 (en) * | 1994-10-20 | 2001-07-24 | Hokkaido Wine Co, Ltd | Process for the production of carbonated alcoholic beverages using koji, malt, and various fermentation media |
| GB9505479D0 (en) | 1995-03-17 | 1995-05-03 | Danisco | Enzyme |
| KR20000010743A (ko) | 1996-05-03 | 2000-02-25 | 한스 발터 라벤 | 향상된 여과성 및/또는 증대된 수율을 갖는 맥아즙을 제조하는방법 |
-
1997
- 1997-07-23 AU AU41161/97A patent/AU720139B2/en not_active Ceased
- 1997-07-23 JP JP10507549A patent/JP2000515381A/ja not_active Ceased
- 1997-07-23 BR BR9711620-3A patent/BR9711620A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-07-23 PL PL331493A patent/PL191456B1/pl unknown
- 1997-07-23 CA CA2262436A patent/CA2262436A1/en not_active Abandoned
- 1997-07-23 US US09/230,590 patent/US6361808B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-23 MX MXPA99001239A patent/MXPA99001239A/es unknown
- 1997-07-23 EP EP97938858A patent/EP0915985A1/en not_active Withdrawn
- 1997-07-23 CZ CZ0037899A patent/CZ296732B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-07-23 CN CN97197918A patent/CN1230225A/zh active Pending
- 1997-07-23 WO PCT/EP1997/004016 patent/WO1998005788A1/en not_active Application Discontinuation
-
1999
- 1999-02-23 BG BG103199A patent/BG64681B1/bg unknown
-
2001
- 2001-10-04 US US09/970,616 patent/US6699515B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-01-07 US US10/765,716 patent/US20050095315A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4285975A (en) * | 1980-01-29 | 1981-08-25 | Miles Laboratories, Inc. | Production of brewer's wort |
| GB2150933A (en) * | 1983-11-28 | 1985-07-10 | Glaxo Group Ltd | Pentosan-degrading enzyme |
| US5180669A (en) * | 1991-03-27 | 1993-01-19 | Genencor International, Inc. | Liquefaction of granular-starch slurries using alpha-amylase in the presence of carbonate ion |
| WO1994014965A1 (en) * | 1992-12-24 | 1994-07-07 | Gist-Brocades N.V. | Cloning and expression of xylanase b |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2262436A1 (en) | 1998-02-12 |
| PL191456B1 (pl) | 2006-05-31 |
| US6361808B1 (en) | 2002-03-26 |
| CZ296732B6 (cs) | 2006-05-17 |
| AU4116197A (en) | 1998-02-25 |
| JP2000515381A (ja) | 2000-11-21 |
| BG103199A (bg) | 2000-05-31 |
| CN1230225A (zh) | 1999-09-29 |
| CZ37899A3 (cs) | 1999-10-13 |
| AU720139B2 (en) | 2000-05-25 |
| US20050095315A1 (en) | 2005-05-05 |
| US20020164399A1 (en) | 2002-11-07 |
| WO1998005788A1 (en) | 1998-02-12 |
| EP0915985A1 (en) | 1999-05-19 |
| MXPA99001239A (es) | 2003-09-12 |
| BR9711620A (pt) | 2001-11-20 |
| US6699515B2 (en) | 2004-03-02 |
| PL331493A1 (en) | 1999-07-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6699515B2 (en) | Process for the production of alcoholic beverages using maltseed | |
| CA2199158C (en) | Seed-specific promoter from barley beta-amylase gene | |
| US5889189A (en) | Process for protein production in plants | |
| James et al. | Glucoamylases: microbial sources, industrial applications and molecular biology—a review | |
| Nuutila et al. | Expression of fungal thermotolerant endo-1, 4-β-glucanase in transgenic barley seeds during germination | |
| US9688973B2 (en) | Polypeptides having alpha-glucosidase activity and polynucleotides encoding same | |
| CN1260001A (zh) | 通过抑制内源海藻糖酶水平来修饰海藻糖－6－磷酸水平从而调节代谢 | |
| KR20000010743A (ko) | 향상된 여과성 및/또는 증대된 수율을 갖는 맥아즙을 제조하는방법 | |
| Kihara et al. | Improvement of β-amylase thermostability in transgenic barley seeds and transgene stability in progeny | |
| US20110086132A1 (en) | Transgenic plant expressing maltogenic alpha-amylase | |
| US20210380909A1 (en) | A brewing method | |
| AU710169B2 (en) | Endo beta-1,4-glucanase from aspergillus | |
| US7033627B2 (en) | Production of enzymes in seeds and their use | |
| JP2023516327A (ja) | 高い限界デキストリナーゼ活性を有する大麦植物 | |
| CN109486841B (zh) | 一种利用稻麦种子生产饲料复合酶的方法 | |
| CN110358775A (zh) | 一种抑制酵母提前絮凝因子产生的方法 | |
| DK165640B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af rekombinant humicola lipase og rekombinante humicola lipaser, der kan fremstilles ved fremgangsmaaden. | |
| MXPA97007112A (en) | Endo-beta-1,4-glucanase from aspergil | |
| Borriss | Structure and function of the genes coding for bacterial endo |