MEIO LÍQUIDO PARA PRESERVAÇÃO DE CÉLULAS DE AMOSTRAS DEMEDIUM FOR PRESERVATION OF SAMPLE CELLS OF
EXAMES CITOLÓGICOS [00' ] A presente invenção refere-se a metodologias alternativas para coleta, transporte e conservação de células, com o objetivo de expandir o uso de meios líquidos para a preservação de amostras de exames citológicos e compreende um meio líquido para preservação de células de amostras destinadas a exames citomorfológicos, composto por etanol 20 ml/dl; formaldeído 1 ml/dl, isopropanol 1 ml/dl em tampão fosfato 10 mmol/L pH7,4. [002] Atualmente, a técnica convencional de Papanicolau é muito utilizada para estimar o risco envolvido em lesões precursoras de câncer, auxiliando em seu ras reamento e acompanhamento, bem como no diagnóstico de infecções, com base na observação de alterações celulares e microrganismos. A coleta da amestra é feita por esfoliação, de células do tecido a ser analisado, e realização de esfregaço em lâmina de microscopia. O material é então submetido à ,fixação, em geral , por aplicação de solução alcoólica de polietile noglicol a 2%, em gotas ou spray, seguida de imersão em etanol a 95%, ccloração de Papanicolau e exame microscópico. [003] Muitas vezes amostras citológicas necessitam de transporte até o laboratório para serem processadas e analisadas. Amostras obtidas por esfoliação podem ser imediatamente fixadas e coradas, como no exame convenóional de citologia cervicovaginal ou mesmo da citologia de escarro. No caso de obtenção de outros materiais, como na citologia de lavados, líquido cefalorraquidiano (LCR), urina, entre outros, há necessidade de preparo da amostra por sedimentação ou centrifugação, para que se possa fixar as células na lâm na. No entanto, há várias limitações em ambos os casos. Células esfoliadas em esfregaços, podem se apresentar arrebentadas, superpostas ou obscurecidas por artefatos, leucócitos, hemácias ou microrganismos. Células de líquidos biológicos podem também aparecer degeneradas, especialmente se o meio biológico em que se encontram é impróprio para a sua conservação, como nos casos de urina ou LCR. [004] A metodologia de Papanicolau tem sido questionada em alguns estudos, nos quais se aponta para índices não ideais de sensibilidade dos preparados convencionais de material citológico, devido à menor representatividade das células do tecido, secagem e ou má fixação do material, falta de homogeneidade na distribuição celular do esfregaço, além do obscurecimento por leucócitos, hemácias e restos celulares. [005] Estudos no sentido de aperfeiçoar o exame citológico pelo método convencionai de Papanicolau têm levado ao desenvolvimento de meios líquidos para a preservação de células. Pela técnica de citologia em meio líquido, as células se encontram suspensas no próprio líquido biológico ou são obtidas por raspagem do, tecido. Em ambos os casos, pode-se adicionar soluções preservadoras, aumentando o tempo de conservação das amostras, bem como permitindo a realização de testes biomoleculares. Os meios líquidos empregados na .coleta de amostras citológicas contêm fixadores, os quais são capazes de preservar a morfologia celular e a composição bioquímica das células após a,retirada do organismo, A fixação pode ser realizada por agentes físico-químicos, que reagem com macromoléculas, promovendo a sua estabilização. [006] Atualmente, existem vários meios líquidos para exames citológicos disponíveis comercialmente. Apesar da existência de estudos apontando vantagens da citologia em meio líquido em comparação ao método convencional de Papanicolau em termos de qualidade amostrai, o custo relativamente elevado do material de coleta inviabiliza sua implantação como metodologia de escolha em unidades de saúde e em programas de prevenção de câncer. [007] O documento de patente “A LIQUID BASED THIN LAYER CYTOPREPARATION FOR LIQUID BASED CYTOLOGY”, IN2376/MUM/2008 decreve uma preparação cito base fino mono-camada de líquido para os testes de diagnóstico de citopatologia, que compreende DL ditiotreítoi, ácido acético-metanol e (solução DAM) utilizado como agente mucolítico, um agente hemolítico e conservante, respectivamente, para o tratamento de amostras de células igualmente eficaz para amostras ginecológicas, não-ginecológicas e FNAC. [008] O documento de patente “FIXATION FLUID FOR SAVING CAST-OFF CELLS AND MANUFACTURING METHOD OF CELL SHALLOW LAYER SMEAR”, CN101182506, revela uma solução de preservação para célula esfoliada e um método de preparação que utiliza a solução de preservação para processar fina camada de esfregaço. A solução para preservação de células esfoliada compreende os componentes que são preparados na proporção de volume de 10 a 15 partes de metanol, de 10 a 15 porções de álcool, de 1 a 2 porções de glicerina, ,1 a 2 porções de polietileno glicol, 10 a 12 porções de formaldeído, 0,5 a 1 partes de ácido acético glacial, 10 a 20 partes de cloreto de sódio com 0,85 por cento a 0,9 por cento de concentração em massa e 33 por cento a 68,5 por cento de tampão fosfato. Os passos do método de preparação de célula de camada fina mancha que são: 1) a amostra colhida é colocado na solução de preservação para célula esfoliada para agitação; a amostra é transferida para uma centrifugadora para tratamento de centrifugação após repouso; 2), o sobrenadante é removido até 1 mi a 2 ml resíduo é deixado no tubo de centrifugação; a suspensão de células é obtida após a vibração uniforme; 3) 0,5 ml de suspensão de células de 1 ml é colocada num copo de esfregaço que é feita em camada fina de células mancha por uma máquina de preparação de esfregaço de células. [009] O documento de patente simplified thin-layer liquid-based cytology cell smeard preparation method, CN1967196, coloca amostras na solução de preservação de células em base líquida, adicione solução de processamento de célula base líquida, e por centrifugação em separado, faz o descarte das amostras de , sobrenadante líquido, utilizando amostras de sedimentos, esfregaço, folha de secagem, utilizando 95% de etanol ou marinar spray para fixação, lavagem e tingimento. [010] A invenção; MEIO LÍQUIDO PARA PRESERVAÇÃO DE CÉLULAS DE AMOSTRAS DE EXAMES CITOLÓGICOS, descrita neste relatório, foi desenvolvida com o intuito de buscar metodologias alternativas para coleta, transporte e conservação de células, com o objetivo de expandir o uso de meios líquidos para a preservação de amostras de exames citológicos. [011] O meio líquido, aqui denominado de “FlP-Solução” é composto por etanol 20 ml/di; formaldeído 1 ml/dl, isopropanol 1 ml/dl em tampão fosfato 10 mmol/L pH7,4. Q seu método de preparo é realizado de acordo com a seguinte técnica: em um tubo plástico cônico tipo Falcon, com capacidade de 15 ml, são adicionados com auxílio de pipeta automática e ponteira descartável, 400μ! de etanol (99,5%v/v); 60μΙ de formaldeído (37% v/v); 20 μΙ de isopropanol (99,5% v/v); tampão fosfato 10 mmoles/l pH 7,4 em quantidade suficiente para 2ml. O tampão fosfato é produzido misturando-se em um balão volumétrico com capacidade para 1000 ml, os sais previamente pesados em balança analítica: 8g de cloreto de sódio (NaCI); 1,16g de fosfato de sódio dibásico (Na2HP04); 0,2g de fosfato de potássio monobásico (KH2P04); 0,2g de cloreto de potássio (KCI); água ultrapura em quantidade suficiente para 1000ml. [012] O método de utilização da “FlP-Solução” compreende a obtenção do material citológico por esfoliação com escova citológica (Kolplast) e o deposito imediatamente no meio líquido. O processamento da amostra deve se dar com homogeneização (vortex Phoenix, AP56) por 20 segundos, retirando-se a escova citológica em seguida. O material é então submetido à centrifugação a 289 x g durante 5 min, desprezando-se o sobrenadante por inversão e ressuspendendo-se o sedimento em 100 pl de meio líquido, com o auxílio de pipeta automática, homogeneizando-se por 20s. Uma alíquota de 50 pl do material assim,obtido é espalhada por movimentos circulares, com o auxílio de ponteira descartável de pipeta automática, de forma a obter um esfregaço com 2 cm de diâmetrp na região central de uma lâmina de microscopia 7,5 x 2,5 cm. Em seguida, a amostra é seca ao ar e submetida à coloração de Papanicolau. [013] Testes com a “FlP-Solução” foi realizado em 10 amostras citológicas provenientes da cavidade oral e em 20 amostras de material cervicovaginal. cujas células ;foram preservadas, em “FlP-Solução" e analisadas em esfregaços preparados como descrito acima, no dia da coleta e após 3, 7 e 15 dias à temperatura ambiente.. Comparou-se a qualidade morfocitológica das amostras mantidas em “FlP-Solução" com a de amostras obtidas pela coleta convencional de Papanicolau. Todas as amostras obtidas em “FlP-Solução” apresentaram boa fixação, qualidade amostrai comparável ao método convencional, apresentando os mesmos tipos celulares e microrganismos, assim como alterações citológicas degenerativas e reativas, sugerindo sua adequabilidade para citologia ginecológica e não ginecológica. [014] O meio “FlP-Solução”, descrito neste relatório, permite a conservação de material citoiógico para análise morfológica do material em até quinze dias após a coleta, proporcionando boa fixação, homogeneidade do esfregaço, alta qualidade e representatividade amostrai. Além disso, a implantação desse meio líquido no sistema público de saúde parece ser acessível, uma vez que é de baixo custo e de fácil preparação.CYTOLOGICAL EXAMINATIONS [00 '] The present invention relates to alternative methodologies for cell collection, transport and preservation for the purpose of expanding the use of liquid media for the preservation of cytological specimens and comprises a liquid medium for preservation of sample cells for cytomorphological examinations, composed of ethanol 20 ml / dl; formaldehyde 1 ml / dl, isopropanol 1 ml / dl in 10 mmol / l phosphate buffer pH7.4. [002] Currently, the conventional Pap smear technique is widely used to estimate the risk involved in cancer precursor lesions, assisting in its screening and follow-up, as well as in the diagnosis of infections, based on the observation of cellular changes and microorganisms. The collection of the sample is done by exfoliation, cells of the tissue to be analyzed, and smear on a microscopy slide. The material is then subjected to fixation in general by application of 2% polyethylene noglycol alcoholic solution in drops or spray, followed by immersion in 95% ethanol, Pap smear and microscopic examination. [003] Often cytological specimens require transport to the laboratory for processing and analysis. Exfoliation specimens can be immediately fixed and stained, as in the conventional cervicovaginal cytology or even sputum cytology examination. In the case of obtaining other materials, such as wash cytology, cerebrospinal fluid (CSF), urine, among others, it is necessary to prepare the sample by sedimentation or centrifugation, so that the cells can be fixed in the lamina. However, there are several limitations in both cases. Smear-exfoliated cells may be burst, overlapped, or obscured by artifacts, leukocytes, red blood cells, or microorganisms. Biological fluid cells may also appear degenerate, especially if the biological environment in which they are found is unsuitable for preservation, such as urine or CSF. The Papanicolau methodology has been questioned in some studies, which point to non-ideal sensitivity indices of conventional cytological material preparations, due to the lower representativeness of tissue cells, drying and / or poor fixation of the material, lack of homogeneity in smear cell distribution, as well as obscuration by leukocytes, red blood cells and cellular debris. Studies to improve cytological examination by the standard Pap smear method have led to the development of liquid means for cell preservation. By liquid cytology, the cells are suspended in the biological liquid itself or are obtained by scraping the tissue. In both cases, preservative solutions can be added, increasing the storage time of the samples, as well as allowing biomolecular testing. The liquid media employed in the collection of cytological specimens contain fixatives, which are capable of preserving cell morphology and biochemical composition of cells after removal from the organism. Fixation can be performed by physicochemical agents that react with macromolecules. , promoting its stabilization. [006] There are currently several commercially available liquid cytological testing media. Despite the existence of studies pointing to advantages of liquid cytology compared to the conventional Papanicolau method in terms of sample quality, the relatively high cost of the collection material makes it impossible to implement it as a method of choice in health facilities and prevention programs. cancer. [007] Patent document "A LIQUID BASED THIN LAYER CYTOPREPARATION FOR LIQUID BASED CYTOLOGY", IN2376 / MUM / 2008 discloses a single-layer thin liquid cytopathology preparation for cytopathology diagnostic tests comprising DL dithiothreitic acid acetic-methanol and (DAM solution) used as mucolytic agent, a hemolytic agent and preservative, respectively, for the treatment of equally effective cell samples for gynecological, non-gynecological and FNAC samples. [008] Patent document "FIXATION FLUID FOR SAVING CAST-OFF CELLS AND MANUFACTURING METHOD OF CELL SHALLOW LAYER SMEAR", CN101182506, discloses an exfoliated cell preservation solution and preparation method utilizing the preservation solution for fine processing smear layer. The exfoliated cell preservation solution comprises the components which are prepared in a volume ratio of 10 to 15 parts methanol, 10 to 15 parts alcohol, 1 to 2 parts glycerin, 1 to 2 parts polyethylene glycol, 10 to 12 parts formaldehyde, 0.5 to 1 parts glacial acetic acid, 10 to 20 parts sodium chloride with 0.85 percent to 0.9 percent mass concentration and 33 percent to 68.5 percent. percent phosphate buffer. The steps of the thin layer stain cell preparation method are: 1) the collected sample is placed in the exfoliated cell preservation solution for agitation; the sample is transferred to a centrifuge for centrifuge treatment after standing; 2) the supernatant is removed until 1 ml to 2 ml residue is left in the centrifuge tube; cell suspension is obtained after uniform vibration; 3) 0.5 ml of 1 ml cell suspension is placed in a smear cup that is made into thin layer of stain cells by a cell smear preparation machine. [009] The simplified thin-layer liquid-based cytology cell smeard preparation method, CN1967196, places samples in the liquid-based cell preservation solution, adds liquid-based cell processing solution, and by separate centrifugation, makes Discarding samples from liquid supernatant using sediment, swab, drying sheet samples using 95% ethanol or marinate spray for fixation, washing and dyeing. [010] The invention; LIQUID FOR PRESERVATION OF CYTOOLOGICAL SAMPLING SAMPLE CELLS, described in this report, was developed to seek alternative methodologies for cell collection, transport, and conservation to expand the use of liquid media for the preservation of cytological examinations. The liquid medium, hereinafter referred to as "FlP-Solution" is composed of ethanol 20 ml / di; formaldehyde 1 ml / dl, isopropanol 1 ml / dl in 10 mmol / l phosphate buffer pH7.4. Q The preparation method is carried out according to the following technique: in a 15 ml Falcon type conical plastic tube, they are added with the aid of automatic pipette and disposable tip, 400μ! ethanol (99.5% v / v); 60μΙ formaldehyde (37% v / v); 20 μΙ isopropanol (99.5% v / v); phosphate buffer 10 mmol / l pH 7.4 in sufficient quantity for 2 ml. Phosphate buffer is produced by mixing in a 1000 ml volumetric flask the previously weighed salts in analytical balance: 8 g sodium chloride (NaCl); 1.16g of dibasic sodium phosphate (Na2HP04); 0.2g of monobasic potassium phosphate (KH2P04); 0.2g potassium chloride (KCI); Ultrapure water in sufficient quantity for 1000ml. [012] The method of using the "FlP-Solution" comprises obtaining the cytological material by cytological brush exfoliation (Kolplast) and depositing it immediately in the liquid medium. Sample processing should be carried out with homogenization (Phoenix vortex, AP56) for 20 seconds, then removing the cytological brush. The material is then centrifuged at 289 x g for 5 min, the supernatant discarded by inversion and the pellet resuspended in 100 µl of liquid medium with the aid of an automatic pipette, homogenizing for 20s. A 50 µl aliquot of the material thus obtained is spread by circular motion with the aid of a disposable pipette tip to obtain a 2 cm diameter smear in the central region of a 7.5 x 2 microscopy slide. 0.5 cm. Then the sample is air dried and subjected to Pap smear. Testing with the "FlP-Solution" was performed on 10 cytological specimens from the oral cavity and on 20 specimens of cervicovaginal material. whose cells; were preserved in "FlP-Solution" and analyzed on smears prepared as described above on the day of collection and after 3, 7 and 15 days at room temperature. The morphocytological quality of the samples maintained on "FlP" was compared. -Solution "with that of samples obtained by conventional Pap smear collection. All samples obtained in “FlP-Solution” presented good fixation, sample quality comparable to the conventional method, presenting the same cell types and microorganisms, as well as degenerative and reactive cytological alterations, suggesting their suitability for gynecological and non-gynecological cytology. [014] The “FlP-Solution” medium, described in this report, allows the conservation of cytological material for morphological analysis of the material up to fifteen days after collection, providing good fixation, smear homogeneity, high quality and sample representativeness. In addition, the deployment of this liquid medium in the public health system appears to be affordable as it is inexpensive and easy to prepare.