BR112018070956B1 - Composto, composição farmacêutica e uso de um composto - Google Patents

Abstract

A invenção fornece conjugados que compreendem uma porção química de direcionamento, um ácido nucleico e grupos de ligação opcionais, bem como intermediários sintéticos e métodos sintéticos úteis para preparar os conjugados. Os conjugados são úteis para direcionar ácidos nucleicos terapêuticos para o fígado e para tratar doenças do fígado incluindo hepatite (por exemplo, hepatite B e hepatite D).

Description

[001] Este pedido de patente reivindica o benefício da prioridade do pedido de patente provisório US n° 62/321.034, depositado em 11 de abril de 2016, do pedido de patente provisório US n° 62/417.156, depositado em 3 de novembro de 2016, e do pedido de patente provisório US n° 62/438.310, depositado em 22 de dezembro de 2016, cujas aplicações são incorporadas ao presente documento a título de referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi apresentada eletronicamente no formato ASCII e está incorporada ao presente documento 3a título de referência, em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 7 de abril de 2017, é nomeada 08155_056W01_SL.txt e tem 7824 bytes de tamanho.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Várias doenças são específicas do fígado, por exemplo, Hepatite B e esteato-hepatite não alcoólica (NASH). Consequentemente, seria benéfico ter composições terapêuticas que possam ser direcionadas principalmente ao fígado, rim, coração, pâncreas ou outros órgãos em indivíduos.

[004] Os ácidos nucleicos, que incluem siRNA são úteis como agentes terapêuticos.

[005] Atualmente, há uma necessidade de composições e métodos que possam ser usados para entregar (por exemplo, direcionar) os ácidos nucleicos terapêuticos em indivíduos vivos.

BREVE SUMÁRIO

[006] A invenção fornece compostos, composições e métodos que podem ser usados para direcionar ácidos nucleicos terapêuticos (por exemplo, ao fígado).

[007] Consequentemente, num aspecto, esta invenção fornece um composto da fórmula Iem que:R1 é um ligante de direcionamento;L1 está ausente ou é um grupo de ligação;L2 está ausente ou é um grupo de ligação;R2 é um ácido nucleico;o anel A está ausente, é uma cicloalquila com 3 a 20 membros, uma arila com 5 a 20 membros, um heteroarila com 5 a 20 membros ou uma heterocicloalquila com 3 a 20 membros;cada RA é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, hidróxi, CN, F, Cl, Br, I, -C1-2 alquila-ORB, C1-10 alquila, C2-10 alquenila e C2-10 alquinila; em que a C1-10 alquila, C2-10 alquenila e C2-10 alquenila são opcionalmente substituídas por um ou mais grupos independentemente selecionados dentre halogênio, hidróxi e C1-3 alcóxi;RB é hidrogênio, um grupo protetor, uma ligação covalente a um suporte sólido, ou uma ligação a um grupo de ligação que é ligado a um suporte sólido; en é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;ou um sal do mesmo.

[008] As doenças e afecções que podem ser tratadas com as moléculas de siRNA, incluindo combinações das mesmas, incluem doenças do fígado, por exemplo, doenças do fígado associadas ou causadas pelo acúmulo de gordura, como esteatose hepática, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), transplante de fígado esteatótico, hepatite (por exemplo, B ou D) e/ou danos agudos ao fígado, incluindo insuficiência hepática fulminante e subfulminante e hipertrigliceridemia.

[009] A invenção também fornece intermediários sintéticos e métodos divulgados no presente documento que são úteis para preparar compostos da fórmula I.

[010] Outros objetivos, recursos e vantagens da presente invenção serão evidentes a um versado na técnica a partir da descrição detalhada e das Figuras a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[011] Figura 1: Ilustra um composto intermediário da fórmula Ie, em que um ligante/aglutinante de direcionamento é ligado a um suporte de fase sólida, e em que Pg1 é a DMTr de grupo protetor.

[012] Figura 2: Ilustra um composto representativo da fórmula Id em que um ligante de direcionamento é ligado a um suporte de fase sólida, com um ácido nucleico covalentemente ligado.

[013] Figura 3: Ilustra um composto representativo da fórmula Id, em que um conjugado de ligante de direcionamento e ácido nucleico foi clivado a partir de um suporte de fase sólida e desprotegido para fornecer o composto da fórmula I.

[014] Figura 4: Ilustra o experimento de knockdown de gene de mRNA de TTR, após uma transfecção de 24 horas de conjugado de GalNAc em várias doses em hepatócitos primários de C57.

[015] Figura 5: Ilustra o knockdown de proteína de TTR após uma única dose SubQ, de 1 mg/kg, de Conjugado de siRNA-GalNAc de TTR; Camundongos C57 (n=4).

[016] Figura 6: Ilustra o knockdown de mRNA de TTR no fígado após uma única dose SubQ, 1 mg/kg, de Conjugado de siRNA-GalNAc de TTR; Camundongos C57 (n=4).

[017] Figura 7: Mostra dados do Exemplo 25 para compostosrepresentativos.

[018] Figura 8: Mostra dados do Exemplo 25 para compostosrepresentativos.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[019] Conforme usado no presente documento, os termos a seguir têm os significados atribuídos aos mesmos a menos que seja especificado o contrário.

[020] O termo “RNA de interferência pequeno” ou “siRNA” conforme usado no presente documento se refere ao RNA de filamento duplo (isto é, RNA duplex) que é capaz de reduzir ou inibir a expressão de um gene ou sequência-alvo (por exemplo, mediando-se a degradação ou inibindo a tradução de mRNAs que são complementares à sequência de siRNA) quando o siRNA estiver na mesma célula que o gene ou a sequência-alvo. O siRNA pode ter identidade substancial ou completa com o gene ou sequência-alvo, ou pode compreender uma região de disparidade (isto é, um motivo de disparidade). Em certas modalidades, os siRNAs podem ter cerca de 19 a 25 nucleotídeos (duplex) de comprimento, e tem, de preferência, cerca de 20 a 24, 21 a 22 ou 21 a 23 nucleotídeos de comprimento. Os siRNAs duplex podem compreender saliências de 3 ’de cerca de 1 a cerca de 4 nucleotídeos ou cerca de 2 a cerca de 3 nucleotídeos e terminais de fosfato de 5’. Exemplos de siRNA incluem, sem limitação, uma molécula de polinucleotídeo de filamento duplo reunida a partir de duas moléculas de filamento separado, em que um filamento é o filamento de senso e o outro é o filamento de antissenso complementar.

[021] Em certas modalidades, a saliência de 5' e/ou 3' num ou ambos os filamentos do siRNA compreende 1 a 4 (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) nucleotídeos de desoxitimidina (t ou dT) modificados e/ou não modificados, 1 a 4 (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) ribonucleotídeos de uridina (U) modificados (por exemplo, 2'OMe) e/ou não modificados, e/ou 1 a 4 (por exemplo 1, 2, 3 ou 4) ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos (por exemplo, 2'OMe) modificados e/ou não modificados que são complementares à sequência-alvo (por exemplo, saliência de 3 ’no filamento de antissenso) ou filamento complementar da mesma (por exemplo, saliência de 3' no filamento de senso).

[022] De preferência, os siRNAs são quimicamente sintetizados. O siRNA também pode ser gerado por meio de clivagem de dsRNA mais longo (por exemplo, dsRNA maior que cerca de 25 nucleotídeos de comprimento) com a E. coli RNase III ou Dicer. Estas enzimas processam o dsRNA para o siRNA biologicamente ativo (consulte, por exemplo, Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 99:9942-9947 (2002); Calegari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 99:14236 (2002); Byrom et al., Ambion TechNotes, 10(1):4-6 (2003); Kawasaki et al., Nucleic Acids Res., 31:981-987 (2003); Knight et al., Science, 293:2269-2271 (2001); e Robertson et al., J. Biol. Chem., 243:82 (1968)). De preferência, o dsRNA tem pelo menos 50 nucleotídeos a cerca de 100, 200, 300, 400 ou 500 nucleotídeos de comprimento. Um dsRNA pode ser tão longo quanto 1000, 1500, 2000, 5000 nucleotídeos de comprimento, ou mais longo. O dsRNA pode codificar toda uma transcrição de gene ou uma transcrição de gene parcial. Em certos casos, o siRNA pode ser codificado por um plasmídeo (por exemplo, transcrito como sequências que se dobram automaticamente em duplexes com alças em formato de grampo).

[023] A frase “que inibe a expressão de um gene-alvo ”se refere à habilidade de um siRNA da invenção silenciar, reduzir ou inibir a expressão de um gene-alvo (por exemplo, expressão de DGAT2 e, opcionalmente, de ANGPTL3). Para examinar a extensão do silenciamento de gene, uma amostra de teste (por exemplo, uma amostra biológica de um organismo de interesse que expressa o gene-alvo ou uma amostra de células na cultura que expressa o gene-alvo) é colocada em contato com um siRNA que silencia, reduz ou inibe a expressão do gene-alvo. A expressão do gene-alvo na amostra de teste é comparada à expressão do gene-alvo numa amostra de controle (por exemplo, uma amostra biológica de um organismo de interesse que expressa o gene-alvo ou uma amostra de células na cultura que expressa o gene-alvo) que não é colocado em contato com o siRNA. As amostras de controle (por exemplo, amostras que expressam o gene-alvo) podem ser atribuídas com um valor de 100%. Em modalidades específicas, o silenciamento, a inibição ou a redução de expressão de um gene-alvo é obtido quando o valor da amostra de teste em relação à amostra de controle (por exemplo, tampão apenas, uma sequência de siRNA que direciona um gene diferente, uma sequência de siRNA embaralhada, etc.) é cerca de 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%,89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%,75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%,5% ou 0%. Os ensaios incluem, sem limitação, a examinação de proteína ouníveis de mRNA usando técnicas conhecidas por aqueles versados na arte, como, por exemplo, dot blots, Northern blots, hidridização in situ, ELISA, imunoprecipitação, função enzimática, assim como ensaios fenotípicos conhecidos por aqueles versados na arte.

[024] O termo “ grupo de ativação sintética ”se refere a um grupo que pode ser fixado a um átomo para ativar aquele átomo para permitir que o mesmo forme uma ligação covalente com um outro grupo reativo. Compreende- se que a natureza do grupo de ativação sintética pode depender do átomo que o mesmo está ativando. Por exemplo, quando o grupo de ativação sintética é fixado a um átomo de oxigênio, o grupo de ativação sintética é um grupo que ativará este átomo de oxigênio para formar uma ligação (por exemplo, uma ligação de éster, carbamato ou éter) com um outro grupo reativo. Tais grupos de ativação sintética são conhecidos. Exemplos de grupos de ativação sintética que podem ser fixados a um átomo de oxigênio incluem, mas sem limitação, acetato, succinato, triflato e mesilato. Quando o grupo de ativação sintética for fixado a um átomo de oxigênio de um ácido carboxílico, o grupo de ativação sintética pode ser um grupo que é derivável de um reagente de acoplamento conhecido (por exemplo, um reagente de acoplamento de amida conhecido). Tais reagentes de acoplamento são conhecidos. Exemplos de tais reagentes de acoplamento incluem, mas sem limitação, N,N’ -Diciclo-hexilcarbodimida (DCC),hidroxibenzotriazol (HOBt), N-(3-Dimetilaminopropil)-N’-etilcarbonato (EDC), (Benzotriazol-1-iloxi)tris(dimetilamino)fosfônio hexafluorofosfato (BOP),benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfônio hexafluorofosfato (PyBOP) ou O- benzotriazol-1-il-N,N,N’,N’-tetrametilurônio hexafluorofosfato (HBTU).

[025] Uma “quantidade eficaz ”ou “quantidade terapeuticamente eficaz ”de um ácido nucleico terapêutico como siRNA é uma quantidade suficiente para produzir o efeito desejado, por exemplo, uma inibição de expressão de uma sequência-alvo em comparação com o nível de expressão normal detectado na ausência de um siRNA. Em modalidades específicas, a inibição de expressão de um gene-alvo ou sequência-alvo é obtida quando o valor obtido com um siRNA em relação ao controle (por exemplo, tampão apenas, uma sequência de siRNA que direciona um gene diferente, uma sequência de siRNA embaralhada, etc..) é cerca de 100%, 99%, 98%, 97%, 96%,95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%,81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%,35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ou 0%. Os ensaios adequados para medira expressão de um gene-alvo ou sequência-alvo incluem, mas sem limitação, a examinação de proteína ou níveis de mRNA usando técnicas conhecidas por aqueles versados na arte, como, por exemplo, dot blots, Northern blots, hibridização in situ, ELISA, imunoprecipitação, função enzimática, assim como ensaios fenotípicos conhecidos por aqueles versados na arte.

[026] O termo “ácido nucleico ”conforme usado no presente documento se refere a um polímero que contém pelo menos dois nucleotídeos (por exemplo, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos) em qualquer forma de filamento único ou duplo e inclui DNA e RNA. “Nucleotídeos ”contêm uma desoxirribose (DNA) ou ribose (RNA) de açúcar, uma base e um grupo fosfato. Os nucleotídeos são ligados juntos através dos grupos fosfato. “Bases ”incluem purinas e pirimidinas, que incluem adicionalmente compostos naturais adenina, timina, guanina, citosina, uracila, inosina e análogos naturais, e derivados sintéticos de purinas e pirimidinas, que incluem, mas sem limitação, modificações que originam novos grupos reativos como, mas sem limitação, aminas, álcoois, tióis, carboxilatos e haletos de alquila. Os ácidos nucleicos incluem ácidos nucleicos que contêm análogos de nucleotídeo conhecidos ou resíduos ou aglutinações de cadeia principal modificados, que são sintéticos, de ocorrência natural e de ocorrência não natural, e que têm propriedades de ligação semelhantes àquelas do ácido nucleico de referência. Exemplos de tais análogos e/ou resíduos modificados incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metila, fosfonatos de metila quiral, ribonucleotídeos de 2’-O-metila e peptídeo-ácidos nucleicos (PNAs). Adicionalmente, os ácidos nucleicos podem incluir uma ou mais porções químicas de UNA.

[027] O termo “ácido nucleico ”inclui qualquer oligonucleotídeo ou polinucleotídeo, com fragmentos que contêm até 60 nucleotídeos geralmente denominados oligonucleotídeos, e fragmentos mais longos denominados polinucleotídeos. Um desoxirribo-oligonucleotídeo consiste num açúcar com 5 carbonos chamado de desoxirribose unido covalentemente ao fosfato nos carbonos 5 ’e 3 ’de seu açúcar para formar um polímero alternante, não ramificado. O DNA pode estar na forma de, por exemplo, moléculas antissenso, DNA de plasmídeo, DNA pré-condensado, um produto de PCR, vetores, cassetes de expressão, sequências quiméricas, DNA cromossômicos ou derivados e combinações destes grupos. Um ribo-oligonucleotídeo consiste numa estrutura de repetição semelhante em que o açúcar com 5 carbonos e ribose. O RNA pode estar na forma, por exemplo, de RNA de interferência pequeno (siRNA), dsRNA de substrato de Dicer, RNA de formato de grampo pequeno (shRNA), RNA de interferência assimétrico (aiRNA), microRNA (miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, tRNA, RNA viral (vRNA), e combinações dos mesmos. Consequentemente, no contexto desta invenção, os termos “polinucleotídeo ”e “oligonucleotídeo ”se referem a um polímero ou oligômero de nucleotídeo ou monômeros de nucleosídeo que consistem em bases de ocorrência natural, açúcares e aglutinações (de cadeia principal) interaçúcares. Os termos “polinucleotídeo ”e “oligonucleotídeo ”também incluem polímeros ou oligômeros que compreendem monômeros de ocorrência não natural, ou porções dos mesmos, que funcionam de modo semelhante. Tais oligonucleotídeos modificados ou substituídos são, frequentemente, preferenciais nas formas nativas devido às propriedades como, por exemplo, absorção celular intensificada, imunogenicidade reduzida e estabilidade aumentada na presença de nucleases.

[028] A menos que seja indicado o contrário, uma sequência de ácido nucleico específica também abrange implicitamente variantes conservadoramente modificadas da mesma (por exemplo, substituições de códon degenerados), alelos, ortólogos, SNPs e sequências complementares assim como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, as substituições de códon degenerado podem ser obtidas gerando-se sequências em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída por resíduos de base mista e/ou desoxi-inosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994)).

[029] Numa modalidade, o ácido nucleico pode ser um siRNA. O siRNA adequado, assim como o método e intermediários úteis para sua preparação são relatados na Publicação de Pedido de Patente Internacional Número WO2016/054421. Numa modalidade, o siRNA pode ser selecionado dentre o siRNA mostrado na seguinte tabela I.Tabela I. Sequências de siRNA

[030] O termo “gene ”se refere a uma sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, DNA ou RNA) que compreende sequências de codificação de comprimento parcial ou de comprimento total necessárias para a produção de um polipeptídeo ou polipeptídeo de precursor.

[031] “Produto de gene”, conforme usado no presente pedido, refere-se a um produto de um gene como uma transcrição de RNA ou um polipeptídeo.

[032] Conforme usado no presente documento, o termo “alquila”, por si só ou como parte de um outro substituinte, significa, a menos que seja definido o contrário, um radical de hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada, que tem o número de átomos de carbono projetado (isto é, C1-8 significa um a oito carbonos). Exemplos de grupos alquila incluem metila, etila, n-propila, iso- propila, n-butila, t-butila, iso-butila, sec-butila, n-pentila, n-hexila, n-heptila, noctila, e semelhantes. O termo “alquenila ”se refere a um radical alquila insaturado que tem uma ou mais ligações duplas. Semelhantemente, o termo “alquinila ”se refere a um radical alquila insaturado que tem uma ou mais ligações triplas. Exemplos de tais grupos alquila insaturados incluem vinila, 2-propenila, crotila, 2-isopentenila, 2-(butadienila), 2,4-pentadienila, 3-(1,4-pentadienila), etinila, 1- e 3-propinila, 3-butinila, e os homólogos e isômeros superiores.

[033] O termo “alquileno ”por si só ou como parte de um outro substituinte significa um radical bivalente derivado de um alcano (que inclui alcanos lineares e ramificados), conforme exemplificado por CH2CH2CH2CH2 e CH(CH3)CH2CH2-.

[034] O termo “cicloalquila”, “carbocíclico ”ou “carbociclo ”se refere a sistema de anel de hidrocarboneto que tem de 3 a 20 em geral de número de átomos de anel (por exemplo, a cicloalquila com 3 a 20 membros é uma cicloalquila com 3 a 20 átomos de anel, ou C3-20 cicloalquila é uma cicloalquila com 3 a 20 átomos de carbono de anel) e sendo que uma cicloalquila com 3 a 5 membros é totalmente saturada ou tem no máximo uma ligação dupla entre vértices de anel e para uma cicloalquila com 6 membros ou maior que é totalmente saturada ou tem no máximo duas ligações duplas entre os vértices de anel. Conforme usado no presente documento, “cicloalquila”, “ carbocíclico ” ou “carbociclo ”também se destina a se referir a sistema de anel de hidrocarboneto bicíclico, policíclico e espirocíclico, como, por exemplo, biciclo[2.2.1]heptano, pinano, biciclo[2.2.2]octano, adamantano, norboreno, C5-12 alcano espirocíclico, etc. Conforme usado no presente documento, os termos, “alquenila”, “alquinila”, “cicloalquila”, “carbociclo ”e “carbocíclico ”se destinam a incluir variantes mono e poli-halogenadas dos mesmos.

[035] O termo “heterocicloalquila”, “heterocíclico ”ou “heterociclo ” se refere a um radical de sistema de anel saturado ou parcialmente insaturado que tem, no geral, de 3 a 20 átomos de anel (por exemplo, a heterocicloalquila com 3 a 20 membros é um radical de heterocicloalquila com 3 a 20 átomos de anel, uma C2-19 heterocicloalquila é uma heterocicloalquila que tem de 3 a 10 átomos de anel entre 2 a 19 átomos de anel que são carbono) que contêm de um a dez heteroátomos selecionados dentre N, O e S, em que os átomos de nitrogênio e enxofre são opcionalmente oxidados, os átomos de nitrogênio são opcionalmente quaternizados, como átomos de anel. A menos que seja definido de outro modo, um anel de “heterocicloalquila“ ”heterocíclico ”ou “heterociclo ” pode ser um sistema de anel monocíclico, um bicíclico espirocíclico ou um policíclico. Exemplos não limitantes de anéis de “heterocicloalquila”, “heterocíclico ”ou “heterociclo ”incluem pirrolidina, piperidina, N-metilpiperidina, imidazolidina, pirazolidina, butirolactam, valerolactam, imidazolidinona, hidantoína, dioxolano, ftalimida, piperidina, pirimidina-2,4(1H,3H)-diona, 1,4- dioxano, morfolina, tiomorfolina, tiomorfolina-S-óxido, tiomorfolina-S,S-óxido, piperazina, pirano, piridona, 3-pirrolina, tiopirano, pirona, tetra-hidrofurano, tetra- hidrotiofeno, quinuclidina, tropano, 2-azaspiro[3.3]heptano, (1R,5S)-3- azabiciclo[3.2.1]octano, (1s,4s)-2-azabiciclo[2.2.2]octano, (1R,4R)-2-oxa-5- azabiciclo[2.2.2]octano e semelhantes. Um grupo “heterocicloalquila”, “heterocíclico ”ou “heterociclo ”pode ser fixado ao restante da molécula através de um ou mais carbonos de anel ou heteroátomos. Uma “heterocicloalquila”, “heterocíclico ”ou “heterociclo ”pode incluir variantes mono- e poli-halogenadas da mesma.

[036] Os termos “alcóxi ”e “alquiltio ”são usados em seu sentido convencional, e se referem àqueles grupos alquila fixados ao restante da molécula por meio de um átomo de oxigênio (“oxi”) ou grupo tio, e incluem adicionalmente variantes mono e poli-halogenadas dos mesmos.

[037] Os termos “halo ”ou “halogênio”, por si próprios ou como parte de um outro substituinte, significam, a menos que definido o contrário, um átomo de flúor, cloro, bromo ou iodo. O termo “(halo)alquila ”se destina a incluir um substituinte tanto de “alquila ”quanto de “haloalquila” . Adicionalmente, o termo “haloalquila ”se destina a incluir mono-haloalquila e poli-haloalquila. Por exemplo, o termo “C1-4 haloalquila ”se destina a incluir trifluorometila, 2,2,2- trifluoroetila, 4-clorobutila, 3-bromopropila, difluorometila e semelhantes.

[038] O termo “ arila ”significa um grupo aromático carbocíclico que tem de 6 a 14 átomos de carbono, seja fundido ou não a um ou mais grupos. Exemplos de grupos arila incluem fenila, naftila, bifenila e semelhantes a menos que seja definido o contrário.

[039] O termo “heteroarila ”se refere a anel (ou anéis) de arila que contém de um a cinco heteroátomos selecionados dentre N, O e S, em que os átomos de nitrogênio e enxofre são opcionalmente oxidados, e os átomos de nitrogênio são opcionalmente quaternizados. Um grupo heteroarila pode ser fixado ao restante da molécula através de um heteroátomo. Exemplos de grupos heteroarila incluem piridila, piridazinila, pirazinila, pirimindinila, triazinila, quinolinila, quinoxalinila, quinazolinila, cinolinila, ftalaziniila, benzotriazinila, purinila, benzimidazolila, benzopirazolila, benzotriazolila, benzisoxazolila, isobenzofurila, isoindolila, indolizinila, benzotriazinila, tienopiridinila, tienopirimidinila, pirazolopirimidinila, imidazopiridinas, benzotiaxolila,benzofuranila, benzotienila, indolila, quinolila, isoquinolila, isotiazolila, pirazolila, indazolila, pteridinila, imidazolila, triazolila, tetrazolila, oxazolila, isoxazolila, tiadiazolila, pirrolila, tiazolila, furila, tienila e semelhantes.

[040] O termo sacarídeo inclui monossacarídeos, dissacarídeos e trissacarídeos. O termo inclui glicose, sacarose frutose, galactose e ribose, assim como desóxi açúcares como desoxirribose e amino açúcar como galactosamina. Os derivados de sacarídeo podem ser, convenientemente, preparados conforme descrito na Publicação de Pedidos de Patente Internacional Números WO 96/34005 e 97/03995. Um sacarídeo pode ser convenientemente ligado ao restante de um composto da fórmula I através de uma ligação de éter, uma ligação de tioéter (por exemplo, um S-glicosídeo), uma amina nitrogênio (por exemplo, um N-glicosídeo), ou uma ligação de carbono-carbono (por exemplo, um C-glicosídeo). Numa modalidade, o sacarídeo pode ser convenientemente ligado ao restante de um composto da fórmula I através de uma ligação de éter. Numa modalidade, o termo sacarídeo inclui um grupo da fórmula:em que:X é NR3, e Y é selecionado dentre (C=O)R4, -SO2R5, e(C=O)NR6R7; ou X é (C=O) e Y é NR8R9;R3 é hidrogênio ou (C1-C4)alquila;R4, R5, R6, R7 , R8 e R9 são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consiste em hidrogênio, (C1-C8)alquila, (C1- C8)haloalquila, (C1-C8)alcóxi e (C3-C6)cicloalquila que é opcionalmente substituída por um ou mais grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em halo, (C1-C4)alquila, (C1-C4)haloalquila, (C1-C4)alcóxi e (C1- C4)haloalcóxi;R10 é -OH, -NR8R9 ou -F; eR11 é -OH, -NR8R9, -F ou heterociclo com 5 membros que é opcionalmente substituído por um ou mais grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em halo, hidroxila, carboxila, amino, (C1- C4)alquila, (C1-C4)haloalquila, (C1-C4)alcóxi e (C1-C4)haloalcóxi. Numa outra modalidade, o sacarídeo pode ser selecionado do grupo que consiste em:

[041] Numa outra modalidade, o sacarídeo pode ser:

[042] O termo “animal ”inclui espécie de mamífero, como um ser humano, camundongo, rato, cachorro, gato, hamster, porquinho da índia, coelho, gado e semelhantes.

GERAÇÃO DE MOLÉCULAS DE SIRNA

[043] O siRNA pode ser fornecido em diversas formas incluindo, por exemplo, como um ou mais duplexes de RNA de interferência pequeno (siRNA) isolados, como RNA de filamento duplo mais longo (dsRNA), ou como siRNA ou dsRNA transcrito a partir de um cassete de transcrição num DNA plasmídeo. Em algumas modalidades, o siRNA pode ser produzido enzimaticamente ou por meio de síntese orgânica parcial/total, e os ribonucleotídeos modificados podem ser introduzidos por meio de síntese enzimática ou orgânica in vitro. Em certos casos, cada filamento é preparado quimicamente. Os métodos de síntese de moléculas de RNA são conhecidos na técnica, por exemplo, os métodos de síntese química conforme descritos em Verma e Eckstein (1998) ou conforme descrito no presente documento.

[044] Os métodos para isolar RNA, sintetizar RNA, hibridizar ácidos nucleicos, produzir e triar bibliotecas de cDNA e realizar PCR são bem conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Gubler e Hoffman, Gene, 25:263269 (1983); Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra), como são os métodos de PCR (consulte, Patente US n° 4.683.195 e n° 4.683.202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds., 1990)). As bibliotecas de expressão também são bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Os textos básicos adicionais que divulgam os métodos gerais de uso nesta invenção incluem Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994). As divulgações destas referências são incorporadas no presente documento a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos.

[045] Tipicamente, siRNA são quimicamente sintetizados. Os oligonucleotídeos que compreendem as moléculas de siRNA da invenção podem ser sintetizados usando qualquer uma dentre uma variedade de técnicas conhecidas na arte, como aqueles descritos em Usman et al., J. Am. Chem. Soc., 109:7845 (1987); Scaringe et al., Nucl. Acids Res., 18:5433 (1990); Wincott et al., Nucl. Acids Res., 23:2677-2684 (1995); e Wincott et al., Methods Mol. Bio., 74:59 (1997). A síntese de oligonucleotídeos faz uso de grupos protetores e de acoplamento de ácido nucleico comuns, como dimetoxitritil na extremidade 5 ’e fosforamiditos na extremidade 3 ’. Como um exemplo não limitante, a síntese de pequena escala pode ser conduzida num sintetizador Applied Biosystems usando um protocolo de escala de 0,2 μmol. Alternativamente, a síntese na escala μde 0,2 μmol pode ser realizada num sintetizador de placa de 96 cavidades da Protogene (Palo Alto, CA). No entanto, uma escala maior ou menor de síntese também está dentro do escopo desta invenção. Os reagentes adequados para síntese de oligonucleotídeo, métodos para desproteção de RNA e métodos para purificação de RNA são conhecidos por aqueles versados na técnica.

[046] As moléculas de siRNA podem ser unidas a partir de dois oligonucleotídeos distintos, em que um oligonucleotídeo compreende o filamento de senso e o outro compreende o filamento de antissenso do siRNA. Por exemplo, cada filamento pode ser sintetizado separadamente e unido por meio de hidridização ou ligação após síntese e/ou desproteção.

MODALIDADES DA INVENÇÃO

[047] Um aspecto da invenção é um composto da fórmula I, conforme definido no Sumário da Invenção, ou um sal do mesmo.

[048] Numa modalidade do composto da fórmula I, R1 é um ligante de direcionamento;

[049] L1 está ausente ou é um grupo de ligação;

[050] L2 está ausente ou é um grupo de ligação;

[051] R2 é um ácido nucleico;

[052] o anel A está ausente, é uma cicloalquila com 3 a 20 membros, uma arila com 5 a 20 membros, um heteroarila com 5 a 20 membros ou uma heterocicloalquila com 3 a 20 membros;

[053] cada RA é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, hidróxi, CN, F, Cl, Br, I, -C1-2 alquila-ORB e C1-8 alquila que é opcionalmente substituída com um ou mais grupos independentemente selecionados dentre halo, hidróxi e C1-3 alcóxi;

[054] RB é hidrogênio, um grupo protetor, uma ligação covalente a um suporte sólido, ou uma ligação a um grupo de ligação que é ligado a um suporte sólido; e

[055] n é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

[056] Numa modalidade, R1 é -C(H)(3-p)(L3-sacarídeo)p, em que cada L3 é independentemente um grupo de ligação; p é 1, 2, ou 3; e sacarídeo é um monossacarídeo ou dissacarídeo.

[057] Numa modalidade, o sacarídeo é:

[058] em que:

[059] X é NR3, e Y é selecionado dentre (C=O)R4, -SO2R5, e (C=O)NR6R7; ou X é (C=O) e Y é NR8R9;

[060] R3 é hidrogênio ou (C1-C4)alquila;

[061] R4, R5, R6, R7 , R8 e R9 são, cada um,independentemente selecionados do grupo que consiste em hidrogênio, (C1-C8)alquila, (C1-C8)haloalquila, (C1-C8)alcóxi e (C3-C6)cicloalquila que é opcionalmente substituída por um ou mais grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em halo, (C1-C4)alquila, (C1- C4)haloalquila, (C1-C4)alcóxi e (C1-C4)haloalcóxi;

[062] R10 é -OH, -NR8R9 ou -F; e

[063] R11 é -OH, -NR8R9, -F ou heterociclo com 5 membros que é opcionalmente substituído por um ou mais grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em halo, hidroxila, carboxila, amino, (C1-C4)alquila, (C1-C4)haloalquila, (C1-C4)alcóxi e (C1-C4)haloalcóxi;

[064] ou um sal do mesmo.

[065] Numa modalidade, o sacarídeo é selecionado do grupo que consiste em:

[066] e sais do mesmo.

[067] Numa modalidade, o sacarídeo é:

[068] Numa modalidade, cada L3 é independentemente uma cadeia de hidrocarboneto bivalente, ramificada ou não ramificada, saturada ou não saturada, que tem de 0 a 50 átomos de carbono, em que um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) dos átomos de carbono na cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituído por -O-, -NRX-, -NRX-C(=O)-, -C(=O)-NRX- ou -S-, e em que RX é hidrogênio ou (C1-C6)alquila, e em que a cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituída por um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) substituintes selecionados dentre (C1-C6)alcóxi, (C3-C6)cicloalquila, (C1-C6)alcanoíla, (C1-C6)alcanoilóxi, (C1-C6)alcoxicarbonila, (C1-C6)alquiltio, azido, ciano, nitro, halo, hidróxi, oxo (=O), carbóxi, arila, arilóxi, heteroarila e heteroarilóxi.

[069] Numa modalidade, cada L3 é independentemente uma cadeia de hidrocarboneto bivalente, ramificada ou não ramificada, saturada ou não saturada, que tem de 1 a 20 átomos de carbono, em que um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) dos átomos de carbono na cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituído por -O-, -NRX-, -NRX-C(=O)-, -C(=O)-NRX- ou -S-, e em que RXé hidrogênio ou (C1-C6)alquila, e em que a cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituída por um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) substituintes selecionados dentre (C1-C6)alcóxi, (C3-C6)cicloalquila, (C1- C6)alcanoíla, (C1-C6)alcanoilóxi, (C1-C6)alcoxicarbonila, (C1-C6)alquiltio, azido, ciano, nitro, halo, hidróxi, oxo (=O), carbóxi, arila, arilóxi, heteroarila e heteroarilóxi.

[070] Numa modalidade, L3 é:

[071] ou um sal do mesmo.

[072] Numa modalidade, R1 é:

[073] ou um sal do mesmo.

[074] Numa modalidade, R1 é:

[075] em que G é -NH- ou -O-;

[076] RC é hidrogênio, (C1-C8)alquila, (C1-C8)haloalquila, (C1- C8)alcóxi, (C1-C6)alcanoíla, (C3-C20)cicloalquila, (C3-C20)heterociclo, arila, heteroarila, monossacarídeo, dissacarídeo ou trissacarídeo; e em que a cicloalquila, heterocila, ari, heteroarila e sacarídeo são opcionalmente substituídos por um ou mais grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em halo, carboxila, hidroxila, amino, (C1-C4)alquila, (C1- C4)haloalquila, (C1-C4)alcóxi e (C1-C4)haloalcóxi;

[077] ou um sal do mesmo.

[078] Numa modalidade, RC é:

[079] Numa modalidade, R1 é:

[080] Numa modalidade, RC é:

[081] Numa modalidade, G é –NH-.

[082] Numa modalidade, R1 é:

[083] Numa modalidade, R1 é:

[084] em que cada RD é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, (C1-C6)alquila, (C9-C20)alquilsilila, (RW)3Si-, (C2- C6)alquenila, tetra-hidropiranila, (C1-C6)alcanoíla, benzoila, arila(C1-C3)alquila, TMTr (Trimetoxitritil), DMTr (Dimetoxitritil), MMTr (Monometoxitritil) e Tr (Tritil); e

[085] cada RW é independentemente selecionado do grupo que consiste em (C1-C4)alquila e arila.

[086] Numa modalidade, os grupos de ligação L1 e L2 são independentemente uma cadeia de hidrocarboneto bivalente, ramificada ou não ramificada, saturada ou não saturada, que tem de 1 a 50 átomos de carbono, em que um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) dos átomos de carbono na cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituído por -O-, -NRX-, -NRX-C(=O)-, - C(=O)-NRX- ou -S-, e em que RX é hidrogênio ou (C1-C6)alquila, e em que a cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituída por um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) substituintes selecionados dentre (C1-C6)alcóxi, (C3- C6)cicloalquila, (C1-C6)alcanoíla, (C1-C6)alcanoilóxi, (C1-C6)alcoxicarbonila, (C1- C6)alquiltio, azido, ciano, nitro, halo, hidróxi, oxo (=O), carbóxi, arila, arilóxi, heteroarila e heteroarilóxi.

[087] Numa modalidade, L1 e L2 são independentemente uma cadeia de hidrocarboneto bivalente, ramificada ou não ramificada, saturada ou não saturada, que tem de 1 a 20 átomos de carbono, em que um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) dos átomos de carbono na cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituído por -O-, -NRX-, -NRX-C(=O)-, -C(=O)-NRX- ou -S-, e em que RXé hidrogênio ou (C1-C6)alquila, e em que a cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituída por um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) substituintes selecionados dentre (C1-C6)alcóxi, (C3-C6)cicloalquila, (C1- C6)alcanoíla, (C1-C6)alcanoilóxi, (C1-C6)alcoxicarbonila, (C1-C6)alquiltio, azido, ciano, nitro, halo, hidróxi, oxo (=O), carbóxi, arila, arilóxi, heteroarila e heteroarilóxi.

[088] Numa modalidade, L1 e L2 são independentemente uma cadeia de hidrocarboneto bivalente, ramificada ou não ramificada, saturada ou não saturada, que tem de 1 a 14 átomos de carbono, em que um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) dos átomos de carbono na cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituído por -O-, -NRX-, -NRX-C(=O)-, -C(=O)-NRX- ou -S-, e em que RXé hidrogênio ou (C1-C6)alquila, e em que a cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituída por um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) substituintes selecionados dentre (C1-C6)alcóxi, (C3-C6)cicloalquila, (C1- C6)alcanoíla, (C1-C6)alcanoilóxi, (C1-C6)alcoxicarbonila, (C1-C6)alquiltio, azido, ciano, nitro, halo, hidróxi, oxo (=O), carbóxi, arila, arilóxi, heteroarila e heteroarilóxi.

[089] Numa modalidade, L1 é conectado a R1 através de -NH-, O-, -S-, -(C=O)-, -(C=O)-NH-, -NH-(C=O)-, -(C=O)-O-, -NH-(C=O)-NH- ou -NH- (SO2)-.

[090] Numa modalidade, L2 é conectado a R2 através de -O-.

[091] Numa modalidade, L1 é selecionado do grupo que consiste em:

[092] Numa modalidade, L1 é selecionado do grupo que consiste em:

[093] e sais do mesmo.

[094] Numa modalidade, L2 é -CH2-O- ou -CH2-CH2-O-.

[095] Numa modalidade, um composto da fórmula I tem a seguintefórmula Ia:

[096] em que:

[097] cada D é independentemente selecionado do grupo que RA l_consiste em

[098] ou um sal do mesmo.

[099] Numa modalidade, um composto da fórmula Ia é selecionadodo grupo que consiste em:

[0100] em que:

[0101] Q1 é hidrogênio e Q2 é R2; ou Q1 é R2 e Q2 é hidrogênio;

[0102] Z é -L1-R1;

[0103] e sais do mesmo.

[0104] Numa modalidade, um composto da fórmula I tem a seguintefórmula Ib:

[0105] em que:

[0106] cada D é independentemente selecionado do grupo queconsiste em

[0107] cada m é independentemente 1 ou 2;

[0108] ou um sal do mesmo.

[0109] Numa modalidade, um composto da fórmula Ib éselecionado do grupo que consiste em:

[0110] em que:

[0111] Q1 é hidrogênio e Q2 é R2; ou Q1 é R2 e Q2 é hidrogênio;

[0112] Z é -L1-R1;

[0113] e sais do mesmo.

[0114] Numa modalidade, um composto da fórmula I tem a seguinte fórmula (Ic):

[0115] Em que E é -O- ou -CH2-;

[0116] n é selecionado do grupo que consiste em 0, 1, 2, 3 e 4; e

[0117] n1 e n2 são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consiste em 0, 1, 2 e 3;

[0118] ou um sal do mesmo.

[0119] Em certas modalidades, um composto da fórmula (Ic) éselecionado do grupo que consiste em:

[0120] em que Z é -L1-R1;

[0121] e sais do mesmo.

[0122] Numa modalidade, a porção química de -A-L2-R2 é:

[0123] em que:

[0124] Q1 é hidrogênio e Q2 é R2; ou Q1 é R2 e Q2 é hidrogênio; e

[0125] cada q é independentemente 0, 1, 2, 3, 4 ou 5;

[0126] ou um sal do mesmo.

[0127] Numa modalidade, R2 é um oligonucleotídeo.

[0128] Numa modalidade, R2 é um siRNA.

[0129] Numa modalidade, um composto da fórmula (I) é selecionado do grupo que consiste em:

[0130] e sais do mesmo.

[0131] Numa modalidade, R1 é selecionado do grupo que consisteem:

[0132] em que RS é

[0133] n é 2, 3 ou 4;

[0134] x é 1 ou 2.

[0135] Numa modalidade, L1 é selecionado do grupo que consiste em:

[0136] Numa modalidade, L1 é selecionado do grupo que consisteem:

[0137] Numa modalidade, A está ausente, é fenila, pirrolidinila ou ciclopentila.

[0138] Numa modalidade, L2 é C1-4 alquileno-O- que éopcionalmente substituído por hidróxi.

[0139] Numa modalidade, L2 é -CH2O-, -CH2CH2O- ou -CH(OH)CH2O-.

[0140] Numa modalidade, cada RA é independentemente hidróxi ou C1-8 alquila que é opcionalmente substituída por hidroxila.

[0141] Numa modalidade, cada RA é independentementeselecionado do grupo que consiste em hidróxi, metila e -CH2OH.

[0142] Numa modalidade, um composto da fórmula I tem a seguinte fórmula (Ig):

[0143] em que B é -N- ou -CH-;

[0144] L1 está ausente ou é -NH-;

[0145] L2 é C1-4 alquileno-O- que é opcionalmente substituído por hidroxila ou halo;

[0146] n é 0, 1 ou 2;

[0147] ou um sal do mesmo.

[0148] Numa modalidade, um composto da fórmula I tem a seguinte fórmula (Ig):

[0149] em que B é -N- ou -CH-;

[0150] L1 está ausente ou é -NH-;

[0151] L2 é C1-4 alquileno-O- que é opcionalmente substituído por hidroxila ou halo;

[0152] n é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7;

[0153] ou um sal do mesmo.

[0154] Numa modalidade, um composto da fórmula I tem a seguinte fórmula (Ig):

[0155] em que B é -N- ou -CH-;

[0156] L1 está ausente ou é -NH-;

[0157] L2 é C1-4 alquileno-O- que é opcionalmente substituído por hidroxila ou halo;

[0158] n é 0, 1, 2, 3 ou 4;

[0159] ou um sal do mesmo.

[0160] Numa modalidade, um composto da fórmula Ig é selecionado do grupo que consiste em:

[0161] em que R ’é C1-9 alquila, C2-9 alquenila ou C2-9 alquinila; em que a C1-9 alquila, C2-9 alquenila ou C2-9 alquinila são opcionalmente substituídas por halo ou hidroxila;

[0162] e sais do mesmo.

[0163] Numa modalidade, um composto da fórmula I é selecionado do grupo que consiste em:

[0164] e sais do mesmo.

[0165] Numa modalidade, o composto da fórmula I ou o sal domesmo é selecionado do grupo que consiste em:

[0166] ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0167] Um aspecto desta invenção é a composição farmacêuticaque compreende um composto da fórmula I, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0168] Um outro aspecto desta invenção é um método para entregar um ácido nucleico ao fígado de um animal que compreende administrar um composto da fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ao animal.

[0169] Numa modalidade, um composto da fórmula I tem a seguintefórmula (Id):

[0170] em que:

[0171] R1d é selecionado dentre:

[0172] Xd é C2-10 alquileno;

[0173] Nd é 0 ou 1;

[0174] R2d é um ácido nucleico; e

[0175] R3d é H, um grupo protetor, uma ligação covalente a um suporte sólido, ou uma ligação a um grupo de ligação que é ligado a um suporte sólido.

[0176] Numa modalidade, R3d inclui um grupo de ligação que une o restante do composto da fórmula Id a um suporte sólido. A natureza do grupo de ligação não é crítica contanto que o composto seja um intermediário adequado para preparar um composto da fórmula Id em que R2d é um ácido nucleico.

[0177] Numa modalidade, o aglutinante em R3d tem um pesomolecular de cerca de 20 daltons a cerca de 1000 daltons.

[0178] Numa modalidade, o aglutinante em R3d tem um pesomolecular de cerca de 20 daltons a cerca de 500 daltons.

[0179] Numa modalidade, o aglutinante em R3d separa o suporte sólido do restante do composto da fórmula I por cerca de 5 angstroms a cerca de 40 angstroms, inclusive, de comprimento.

[0180] Numa modalidade, o aglutinante em R3d é uma cadeia de hidrocarboneto bivalente, ramificada ou não ramificada, saturada ou não saturada, que tem de 2 a 15 átomos de carbono, em que um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) dos átomos de carbono são opcionalmente substituídos por (O) ou (-N(H)-), e em que a cadeia é opcionalmente substituída em carbono por um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) substituintes selecionados dentre (C1- C6)alcóxi, (C3-C6)cicloalquila, (C1-C6)alcanoíla, (C1-C6)alcanoilóxi, (C1-C6)alcoxicarbonila, (C1-C6)alquiltio, azido, ciano, nitro, halo, hidróxi, oxo (=O), carbóxi, arila, arilóxi, heteroarila e heteroarilóxi.

[0181] Numa modalidade, o aglutinante em R3d é uma cadeia de hidrocarboneto bivalente, ramificada ou não ramificada, saturada ou não saturada, que tem de 2 a 10 átomos de carbono, em que um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) dos átomos de carbono são opcionalmente substituídos por (-O-) ou (-N(H)-), e em que a cadeia é opcionalmente substituída em carbono por um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) substituintes selecionados dentre (C1- C6)alcóxi, (C3-C6)cicloalquila, (C1-C6)alcanoíla, (C1-C6)alcanoilóxi, (C1-C6)alcoxicarbonila, (C1-C6)alquiltio, azido, ciano, nitro, halo, hidróxi, oxo (=O), carbóxi, arila, arilóxi, heteroarila e heteroarilóxi.

[0182] Numa modalidade, o aglutinante em R3d é - C(=O)CH2CH2C(=O)N(H)-.

[0183] Numa modalidade, R1d é:

[0184] Numa modalidade, R1d é:

[0185] Numa modalidade, Xd é C8 alquileno.

[0186] Numa modalidade, nd é 0.

[0187] Numa modalidade, R2d é um siRNA.

[0188] Numa modalidade, R3d é H.

[0189] Numa outra modalidade, um composto de (Id) ou o sal do mesmo é selecionado do grupo que consiste em:

[0190] e sais do mesmo.

[0191] Um aspecto desta invenção é uma composiçãofarmacêutica que compreende um composto da fórmula (Id), e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0192] Um aspecto desta invenção é um ácido nucleico para o fígado de um animal que compreende administrar um composto da fórmula (Id) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para o animal.

[0193] A invenção também fornece intermediários sintéticos e métodos divulgados no presente documento que são úteis para preparar compostos da fórmula (Id). Por exemplo, a invenção inclui um composto intermediário da fórmula Ie:

[0194] ou um sal do mesmo, em que:

[0195] R1d é selecionado dentre:

[0196] Xd é C2-8alquileno;

[0197] nd é 0 ou 1;

[0198] Pg1 é H ou um grupo protetor adequado; e

[0199] R3d é H, um grupo protetor, uma ligação covalente a um suporte sólido, ou uma ligação a um grupo de ligação que é ligado a um suporte sólido. A Figura 1 ilustra um composto intermediário representativo da fórmula (Ie), em que um ligante/aglutinante de direcionamento é ligado a um suporte de fase sólida, e em que Pg1 é a DMTr de grupo protetor.

[0200] Numa modalidade, Pg1 é TMTr (Trimetoxitritil), DMTr (Dimetoxitritil), MMTr (Monometoxitritil) ou Tr (Tritil).

[0201] A invenção também fornece um método para preparar um composto da fórmula (Id) conforme descrito no presente documento que compreende submeter um composto da fórmula correspondente (Ie):

[0202] em que:

[0203] Xd é C2-8alquileno;

[0204] nd é 0 ou 1;

[0205] Pg1 é H; e

[0206] R3d é uma ligação covalente a um suporte sólido ou uma ligação a um grupo de ligação que está ligado a um suporte sólido, às condições de síntese de ácido nucleico de fase sólida para fornecer um composto correspondente da fórmula Id em que R2d é um ácido nucleico.

[0207] Numa modalidade, o método compreende adicionalmente remover o composto do suporte sólido para fornecer o composto correspondente da fórmula Id em que R3d é H.

[0208] Numa modalidade, o composto não é:Numa modalidade, o composto não é um composto da fórmula Id:

[0209] ou um sal do mesmo, em que:

[0210] R1d é selecionado dentre:

[0211] Xd é C2-10 alquileno;

[0212] Nd é 0 ou 1;

[0213] R2d é um ácido nucleico; e

[0214] R3d é H, um grupo protetor, uma ligação covalente a um suporte sólido, ou uma ligação a um grupo de ligação que é ligado a um suporte sólido.

[0215] Numa modalidade, o composto não é um composto da fórmula Ie:

[0216] ou um sal do mesmo, em que:

[0217] R1d é selecionado dentre:

[0218] Xd é C2-8alquileno;

[0219] nd é 0 ou 1;

[0220] Pg1 é H ou um grupo protetor adequado; e

[0221] R3d é H, um grupo protetor, uma ligação covalente a umsuporte sólido, ou uma ligação a um grupo de ligação que é ligado a um suporte sólido.

[0222] Numa modalidade, R3d é H.

[0223] Numa modalidade, R3d é uma ligação covalente a um suporte sólido.

[0224] Numa modalidade, R3d é uma ligação a um grupo de ligação que é ligado a um suporte sólido, em que o grupo de ligação é uma cadeia de hidrocarboneto bivalente, ramificada ou não ramificada, saturada ou não saturada, que tem de 2 a 15 átomos de carbono, em que um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) dos átomos de carbono é opcionalmente substituído por (-O-) ou (-N(H)-), e em que a cadeia é opcionalmente substituída em carbono por um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) substituintes selecionados dentre (C1- C6)alcóxi, (C3-C6)cicloalquila, (C1-C6)alcanoíla, (C1-C6)alcanoilóxi, (C1-C6)alcoxicarbonila, (C1-C6)alquiltio, azido, ciano, nitro, halo, hidróxi, oxo (=O), carbóxi, arila, arilóxi, heteroarila e heteroarilóxi.

[0225] Numa modalidade, R3d é uma ligação a um grupo de ligação que é ligado a um suporte sólido, em que o grupo de ligação é uma cadeia de hidrocarboneto bivalente, ramificada ou não ramificada, saturada ou não saturada, que tem de 2 a 10 átomos de carbono, em que um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) dos átomos de carbono é opcionalmente substituído por (-O-) ou (-N(H)-), e em que a cadeia é opcionalmente substituída em carbono por um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) substituintes selecionados dentre (C1- C6)alcóxi, (C3-C6)cicloalquila, (C1-C6)alcanoíla, (C1-C6)alcanoilóxi, (C1-C6)alcoxicarbonila, (C1-C6)alquiltio, azido, ciano, nitro, halo, hidróxi, oxo (=O), carbóxi, arila, arilóxi, heteroarila e heteroarilóxi.

[0226] Numa modalidade, R3d é uma ligação a um grupo de ligação que é ligado a um suporte sólido, em que o grupo de ligação é - C(=O)CH2CH2C(=O)N(H)-.

[0227] Numa modalidade da invenção fornece-se um composto da fórmula (I):

[0228] em que:

[0229] R1 é H ou um grupo de ativação sintética;

[0230] L1 está ausente ou é um grupo de ligação;

[0231] L2 está ausente ou é um grupo de ligação;

[0232] R2 é um ácido nucleico;

[0233] o anel A está ausente, é uma cicloalquila com 3 a 20 membros, uma arila com 5 a 20 membros, um heteroarila com 5 a 20 membros ou uma heterocicloalquila com 3 a 20 membros;

[0234] cada RA é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, hidróxi, CN, F, Cl, Br, I, -C1-2 alquila-ORB, C1-10 alquila, C2-10 alquenila e C2-10 alquinila; em que a C1-10 alquila, C2-10 alquenila e C2-10 alquenila são opcionalmente substituídas por um ou mais grupos independentemente selecionados dentre halo, hidróxi e C1-3 alcóxi;

[0235] RB é hidrogênio, um grupo protetor, uma ligação covalente a um suporte sólido, ou uma ligação a um grupo de ligação que é ligado a um suporte sólido; e

[0236] n é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;

[0237] ou um sal do mesmo.

[0238] Numa modalidade da invenção fornece-se um composto da fórmula (I):

[0239] em que:

[0240] R1 é um ligante de direcionamento;

[0241] L1 está ausente ou é um grupo de ligação;

[0242] L2 está ausente ou é um grupo de ligação;

[0243] R2 é H ou um grupo de ativação sintética;

[0244] o anel A está ausente, é uma cicloalquila com 3 a 20 membros, uma arila com 5 a 20 membros, um heteroarila com 5 a 20 membros ou uma heterocicloalquila com 3 a 20 membros;

[0245] cada RA é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, hidróxi, CN, F, Cl, Br, I, -C1-2 alquila-ORB, C1-10 alquila, C2-10 alquenila e C2-10 alquinila; em que a C1-10 alquila, C2-10 alquenila e C2-10 alquenila são opcionalmente substituídas por um ou mais grupos independentemente selecionados dentre halo, hidróxi e C1-3 alcóxi;

[0246] RB é hidrogênio, um grupo protetor, uma ligação covalente a um suporte sólido, ou uma ligação a um grupo de ligação que é ligado a um suporte sólido; e

[0247] n é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;

[0248] ou um sal do mesmo.

[0249] Numa modalidade da invenção fornece-se um composto da fórmula (Ig):

[0250] em que:

[0251] B é -N- ou -CH-;

[0252] L2 é C1-4 alquileno-O- que é opcionalmente substituído por hidroxila ou halo; e

[0253] n é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7;

[0254] ou um sal do mesmo.

[0255] Numa modalidade, a invenção fornece um composto selecionado do grupo que consiste em:

[0256] em que:

[0257] Q é -L1-R1; e

[0258] R ’é C1-9 alquila, C2-9 alquenila ou C2-9 alquinila; em que a C1-9 alquila, C2-9 alquenila ou C2-9 alquinila são opcionalmente substituídas por halo ou hidroxila;

[0259] e sais do mesmo.

[0260] Numa modalidade, a invenção fornece um compostoselecionado do grupo que consiste em:

[0261] em que: Q é -L1-R1; e sais do mesmo.

[0262] Numa modalidade, a invenção fornece-se um composto da fórmula (Ig):

[0263] em que:

[0264] B é -N- ou -CH-;

[0265] L1 está ausente ou é um grupo de ligação;

[0266] L2 é C1-4 alquileno-O- que é opcionalmente substituído por hidroxila ou halo;

[0267] n é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7;

[0268] R1 é H ou um grupo de ativação sintética; e

[0269] R2 é H ou um grupo de ativação sintética;

[0270] ou um sal do mesmo.

[0271] Numa modalidade, a invenção fornece um composto selecionado do grupo que consiste em:

[0272] em que Q é -L1-R1;

[0273] L1 está ausente ou é um grupo de ligação;

[0274] R ’é C1-9 alquila, C2-9 alquenila ou C2-9 alquinila; em que a C19 alquila, C2-9 alquenila ou C2-9 alquinila são opcionalmente substituídas por halo ou hidroxila;

[0275] R1 é H ou um grupo de ativação sintética; e

[0276] R2 é H ou um grupo de ativação sintética;

[0277] ou um sal do mesmo.

[0278] Numa modalidade, a invenção fornece um compostoselecionado do grupo que consiste em:

[0279] em que:

[0280] Q é -L1-R1;

[0281] L1 está ausente ou é um grupo de ligação;

[0282] R1 é H ou um grupo de ativação sintética; e

[0283] R2 é H ou um grupo de ativação sintética;

[0284] ou um sal do mesmo.

[0285] Numa modalidade, R1 é H ou um grupo de ativação sintética derivável de DCC, HOBt, EDC, BOP, PyBOP ou HBTU.

[0286] Numa modalidade, R2 é H, acetato, triflato, mesilato ou succinato.

[0287] Numa modalidade, R1 é um grupo de ativação sintética derivável de DCC, HOBt, EDC, BOP, PyBOP ou HBTU.

[0288] Numa modalidade, R2 é acetato, triflato, mesilato ou succinato.

[0289] Numa modalidade, L1 é uma cadeia de hidrocarboneto bivalente, ramificada ou não ramificada, saturada ou não saturada, que tem de 5 a 20 átomos de carbono, em que um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) dos átomos de carbono na cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente -O-, -NH-, - NH-C(=O)-, -C(=O)-NH- ou -S- substituído.

[0290] Numa modalidade da invenção fornece-se um composto da fórmula (XX):

[0291] em que:

[0292] R1 é um ligante de direcionamento;

[0293] L1 está ausente ou é um grupo de ligação;

[0294] L2 está ausente ou é um grupo de ligação;

[0295] R2 é um ácido nucleico;

[0296] B é bivalente e é selecionado do grupo que consiste em:

[0297] em que:

[0298] cada R ’é independentemente C1-9 alquila, C2-9 alquenila ouC2-9 alquinila; em que a C1-9 alquila, C2-9 alquenila ou C2-9 alquinila são opcionalmente substituídas por halo ou hidroxila;

[0299] a valência marcada com * é fixada ao L1 ou é fixada ao R1 se L1 estiver ausente; e

[0300] a valência marcada com ** é fixada ao L2 ou é fixada ao R2 se L2 estiver ausente;

[0301] ou um sal do mesmo.

[0302] Numa modalidade, R1 compreende de 2 a 8 sacarídeos.

[0303] Numa modalidade, R1 compreende de 2 a 6 sacarídeos.

[0304] Numa modalidade, R1 compreende de 2 a 4 sacarídeos.

[0305] Numa modalidade, R1 compreende de 3 a 8 sacarídeos.

[0306] Numa modalidade, R1 compreende de 3 a 6 sacarídeos.

[0307] Numa modalidade, R1 compreende de 3 a 4 sacarídeos.

[0308] Numa modalidade, R1 compreende 3 sacarídeos.

[0309] Numa modalidade, R1 compreende 4 sacarídeos.

[0310] Numa modalidade, R1 tem a seguinte fórmula:

[0311] em que:

[0312] B1 é um grupo trivalente que compreende cerca de 1 a cerca de 20 átomos e é covalentemente ligado a L1, T1 e T2.

[0313] B2 é um grupo trivalente que compreende cerca de 1 a cerca de 20 átomos e é covalentemente ligado a T1, T3 e T4.

[0314] B3 é um grupo trivalente que compreende cerca de 1 a cerca de 20 átomos e é covalentemente ligado a T2, T5 e T6.

[0315] T1 está ausente ou é um grupo de ligação;

[0316] T2 está ausente ou é um grupo de ligação;

[0317] T3 está ausente ou é um grupo de ligação;

[0318] T4 está ausente ou é um grupo de ligação;

[0319] T5 está ausente ou é um grupo de ligação; e

[0320] T6 está ausente ou é um grupo de ligação.

[0321] Numa modalidade, cada sacarídeo é independentementeselecionado dentre:

[0322] em que:

[0323] X é NR3, e Y é selecionado dentre (C=O)R4, -SO2R5, e(C=O)NR6R7; ou X é (C=O) e Y é NR8R9;

[0324] R3 é hidrogênio ou (C1-C4)alquila;

[0325] R4, R5, R6, R7 , R8 e R9 são, cada um, independentementeselecionados do grupo que consiste em hidrogênio, (C1-C8)alquila, (C1- C8)haloalquila, (C1-C8)alcóxi e (C3-C6)cicloalquila que é opcionalmente substituída por um ou mais grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em halo, (C1-C4)alquila, (C1-C4)haloalquila, (C1-C4)alcóxi e (C1- C4)haloalcóxi;

[0326] R10 é -OH, -NR8R9 ou -F; e

[0327] R11 é -OH, -NR8R9, -F ou heterociclo com 5 membros que é opcionalmente substituído por um ou mais grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em halo, hidroxila, carboxila, amino, (C1- C4)alquila, (C1-C4)haloalquila, (C1-C4)alcóxi e (C1-C4)haloalcóxi.

[0328] Numa modalidade, cada sacarídeo é independentementeselecionado do grupo que consiste em:

[0329] Numa modalidade, cada sacarídeo é independentemente:

[0330] Numa modalidade, um dentre T1 e T2 está ausente.

[0331] Numa modalidade, tanto T1 quanto T2 estão ausentes.

[0332] Numa modalidade, cada um dentre T1, T2, T3, T4, T5 e T6 está independentemente ausente ou é uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada, saturada ou insaturada, que tem de 1 a 50 átomos de carbono, em que um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) dos átomos de carbono na cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituído por -O-, -NRX-, -NRX-C(=O)-, - C(=O)-NRX- ou -S-, e em que RX é hidrogênio ou (C1-C6)alquila, e em que a cadeia de hidrocarboneto, é opcionalmente substituída por um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) substituintes selecionados dentre (C1-C6)alcóxi, (C3- C6)cicloalquila, (C1-C6)alcanoíla, (C1-C6)alcanoilóxi, (C1-C6)alcoxicarbonila, (C1-C6)alquiltio, azido, ciano, nitro, halo, hidróxi, oxo (=O), carbóxi, arila, arilóxi, heteroarila e heteroarilóxi.

[0333] Numa modalidade, cada um dentre T1, T2, T3, T4, T5 e T6 está independentemente ausente ou é uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada, saturada ou insaturada, que tem de 1 a 20 átomos de carbono, em que um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) dos átomos de carbono na cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituído por -O-, -NRX-, -NRX-C(=O)-, - C(=O)-NRX- ou -S-, e em que RX é hidrogênio ou (C1-C6)alquila, e em que a cadeia de hidrocarboneto, é opcionalmente substituída por um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) substituintes selecionados dentre (C1-C6)alcóxi, (C3- C6)cicloalquila, (C1-C6)alcanoíla, (C1-C6)alcanoilóxi, (C1-C6)alcoxicarbonila, (C1-C6)alquiltio, azido, ciano, nitro, halo, hidróxi, oxo (=O), carbóxi, arila, arilóxi, heteroarila e heteroarilóxi.

[0334] Numa modalidade, cada um dentre T1, T2, T3, T4, T5 e T6 está independentemente ausente ou é uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada, saturada ou insaturada, que tem de 1 a 50 átomos de carbono, ou um sal do mesmo, em que um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) dos átomos de carbono na cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituído por -O- ou -NRX-, e em que RX é hidrogênio ou (C1-C6)alquila, e em que a cadeia de hidrocarboneto, é opcionalmente substituída por um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) substituintes selecionados dentre halo, hidróxi e oxo (=O).

[0335] Numa modalidade, cada um dentre T1, T2, T3, T4, T5 e T6 está independentemente ausente ou é uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada, saturada ou insaturada, que tem de 1 a 20 átomos de carbono, em que um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) dos átomos de carbono na cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituída por -O- e em que a cadeia de hidrocarboneto, é opcionalmente substituída por um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) substituintes selecionados dentre halo, hidróxi e oxo (=O).

[0336] Numa modalidade, cada um dentre T1, T2, T3, T4, T5 e T6 está independentemente ausente ou é uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada, saturada ou insaturada, que tem de 1 a 20 átomos de carbono, em que um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) dos átomos de carbono na cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituída por -O- e em que a cadeia de hidrocarboneto, é opcionalmente substituída por um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) substituintes selecionados dentre halo, hidróxi e oxo (=O).

[0337] Numa modalidade, pelo menos um dentre T3, T4, T5 e T6 é:

[0338] em que:

[0339] n = 1, 2, 3.

[0340] Numa modalidade, cada um dentre T3, T4, T5 e T6 é independentemente selecionado do grupo que consiste em:

[0341] em que:

[0342] n = 1, 2, 3.

[0343] Numa modalidade, pelo menos um dentre T1 e T2 é glicina.

[0344] Numa modalidade, cada um dentre T1 e T2 é glicina.

[0345] Numa modalidade, B1 é um grupo trivalente quecompreende de 1 a 15 átomos e é covalentemente ligado a L1, T1 e T2.

[0346] Numa modalidade, B1 é um grupo trivalente quecompreende de 1 a 10 átomos e é covalentemente ligado a L1, T1 e T2.

[0347] Numa modalidade, B1 compreende uma (C1-C6)alquila.

[0348] Numa modalidade, B1 compreende uma C3-8 cicloalquila.

[0349] Numa modalidade, B1 compreende um grupo silila.

[0350] Numa modalidade, B1 compreende um D- ou L-aminoácido.

[0351] Numa modalidade, B1 compreende um sacarídeo.

[0352] Numa modalidade, B1 compreende um grupo fosfato.

[0353] Numa modalidade, B1 compreende um grupo fosfonato.

[0354] Numa modalidade, B1 compreende uma arila.

[0355] Numa modalidade, B1 compreende um anel de fenila.

[0356] Numa modalidade, B1 é um anel de fenila.

[0357] Numa modalidade, B1 é CH.

[0358] Numa modalidade, B1 compreende uma heteroarila.

[0359] Numa modalidade, B1 é selecionado do grupo que consisteem:

[0360] Numa modalidade, B2 é um grupo trivalente quecompreende de 1 a 15 átomos e é covalentemente ligado a L1, T1 e T2.

[0361] Numa modalidade, B2 é um grupo trivalente quecompreende de 1 a 10 átomos e é covalentemente ligado a L1, T1 e T2.

[0362] Numa modalidade, B2 compreende uma (C1-C6)alquila.

[0363] Numa modalidade, B2 compreende uma C3-8 cicloalquila.

[0364] Numa modalidade, B2 compreende um grupo silila.

[0365] Numa modalidade, B2 compreende um D- ou L-aminoácido.

[0366] Numa modalidade, B2 compreende um sacarídeo.

[0367] Numa modalidade, B2 compreende um grupo fosfato.

[0368] Numa modalidade, B2 compreende um grupo fosfonato.

[0369] Numa modalidade, B2 compreende uma arila.

[0370] Numa modalidade, B2 compreende um anel de fenila.

[0371] Numa modalidade, B2 é um anel de fenila.

[0372] Numa modalidade, B2 é CH.

[0373] Numa modalidade, B2 compreende uma heteroarila.

[0374] Numa modalidade, B2 é selecionado do grupo que consiste em:

[0375] Numa modalidade, B3 é um grupo trivalente quecompreende de 1 a 15 átomos e é covalentemente ligado a L1, T1 e T2.

[0376] Numa modalidade, B3 é um grupo trivalente quecompreende de 1 a 10 átomos e é covalentemente ligado a L1, T1 e T2.

[0377] Numa modalidade, B3 compreende uma (C1-C6)alquila.

[0378] Numa modalidade, B3 compreende uma C3-8 cicloalquila.

[0379] Numa modalidade, B3 compreende um grupo silila.

[0380] Numa modalidade, B3 compreende um D- ou L-aminoácido.

[0381] Numa modalidade, B3 compreende um sacarídeo.

[0382] Numa modalidade, B3 compreende um grupo fosfato.

[0383] Numa modalidade, B3 compreende um grupo fosfonato.

[0384] Numa modalidade, B3 compreende uma arila.

[0385] Numa modalidade, B3 compreende um anel de fenila.

[0386] Numa modalidade, B3 é um anel de fenila.

[0387] Numa modalidade, B3 é CH.

[0388] Numa modalidade, B3 compreende uma heteroarila.

[0389] Numa modalidade, B3 é selecionado do grupo que consiste em:

[0390] ou um sal do mesmo.

[0391] Numa modalidade, L1 e L2 são independentemente uma cadeia de hidrocarboneto bivalente, ramificada ou não ramificada, saturada ou não saturada, que tem de 1 a 50 átomos de carbono, em que um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) dos átomos de carbono na cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituído por -O-, -NRX-, -NRX-C(=O)-, -C(=O)-NRX- ou -S-, e em que RX é hidrogênio ou (C1-C6)alquila, e em que a cadeia de hidrocarboneto, é opcionalmente substituída por um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) substituintes selecionados dentre (C1-C6)alcóxi, (C3-C6)cicloalquila, (C1- C6)alcanoíla, (C1-C6)alcanoilóxi, (C1-C6)alcoxicarbonila, (C1-C6)alquiltio, azido, ciano, nitro, halo, hidróxi, oxo (=O), carbóxi, arila, arilóxi, heteroarila e heteroarilóxi.

[0392] Numa modalidade, L1 é selecionado do grupo que consiste em:

[0393] ou um sal do mesmo.

[0394] Numa modalidade, L1 é conectado a B1 através de uma aglutinação selecionada do grupo que consiste em: -O-, -S-, -(C=O)-, -(C=O)- NH-, -NH-(C=O), -(C=O)-O-, -NH-(C=O)-NH- ou -NH-(SO2)-.

[0395] Numa modalidade, L1 é selecionado do grupo que consiste em:

[0396] Numa modalidade, L2 é conectado a R2 através de -O-.

[0397] Numa modalidade, L2 é C1-4 alquileno-O- que éopcionalmente substituído por hidróxi.

[0398] Numa modalidade, L2 é conectado a R2 através de -O-.

[0399] Numa modalidade, L2 está ausente.

[0400] Numa modalidade, a invenção fornece um composto ou sal selecionado do grupo que consiste em:

[0401] e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

EXEMPLOS

[0402] A presente invenção será descrita com mais detalhes a título de exemplos específicos. Os seguintes exemplos são oferecidos para propósitos de ilustração e não se destinam a limitar a invenção de maneira alguma. Os versados na técnica irão reconhecer prontamente uma variedade de parâmetros não críticos que podem ser alterados ou modificados para produzir essencialmente os mesmos resultados.EXEMPLO 1. SÍNTESE DE CONJUGADO 1ESQUEMA 1.ESQUEMA 2.ESQUEMA 3.ESQUEMA 4.ESQUEMA 5.ETAPA 1. PREPARAÇÃO DE 2-(2-(2-(2-HIDROXIETOXI)ETOXI)ETOXI)ETIL 4-METILBENZENOSSULFONATO 3

[0403] Uma solução de tetraetileno glicol (934 g, 4,8 mol) em THF (175 ml) e NaOH aquoso (5 M, 145 ml) foi resfriada (0 °C) e tratada com cloreto de p-Toluenossulfonila (91,4 g, 480 mmol) dissolvido em THF (605 ml) e, então, agitado por duas horas (0 °C). A mistura de reação foi diluída com água (3 l) e extraída (3 x 500 ml) com CH2Cl2. Os extratos combinados foram lavados com água e salmoura, então, secos (MgSO4), filtrados e concentrados para produzir 2-(2-(2-(2-hidroxietoxi)etoxi)etoxi)etil 4-metilbenzenossulfonato 3 (140 g, 84%) como um óleo amarelo pálido. Rf (0,57, 10% de MeOH-CH2Cl2).ETAPA 2. PREPARAÇÃO DE 2-(2-(2-(2-AZIDOETOXI)ETOXI)ETOXI)ETAN-1-OL 4

[0404] Uma solução de 3 (140 g, 403 mmol) em DMF (880 ml) foi tratada com azido de sódio (131 g, 2,02 mol) e aquecida (45 °C) de um dia para o outro. Uma maioria do DMF foi removida sob pressão reduzida e o resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (500 ml) e lavada (3 x 500 ml) com salmoura, então, secada (MgSO4), filtrada e concentrada. O resíduo foi passado através de um leito curto de sílica (5% de MeOH-CH2Cl2) e concentrado para produzir 2-(2-(2- (2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etan-1-ol 4 (65 g, 74%) como um óleo amarelo. Rf (0,56, 10% de MeOH-CH2Cl2).ETAPA 3. PREPARAÇÃO DE GALACTOSAMINA 6 PERACETILADA

[0405] Cloridrato de D-galactosamina 5 (250 g, 1,16 mol) em piridina (1,5 l) foi tratado com anidrido acético (1,25 l, 13,2 mol) em 45 minutos. Após agitação de um dia para o outro a mistura de reação foi dividida em três porções de 1 l. Cada porção de 1 l foi despejada em 3 l de água gelada e misturada por uma hora. Após a mistura, os sólidos foram filtrados, combinados, congelados em nitrogênio líquido e, então, liofilizados por cinco dias para produzir a galactosamina 6 peracetilada (369,4 g, 82%) como um sólido branco. Rf (0,58, 10% de MeOH-CH2Cl2). ETAPA 4. PREPARAÇÃO DE (3AR,5R,6R,7R,7AR)-5-(ACETOXIMETIL)-2-METIL- 3A,6,7,7A-TETRA-HIDRO-5H-PIRANO[3,2-D]OXAZOL-6,7-DIIL DIACETATO 7

[0406] Uma solução de galactosamina 6 peracetilada (8,45 g, 21,7 mmol) em CHCl3 (320 ml) foi tratada por gotejamento com TMSOTf (4,32 ml, 23,9 mmol). Após agitação (1,5 h, 40 °C), a reação foi arrefecida bruscamente pela adição de trietilamina (5 ml) e concentrada até secura para fornecer o composto 7 como um vidro amarelo pálido (7,2 g, Quant.). O produto foi usado sem purificação adicional. Rf (0,59, 10% de MeOH-CH2Cl2).ETAPA 5. PREPARAÇÃO DE (2R,3R,4R,5R,6R)-5-ACETAMIDO-2-(ACETOXIMETIL)-6- (2-(2-(2-(2-AZIDOETOXI)ETOXI)ETOXI)ETOXI)TETRA-HIDRO-2H-PIRAN-3,4-DIILDIACETATO 8

[0407] O composto 7 (7,2 g, 21,7 mmol) e 2-(2-(2-(2- azidoetoxi)etoxi)etoxi)etan-1-ol 4 (2,65 g, 15,2 mmol) foram azeotropados (3x) a partir de tolueno (150 ml) para remover traços de água. O material seco foi dissolvido em 1,2-dicloroetano (150 ml), resfriado (~5 °C) e tratado com TMSOTf (784 μl, 4,34 mmol). Após agitação de um dia para o outro a reação foi arrefecida bruscamente pela adição de trietilamina (5 ml) e concentrada. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia (1% ^5% de MeOH-CH2Cl2) para produzir 8 (7,12 g, 85%) como um óleo marrom. Rf (0,3, 10% de MeOH-CH2Cl2).ETAPA 6. PREPARAÇÃO DE 2-(2-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-ACETAMIDO-4,5- DIACETOXI-6-(ACETOXIMETIL)TETRA-HIDRO-2H-PIRAN-2-IL)OXl)ETOXl)ETOXl)ETOXl)ETAN-1-AMÍNIO 2,2,2-TRIFLUOROACETATO 9

[0408] Uma solução do azido 8 (7,12 g, 13 mmol) em EtOAc (150 ml) e ácido trifluoroacético (2 ml) foi tratado com paládio em carvão (1,5 g, 10% em p/p com base úmida). A mistura de reação foi, então, purgada com hidrogênio e agitada vigorosamente de um dia para o outro. Após purga com nitrogênio, a mistura foi filtrada através de Celite, enxaguando com MeOH. O filtrado foi concentrado e purificado por meio de cromatografia (5% ^10% ^20% deMeOH-CH2Cl2) para produzir 9 (5,8 g, 72%) como um óleo marrom. Rf (0,34, 15% de MeOH-CH2Cl2).ETAPA 7. PREPARAÇÃO DE 4-(((BENZILOXI)CARBONIL)AMINO)-4-(3-(TERC-BUTOXI)-3-OXOPROPIL)HEPTANODIOATO DE DI-TERC-BUTILA 11

[0409] A uma solução de 4-amino-4-(3-(terc-butoxi)-3-oxopropil)heptanodioato de di-terc-butila 10 (13,5 g, 33 mmol), 25% de Na2CO3 (aq) (150 ml) e diclorometano (300 ml) foi adicionado lentamente cloroformato de benzila (14 ml, 98 mmol). A solução foi agitada vigorosamente de um dia para o outro (16h) em temperatura ambiente. Mediante completação, o diclorometano adicional (100 ml) foi adicionado e a camada de diclorometano foi separada. A camada aquosa foi extraída com diclorometano (2 x 100 ml). Os extratos de diclorometano combinados foram secos em sulfato de magnésio, filtrados e concentrados até a secura. O produto 11 foi isolado como um óleo incolor que não exigiu purificação adicional (15,8 g, 88%). Rf (0,7, 1:1 de EtOAc-Hexano). ETAPA 8. PREPARAÇÃO DE ÁCIDO 4-(((BENZILOXI)CARBONIL)AMINO)-4-(2-CARBOXIETIL)HEPTANODIOICO 12

[0410] Uma solução de 11 (15,6 g, 28,8 mmol) em ácido fórmico(50 ml) foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas. A solução foi concentrada até a secura e dissolvida em acetato de etila (~25 ml). Mediante o repouso, o produto é cristalizado como um sólido incolor. O sólido foi filtrado, lavado com acetato de etila e seco ao ar para produzir 12 como um sólido incolor (10,2 g, 93%). Rf (0,1, 10% de MeOH-CH2Cl2). ETAPA 9. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 13

[0411] Uma solução de 12 (793 mg, 2,08 mmol) e 9 (5,8 g, 9,36 mmol) em DMF (50 ml) foi tratada com BOP (3,67 g, 8,32 mmol), então, N,N-di- isopropiletilamina (4,31 ml, 25 mmol). Após agitação de um dia para o outro a mistura foi concentrada até a secura e submetida à cromatografia (1% ^2% ^ 5% ^10% ^15% de MeOH-CH2Cl2) para produzir 13 (5,71 g [cru], >100% - continha subprodutos de acoplamento que não afetaram a próxima etapa). Rf (0,45, 10% de MeOH-CH2Cl2).ETAPA 10. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 14

[0412] O composto 13 (5,7 g) foi dissolvido em MeOH (150 ml) e TFA (1,5 ml) e tratado com paládio em carvão (1 g, 10% em p/p com base úmida). A mistura de reação foi, então, purgada com hidrogênio e agitada vigorosamente de um dia para o outro. Após purga com nitrogênio, a mistura foi filtrada através de Celite, enxaguando com MeOH. O filtrado foi concentrado e purificado por meio de cromatografia (5% ^10% ^20% de MeOH-CH2Cl2) para produzir 14 como um óleo marrom (2,15 g, 56% em duas etapas). Rf (0,32, 10% de MeOH- CH2Cl2).ETAPA 11. PREPARAÇÃO DE (5-AMINO-1,3-FENILENO)DIMETANOL 15

[0413] Uma solução de 5-aminoisoftalato de dimetila (20,0 g, 96 mmol) em THF (350 ml) foi adicionada, por gotejamento, a uma mistura de refluxo de 3,75 eq de LiAlH4 (13,6 g, 358 mmol) em THF (440 ml) numa hora. A mistura foi agitada em refluxo por mais duas horas, então, resfriada até temperatura ambiente e arrefecida bruscamente pela adição cuidadosa de MeOH (27 ml), então, água (40 ml). Após agitação, a mistura arrefecida bruscamente por duas horas foi filtrada e concentrada até a secura. O resíduo foi recristalizado (2X) a partir de EtOAc para produzir 15 como cristais amarelo amarronzados (10,2 g, 70 %).ETAPA 12. PREPARAÇÃO DE10-((3,5-BIS(HIDROXIMETIL)FENIL)AMINO)-10-OXODECANOATO DE METILA 16

[0414] Uma solução de sebacato de metila (3,8 g, 17 mmol), 15 (2,5 g, 17 mmol) e EEDQ (8,1 g, 33 mmol) em 2:1 de diclorometano/metanol (200 ml) foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas. Mediante completação, a solução foi concentrada até a secura. O sólido obtido foi triturado com diclorometano (50 ml) e filtrado. O sólido foi enxaguado com diclorometano frio e seco ao ar para produzir 16 como um sólido incolor (4,3 g, 72%). Rf (0,33, EtOAc).ETAPA 13. PREPARAÇÃO DE 10-((3-((BIS(4-METOXIFENIL)(FENIL)METOXI)METIL)-5- (HIDROXIMETIL)FENIL)AMINO)-10-OXODECANOATO DE METILA 17

[0415] A uma solução de 16 (4,3 g, 12 mmol) em piridina (50 ml) foi adicionado 4,4'-(cloro(fenil)metileno)bis(metoxibenzeno) (4,1 g, 12 mmol). A solução foi agitada sob nitrogênio de um dia para o outro em temperatura ambiente. Mediante completação, a solução foi concentrada até a secura e o resíduo foi purificado por meio de cromatografia de coluna (0,5% ^0,75% ^1% ^1,5% de MeOH-CH2Cl2) para produzir 17 como um sólido amarelo (2,9 g, 35%). Rf (0,6, 10% de MeOH-CH2Cl2).ETAPA 14. PREPARAÇÃO DE 10-((3-((BIS(4-METOXIFENIL)(FENIL)METOXI)METIL)-5- (HIDROXIMETIL)FENIL)AMINO)-10-OXODECANOATO DE LÍTIO 18

[0416] A uma solução de 17 (2,9 g, 4,3 mmol) em THF (60 ml) foi adicionada água (15 ml) e hidróxido de lítio (112 mg, 4,7 mmol). A solução foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente. Mediante completação, a solução foi concentrada para remover o THF. A solução aquosa restante foi escoada congelada em nitrogênio líquido e liofilizada de um dia para o outro para produzir um sólido incolor (2,9 g, quant.). Rf (0,3, 10% de MeOH- CH2Cl2). ETAPA 15. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 19

[0417] A uma solução 14 (454 mg, 0,67 mmol), 18 (1,25 g, 0,67 mmol) e HBTU (381 mg, 1,0 mmol) em DMF anidro (25 ml) foi adicionado N,N- di-isopropiletilamina (0,35 ml, 2,0 mmol). A solução foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente. Mediante completação, a solução foi derramada em acetato de etila (250 ml) e lavada com salmoura (3 x 200 ml). A camada de acetato de etila foi seca em sulfato de magnésio, filtrada e concentrada até a secura. A purificação por meio de cromatografia de coluna (5% ^7,5% ^10% ^15% de MeOH em CH2Cl2) produziu 19 como uma espuma laranja pálida (1,5 g, 94%). Rf (0,25, 10% de MeOH-CH2Cl2).ETAPA 16. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 20

[0418] Uma solução de composto 19 (1,5 g, 0,6 mmol), anidrido succínico (120 mg, 1,2 mmol), DMAP (220 mg, 1,8 mmol) e trimetilamina (250 μl, 1,8 mmol) em CH2Cl2 anidro (50 ml) foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente. Mediante completação, a solução foi concentrada até a secura e filtrada através de um plugue curto de sílica (100% de CH2Cl2 ^15% de MeOH em CH2Cl2) para produzir o produto 20 como uma espuma bege claro (1,1 g, 70%). Massa m/z (ES-TOF MS) 727,7 [M + 3H - DMTr]+, 1091,1 [M + 2H - DMTr]. RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,92 (br s, 1H), 7,78 (s, 1H), 7,49-7,47 (m, 3H), 7,41 (br s, 1H), 7,38-7,34 (m, 5H), 7,32-7,26 (m, 4H), 7,24-7,08 (br s, 3H), 7,08 (s, 1H), 6,90-6,80 (m, 7H), 5,31 (d, 3H, J = 2,7Hz), 5,12 (s, 2H), 5,06 (dd, 3H, J = 11,2, 3,2 Hz), 4,78 (d, 3H, J = 8,5 Hz), 4,24-4,08 (m, 12H), 3,95-3,88 (m, 7H), 3,85-3,76 (m, 4H), 3,78 (s, 6H), 3,68-3,56 (m, 34H), 3,54-3,44 (m, 8H), 3,41-3,33 (m, 6H), 2,70-2,60 (m, 4H), 2,52-2,30 (m, 30H), 2,24-2,16 (m, 8H), 2,14 (s, 9H), 2,04 (s, 9H), 2,02-1,96 (m, 6H), 1,98 (s, 9H), 1,96 (s, 9H), 1,74-1,52 (m, 4H), 1,36-1,24 (m, 12H).ETAPA 17. PREPARAÇÃO DE CONJUGADO 1

[0419] O succinato 20 foi carregado para o CPG (vidro de poro de controle) de 1000A de LCAA (aminoalquila de cadeia longa) usando química de acoplamento de amida padrão. Uma solução de di-isopropilcarbodi-imida (52,6 μmol), N-hidróxi succinimida (0,3 mg, 2,6 μmol) e piridina (10 μl) em acetonitrila anidra (0,3 ml) foi adicionado a 20 (20,6 mg, 8 μmol) em diclorometano anidro (0,2 ml). A mistura foi adicionada a CPG de LCAA (183 mg). A suspensão foi gentilmente misturada de um dia para o outro em temperatura ambiente. Mediante o desaparecimento de 20 (HPLC), a mistura de reação foi filtrada e o CPG foi lavado com 1 ml de cada diclorometano, acetonitrila, uma solução de 5% de anidrido acético/5% de N-metilimidazol/5% de piridina em THF, então, THF, acetonitrila e diclorometano. O CPG foi, então, seco de um dia para o outro sob alto vácuo. O carregamento foi determinado por ensaio de DMTr padrão por UV/Vis (504 nm) para ser 25 μmol/g. O suporte sólido carregado por GalNAc resultante foi empregado em síntese de oligonucleotídeo automatizada usando procedimentos padrão. A desproteção de nucleotídeo após a remoção do suporte sólido (com desproteção de acetato de galactosamina concomitante) produziu o conjugado de GalNAc-oligonucleotídeo 1 como um exemplo representativo.EXEMPLO 2: SÍNTESE DE CONJUGADO 34ESQUEMA 6.ESQUEMA 7.ESQUEMA 8.ETAPA 1. PREPARAÇÃO DE 4-(2-(((BENZILOXI)CARBONIL)AMINO)ACETAMIDO)-4-(3-(TERC-BUTOXI)-3-OXOPROPIL)HEPTANODIOATO DE DI-TERC-BUTILA 21

[0420] Uma de 4-amino-4-(3-(terc-butoxi)-3- oxopropil)heptanodioato de di-terc-butila (25 g, 60 mmol) e Z-glicina (18,9 g, 90,2 mmol,) em CH2Cl2 (300 ml) foi tratada sucessivamente com EDC (23 g, 120 mmol), Di-isopropiletilamina (32 ml, 180 mmol) e DMAP (Cat. 17 mg). Após agitação (16h), a mistura de reação foi derramada em NaHCO3 (Sat. Aq.), extraída com CH2Cl2, lavada com salmoura, seca (MgSO4), filtrada e concentrada para produzir 4-(2-(((benziloxi)carbonil)amino)acetamido)-4-(3- (terc-butoxi)-3-oxopropil)heptanodioato de di-terc-butila 21 como um sólido amorfo e foi usada sem processamento adicional (36 g, quant.). Rf (0,85, 10% de MeOH-CH2Cl2).ETAPA 2. PREPARAÇÃO DE ÁCIDO 4-(2-(((BENZILOXI)CARBONIL)AMINO)ACETAMIDO)-4-(2-CARBOXIETIL)HEPTANODIOICO 22

[0421] Uma solução de 4-(2- (((benziloxi)carbonil)amino)acetamido)-4-(3-(terc-butoxi)-3- oxopropil)heptanodioato de di-terc-butila 21 (59,3 mmol, 36g) foi agitada em ácido fórmico puro (150 ml) por 72 horas. Mediante completação, o ácido fórmico foi removido sob pressão reduzida e o sólido cru foi seco de um dia para o outro em alto vácuo para produzir 22 como um sólido incolor (15,9 g, 61%). Rf (0,15, 10% de MeOH-CH2Cl2).ETAPA 3. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 23

[0422] Uma solução de 22 (6,2 g, 14,1 mmol) e 2-(2-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetoxi-6-(acetoximetil)tetra-hidro-2H- piran-2-il)oxi)etoxi)etoxi)etoxi)etan-1-amínio 2,2,2-trifluoroacetato (35 g, 56,5 mmol) em DMF (250 ml) foi tratada com BOP (25 g, 56,5 mmol), então, N,N-di- isopropiletilamina (29 ml, 170 mmol). Após agitação de um dia para o outro, a mistura foi concentrada até a secura e submetida à cromatografia (100% de CH2Cl2 a 15% de MeOH-CH2Cl2) para produzir composto 23 (24,6 g, 89%). Rf (0,55, 15% de MeOH-CH2Cl2). ETAPA 4. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 24

[0423] O composto 23 (24,6 g) foi dissolvido em MeOH (200 ml) e TFA (1,5 ml) e purgado com nitrogênio. O paládio em carvão (1 g, 10% em p/p com base úmida) foi adicionado e, então, a mistura de reação foi purgada com hidrogênio e agitada vigorosamente de um dia para o outro. Mediante completação, a reação foi purgada com nitrogênio, filtrada através de Celite e enxaguada com MeOH. O filtrado foi concentrado e purificado por meio de cromatografia de coluna em gel de sílica 60 (gradiente: 5% ^10% ^20% deMeOH-CH2Cl2) para produzir 24 como um óleo viscoso marrom pálido (23 g). Rf (0,32, 10% de MeOH-CH2Cl2).ETAPA 5. PREPARAÇÃO DE (5-AMINO-1,3-FENILENO)DIMETANOL 26

[0424] Uma suspensão de lítio hidreto de alumínio (13,6 g, 358 mmol) em tetra-hidrofurano anidro (450 ml) foi levada ao refluxo sob uma atmosfera de nitrogênio e tratada, por gotejamento, com uma solução de dimetil- 5-aminoisoftalto 25 (20 g, 96 mmol) em tetra-hidrofurano anidro (350 ml). Após a adição ser completa, a mistura foi aquecida para refluxo para mais 2 horas. Mediante completação, a solução foi resfriada para temperatura ambiente e arrefecida bruscamente pela adição lenta de MeOH (27 ml), então, água (40 ml). Após agitação por 2 horas, a mistura foi filtrada, concentrada e recristalizada a partir de EtOAc para produzir (5-amino-1,3-fenileno)dimetanol 26 como cristais esbranquiçados (10,2 g, 70%). Rf 0,5 (15% de MeOH-CH2Cl2). ETAPA 6. PREPARAÇÃO DE 3,5-BIS(HIDROXIMETIL)BENZONITRILA 27

[0425] Uma solução de 26 (5 g, 33 mmol) em ácido clorídrico 2N(100 ml) foi resfriada para 0 °C e tratada com uma solução fria de nitrito de sódio (3,53 g, 36 mmol) em água (50 ml). A mistura de reação foi mantida numa temperatura >5 °C por 30 min, então, tratada com uma solução de cianeto de cobre (I) (3,19 g, 35,6 mmol) e cianeto de sódio (3,53 g, 72 mmol) em água (50 ml) numa única porção. Após agitação de um dia para o outro em temperatura ambiente, a mistura foi filtrada, extraída com diclorometano (3 x 100 ml), concentrada e usada sem purificação adicional. O diol, 3,5- bis(hidroximetil)benzonitrila 27 foi obtido como um sólido amarelo (2,19 g, 41%). Rf 0,75 (15% de MeOH-CH2Cl2).ETAPA 7. PREPARAÇÃO DE 3-((BIS(4-METOXIFENIL)(FENIL)METOXI)METIL)-5- (HIDROXIMETIL)BENZONITRILA 28

[0426] Uma solução de 3,5-bis(hidroximetil)benzonitrila 27 (538mg, 3,3 mmol) em piridina (14 ml) foi tratada com Cloreto de 4,4‘-dimetoxitritila (1,17 g, 3,46 mmol) e agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente. Uma vez completada, a mistura foi concentrada e dispersa em éter dietílico (25 ml), filtrada e concentrada. O produto cru foi purificado por meio de cromatografia de coluna de gel de sílica 60 (gradiente: 10% a 50% de EtOAc-Hexano) para produzir o 28 como um sólido amarelo (725 mg, 47%). Rf 0,5 (1:1 de EtOAc- hexano). ETAPA 8. PREPARAÇÃO DE (3-(AMINOMETIL)-5-((BIS(4- METOXIFENIL)(FENIL)METOXI)METIL)FENIL)METANOL 29

[0427] Uma solução do 28 (100 mg, 0,22 mmol) em metil tetra- hidrofurano (5 ml) foi resfriada para 0 °C e tratada lentamente com lítio hidreto de alumínio (0,64 mmol = 0,28 ml de uma solução 2,3 M em MeTHF). Após agitação por uma hora, a reação foi arrefecida bruscamente pela adição de metanol (1 ml), então, água (0,3 ml) e agitada por 30 min. A mistura foi filtrada e concentrada para produzir (3-(aminometil)-5-((bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)fenil)metanol 29 (78 mg, 77%). Rf 0,15 (10% de MeOH-CH2Cl2).ETAPA 9. PREPARAÇÃO DE 10-((3-((BIS(4-METOXIFENIL)(FENIL)METOXI)METIL)-5-(HIDROXIMETIL)BENZIL)AMINO)-10-OXODECANOATO DE METILA 30

[0428] Uma solução de (3-(aminometil)-5-((bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)-metil)fenil)metanol 29 (78 mg, 0,17 mmol) e sebacato de monometila (38 mg, 0,17 mmol,) em diclorometano (5 ml) foram tratados sucessivamente com EDC (48 mg, 0,25 mmol), DMAP (cat., 5 mg) e di- isopropiletilamina (57 μl, 0,33 mmol). Após agitação (3,5 h), a mistura de reação foi derramada na solução de bicarbonato de sódio saturada (50 ml). A solução de bicarbonato de sódio foi extraída com diclorometano (3 x 50 ml), lavada com salmoura (50 ml), seca em sulfato de magnésio, filtrada e concentrada até a secura. O material cru foi purificado por meio de cromatografia de coluna em gel de sílica 60 (gradiente: 2% a 5% de MeOH-CH2Cl2) para produzir 10-((3-((bis(4- metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-5-(hidroximetil)benzil)amino)-10-oxodecanoato de metila 30 como um óleo amarelo (57 mg, 53%). Rf 0,45 (10% de MeOH-CH2Cl2).ETAPA 10. PREPARAÇÃO DE 10-((3-((BIS(4-METOXIFENIL)(FENIL)METOXI)METIL)-5-(HIDROXIMETIL)BENZIL)AMINO)-10-OXODECANOATO DE LÍTIO 31

[0429] O composto 30 (188 mg, 0,28 mmol) foi dissolvido em tetra- hidrofurano (5 ml) e tratado com uma solução de LiOH (7 mg, 0,30 mmol) em água (1 ml). Mediante completação, o tetra-hidrofurano foi removido em vácuo e a mistura aquosa restante foi congelada e liofilizada para produzir 10-((3-((bis(4- metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-5-(hidroximetil)benzil)amino)-10-oxodecanoato de lítio 31 como um sólido incolor (180 mg, 99%). Rf 0,45 (10% de MeOH- CH2Cl2).

ETAPA 11. PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS 32, 33 E 34

[0430] Os compostos 32, 33 e 34 foram preparados de acordo com o mesmo procedimento usado para sintetizar os compostos 19, 20 e 1,respectivamente.EXEMPLO 3. SÍNTESE DE CONJUGADO 36

ETAPA 1. PREPARAÇÃO DE CONJUGADO 36

[0431] O conjugado 36 foi preparado usando procedimentos idênticos conforme usado para sintetizar o composto 34 e todos os intermediários correspondentes. Sendo que a única exceção é a síntese do composto 6 em que o anidrido propanoico foi usado no lugar de anidrido acético. EXEMPLO 4. SÍNTESE DE CONJUGADO 42ESQUEMA 9.ESQUEMA 10. ETAPA 1. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 37

[0432] Uma solução de ácido 18β-glicirretinico (2,5 g, 5,3 mmol),terc-butil (3-aminopropil)carbamato (1,1 g, 6,4 mmol) e HBTU (3,0 g, 8,0 mmol) em N,N-dimetilformamida (20 ml) foi adicionada di-isopropiletilamina (2,75 ml, 15,9 mmol). A solução foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente. Mediante completação, a solução foi concentrada em vácuo até a secura. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia de coluna em gel de sílica 60 (gradiente: 2% a 5% de MeOH/CH2Cl2) para produzir o produto como um sólido incolor (2,1 g, 63%).ETAPA 2. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 38

[0433] A uma solução de 37 (2,1 g, 3,3 mmol) e trietilamina (3,5 ml, 10 mmol) em diclorometano (25 ml) foram adicionados anidrido acético (850 μl, 5,3 mmol) e DMAP (5 mg). A solução foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente. Mediante completação, a solução foi concentrada até a secura e dissolvida em acetato de etila (100 ml), lavada com água (100 ml), seca em sulfato de magnésio, filtrada e concentrada até a secura para produzir uma espuma marrom pálida (1,9 g, 85%).ETAPA 3. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 39

[0434] A uma solução de 38 (1,5 g, 2,3 mmol) em dioxano anidro (25 ml) foi adicionado cloreto de hidrogênio 2M em dioxano (25 ml). A solução foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente, então, concentrada em vácuo até a secura para produzir um sólido marrom claro (1,3 g, 96%).

ETAPA 4. PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS 40, 41 E 42

[0435] Os compostos 40, 41 e 42 foram preparados de acordo como mesmo procedimento usado para sintetizar os compostos 19, 20 e 1, respectivamente.EXEMPLO 5. SÍNTESE DE CONJUGADO 43ESQUEMA 11.ESQUEMA 12.ETAPA 1. PREPARAÇÃO DE 11-(2,6-BIS(HIDROXIMETIL)-4-METILFENOXI)UNDECANOATODE METILA 44

[0436] A uma solução de 2,6-bis(hidroximetil)-p-cresol (2,7 g, 16,3 mmol), 11-bromoundecanoato de metila (5,0 g, 17,9 mmol) e carbonato de potássio (4,5 g, 32,6 mmol) em acetona (100 ml) foi refluxada por 16 horas. Mediante completação, a solução foi concentrada em vácuo até a secura, suspensa em acetato de etila (150 ml) e lavada com água (2 x 100 ml) e salmoura (100 ml). A camada de acetato de etila foi seca em sulfato de magnésio, filtrada e concentrada em vácuo até a secura. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia de coluna em gel de sílica 60 (gradiente: 100 % de Hex ^ 50% de EtOAc/Hex) para produzir 11-(2,6-bis(hidroximetil)-4-metilfenoxi)undecanoato de metila 44 como um óleo incolor (1,6 g, 27%).ETAPA 2. PREPARAÇÃO DE 11-(2-((BIS(4-METOXIFENIL)(FENIL)METOXI)METIL)-6-(HIDROXIMETIL)-4-METILFENOXI)UNDECANOATO DE METILA 45

[0437] A uma solução de 11-(2,6-bis(hidroximetil)-4- metilfenoxi)undecanoato de metila 44 (1,5 g, 4,1 mmol) em piridina anidra (20 ml) foi adicionado Cloreto de 4,4‘-dimetoxitritila (1,4 g, 4,1 mmol). A solução foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente. Mediante completação, a solução foi concentrada em vácuo até a secura e purificada por meio de cromatografia de coluna em gel de sílica 60 (0,5 a 1% de MeOH em CH2Cl2) para produzir 11-(2-((bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-6-(hidroximetil)-4-metilfenoxi)undecanoato de metila 45 como um sólido amarelo pálido (1,1 g, 40%). ETAPA 3. PREPARAÇÃO DE 11-(2-((BIS(4-METOXIFENIL)(FENIL)METOXI)METIL)-6-(HIDROXIMETIL)-4-METILFENOXI)UNDECANOATO DE LÍTIO 46

[0438] A uma solução de 11-(2-((bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-6-(hidroximetil)-4-metilfenoxi)undecanoato de metila 45 (1,1 g, 1,7 mmol) em tetra-hidrofurano anidro (40 ml) e água (10 ml) foi adicionado hidróxido de lítio (44 mg, 1,8 mmol). A solução foi concentrada em vácuo para remover todo o tetra-hidrofurano. A solução aquosa restante foi escoada congelada em nitrogênio líquido, então, liofilizada de um dia para o outro para produzir 11-(2-((bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-6-(hidroximetil)- 4-metilfenoxi)undecanoato de lítio 46 como um sólido rosa pálido (1,1 g, 94%).

ETAPA 4. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 47

[0439] Uma solução de 10 (1,33 g, 0,66 mmol), 46 (0,5 g, 0,73 mmol), HBTU (400 mg, 1 mmol) em N,N-dimetilformamida (25 ml) foi adicionada di-isopropiletilamina (0,35 ml, 2 mmol). A solução foi agitada de um dia para o outro (18 horas) em temperatura ambiente. Mediante completação, o solvente foi removido em vácuo e o resíduo foi purificado por meio de cromatografia de coluna em gel de sílica (gradiente: 100% de CH2Cl2 - 5% - 10% - 15% de MeOH em CH2Cl2) para produzir 47 como um sólido incolor (710 mg, 41%).

ETAPA 5. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 48

[0440] A uma solução de 47 (0,71 g, 0,3 mmol), trietilamina (0,4 ml, 3,0 mmol) e poliestireno-DMAP (carregamento de 3 mmol/g, 200 mg, 0,6 mmol) em diclorometano (15 ml) foi adicionado anidrido succínico (60 mg, 0,6 mmol). A solução foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente e, mediante completação, filtrada e concentrada em vácuo até a secura. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia de coluna em gel de sílica 60 (gradiente 5% a 20% de MeOH em CH2Cl2) para produzir o 48 como um sólido amarelo pálido (570 mg, 70%). RMN de 1H (DMSO-d6, 400 MHz) δ 7,91 (m, 1H), 7,86-7,76 (m, 6H), 7,45-7,40 (m, 2H), 7,36-7,14 (m, 10H), 7,10 (s, 1H), 6,91 (d, J = 8,9 Hz, 4H), 5,21 (d, J = 3,3 Hz, 3H), 5,01 (s, 2H), 4,97 (dd, J = 11,2, 3,4 Hz, 3H), 4,56 (d, J = 8,5 Hz, 3H), 4,06-3,98 (m, 11H), 3,93-3,84 (m, 3H), 3,81-3,72 (m, 3H), 3,74 (s, 6H), 3,65-3,46 (m, 38H), 3,40-3,35 (m, 6H), 3,20-3,16 (m, 6H), 2,56-2,44 (m, 4H), 2,33 (s, 3H), 2,15-2,08 (m, 2H), 2,10 (s, 9H), 2,04-1,96 (m, 6H), 1,89 (s, 9H), 1,82-1,76 (m, 4H), 1,77 (s, 9H), 1,54-1,34 (m, 4H), 1,28-1,10 (m, 12H),

ETAPA 6. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 49

[0441] A uma solução de 48 (100 mg, 40 μmol), N - Hidroxisuccinimida (30 mg/ml soln em acetonitrila, 50 μl, 13 μmol), N, N '-Di- isopropilcarbodi-imida (40 μl, 264 μmol) e piridina (50 μl) em diclorometano (2 ml) e acetonitrila (3 ml) foi adicionado CPG de 1000 A de lcaa (síntese principal, 920 mg). A solução foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente num agitador orbital. A análise de TLC da solução de reação mostrou apenas consumo parcial do éster N-Hidroxissuccínico ativado, então, CPG adicional (500 mg) foi adicionado. A solução foi agitada novamente de um dia para o outro. Mediante completação, o CPG foi filtrado e lavado com diclorometano (25 ml), acetonitrila (25 ml) e tetra-hidrofurano (25 ml). Os resíduos de amina não reagidos no CPG foram acetilados (capeados) adicionando-se uma solução de 1:1 de anidrido acético em acetonitrila (3 ml) e 10% de N-metilimidazol/10% de piridina em tetra-hidrofurano (3 ml). A suspensão foi deixada por 2 horas, então, filtrada e enxaguada com partes iguais de tetra-hidrofurano (25 ml), acetonitrila (25 ml) e diclorometano (25 ml). O CPG carregado 49 foi seco a alto vácuo de um dia para o outro. A eficiência de carregamento de ligante foi determinada como 22 μmol/g usando um ensaio de carregamento de DMT padrão (3% de ácido tricloroacético em CH2Cl2, UV-VIS, A504).

ETAPA 7. PREPARAÇÃO DE CONJUGADO 43

[0442] O suporte sólido carregado por GalNAc resultante 49 foi empregado em síntese de oligonucleotídeo automatizada usando procedimentos padrão. A desproteção de nucleotídeo após remoção do suporte sólido (com desproteção de acetato de galactosamina concomitante) produziu um conjugado de GalNAc-oligonucleotídeo 43.EXEMPLO 6. SÍNTESE DE CONJUGADO 50ESQUEMA 13.ESQUEMA 14. ETAPA 1. PREPARAÇÃO DE 2-((2-((TERC-BUTILDIMETILSILIL)OXI)ETIL)AMINO)ETAN-1- OL 51

[0443] Uma solução de etanolamina (77 ml, 1,25 mol) e (2- bromoetoxi)-terc-butil dimetilsilano (15 g, 62,7 mmol) em acetonitrila anidra (200 ml) foi refluxada durante 3 horas. Mediante completação, a reação foi resfriada até a temperatura ambiente, diluída com água (400 ml) e extraída com acetato de etila (3 x 150 ml). Os extratos de acetato de etila combinados foram secos em sulfato de magnésio, filtrados e concentrados à vácuo até a secura. O resíduo foi purificado por meio de filtração através de um coxim de sílica, primeiro, com 50% de acetato de etila/hexanos, então, 50% de MeOH/EtOAc para produzir 51 como um óleo amarelo pálido (14 g, 100%).ETAPA 2. PREPARAÇÃO DE 2-(BIS(4-METOXIFENIL)(FENIL)METOXI)-N-(2-((TERC-BUTILDIMETILSILIL)OXI)ETIL)ETAN-1 -AMINA 52

[0444] A uma solução de 2-((2-((terc- butildimetilsilil)oxi)etil)amino)etan-1-ol 51 (14 g, 64 mmol) e trietilamina (17,5 ml, 128 mmol) em diclorometano anidro (250 ml) foi adicionado Cloreto de 4,4'- dimetoxitritila (24 g, 70 mmol). A solução foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente, então, concentrada à vácuo até a secura. O resíduo foi dissolvido em acetato de etila (300 ml) e lavado com água (250 ml) e salmoura (250 ml). O acetato de etila foi seco em sulfato de magnésio, filtrada e concentrada em vácuo até a secura. A purificação por meio de cromatografia de coluna em gel de sílica 60 (1% a 5% de MeOH em CH2Cl2) produziu 52 como um óleo viscoso amarelo pálido (13 g, 39%).ETAPA 3. PREPARAÇÃO DE 10-((2-(BIS(4-METOXIFENIL)(FENIL)METOXI)ETIL)(2-((TERC-BUTILDIMETILSILIL)OXI)ETIL)AMINO)-10-OXODECANOATO DE METILA 53

[0445] Uma solução de 2-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)-N-(2- ((terc-butildimetilsilil)oxi)etil)etan-1-amina 52 (5,4 g, 10,3 mmol), sebacato de monometila (2,2 g, 10,3 g), HBTU (4,9 g, 12,9 mmol), DIPEA (5,3 ml, 30,9 mmol) em N,N-dimetilformamida (100 ml) foi agitada por 3 horas em temperatura ambiente. Mediante completação, a solução foi derramada em água (400 ml) e extraída com acetato de etila (1 x 500 ml). O extrato de acetato de etila foi lavado com salmoura (2 x 250 ml), seco em sulfato de magnésio, filtrado e concentrado à vácuo até a secura. A purificação por meio de cromatografia de coluna em gel de sílica 60 (10% a 25% acetato de etila em hexanos) produziu 53 como um óleo amarelo viscoso (6,5 g, 87%).ETAPA 4. PREPARAÇÃO DE 10-((2-(BIS(4-METOXIFENIL)(FENIL)METOXI)ETIL)(2-HIDROXIETIL)AMINO)-10-OXODECANOATO DE METILA 54

[0446] A uma solução de 10-((2-(bis(4- metoxifenil)(fenil)metoxi)etil)(2-((terc-butildimetilsilil)oxi)etil)amino)-10- oxodecanoato de metila 53 (2,0 g, 2,8 mmol) e trietilamina (1 ml) em tetra- hidrofurano anidro (20 ml) foi adicionado TBAF (1M em THF, 3,4 ml, 3,3 mmol). A solução foi agitada por 6h, mas apenas conversão parcial foi observada por TLC (5% de MeOH em CH2Cl2). Mais 1,7 ml de TBAF foi adicionado e a solução foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente. Mediante completação, a solução foi concentrada em vácuo e purificada por meio de cromatografia de coluna em gel de sílica 60 (10% a 50% EtOAc em hexanos, então, 100% de EtOAc) para produzir 54 como um óleo incolor viscoso (0,5 g, 29%).ETAPA 5. PREPARAÇÃO DE 10-((2-(BIS(4-METOXIFENIL)(FENIL)METOXI)ETIL)(2- HIDROXIETIL)AMINO)-10-OXODECANOATO DE LÍTIO 55

[0447] A uma solução de 10-((2-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)etil)(2-hidroxietil)amino)-10-oxodecanoato de metila 54 (0,5 g, 0,83 mmol) em THF (40 ml) foram adicionados água (10 ml) e hidróxido de lítio (24 mg, 1,0 mmol). A solução foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente, então, concentrada em vácuo para remover o THF. A solução aquosa restante foi escoada congelada em nitrogênio líquido e liofilizada para produzir 55 como um sólido incolor (485 mg, 95%).

ETAPA 6. PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS 56, 57, 58 E 50

[0448] Os compostos 56, 57, 58 e 50 foram preparados usando os procedimentos idênticos àqueles usados para sintetizar os compostos 47, 48, 49 e 43, respectivamente. EXEMPLO 7. SÍNTESE DE CONJUGADO 59ESQUEMA 15.ESQUEMA 16.ETAPA 1. PREPARAÇÃO DE (2R,5R)-5-HIDROXIPIPERIDINA-2-CARBOXILATO DE METILA61

[0449] Ácido (2R,5R)-5-hidroxipiperidina-2-carboxílico 60 (3,5 g, 24,1 mmol) foi agitado em MeOH (50 ml). HCl (g) foi borbulhado através da solução por 2 min e a reação foi agitada em refluxo por 1,5 h. A reação foi concentrada em vácuo para render (2R,5R)-5-hidroxipiperidina-2-carboxilato de metila 61 em rendimento quantitativo que foi usado sem purificação adicional.ETAPA 2. PREPARAÇÃO DE I-(TERC-BUTIL) 2-METIL (2R,5R)-5-HIDROXIPIPERIDINA-1 ,2-DICARBOXILATO 62

[0450] (2R,5R)-5-hidroxipiperidina-2-carboxilato de metila 61 (24,1 mmol) e TEA (7,2 ml, 53,02 mmol) foram agitados em DCM (100 ml) em TA. Di- terc-butil-di-carbonato (5,7 g, 26,5 mmol) foi adicionado em porções e a reação foi agitada por 2 h. A reação foi diluída com DCM (100 ml) e lavada sequencialmente com HCl 1 M (2 x 75 ml), NaHCO3 saturado (2 x 75 ml), H2O (2 x 75 ml) e solução de NaCl saturada (2 x 75 ml). Os orgânicos foram separados, secos (Na2SO4) e concentrados em vácuo para render 1-(terc-butil) 2-metil (2R,5R)-5-hidroxipiperidina-1,2-dicarboxilato 62 (5,53 g, 88%) que foi usado sem purificação adicional.ETAPA 3. PREPARAÇÃO DE TERC-BUTIL (2R,5R)-5-HIDROXI-2-(HIDROXIMETIL)PIPERIDINA-I -CARBOXILATO 63

[0451] O ácido (2R,5R)-1-(terc-Butoxicarbonil)-5-hidroxipiperidina- 2-carboxílico 62 (5,53 g, 21,4 mmol) foi agitado em THF a 0 °C. LiBH4 (solução 3,0 M em THF) (8,9 ml, 27,7 mmol) foi adicionado por gotejamento em 1 h. A reação foi deixada para aquecer até TA e a agitação continuou por 16 h. A reação foi arrefecida bruscamente com NaOH 1M, o THF removido em vácuo e a água exaustivamente extraída com EtOAc (10 x 100 ml). Os orgânicos combinados foram lavados com H2O (50 ml), solução de NaCl saturada (2 x 50 ml), secos (Na2SO4) e concentrados em vácuo para render terc-butil (2R,5R)-5-hidroxi-2- (hidroximetil)piperidina-1-carboxilato 63 (2,4 g, 49,0 %) que foi usado sem purificação adicional.ETAPA 4. PREPARAÇÃO DE (3R,6R)-6-(HIDROXIMETIL)PIPERIDIN-3-OL 64

[0452] terc-Butil (2R,5R)-5-hidroxi-2-(hidroximetil)piperidina-1-carboxilato 63 (2,4 g, 10,4 mmol) foi agitado em Et2O em TA. HCl (g) foi borbulhado por 45 s e a reação foi agitada em TA por 45 min. A reação foi concentrada em vácuo e seca sob alto vácuo para produzir (3R,6R)-6- (hidroximetil)piperidin-3-ol 64. O produto foi usado sem purificação adicional.ETAPA 5. PREPARAÇÃO DE 2,2,2-TRIFLUORO-1-((2R,5R)-5-HIDROXI-2-(HIDROXIMETIL)PIPERIDIN-I -IL)ETAN-1 -ONA 65

[0453] O (3R,6R)-6-(hidroximetil)piperidin-3-ol 64 cru da reaçãoanterior foi agitado em MeCN (50 ml) com TEA (3,5 ml, 25,2 mmol) em TA. O trifluoroacetato de etila (3 ml, 25,2 mmol) foi adicionado e a reação foi agitada em TA por 16 h, então, concentrada em vácuo para render 2,2,2-trifluoro-1- ((2R,5R)-5-hidroxi-2-(hidroximetil)piperidin-1-il)etan-1-ona 65. O produto foi usado sem purificação adicional. ETAPA 6. PREPARAÇÃO DE 1-((2R,5R)-2-((BIS(4-METOXIFENIL)(FENIL)METOXI)METIL)- 5-HIDROXIPIPERIDIN-1 -IL)-2,2,2-TRIFLUOROETAN-1 -ONA 66

[0454] A 2,2,2-trifluoro-1-((2R,5R)-5-hidroxi-2-(hidroximetil)piperidin-1-il)etan-1-ona 65 crua da reação anterior foi agitada em DCM com TEA (50 ml) em TA. Cloreto de 4,4’-dimetoxitritila (DMTrCl) (3,87 g, 11,44 mmol) foi adicionado numa porção e a reação foi agitada em TA por 3 horas. A reação foi diluída com DCM (50 ml) e lavada sequencialmente com NaHCO3 saturado (2 x 75 ml), H2O (2 x 75 ml) e solução de NaCl saturada (2 x75 ml). Os orgânicos foram separados, secos (Na2SO4), concentrados em vácuo e purificados por meio de cromatografia de coluna (100% de hexanos - 60% de EtOAc/Hexanos) (0,1% de TEA) para render 1-((2R,5R)-2-((bis(4- metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-5-hidroxipiperidin-1-il)-2,2,2-trifluoroetan-1-ona 66 (3,14 g, 57%)ETAPA 7. PREPARAÇÃO DE (3R,6R)-6-((BIS(4-METOXIFENIL)(FENIL)METOXI)METIL)- PIPERIDIN-3-OL 67

[0455] 1-((2R,5R)-2-((bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-5- hidroxipiperidin-1-il)-2,2,2-trifluoroetan-1-ona 66 (3,14 g, 6,0 mmol) foi agitada em MeOH (50 ml) em TA. KOH (672 mg, 12 mmol) foi adicionado e a reação foi agitada em TA por 16 horas. KOH adicional (300 mg, 6 mmol) foi adicionado e a agitação continuou por mais 24 h. A reação foi concentrada em vácuo, absorvida em DCM (150 ml), lavada com H2O (4 x 50 ml), seca (Na2SO4) e concentrada em vácuo para render (3R,6R)-6-((bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)piperidin- 3-ol 67 (2,34 g, 90%) que foi usado sem purificação adicional. ETAPA 8. PREPARAÇÃO DE 12-((2R,5R)-2-((BIS(4-METOXIFENIL)(FENIL)- METOXI)METIL)-5-HIDROXIPIPERIDIN-1-IL)-12-OXODODECANOATO DE METILA 68

[0456] (3R,6R)-6-((Bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)piperidin-3-ol 67 (2,34 g, 5,34 mmol) foi agitada em DCM (75 ml) em TA. Trietilamina (2,2 ml, 16,2 mmol), HATU (3,5 g, 9,2 mmol) e ácido 12-metoxi-12-oxododecanoico (1,32 g, 5,4 mmol) foram adicionados e a reação foi agitada em TA por 3 h. O precipitado sólido resultante foi removido por meio de filtração, o filtrado foi concentrado em vácuo e o resíduo purificado por meio de cromatografia de coluna (2,5% de MeOH/DCM, 0,1% de TEA) para render 12-((2R,5R)-2-((bis(4- metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-5-hidroxipiperidin-1-il)-12-oxododecanoato demetila 68 em rendimento quantitativo.ETAPA 9. PREPARAÇÃO DE 12-((2R,5R)-2-((BIS(4-METOXIFENIL)(FENIL)METOXI)- METIL)-5-HIDROXIPIPERIDIN-1-IL)-12-OXODODECANOATO DE LÍTIO 69

[0457] 12-((2R,5R)-2-((bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-5-hidroxipiperidin-1-il)-12-oxododecanoato de metila 68 (5,4 mmol) e LiOH (140 mg, 5,94 mmol) foram agitados em THF:H2O (1:1, 100 ml) em TA por 48 h. O THF foi removido em vácuo, a água foi congelada e liofilizada para render 12- ((2R,5R)-2-((bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-5-hidroxipiperidin-1-il)-12- oxododecanoato de lítio 69 (3,2 g, 91%). O que foi usado nas reações subsequentes sem purificação adicional.

ETAPA 10. PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS 70, 71,72 E 59

[0458] Os compostos 70, 71, 72 e 59 foram preparados usando osprocedimentos idênticos àqueles usados para sintetizar os compostos 47, 48, 49 e 43, respectivamente.EXEMPLO 8. SÍNTESE DE CONJUGADO 142ESQUEMA 17.ESQUEMA 18.

ETAPA 1. PREPARAÇÃO DE ÁCIDO 3,4,5-TRIACETOXIBENZOICO 73

[0459] A uma solução de Ácido gálico (20 g) em piridina (50 ml) e anidrido acético (50 ml). A solução foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente, então, derramada em água gelada (1 l). A solução foi tornada ácida com ácido clorídrico concentrado em que um sólido incolor é precipitado. O sólido foi coletado por meio de filtração e lavado com água (5 x 100 ml). O sólido úmido foi congelado em nitrogênio líquido e seco por congelamento para produzir ácido 3,4,5-triacetoxibenzoico (26 g, 75%).

ETAPA 2. PREPARAÇÃO DE 5-((2-((2-OXO-2-FENIL-1A2-ETIL)AMINO)ETIL)CARBAMOIL)BENZENO-1,2,3-TRIIL TRIACETATO 74

[0460] A uma solução de ácido 3,4,5-triacetoxibenzoico (10 g, 33,8 mmol), cloridrato de N-carbobenzoxi-1,2-diaminoetano (5,3 g, 33,8 mmol) e HBTU (13,5 g, 35,5 mmol) em DMF (200 ml) foi adicionado DIPEA (17,5 ml, 101 mmol). A solução foi agitada por 16 horas, então, diluída com acetato de etila (250 ml), lavada com salmoura (3 x 200 ml), seca em sulfato de magnésio, filtrada e concentrada à vácuo até a secura. O produto cru foi purificado por meio de cromatografia de coluna em gel de sílica (Gradiente 1% a 5% de MeOH em DCM) para produzir 5-((2-((2-Oxo-2-fenil-1À2- etil)amino)etil)carbamoil)benzeno-1,2,3-triil triacetato como um sólido esbranquiçado (5,5 g).

ETAPA 3. PREPARAÇÃO DE 3,4,5-TRI-HIDROXI-N-(2-((2-OXO-2-FENIL-1A2- ETIL)AMINO)ETIL)BENZAMIDA 75

[0461] Uma solução de 5-((2-((2-Oxo-2-feniMÀ2-etil)amino)etil)carbamoil)benzeno-1,2,3-triil triacetato (5 g, 1,1 mmol) em 1:1 de MeOH/CH2Cl2 (100 ml) foi agitada por 3 dias em temperatura ambiente. Mediante completação, o solvente foi removido para produzir 3,4,5-Tri- hidroxi-N-(2-((2-oxo-2-fenil-1À2-etil)amino)etil)benzamida como um sólido incolor (4 g, quantitativo).

ETAPA 4. PREPARAÇÃO DE TRIMETIL 2,2',2"-((5-((2-((2-OXO-2-FENIL-1A2- ETIL)AMINO)ETIL)CARBAMOIL)BENZENO-1,2,3-TRIIL)TRIS(OXI))TRIACETATO 76

[0462] Uma solução de 3,4,5-Tri-hidroxi-N-(2-((2-oxo-2-fenil- 1À2-etil)amino)etil)benzamida (4 g, 11,6 mmol), bromoacetato de metila (7,7 g, 46,4 mmol) e carbonato de potássio (9,6 g, 69,4 mmol) em DMF (100 ml) foi agitada de um dia para o outro a 60 °C. Mediante completação, a solução foi resfriada até temperatura ambiente, diluída com acetato de etila (200 ml), lavada com água (200 ml), salmoura (3 x 100 ml), seca em sulfato de magnésio, filtrada e concentrada à vácuo até a secura. O produto cru foi purificado por meio de cromatografia de coluna em gel de sílica (Gradiente 2% a 10% de MeOH em DCM) para produzir 2,2',2''-((5-((2-((2-oxo-2-fenil- 1À2-etil)amino)etil)carbamoil)benzeno-1,2,3-triil)tris(oxi))-triacetato detrimetila como um sólido bege (5 g, 79%)

ETAPA 5. PREPARAÇÃO DE ÁCIDO 2,2',2"-((5-((2-((2-OXO-2-FENIL-1A2- ETIL)AMINO)ETIL)-CARBAMOIL)BENZENO-1,2,3-TRIIL)TRIS(OXI))TRIACÉTICO 77

[0463] Uma solução de 2,2',2"-((5-((2-((2-oxo-2-feniMÀ2- etil)amino)etil)-carbamoil)benzeno-1,2,3-triil)tris(oxi))triacetato de trimetila (5 g, 9,2 mmol) e NaOH 1M (30 ml) em metanol (100 ml) foi agitada por 2 horas em temperatura ambiente. Mediante completação, a reação foi concentrada para remover o metanol e diluída com água (75 ml). A mistura foi resfriada para 0 °C, acidificada com HCl 2M e extraída com acetato de etila (5 x 150 ml). Os extratos de acetato de etila combinados foram secos em sulfato de magnésio, filtrados e concentrados à vácuo até a secura para produzir ácido 2,2',2"-((5-((2-((2-Oxo-2-feniMÀ2- etil)amino)etil)carbamoil)benzeno-1,2,3-triil)tris(oxi))triacético como um sólido incolor (2,3 g, 50%).

ETAPA 6. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 78

[0464] O composto 78 foi preparado a partir de compostos 9 (2,75 g, 4,3 mmol) e 77 (0,5 g, 0,96 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 13. Rendimento: 600 mg.

ETAPA 7. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 79

[0465] O composto 79 foi preparado a partir de compostos 78 (0,6 g) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 14. Rendimento: 500 mg.

ETAPA 8. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 140

[0466] O composto 140 foi preparado a partir do composto 79 (500 mg, 0,25 mmol) e composto 18 (175 mg, 0,25 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 19. Rendimento: 250 mg, 44%.

ETAPA 9. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 141

[0467] O composto 141 foi preparado a partir do composto 140 (250 mg, 0,11 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 20. Rendimento: 200 mg.

ETAPA 10. PREPARAÇÃO DE CONJUGADO 142

[0468] O conjugado 142 foi preparado a partir do composto 141 (200 mg) e CPG de 1000A Icaa (1,8 g) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 1. Rendimento: 1,9 g, 22 μmol/g de carregamento de CPG. O suporte sólido carregado por GalNAc resultante foi empregado em síntese de oligonucleotídeo automatizada usando procedimentos padrão. A desproteção de nucleotídeo após remoção do suporte sólido (com desproteção de acetato de galactosamina concomitante) produziu o conjugado de GalNAc-oligonucleotídeo 142. EXEMPLO 9. SÍNTESE DE CONJUGADO 145ESQUEMA 19.ESQUEMA 20.

ETAPA 1. PREPARAÇÃO DE (3AR,6AS)-5-BENZIL-3A,6A-DIMETILTETRA-HIDRO-1H-FURO[3,4-C]PIRROL-1,3(3AH)-DIONA 123

[0469] A uma solução resfriada (0 °C) de 3,4-dimetilfuran-2,5-diona (3 g, 24 mmol) e N-benzil-1-metoxi-N-((trimetilsilil)metil)metanamina (7 g, 29,8 mmol) em diclorometano (75 ml) foi lentamente adicionado ácido trifluoroacético (75 μl). A agitação de um dia para o outro permitiu que a solução aquecesse lentamente até temperatura ambiente como o banho de gelo derretido. A mistura de reação foi concentrada até a secura, dissolvida em acetato de etila (100 ml), lavada com bicarbonato de sódio saturado (2 x 100ml), seco em sulfato de magnésio, filtrada e concentrada até a secura. A purificação por meio de cromatografia de coluna em gel de sílica (gradiente: 20% de acetato de etila em hexanos a 100% de acetato de etila) produziu (3aR,6aS)-5-Benzil-3a,6a-dimetiltetra-hidro-1H-furo[3,4-c]pirrol-1,3(3aH)- diona como um óleo amarelo (3,5 g, 56%).

ETAPA 2. PREPARAÇÃO DE ((3R,4S)-1-BENZIL-3,4-DIMETILPIRROLIDINA-3,4- DIIL)DIMETANOL 124

[0470] A uma solução resfriada (0 °C) de (3aR,6aS)-5-Benzil- 3a,6a-dimetiltetra-hidro-1H-furo[3,4-c]pirrol-1,3(3aH)-diona (3,5 g, 13,4 mmol) em éter dietílico anidro (50 ml) foi adicionado lentamente péletes de lítio hidreto de alumínio (1,5 g, 40 mmol) em três porções. A solução foi agitada de um dia para o outro aquecendo até temperatura ambiente como o banho de água com gelo derretido. Mediante completação, a reação foi resfriada até 0 °C e arrefecida bruscamente de modo muito lento com 1,5 ml de NaOH 5M após 1,5 ml de água. Agitou-se por 30 minutos, então, adicionou-se sulfato de magnésio e filtro. O filtrado foi concentrado para produzir ((3R,4S)-1-Benzil-3,4-dimetilpirrolidina-3,4- diil)dimetanol como um óleo incolor (2,7 g).

ETAPA 3. PREPARAÇÃO DE ((3R,4S)-3,4-DIMETILPIRROLIDINA-3,4-DIIL)DIMETANOL 125

[0471] A uma solução de ((3R,4S)-1-Benzil-3,4-dimetilpirrolidina- 3,4-diil)dimetanol (10 g, 40 mmol) em metanol (10 ml) foi adicionado 10% de paládio em carvão ativado úmido (1 g). A solução foi agitada vigorosamente sob uma atmosfera de hidrogênio por 16 horas. Mediante completação, a solução foi filtrada através de Celite, e concentrada até a secura para produzir ((3R,4S)-3,4- Dimetilpirrolidina-3,4-diil)dimetanol como um sólido incolor (5,5 g, 86%).

ETAPA 4. PREPARAÇÃO DE 10-((3R,4S)-3,4-BIS(HIDROXIMETIL)-3,4- DIMETILPIRROLIDIN-1-IL)-10-OXODECANOATO DE METILA 126

[0472] O composto 126 foi preparado a partir do composto 125 (1,3 g, 8,2 mmol) e sebacato de monometila (1,8 g, 8,2 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 17. Rendimento: 1,8 g, 61%.

ETAPA 5. PREPARAÇÃO DE 10-((3R,4S)-3-((BIS(4- METOXIFENIL)(FENIL)METOXI)METIL)-4-(HIDROXIMETIL)-3,4-DIMETILPIRROLIDIN-1-IL)- 10-OXODECANOATO DE METILA 127

[0473] O composto 127 foi preparado a partir do composto 126 (1,8 g, 5,0 mmol) e Cloreto de 4,4‘-dimetoxitritila (1,7 g, 5,0 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 18. Rendimento: 1,4 g, 42%.

ETAPA 6. PREPARAÇÃO DE 10-((3R,4S)-3-((BIS(4-METOXIFENIL)(FENIL)METOXI)METIL)-4-(HIDROXIMETIL)-3,4-DIMETILPIRROLIDIN-1-IL)- 10-OXODECANOATO DE LÍTIO 128

[0474] A uma solução de composto 127 (3,0 g, 4,6 mmol) em THF (50 ml) e água (50 ml) foi adicionado hidróxido de lítio (121 mg, 5,0 mmol). A solução foi agitada por 4 horas em temperatura ambiente, então, concentrada para remover o THF. A solução aquosa restante foi seca por congelamento de um dia para o outro para produzir um sólido rosa pálido (2,9 g, quantitativo).

ETAPA 7. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 143

[0475] O composto 143 foi preparado a partir do composto 128 (270 mg, 0,42 mmol) e composto 14 (800 mg, 0,42 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 19. Rendimento: 900 mg, 87%.

ETAPA 8. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 144

[0476] O composto 144 foi preparado a partir do composto 143 (500 mg, 0,2 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 20. Rendimento: 200 mg.

ETAPA 9. PREPARAÇÃO DE CONJUGADO 145

[0477] O conjugado 145 foi preparado a partir do composto 144 (200 mg) e CPG de 1000A Icaa (1,8 g) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 1. Rendimento: 1,9 g, 20 μimol/g de carregamento de CPG. O suporte sólido carregado por GalNAc resultante foi empregado em síntese de oligonucleotídeo automatizada usando procedimentos padrão. A desproteção de nucleotídeo após remoção do suporte sólido (com desproteção de acetato de galactosamina concomitante) produziu o conjugado de GalNAc- oligonucleotídeo 145.EXEMPLO 10. SÍNTESE DE CONJUGADO 150ESQUEMA 21.

ETAPA 1. PREPARAÇÃO DE 146-1

[0478] A uma solução de éster monometílico de ácido dodecanodioico (12,2 g, 50,0 mmol) em diclorometano (300 ml) foi adicionado N- hidroxissuccinimida (6,10 g, 53,0 mmol) e cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodi-imida (EDC) (10,52g, 55,0 mmol). A mistura enevoada foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente e a reação se tornou uma solução clara. TLC indicou que a reação foi completada. Os orgânicos foram lavados com NH4Cl saturado (300 ml) e salmoura (100 ml). A camada orgânica foi separada, seca em MgSO4 e concentrada até a secura para o 1-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) 12-metil dodecanodioato puro 146-1 como um sólido branco (16,7 g, 97,8%).

ETAPA 2. PREPARAÇÃO DE CICLOPENT-3-EN-1-ILMETANOL 146-2

[0479] A uma suspensão de lítio hidreto de alumínio (15,2 g, 0,40 mol) em éter anidro (1 l) a 0 °C sob nitrogênio, foi adicionada a solução de ciclopent-3-enecarboxilato de metila (50 g, 0,40 mol) em éter (300 ml) por gotejamento em 5 h. A suspensão foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. TLC indicou a completação da reação. A reação foi resfriada novamente para 0 °C. A solução saturada de Na2SO4 (32 ml) foi adicionada por gotejamento para arrefecer bruscamente a reação. Após a adição ser completada, a mistura foi agitada por mais 3 h e foi filtrada através de um coxim de Celite. A evaporação de solvente produziu ciclopent-3-enilmetanol 146-2 (37,3 g, 95%) como um líquido incolor.

ETAPA 3. PREPARAÇÃO DE (6-OXABICICLO[3.1.0]HEXAN-3-IL)METANOL 146-3

[0480] A uma solução de ciclopent-3-enilmetanol 146-2 (4,0 g, 41 mmol) em diclorometano (150 ml) a 0 °C foi adicionado ácido 3-cloroperbenzoico (10 g, 45 mmol, 77% de pureza) por porção. A reação foi agitada de um dia para o outro. Diclorometano (150 ml) foi adicionado. Os orgânicos foram lavados com tiossulfato de sódio (12 g em 10 ml de água), após NaHCO3 saturado (40 ml). Isso foi repetido até que todo o ácido 3-cloroperbenzoico restante fosse lavado. O orgânico foi seco em MgSO4. A evaporação de solvente forneceu uma mistura de cis- e trans- 6-oxabiciclo[3.1.0]hexan-3-ilmetanol 146-3 (2,6 g, 57%) como um óleo amarelo. GC-MS: m/z 114 (5) (M+), 95 (15), 88 (100), 81 (15).

ETAPA 4. PREPARAÇÃO DE 2-AMINO-4-(HIDROXIMETIL)CICLOPENTAN-1-OL 146-4

[0481] A uma solução de 6-oxabiciclo[3.1.0]hexan-3-ilmetanol 1463 (2,0 g, 17,6 mmol) em metanol (20 ml) a 0 °C foi purgado o gás de amônia por 10 min. A reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. TLC indicou a não completação da reação. O metanol foi removido e NH3 .H2O (50 ml) foi adicionado e, este, foi agitado em temperatura ambiente por semana. TLC confirmou a completação da reação. A água foi removida azeotropicamente com etanol para produzir 2-amino-4-(hidroximetil)ciclopentanol 146-4 (2,1 g, 91%) como um óleo amarelo.

ETAPA 5. PREPARAÇÃO DE 12-(2-HIDROXI-4-(HIDROXIMETIL)CICLOPENTILAMINO)-12- OXODODECANOATO DE METILA 146-5

[0482] O composto 146-5 foi preparado a partir de 2-amino-4- (hidroximetil)ciclopentanol 146-4 e 1-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) 12-metil dodecanodioato 146-1, usando o mesmo procedimento que o descrito na síntese de 12-(2-(terc-butoxicarbonilamino)etilamino)-12-oxododecanoato (3-2). 12-(2- hidroxi-4-(hidroximetil)ciclopentilamino)-12-oxododecanoato de metila 146-5 foi obtido em 87,4% de rendimento como um sólido esbranquiçado.

ETAPA 6. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 147

[0483] O composto 147 foi preparado quantitativamente a partir do composto 146 (1,4 g, 2,33 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 18.

ETAPA 7. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 148

[0484] O composto 148 foi preparado a partir do composto 147 (150 mg, 0,23 mmol) e composto 14 (431 mg, 0,23 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 19. Rendimento: 460 mg, 84%.

ETAPA 8. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 149

[0485] O composto 149 foi preparado a partir do composto 148 (460 mg, 0,19 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 20. Rendimento: 436 mg, 91%.

ETAPA 9. PREPARAÇÃO DE CONJUGADO 150

[0486] O composto 150 foi preparado a partir do composto 149 (436 mg) e CPG de 1000A Icaa (2,62 g) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 1. Rendimento: 2,7 g, 21,3 μmol/g de carregamento de CPG. O suporte sólido de CPG carregado por GalNAc resultante foi empregado em síntese de oligonucleotídeo automatizada usando procedimentos padrão. A desproteção de nucleotídeo após remoção do suporte sólido (com desproteção de acetato de galactosamina concomitante) produziu o conjugado de GalNAc- oligonucleotídeo 150.EXEMPLO 11. SÍNTESE DE CONJUGADOS 153, 158, 163, 168 E 173ESQUEMA 22.

ETAPA 1. PREPARAÇÃO DE I-(TERC-BUTIL) 2-METIL (2S,4R)-4-HIDROXIPIRROLIDINA- 1,2-DICARBOXILATO (133)

[0487] (2S,4R)-4-hidroxipirrolidina-2-carboxilato de metila (25,9 g, 46 mmol), anidrido de BOC (65,9 g, 302,5 mmol) e TEA (42 ml, 302,5 mmol) foram agitados em DCM em TA por 16 h. Os orgânicos foram lavados sequencialmente com HCl 1M (x2), NaHCO3 saturado (x2), H2O e salmoura, secos e concentrados em vácuo para render 1-(terc-butil) 2-metil (2S,4R)-4- hidroxipirrolidina-1,2-dicarboxilato (133) (58,1 g, 85%).

ETAPA 2. PREPARAÇÃO DE I-(TERC-BUTIL) 2-METIL (4R)-4-HIDROXI-2- METILPIRROLIDINA-1 ,2-DICARBOXILATO (134)

[0488] 1-(terc-butil) 2-metil (2S,4R)-4-hidroxipirrolidina-1,2-dicarboxilato (133) (5 g, 20,4 mmol) e MeI (12 g, 84,5 mmol) foram agitados em THF anidro a -40 °C. LDA (solução 2,0 M em THF) (37,5 ml, 75 mmol) foi adicionado por gotejamento. A reação foi deixada para aquecer para TA e agitada por 4 h, então, arrefecida bruscamente com NH4Cl saturado. A reação foi extraída com EtOAc, lavada com H2O e salmoura, seca (Na2SO4) e concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia de coluna 50:50 de EtOAc//hexanos para render 1-(terc-butil) 2-metil (4R)-4-hidroxi- 2-metilpirrolidina-1,2-dicarboxilato (134) como uma mistura racêmica (3,6 g, 68%)

ETAPA 3. PREPARAÇÃO DE TERC-BUTIL (2S,4R)-4-HIDROXI-2-(HIDROXIMETIL)-2- METILPIRROLIDINA-1 -CARBOXILATO (135A)

[0489] 1-(Tert-butil) 2-metil (4R)-4-hidroxi-2-metilpirrolidina-1,2- dicarboxilato (134) (19 g, 73,5 mmol) foi agitada em THF anidro sob N2. A solução de LiBH4 (48 ml, 96 mmol) foi adicionada por gotejamento e a reação foi agitada em TA por 48 h. A reação foi arrefecida bruscamente com NaOH 1M, o THF foi removido em vácuo e o residual extraído com EtOAc (4 x 100ml). Os orgânicos foram lavados com H2O e salmoura, secos (Na2SO4) e concentrados em vácuo. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia de coluna (5% de MeOH/DCM) para render terc-butil (2S,4R)-4-hidroxi-2-(hidroximetil)-2- metilpirrolidina-1-carboxilato (135a) como o produto principal (8 g, 47%). A estrutura é atribuída de acordo com as referências literárias.

ETAPA 4. PREPARAÇÃO DE CLORIDRATO DE (3R,5S)-5-(HIDROXIMETIL)-5- METILPIRROLIDIN-3-OL (136)

[0490] terc-Butil (2S,4R)-4-hidroxi-2-(hidroximetil)-2-metilpirrolidina-1-carboxilato (135a) (8 g, 34,6 mmol) foi agitado em EtOAc em TA e HCl gasoso aplicado por aproximadamente dois minutos. A reação foi agitada por uma hora, então, concentrada em vácuo e seca sob alto vácuo para render cloridrato de (3R,5S)-5-(hidroximetil)-5-metilpirrolidin-3-ol (136) de maneira quantitativa.

ETAPA 5. PREPARAÇÃO DE 12-((2S,4R)-4-HIDROXI-2-(HIDROXIMETIL)-2- METILPIRROLIDIN-1-IL)-12-OXODODECANOATO DE METILA (137)

[0491] Cloridrato de (3R,5S)-5-(Hidroximetil)-5-metilpirrolidin-3-ol (136) (7,9 g, 47,4 mmol), ácido 12-metoxi-12-oxododecanoico (11,5 g, 47,4 mmol), HBTU (36 g, 76 mmol) e TEA 20 ml, 142,2 mmol) foram agitados em DCM em TA por 16 h. O precipitado foi removido por meio de filtração e os orgânicos lavados com HCl 1 M (x2), NaHCO3 saturado (x2), H2O e salmoura. Após secagem, os orgânicos foram concentrados em vácuo e purificados por meio de cromatografia de coluna (5% de MeOH/DCM) para render 12-((2S,4R)- 4-hidroxi-2-(hidroximetil)-2-metilpirrolidin-1-il)-12-oxododecanoato de metila (137) (3,1 g, 18,3 %).

ETAPA 6. PREPARAÇÃO DE 12-((2S,4R)-2-((BIS(4-METOXIFENIL)(FENIL)METOXI)METIL)-4-HIDROXI-2-METILPIRROLIDIN-1-IL)-12- OXODODECANOATO DE METILA (138)

[0492] 12-((2S,4R)-4-hidroxi-2-(hidroximetil)-2-metilpirrolidin-1-il)- 12-oxododecanoato de metila (137) (3,1 g, 9,0 mmol), DMTr-Cl (2,8 g, 8,2 mmol) e TEA (1,1 ml, 8,2 mmol) foram agitados em DC< em TA por 16 h. A reação foi concentrada em vácuo e o resíduo purificado por meio de cromatografia de coluna (5% de MeOH/DCM, 0,1% de TEA) para render 12-((2S,4R)-2-((bis(4- metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-4-hidroxi-2-metilpirrolidin-1-il)-12-oxododecanoato de metila (138) (2,7 g, 45,5 mmol).ESQUEMA 23

ETAPA 7. PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 154-1

[0493] A uma solução de N-(2-hidroxietil)ftalimida (4,80 g, 25,0 mmol) e cloreto de 4,4’-dimetoxitritila (8,8 g, 26,0 mmol) em diclorometano (200 ml) a 0 °C sob nitrogênio, foi adicionada trietilamina (10,4 ml, 74,6 mmol) por gotejamento. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 3 h. TLC indicou a completação da reação. A camada orgânica foi lavada com salmoura (100 ml), seca em MgSO4 e concentrada até a secura. Esta foi usada diretamente para a próxima reação sem purificação.

ETAPA 8. PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 154-2

[0494] A 2-(2-(Bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)etil)isoindolina-1,3- diona (154-1) obtida acima e monoidrato de hidrazina (3,6 ml, 74 mmol) em etanol (100 ml) foram agitados de um dia para o outro em temperatura ambiente. TLC indicou a completação da reação. O precipitado foi filtrado. O filtrado foi evaporado. O resíduo foi absorvido por acetato de etila (100 ml). A solução orgânica foi lavada com 10% de NaOH, água e salmoura, e seca em MgSO4. A evaporação de solvente produziu 2-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)etanamina (154-2) como um líquido amarelo (8,11 g, 89,3% de rendimento em duas etapas). Este foi usado para a próxima reação sem purificação adicional.

ETAPA 9. PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 154-3

[0495] A uma solução de L-treonina (1,19 g, 10,0 mmol) e NaHCO3 (2,3 g, 27 mmol) em água (20 ml) e dioxano (10 ml), foi adicionado 1-(2,5- dioxopirrolidin-1-il) 12-metil dodecanodioato 146-1 (3,1 g, 9,1 mmol) em dioxano (10 ml) por gotejamento. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. HCl 4N (10 ml) foi adicionado. O precipitado foi coletado por meio de filtração e lavado com água (3 x 10 ml). O sólido foi seco em P2O5 num dessecador para produzir ácido (2S,3R)-3-hidroxi-2-(12-metoxi- 12-oxododecanamido)butanoico 154-3 como um sólido esbranquiçado (2,84 g, 82,2%). LC-MS (ESI): m/z: 346 (100), (M + H+).

ETAPA 10. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 154

[0496] O ácido (2S,3R)-3-hidroxi-2-(12-metoxi-12-oxododecanamido)butanoico 154-3 (2,47 g, 7,15 mmol), 2-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)etanamina 154-2 (2,60 g, 7,15 mmol), EDC (1,64 g, 8,58 mmol), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) (1,16 g, 8,58 mmol) e TEA (2,4 ml, 17,2 mmol) foram agitados em diclorometano (72 ml) em temperatura ambiente por 2 h. A água (30 ml) foi adicionada. A camada orgânica foi separada e lavada com salmoura (2 x 30 ml). A evaporação de solvente seguiu por meio de cromatografia de coluna (30% de acetato de etila/hexanos a 50% de acetato de etila/hexanos) produziu 12-((2S,3R)-1-(2-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)etilamino)-3-hidroxi-1-oxobutan-2-ilamino)-12- oxododecanoato de metila 154 como um semissólido amarelo ceroso (2,60 g, 52,6%). RMN de 1H (400MHz, acetona-d6, ppm): δ 7,51 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 7,457,49 (m, 2H), 7,28-7,36 (m, 6H), 7,21 (tt, J = 7,2, 1,2 Hz, 1H), 7,08 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,88 (dt, J = 8,9, 2,5 Hz, 4H), 4,39 (dd, J = 8,2, 3,0 Hz, 1H), 4,20-4,27 (m, 1H), 3,78 (s, 6H), 3,60 (s, 1H), 3,35-3,52 (m, 2H), 3,07-3,16 (m, 2H), 2,23-2,37 (m, 4H), 1,53-1,65 (m, 4H), 1,23-1,36 (m, 12H), 1,10 (d, J = 6,4 Hz, 3H).ESQUEMA 24

ETAPA 11. PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 164-1

[0497] A uma suspensão de t-butóxido de potássio (14,6 g, 130 mol) em THF (120 ml)/éter (360 ml) foi adicionado brometo de metiltrifenilfosfônio (46,6 g,130 mmol). A mistura foi refluxada por 2 h e, então, resfriada para 0 °C. A terc-butil 2-formilpirrolidina-1-carboxilato (13,0 g, 65,2 mmol) em éter (50 ml) foi adicionado por gotejamento. A mistura de reação foi agitada a 0 °C e, então, arrefecida bruscamente pela adição de água (250 ml). A camada orgânica foi separada e a água foi extraída com éter (250 ml). O extrato combinado foi seco em MgSO4. A evaporação de solvente, seguida por meio de purificação por cromatografia de coluna (5% de acetato de etila/hexanos) forneceu terc-butil 3- vinilpirrolidina-1-carboxilato 164-1 (11,5 g, 89,4%) como um líquido incolor. GC- MS: m/z: 197 (2) (M+), 141 (40), 124 (30), 57 (100).

ETAPA 12. PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 164-2

[0498] A uma mistura de t-BuOH (140 ml) e água (70 ml), foram carregados AD-mix-β (47,4 g) e metanossulfonamida (2,89 g, 30,4 mmol). A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 30 min e foi, então, resfriada para 0 °C. terc-Butil 3-vinilpirrolidina-1-carboxilato 164-1 (6,00 g, 30,4 mmol) foi adicionado. A reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura de reação foi resfriada para 0 °C. Pentaidrato de tiossulfato de sódio (96 g, 387 mmol) foi adicionado e a temperatura foi deixada para aquecer para temperatura ambiente. Água (700 ml) foi adicionada e a mistura foi extraída com acetato de etila (500 ml). O extrato foi lavado com água (2 x 50 ml) e salmoura (50 ml) e seco em MgSO4. A evaporação de solvente, seguida por meio de cromatografia de coluna (2% de metanol/diclorometano a 7% de metanol/diclorometano) forneceu terc-butil 3-(1,2-di-hidroxietil)pirrolidina-1- carboxilato 164-2 (5,4 g, 77%) como um óleo marrom claro.

ETAPA 13. PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 164-3

[0499] A uma solução de terc-butil 3-(1,2-di-hidroxietil)pirrolidina-1- carboxilato 164-2 (3,1 g, 13,4 mmol) em etanol (10 ml) foi adicionado HCl 3N (30 ml, 90 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. TLC indicou a completação da reação. Etanol foi evaporado. Tolueno foi adicionado e evaporado. Isto foi repetido três vezes para render cloridrato de 1-(pirrolidin-3-il)etano-1,2-diol 164-3 (2,0 g, 89%) como um óleo marrom. LC-MS (ESI): m/z: 132 (100), (M + H+, amina livre).

ETAPA 14 PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 164-4

[0500] A uma solução de cloridrato de 1-(pirrolidin-3-il)etano-1,2- diol 164-2 (2,0 g, 12 mmol) em água (30 ml) foi adicionado NaHCO3 (3,7g, 44 mmol) por porção. Dioxano (20 ml) foi, então, adicionado. À solução acima foi adicionado 1-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) 12-metil dodecanodioato 146-1 (3,7 g, 11 mmol) em dioxano (30 ml). A mistura de reação foi agitada de um dia para o outro. Esta foi extraída com acetato de etila (3 x 100 ml). O extrato combinado foi lavado com HCl 0,5 N (50 ml) e salmoura (50 ml) e seco em MgSO4.

ETAPA 15. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 164

[0501] Esta substância foi preparada a partir de 12-(3-(1,2-di- hidroxietil)pirrolidin-1-il)-12-oxododecanoato de metila 164-4 e cloreto de 4,4- dimetoxitritila (1 eq) usando o mesmo procedimento conforme descrito na síntese de 2-(2-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)etil)isoindolina-1,3-diona 138. O produto foi purificado por meio de cromatografia de coluna (1,5% de12-(3-(2-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)-1- hidroxietil)pirrolidin-1-il)-12-oxododecanoato de metila 164 foi obtido em 51% de rendimento como um óleo amarelo. RMN de 1H (400MHz, acetona-d6, ppm): δ 7,49-7,54 (m, 2H), 7,35-7,40 (m, 4H), 7,28-7,34 (m, 2H), 7,19-7,25 (m, 1H), 6,86- 6,91 (m, 4H), 4,11-4,20 (m, 1H), 3,79 (s, 6H), 3,68-3,77 (m, 1H), 3,60 (s, 3H), 3,29-3,59 (m, 3H), 3,06-3,20 (m, 3H), 2,33-2,55 (m, 1H), 2,29 (t, J = 7,4 Hz, 2H),2,19 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 1,65-2,0 (m, 2H), 1,51-1,62 (m, 4H), 1,26-1,35 (m, 12H).ESQUEMA 25

ETAPA 16. PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 170-1

[0502] A uma solução de terc-butil 2-aminoetilcarbamato (2,88 g,18,0 mmol) e trietilamina (2,98 g, 29,4 mmol) em diclorometano (100 ml), foi adicionado 1-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) 12-metil dodecanodioato (146-1) (5,09 g, 14,9 mmol) em diclorometano (50 ml) por gotejamento em temperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada de um dia para o outro e TLC indicou a completação da reação. 100 ml de salmoura foi adicionado e a camada orgânica foi separada. A camada orgânica foi lavada com HCl 0,5N (150 ml), salmoura (2 x 100 ml) e seca em MgSO4. A evaporação de solvente forneceu 12-(2-(terc- butoxicarbonilamino)etilamino)-12-oxododecanoato de metila puro 170-1 (5,85 g 100%) como um sólido branco.

ETAPA 17. PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 170-2

[0503] A uma solução de 12-(2-(terc-butoxicarbonilamino)etilamino)-12-oxododecanoato 170-1 (5,55 g, 14,4 mmol) em metanol (100 ml) a 0 °C, foi adicionado cloreto de tionila (3,3 ml, 45,5 mmol) por gotejamento. A reação foi, então, agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. TLC indicou a completação da reação. O solvente e os orgânicos voláteis foram evaporados. O resíduo foi, então, coevaporado com heptanos duas vezes para render cloridrato de 12-(2-aminoetilamino)-12- oxododecanoato de metila 170-2 quantitativamente como um sólido branco. LC- MS (ESI): m/z: 287 (100), (M + H+, amina livre).

ETAPA 18. PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 170-3

[0504] (-)-(S)-2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-carboxilato de metila (5,01 g, 31,2 mmol) e LiOH.H2O (2,55 g, 60,8 mmol) em THF (50 ml) e água (50 ml) foram agitados de um dia para o outro. TLC indicou a completação da reação. THF foi evaporado e a água foi acidificada com HCl 1N para pH = 1. Esta foi extraída com acetato de etila (5 x 50 ml). O extrato combinado foi seco em MgSO4. A evaporação de solvente forneceu ácido (S)-2,2-dimetil-1,3-dioxolano- 4-carboxílico 170-3 (2,93 g, 64,3%) como um líquido amarelo claro.

ETAPA 19. PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 170-4

[0505] O composto 170-4 foi sintetizado a partir de ácido (S)-2,2- dimetil-1,3-dioxolano-4-carboxílico 170-3 e N-hidroxissuccinimida em 86% de rendimento, usando o mesmo procedimento que o descrito na síntese de 1-(2,5- dioxopirrolidin-1-il) 12-metil dodecanodioato 146-1. (S)-2,5-Dioxopirrolidin-1-il 2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-carboxilato 170-4 foi obtido em 86% de rendimento como um sólido branco.

ETAPA 20. PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 170-5

[0506] A uma suspensão de cloridrato de 12-(2-aminoetilamino)- 12-oxododecanoato de metila 170-2 (14,4 mmol) e (S)-2,5-dioxopirrolidin-1-il 2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-carboxilato 170-4 (3,80 g, 15,6 mmol) emdiclorometano (100 ml) foi adicionada trietilamina (6 ml, 43,0 mmol) em diclorometano (25 ml) em 4 h a 0 °C. A mistura de reação foi, então, agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. LC-MS indicou que o material de partida 170-2 foi completamente convertido. A camada orgânica foi lavada com salmoura (50 ml), HCl 1N (50 ml), salmoura (50 ml), seca em MgSO4 e concentrada até a secura para produzir 12-(2-(2,2-dimetil-1,3- dioxolano-4-carboxamido)etilamino)-12-oxododecanoato de (S)-metila 170-5 (5,93 g, 99,3%) como um sólido branco.

ETAPA 21. PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 170-6

[0507] A uma solução de 12-(2-(2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4- carboxamido)etilamino)-12-oxododecanoato de (S)-metila 170-5 (5,93g, 14,3mmol) foi adicionada uma gota de ácido sulfúrico concentrado. Este foi refluxada por 6 h e, então, resfriado até temperatura ambiente. O sólido foi coletado através de filtração e lavado duas vezes com metanol frio. O sólido foi seco ao ar (3,32 g). A segunda cultura (0,42 g) foi obtida a partir do líquido-mãe para render 12-(2-(2,3-di-hidroxipropanamido)etilamino)-12-oxododecanoato de (S)- metila 170-6 (3,74 g em total, 69,4%) como um cristal branco. LC-MS (ESI): m/z: 375 (100), (M + H+). RMN de 1H (400MHz, DMSO-d6, ppm): δ 7,79 (br, 2H), 5,49 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 4,66 (t, J = 5,8 Hz, 1H), 3,83-3,88 (m, 1H), 3,55-3,61 (m, 4H), 3,41-3,47 (m, 1H), 3,05-3,15 (m, 4H), 2,29 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,03 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 1,42-1,52 (m, 4H), 1,18-1,29 (m, 12H).

ETAPA 22. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 170

[0508] A uma solução de 12-(2-(2,3-di-hidroxipropanamido)etilamino)-12-oxododecanoato de (S)-metila 170-6 (2,99 g, 7,99 mmol) em piridina seca (57,5 ml) sob nitrogênio, foi adicionado cloreto de 4,4’-dimetoxitritila (2,84 g, 8,38 mmol) numa porção. A reação foi agitada à temperatura ambiente por dois dias. Metanol (5 ml) foi adicionado para arrefecer bruscamente a reação. Piridina foi evaporada. Tolueno foi adicionado e, então, evaporado. Isto foi repetido três vezes. Água (100 ml) foi adicionada e esta foi extraída com acetato de etila (5 x 250 ml). Os extratos foram combinados e secos em MgSO4. A evaporação de solvente, seguida por meio de cromatografia de coluna (1% de metanol/diclorometano a 3% de metanol/diclorometano) forneceu 12-(2-(3-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)-2-hidroxipropanamido)etilamino)-12- oxododecanoato de (S)-metila 170 (1,70 g, 31,4%) como um óleo viscoso. RMN de 1H (400MHz, acetona-d6, ppm): δ 7,64-7,70 (br, 1H), 7,47-7,51 (m, 2H), 7,33- 7,37 (m, 4H), 7,26-7,32 (m, 2H), 7,20 (dt, J = 7,3, 2,1 Hz, 1H), 7,11 (br, 1H), 6,86 (d, J = 8,7 Hz, 4H), 4,84 (br, 1H), 4,21 (dd, J = 5,1, 3,8 Hz, 1H), 3,78 (s, 6H), 3,60 (s, 1H), 3,25-3,42 (m, 6H), 2,28 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,48-1,62 (m, 4H), 1,21-1,34 (m, 12H).ESQUEMA 26.

ETAPA 23. PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS 139, 155, 160, 165 E 170

[0509] Os compostos 139, 155, 160, 165 e 170 foram preparados a partir de compostos 138, 154, 159, 164 e 169 usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 18.

ETAPA 24. PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS 153, 158, 163, 168 E 173

[0510] Os conjugados 153, 158, 163, 168 e 173 foram preparados a partir de compostos 139, 154, 159, 164 e 169 usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 1.EXEMPLO 12. SÍNTESE DE CONJUGADO 176ESQUEMA 27. ESQUEMA 28.

ETAPA. 1. PREPARAÇÃO DE 12-AMINODODECANOATO DE METILA 132

[0511] O ácido 12-aminoundecanoico (131) (10 g, 4,64 mmol) foi agitado em MeOH em TA. O cloreto de acetila (856 μl, 12 mmol) foi adicionado por gotejamento e a reação foi agitada por 1,5 h. O solvente foi removido em vácuo, o resíduo absorvido em MTBE e resfriado no congelador de um dia para o outro. O precipitado resultante foi coletado por meio de filtração, lavado com MTBE gelado e seco sob alto vácuo para produzir 12-aminododecanoato de metila 132.

ETAPA 2. PREPARAÇÃO DE 12-(12-(10-((3R,4S)-3-((BIS(4-METOXIFENIL)- (FENIL)METOXI)METIL)-4-(HIDROXIMETIL)-3,4-DIMETILPIRROLIDIN-1-IL)-10- OXODECANAMIDO)DODECANAMIDO)DODECANOATO DE METILA 129

[0512] 10-((3R,4S)-3-((bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-4- (hidroximetil)-3,4-dimetilpirrolidin-1-il)-10-oxodecanoato de lítio (128) (2 g, 3,1 mmol), de 12-aminododecanoato de metila (132) (778 mg, 3,1 mmol), HBTU (1,2 g, 3,1 mmol) e TEA (1,4 ml, 10 mmol) foram agitados em DCM em TA O/N. O precipitado foi removido por meio de filtração, o filtrado foi concentrado em vácuo e o resíduo foi purificado por meio de cromatografia de coluna (5% de MeOH, DCM). TLC mostrou dois locais de execução próximos com massa idêntica que foram atribuídos como isômeros geométricos e agrupados juntos para render 12- (12-(10-((3R,4S)-3-((bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-4-(hidroximetil)-3,4- dimetilpirrolidin-1-il)-10-oxodecanamido)dodecanamido)dodecanoato de metila (129) de maneira quantitativa.

ETAPA 3. PREPARAÇÃO DE 12-(12-(10-((3R,4S)-3-((BIS(4-METOXIFENIL)(FENIL)- METOXI)METIL)-4-(HIDROXIMETIL)-3,4-DIMETILPIRROLIDIN-1-IL)-10-OXODECANAMIDO)- DODECANAMIDO)DODECANOATO DE LÍTIO 130

[0513] 12-(12-(10-((3R,4S)-3-((bis(4- metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-4-(hidroximetil)-3,4-dimetilpirrolidin-1-il)-10- oxodecanamido)dodecanamido)dodecanoato de metila (129) (3,1 mmol) foi agitado em THF:H2O (50:50) com LiOH (88 mg, 3,7 mmol) em TA O/N. A reação foi confirmada por TLC e o THF foi removido em vácuo. A solução aquosa foi congelada em N2 líquido e liofilizada por 48 horas para render 12-(12-(10- ((3R,4S)-3-((bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-4-(hidroximetil)-3,4- dimetilpirrolidin-1-il)-10-oxodecanamido)dodecanamido)dodecanoato de lítio130 quantitativamente.

ETAPA 4. PREPARAÇÃO DE CONJUGADO 176

[0514] O conjugado 176 foi preparado a partir de compostos 24 e 130 usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 1.EXEMPLO 13. SÍNTESE DE CONJUGADO 179ESQUEMA 29.ESQUEMA 30.

ETAPA 1. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 80

[0515] O composto 24 (2 g, 0,86 mmol), ácido N-carbobenzoxi- L-glutâmico (120 mg, 0,43 mmol), HBTU (326 mg, 0,86 mmol) e TEA (353 μl, 2,6 mmol) foram agitados em DCM em TA O/N. A mistura foi concentrada em vácuo e purificada por meio de cromatografia de coluna para render o composto 80 (2,88 g, 83%).

ETAPA 2. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 81

[0516] O composto 81 foi preparado a partir dos compostos 80 (670 mg, 0,17 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 14. O composto foi usado cru em reações subsequentes e o rendimento foi tomado como quantitativo.

ETAPA 3. PREPARAÇÃO DE CONJUGADO 179

[0517] O conjugado 179 foi preparado a partir de compostos 18 e 81 usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 1.EXEMPLO 14. SÍNTESE DE CONJUGADO 182ESQUEMA 31.ESQUEMA 32.

ETAPA 1. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 93

[0518] O composto 93 foi preparado a partir de ácido (2-oxo-2-fenil-1À2-etil)-D-glutâmico (2,25 g, 8,1 mmol) e 9 (13 g, 21 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 89. Rendimento: 11,2 g.

ETAPA 2. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 94

[0519] O composto 94 foi preparado a partir do composto 93(11,1 g) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 90.Rendimento: 10,2 g.

ETAPA 3. PREPARAÇÃO DE CONJUGADO 182

[0520] O conjugado 182 foi preparado a partir de compostos 18e 94 usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 1.EXEMPLO 15. SÍNTESE DE CONJUGADOS 185 E 188ESQUEMA 33. ESQUEMA 34.ESQUEMA 35.

ETAPA 1. PREPARAÇÃO DE 14-HIDROXI-3,6,9,12-TETRAOXATETRADECIL 4- METILBENZENOSSULFONATO 82

[0521] Uma solução de pentaetileno glicol (35 g, 147 mmol), TEA (41 ml, 294 mmol) e trimetilamina-HCl (1,4 g, 14,7 mmol) em CH2Cl2 (600 ml) foi tratada com cloreto de tossila (29,4 g, 154 mmol). Após agitação (18h), a mistura de reação foi lavada com H2O-salmoura (1:1), seca (MgSO4), filtrada, concentrada e submetida à cromatografia para render 82 (24,6 g, 43%) como um óleo amarelo pálido. Rf 0,8 (10% de CH3OH-CH2Cl2).

ETAPA 2. 14-AZIDO-3,6,9,12-TETRAOXATETRADECAN-1-OL 83

[0522] 14-azido-3,6,9,12-tetraoxatetradecan-1-ol (83) foipreparado a partir de 82 (24,6 g, 62,7 mmol) e azido de sódio (7,13 g, 110 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 4. Rendimento: 14,8 g, 90%.

ETAPA 3. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 84

[0523] Uma solução de GalNAc 6 (12,2 g, 31,4 mmol) e HO-PEG- N3 83 (9,2 g, 35 mmol) em 1,2-dicloroetano (150 ml) foi tratada com Sc(OTf)3 (771 mg, 1,6 mmol). Após agitação (85 °C, 2 h) a reação foi resfriada (TA), arrefecida bruscamente pela adição de TEA (40 ml) e concentrada. O material cru foi submetido à cromatografia para render 84 (11,16 g, 60%) como uma espuma amarelo pálido. Rf 0,7 (10% de CH3OH-CH2Cl2).

ETAPA 4. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 85

[0524] Uma solução de 84 (11,16 g, 18,8 mmol) e Pd/C (1,1 g, 10% - suporte úmido) em EtOAc (120 ml) foi tratada com TFA (4,32 ml, 56,5 mmol) e purgada com H2. Após agitação vigorosa (4,5 h), a reação foi purgada com N2, filtrada através de Celite e concentrada. O material cru foi submetido à cromatografia para render 85 (5,77 g, 45%) como uma espuma incolor. Rf 0,5 (10% de CH3OH-CH2Cl2).

ETAPA 5. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 95

[0525] O composto 95 foi preparado a partir de ácido (2-oxo-2- fenil-1À2-etil)-D-glutâmico (1,04 g, 3,7 mmol) e composto 94 (10,2 g) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 91. Rendimento: 7,2 g.

ETAPA 6. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 96

[0526] O composto 96 foi preparado a partir do composto 95 (11,1 g) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 92. Rendimento: 6,5 g.

ETAPA 7. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 97

[0527] O composto 97 foi preparado a partir de ácido (2-oxo-2- fenil-1À2-etil)-D-glutâmico (2 g, 7,1mmol) e 85 (12,1 g, 17,8 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 89. Rendimento: 10 g, quantitativo.

ETAPA 8. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 98

[0528] O composto 98 foi preparado a partir do composto 97 (10g, 7,2 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 90. Rendimento: 3,5 g, 36%.

ETAPA 9. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 99

[0529] O composto 99 foi preparado quantitativamente a partir de ácido (2-oxo-2-fenil-1À2-etil)-D-glutâmico (350 mg, 1,25 mmol) e composto 98 (2,86 mg, 2,5 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 91.

ETAPA 10. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 100

[0530] O composto 100 foi preparado quantitativamente a partirdo composto 99 (3,2 g, 1,25 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 92.

ETAPA 11. PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS 185 E 188

[0531] Os conjugados 185 e 188 foram preparados a partir doscompostos 18 e 96 ou 18 e 100 usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 1.EXEMPLO 16. SÍNTESE DE CONJUGADOS 191, 194, 197 E 200ESQUEMA 36ESQUEMA 37. ESQUEMA 38.

ETAPA 1. PREPARAÇÃO DE 2-(2-(2-AZIDOETOXI)ETOXI)ETAN-1-OL 86

[0532] A uma solução de 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etan-1-ol (13 g, 77 mmol) em água (200 ml) foi adicionado azido de sódio (10 g, 154 mmol). A reação foi aquecida para 100 °C por 18 horas. A reação foi resfriada para temperatura ambiente e derramada num funil separador de 1 l e extraída com diclorometano (3 x 200 ml). Os extratos de diclorometano combinados foram secos em sulfato de magnésio, filtrados e concentrados até a secura para produzir 2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etan-1-ol como um óleo incolor (11,7 g).

ETAPA 2. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 87

[0533] O composto 87 foi preparado a partir de 86 (4,95 g, 28,3 mmol) e 6 (10 g, 25,7 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 84. Rendimento: 10 g, 77%.

ETAPA 3. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 88

[0534] O composto 88 foi preparado a partir de 87 (10 g, 19,8 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 85. Rendimento: 7,63 g, 65%.

ETAPA 4. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 89

[0535] Uma solução de 88 (2 g, 3,38 mmol) e ácido Z-glutâmico (427 mg, 1,52 mmol) em CH2Cl2 (50 ml) foi tratado com HBTU (1,41 g, 3,7 mmol) e base de Hünig (1,77 ml, 10,1 mmol). Após agitação (18h), a mistura foi concentrada e submetida à cromatografia para render 89 (871 mg, 48%) como uma espuma incolor. Rf 0,5 (10% de CH3OH-CH2Cl2).

ETAPA 5. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 90

[0536] Uma solução de 89 (870 g, 0,72 mmol) e Pd/C (90 mg, 10% - suporte úmido) em EtOAc (10 ml) foi tratada com TFA (84 μl, 1,1 mmol) e purgada com H2. Após agitação vigorosa (2 h), a reação foi purgada com N2, filtrada através de Celite e concentrada. O material cru foi usado sem processamento adicional e rendeu 90 (850 mg, quantitativo) como uma espuma incolor. Rf 0,25 (10% de CH3OH-CH2Cl2).

ETAPA 6. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 91

[0537] Uma solução de 90 (850 mg, 0,72 mmol) e ácido Z- glutâmico (91 mg, 0,32 mmol) em CH2Cl2 (10 ml) foi tratado com HBTU (300 mg, 0,79 mmol) e base de Hünig (502 μl, 2,9 mmol). Após agitação (1,5 h), a mistura foi diluída com CH2Cl2 e lavada com NaHCO3 (Sat. Aq.), seca (MgSO4), filtrada e concentrada. O material cru foi submetido à cromatografia para render 91 (590 mg, 76%) como uma espuma incolor. Rf 0,5 (10% de CH3OH-CH2Cl2).

ETAPA 7. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 92

[0538] Uma solução de 91 (590 mg, 0,25 mmol) e Pd/C (100 mg, 10% - suporte úmido) em CH3OH (30 ml) foi tratada com TFA (29 μl, 0,37 mmol) e purgada com H2. Após agitação (3h), a mistura foi purgada com N2, então, filtrada através de Celite e concentrada. O material cru foi usado sem processamento adicional e rendeu 92 (600 mg, quantitativo) como uma espuma incolor. Rf 0,1 (10% de CH3OH-CH2Cl2).

ETAPA 8. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 101

[0539] O composto 101 foi preparado de ácido (R)-2-((2-oxo-2- fenil-1l2-etil)amino)hexanodioico (2,51 g, 8,6 mmol) e 9 (11 g, 17,2 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 89. Rendimento: 4,2 g, 37%.

ETAPA 9. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 102

[0540] O composto 102 foi preparado a partir do composto 101 (4,2 g, 3,2 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 90. Rendimento: 2,1 g, 47%.

ETAPA 10. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 103

[0541] O composto 103 foi preparado de ácido (R)-2-((2-oxo-2- fenil-1l2-etil)amino)hexanodioico (265 mg, 0,9 mmol) e composto 102 (2,1 g, 1,8 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 91. Rendimento: (560 mg, 24%).

ETAPA 11. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 104

[0542] O composto 104 foi preparado quantitativamente a partir do composto 103 (560 mg) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 92. O composto foi usado sem purificação.

ETAPA 12. PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS 191, 194, 197 E 200

[0543] Os conjugados 191, 194, 197 e 200 foram preparados apartir de compostos 128 e 92, 96, 100 ou 104 usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 1.EXEMPLO 17. SÍNTESE DE CONJUGADOS 203 E 206ESQUEMA 39.

ETAPA 1. PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 69B

[0544] O composto 69b foi preparado a partir de ácido (2S,4R)-4-Hidroxipirrolidina-2-carboxílico usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 69.

ETAPA 2. PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS 203 E 206

[0545] Os conjugados 203 e 206 foram preparados a partir do composto 96 e 100 usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 1. EXEMPLO 18. SÍNTESE DE CONJUGADO 207ESQUEMA 40.

ETAPA 1. PREPARAÇÃO DE CONJUGADO 209

[0546] O conjugado 209 foi preparado a partir de compostos 96 e um procedimento idêntico àquele usado para o composto 1 EXEMPLO 19. SÍNTESE DE CONJUGADOS 212 E 215ESQUEMA 41. ESQUEMA 42.

ETAPA 1. PREPARAÇÃO DE 5-(2-((2-OXO-2-FENIL-1A2- ETIL)AMINO)ACETAMIDO)ISOFTALATO DE DIMETILA 105

[0547] Uma solução de 5-aminoisoftalato de dimetila (5 g, 24 mmol), Z-Gly-OH (5 g, 24 mmol), EDC (5 g, 26,3 mmol), HOBt (3,6 g, 26,3 mmol), NMM (2,9 ml, 26,3 mmol) em DMF (50 ml) foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente. Mediante completação, a mistura de reação foi diluída com acetato de etila (250 ml) e lavada, cada, com HCl 1 M (2 x 100 ml), bicarbonato de sódio saturado (1 x 100 ml) e salmoura (2 x 100 ml). Seco em sulfato de magnésio, filtrado e concentrado até a secura para produzir 5-(2- ((2-oxo-2-fenil-1À2-etil)amino)acetamido)isoftalato de dimetila como um sólido incolor (7,2 g, 79%).

ETAPA 2. PREPARAÇÃO DE ÁCIDO 5-(2-((2-OXO-2-FENIL-1A2- ETIL)AMINO)ACETAMIDO)ISOFTÁLICO 106

[0548] A uma solução de 5-(2-((2-oxo-2-fenil-1À2-etil)amino)acetamido)isoftalato de metila (7,2 g) em metanol (25 ml) e THF (25 ml) foi adicionado NaOH 1M (25 ml). A solução foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas, então, concentrada para remover THF e MeOH. A solução aquosa restante foi diluída com água (75 ml), resfriada num banho de água gelada e acidificada para pH = 1 com HCl 6M. O sólido foi filtrado e lavado com água (3 x 100 ml). O sólido foi seco por congelamento para produzir ácido 5-(2-((2-oxo-2-fenil-1À2-etil)amino)acetamido)-isoftálico (6,9 g, quantitativo).

ETAPA 3. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 107

[0549] O composto 107 foi preparado a partir de ácido 5-(2-((2- oxo-2-fenil-1À2-etil)amino)acetamido)isoftálico 106 (200 mg, 0,54 mmol) e 94 (1,7 g, 1,3 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 95. Rendimento: 600 mg.

ETAPA 4. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 108

[0550] O composto 108 foi preparado a partir do composto 107 (600 mg) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 96. Rendimento: 650 mg, quantitativo.

ETAPA 5. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 109

[0551] O composto 109 foi preparado a partir de ácido 5-(2-((2- oxo-2-fenil-1À2-etil)amino)acetamido)isoftálico 106 (180 mg, 0,48 mmol) e 98 (1,5 g, 1,1 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 99. Rendimento: 900 mg.

ETAPA 6. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 110

[0552] O composto 110 foi preparado a partir do composto 109 (900 mg) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 100. Rendimento: 920 mg, quantitativo.

ETAPA 7. PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS 212 E 215

[0553] Os conjugados 212 e 215 foram preparados a partir do composto 128 e 108 ou 110 usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 1.EXEMPLO 20. SÍNTESE DE CONJUGADOS 218 E 221ESQUEMA 43. ESQUEMA 44.

ETAPA 1. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 111

[0554] O composto 111 foi preparado a partir de ácido 4-(((terc- butoxicarbonil)amino)metil)ftálico (1,13 g, 3,84mmol) e 88 (5 g, 8,44 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para composto 89. Rendimento: 2,21 g, 49%.

ETAPA 2. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 112

[0555] Uma solução de 111 (2,21 g, 1,87 mmol) em CH2Cl2 (40 ml) foi lentamente tratada com TFA (5 ml). Após agitação (2h), a mistura foi concentrada e submetida à cromatografia para render 112 (1,08 g, 47%) como uma espuma incolor. Rf 0,1 (10% de CH3OH-CH2Cl2).

ETAPA 3. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 113

[0556] O composto 113 foi preparado a partir do composto 112 (1,08 g, 0,88 mmol) e ácido (2-oxo-2-fenil-1À2-etil)-D-glutâmico (112 mg, 0,39 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para composto 91. Rendimento: 600 mg, 62%.

ETAPA 4. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 114

[0557] O composto 114 foi preparado a partir do composto 113 usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 92.

ETAPA 5. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 115

[0558] O composto 115 foi preparado a partir de ácido 4-(((terc- butoxicarbonil)amino)metil)ftálico (3,94 g, 13,3 mmol) e 9 (18,2 g, 29,4 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para composto 93. Rendimento: 9,02 g, 53%.

ETAPA 6. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 116

[0559] O composto 116 foi preparado a partir do composto 115 (8 g, 6,3 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 112. Rendimento: 3,23 g, 39%.

ETAPA 7. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 117

[0560] O composto 117 foi preparado a partir do composto 116 (3,23 g, 2,45 mmol) e ácido (2-oxo-2-fenil-1À2-etil)-D-glutâmico (192 mg, 1,1 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para composto 95. Rendimento: 2,22 g, 34%.

ETAPA 8. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 118

[0561] O composto 118 foi preparado a partir do composto 117 (2,22 g, 0,84 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 96. Rendimento: 2,02 g, 91%.

ETAPA 9. PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS 218 E 221

[0562] Os conjugados 218 e 221 foram preparados a partir doscompostos 128 e 114 ou 118 usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 1.EXEMPLO 21. SÍNTESE DE CONJUGADO 224ESQUEMA 45.

ETAPA 1. PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 224

[0563] O conjugado 224 foi preparado a partir de compostos 96 e 130usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 1. \EXEMPLO 22 SÍNTESE DE CONJUGADO 231ESQUEMA 46ESQUEMA 47

ETAPA 1 PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 225

[0564] O composto 225 foi preparado a partir de ácido 5-(2- aminoacetamido)isoftálico 106 (560 mg, 1,5 mmol) e 9 (2,24 g, 3,6 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para 89. Rendimento de 1,6 g, 80%.

ETAPA 2 PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 226

[0565] O composto 226 foi preparado da mesma maneira que 14. Rendimento de 1,22 g, 78%.

ETAPA 3 PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 227

[0566] O composto 227 foi preparado da mesma maneira que 89, a partir de ácido Z-glutâmico (108 mg, 0,38 mmol) e 226 (1,22 g, 0,92 mmol). Rendimento de 471 mg, 45%.

ETAPA 4 PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 228

[0567] O composto 228 foi preparado da mesma maneira que 14. Rendimento 460 mg, Quant.

ETAPA 5 PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 229

[0568] O composto 229 foi preparado a partir de 228 (460 mg, 0,17 mmol) e 128 (125 mg, 0,19 mmol) da mesma maneira que 89. Rendimento de 365 mg, 66%.

ETAPA 6 PREPARAÇÃO DE COMPOSTO 231

[0569] O conjugado 231 foi preparado usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 1.EXEMPLO 23. SÍNTESE DE CONJUGADO 233ESQUEMA 48

ETAPA 1. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 232

[0570] O composto 232 foi preparado a partir do composto 24 (650 mg, 0,33 mmol) e composto 69b (175 mg, 0,33 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 19. Rendimento: 380 mg, 47%.

ETAPA 2. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 233

[0571] O composto 233 foi preparado a partir do composto 232usando procedimentos idênticos àqueles usados para o composto 1.EXEMPLO 24. SÍNTESE DE CONJUGADO 235ESQUEMA 49

ETAPA 1. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 234

[0572] O composto 234 foi preparado a partir do composto 24 (1,1g, 0,55 mmol) e composto 18 (175 mg, 0,33 mmol) usando um procedimento idêntico àquele usado para o composto 19. Rendimento: 685 mg, 51%.

ETAPA 2. PREPARAÇÃO DO COMPOSTO 235

[0573] O composto 235 foi preparado a partir do composto 234 usando procedimentos idênticos àqueles usados para o composto 1.

EXEMPLO 25. AVALIAÇÃO IN VITRO E IN VIVO DE CONJUGADO DE GALNAC-SITTR HIDRATAÇÃO DE CONJUGADOS DE GALNAC-SITTR:

[0574] Conjugados de GalNAc-siTTR com a estrutura de composto 1, que emprega um oligonucleotídeo com sequência de siRNA conforme segue, escrito 5 ’a 3’. Filamento de senso: A*a*CaGuGuUCUuGcUcUaUaA(GalNAc) (SEQ ID NO: 31). Filamento de antissenso: u*U*aUaGaGcAagaAcAcUgUu*u*u (SEQ ID NO: 32). Onde a letra maiúscula sublinhada é uma modificação de açúcar de 2’-OMetila e a letra minúscula é uma modificação de açúcar de 2’- fluoro. Um asterisco (*) representa uma aglutinação de fosforotioato (PS). Antes do uso nos estudos, os conjugados foram hidratados em PBS e quantificados usando um instrumento NanoDrop para medição de A260.

COMPARAÇÃO IN VITRO DE CONJUGADOS DE GALNAC-SITTR:

[0575] Os hepatócitos primários foram isolados de um camundongo fêmea C57 Bl/6 usando procedimentos padrão. Uma vez isolados, os hepatócitos foram colocados em placas em placas Primaria de 96 cavidades a 2,75 x 104 células/poço em Williams Media E (WME) contendo 10% de FBS. Quatro horas depois, e para o restante do experimento, os meios foram trocados para WME sem FBS. No dia seguinte, 90 μl de WME fresco foram aplicados às células. Estoques de conjugado de siRNA foram preparados em PBS numa concentração de 100 μg/ml. A diluição serial (1 em 2) em WME (50 μl de diluição de conjugado + 50 μl de WME) foi realizada. 10 μl de cada diluição de conjugado foram, então, transferidos para a placa Primaria em triplicata, dando concentrações de conjugado finais nos hepatócitos de 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,312, 0,156 e 0,078 μg/ml. Uma diluição serial de PBS em WME agiu como o controle negativo. As células foram incubadas por 24 horas a 37 °C e 5% de CO2. Os meios de transfecção foram, então, removidos e as células foram lisadas pela adição de 200 μl IxLWR (contendo 0,5 mg/ml de Proteinase K). A placa foi congelada-descongelada (60 min de ciclo, -80 °C/52 °C) para auxiliar na lise das células. Os lisatos resultantes foram, então, analisados para níveis de mRNA de TTR & GAPD de camundongo usando Ensaio QuantiGene 2.0 de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações relativas de mRNA de TTR, normalizadas para GAPD mRNA, foram determinadas e plotadas. As células tratadas com o conjugado exibiram um knockdown marcado de mRNA-alvo.

COMPARAÇÃO IN VIVO DE CONJUGADOS DE GALNAC-SITTR:

[0576] Os camundongos fêmea C57BL/6 (n = 4) foram tratados subcutaneamente (região escapular) com PBS ou conjugado de GalNAc-siTTR (diluído para 0,1 mg/ml ou 0,2 mg/ml em PBS, de modo que os animais recebessem uma dose de 1 mg/kg ou 2 mg/kg de conjugado, respectivamente). O sangue no Dia 2, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 14, 21 (corte de cauda) e no Dia 28 (terminal) foi coletado e o plasma resultante foi analisado para proteína de TTR por ELISA. Os valores de proteína de plasma de TTR eram relativos ao controle PBS são tabulados (Tabelas 1 e 2; consulte as Figuras 7 e 8). Os animais tratados com o conjugado exibiram um knockdown marcado de mRNA-alvo e proteína.

Claims (5)

1.COMPOSTO, caracterizado por ter a fórmula:ou um sal do mesmo,em que:Q é L1-R1;R1 é um ligante de direcionamento que possui a seguinte fórmula:em que:B1 é CH e é ligado covalentemente a L1, T1 e T2;B2 é selecionado do grupo que consiste em:e é ligado covalentemente a T1, T3 e T4;B3 é selecionado do grupo que consiste em:e é ligado covalentemente a T2, T5 e T6;cada um dos T1 e T2 é uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada, saturada ou insaturada, que tem de 1 a 20 átomos de carbono, em que um ou mais dos átomos de carbono na cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituído por -NRX-C(=O)- ou -C(=O)-NRX-, e em que RX é hidrogênio ou (C1-C6)alquila, e em que a cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituída por oxo (=O);cada um dos T3, T4, T5 e T6 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em:em que:n = 1, 2, ou 3;L1 é uma cadeia de hidrocarboneto bivalente, ramificada ou não ramificada, saturada ou não saturada, que tem de 1 a 12 átomos de carbono, em que um ou mais dos átomos de carbono na cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituído por -NRX-C(=O)- ou -C(=O)-NRX-, e em que RX é hidrogênio ou (C1-C6)alquila, e em que a cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituída por oxo (=O); ou em que L1 é uma cadeia de hidrocarboneto bivalente, não ramificada, saturada, que tem de 1 a 24 átomos de carbono, em que um ou mais dos átomos de carbono na cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituído por -NRX-C(=O)- ou -C(=O)-NRX-, e em que RX é hidrogênio, e em que a cadeia de hidrocarboneto é opcionalmente substituída por oxo (=O);R’ é C1-9 alquila; eR2 é um RNA de interferência pequeno;em que cada sacarídeo é independentemente:

2. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo RNA de interferência pequeno ser um oligonucleotídeo, ouum sal do mesmo, selecionado do grupo que consiste em:

3. COMPOSTO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado por ser para uso em um método para entregar um ácido nucléico para o fígado de um animal.

4. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada porcompreender um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

5. USO DE UM COMPOSTO, ou um sal farmaceuticamenteaceitável do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou de uma composição, conforme definida na reivindicação 4, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar doenças do fígado, preferencialmente em que as doenças do fígado são selecionadas a partir de doenças do fígado associadas com ou causadas pelo acúmulo de gordura, como esteatose hepática, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), esteato- hepatite não alcoólica (NASH), transplante de fígado esteatótico, hepatite e/ou danos agudos ao fígado, incluindo insuficiência hepática fulminante e subfulminante e hipertrigliceridemia.