BR112019014680A2

BR112019014680A2 - Métodos e composições para alimentação de insetos de perfuradores e insetos sugadores

Info

Publication number: BR112019014680A2
Application number: BR112019014680-6A
Authority: BR
Inventors: Van Tran Hai
Original assignee: AgBiome, Inc.
Priority date: 2017-01-16
Filing date: 2018-01-12
Publication date: 2020-02-18
Also published as: US20190364885A1; WO2018132670A1; EP3568012A1; AU2018207567A1; CA3050253A1

Abstract

métodos e composições são fornecidos para avaliar a resistência a insetos de um agente de interesse. especificamente, é fornecido um aparelho de alimentação para avaliação da atividade inseticida de um agente de interesse em uma solução de dieta líquida contra um inseto perfurador ou sugador. além disso, são fornecidos métodos para alimentar um inseto perfurador ou sugador uma dieta líquida com um agente de interesse a fim de avaliar a atividade inseticida do agente.

Description

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA A ALIMENTAÇÃO DE INSETOS PERFURADORES E SUGADORES

CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção se refere aos campos de resistência a insetos e controle de pragas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] Pragas de plantas, incluindo pragas de insetos perfuradores e sugadores, são um dos principais fatores que danificam cultivos agrícolas em todo o mundo. Insetos perfuradores e sugadores significativos para a agricultura incluem o percevejo verde da soja (Nezara viridula), percevejo marrom marmorizado (Halyomorpha halys) e percevejo do kudzu (Megacopta cribraria) . Os percevejos são pentatomídeos fitófagos, com uma ampla variedade de hospedeiros, incluindo plantas com brotos em crescimento e sementes ou frutos em desenvolvimento. Outras pragas de insetos perfuradores ou sugadores incluem pulgões e mosquitos. Além do impacto agrícola, os insetos perfuradores ou sugadores podem provocar ferimentos e até mesmo a morte com suas picadas. Além disso, muitas pragas transmitem bactérias e outros patógenos que provocam doenças em humanos e animais. Por exemplo, os mosquitos transmitem patógenos que causam malária, febre amarela, encefalite e outras doenças. A peste bubônica, ou morte negra, é causada por bactérias que infectam ratos e outros roedores.

[003] São necessários meios simples e eficazes para avaliar agentes inseticidas em uma solução líquida levando em

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 6/40

2/31 consideração os desafios específicos dos insetos perfuradores e sugadores.

BREVE RESUMO DA INVENÇÃO [004] São fornecidos métodos e composições para avaliar a resistência a insetos de um agente de interesse. Especificamente, é fornecido um aparelho de alimentação para avaliar a atividade inseticida de um agente de interesse em uma solução de dieta liquida contra um inseto perfurador ou sugador.São fornecidos, ainda, métodos para alimentar um inseto perfurador ou sugador com uma dieta líquida contendo um agente de interesse a fim de avaliar a atividade inseticida do agente.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [005] A Figura 1 apresenta dados sobre a mortalidade de percevejos usando o bioensaio de ingestão de tubo capilar. Os percevejos exibiram baixa mortalidade (15%) no dia 4 quando receberam apenas uma dieta líquida. Observou-se uma alta mortalidade (100%) no dia 4 quando os percevejos foram alimentados com dieta mais 5 ppm de inseticida imidacloprid. Observou-se também uma alta mortalidade (100%) no dia 4 quando os percevejos receberam água sem dieta. Os dados foram coletados em duas repetições com 5 insetos cada uma.

[006] A Figura 2 mostra a mortalidade dos percevejos nos dias 5 a 7 quando receberam 10% de sacarose mais Nistatina em tubos capilares. A adição de nistatina antifúngica não aumenta a mortalidade dos percevejos conforme aumenta a concentração de nistatina.

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 7/40

3/31 [007] A Figura 3 compara a mortalidade de controle do percevejo verde da soja usando os formatos de placas de 24 poços e de tubo capilar. A mortalidade para cada tratamento foi semelhante entre os formatos.

[008]	A Figura 4 mostra	um inseto perfurador que	se
alimenta	de uma solução de	dieta líquida através de	um
orifício	em um tubo capilar.
DESCRIÇÃO	DETALHADA
[009]	Muitas modificações	e outras configurações	das

invenções aqui apresentadas virão à mente dos especialistas na técnica à qual estas invenções pertencem, com o beneficio dos ensinamentos apresentados nas descrições anteriores e em suas correspondentes figuras. Portanto, deve-se entender que as invenções não se limitam às configurações especificas descritas e que modificações e outras configurações supõem-se incluídas no escopo das reivindicações em anexo. Embora sejam empregados termos específicos, estes são utilizados em sentido meramente genérico e descritivo e não com fins de limitação.

I. Considerações gerais [0010] Os métodos aqui descritos são úteis para avaliar a atividade inseticida de um agente de interesse contra insetos sugadores e perfuradores. Um agente inseticida pode ser qualquer agente capaz de ser administrado a um inseto em um líquido. Por exemplo, um agente inseticida pode ser uma proteína, um ácido nucleico (por ex., ácido nucleico interferente), um micro-organismo ou lisado celular, entre outros. O lisado pode ser um lisado de qualquer célula que

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 8/40

4/31 expresse um agente inseticida ou agente potencialmente inseticida. Em configurações especificas, o lisado celular pode ser o lisado de Escherichia coli ou Bacillus thuringiensis modificado para expressar um agente inseticida. [0011] Em algumas configurações, as composições e métodos aqui descritos são utilizados para administrar um agente sem atividade inseticida a um inseto com o objetivo de determinar a atividade inseticida do agente. Conforme aqui utilizado, a atividade inseticida se refere à capacidade de um determinado agente, ao ser consumido por um inseto, para impedir que esse inseto sobreviva, considerando que o inseto teria sobrevivido consumindo a mesma dieta, porém sem consumir o agente de interesse.

II. Aparelho de alimentação [0012] As composições e métodos aqui divulgados utilizam um aparelho de alimentação para administrar uma solução de dieta liquida contendo um agente potencialmente inseticida a um inseto perfurador ou sugador. O aparelho de alimentação pode incluir um tubo de alimentação com orificios e uma solução de dieta para um inseto perfurador ou sugador. Além do agente inseticida, ou agente potencialmente inseticida, a solução de dieta pode incluir açúcares ou outras fontes alimentares essenciais para um inseto perfurador ou sugador em particular. Por exemplo, a solução de dieta pode conter cerca de 5%, cerca de 10% ou cerca de 15% de solução de açúcar, como glicose, sacarose, frutose ou manose, entre outras. Em configurações especificas, a solução de dieta contém cerca de 10% de

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 9/40

5/31 sacarose. A solução de dieta pode conter aminoácidos em uma concentração suficiente para impedir a mortalidade do inseto. [0013] Em algumas configurações, a solução de dieta contém cerca de 10% de sacarose e aminoácidos. Qualquer liquido pode ser usado para administrar o agente de interesse a um inseto, incluindo, mas não se limitando a, água. O líquido de administração para o agente de interesse também pode incluir qualquer tampão ou fonte alimentar apropriada que não interfira na atividade inseticida do agente de interesse. A quantidade de solução de dieta utilizada no ensaio de alimentação pode variar com base no tamanho do tubo de alimentação utilizado. Em configurações específicas, cerca de

10	μΐ,	15 μΐ, 16 μΐ, 17 μΐ, 18 μΐ, 19 μΐ,	20 μΐ,	21 μΐ, 22 μΐ,
23	μΐ,	24 μΐ, 25 μΐ, 26 μΐ, 27 μΐ, 28 μΐ,	29 μΐ,	30 μΐ, 35 μΐ,
40	μΐ,	45 μΐ, 50 μΐ, 60 μΐ, 70 μΐ, 80 μΐ	ou 100	μΐ de solução
de	dieta são adicionados ao tubo de alimentação.
[0014]	Em algumas configurações,	uma	composição

antimicrobiana ou antifúngica é adicionada à solução de dieta a fim de impedir a contaminação da solução de alimentação com bactérias ou fungos. Por exemplo, a solução de dieta pode conter Nistatina em uma concentração de cerca de 500 ppm, 750 ppm, 900 ppm, 1000 ppm, 1100 ppm, 1250 ppm ou 1500 pm.

[0015] A solução de dieta líquida administrada ao inseto perfurador ou sugador fica dentro de um tubo com orifícios através dos quais o inseto pode ter acesso à solução de dieta. Qualquer tubo capaz de conter um líquido pode ser usado para administrar a solução de dieta líquida ao inseto. O tubo pode ser feito de plástico, borracha, metal ou qualquer outro

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 10/40

6/31 material capaz de conter uma solução liquida. Por exemplo, o tubo pode ser feito de qualquer tipo de plástico, como estireno (HIPS), PETG ou polietileno. As paredes do tubo devem ter espessura suficiente para permitir que um inseto perfurador ou sugador se alimente da solução de dieta contida dentro do tubo. Em algumas configurações, as paredes do tubo possuem cerca de 0,010 mm, cerca de 0,10 mm, cerca de 0,20 mm,

cerca	de	0,30 mm,	cerca	de	0,40 mm,	cerca	de	0,50 mm,	cerca	de
0, 60 :	mm,	cerca de	0,70	mm,	cerca de	0, 80	mm,	cerca de	0, 90	mm
cerca	de	1,0 mm,	cerca	de	1,10 mm,	cerca	de	1,25 mm,	cerca	de

1,50 mm, cerca de 2,0 mm ou mais.

[0016] O tubo pode ter qualquer comprimento que permita que pelo menos um inseto se alimente no tubo. Em algumas configurações, o tubo possui cerca de 20 mm, cerca de 25 mm, cerca de 30 mm, cerca de 35 mm, cerca de 40 mm, cerca de 45 mm, cerca de 50 mm, cerca de 55 mm, cerca de 60 mm, cerca de 65 mm, cerca de 70 mm, cerca de 75 mm, cerca de 80 mm, cerca de 85 mm, cerca de 90 mm, cerca de 95 mm, cerca de 100 mm, cerca de 125 mm, cerca de 150 mm, cerca de 175 mm, cerca de 200 mm ou mais. Em algumas configurações, o tubo possui um comprimento suficiente para encaixar dentro de um recipiente de alimentação, como dentro de uma placa de Petri padrão (cerca de 100 mm de diâmetro). Em algumas configurações, o tubo é um tubo capilar de plástico com um diâmetro interno de cerca de 0,90 mm, um diâmetro externo de cerca de 1,60 mm e uma espessura de parede de cerca de 0,70 mm.

[0017] 0 tubo pode ser fechado em uma ou ambas as extremidades para impedir a drenagem da solução liquida.

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 11/40

7/31

Qualquer material pode ser usado para fechar as extremidades do tubo, incluindo uma tampa, filme plástico, filme de parafina plástica ou cera, entre outros. Alternativamente, o tubo pode ser aquecido para derreter as extremidades do tubo fechado. É possível adicionar líquido extra ao recipiente de alimentação a fim de impedir a evaporação da solução de dieta do tubo de alimentação. Em algumas configurações, adiciona-se cerca de 0,2 mL, cerca de 0,4 mL, cerca de 0,5 mL, cerca de 0,6 mL, cerca de 0,7 mL ou cerca de 1,0 mL de água ao recipiente de alimentação com o tubo de alimentação. A água utilizada no ensaio pode ser de qualquer origem ou composição e pode ser purificada para reduzir o conteúdo microbiano e outras formas de contaminação. Em configurações específicas, a água é água desionizada (diH2O), água de osmose inversa (roH20), água filtrada, água destilada, água de nascente ou água da torneira. Em algumas configurações, a água pode ser autoclavada antes de ser utilizada no ensaio de alimentação aqui divulgado. A água adicionada ao recipiente de alimentação pode ser adicionada diretamente ao recipiente ou pode ser adicionada a um material absorvente no recipiente. Em algumas configurações, a água autoclavada é adicionada a uma almofada de filtro ou papel de filtro no recipiente de alimentação. O líquido extra pode ser adicionado ao recipiente de alimentação antes ou depois de colocar os insetos. Em algumas configurações, o líquido extra é adicionado a uma almofada de placa de Petri dentro ou fora do recipiente de alimentação da placa de Petri. Em configurações específicas, a água autoclavada pode ser adicionada ao papel de filtro fora do

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 12/40

8/31 recipiente de alimentação da placa de Petri e ser posteriormente transferida para o recipiente de alimentação. [0018] Um ou mais orifícios podem ser feitos no tubo de alimentação para permitir que um inseto perfurador ou sugador se alimente da solução de dieta contida dentro do tubo. Os orifícios do tubo devem ter diâmetro suficiente para permitir que um inseto perfurador ou sugador se alimente da solução de dieta. Assim, o diâmetro dos orifícios pode variar com base na capacidade de cada inseto perfurador ou sugador para ter acesso à solução de dieta. Em configurações especificas, os orificios podem ser feitos no tubo utilizando uma agulha de dissecação ou uma agulha de retalhamento, como uma agulha de retalhamento de calibre 19. Os orificios do tubo podem ter menos de cerca de 0,5 mm ou ter cerca de 0,5 mm, cerca de 0,6 mm, cerca de 0,7 mm, cerca de 0,8 mm, cerca de 0,9 mm, cerca de 1,0 mm, cerca de 1,1 mm, cerca de 1,2 mm, cerca de 1,3 mm, cerca de 1,4 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 1,7 mm, cerca de 2,0 mm, cerca de 2,5 mm, cerca de 3,0 mm ou mais, ou cerca de 0,5 mm a cerca de 2,0 mm, cerca de 0,8 mm a cerca de 1,4 mm ou cerca de 0,9 mm a cerca de 1,2 mm.

[0019] O tubo pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,

12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 ou mais orificios. Quando o tubo tiver mais de um orifício, os orificios devem estar a uma distância suficiente um do outro para permitir que vários insetos perfuradores ou sugadores se alimentem simultaneamente de diferentes orificios. Por exemplo, os orificios podem estar a pelo menos 2 mm, pelo menos 3 mm, pelo menos 4 mm, pelo menos 5 mm, pelo menos 6 mm, pelo menos 7 mm, pelo menos 8 mm,

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 13/40

9/31 pelo menos 9 mm, pelo menos 10 mm, pelo menos 12 mm, pelo menos 15 mm, ou pelo menos de 2 a 20 mm, pelo menos de 4 a 15 mm, pelo menos de 6 a 12 mm, ou pelo menos de 8 a 10 mm de distância um do outro.

[0020] Em determinadas configurações, o tubo está localizado dentro de um recipiente de alimentação. Qualquer recipiente de alimentação pode ser usado para impedir a fuga do inseto perfurador ou sugador e permitir o acesso do inseto ao tubo de alimentação e à solução da dieta. Em configurações específicas, o recipiente de alimentação permite que o ar chegue até o interior do recipiente (ou seja, não é hermético). Por exemplo, o recipiente de alimentação pode ser uma placa de Petri onde são colocados o tubo de alimentação e o inseto perfurador ou sugador. Em algumas configurações, mais do que um tubo de alimentação pode estar localizado dentro de um único recipiente de alimentação. Por exemplo, um recipiente de alimentação pode conter 2, 3, 4 ou 5 tubos de alimentação, conforme aqui descrito.

III. Métodos de alimentação [0021] O aparelho de alimentação aqui descrito pode ser utilizado para alimentar insetos perfuradores ou sugadores a fim de avaliar a atividade inseticida de um agente de interesse. Qualquer inseto perfurador ou sugador pode ser colocado em um recipiente de alimentação compreendendo o tubo com a solução de dieta aqui descrita. Os insetos podem ser colocados no recipiente de alimentação ou no aparelho de alimentação usando qualquer meio adequado para transferir insetos perfuradores ou sugadores sem feri-los. Por exemplo,

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 14/40

10/31 os insetos podem ser colocados no recipiente de alimentação usando uma pinça com ponta de penas ou uma aspiradora a vácuo. Em algumas configurações, um inseto de interesse é infestado em uma planta de interesse utilizando uma escova de pelo de camelo umedecida, de modo tal que nem o inseto de interesse nem a planta de interesse sejam feridos. Opcionalmente, gás dióxido de carbono pode ser usado para derrubar, atordoar ou anestesiar os insetos antes da infestação. Alternativamente, qualquer outro meio quimico ou mecânico pode ser usado para derrubar os insetos antes da infestação.

[0022] Qualquer espécie de inseto perfurador ou sugador ou uma combinação de espécies pode ser colocada no recipiente de alimentação. Em algumas configurações, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos de 2 a 11, pelo menos de 4 a 10, ou pelo menos de 6 a 8 insetos são colocados no recipiente de alimentação. Em configurações especificas, 5 insetos são colocados no recipiente de alimentação para o ensaio de alimentação. Em configurações especificas, o tamanho de todos os insetos em um único recipiente de alimentação é consistente, de modo tal que os insetos maiores não canibalizem os insetos menores. Por exemplo, o tamanho de cada inseto pode ser de 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou mais, em comparação com outro inseto em um único recipiente de alimentação. O tamanho do inseto pode se referir à altura,

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 15/40

11/31 peso, circunferência ou qualquer outra medida objetiva ou subjetiva do tamanho do inseto.

[0023] Os insetos empregados no método aqui divulgado podem ser usados em qualquer estágio de desenvolvimento em que o inseto for capaz de utilizar dieta liquida como fonte de alimento.Por exemplo, os insetos podem ser usados após o primeiro instar, durante o segundo instar, terceiro instar, quarto instar, quinto instar ou qualquer outro estágio de desenvolvimento ou crescimento adulto. Conforme aqui utilizado, o termo instar é usado para denotar o estágio de desenvolvimento das formas larvais ou ninfais dos insetos. Em configurações especificas, os percevejos marrons marmorizados ou os percevejos verdes do sul são selecionados no estágio do segundo instar para sua utilização no método aqui divulgado. Em outras configurações, os percevejos do kudzu são selecionados no estágio do quarto instar para sua utilização no método aqui divulgado. Em configurações especificas, os insetos do gênero Lygus são selecionados no estágio do terceiro instar para sua utilização nos métodos aqui divulgados. Em algumas configurações, os pulgões são selecionados no estágio de crescimento adulto para sua utilização nos métodos aqui divulgados.

[0024] Conforme aqui utilizado, um inseto perfurador ou sugador possui peças bucais especificamente concebidas para perfuração e sucção.Os insetos perfuradores e sugadores são particularmente capazes de danificar o tecido das plantas inserindo suas peças bucais no tecido da planta e extraindo líquidos. As plantas muito infestadas tornam-se amarelas,

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 16/40

12/31 murcham, ficam deformadas ou raquíticas e podem terminar morrendo. Alguns insetos sugadores injetam materiais tóxicos na planta enquanto se alimentam e alguns transmitem organismos patogênicos. Exemplos de insetos perfuradores e sugadores incluem, mas não se limitam a, pulgões, cigarrinhas, percevejos, percevejos manchados, bichos da abóbora, tripes, ácaros-aranha e mosquitos. Em configurações especificas, os insetos utilizados nos métodos aqui divulgados podem ser selecionados das ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente da Hemiptera. Em algumas configurações, as pragas de insetos incluem insetos Pentatomidae. Conforme aqui utilizado, o termo inseto se refere a um inseto em qualquer estágio de desenvolvimento, incluindo uma ninfa de inseto e um inseto adulto.

[0025] Pragas de insetos comuns nos principais cultivos incluem: Soja: Aphis glycines, pulgão da soja; Euschistus (E. biformis, E. integer, E. quadrator, E. servus, E. tristigma), percevejo marrom norte-americano; Piezodorus guildinii, percevejo verde pequeno da soja; Pseudoplusia includens, lagarta falsa-medideira; Anticarsia gemmatalis, lagarta da soja; Plathypena scabra, lagarta verde do trevo; Ostrinia nubilalis, broca europeia do milho; Agrotis ipsilon, lagarta negra; Spodoptera exigua, lagarta do cartucho da beterraba; Heliothis virescens, lagarta das maçãs; Helicoverpa zea, lagarta do algodão; Epilachna varivestis, besouro mexicano do feijão; Myzus persicae, pulgão verde do pêssego; Empoasca

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 17/40

13/31 fabae, cigarrinha da batata; Acrosternum hilare, percevejo verde; Nezara viridula, percevejo verde da soja; Halyomorpha halys, percevejo marrom marmorizado; Megacopta cribraria, percevejo do kudzu; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de perna vermelha; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Hylemya platura, verme da semente do milho; Sericothrips variabilis, tripes da soja; Thrips tabaci, tripes da cebola; Tetranychus turkestani, ácaro-aranha do morango; Eetranychus urticae, ácaro-aranha de duas manchas; Milho: Halyomorpha halys, percevejo marrom marmorizado; Euschistus (E. biformis, E. integer, E. quadrator, E. servus, E. tristigma), percevejo marrom norte-americano, Acrosternum hilare, percevejo verde; Nezara viridula, percevejo verde da soja; Bagrada hilaris, percevejo Bagrada; Ostrinia nubilalis, broca europeia do milho; Agrotis ipsilon, lagarta negra; Helicoverpa zea, lagarta da espiga; Spodoptera frugiperda, lagarta do cartucho do milho; Diatraea grandiosella, broca do milho do sudoeste; Elasmopalpus lignosellus, lagarta-elasmo; Diatraea saccharalis, broca da cana-de-açúcar; Diabrotica virgifera, lagarta da raiz do milho ocidental; Diabrotica longicornis barberi, lagarta da raiz do milho do norte; Diabrotica undecimpunctata howardi, lagarta da raiz do milho do sul; espécies de pragas da familia Elateridae, incluindo espécies dos gêneros Aeolus, Agriotes, Conoderus, Hemicrepidus e Limonius; Melanotus spp., pirilampos; Cyclocephala borealis, escaravelho mascarado do norte (larva branca); Cyclocephala immaculata, escaravelho mascarado do sul (larva branca); Popillia j aponica, besouro japonês; Chaetocnema pulicaria,

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 18/40

14/31 besouro da pulga do milho; Sphenophorus maidis, percevejo do milho; Rhopalosiphum maidis, pulgão da folha do milho; Anuraphis maidiradicis, pulgão da raiz do milho; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo das gramineas; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de perna vermelha; Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migratório; Hylemya platura, verme da semente do milho; Agromyza parvicornis, larva da mancha do milho; Anaphothrips obscrurus, tripes da grama; Solenopsis milesta, formiga-ladra; Tetranychus urticae, ácaro-aranha de duas manchas; Sorgo: Chilo partellus, broca do sorgo; Spodoptera frugiperda, lagarta do cartucho do milho; Helicoverpa zea, lagarta da espiga; Elasmopalpus lignosellus, lagarta-elasmo; Feltia subterrânea, lagarta-rosca; Phyllophaga crinita, larva branca; Eleodes, Conoderus e Aeolus spp., pirilampos; Oulema melanopus, larva-lesma; Chaetocnema pulicaria, besouro da pulga do milho; Sphenophorus maidis, percevejo do milho; Rhopalosiphum maidis, pulgão da folha do milho; Sipha fiava, pulgão amarelo da cana-de-açúcar; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo das gramineas; Contarinia sorghicola, mosca do sorgo; Tetranychus cinnabarinus, ácaroaranha carmim; Tetranychus urticae, ácaro-aranha de duas manchas; Trigo: Eurygaster integriceps, praga de Sunn; Diuraphis noxia, pulgão russo do trigo; Pseudaletia unipunctata, lagarta do cartucho; Spodoptera frugiperda, lagarta do cartucho do milho; Elasmopalpus lignosellus, lagarta-elasmo; Agrotis orthogonia, agrotis ocidental;

Elasmopalpus lignosellus, lagarta-elasmo; Oulema melanopus, larva-lesma; Hypera punctata, caruncho da folha do trevo;

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 19/40

15/31

Diabrotica undecimpunctata howardi, lagarta da raiz do milho do sul; pulgão russo do trigo; Schizaphis graminum, pulgão verde dos cereais; Macrosiphum avenae, pulgão da espiga do trigo; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de perna vermelha; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migratório; Mayetiola destructor, mosca-de-hesse; Sitodiplosis mosellana, verme do trigo; Meromyza americana, verme do talo do trigo; Hylemya coarctata, mosca do bulbo do trigo; Frankliniella fusca, tripes do fumo; Cephas cinctus, mosca do talo do trigo; Aceria tulipae, eriofideo do alho; Girassol: Suleima helianthana, traça do botão do girassol; Homoeosoma electellum, traça do girassol; Zygogramma exclamationis, besouro do girassol; Bothyrus gibbosus, besouro da cenoura; Neolasioptera murtfeldtiana, mosca da semente do girassol; Algodão: Heliothis virescens, lagarta das maçãs; Helicoverpa zea, lagarta do algodão; Spodoptera exigua, lagarta do cartucho da beterraba; Pectinophora gossypiella, lagarta rosada; Anthonomus grandis, bicudo do algodoeiro; Aphis gossypii, pulgão do algodoeiro; Pseudatomoscelis seriatus, pulga saltadora do algodoeiro; Trialeurodes abutilonea, mosca branca; Lygus lineolaris, percevejo opaco da planta; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de perna vermelha; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Thrips tabaci, tripes da cebola; Franklinkiella fusca, tripes do fumo; Tetranychus cinnabarinus, ácaro-aranha carmim; Tetranychus urticae, ácaro-aranha de duas manchas; Arroz: Diatraea saccharalis, broca da cana-de-açúcar;

Spodoptera frugiperda, lagarta do cartucho do milho;

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 20/40

16/31

Helicoverpa zea, lagarta da espiga; Colaspis brunnea, vaquinha; Lissorhoptrus oryzophilus, caruncho da água do arroz; Sitophilus oryzae, caruncho do arroz; Nephotettix nigropictus, cigarrinha do arroz; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo das gramineas; Acrosternum hilare, percevejo verde; Cevada: Ostrinia nubilalis, broca europeia do milho; Agrotis ipsilon, lagarta negra; Schizaphis graminum, pulgão verde dos cereals; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo das gramineas; Acrosternum hilare, percevejo verde; Euschistus servus, percevejo marrom norte-americano; Delia platura, verme da semente do milho; Mayetiola destructor, mosca-de-hesse; Petrobia latens, ácaro marrom do trigo; Colza: Brevicoryne brassicae, pulgão da couve; Phyllotreta cruciferae, besouro-pulga; Mamestra configurata, lagarta do cartucho bertha; Plutella xylostella, traça das cruciferas; Delia ssp., vermes da raiz.

[0026] Conforme aqui utilizado, o termo insetos Pentatomidae se refere a qualquer membro da familia Pentatomidae. Por conseguinte, os métodos aqui divulgados são também úteis na avaliação da resistência de plantas a qualquer inseto Pentatomidae, incluindo gêneros e espécies representativos como, mas não limitados a, Acrocorisellus (A. serraticollis), Acrosternum (A. adelpha, A. hilare, A. herbidum, A. scutellatum), Agonoscelis (A. nubila), Alcaeorrhynchus (A. grandis, A. phymatophorus), Amaurochrous (A. brevitylus), Apateticus (A. anatarius, A. bracteatus, A. cynicus, A. lineolatus, A. marginiventris), Apoecilus, Arma (A. custos), Arvelius, Bagrada, Banasa (B. calva, B. dimiata,

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 21/40

17/31

B. grisea, B. induta, B. sórdida), Brochymena (B. affinis, B. cariosa, B. haedula, B. hopping!, B. sulcata) , Carbula (C. obtusangula, C. sinica) , Chinavia, Chlorochroa (C. belfragii,

C. kanei, C. norland!, C. senilis, C. viridicata), Chlorocoris

(C. distinctus,	C. flaviviridis,	C. hebetatus, C. subrugosus,
C. tau), Codophila (C. remota, C.	sulcata, C	. varius), Coenus
(C. delius, C	inermis, C.	tarsalis),	Cosmopepla	(C.
bimaculata, C.	binotata, C.	carnifex,	C. decorata,	c.
intergressus),	Dalpada (D.	oculata),	Dendrocoris	(D.
arizonesis, D.	fruticicola, D.	humeralis,	D. parapini,	D.

reticulatus), Dolycoris (D. baccarum (percevejo cabeludo)), Dybowskyia (D. reticulata), Edessa, Erthesina (E. fullo), Eurydema (E. dominulus, E. gebleri (percevejo escudo), E. pulchra, E. rugosa), Euschistus (E. biformis, E. integer, E. quadrator, E. servus, E. tristigma) , Euthyrhynchus (E. floridanus, E. macronemis), Gonopsis (G. coccinea), Graphosoma (G. lineatum (percevejo), G. rubrolineatum), Halyomorpha (H. halys (percevejo marrom marmorizado)), Halys (H. sindillus, H. sulcatus) , Holcostethus (H. abbreviatus, H. fulvipes, H. limbolarius, H. piceus, H. sphacelatus), Homalogonia (H. obtusa), Hymenarcys (H. aequalis, H. crassa, H. nervosa, H. perpuncata, H. reticulata), Lelia (L. decempunctata), Lineostethus, Loxa (L. flavicollis, L. viridis) , Mecidea (M. indicia, M. major, M. minor), Megarrhamphus (M. hastatus), Menecles (M. insertus, M. portacrus), Mormidea (M. cubrosa, M. lugens, M. pama, M. pictiventris, M. ypsilon), Moromorpha (M. tetra), Murgantia (M. angularás, M. tessellata, M. varicolor, M. violascens) , Neottiglossa (N. californica, N. cavifrons, N.

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 22/40

18/31 coronaciliata, N. sulcifrons, N. undata), Nezara (N. smaragdulus, N. viridula (percevejo verde da soja)), Oebalus (0. grisescens, 0. insularis, 0. mexicanus, 0. pugnax, 0. typhoeus), Oechalia (0. schellenbergii (percevejo predador espinhado)), Okeanos (0. quelpartensis), Oplomus (0. catena,

O. dichrous, 0. tripustulatus), Palomena (P. prasina (percevejo verde comum)), Parabrochymena, Pentatoma (P. angulata, P. illuminata, P. j aponica, P. kunmingensis, P. metallifera, P. parataibaiensis, P. rufipes, P. semiannulata,

P. viridicornuta) , Perillus (P. bioculatus, P. confluens, P. strigipes), Picromerus (P. griseus), Piezodorus (P. degeeri, P. guildinii, P. lituratus (percevejo do campo)), Pinthaeus (P. humeralis), Plautia (P. crossota, P. stall (percevejo verde de asa marrom)), Podisus (P. maculiventris), Priassus (P. testaceus), Prionosoma, Proxys (P. albopunctulatus, P.

punctulatus, P. victor), Rhaphigaster (R. nebulosa) , Scotinophara (S. horvathi), Stiretrus (S. anchorago, S. fimbriatus), Thyanta (T. accerra, T. calceata, T. casta, T. perditor, T. pseudocasta), Trichopepla (T. aurora, T. dubia, T. pilipes, T. semivittata, T. vandykei), Tylospilus e Zicrona.

[0027] Em algumas configurações, o inseto perfurador ou sugador é um inseto capaz de infestar ou ferir seres humanos e/ou animais tais como, mas não limitados a, aqueles com peças bucais de perfuração e sucção, conforme os encontrados em Hemiptera e em alguns Hymenoptera e Diptera como mosquitos, abelhas, vespas, piolhos, pulgas e formigas, bem como membros dos Arachnidae como carrapatos e ácaros da ordem, classe ou

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 23/40

19/31 família dos Acarina (carrapatos e ácaros), por ex., representantes das famílias Argasidae, Dermanyssidae, Ixodidae, Psoroptidae ou Sarcoptidae e representantes das espécies Amblyomma spp., Anocentor spp., Argas spp., Boophilus spp., Cheyletiella spp., Chorioptes spp., Demodex spp., Dermacentor spp. , Denmanyssus spp. , Haemophysalis spp. , Hyalomma spp. , Ixodes spp. , Lynxacarus spp. , Mesostigmata spp., Notoedres spp., Ornithodoros spp., Ornithonyssus spp., Otobius spp., Otodectes spp., Pneumonyssus spp., Psoroptes spp. , Rhipicephalus spp., Sarcoptes spp. ou Trombicula spp. ; Anoplura (piolhos sugadores e mordedores) por ex. . representantes das espécies Bovicola spp., Haematopinus spp. , Linognathus spp., Menopon spp., Pediculus spp., Pemphigus spp., Phylloxera spp. ou Solenopotes spp.; Diptera (moscas) por ex. . representantes das espécies Aedes spp., Anopheles spp. , Calliphora spp., Chrysomyia spp., Chrysops spp. , Cochliomyia spp., Culex spp., Culicoides spp., Cuterebra spp., Dermatobia spp., Gastrophilus spp., Glossina spp., Haematobia spp., Haematopota spp., Hippobosca spp., Hypoderma spp., Lucilia spp., Lyperosia spp., Melophagus spp., Oestrus spp. , Phaenicia spp., Phlebotomus spp., Phormia spp., Sarcophaga spp., Simulium spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia spp. ou Tipula spp.; Mallophaga (piolhos mordedores) por ex. representantes das espécies Damalina spp., Felicola spp. , Heterodoxus spp. ou Trichodectes spp.; ou Siphonaptera (insetos sem asas) por ex. representantes das espécies Ceratophyllus spp., spp., Pulex spp. ou Xenopsylla spp; Cimicidae (percevejos verdadeiros) por ex. representantes das

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 24/40

20/31 espécies Cimex spp., Tritominae spp., Rhodinius spp. ou Triatoma spp.

[0028] Os insetos podem ser mantidos no recipiente de alimentação o tempo que for necessário para avaliar a atividade inseticida do agente de interesse na solução de dieta liquida. Em configurações especificas, o inseto perfurador ou sugador é mantido no recipiente de alimentação durante pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10,

pelo	menos	12,	pelo	menos	13,	pelo menos 14,	pelo menos	15,
pelo	menos	16,	pelo	menos	17,	pelo menos 18,	pelo menos	19,
pelo	menos	20,	pelo	menos	de	2 a 18, pelo menos de 5 a	10,
pelo	menos	de	6 a	14 ou	pelo menos de 8	a 12 dias	. A

quantidade de tempo no recipiente de alimentação pode variar dependendo da espécie do inseto e/ou do agente potencialmente inseticida sob avaliação.

[0029] O tempo que uma ninfa de inseto pode sobreviver sem comida vai mudando à medida que a ninfa amadurece. Por exemplo, no estágio do segundo instar, uma ninfa pode sobreviver na água sem qualquer fonte de alimento por pelo menos 5 a 15 dias, 6 a 12 dias, 7 a 10 dias ou 8 a 9 dias. Especificamente, uma ninfa de segundo instar pode sobreviver na água sem nenhuma fonte de alimento durante cerca de 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias ou 15 dias. Analogamente, no estágio de quarto ou quinto instar, uma ninfa pode sobreviver na água sem nenhuma fonte de alimento por pelo menos 8 a 21 dias, 10 a 18 dias, 12 a 14 dias ou 12 a 16 dias. Especificamente, uma ninfa

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 25/40

21/31 de quarto instar pode sobreviver na água sem nenhuma fonte de alimento durante 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias ou 21 dias. O tempo que uma ninfa de inseto consegue sobreviver na água sem nenhuma fonte de alimento pode variar com base em condições ambientais como temperatura, umidade e luz, entre outras.

[0030] Por exemplo, os percevejos marrons marmorizados e os percevejos verdes da soja no estágio de segundo instar podem sobreviver por cerca de 7 dias sem uma fonte de alimento, enquanto os percevejos do kudzu no estágio de quarto instar podem sobreviver por cerca de 14 dias sem uma fonte de alimento.Assim, em certas configurações, os percevejos marrons marmorizados ou os percevejos verdes da soja são selecionados no estágio de segundo instar, adicionados a um recipiente de alimentação e mantidos em um ambiente fechado durante pelo menos cerca de 7 dias. Os insetos podem ser mantidos no recipiente de alimentação em condições normais de temperatura ambiente e umidade. As condições de temperatura podem variar de cerca de 20 °C a cerca de 37 °C, incluindo cerca de 23 °C, cerca de 24 °C, cerca de 25 °C, cerca de 26 °C, cerca de 27 °C e cerca de 30 °C. As condições de umidade relativa podem variar de cerca de 50% a cerca de 90%, de 60% a 80%, de 65% a 75% de umidade relativa, incluindo pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75% ou pelo menos cerca de 80% de umidade relativa. Em configurações especificas, os insetos são mantidos a 25 °C e a pelo menos cerca de 75% de umidade relativa.

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 26/40

22/31 [0031] Em configurações particulares, a quantidade de luz fornecida durante o ensaio de alimentação pode ser alterada para imitar as condições diurnas e noturnas normais. Por exemplo, o ensaio de alimentação pode ser conduzido com um ciclo dia-noite de 24:0 (ciclo dia:noite), ciclo dia-noite de 20:4, ciclo dia-noite de 18:6, ciclo dia-noite de 16:8, ciclo dia-noite de 14:10, ciclo dia-noite de 12:12, ciclo dia-noite de 10:14, ciclo dia-noite de 8:16, ciclo dia-noite de 6:18, ciclo dia-noite de 4:20 ou ciclo dia-noite de 0:24. Em um ciclo dia-noite 16:8, os insetos são mantidos com 16 horas de luz e 8 horas de escuridão. Em configurações especificas, os insetos são mantidos a 25 °C e a pelo menos cerca de 75% de umidade relativa, com um ciclo dia-noite de 16:8.

[0032] Em certas configurações, os insetos que se alimentem da solução de dieta contendo um agente inseticida de interesse não sobreviverão como teriam sobrevivido consumindo a mesma solução de dieta, porém sem o agente inseticida de interesse. Nestas circunstâncias, o agente de interesse pode ser avaliado como um agente que possui atividade inseticida. Conforme aqui utilizado, a atividade inseticida de um agente se refere à capacidade do agente, ao ser consumido por um inseto perfurador ou sugador em uma solução de dieta, para impedir que o inseto sobreviva, considerando que o inseto teria sobrevivido consumindo a mesma solução de dieta sem o agente. Do mesmo modo, uma solução de dieta de controle se refere a uma solução de dieta compreendendo uma fonte de alimento para manter um inseto vivo, porém sem um agente inseticida. A atividade inseticida pode ser medida calculando a % de

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 27/40

23/31 mortalidade ( [n° de mortes de insetos / total de insetos] x 100), LD50 ou LC50. A % de mortalidade pode ser avaliada desde o dia 2 ao 25, dia 3 ao 12, dia 5 ao 10 ou dia 7 ao 15 após a adição ao recipiente de alimentação, ou então a cada 3 dias, a cada 4 dias, a cada 5 dias, a cada 6 dias ou a cada 7 dias. O dia em que a % de mortalidade é avaliada pode variar com base na espécie do inseto e no agente sob avaliação.

[0033] Também é proporcionado um agente inseticida de acordo com o método aqui divulgado. Em algumas configurações, os agentes selecionados foram avaliados executando o método aqui divulgado uma única vez. Em outra configuração, um agente é selecionado após ser avaliado usando o método aqui divulgado diversas vezes, incluindo 1 repetição, 2 repetições, 3 repetições, 4 repetições, 5 repetições, 6 repetições, 7 repetições, 8 repetições, 9 repetições, 10 repetições, 12 repetições, 15 repetições ou 20 repetições do método de avaliação aqui divulgado.

[0034] Os artigos um e uma são aqui utilizados para se referir a um ou mais de um (ou seja, a pelo menos um) objeto qramatical do artigo. A titulo de exemplo, um elemento significa um ou mais elementos.

[0035] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados na especificação são indicativos do nivel dos especialistas na técnica à qual esta divulgação pertence. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incorporados como referência de igual maneira como se cada publicação ou pedido de patente em particular fosse

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 28/40

24/31 especificamente e individualmente indicado para ser incorporado como referência.

[0036] Embora a invenção anterior tenha sido descrita em algum detalhe por meio de ilustrações e exemplos para fins de clareza de compreensão, é elementar ressaltar que certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas.

[0037] Configurações não-limitantes incluem:

1. Um aparelho para a alimentação de insetos perfuradores e sugadores compreendendo um tubo capilar com pelo menos um orifício de alimentação e um fecho na extremidade, em que o referido tubo capilar contém uma solução de dieta para um inseto perfurador ou sugador.

2. O aparelho da configuração 1, em que a solução de dieta compreende sacarose.

3. O aparelho da configuração 1 ou 2, em que a solução de dieta compreende uma cultura microbiana, um lisado celular ou uma proteína.

4. O aparelho da configuração 3, em que a cultura microbiana ou lisado celular compreende uma proteína com atividade inseticida contra o inseto perfurador ou sugador ou proteína possui atividade inseticida contra o inseto perfurador ou sugador.

5. O aparelho de qualquer uma das configurações 1 a 4, em que a referida solução de dieta compreende um agente antifúngico.

6. O aparelho de qualquer uma das configurações 1 a 5, em que o tubo capilar está fechado em ambas as extremidades.

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 29/40

25/31

7. 0 aparelho de qualquer uma das configurações 1 a 6, em que o tubo capilar compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,

8, 9 ou 10 orifícios de alimentação.

8. O aparelho da configuração 7, em que o tubo capilar compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 orifícios de alimentação, em que os orifícios de alimentação estão espaçados com 6 a 12 mm de distância.

9. O aparelho de qualquer uma das configurações 1 a 8, em que cada orifício de alimentação tem um diâmetro suficiente para maximizar a alimentação do inseto perfurador ou sugador.

10. O aparelho da configuração 9, em que cada orifício de alimentação possui de 0,5 a 2 mm de diâmetro.

11. O aparelho de qualquer uma das configurações 1 a 10, em que o referido tubo capilar está dentro de um recipiente de alimentação.

12. Um método para a alimentação de um inseto perfurador ou sugador, método que compreende colocar pelo menos um inseto perfurador ou sugador em um recipiente de alimentação, em que o recipiente de alimentação compreende um tubo capilar com pelo menos um orifício de alimentação e um fecho na extremidade, em que o referido tubo capilar contém uma solução de dieta para um inseto perfurador ou sugador.

13. O método da configuração 12, em que a solução de dieta compreende sacarose.

14. O método da configuração 12 ou 13, em que a solução de dieta compreende uma cultura microbiana, um lisado celular ou uma proteína.

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 30/40

26/31

15. 0 método de qualquer uma das configurações 12 a 14, em que a cultura microbiana ou lisado celular compreende uma proteina com atividade inseticida contra o inseto perfurador ou sugador ou a proteina possui atividade inseticida contra o

inseto	perfurador	ou sugador.
16.	0	método de	qualquer	uma	das	configurações	12 a	15,	em
que	a	referida	solução	de	dieta compreende	um	agente
antifúngico.
17.	0	método de	qualquer	uma	das	configurações	12 a	16,	em
que	o tubo capilar está fechado	em	ambas as extremidades.
18 .	0	método de	qualquer	uma	das	configurações	12 a	17,	em

que o tubo capilar compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,

8, 9 ou 10 orifícios de alimentação.

19. O método da configuração 18, em que o tubo capilar compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 orifícios de alimentação, em que os orifícios de alimentação estão espaçados com 6 a 12 mm de distância.

20. O método de qualquer uma das configurações 12 a 19, em que cada orifício de alimentação tem um diâmetro suficiente para maximizar a alimentação do inseto perfurador ou sugador.

21. O método da configuração 20, em que cada orifício de alimentação possui de 0,5 a 2 mm de diâmetro.

22. O método de qualquer uma das configurações 12 a 21, em que o pelo menos um inseto perfurador ou sugador é colocado no recipiente de alimentação utilizando uma pinça com ponta de penas ou uma aspiradora a vácuo.

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 31/40

27/31

23. 0 método de qualquer uma das configurações 12 a 22, em que 2 a 11 insetos perfuradores ou sugadores são colocados no recipiente de alimentação.

24. 0 método da configuração 23, em que o tamanho de cada inseto perfurador ou sugador está dentro de 70% do tamanho dos outros insetos perfuradores ou sugadores no recipiente de alimentação.

25. O método de qualquer uma das configurações 12 a 24, em que pelo menos um inseto perfurador ou sugador é colocado no recipiente de alimentação entre o estágio de segundo instar e o estágio de quinto instar.

26. 0 método	de	qualquer uma das	configurações 12 a	25, em
que o referido	inseto perfurador	ou	sugador é um	inseto
Hemiptera.
27. 0 método	da	configuração 26,	em	que o referido	inseto
Hemiptera é um	inseto Pentatomidae.
28. 0 método	da	configuração 27,	em	que o referido	inseto
Pentatomidae	é	um percevejo	verde, percevejo	marrom

marmorizado, percevejo verde da soja, percevejo do arroz ou percevejo de perna vermelha.

29. O método de qualquer uma das configurações 12 a 28, compreendendo, ainda, manter pelo menos um inseto perfurador ou sugador no recipiente de alimentação durante cerca de 6 a 14 dias.

30. O método da configuração 29, em que cerca de 0,1 a 1 mL de água é adicionado ao recipiente de alimentação a cada 2 a 6 dias.

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 32/40

28/31

31. 0 método da configuração 29 ou 30, método que compreende, ainda, medir a mortalidade após 3 dias, após 4 dias, após 5 dias, após 6 dias, após 7 dias, após 8 dias, após 9 dias, após 10 dias, após 11 dias e/ou após 12 dias.

[0038] Os exemplos a seguir são oferecidos a título de ilustração e não a título de limitação.

EXPERIMENTAL

Exemplo 1. Ensaio de alimentação do percevejo verde da soja [0039] O bioensaio dos insetos foi realizado com duas repetições de cinco ninfas de 2^o instar do percevejo verde da soja (Southern green stink bug - SGSB) por tratamento. A unidade do bioensaio estava composta por uma placa de Petri revestida com papel-filtro contendo dois tubos capilares cheios de substâncias de teste de proteínas ou de micróbios em uma dieta líquida para insetos (10% de sacarose em água). Tubos capilares (tubo capilar de plástico para microhematócritos da Globe Scientific Inc., liso e de ponta azul) foram cortados ao meio usando uma lâmina de barbear de modo que seus comprimentos finais foram de aproximadamente 37,5 mm cada. Quatro furos, a uma distância aprox. de 8 a 9 mm, foram feitos ao longo de uma das laterais de cada tubo capilar para criar locais onde os insetos pudessem se alimentar usando uma agulha de retalhamento (agulha de retalhamento BioQuip, ponta reta) . 25 μΐ de cada amostra de proteína ou micróbio foram pipetados em cada tubo capilar. As extremidades de cada tubo foram então vedadas com cera ou com uma tampa. Dois tubos capilares com seus orifícios voltados para cima foram colocados em uma placa de Petri de 60 x 15 mm contendo uma

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 33/40

29/31 almofada de filtração umedecida com 0,25 ml do diH2O autoclavado. Cinco percevejos verdes da soja de segundo instar foram então adicionados usando uma pinça com ponta de penas ou uma aspiradora a vácuo na placa de Petri antes de fechar a placa com sua tampa. Para cada bioensaio, foram testados controles positivos e negativos adequados de micróbios ou proteínas, juntamente com os tratamentos. Para cada repetição, a porcentagem de mortalidade foi determinada nos dias 6 e 8. Ao calcular a LC50 para um determinado micróbio ou proteina, a mortalidade porcentual foi avaliada dos dias 5 a 10. Ao longo da duração do bioensaio, as placas de Petri foram armazenadas em uma câmara ambiental controlada a 25 °C e > 75% de umidade relativa com um ciclo dia-noite de 16:8.

[0040] Quadro 1. Mortalidade porcentual média de ninfas de segundo instar de percevejos verdes da soja que receberam tratamentos de proteínas ou um controle apenas com dieta nos tubos capilares. (n = 2 repetições de 10 percevejos por tratamento e 20 percevejos por repetição para o controle da dieta de sacarose).

	Mortalidade % média
Tratamento (ppm)	Dia 4	Dia 5	Dia 6	Dia 7	Dia 8
Controle positivo de proteína (9000)	80	80	80	90	100

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 34/40

30/31

Controle positivo de proteina (4000)	70	90	100	100	100
Controle positivo de proteina (2000)	10	20	50	70	80
Controle positivo de proteina (1000)	0	10	20	20	20
Controle positivo de proteina (500)	0	0	0	0	0
Controle positivo de proteina (250)	0	0	0	10	20
Controle com dieta de sacarose (20 SGSB)	0	0	0	10	15

Exemplo 2. Ensaio de alimentação de insetos Lygus [0041] O bioensaio de Lygus foi realizado com quatro repetições de cinco ninfas de insetos Lygus de terceiro instar por tratamento. A unidade de bioensaio estava composta por uma placa de Petri revestida com papel-filtro contendo três tubos

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 35/40

31/31 capilares cheios de substâncias de teste de proteínas ou de micróbios em uma dieta líquida para insetos (10% de sacarose + aminoácidos em água). Os bioensaios foram realizados usando o mesmo formato que no Exemplo 1 com as modificações a seguir. Os bioensaios foram classificados quanto à mortalidade nos dias 3, 5 e 7 após a introdução de ninfas em unidades de bioensaio. As placas de Petri foram armazenadas em uma câmara ambiental controlada a 25 °C e > 75% de umidade relativa com ciclo dia-noite de 16:8.

[0042] Quadro 2. Mortalidade porcentual média (11 SEM) de ninfas de terceiro instar de percevejos manchados ocidentais (Lygus hesperus) que receberam tratamentos de proteínas ou um controle apenas com dieta nos tubos capilares. (n = 6 repetições de 5 insetos Lygus cada por tratamento e a dieta de controle).

	Mortalidade % média
Tratamento (ppm)	Dia 3	Dia 5	Dia 7
Controle positivo de proteína (2000)	43,3 1 6,1	93,3 1 4,2	100 1 0,0
Controle positivo de proteína (2000)	6,7 1 4,2	30,0 1 8,6	7 0,0 1 6, 8
Tampão (controle negativo)	13,3 ± 4,2	20,0 ± 5,2	43,3 1 6,1
Controle apenas com dieta	6,7 ± 4,2	13,3 ± 4,2	4 0,0 1 7,3

Petição 870190091251, de 13/09/2019, pág. 36/40

Claims

1. Um aparelho para a alimentação de insetos perfuradores ou sugadores, caracterizado por compreender um tubo capilar que tem pelo menos um orifício de alimentação, um encerramento de extremidade, em que o referido tubo capilar contém uma solução de dieta para um inseto perfurador ou sugador.

2. 0 aparelho da reivindicação 1, caracterizado por a solução de dieta compreender sacarose.

3. 0 aparelho da reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a solução de dieta compreender uma cultura microbiana, um lisado celular ou uma proteína.

4. 0 aparelho da reivindicação 3, caracterizado por a cultura microbiana ou lisado celular compreender uma proteína com atividade inseticida contra o inseto perfurador ou sugador ou a proteína tem atividade inseticida contra o inseto perfurador ou sugador.

5. 0 aparelho de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por que a referida solução de dieta compreender um agente antifúngico.

6. 0 aparelho de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o tubo capilar ser fechado em ambas as extremidades.

7. 0 aparelho de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por o tubo capilar compreender pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 orifícios de alimentação.

8. O aparelho da reivindicação 7, caracterizado por o tubo capilar compreender pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 orifícios de alimentação, em que os orifícios de alimentação são espaçados 6-12mm.

9. O aparelho de qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado por cada orifício de alimentação ser de um

Petição 870190067334, de 16/07/2019, pág. 89/93

2/4 diâmetro suficiente para maximizar a alimentação de o inseto perfurador ou sugador.

10. O aparelho da reivindicação 9, caracterizado por cada orifício de alimentação ter 0,5-2 mm de diâmetro.

11. O aparelho de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por o referido tubo capilar estar dentro de um recipiente de alimentação.

12. Um método para alimentação de um inseto perfurador ou sugador, caracterizado por o referido método compreender a colocação de pelo menos um inseto perfurador ou sugador dentro de um recipiente de alimentação, em que o recipiente de alimentação compreende um tubo capilar que tem pelo menos um orifício de alimentação, um encerramento de extremidade, em que o referido tubo capilar contém uma solução de dieta para um inseto perfurador ou sugador.

13. O método da reivindicação 12, caracterizado por a solução de dieta compreender sacarose.

14 . 0 método da reivindicação 12 ou 13, caracterizado por a solução de dieta compreender uma cultura microbiana, um lisado celular ou uma proteína. 15. 0 método da reivindicação 12 a 14, caracterizado por a

cultura microbiana ou lisado celular compreender uma proteína com atividade inseticida contra o inseto perfurador ou sugador ou a proteína tem atividade inseticida contra o inseto perfurador ou sugador.

16. O método de qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado por a referida solução de dieta compreender um agente antifúngico.

17. O método de qualquer uma das reivindicações 12 a 16, caracterizado por o tubo capilar ser fechado em ambas as extremidades.

Petição 870190067334, de 16/07/2019, pág. 90/93

3/4

18. 0 método de qualquer uma das reivindicações 12 a 17, caracterizado por o tubo capilar compreender pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 orifícios de alimentação.

19. O método da reivindicação 18, caracterizado por o tubo capilar compreender pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 orifícios de alimentação, em que os orifícios de alimentação

são espaçados 6-12mm. 20 . 0 método de qualquer uma das reivindicações 12 a 19, caracterizado por cada orifício de alimentação ser de um diâmetro suficiente para maximizar a alimentação do inseto perfurador ou sugador. 21 . 0 método da reivindicação 20, caracterizado por cada orifício de alimentação ter 0,5-2 mm de diâmetro. 22 . 0 método de qualquer uma das reivindicações 12 a 21,

caracterizado por o pelo menos um inseto perfurador ou sugador ser colocado no recipiente de alimentação usando uma pinça de ponta ou aspirador a vácuo.

23. O método de qualquer uma das reivindicações 12 a 22, caracterizado por 2-11 os insetos perfuradores ou sugadores serem colocados no recipiente de alimentação.

24. O método da reivindicação 23, caracterizado por o tamanho de cada inseto perfurador ou sugador estar dentro de 70% do tamanho dos outros insetos perfuradores ou sugadores no recipiente de alimentação.

25. O método de qualquer uma das reivindicações 12 a 24, caracterizado por o referido pelo menos um inseto perfurador ou sugador ser colocado no recipiente de alimentação entre o segundo instar e quinto instar.

26. O método de qualquer uma das reivindicações 12 a 25, caracterizado por o referido inseto perfurador ou sugador ser um inseto Hemíptera.

Petição 870190067334, de 16/07/2019, pág. 91/93

4/4

27. 0 método da reivindicação 26, caracterizado por o referido inseto Hemiptera ser um inseto Pentatomidae.

28. 0 método da reivindicação 27, caracterizado por o referido inseto Pentatomidae ser um percevejo verde, percevejo marrom marmorizado, percevejo verde do Sul, percevejo de arroz ou um inseto da floresta.

29. 0 método de qualquer uma das reivindicações 12 a 28, caracterizado por compreender ainda a manutenção de, pelo menos, um inseto perfurador ou sugador no recipiente de alimentação durante cerca de 6-14 dias.

30 . 0 método da reivindicação 29, caracterizado por cerca de 0,1 -1 ml de água ser adicionado ao recipiente de alimentação a cada 2-6 dias. 31. 0 método da reivindicação 29 ou 30, caracterizado por o método compreendei ? ainda medir a mortalidade após 3 dias, após 4 dias, após 5 dias, após 6 dias, após 7 dias, após 8

dias, após 9 dias, após 10 dias, após 11 dias, e/ou após 12 dias .