BR112019018506A2

BR112019018506A2 - glucoamilase termoestável e métodos de uso da mesma

Info

Publication number: BR112019018506A2
Application number: BR112019018506A
Authority: BR
Inventors: Zhang Bo; Nikolaev Igor; Flyvholm Cramer Jacob; K Shetty Jayarama; Ge Jing; Anton Bernhard KOLKMAN Marc; Antonius Hendricus Van Der Kleij Wilhelmus; Zou Zhengzheng; Xie Zhiyong; Tang Zhongmei
Original assignee: Danisco Us Inc
Priority date: 2017-03-07
Filing date: 2017-11-09
Publication date: 2020-04-28
Also published as: JP2020522995A; US20230002749A1; EP3592849A1; CA3055530A1; WO2018164737A1; CN110603322A; JP7069201B2

Abstract

a presente invenção refere-se a polipeptídeos que têm atividade de glucoamilase, composições que compreendem tais polipeptídeos, e métodos de uso de tais polipeptídeos e composições.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para GLUCOAMILASE TERMOESTÁVEL E MÉTODOS DE USO DA MESMA.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO [001] Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente internacional n² PCT/CN2013/076419, depositado em 07 de março de 2017, que está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO [002] A presente descrição refere-se a polipeptídeos que têm atividade de glucoamilase e a composições que compreendem tais polipeptídeos. A presente descrição refere-se, ainda, a polinucleotídeos que codificam tais polipeptídeos, vetores e células hospedeiras que compreendem genes que codificam tais polipeptídeos, os quais também podem possibilitar a produção de tais polipeptídeos. A descrição também se refere a métodos para sacarificar material que contém amidos com o uso ou a aplicação dos polipeptídeos ou composições, bem como os sacarídeos assim produzidos pelo método. Ademais, a descrição refere-se a métodos para produzir produtos de fermentação, bem como os produtos de fermentação produzidos pelo método da mesma.

ANTECEDENTES [003] A glucoamilase (1,4-alfa-D-glucano-gluco-hidrolase, EC 3.2.1.3) é uma enzima que catalisa a liberação de D-glicose a partir das extremidades não redutoras de amido ou moléculas relacionadas de oligo e polissacarídeo. As glucoamilases são produzidas por diversos fungos filamentosos e leveduras.

[004] A principal aplicação de glucoamilase é a sacarificação de amido/dextrina parcialmente processado em glicose, que é um substrato essencial para inúmeros processos de fermentação. A glicose

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2/58 pode, então, ser convertida direta ou indiretamente em um produto de fermentação com o uso de um organismo de fermentação. Exemplos de produtos de fermentação comerciais incluem álcoois (por exemplo, etanol, metanol, butanol, 1,3-propanodiol); ácidos orgânicos (por exemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido láctico, ácido glucônico, gluconato, ácido lático, ácido succínico, ácido 2,5-diceto-Dglucônico); cetonas (por exemplo, acetona); aminoácidos (por exemplo, ácido glutâmico); gases (por exemplo, H2 e CO2) e compostos mais complexos, incluindo, por exemplo, antibióticos (por exemplo, penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (por exemplo, riboflavina, B12, betacaroteno); hormônios e outros compostos que são difíceis de produzir sinteticamente. Os processos de fermentação também são comumente usados na indústria de álcool consumível (por exemplo, cerveja e vinho), laticínios (por exemplo, na produção de iogurte e queijo), couro, bebidas e tabaco.

[005] O produto final também pode ser xarope. Por exemplo, 0 produto final pode ser glicose, mas também pode ser convertido, por exemplo, por glicose isomerase, em frutose ou uma mistura composta quase igualmente por glicose e frutose. A mistura, ou uma mistura adicionalmente enriquecida com frutose, é 0 xarope de milho com alto teor de frutose (HFCS) mais comumente usado comercializado em todo 0 mundo.

[006] A glucoamilase para propósitos comerciais tradicionalmente tem sido produzida empregando-se fungos filamentosos, embora um grupo diverso de micro-organismos produza glucoamilase, visto que secretam grandes quantidades da enzima extracelularmente. Entretanto, as glucoamilases fúngicas usadas comercialmente têm certas limitações como termoestabilidade moderada, exigência de pH ácido e atividade catalítica lenta que aumentam os custos de processo. Portanto, é necessário procurar novas glucoamilases para aprimorar a

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3/58 temperatura ideal, levando a melhorias na eficiência catalítica para reduzir o tempo de sacarificação ou obter maior rendimento de produtos finais.

[007] É um objetivo da presente descrição fornecer certos polipeptídeos que têm atividade de glucoamilase, polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos, construtos de ácido nucleico que podem ser usados para produzir tais polipeptídeos, composições que compreendem os mesmos, bem como métodos de aplicações de tais polipeptídeos a diferentes aplicações industriais.

SUMÁRIO [008] Os presentes polipeptídeos, composições e métodos de sacarificação de material que contém amidos com o uso ou a aplicação dos polipeptídeos ou das composições. Aspectos e modalidades dos polipeptídeos, composições e métodos são descritos nos parágrafos independentemente numerados a seguir.

[009] 1. Em um aspecto, um polipeptídeo que tem atividade de glucoamilase, selecionado a partir do grupo que consiste em:

[0010] (a) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95%, como ainda pelo menos 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 3;

[0011] (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob pelo menos condições de baixa severidade, com mais preferência, pelo menos condições de severidade média, ainda com mais preferência, pelo menos condições de severidade média a alta, com máxima preferência, pelo menos severidade alta, e ainda com máxima preferência, pelo menos condições de severidade muito alta com [0012] (i) a sequência de codificação do polipeptídeo maduro da

SEQ ID NO: 1,

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4/58 [0013] (ii) a sequência de DNA genômico que compreende a sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou [0014] (iii) um fita complementar de comprimento total de (i) ou (ii);

[0015] (c) um polipeptídeo codificado por urn polinucleotideo que compreende uma sequência de nucleotídeos que tem, de preferência, pelo menos 75%, com mais preferência, pelo menos 80%, com mais preferência, pelo menos 85%, com mais preferência, pelo menos 90%, com mais preferência, pelo menos 91 %, com mais preferência, pelo menos 92%, ainda com mais preferência, pelo menos 93%, com máxima preferência, pelo menos 94%, e ainda com máxima preferência, pelo menos 95%, como ainda pelo menos 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de codificação de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1;

[0016] (d) uma variante que compreende uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais (por exemplo, diversos) aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2; e [0017] (e) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c) ou (d) que tem atividade de glucoamilase.

[0018] 2. Em um outro aspecto, um polinucleotideo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo do parágrafo 1.

[0019] 3. Em algumas modalidades do polinucleotideo do parágrafo operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que controlam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão. [0020] 4. Em um outro aspecto, uma célula hospedeira recombinante que compreende o polinucleotideo do parágrafo 2.

[0021] 5. Em algumas modalidades da célula hospedeira do parágrafo 4, que é um micro-organismo etanologênico.

[0022] 6. Em algumas modalidades da célula hospedeira do parágrafo 4 ou 5, que expressa e secreta adicionalmente uma ou mais

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5/58 enzimas adicionais selecionadas a partir do grupo que compreende protease, hemicelulase, celulase, peroxidase, enzima lipolítica, enzima metalolipolítica, xilanase, lipase, fosfolipase, esterase, peridrolase, cutinase, pectinase, pectato liase, mananase, queratinase, redutase, oxidase, fenoloxidase, lipoxigenase, ligninase, alfa-amilase, pululanase, fitase, tanase, pentosanase, malanase, beta-glucanase, arabinosidase, hialuronidase, condroitinase, lacase, transferrase ou uma combinação das mesmas.

[0023] 7. Em um outro aspecto, um método para sacarificar um material que contém amido que compreende as etapas de: i) colocar o material que contém amido em contato com uma alfa-amilase; e ii) colocar o material que contém amido em contato com uma glucoamilase a uma temperatura de pelo menos 70 Ό; em que o mét odo produz pelo menos glicose 70% livre do material que contém amido (substrato).

[0024] 8. Em algumas modalidades do método do parágrafo 7, em que a etapa (ii) é realizada a uma temperatura de pelo menos 75Ό, de preferência, pelo menos 80 Ό para entre 12 e 96 ho ras, de preferência, 18 a 60 horas.

[0025] 9 .Em algumas modalidades do método do parágrafo 7 ou 8, em que a glucoamilase mantém pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 100% de atividade relativa a uma temperatura de pelo menos 70 Ό, e/ou a um pH entre 2,0 e 7,0, de preferência, entre pH 4,0 e pH 6,0, com mais preferência, entre pH 4,5 e pH 5,5.

[0026] 10 .Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 7 a 9, em que o método inclui realizar sequencial ou simultaneamente a etapa (i) e a etapa (ii).

[0027] 11. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 7 a 10, em que o método compreende adicionalmente uma pré-sacarificação antes da etapa de sacarificação ii).

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6/58 [0028] 12. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 7 a 11, em que a glucoamilase é o polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1.

[0029] 13. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 7 a 12, em que a etapa (i) é realizada à temperatura de gelatinização do material que contém amido, ou abaixo da mesma.

[0030] 14. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 7 a 13, em que uma enzima desramificante adicional está ausente durante a etapa (i) e/ou etapa (ii).

[0031] 15. Em algumas modalidades do método do parágrafo 14, em que a enzima desramificante é pululanase.

[0032] 16. Em um outro aspecto, um sacarídeo produzido pelo método de qualquer um dos parágrafos 7 a 15.

[0033] 17. Em um outro aspecto, um método para produzir produtos de fermentação a partir do sacarídeo do parágrafo 16, em que o sacarídeo é fermentado por um organismo de fermentação.

[0034] 18. Em algumas modalidades do método do parágrafo 17, em que o processo de fermentação é realizado sequencial ou simultaneamente com a etapa (ii).

[0035] 19. Em algumas modalidades do método do parágrafo 17 ou

18, em que o produto de fermentação compreende etanol.

[0036] 20. Em algumas modalidades do método do parágrafo 17 ou

18, em que o produto de fermentação compreende um metabólito não etanol.

[0037] 21. Em algumas modalidades do método do parágrafo 20, em que o metabólito é ácido cítrico, ácido lático, ácido succínico, glutamato monossódico, ácido glucônico, gluconato de sódio, gluconato de cálcio, gluconato de potássio, um ácido orgânico, glucono deltalactona, eritorbato de sódio, ácido graxo de ômega 3, butanol, isobutanol, um aminoácido, lisina, tirosina, treonina, glicina, ácido

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7/58 itacônico, 1,3-propanodiol, vitaminas, enzimas, hormônios, isopreno ou outros produtos bioquímicos ou biomateriais.

[0038] 22. Em um outro aspecto, um método de aplicação do polipeptídeo do parágrafo 1 no preparo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0039] A Figura 1 é um mapa de plasmídeo de pJG580.

[0040] A Figura 2 é um perfil de produção de PruGAI ao longo de uma fermentação de 95 horas.

[0041] A Figura 3 é uma comparação de produção de DP1 de PruGAI-0,3x, PruGAI-1 x, AfuGA-1 χ e AnGA-1 χ a 60, 65 e 70 Ό, após incubação de 72 horas.

[0042] A Figura 4 é uma comparação de atividades em relação ao amido bruto de PruGAI com TrGA a pH 3,5.

[0043] A Figura 5 é uma comparação de atividades em relação ao amido bruto de PruGAI com TrGA a pH 4,5.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0044] A presente descrição refere-se a polipeptídeos que têm atividade de glucoamilase e a composições que compreendem tais polipeptídeos. A presente descrição refere-se, ainda, a polinucleotídeos que codificam tais polipeptídeos, vetores e células hospedeiras que compreendem genes que codificam tais polipeptídeos, os quais também podem possibilitar a produção de tais polipeptídeos. A descrição também se refere a métodos para sacarificar material que contém amidos com o uso ou a aplicação dos polipeptídeos ou composições, bem como os sacarídeos assim produzidos pelo método. Ademais, a descrição refere-se a métodos para produzir produtos de fermentação, bem como os produtos de fermentação produzidos pelo método da mesma.

[0045] Antes de descrever as composições e métodos em detalhes, os seguintes termos e abreviações são definidos.

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8/58 [0046] Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados têm seu significado comum no campo científico relevante. Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2- edição, John Wiley e Sons, Nova lorque (1994), e Hale & Markham, Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) fornecem o significado comum de muitos dos termos que descrevem a invenção.

Definição [0047] O termo atividade de glucoamilase (1,4-alfa-D-glucano gluco-hidrolase, EC 3.2.1.3) é definido no presente documento como uma atividade enzimática que catalisa a liberação de D-glicose a partir das extremidades não redutoras de amido ou moléculas relacionadas de oligo e polissacarídeo.

[0048] Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 70%, com mais preferência, pelo menos 80%, ainda com mais preferência, pelo menos 90%, com máxima preferência, pelo menos 95%, e ainda com máxima preferência, pelo menos 100% da atividade de glucoamilase do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[0049] O termo sequência de aminoácidos é sinônimo dos termos polipeptídeo, proteína e peptídeo e são usados intercambiavelmente. Quando tais sequências de aminoácidos exibirem atividade, podem ser referidas como enzima. São usados os códigos convencionais de uma letra ou três letras para resíduos de aminoácidos, com sequências de aminoácidos sendo apresentadas na orientação padrão amino-para-carbóxi terminal (isto é, N^C).

[0050] O termo polipeptídeo maduro é definido no presente documento como um polipeptídeo em sua forma final após a tradução e quaisquer modificações pós-traducionais, como processamento no Nterminal, truncamento no C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro trata-se de aminoácidos 22 a 614

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9/58 da SEQ ID NO: 2, com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1 a 6) que prevê que os aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO: 2 são um peptídeo sinal.

[0051] O termo ácido nucleico abrange DNA, RNA, heteroduplexes e moléculas sintéticas com capacidade para codificar um polipeptídeo. Ácidos nucleicos podem ser de fita simples ou de fita dupla e podem ser quimicamente modificados. Os termos ácido nucleico e polinucleotídeo são usados intercambiavelmente. Uma vez que o código genético é degenerado, pode ser usado mais do que um códon para codificar um aminoácido particular, e as presentes composições e métodos abrangem sequências de nucleotídeos que codificam uma sequência de aminoácidos particular. A menos que indicado de outra forma, sequências de ácidos nucleicos são apresentadas na orientação 5'-para-3'.

[0052] O termo sequência de codificação significa uma sequência de nucleotídeos que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de seu produto proteico. Os limites da sequência de codificação são geralmente determinados por um quadro de leitura aberto, que normalmente começa com o códon inicial ATG ou códons iniciais alternativos como GTG e TTG e termina com um códon de parada como TAA, TAG e TGA. A sequência de codificação pode ser uma sequência de nucleotídeos de DNA, cDNA, sintética ou recombinante.

[0053] O termo cDNA é definido no presente documento como uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição inversa a partir de uma molécula de DNA, submetida a splicing, madura obtida a partir de uma célula eucariótica. O cDNA carece de sequências de introns que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito inicial de RNA primário é um precursor do mRNA que é processado através de uma série de etapas antes de aparecer como

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10/58 mRNA submetido a splicing maduro. Essas etapas incluem a remoção de sequências de introns por um processo chamado splicing. O cDNA derivado de mRNA carece, portanto, de quaisquer sequências de introns.

[0054] O termo hibridização refere-se ao processo pelo qual uma fita de ácido nucleico forma um duplex, isto é, pares de base, com uma fita complementar, conforme ocorre durante as técnicas de hibridização por blot e técnicas de PCR. As condições de hibridização estringentes são exemplificadas pela hibridização sob as seguintes condições: 65 G e 0,1X SSC (em que 1X SSC = NaCI 0,15 M, citrato de Na3 0,015 M, pH 7,0). Ácidos nucleicos duplex hibridizados são caracterizados por uma temperatura de fusão (Tm), em que metade dos ácidos nucleicos hibridizados não são emparelhados com a fita complementar. Nucleotídeos desalinhados dentro do duplex reduzem a Tm.

[0055] Uma molécula sintética é produzida por síntese química ou enzimática in vitro, e não por um organismo.

[0056] Uma cepa hospedeira ou célula hospedeira é um organismo no qual um vetor de expressão, fago, vírus ou outro construto de DNA, incluindo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse (por exemplo, uma amilase) foi introduzido. Cepas hospedeiras exemplificativas são células de micro-organismos (por exemplo, bactérias, fungos filamentosos e levedura) com capacidade para expressar o polipeptídeo de interesse e/ou fermentar sacarídeos. O termo célula hospedeira inclui protoplastos criados a partir de células.

[0057] O termo expressão refere-se ao processo pelo qual um polipeptídeo é produzido com base em uma sequência de ácidos nucleicos. O processo inclui tanto transcrição como tradução.

[0058] O termo vetor refere-se a uma sequência de polinucleotídeos projetada para introduzir ácidos nucleicos em um ou

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11/58 mais tipos de célula. Os vetores incluem vetores de clonagem, vetores de expressão, vetores bifuncionais, plasmídeos, fago partículas, cassetes e semelhantes.

[0059] Um vetor de expressão refere-se a um construto de DNA que compreende uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo de interesse, tal sequência de codificação é operacionalmente ligada a uma sequência de controle adequada com a capacidade para efetuar a expressão do DNA em um hospedeiro adequado. Tais sequências de controle podem incluir um promotor para efetuar a transcrição, uma sequência operadora opcional para controlar a transcrição, uma sequência que codifica sítios de ligação a ribossoma adequados no mRNA, intensificadores e sequências que controlam a terminação da transcrição e tradução.

[0060] O termo sequências de controle é definido no presente documento de modo a incluir todos os componentes necessários para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa ou estranha à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo, nativas ou estranhas entre si. Tais sequências de controle incluem mas não se limitam a um líder, sequência de poliadenilação, sequência propeptídica, promotor, sequência de peptídeo sinal, e terminador da transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sinais de terminação da transcrição e tradução. As sequências de controle podem ser dotadas de ligantes com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das sequências de controle à região de codificação da sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo.

[0061] O termo operacionalmente ligado significa que os componentes especificados estão em uma relação (incluindo, porém sem limitação, justaposição) permitindo que os mesmos funcionem de

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12/58 uma maneira pretendida. Por exemplo, uma sequência reguladora é operacionalmente ligada a uma sequência de codificação de modo que a expressão da sequência de codificação esteja sob controle das sequências reguladoras.

[0062] Uma sequência de sinal é uma sequência de aminoácidos ligados à porção N-terminal de uma proteína, o que facilita a secreção da proteína fora da célula. A forma madura de uma proteína extracelular não tem a sequência de sinal, que é removida por divagem durante o processo de secreção.

[0063] Biologicamente ativo refere-se a uma sequência que têm uma atividade biológica especificada, tal como uma atividade enzimática.

[0064] O termo atividade específica refere-se ao número de moles do substrato que pode ser convertido em produto por uma enzima ou preparação enzimática por unidade de tempo sob condições específicas. A atividade específica é geralmente expressa como unidades (U)/mg de proteína.

[0065] Porcentagem de identidade de sequência significa que uma sequência particular tem pelo menos uma determinada porcentagem de resíduos de aminoácido idênticos àqueles em uma sequência de referência especificada, quando alinhadas com o uso do algoritmo CLUSTAL W com parâmetros-padrão. Consultar Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4.673 a 4.680. Parâmetros predefinidos para o algoritmo CLUSTAL W são:

Penalidade por abertura de lacuna:10,0

Penalidade por extensão da lacuna:0,05

Matriz de peso de proteína: série BLOSUM

Matriz de pesos de DNA:IUB % de sequências divergentes de atraso40

Distância de separação de lacuna:8

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Peso de transições de DNA:

Listar Resíduos hidrofílicos:

0,50

GPSNDQEKR

DESLIGADO

Usar matriz negativa:

Alternar penalidades específicas de resíduo: LIGADO Alternar penalidades hidrofílicas: LIGADO

Alternar penalidade de separação de lacuna final DESLIGADO.

[0066] O termo sequência homóloga é definido no presente documento como uma proteína prevista que tem um valor E (ou pontuação de expectativa) inferior a 0,001 em uma pesquisa rápida (Pearson, W. R., 1999, em Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener e S. A. Krawetz, ed., páginas 185 a 219) com a glucoamilase de Penicillium russellii da SEQ ID NO: 3.

[0067] O termo fragmento de polipeptídeo é definido no presente documento como um polipeptídeo que tem um ou mais (por exemplo, diversos) aminoácidos deletados da terminação amino e/ou carboxila do polipeptídeo da SEQ ID NO: 3; ou uma sequência homóloga da mesma; em que o fragmento tem atividade de glucoamilase.

[0068] Os termos, tipo selvagem, parental ou referência, em relação a um polipeptídeo, referem-se a um polipeptídeo de ocorrência natural que não inclui uma substituição, inserção ou deleção realizada pelo homem em uma ou mais posições de aminoácido. Similarmente, os termos tipo selvagem, parental ou referência, em relação a um polinucleotídeo, referem a um polinucleotídeo de ocorrência natural que não inclui uma alteração de nucleosídeo feita pelo homem. Entretanto, note que um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo do tipo selvagem, parental ou de referência não se limita a um polinucleotídeo de ocorrência natural e abrange qualquer polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo do tipo selvagem, parental ou de referência.

[0069] Os termos termoestável e termoestabilidade, em referência a uma enzima, referem-se à capacidade da enzima para reter

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14/58 atividade após a exposição a uma temperatura elevada. A termoestabilidade de uma enzima, como uma enzima amilase, é medida por sua meia vida (ti/2) dada em minutos, horas ou dias, durante os quais metade da atividade enzimática é perdida sob condições definidas. A meia vida pode ser calculada medindo-se a atividade de alfa-amilase residual, por exemplo, após a exposição (isto é, desafio) a uma temperatura elevada.

[0070] Uma faixa de pH, com referência a uma enzima, refere-se à faixa de valores de pH sob a qual a enzima exibe atividade catalítica. [0071] Os termos estável ao pH e estabilidade ao pH, relativamente a uma enzima, se relacionam com a capacidade da enzima de reter atividade ao longo de uma gama ampla de valores de pH durante um período de tempo predeterminado (por exemplo, 15 min, 30 min, 1 hora).

[0072] O termo pré-sacarificação é definido no presente documento como um processo anterior à sacarificação completa ou sacarificação e fermentação simultânea (SSF). A pré-sacarificação é realizada tipicamente a uma temperatura entre 30 e 65 graus C, cerca de 60 graus C, por 40 a 90 minutos.

[0073] O sintagma sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) refere-se a um processo na produção de produtos bioquímicos em que um organismo microbiano, tal como um micro-organismo etanologênico, e pelo menos uma enzima, tal como uma amilase, estão presentes durante a mesma etapa de processo. SSF inclui a hidrólise contemporânea de substratos de amido (granulares, liquefeitos ou solubilizados) em sacarídeos, incluindo glicose, e a fermentação dos sacarídeos em álcool ou outro produto bioquímico ou biomaterial no mesmo vaso de reator.

[0074] Uma pasta fluida é uma mistura aquosa que contém grânulos de amido insolúveis em água.

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15/58 [0075] O termo teor total de açúcar refere-se ao teor total de açúcar solúvel presente em uma composição de amido, incluindo monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos.

[0076] O termo sólidos secos (ds) se refere a sólidos secos dissolvidos em água, sólidos secos dispersos em água ou uma combinação de ambos. Sólidos secos incluem, assim, amido granular e seus produtos de hidrólise, incluindo glicose.

[0077] Teor de sólido seco se refere à porcentagem de sólidos secos tanto dissolvidos como dispersos conforme uma porcentagem em peso em relação à água em que os sólidos secos são dispersos e/ou dissolvidos. O teor de sólido seco inicial do amido é o peso de amido granular corrigido pelo teor de umidade sobre o peso de amido granular mais peso de água. O teor de sólido seco subsequente pode ser determinado a partir do teor inicial ajustado para qualquer água adicionada ou perdida e para ganho químico. O teor sólido seco dissolvido subsequente pode ser medido a partir do índice de refração conforme indicado abaixo. 8 [0078] O termo alto DS refere-se à pasta fluida de amido aquosa com um teor de sólido seco maior que 38% (p/p).

[0079] Amido como substância seca refere-se ao teor de amido seco de um substrato, como uma pasta fluida de amido, e pode ser determinado subtraindo-se qualquer contribuição de componentes não amido, como proteína fibra e água da massa do substrato. Por exemplo, se uma pasta fluida de amido granular tiver um teor de água de 20% (p/p), e um teor de proteína de 1 % (p/p), então, 100 kg de amido granular tem um teor de amido seco de 79 kg. O amido de substância seca pode ser usado na determinação de quantas unidades de enzimas usar.

[0080] Grau de polimerização (DP) refere-se ao número (n) de unidades de anidroglucopiranose em um dado sacarídeo. Exemplos de DP1 são os monossacarídeos, como glicose e frutose. Exemplos de

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DP2 são os dissacarídeos, como maltose e sacarose. Um DP4+ (>DP3) denota polímeros com um grau de polimerização maior que 3.

[0081] O termo colocar em contato refere-se à colocação de componentes referenciados (incluindo, porém sem limitação, enzimas, substratos e organismos de fermentação) em proximidade suficiente para afetar um resultado esperado, como a enzima que atua no substrato ou o organismo de fermentação que fermenta um substrato. Aquele versado na técnica reconhecerá que as soluções de mistura podem causar o contato. Um micro-organismo etanologênico referese a um micro-organismo com a capacidade para converter um açúcar ou outros carboidratos em etanol.

[0082] O termo produtos bioquímicos refere-se a um metabólito de um micro-organismo, como ácido cítrico, ácido lático, ácido succínico, glutamato monossódico, ácido glucônico, gluconato de sódio, gluconato de cálcio, gluconato de potássio, glucono delta-lactona, eritorbato de sódio, ácido graxo de ômega 3, butanol, iso-butanol, um aminoácido, lisina, ácido itacônico, outros ácidos orgânicos, 1,3-propanodiol, vitaminas, ou isopreno ou outro biomaterial.

[0083] O termo pululanase também chamado de enzima desramificante (E.C. 3.2.1.41, pululano 6-glucano-hidrolase), tem capacidade para hidrolisar ligações alfa 1-6 glucosídicas em uma molécula de amilopectina.

[0084] O termo cerca de refere-se a ± 15% em relação ao valor referenciado.

[0085] O termo compreender e seus cognatos são usados em seu sentido inclusive; ou seja, equivalente ao termo incluir e seus cognatos correspondentes.

EC comissão de enzima

CAZy enzima ativa de carboidrato p/v peso/volume

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p/p	peso/peso
v/v	volume/volume
% em p	porcentagem em peso
°C	graus centígrados
g	grama
pg	micrograma
mg	miligrama
kg	quilograma
μΙ_ e μΙ	microlitro
mL e ml	mililitro
mm	milímetro
μιτι	micrômetro
mol	mol
mmol	milimol
M	molar
mM	milimolar
μΜ	micromolar
nm	nanômetro
U	unidade
PPm	partes por milhão
hr e h	hora
EtOH	etanol
ds	sólido seco

Polipeptídeos que têm atividade de glucoamilase [0086] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a polipeptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos que tem, de preferência, pelo menos 90%, com mais preferência, pelo menos 92%, ainda com mais preferência, pelo menos 93%, com máxima preferência, pelo menos 94%, e ainda com máxima preferência, pelo menos 95%, como ainda pelo menos 96%, 97%, 98%, 99% ou

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100% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 3, que tem atividade de glucoamilase.

[0087] Em algumas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção são os polipeptídeos homólogos que compreendem sequências de aminoácidos que diferem em dez aminoácidos, de preferência, em nove aminoácidos, de preferência, em oito aminoácidos, de preferência, em sete aminoácidos, de preferência, em seis aminoácidos, de preferência, em cinco aminoácidos, com mais preferência, em quatro aminoácidos, ainda com mais preferência, em três aminoácidos, com máxima preferência, em dois aminoácidos, e ainda com máxima preferência, em um aminoácido do polipeptídeo da SEQ ID NO: 3.

[0088] Em algumas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção são as variantes de polipeptídeo da SEQ ID NO: 3, ou um fragmento da mesma que tem atividade de glucoamilase.

[0089] Em algumas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção são termoestáveis e retêm atividade de glucoamilase em temperatura elevada. Os polipeptídeos da presente invenção mostraram termoestabilidade em valores de pH na faixa de cerca de 2,5 a cerca de 8,0 (por exemplo, cerca de 3,0 a cerca de 7,5, cerca de 3,0 a cerca de 7,0, cerca de 3,0 a cerca de 6,5, etc.). Por exemplo, a pH de cerca de 3,0 a cerca de 7,0 (por exemplo, cerca de 3,5 a cerca de 6,5, etc.), os polipeptídeos da presente invenção retêm a maior parte da atividade de glucoamilase por um período prolongado de tempo a alta temperatura (por exemplo, pelo menos 50 Ό, pelo me nos 55 Ό, pelo menos 60 Ό, pelo menos 65 Ό, pelo menos 70 Ό, pe Io menos 75 Ό, pelo menos 80 Ό, pelo menos 85 Ό, pelo menos 90 ° C ou uma temperatura mais alta), por exemplo, por pelo menos 1 hora, pelo menos 2 horas, pelo menos 3 horas, pelo menos 5 horas, ou por mais tempo. Por exemplo, os polipeptídeos da presente invenção retêm pelo menos

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19/58 cerca de 35% (por exemplo, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70% ou um percentual maior) de atividade de glucoamilase quando incubados por pelo menos cerca de 1 hora, 3 horas, 5 horas, ou por mais tempo a temperatura elevada a um pH de cerca de 3,5 a cerca de 6,5.

[0090] Em algumas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção têm atividade máxima a um pH de cerca de 5, têm mais de 90% de atividade máxima a um pH de cerca de 3,5 a um pH de cerca de 6,0 e têm mais de 70% de atividade máxima a um pH de cerca de 2,8 a um pH de cerca de 7,0, medido a uma temperatura de 50 Ό, conforme determinados pelos ensaios descritos no presente documento. Faixa exemplificativas de pH para uso da enzima são pH 2,5 a 7,0, 3,0 a 7,0, 3,5 a 7,0, 2,5 a 6,0, 3,0 a 6,0 e 3,5 a 6,0.

[0091] Em algumas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção têm atividade máxima a uma temperatura de cerca de 75 Ό, têm mais de 70% de atividade máxima a uma temperatura de cerca de 63 O a uma temperatura de cerca de 79 Ό, medida a um pH de 5,0, conforme determinado pelos ensaios descritos no presente documento. Faixas exemplificativas de temperatura para uso da enzima são 50 a 82Ό, 50 a 80 Ό, 55 a 82 Ό, 55 a 80 Ό e 60 a 80 Ό. Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a polipeptídeos que têm atividade de glucoamilase, que são codificados por polinucleotídeos que hibridizam sob, de preferência, condições de severidade muito baixa, com mais preferência, condições de baixa severidade, com mais preferência, condições de severidade média, com mais preferência, condições de severidade média a alta, ainda com mais preferência, condições de severidade alta, e com máxima preferência, condições de severidade muito alta com (i) a sequência de codificação de polipeptídeo

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20/58 maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNA genômico que compreende a sequência de codificação de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou (iii) uma fita complementar de comprimento total de (i) ou (ii) (J. Sambrook, E. F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2- edição, Cold Spring Harbor, Nova York).

[0092] A sequência de nucleotideos de SEQ ID NO: 1; ou um fragmento da mesma pode ser usada para projetar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar polipeptídeos codificadores de DNA que têm atividade de glucoamilase a partir de cepas de diferentes gêneros ou espécies de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridização com o DNA genômico ou cDNA do gênero ou espécie de interesse, seguindo procedimentos Southern blotting padrão, a fim de identificar e isolar o gene correspondente no mesmo. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência completa, mas devem ter pelo menos 14, preferencialmente pelo menos 25, mais preferencialmente pelo menos 35, e muito preferencialmente pelo menos 70 nucleotideos de comprimento. No entanto, é preferencial que a sonda de ácido nucleico tenha pelo menos 100 nucleotideos de comprimento. Por exemplo, a sonda de ácido nucleico pode ter pelo menos 200 nucleotideos, preferencialmente pelo menos 300 nucleotideos, mais preferencialmente pelo menos 400 nucleotideos, ou muito preferencialmente pelo menos 500 nucleotideos de comprimento. Sondas ainda mais longas podem ser usadas, por exemplo, sondas de ácido nucleico que têm, de preferência, pelo menos 600 nucleotideos, com mais preferência, pelo menos 800 nucleotideos, ainda com mais preferência, pelo menos 1.000 nucleotideos, ainda com mais preferência, pelo menos 1.500 nucleotideos, ou com máxima preferência, pelo menos 1.800 nucleotideos de comprimento. As sondas

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21/58 tanto de DNA quanto de RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com ³²P, ³H, ³⁵S, biotina ou avidina). Tais sondas também são abrangidas pela presente invenção.

[0093] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de outras cepas pode, portanto, ser tríada para o DNA que hibridiza com as sondas descritas acima e codifica um polipeptídeo que tem atividade de glucoamilase. DNA genômico ou outro de tais cepas diferentes pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, ou outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para e imobilizado em nitrocelulose ou outro material transportador adequado. A fim de identificar um clone ou DNA que seja homólogo à SEQ ID NO: 1, ou uma subsequência da mesma, o material carreador é, de preferência, usado em um Southern blot.

[0094] Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a polipeptídeos que têm atividade de glucoamilase codificada por polinucleotídeos que compreendem sequências de nucleotídeos que têm, de preferência, um grau de identidade de sequência com a sequência de codificação de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 60%, com mais preferência, pelo menos 63%, com mais preferência, pelo menos 65%, com mais preferência, pelo menos 68%, com mais preferência, pelo menos 70%, com mais preferência, pelo menos 72%, com mais preferência, pelo menos 75%, pelo menos 77%, com mais preferência, pelo menos 79%, com mais preferência, pelo menos 81%, com mais preferência, pelo menos 83%, com mais preferência, pelo menos 85%, com mais preferência, pelo menos 90%, com mais preferência, pelo menos 92%, ainda com mais preferência, pelo menos 93%, com máxima preferência, pelo menos 94%, e ainda com máxima preferência, pelo menos 95%, como ainda pelo menos

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96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade, que codifica um polipeptídeo que tem atividade de glucoamilase.

[0095] Em um quarto aspecto, as presentes glucoamilases compreendem substituição conservadora de um ou diversos resíduos de aminoácido em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Substituições conservadoras de aminoácido exemplificativas estão listadas na Tabela 1. Algumas mutações conservadoras podem ser produzidas por manipulação genética, enquanto outras são produzidas introduzindo-se aminoácidos sintéticos em um polipeptídeo por outros meios.

Tabela 1. Substituições conservatives de aminoácidos

Para o Aminoácido	Código	Substituir por qualquer um dentre
Alanina	A	D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginina	R	D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, lie, DMet, D-lle, Orn, D-Orn
Asparagina	N	D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-GIn
Ácido Aspártico	D	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-GIn
Cisteína	C	D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Glutamina	Q	D-GIn, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Ácido Glutâmico	E	D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-GIn
Glicina	G	Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, b-Ala, Acp
Isoleucina	1	D-lle, Vai, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucina	L	D-Leu, Vai, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Lisina	K	D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, lie, D-lle, Orn, D-Orn
Metionina	M	D-Met, S-Me-Cys, lie, D-lle, Leu, D-Leu, Vai, D-Val
Fenilalanina	F	D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans- 3,4 ou 5-fenilprolina, cis-3,4, ou 5-fenilprolina
Prolina	P	D-Pro, ácido L-l-tioazolidina-4-carboxílico, ácido D- ou L-1oxazolidina-4-carboxílico
Serina	S	D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), L-Cys, D-Cys

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Para o Aminoácido	Código	Substituir por qualquer um dentre
Treonina	T	D-Thr, Ser, D-Ser, alio-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Vai, D-Val
Tirosina	Y	D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Valina	v	D-Val, Leu, D-Leu, He, D-lle, Met, D-Met

[0096] Em algumas modalidades, a presente glucoamilase compreende uma deleção, substituição, inserção ou adição de um ou alguns resíduos de aminoácido em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência homóloga da mesma. Em algumas modalidades, as presentes glucoamilases são derivadas da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 por substituição conservadora de um ou diversos resíduos de aminoácido. Em algumas modalidades, as presentes glucoamilases são derivadas da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 por deleção, substituição, inserção ou adição de um ou alguns resíduos de aminoácido em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Em todos os casos, a expressão um ou alguns resíduos de aminoácido refere-se a 10 ou menos, isto é, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácido.

[0097] Alternativamente, as alterações de aminoácidos são de natureza tal que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as alterações de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade para o substrato, mudar o pH ótimo, e assim por diante.

[0098] Substituições, deleções e/ou inserções de único ou múltiplos aminoácidos podem ser realizadas e testadas com o uso de métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguido por um procedimento de triagem relevante, como aqueles revelados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53 a 57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados

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24/58 incluem PCR propensa ao erro, exibição de fago (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochem. 30: 10.832 a 10.837; patente no U.S. 5.223.409; documento no WO 92/06204) e mutagênese de região direcionada (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[0099] Métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com métodos de triagem automatizados de alto rendimento para detectar a atividade de polipeptídeos clonados mutagenizados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893 a 896). Moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Esses métodos permitem a rápida determinação da importância de resíduos de aminoácido individuais em um polipeptídeo de interesse e podem ser aplicados a polipeptídeos de estrutura desconhecida.

[00100] As substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 podem ser no máximo 10, de preferência, no máximo 9, com mais preferência, no máximo 8, com mais preferência, no máximo 7, com mais preferência, no máximo 6, com mais preferência, no máximo 5, com mais preferência, no máximo 4, ainda com mais preferência, no máximo 3, com máxima preferência, no máximo 2, e ainda com máxima preferência, no máximo 1.

[00101] A glucoamilase pode ser um polipeptídeo quimérico ou híbrido, visto que inclui pelo menos uma porção de uma primeira glucoamilase, e pelo menos uma porção de uma segunda amilase, glucoamilase, beta-amilase, alfa-glucosidase ou outras enzimas degradadoras de amido, ou ainda outras glicosil hidrolases, como, sem limitação, celulases, hemicelulases, etc. (incluindo tais amilases quiméricas foram recentemente redescobertas como amilases de troca de domínio). As presentes glucoamilases podem incluir, ainda, sequência sinal heteróloga, um epítopo para permitir o rastreamento ou

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25/58 a purificação ou semelhantes.

Produção de glucoamilase [00102] As presentes glucoamilases podem ser produzidas em células hospedeiras, por exemplo, por secreção ou expressão intracelular. Um material celular cultivado (por exemplo, um caldo de célula total) que compreende uma glucoamilase pode ser obtido após a secreção da glucoamilase no meio celular. Opcionalmente, a glucoamilase pode ser isolada das células hospedeiras, ou ainda isolada do caldo de célula, dependendo da pureza desejada da glucoamilase final. Um gene que codifica uma glucoamilase pode ser clonado e expresso de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. Células hospedeiras adequadas incluem células bacterianas, fúngicas (incluindo levedura e fungos filamentosos) e vegetais (incluindo algas). Células hospedeiras particularmente úteis incluem Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesi ou Myceliopthora Thermophila. Outras células hospedeiras incluem células bacterianas, por exemplo, Bacillus subtil is ou B. licheniformis, bem como Streptomyces.

[00103] Adicionalmente, o hospedeiro pode expressar uma ou mais enzimas, proteínas ou peptídeos acessórios. Esses podem beneficiar processos de liquefação, sacarificação, fermentação, SSF e a jusante. Além disso, a célula hospedeira pode produzir etanol e outros produtos bioquímicos ou biomateriais além das enzimas usadas para digerir as várias matérias-primas. Tais células hospedeiras podem ser úteis para processos de fermentação ou de sacarificação e fermentação simultânea para reduzir a necessidade de adição de enzimas.

Composições [00104] A presente invenção também se refere a composições que compreendem um polipeptídeo da presente invenção. Em algumas modalidades, um polipeptídeo que compreende uma sequência de

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26/58 aminoácidos que é pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% idêntica àquela da SEQ ID NO: 1 também pode ser usado na composição da enzima. De preferência, as composições são formuladas para fornecer características desejáveis como pouca cor, baixo odor e estabilidade em armazenamento aceitável.

[00105] A composição pode compreender um polipeptídeo da presente invenção como o componente enzimático principal, por exemplo, uma composição monocomponente. Alternativamente, a composição pode compreender múltiplas atividades enzimáticas, como uma aminopeptidase, amilase, carbo-hidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, deoxirribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, beta-amilase, isoamilase, haloperoxidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, pululanase, ribonuclease, transglutaminase, xilanase ou uma combinação das mesmas, que podem ser adicionadas em quantidades eficazes bem conhecidas pelos versados na técnica.

[00106] As composições polipeptídicas podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de um líquido ou composição seca. Por exemplo, as composições que compreende as presentes glucoamilases podem ser formulações aquosas ou não aquosas, grânulos, pós, géis, pastas fluidas, pastas, etc., que podem compreender, ainda, qualquer uma ou mais dentre as enzimas adicionais listadas no presente documento, juntamente com tampões, sais, conservantes, água, cossolventes, tensoativos e semelhantes. Tais composições podem trabalhar em combinação com enzimas endógenas ou outros ingredientes já presente em uma pasta

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27/58 fluida, banho de água, máquina de lavar, produto alimentício ou de bebidas, etc., por exemplo, enzimas endógenas de planta (incluindo algal), enzimas residuais de uma etapa de processamento anterior e semelhantes. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[00107] A composição pode se tratar de células que expressam o polipeptídeo, incluindo células com capacidade para produzir um produto a partir da fermentação. Tais células podem ser fornecidas em um creme ou na forma seca juntamente com estabilizadores adequados. Tais células podem expressar, ainda, polipeptídeos adicionais, como aqueles mencionados acima.

[00108] Abaixo são fornecidos Exemplos de usos preferenciais dos polipeptídeos ou das composições da invenção. A dosagem da composição de polipeptídeo da invenção e outras condições sob as quais a composição é usada podem ser determinadas com base nos métodos conhecidos na técnica.

[00109] A composição acima é adequada para uso no processo de liquefação, sacarificação e/ou fermentação, de preferência, na conversão de amido, especialmente para produzir xarope e produtos de fermentação, como etanol.

Uso [00110] A presente invenção também é direcionada ao uso de um polipeptídeo ou uma composição da presente invenção em um processo de liquefação, sacarificação e/ou fermentação. O polipeptídeo ou a composição pode ser usado em um único processo, por exemplo, em um processo de liquefação, um processo de sacarificação ou um processo de fermentação. O polipeptídeo ou a composição também pode ser usado em uma combinação de processos, por exemplo, em um processo de liquefação e sacarificação, em um processo de liquefação e fermentação ou em um processo de sacarificação e

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28/58 fermentação, de preferência, em relação à conversão de amido.

1. Liquefação [00111] Conforme usado no presente documento, o termo liquefação ou liquefazer significa um processo pelo qual amido gelatinizado é convertido em líquido menos viscoso contendo dextrinas solúveis de cadeia mais curta, enzimas indutoras de liquefação e/ou de sacarificação opcionalmente podem ser adicionadas. Em algumas modalidades, o substrato de amido preparado é transformado em pasta fluida com água. A pasta fluida de amido pode conter amido como uma porcentagem em peso de sólidos secos de cerca de 10 a 55%, cerca de 20 a 45%, cerca de 30 a 45%, cerca de 30 a 40% ou cerca de 30 a 35%. Alfa-amilase (EC 3.2.1.1) pode ser adicionada à pasta fluida, com uma bomba medidora, por exemplo. A alfa-amilase tipicamente usada para esse pedido é uma alfa-amilase bacteriana termoestável, como uma alfa-amilase de Geobacillus stearothermophilus, alfa-amilase de Cytophaga, etc, por exemplo, Spezyme® RSL (produto DuPont), Spezyme AA (produto DuPont), Spezyme® Fred (produto DuPont), Clearflow AA (produto DuPont), Spezyme Alpha PF (produto DuPont), Spezyme Powerliq (produto DuPont) podem ser usadas aqui.

[00112] A pasta fluida de amido mais a alfa-amilase pode ser bombeada continuamente através de um cozidor a jato, que é aquecido por vapor até 80 a 110 G, dependendo da fonte da matéria-prima contendo amido. A gelatinização ocorre rapidamente sob essas condições, e a atividade enzimática, combinada com as forças de cisalhamento significativas, começa a hidrólise do substrato de amido. O tempo de permanência no cozidor a jato é breve. O amido parcialmente gelatinizado pode, então, ser passado em uma série de tubos de retenção mantidos a 105 a 110 G e retidos por 5 a 8 min para concluir o processo de gelatinização (liquefação primária). A hidrólise ao DE exigida é concluída em tanques de retenção a 85 a 95 G ou

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29/58 temperaturas mais elevadas por cerca de 1 a 2 horas (liquefação secundária). A pasta fluida é, então, deixada resfriar até a temperatura ambiente. Essa etapa de resfriamento pode ser 30 minutos a 180 minutos, por exemplo, 90 minutos a 120 minutos. O amido liquefeito está tipicamente na forma de uma pasta fluida que tem um teor de sólidos secos (em p/p) de cerca de 10 a 50%; cerca de 10 a 45%; cerca de 15 a 40%; cerca de 20 a 40%; cerca de 25 a 40%; ou cerca de 25 a 35%. [00113] Em um processo de liquefação enzimática convencional, a alfa-amilase termoestável é adicionada e o amido de cadeia longa é degradado em unidades mais curtas ramificadas e lineares (maltodextrinas), mas glucoamilase não é adicionada. A glucoamilase da presente invenção é altamente termoestável, de modo que seja vantajoso adicionar a glucoamilase no processo de liquefação.

2. Sacarificação [00114] O amido liquefeito pode ser sacarificado em um xarope rico em sacarídeos de DP mais baixo (por exemplo, DP1 + DP2), com o uso de alfa-amilases e glucoamilases, opcionalmente na presença de outra enzima (ou enzimas). A composição exata dos produtos de sacarificação depende da combinação de enzimas usada, bem como do tipo de amido processado. Vantajosamente, o xarope obtenível com o uso das glucoamilases fornecidas pode conter uma porcentagem em peso de DP2 dos oligossacarídeos totais no amido sacarificado que excede 30%, por exemplo, 45% a 65% ou 55% a 65%. A porcentagem em peso de (DP1 + DP2) no amido sacarificado pode exceder cerca de 70%, por exemplo, 75% a 85% ou 80% a 85%.

[00115] Embora a liquefação seja geralmente executada como um processo contínuo, a sacarificação é frequentemente conduzida como um processo em batelada. As condições de sacarificação dependem da natureza do liquefeito e do tipo de enzimas disponíveis. Em alguns casos, um processo de sacarificação pode envolver temperaturas de

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30/58 cerca de 60 a 65 Ό e um pH de cerca de 4,0 a 4,5, por exemplo, pH 4,3. A sacarificação pode ser realizada, por exemplo, a uma temperatura entre cerca de 40 Ό, cerca de 50 Ό ou cerca de 55 O a cerca de 600 ou cerca de 65 O, exigindo resfriamento do Liquefe ito. O pH pode ser também ajustado conforme necessário. A sacarificação é, normalmente, conduzida em tanques agitados, que pode levar diversas horas para preencher ou esvaziar. As enzimas são tipicamente adicionadas ou a uma razão fixa a sólidos secos na medida em que os tanques são preenchidos ou adicionadas como uma dose única no início do estágio de preenchimento. Uma reação de sacarificação para compor um xarope é tipicamente executada ao longo de cerca de 24 a 72 horas, por exemplo, 24 a 48 horas. Entretanto, é comum apenas realizar uma présacarificação de tipicamente 40 a 90 minutos a uma temperatura entre 30 a 650, tipicamente cerca de 600, seguido por s acarificação completa em uma sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). A glucoamilase da presente invenção é altamente termoestável, então, a pré-sacarificação e/ou sacarificação da presente invenção pode ser realizada a uma temperatura mais alta que a pré-sacarificação e/ou sacarificação convencional. Em uma modalidade, um processo da invenção inclui pré-sacarificar material que contém amido antes do processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). A présacarificação pode ser executada a uma alta temperatura (por exemplo, 50 a 850, de preferência, 60 a 750) antes de ser movido para SSF. De preferência, a sacarificação idealmente é conduzida a uma faixa de temperatura mais alta de cerca de 30 O a cerca de 75 O, por exemplo, 45 O a 75 O ou 50 O a 75 O. Conduzindo-se o pro cesso de sacarificação em temperaturas mais altas, o processo pode ser executado em um período de tempo mais curto ou, alternativamente, o processo pode ser executado com o uso de dosagem de enzima mais baixa. Além disso, o risco de contaminação microbiana é reduzido ao

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31/58 executar o processo de liquefação e/ou sacarificação em temperatura mais alta.

[00116] Em um aspecto preferencial da presente invenção, a liquefação e/ou sacarificação inclui processos de liquefação e sacarificação realizados de modo sequencial ou simultâneo.

3. Fermentação [00117] O hidrolisado de amido solúvel, particularmente um xarope rico em glicose, pode ser fermentado colocando-se o hidrolisado de amido em contato com um organismo de fermentação tipicamente a uma temperatura em torno de 32 Ό, como de 30 O a 35 Ό. Organismo de fermentação refere-se a qualquer organismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, adequado para uso em um processo de fermentação e com capacidade para produzir um produto de fermentação desejado. Os organismos de fermentação especialmente adequados têm capacidade de fermentar, isto é, converter, açúcares, como glicose ou maltose, direta ou indiretamente no produto de fermentação desejado. Os exemplos de organismos de fermentação incluem leveduras, tais como Saccharomyces cerevisiae e bactérias, por exemplo, Zymomonas mobilis, que expressam álcool desidrogenase e piruvato descarboxilase. O micro-organismo etanologênico pode expressar xilose redutase e xilitol desidrogenase, que convertem xilose em xilulose. Cepas melhoradas de microorganismos etanologênicos, que podem suportar temperaturas mais elevadas, por exemplo, são conhecidos na técnica e podem ser usados. Consultar Liu et al. (2011) Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 27:1.049 a 1.056 A levedura comercialmente disponível inclui, por exemplo, Red Star(TM)/Lesaffre Ethanol Red (disponível junto à Red Star/Lesaffre, EUA) FALI (disponível junto à Fleischmann's Yeast, uma divisão de Burns Philp Food Inc., EUA), SUPERSTART (disponível junto à Alltech), GERT STRAND (disponível junto à Gert Strand AB, Suécia) e FERMIOL

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32/58 (disponível junto à DSM Specialties). A temperatura e o pH da fermentação dependerão do organismo fermentador. Os microorganismos que produzem outros metabolites, tais como ácido cítrico e ácido láctico, por fermentação são também conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Papagianni (2007) Biotechnol. Adv. 25:244 a 263; John et al. (2009) Biotechnol. Adv. 27:145 a 152.

[00118] Os processos de sacarificação e fermentação podem ser executados como um processo de SSF. Um processo de SSF pode ser conduzido com células fúngicas que expressam e secretam glucoamilase continuamente por todo SSF. As células fúngicas que expressam glucoamilase também podem ser o micro-organismo de fermentação, por exemplo, um micro-organismo etanologênico. A produção de etanol pode ser, assim, executada com o uso de uma célula fúngica que expressa glucoamilase suficiente de modo que menos ou nenhuma enzima tenha que ser adicionada exogenamente. A célula hospedeira fúngica pode ser de uma cepa fúngica geneticamente modificada de modo apropriado. As células hospedeiras fúngicas que expressam e secretam outras enzimas, adicionalmente à glucoamilase, também podem ser usadas. Tais células podem expressar amilase e/ou uma pululanase, fitase, a/ía-glicosidase, isoamilase, beta-amilase celulase, xilanase, outras hemicelulases, protease, be/a-glicosidase, pectinase, esterase, enzimas de oxirredução, transferase ou outras enzimas. A fermentação pode ser seguida por recuperação subsequente de etanol.

4. Hidrólise de amido bruto [00119] A presente invenção fornece um uso da glucoamilase da invenção para produzir glicoses e similares a partir de amido bruto ou amido granular. De modo geral, a glucoamilase da presente invenção sozinha ou na presença de uma alfa-amilase pode ser usada em um processo de hidrólise de amido bruto (RSH) ou hidrólise de amido

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33/58 granular (GSH) para produzir açúcares e produtos de fermentação desejados. O amido granular é solubilizado por hidrólise enzimática abaixo da temperatura de gelatinização. Tais sistemas de baixa temperatura (conhecidos também como sem cozimento ou cozimento a frio) foram relatados como capazes de processar concentrações de sólidos secos mais altas do que os sistemas convencionais (por exemplo, até 45%).

[00120] Um processo de hidrólise de amido bruto (RSH) difere de processos de tratamento de amido convencionais, incluindo sacarificar e fermentar de modo sequencial ou simultâneo amido granular em ou abaixo da temperatura de gelatinização do substrato de amido tipicamente na presença de pelo menos uma glucoamilase e/ou amilase. O amido aquecido em água começa a gelatinizar entre 50Ό e 75Ό, a temperatura exata de gelatinização depende do amido específico. Por exemplo, a temperatura de gelatinização pode variar de acordo com a espécie de planta, com a variedade particular da espécie de planta assim como das condições de crescimento. No contexto desta invenção, a temperatura de gelatinização de um dado amido é a temperatura em que birrefringência é perdida em 5% dos grânulos de amido com o uso do método descrito por Gorinstein. S. e Lii. C., Starch/Starke, volume 44 (12) páginas 461 a 466 (1992).

[00121] A glucoamilase da invenção pode ser também usada em combinação com uma enzima que hidrolisa apenas ligações alfa-( 1,6)glucosídicas em moléculas que compreendem pelo menos quatro resíduos de glicosila. De preferência, a glucoamilase da invenção é usada em combinação com pululanase ou isoamilase. O uso de isoamilase e pululanase para desramificação de amido, as propriedades moleculares das enzimas, e o uso potencial das enzimas juntamente com glucoamilase é descrito em G. M. A. van Beynum et al., Starch Conversion Technology, Marcel Dekker, New York, 1985, 101 a 142.

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34/58 [00122] Em outro aspecto, a invenção refere-se ao uso da glucoamilase da invenção, incluindo conversão de amido, por exemplo, em bebida de xarope e/ou um produto de fermentação, incluindo etanol.

5. Produtos de Fermentação [00123] O termo produto de fermentação significa um produto produzido por um processo incluindo um processo de fermentação com o uso de um organismo de fermentação. Os produtos de fermentação contemplados de acordo com a invenção incluem álcoois (por exemplo, arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, etileno glicol, 1,3propanodiol [propileno glicol], butanodiol, glicerina, sorbitol e xilitol); ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido lático, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiônico, ácido succínico e ácido xilônico); cetonas (por exemplo, acetona); aminoácidos (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina e treonina); um alcano (por exemplo, pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano e dodecano); um cicloalcano (por exemplo, ciclopentano, ciclo-hexano, ciclo-heptano e ciclo-octano); um alceno (por exemplo, penteno, hexeno, hepteno e octeno); gases (por exemplo, metano, hidrogênio (H2), dióxido de carbono (CO2) e monóxido de carbono (CO)); antibióticos (por exemplo, penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (por exemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); e hormônios. Em um aspecto preferencial, 0 produto de fermentação é etanol, por exemplo, etanol combustível; etanol para beber, isto é, bebidas destiladas neutras potáveis; ou etanol ou produtos industriais usados na indústria de álcool consumível (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de laticínios (por exemplo, produto lácteos fermentados), indústria de couro e indústria

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35/58 de tabaco. Os tipos de cerveja preferenciais compreendem cervejas do tipo Ale, cervejas do tipo Stout, cervejas do tipo Porter, cervejas do tipo Lager, amargas, licores de malte, cerveja com alto teor alcoólico, cerveja com baixo teor alcoólico, cerveja com baixo teor calórico ou cerveja light. Os processos de fermentação preferenciais usados incluem processos de fermentação de álcool, que são bem conhecidos na técnica. Os processos de fermentação preferenciais são processos de fermentação anaeróbicos, que são bem conhecidos na técnica.

6. Preparo [00124] As glucoamilases da presente invenção são altamente termoestáveis e, portanto, podem ser usadas para hidrólise de amido em alta temperatura para produzir uma bebida de malte fermentada. Por exemplo, as glucoamilases da invenção podem ser adicionadas a uma farelada quente, tirando vantagem da temperatura elevada para aumentar a taxa de reação e aumentar o rendimento de açúcares fermentáveis antes da adição de levedura. A glucoamilase, em combinação com uma amilase e, opcionalmente, uma pululanase e/ou isoamilase auxiliam na conversão do amido em dextrinas e açúcares fermentáveis, reduzindo os carboidratos não fermentáveis residuais na cerveja final. As glucoamilases da invenção são adicionadas em quantidades eficazes que podem ser facilmente determinadas pela pessoa versada na técnica.

[00125] Os processos para produzir cerveja são bem conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Wolfgang Kunze (2004) Technology Brewing and Malting, Instituição de Pesquisa e Ensino para Cervejaria, Berlim (VLB), 3- edição. Em suma, o processo envolve: (a) preparar uma farelada, (b) filtrar a farelada para preparar um mosto e (c) fermentar o mosto para obter uma bebida fermentada, tal como cerveja.

[00126] A composição de fabricação de cerveja que compreende uma glucoamilase, em combinação com uma amilase e, opcionalmente,

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36/58 uma pululanase e/ou isoamilase, pode ser adicionada à farelada da etapa (a) acima, isto é, durante a preparação da farelada. Alternativa ou adicionalmente, a composição de fabricação de cerveja pode ser adicionada à farelada da etapa (b) acima, isto é, durante a filtração da farelada. Alternativa ou adicionalmente, a composição de fabricação de cerveja pode ser adicionada ao mosto da etapa (c) acima, isto é, durante a fermentação do mosto.

[00127] Todas as referências citadas no presente documento estão incorporadas ao presente documento a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos. A fim de ilustrar adicionalmente as composições e métodos, e vantagens dos mesmos, os exemplos específicos a seguir são dados com o entendimento de que os mesmos são ilustrativos em vez de limitantes.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Sequência de glucoamilase de Penicillium russellii (PruGM) [00128] A cepa de Penicillium russellii foi selecionada como uma fonte potencial para várias enzimas, útil para aplicações industriais. O genoma inteiro da cepa de Penicillium russellii foi sequenciado e a sequência de nucleotídeo de uma glucoamilase putativa, designado PruGAI foi identificado por identidade de sequência. O gene que codifica PruGAI é apresentado como a SEQ ID NO:1: ATGCGCTATACTCTTTTAACGAGTATTGCCAGCGTCCTTAGCGTG GGGCCGCTGGCATCTGCGAGCCCTACATCGAAGGATGGAAATTT GGCATCCTATATAGCGAAAGAGGGACAACGATCTATTGTGGGGAT CACTGAAAACCTCGGTGGTAAAGGCAGCAAGACACCGGGCACGG CCGCTGGCTTATTCATTGCTAGTCCTAATATGGCGAACCCCAATTA CTATTATACGTGGACTCGTGATTCGGCCCTTACATTCAAATGCTTG ATCGACCTGTTTGAAACTTCTGATCAGGACTATATCAGTCGTAAAG AGTTGGAAACCGACATTCGGAATTATGTCTCATCACAAGCAGTGC

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TGCAGAATGTATCCAATCCATCTGGGACTCTGAAAGATGGCTCTG GACTCGGTGAGCCCAAGTTTGAGATCGACCTGAACCCATTCAGTG GTTCCTGGGGCCGGCCTCAGCGTGACGGTCCCGCCCTGCGAGC GACCGCCATGATCACTTACGCAGACTGGTTGGTTTCCCACGGTCA GAAATCCGAAGCCACCAACATCATGTGGCCCATCATTGCAAATGA CTTGGCATATGTAGGCCAGTACTGGAACAAAACTGGATTCGACCT CTGGGAAGAGGTAGATGGATCTTCCTTTTACACCTTGGCTGTCCA ACACCGAGCACTGGTCCAGGGAGCAAGCCTTGCGAAGAAGCTTG GCAAGTCGTGCACTGCTTGTGTATCCCAAGCACCTCAGATTCTTT GCTTTCTCCAGAGCTTCTGGAACGGAAATTACATCACCGCCAACA TCAATCTTGACACAAGTCGCTCCGGTATCGATTTGAACTCGATCTT GGGAAGCATCCACACCTTTGATCCCGAAGCTTCATGTGATGATTC GACCTTCCAACCTTGCTCAGCCAGAGCGCTTGCAAACCATAAGGT CTATGTTGACGCGTTCCGTTCAATCTATGGTGTCAATGCTGGCCTT TCAAACGGGACAGCCGCCAATGTCGGTCGGTACCCAGAAGATGT TTACCAAGGAGGTAACCCATGGTATCTCGCCACTCTAGCAGCAGC TGAACTGCTGTACGATGCTCTATACCAATGGAACCAAATTGGCAA GCTCGATGTCACCAAGACCTCGCTAGCGTTCTTCAAAGATTTTGA CGCGGCCGTCAAAACAGGCACATACTCAGCGCATAGCTCAGCCT ACAGGACTCTCACCTCAGCCATCCGAACTTATGCAGATGATTTCAT CAGTCTCGTCCAACACTATACTCCTTCTAATGGGTCCTTGGCCGA GCAATATGATCGGGATACTGGTATCCCACTGTCAGCCAATGATCT AACTTGGTCTTACGCTTCCTTCATCACAGCTATCGAGCGTCGTGCT TCCGTCGTGCCCGCCTCATGGGGCGAAAAATCTGCAAATGTGGTT CCCACTACCTGCTCAGCCTCTCCTGTCACTGGAACTTACGTAGCT GCTACTTCAGTATTCCCGACAACCACTGGATGTGTTCCGGCGACA AGCATCGTTCCGATCACATTCTACTTGACTGAGAGCACATTCTATG GAGAAAATGTCTACATGACTGGCAACATTAGTGCACTTGGCAACT GGGACACGAGCAGTGGTTTCCCCCTCACAGCAAACTTATACACTG ATTCAGACCATTTGTGGTTTGCCAGTGTTGAGCTTGTTCCGGCGG

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GGACACCGTTTGAATACAAATACTACAAGGTAGAGCCGAATGGTA CTGTCATTTGGGAGAACGGTGAGAACAGGGTATACGTTGCTCCTA CTGGGTGTCCGATCCAGCCTAGCCAAACCGATATTTGGCGT [00129] A sequência de aminoácidos da proteína precursora PruGAI é apresentada como a SEQ ID NO: 2: MRYTLLTSIASVLSVGPLASASPTSKDGNLASYIAKEGQRSIVGITENL GGKGSKTPGTAAGLFIASPNMANPNYYYTWTRDSALTFKCLIDLFET SDQDYISRKELETDIRNYVSSQAVLQNVSNPSGTLKDGSGLGEPKFEI DLNPFSGSWGRPQRDGPALRATAMITYADWLVSHGQKSEATNIMW PIIANDLAYVGQYWNKTGFDLWEEVDGSSFYTLAVQHRALVQGASLA KKLGKSCTACVSQAPQILCFLQSFWNGNYITANINLDTSRSGIDLNSIL GSIHTFDPEASCDDSTFQPCSARALANHKVYVDAFRSIYGVNAGLSN GTAANVGRYPEDVYQGGNPWYLATLAAAELLYDALYQWNQIGKLDV TKTSLAFFKDFDAAVKTGTYSAHSSAYRTLTSAIRTYADDFISLVQHYT PSNGSLAEQYDRDTGIPLSANDLTWSYASFITAIERRASVVPASWGE KSANVVPTTCSASPVTGTYVAATSVFPTTTGCVPATSIVPITFYLTEST FYGENVYMTGNISALGNWDTSSGFPLTANLYTDSDHLWFASVELVPA GTPFEYKYYKVEPNGTVIWENGENRVYVAPTGCPIQPSQTDIWR [00130] A sequência de aminoácidos da forma madura de PruGAI confirmada por degradação de Edman N-terminal é apresentada como a SEQ ID NO: 3: SKDGNLASYIAKEGQRSIVGITENLGGKGSKTPGTAAGLFIASPNMAN PNYYYTWTRDSALTFKCLIDLFETSDQDYISRKELETDIRNYVSSQAV LQNVSNPSGTLKDGSGLGEPKFEIDLNPFSGSWGRPQRDGPALRAT AMITYADWLVSHGQKSEATNIMWPIIANDLAYVGQYWNKTGFDLWEE VDGSSFYTLAVQHRALVQGASLAKKLGKSCTACVSQAPQILCFLQSF WNGNYITANINLDTSRSGIDLNSILGSIHTFDPEASCDDSTFQPCSARA LANHKVYVDAFRSIYGVNAGLSNGTAANVGRYPEDVYQGGNPWYLA TLAAAELLYDALYQWNQIGKLDVTKTSLAFFKDFDAAVKTGTYSAHSS AYRTLTSAIRTYADDFISLVQHYTPSNGSLAEQYDRDTGIPLSANDLT

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WSYASFITAIERRASVVPASWGEKSANVVPTTCSASPVTGTYVAATS VFPTTTGCVPATSIVPITFYLTESTFYGENVYMTGNISALGNWDTSSG FPLTANLYTDSDHLWFASVELVPAGTPFEYKYYKVEPNGTVIWENGE NRVYVAPTGCPIQPSQTDIWR

EXEMPLO 2

Expressão e purificação de glucoamilase de Penicillium russellii (PruGAI) [00131] A sequência de nucleotideo do gene PruGAI de Penicillium russelliié sintetizada e apresentada como SEQ ID NO: 4: ATGCGCTATACTCTTTTAACGAGTATTGCCAGCGTCCTTAGCGTG GGGCCGCTGGCATCTGCGAGCCCTACATCGAAGGATGGAAATTT GGCATCCTATATAGCGAAAGAGGGACAACGATCTATTGTGGGGAT CACTGAAAACCTCGGTGGTAAAGGCAGCAAGACACCGGGCACGG CCGCTGGCTTATTCATTGCTAGTCCTAATATGGCGAACCCCAATTA CTATTATACGTGGACTCGTGATTCGGCCCTTACATTCAAATGCTTG ATCGACCTGTTTGAAACTTCTGATCAGGACTATATCAGTCGTAAAG AGTTGGAAACCGACATTCGGAATTATGTCTCATCACAAGCAGTGC TGCAGAATGTATCCAATCCATCTGGGACTCTGAAAGATGGCTCTG GACTCGGTGAGCCCAAGTTTGAGATCGACCTGAACCCATTCAGTG GTTCCTGGGGCCGGCCTCAGCGTGACGGTCCCGCCCTGCGAGC GACCGCCATGATCACTTACGCAGACTGGTTGGTTTCCCACGGTCA GAAATCCGAAGCCACCAACATCATGTGGCCCATCATTGCAAATGA CTTGGCATATGTAGGCCAGTACTGGAACAAAACTGGATTCGACCT CTGGGAAGAGGTAGATGGATCTTCCTTTTACACCTTGGCTGTCCA ACACCGAGCACTGGTCCAGGGAGCAAGCCTTGCGAAGAAGCTTG GCAAGTCGTGCACTGCTTGTGTATCCCAAGCACCTCAGATTCTTT GCTTTCTCCAGAGCTTCTGGAACGGAAATTACATCACCGCCAACA TCAATCTTGACACAAGTCGCTCCGGTATCGATTTGAACTCGATCTT GGGAAGCATCCACACCTTTGATCCCGAAGCTTCATGTGATGATTC GACCTTCCAACCTTGCTCAGCCAGAGCGCTTGCAAACCATAAGGT

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CTATGTTGACGCGTTCCGTTCAATCTATGGTGTCAATGCTGGCCTT TCAAACGGGACAGCCGCCAATGTCGGTCGGTACCCAGAAGATGT TTACCAAGGAGGTAACCCATGGTATCTCGCCACTCTAGCAGCAGC TGAACTGCTGTACGATGCTCTATACCAATGGAACCAAATTGGCAA GCTCGATGTCACCAAGACCTCGCTAGCGTTCTTCAAAGATTTTGA CGCGGCCGTCAAAACAGGCACATACTCAGCGCATAGCTCAGCCT ACAGGACTCTCACCTCAGCCATCCGAACTTATGCAGATGATTTCAT CAGTCTCGTCCAACACTATACTCCTTCTAATGGGTCCTTGGCCGA GCAATATGATCGGGATACTGGTATCCCACTGTCAGCCAATGATCT AACTTGGTCTTACGCTTCCTTCATCACAGCTATCGAGCGTCGTGCT TCCGTCGTGCCCGCCTCATGGGGCGAAAAATCTGCAAATGTGGTT CCCACTACCTGCTCAGCCTCTCCTGTCACTGGAACTTACGTAGCT GCTACTTCAGTATTCCCGACAACCACTGGATGTGTTCCGGCGACA AGCATCGTTCCGATCACATTCTACTTGACTGAGAGCACATTCTATG GAGAAAATGTCTACATGACTGGCAACATTAGTGCACTTGGCAACT GGGACACGAGCAGTGGTTTCCCCCTCACAGCAAACTTATACACTG ATTCAGACCATTTGTGGTTTGCCAGTGTTGAGCTTGTTCCGGCGG GGACACCGTTTGAATACAAATACTACAAGGTAGAGCCGAATGGTA CTGTCATTTGGGAGAACGGTGAGAACAGGGTATACGTTGCTCCTA CTGGGTGTCCGATCCAGCCTAGCCAAACCGATATTTGGCGTTAA [00132] A sequência de DNA de PruGAI foi otimizada para expressão de PruGAI em Trichoderma reesei e inserida no vetor de expressão pTrex3gM (descrito no Pedido Publicado no U.S. 2011/0136197 A1), resultando em pJG580 (Figura 1).

[00133] O plasmídeo pJG580 foi transformado em uma cepa de Trichoderma reesei (descrita no documento n² WO 05/001036) com o uso de transformação de protoplasto (Te'o et al., J. Microbiol. Methods 51:393 a 399, 2002). Os transformantes foram selecionados e fermentados pelos métodos descritos no documento n² WO 2016/138315. Os sobrenadantes a partir destas culturas foram usados

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41/58 para confirmar a expressão de proteína por análise de SDS-PAGE e ensaio para atividade de enzima.

[00134] Uma cultura de sementes das células transformadas mencionadas acima foi subsequentemente cultivada em um fermentador de 2,8 I em um meio definido. O caldo de fermentação foi amostrado nos tempos de fermentação de 42, 65 e 95 horas até passar as amostras em SDS-PAGE, medições de peso seco, glicose residual e concentrações de proteína extracelular. A Figura 2 mostra o perfil de produção de PruGAI em fermentação por 95 horas. Após 95 horas após a fermentação, depois de centrifugação, filtração e concentração, 500 ml das amostras concentradas foram obtidas. A concentrações de proteína foi determinada como sendo 10,7 g/l pelo método BOA.

[00135] Duzentos ml de caldo de cultura clarificado foram carregados em uma coluna Sepharose 6 acoplada com beta-ciclodextrina de 20 ml (pré-equilibrada com acetato de sódio 20 mM pH 5,0, NaCI 150 mM), seguido por lavagem com 3 volumes de coluna do mesmo tampão. A eluição foi realizada com o uso de 5 volumes de coluna de alfaciclodextrina 10 mM em acetato de sódio 20 mM pH 5,0 contendo NaCI 150 mM. As frações foram coletadas e avaliadas quanto à atividade de glucoamilaselase e passadas em SDS-PAGE. As frações contendo a proteína-alvo foram agrupadas e concentradas com o uso do dispositivo Ultra-15 com 10 K MWCO com o uso de acetato de sódio 20 mM pH 5,0 contendo NaCI 150 mM. A amostra purificada é mais de 99% pura e armazenada em 40% de glicerol a -80 Ό até o uso.

EXEMPLO 3

Atividade específica de PruGAI em amido solúvel [00136] A atividade específica de glucoamilase foi avaliada com base na liberação de glicose por glucoamilase de amido solúvel com o uso de um método de glicose oxidase/peroxidase acoplado (GOX/HRP) (Anal. Biochem. 105 (1980), 389 a 397).

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42/58 [00137] As soluções de substrato foram preparadas misturando-se 9 ml de amido solúvel (1% em água, p/p) e 1 ml de tampão acetato de sódio 0,5 M pH 5,0 em um tubo cônico de 15 ml. A solução de enzima (GOX/HRP) acoplada com ABTS foi preparada em tampão acetato de sódio 50 mM (pH 5,0), com as concentrações finais de ABTS 2,74 mg/ml, HRP 0,1 U/ml e GOX 1 U/ml.

[00138] As diluições em série de amostras de glucoamilase e padrão de glicose foram preparadas em água purificada. Cada amostra de glucoamilase (10 μΙ) foi transferida para uma nova placa de microtítulo (Corning 3641) que contém 90 μΙ de solução de substrato pré-incubada a 50 O por 5 min a 600 rpm. As reações foram execu tadas a 50 O por 10 min com agitação (600 rpm) em um termomisturador (Eppendorf), 10 μΙ de misturas de reação assim como 10 μΙ de diluições em série de padrão de glicose foram rapidamente transferidos a novas placas de microtitulação (Corning 3641), respectivamente, seguido pela adição de 100 μΙ de solução de ABTS/GOX/HRP. A absorbância a 405 nm foi imediatamente medida em intervalos de 11 segundos por 5 min com o uso de um leitor de placa SoftMax Pro (Molecular Device). A emissão foi a taxa de reação, Vo, para cada concentração de enzima. A regressão linear foi usada para determinar o coeficiente linear do gráfico Vo vs. dose de enzima. A atividade específica de glucoamilase foi calculada com base na curva padrão de glicose com o uso de Equação 1:

Atividade Específica (Unidade/mg) = Coeficiente Linear (enzima) / coeficiente linear (padrão) χ 1.000 (1), em que 1 Unidade = 1 μ mol de glicose /min.

[00139] Com o uso do método mencionado acima, a atividade específica de PruGAI foi determinada e comparada com o teste de desempenho, AnGA (uma glucoamilase de Aspergillus niger). Os resultados são mostrados na Tabela 2. A atividade específica de PruGAI de 197 U/ mg em relação a amido solúvel foi aproximadamente

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43/58 vezes mais alta que a outra glucoamilase AnGA.

Tabela 2. Atividade específica de PruGAI purificado em relação a amido solúvel em comparação com AnGA

Substrato	Atividade específica (U/mg/min)
PruGAI	AnGA
Amido Solúvel	197	106

EXEMPLO 4

Atividade de hidrólise de pululano de Glucoamilase PruGAI [00140] A atividade de glucoamilase em relação a pululano foi avaliada com o uso do mesmo protocolo conforme descrito acima para atividade específica de glucoamilase PruGAI em relação a amido solúvel, exceto pelo fato de que as enzimas foram dosadas a 10 ppm. A Tabela 3 resume as atividades de hidrólise de pululano de PruGAI e o teste de desempenho, AnGA. A atividade de PruGAI sobre pululano foi aproximadamente 6 vezes tão alta quanto aquela de AnGA.

Tabela 3. Atividade de hidrólise de pululano de PruGAI em comparação com AnGA.

Substrato	Atividade de GA (dosada a 10 ppm) em relação a pululano
PruGAI	AnGA
pululano	154	24

EXEMPLO 5

Efeito de pH e temperatura sobre atividade de glucoamilase PruGAI [00141] O efeito de pH (de 2,0 a 10,0) sobre a atividade de PruGAI foi monitorado com o uso de amido solúvel (1% em água, p/p) como substrato. As soluções de trabalho de tampão consistiram na combinação de glicina/acetato de sódio/HEPES (250 mM), com pH

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44/58 variando de 2,0 a 10,0. As soluções de substrato foram preparadas misturando-se amido solúvel (1% em água, p/p) com solução tampão 250 mM a uma razão de 9:1. As soluções de trabalho de enzima foram preparadas em água a uma certa dose (que mostra sinal dentro da faixa linear como por curva de resposta de dose). Todas as incubações foram executadas a 50 G por 10 min seguindo o mesmo protocolo conforme descrito acima para atividade específica de glucoamilase PruGAI em relação a amido solúvel. A atividade de enzima em cada pH foi relatada como atividade relativa em comparação com a atividade de enzima em pH otimizado. O perfil de pH de PruGAI é mostrado na Tabela 4. PruGAI mostrou ter um pH otimizado em cerca de 5,0 e reter mais do que 70% de atividade máxima entre pH 2,8 e 7,0.

Tabela 4. Perfil de pH de PruGAI

PH	Atividade relativa (%)
2	31
2,5	48
3	81
3,5	92
4	98
5	100
6	98
7	71
8	32
9	13
10	1

[00142] O efeito de temperatura (de 40 G a 84 G) sobre a atividade de PruGAI foi monitorado com o uso de amido solúvel (1% em água, p/p) como substrato. As soluções de substrato foram preparadas misturando-se 9 ml de amido solúvel (1% em água, p/p) e 1 ml de tampão 0,5 M (acetato de sódio em pH 5,0) em um tubo cônico de 15

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45/58 ml. As soluções de trabalho de enzima foram preparadas em água a uma certa dose (que mostra sinal dentro da faixa linear como por curva de resposta de dose). Incubações foram realizadas em temperaturas de 40 Ό a 84 Ό, respectivamente, por 10 min após o m esmo protocolo conforme descrito acima para atividade específica de glucoamilase PruGAI em relação a amido solúvel. A atividade em cada temperatura foi relatada como atividade relativa em comparação com a atividade de enzima em temperatura otimizada. O perfil de temperatura de PruGAI é mostrado na Tabela 5. O PruGAI exibiu atividade ideal a 75 Ό e a atividade permaneceu acima de 70% da atividade máxima entre 63 Ό e 79 Ό.

Tabela 5. Perfil de temperatura-atividade de PruGAI

Temperatura (Ό)	Atividade relativa (%)
40	24
44,7	34
49,4	42
55	54
59,7	63
65	77
69,2	90
74,6	100
80	58
85	19

EXEMPLO 6

Desempenho de sacarificação de PruGAI em pH 4,5 a diferentes temperaturas [00143] A atividade de PruGAI, AnGA e AfuGA (descrita no documento n² WO2014092960) foi avaliada sob condições de sacarificação em pH 4,5 com diferentes temperaturas de incubação. A

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46/58 avaliação de DP1 foi medida analisando-se as composições de açúcar com dosagem de enzima igual. O liquefeito de amido de milho prétratado com alfa-amilase (preparado a 34,9% ds, pH 3,8) foi usado como um substrato de partida. As incubações de glucoamilases (dosadas a 0,121 mg/gds como Ixdose) e liquefeito de amido de milho (34% ds) foram realizadas em pH 4,5 a 60, 65 e 70 Ό, respectivamente. As amostras foram coletadas a 16, 24, 40, 64 e 72 h, respectivamente. Todas as incubações foram bruscamente arrefecidas por aquecimento a 100 Ό por 15 min. O sobrenadante de amostra foi transferido e diluído 400 vezes em H2SO4 5 mM por análise por HPLC com 0 uso de um sistema Agilent 1200 series com uma coluna Fast fruit (100 mm x 7,8 mm) executada a 85 °C. Amostras de 10 μΙ foram carregadas na coluna e separadas com um gradiente isocrático de água purificada como a fase móvel a uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min. Os produtos de oligosacarídeo foram detectados com 0 uso de um detector de índice de refração. As atividades glucogênicas das amostras são resumidas na Tabela 6. Selecionar % de DP1 após incubação por 72 horas (Figura 3) como um exemplo, PruGAI em dosagem 0,3x (40 pg/gds) superou a dosagem de AfuGA-1x (121 pg/gds) e a dosagem de AnGA-1x (121 pg/gds) em todas as três temperaturas testadas. Mesmo quando a temperatura de incubação foi aumentada até 70 Ό, P ruGA1 manteve seu desempenho superior em termos de produção de DP1. As atividades glucogênicas das amostras são resumidas na Tabela 6.

Tabela 6. A produção de DP1 de PruGAI, AfuGA e AnGA (dosagem 1 x ajustada em 121 pg/gds) incubados com liquefeito de amido de milho a pH 4,5, em várias temperaturas.

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Nome da amostra	Tempo (h)	60 Ό	65 Ό	70 Ό
PruGAI -0,3x	16	74,2	77,7	80,6
24	84,2	85,6	87,2
40	91,2	93,0	93,5
64	95,3	95,1	95,0
72	94,8	94,4	94,3
PruGAI -1 x	16	93,7	94,3	94,2
24	94,7	94,2	93,5
40	93,5	92,7	92,5
64	92,3	92,3	92,2
72	91,8	91,8	91,8
AfuGA-1 x	16	85,9	86,9	86,3
24	88,6	89,3	88,6
40	91,6	91,8	90,9
64	93,9	93,8	92,3
72	93,5	93,2	91,5
AnGA-1 x	16	82,3	83,0	81,8
24	85,5	85,4	82,9
40	88,9	87,9	84,2
64	91,7	89,8	85,4
72	91,5	89,8	85,2

EXEMPLO 7

Avaliação de sacarificação de PruGAI em pH 5,5 e 70 °C [00144] A atividade glucogênica de PruGAI a uma temperatura elevada (visando tempo de sacarificação mais curto) foi avaliada. O liquefeito de amido de milho (32% ds, pH 3,9) foi obtido a partir de liquefeito de amido de milho pré-tratado com alfa-amilase. As incubações de PruGAI com diferentes dosagens e liquefeito de amido de milho (32%ds) foram realizadas em pH 5,5, 70 Ό. As amostras foram

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48/58 coletadas em 18, 26, 42, 50, 66 e 72 h. Todas as incubações foram bruscamente arrefecidas por aquecimento a 100 Ό por 15 min. O sobrenadante da amostra foi transferido e diluído 400 vezes em H2SO4 5 mM por análise por HPLC com 0 uso das mesmas condições conforme mostrado no Exemplo 6. As atividades glucogênicas das amostras foram resumidas na Tabela 7. Os resultados mostraram que PruGAI (dosado a 30 pg/gds) poderíam atingir > 95% de produção de DP1 após incubação por dois dias em pH 5,5, 70 O.

Tabela 7. Produção de açúcar por PruGAI em diferentes dosagens (de a 50 pg/gds) sob condição de sacarificação a pH 5,5 e 70 O com 0 uso de liquefeito de amido de milho como um substrato

Dose de enzima	Tempo de incubação (h)	% de DP3+	% de DP3	% de DP2	% de DP1
50 pg/gds	18	8,2	0,6	2,2	89,0
26	2,4	0,4	2,3	94,9
42	0,6	0,4	3,3	95,8
50	0,9	0,4	3,6	95,1
66	1,3	0,5	4,0	94,2
72	1,4	0,5	4,3	93,9
40 pg/gds	18	12,4	0,6	1,9	85,1
26	5,6	0,4	1,9	92,0
42	1,0	0,2	2,8	96,0
50	1,1	0,4	3,1	95,4
66	1,4	0,4	3,7	94,4
72	1,3	0,4	4,0	94,3
30 pg/gds	18	16,8	0,8	3,0	79,3
26	10,7	0,5	1,8	87,0
42	2,9	0,4	2,3	94,4
50	2,0	0,3	2,6	95,1

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Dose de enzima	Tempo de incubação (h)	% de DP3+	% de DP3	% de DP2	% de DP1
	66	1,6	0,4	3,1	94,9
72	1,3	0,4	3,3	95,0
20 μg/gds	18	24,3	0,6	7,4	67,7
26	17,3	0,7	3,4	78,6
42	8,2	0,5	1,7	89,6
50	6,5	0,5	2,0	91,0
66	3,8	0,4	2,3	93,5
72	3,3	0,4	2,4	93,9

EXEMPLO 8

Atividade de amido bruto de PruGAI [00145] A atividade de PruGAI em ensaio de amido bruto foi medida e comparada com a atividade de glucoamilase de Trichoderma reesei (TrGA) com o uso para fermentação de enzima de hidrólise de amido granular (GSHE) e direcionar amido ao processo de glicose/maltose (DSTG/DSTM). Alfa-amilase e glucoamilase foram mescladas a uma razão de 1:6,6 nesse ensaio. A amilase de Aspergillus kawachii (AkAA, descrita no documento n² WO2013169645) foi usada. Uma coluna de HPLC Fast Fruit (Waters) foi usada para análise de perfil de açúcar e glicose (produto final) foi usada para determinar a capacidade de hidrólise de amido bruto da enzima.

[00146] 150 μΙ do substrato de amido de milho (1%, em tampão acetato de sódio 50 mM pH 3,5/pH 4,5) foram dispensados em placas de microtitulação de 0,5 ml com o uso de pontas de orifício amplo. 10 μΙ de amilase e 10 μΙ de glucoamilase foram adicionados por poço para definir as dosagens finais para AkAA e glucoamilase em 1,5 ppm e 10 ppm, respectivamente. As amostras foram colocadas em incubadora iEMS ajustada a 32 G, 900 rpm por 6, 20 e 28 h. 50 μΙ de NaOH 0,5 M

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50/58 foram adicionados para arrefecer bruscamente as reações e o tampão de amido foi suspenso colocando-se a placa em um agitador por 2 min. Após o mesmo, a placa foi vedada e centrifugada a 2.500 rpm por 3 min. Para análise por HPLC, o sobrenadante foi diluído 10 vezes com o uso de H2SO4 0,01 N. Amostras de 10 μΙ foram analisadas com 0 uso de uma HPLC Agilent 1200 series equipada com um detector de índice de refração. A coluna usada foi uma coluna Phenomenex Rezex-RFQ Fast Fruit (n² de catálogo 00D-0223-K0) com uma coluna de proteção Phenomenex Rezex ROA Organic Acidc (n² de catálogo 03B-0138-KO). A fase móvel foi H2SO4 0,01 N, e a taxa de fluxo foi 1,0 ml/min a 85 O. Os resultados são mostrados na Figura 4 e 5. PruGAI exibiu atividade comparável a glucoamilase de teste de desempenho TrGA tanto a pH 3,5 quanto a pH 4,5 em relação a amido bruto.

EXEMPLO 9

Avaliação de PruGAI para fermentação em baixo pH [00147] A atividade glucogênica de PruGAI sob condições de fermentação em baixo pH foi avaliada. Os desempenhos de PruGAI e TrGA foram testados em concentração de proteína igual de 0,25 mg/gds. O liquefeito de amilase tratado com amilase (34,9% ds, pH 3,8) foi usado como substrato. O pH d liquefeito de amido de milho (32% ds, pré-tratado com amilase) foi ajustado em pH 3,0 e 10 g foram transferidos para uma garrafa de vidro de 50 ml. As incubações foram realizadas a 32 Ό e 55 Ό. As amostras foram colet adas em 17, 24, 41, 48, 63, 72 h. Todas as incubações foram bruscamente arrefecidas por aquecimento a 100 Ό por 15 min. Os sobrenadantes das amostras foram transferidos e diluídos 400 vezes em H2SO4 5 mM para análise por HPLC com 0 uso das mesmas condições conforme mostrado no Exemplo 7. Os valores relatados na Tabela 7 refletem as porcentagens de área de pico de cada DPn como uma fração do DP1, DP2, DP3 e DP3+ total. Os dados na Tabela 8 mostram que PruGAI exibiu atividade

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51/58 glucogênica mais alta que TrGA quando dosado em concentração de proteína igual e incubado a 32 Ό, pH 3. Quando a temperatura de incubação foi aumentada até 55 Ό, PruGAI hidroliso u açúcares de alto DP muito eficazmente, com apenas 5% de DP3+ restando após incubação por 17 h, enquanto aquela para TrGA foi 18%.

[00148] Para avaliar adicionalmente o desempenho de PruGAI em baixo pH, outro teste foi conduzido em relação a liquefeito de amido em um pH ainda mais baixo (pH 2,0). O procedimento de triagem foi igual àquele para pH 3,0 exceto pelo fato de que as enzimas foram dosadas a 0,2 mg/gds e as amostras foram coletadas em 4, 21,29, 45, 53, 70 h. Conforme mostrado na Tabela 9, em pH 2 e 32 °C, o DP1 liberado por PruGAI foi 77,4% após 70 h, enquanto TrGA liberou 54%. A porcentagem de DP1 liberado por PruGAI a 55 °C foi 26,2% enquanto apenas 3,2% para reação de TrGA.

Tabela 8. Análise composicional de açúcar de hidrólise de PruGAI e

TrGA de liquefeito de amido a pH 3, a 32 °C ou 55 °C

Nome da amostra	Temperatura de incubação (°C)	Tempo (h)	% de DP3+	% de DP3	% de DP2	% de DP1
		17	36,9	1,2	6,1	55,8
		24	24,7	0,6	3,9	70,8
		41	20,9	0,6	1,5	77,1
TrGA	32
		48	18,2	0,5	1,5	79,8
		63	15,2	0,2	1,6	82,9
		72	14,3	0,4	1,7	83,6
		17	35,5	1,3	4,1	59,0
		24	20,9	0,6	2,2	76,3
		41	12,2	0,2	1,4	86,3
PruGAI	32
		48	9,7	0,4	1,6	88,3
		63	5,7	0,2	1,8	92,3
		72	5,3	0,2	2,1	92,4

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Nome da amostra	Temperatura de incubação (°C)	Tempo (h)	% de DP3+	% de DP3	% de DP2	% de DP1
		17	18,1	0,6	2,6	78,7
		24	14,2	0,5	2,3	83,1
		41	9,7	0,4	2,7	87,3
TrGA	55
		48	8,9	0,4	2,7	88,0
		63	7,2	0,0	3,0	89,8
		72	6,7	0,2	3,1	89,9
		17	4,8	0,4	2,6	92,2
		24	2,0	0,4	3,4	94,2
		41	2,5	0,5	4,8	92,1
PruGAI	55
		48	2,3	0,6	5,4	91,7
		63	2,5	0,0	6,9	90,7
		72	1,8	0,9	7,0	90,3

Tabela 9. Análise composicional de açúcar de hidrólise de PruGAI e

TrGA de liquefeito de amido a pH 2, a 32 °C ou 55 °C

Nome da amostra	Temperatura de incubação (°C)	Tempo (h)	% de DP3+	% de DP3	% de DP2	% de DP1
		4	77,7	7,7	4,5	10,1
		21	48,5	6,2	10,1	35,2
		29	44,1	4,2	11,1	40,6
TrGA	32
		45	36,6	1,9	12,2	49,3
		53	35,3	1,3	12,0	51,5
		70	33,5	0,9	11,6	54,0
		4	71,6	7,8	5,7	14,9
		21	35,3	0,9	11,6	52,2
		29	29,4	0,2	9,4	61,0
PruGAI	32
		45	26,0	0,2	5,0	68,8
		53	25,2	0,3	3,4	71,2
		70	20,3	0,6	1,7	77,4

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53/58

Nome da amostra	Temperatura de incubação (°C)	Tempo (h)	% de DP3+	% de DP3	% de DP2	% de DP1
		4	87,3	6,1	3,6	3,0
		21	87,2	5,9	3,8	3,2
		29	87,2	6,0	3,7	3,1
TrGA	55
		45	86,6	6,0	3,9	3,4
		53	86,9	6,1	3,8	3,2
		70	87,1	6,0	3,7	3,2
		4	62,1	8,0	7,2	22,7
		21	59,2	7,8	7,8	25,2
		29	57,8	7,7	7,9	26,5
PruGAI	55
		45	57,2	7,8	8,1	26,9
		53	59,2	7,6	7,7	25,5
		70	58,1	7,7	7,9	26,2

EXEMPLO 10

Brassagem por infusão em alta temperatura com glucoamilase em substrato de mosto [00149] A atividade glucogênica de PruGAI em processo de brassagem por infusão em alta temperatura foi avaliada em comparação com outros testes de desempenho de glucoamilase para substrato de mosto de aplicação de preparo.

[00150] A operação de brassagem foi realizada com 55% de malte do tipo Pilsner (malte do tipo Pilsner; Fuglsang Denmark, Lote 13.01.2016) e 45% de grão pronto para moagem de milho (Benntag Nordic; Nordgetreide GmBH Lübec, Alemanha, Lote: 02.05.2016.), com o uso de uma ração entre água e grão pronto para moagem de 4,0:1. O malte do tipo Pilsner foi moído em um moinho de malte Buhler Miag (configuração de 0,5 mm). Grão pronto para moagem de milho (1,35 g), Malte (malte do tipo pilsner moído, 1,65 g) foram misturados em copos wheaton (recipientes de vidro wheaton com tampa) pré-incubados com

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12,0g de água da torneira com pH ajustado em pH 5,4 com ácido sulfúrico 2,5 Μ. O substrato resultante (15%ds, pH 5,4) foi, então, usado para avaliação de desempenho de glucoamialse. PruGAI (10 μΙ de 1 mg/ml de estoque) foi adicionado em 90 μΙ do substrato dispensado em uma placa de microtitulação de PCR (Axygen). As outras glucoamilases avaliadas foram: Variante A de TrGA, uma variante de glucoamilase de Trichorderma reesie (com as substituições D44R e D539R, 10 μΙ de 2 mg/ml de estoque) e glucoamilase de Aspergillus niger (AnGA, 10 μΙ de 1 mg/ml de estoque). Todas as incubações foram executadas a 64 Ό por 4 h em temperatura de brassagem ainda mais alta, as incubações foram realizadas a 70 Ό por 2 h; seguidas por 79 ° C por 15 min. Após arrefecimento brusco, a reação a 95 Ό por 10 min, a mistura de reação foi centrifugada a 3.700 rpm por 10 min. As amostras de sobrenadante foram transferidas e diluídas 20 vezes em H2SO4 5 mM para análise por HPLC. A separação por HPLC foi realizada com 0 uso de um sistema de HPLC Agilent 1200 series com uma coluna Fast fruit (100 mm x 7,8 mm) a 85 °C. As amostras (10 μΙ) foram carregadas na coluna de HPLC e separadas com um gradiente isocrático de água purificada como a fase móvel a uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min. Os produtos de oligosacarídeo foram detectados com 0 uso de um detector de índice de refração. As atividades glucogênicas das amostras são resumidas na Tabela 10. A amostra de PruGAI a 100 ppm exibiu desempenho comparável à glucoamilase de variante A de TrGA A (TrGA vA) a 200 ppm. A enzima PruGAI também mostrou desempenho superior ao teste de desempenho quando a temperatura de incubação foi aumentada até 70 Ό e 0 tempo de incubação foi encurtado a 2 h.

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Tabela 10. Análise composicional de açúcar de glucoamilases incubadas com substrato de mosto a pH 5,4

Condição de brassagem	Nome da amostra	% de DP3+	% de DP3	% de DP2	% de DP1
64 O 4 h	AnGA	4	2	3	92
TrGA vA	0	1	2	98
PruGAI	0	0	2	98
70 0 2 h	TrGA vA	15	2	38	44
PruGAI	3	2	3	92

EXEMPLO 11

Brassagem por infusão em temperatura muito alta com o uso de malte e milho com glucoamilase [00151] A glucoamilase PruGAI foi testada na operação de brassagem com 55% de malte do tipo pilsner (malte do tipo Pilsner; Fuglsang Denmark, Lote 13.01.2016) e 45% de grão pronto para moagem de milho (Benntag Nordic; Nordgetreide GmBH Lübec, Alemanha, Lote: 02.05.2016.), com o uso de uma ração entre água e grão pronto para moagem de 4,0:1. O malte do tipo Pilsner foi moído com um moinho de malte Buhler Miag (configuração de 0,5 mm).

[00152] Grãos prontos para moagem de milho (1,35g) e malte (malte do tipo pilsner moído, 1,65 g) foram misturados em copos wheaton (recipientes de vidro wheaton com tampa) pré-incubados com 12,0 g de água da torneira com pH ajustado em pH 5,4 com ácido sulfúrico 2,5 M. A enzima glucoamilase foi adicionada com base em ppm de proteína ativa (no total 1,0 ml) e água como um controle sem enzima. Os copos wheaton foram colocados em Drybath (estação Thermo Scientific Stem) com agitação magnética e o seguinte programa de brassagem foi aplicado; as amostras foram aquecidas a 64 O por 3 0 minutos;

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56/58 mantidas a 64 G por 15 minutos; aquecidas a 79 G por 15 minutos aumentando-se a temperatura com 1 G/minuto; mantidas a 79 G por 15 minutos; aquecidas a 90 í por 11 minutos aumentando-se a temperatura com 1 G/minuto mantida a 90G por 15 m inutos; resfriadas a 79 G por 15 minutos e finalmente aquecidas a 79 °C por 15 minutos e removidas por brassagem. Uma amostra de 10 ml foi transferida para tubos Falcon e fervida a 100 °C por 20 minutos para garantir a inativação de enzima completa. O grão gasto foi separado do mosto por centrifugação em Heraeus Multifuge X3R a 4.500 rpm por 20 minutos a 10 °C. O sobrenadante foi coletado por análise de açúcar por HPLC com o uso de métodos padrão. Os resultados são mostrados na Tabela 11. Tabela 11. Distribuição relativa de açúcares (DP1 a DP5+) em mosto determinada por HPLC

	% de açúcar relativo
DP1	DP2	DP3	DP4	DP5+	Açúcar Total
200 ppm de PruGAI	48,04	33,95	3,39	1,38	13,23	100,00
300 ppm de PruGAI	58,42	26,63	1,71	1,21	12,02	100,00
500 ppm de PruGAI	74,60	15,53	1,06	0,48	8,34	100,00
750 ppm de PruGAI	83,44	7,41	0,75	0,12	8,28	100,00
Sem enzima - controle	12,46	35,86	11,45	4,34	35,90	100,00

[00153] Está claro que PruGAIfacilitou a alta produção de DP1 de uma maneira dependente de dose. Até 83,44% de DP1 foram produzidos em uma dose de 750 ppm de enzima.

EXEMPLO 12

100% de brassagem por infusão de milho em alta temperatura com glucoamilase

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57/58 [00154] O objetivo desse experimento foi avaliar a atividade glucogênica de PruGAI em processo de brassagem em alta temperatura com o uso de milho e malte em comparação com testes de desempenho industriais. A operação de brassagem foi realizada com 100% de grão pronto para moagem (Benntag Nordic; Nordgetreide GmBH Lübec, Alemanha, Batch: 02.05.2016.), com o uso de uma ração entre água e grão pronto para moagem de 4,0:1.

[00155] Os grãos prontos para moagem de milho (3,0 g) foram adicionados em copos wheaton (recipientes de vidro wheaton com tampa) pré-incubados com 12,0 g de água da torneira com pH ajustado em pH 5,4 com ácido sulfúrico 2,5 Μ. A enzima glucoamilase foi adicionada com base em ppm de proteína ativa (no total 1,0 ml) ou água como um controle sem enzima. Uma concentração fixa de 5,0 ppm de alfa-amilase (AMYLEX® 5T, da Dupont) e 0,21 ppm de beta-glucanase (LAMINEX® 750, da Dupont) foi aplicada a todas as amostras para facilitar a liquefação e filtrabilidade. Os copos wheaton foram colocados em Drybath (estação Thermo Scientific Stem) com agitação magnética e os três programas de brassagem diferentes foram aplicados. De acordo com o Perfil 1, as amostras foram aquecidas a 64 Ό; mantidas a 64 O por 80 minutos; aquecidas a 80 O por 10 mi nutos aumentandose a temperatura com 1,6 Ό/minuto; mantidas a 80 ° C por 30 minutos e, então, removidas por brassagem. De acordo com o Perfil 2, as amostras foram aquecidas a 70 Ό; mantidas a 70 Ό por 80 minutos; aquecidas a 80 Ό por 10 minutos aumentando a temperatura com 1 .OO/minuto; mantidas a 80 Ό por 30 minutos e, en tão, removidas por brassagem; De acordo com o Perfil 3, as amostras foram aquecidas a 75 Ό; mantidas a 75 Ό por 80 minutos; aquecidas a 80 Ό por 10 minutos aumentando-se a temperatura com 0,5 Ό/minuto; mantidas a 80 Ό por 30 minutos e, então, removidas por brassagem. Amostras de 10 ml foram transferidas para tubos Falcon e fervida a 100 °C por 20

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58/58 minutos para garantir a inativação de enzima completa. Os grãos gastos foram separados do mosto por centrifugação em Heraeus Multifuge X3R a 4.500 rpm por 20 minutos a 10 °C. O sobrenadante foi coletado por análise de açúcar por HPLC. As atividades glucogênicas das amostras são resumidas na Tabela 12.

Tabela 12. Análise composicional de açúcar de glucoamilases após brassagem por infusão com o uso de 100% de milho a pH 5,4 com o uso de várias temperaturas.

Condição de brassagem	Nome da amostra	% de DP3+	% de DP3	% de DP2	% de DP1
perfil 1: 64 <C 80 min, 80 Ό 30 min	TrGA	28	5	12	55
PruGAI	32	9	22	37
perfil 2: 70 Ό 80 min, 80 Ό 30 min	TrGA	31	7	21	41
PruGAI	29	8	24	39
perfil 3: 75 Ό 80 min, 80 Ό 30 min	TrGA	41	11	18	30
PruGAI	26	9	25	40

[00156] PruGAI exibiu desempenho aprimorado em perfil de brassagem a 70 O e 75 T (concentração final: 18 p pm) em comparação com TrGA (concentração final: 18 ppm), o tipo selvagem de glucoamilase de Trichorderma reesie.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo que tem atividade de glucoamilase, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo que consiste em:

(a) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95%, como até mesmo pelo menos 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 3;

(b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob, de preferência, pelo menos condições de baixa severidade, com mais preferência, pelo menos condições de severidade média, ainda com mais preferência, pelo menos condições de severidade média a alta, com máxima preferência, pelo menos severidade alta, e ainda com máxima preferência, pelo menos condições de severidade muito alta com (i) a sequência de codificação do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNA genômico que compreende a sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) uma fita complementar de comprimento total de (i) ou (ii);

(c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo que tem, de preferência, pelo menos 75%, com mais preferência, pelo menos 80%, com mais preferência, pelo menos 85%, com mais preferência, pelo menos 90%, com mais preferência, pelo menos 91 %, com mais preferência, pelo menos 92%, ainda com mais preferência, pelo menos 93%, com máxima preferência, pelo menos 94%, e ainda com máxima preferência, pelo menos 95%, como ainda pelo menos 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de codificação de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1;

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2/4 (d) uma variante que compreende uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3; e (e) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c) ou (d) que tem atividade de glucoamilase.

2. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1.
3. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 2, operativamente ligado a uma ou mais sequências de controle que controlam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.
4. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 2.
5. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que é um micro-organismo etanologênico.
6. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que expressa adicionalmente e secreta uma ou mais enzimas adicionais selecionadas a partir do grupo que compreende protease, hemicelulase, celulase, peroxidase, enzima lipolítica, enzima metalolipolítica, xilanase, lipase, fosfolipase, esterase, peridrolase, cutinase, pectinase, pectato liase, mananase, queratinase, redutase, oxidase, fenoloxidase, lipoxigenase, ligninase, alfa-amilase, pululanase, fitase, tanase, pentosanase, malanase, beta-glucanase, arabinosidase, hialuronidase, condroitinase, lacase, transferrase, ou uma combinação das mesmas.
7. Método para sacarificar um material que contém amido, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: i) colocar o material que contém amido em contato com uma alfa-amilase; e ii)

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3/4 colocar o material que contém amido em contato com uma glucoamilase em uma temperatura de pelo menos 70 C; em que o método produz pelo menos glicose 70% livre do material que contém amido (substrato).
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de a etapa (ii) é realizada em uma temperatura de pelo menos 75 'C, de preferência, pelo menos 80 C para entre 12 e 96 horas, de preferência, 18 a 60 horas.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de a glucoamilase mantém pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 100% de atividade relativa a uma temperatura de pelo menos 70 C, e/ou em um pH entre 2,0 e 7,0, de preferência, entre pH 4,0 e pH 6,0, com mais preferência entre pH 4,5 e pH 5,5.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que inclui realizar, sequencial ou simultaneamente a etapa (i) e etapa (ii).
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de compreende ainda uma pré-sacarificação antes da etapa de sacarificação ii).
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de a glucoamilase é o polipeptídeo, como definido na reivindicação 1.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, caracterizado pelo fato de que a etapa (i) é realizada na temperatura ou abaixo da temperatura de gelatinização do material que contém amido.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13, caracterizado pelo fato de que uma enzima desramificante adicional está ausente durante a etapa (i) e/ou etapa (ii).

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4/4
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a enzima desramificante é pululanase.
16. Sacarídeo, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 15.
17. Método para produzir produtos de fermentação do sacarídeo, como definido na reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o sacarídeo é fermentado por um organismo de fermentação.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o processo de fermentação é realizado sequencial ou simultaneamente com a etapa (ii).
19. Método, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o produto de fermentação compreende etanol.
20. Método, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o produto de fermentação compreende um metabólito não etanol.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o metabólito é ácido cítrico, ácido lático, ácido succínico, glutamato monossódico, ácido glucônico, gluconato de sódio, gluconato de cálcio, gluconato de potássio, um ácido orgânico, glucono delta-lactona, eritorbato de sódio, ácido graxo de ômega 3, butanol, iso-butanol, um aminoácido, lisina, tirosina, treonina, glicina, ácido itacônico, 1,3-propanodiol, vitaminas, enzimas, hormônios, isopreno ou outros produtos bioquímicos ou biomateriais.
22. Método de aplicação do polipeptídeo, como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é no preparo.
23. Método de aplicação do polipeptídeo, como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para a produção de cerveja ou uma bebida à base de malte.