BR112019011115A2 - métodos para tratar artropatia hemofílica usando fatores de coagulação quiméricos - Google Patents

Abstract

métodos para tratar artropatia hemofílica usando fatores de coagulação quimé- ricos. a presente invenção refere-se a métodos para tratar artropatia hemofílica reversível de uma articulação em um ser humano tendo hemofilia compreendendo administrar ao ser humano de uma quantidade eficaz de uma proteína quimérica ou composição compreendendo um fator de coagulação e uma região fc.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS PARA TRATAR ARTROPATIA HEMOFÍLICA USANDO FATORES DE COAGULAÇÃO QUIMÉRICOS.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTES RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica o benefício dos Pedidos Provisórios US. Nos. 62/429.509, depositado em 2 de dezembro de 2016, 62/529.896 depositado em 7 de julho de 2017, 62/550.488 depositado em 25 de agosto de 2017 e 62/558.793 depositado em 14 de setembro de 2017, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO [002] A presente invenção refere-se geralmente ao campo da terapêutica para distúrbios hemostáticos.

ANTECEDENTES [003] A hemofilia é um distúrbio hemorrágico ligado ao cromossomo X causado por mutações e/ou deleções em genes que codificam proteínas de coagulação, em particular o gene do Fator VIII (FVIII), resultando em uma deficiência da atividade de FVIII (hemofilia A) ou o gene do Fator IX, resultando em uma deficiência da atividade de FIX (hemofilia B) (ver, por exemplo, Peyvandi, F. e outros, Haemophilia 12: 82 a 89 (2006)). A doença é caracterizada por hemorragia espontânea e sangramento excessivo após o trauma. O tratamento da hemofilia é por terapia de substituição visando a restauração da atividade de FVIII e/ou FIX para prevenir o sangramento espontâneo (ver, por exemplo, Mannucci, P.M. e outros, N. Engl. J. Med. 344: 1773 a 1779 (2001)).

[004] Com o tempo, o sangramento repetido nos músculos e articulações, que muitas vezes começa no início da infância, resulta em artropatia hemofílica e lesão articular. A artropatia hemofílica é uma complicação comum e grave associada à hemofilia, que frequente

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2/143 mente resulta em dor, deformidade e incapacidade. Os pacientes mais comuns que sofrem de artropatia hemofílica são jovens do sexo masculino, com idades entre 3 e 15 anos. Embora os joelhos sejam as articulações mais prováveis de serem afetadas, a artropatia hemofílica também pode se apresentar no cotovelo, tornozelos, ombros e na coluna. A artropatia hemofílica é conhecida por ser irreversível. O tratamento atualmente disponível para artropatia hemofílica é, portanto, limitado.

[005] Por conseguinte, há uma necessidade de desenvolver novas formas de tratamento da artropatia hemofílica.

BREVE SUMÁRIO [006] Um aspecto da descrição fornece um método para tratar artropatia hemofílica reversível de uma articulação em um ser humano que tem hemofilia compreendendo administrar ao humano uma quantidade eficaz de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc ou uma composição compreendendo a proteína quimérica. Em algumas modalidades, a artropatia hemofílica reversível compreende sinovite. Em certas modalidades, a artropatia hemofílica reversível compreende uma micro-hemorragia ou hemorragia subclínica.

[007] Um outro aspecto da presente descrição fornece um método para tratar sinovite em um ser humano que tem hemofilia compreendendo administrar ao ser humano uma quantidade eficaz de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc ou uma composição compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. Em algumas modalidades, a sinovite está associada à artropatia hemofílica.

[008] Um outro aspecto da presente invenção fornece um método para reduzir a ocorrência de remodelação vascular em uma articulação de um ser humano que tem hemofilia compreendendo administrar ao

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3/143 ser humano uma quantidade eficaz de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. Outro aspecto da presente descrição fornece um tratamento profilático de remodelação vascular em uma articulação de um ser humano que tem hemofilia compreendendo administrar ao ser humano uma quantidade eficaz de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc ou uma composição compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc.

[009] Um outro aspecto da presente descrição fornece um método para melhorar o tecido mole circundante de uma articulação de um ser humano que tem hemofilia compreendendo administrar ao ser humano uma quantidade eficaz de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc ou uma composição compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. [0010] Em algumas modalidades, a administração melhora um escore de saúde articular (HJHS) no ser humano. Em algumas modalidades, a administração reduz a dor nas articulações no ser humano.

[0011] Em certas modalidades, a região Fc liga-se especificamente a um receptor ll-b da região Fc da gama imunoglobulina (FcyRIIB) de baixa afinidade. Em algumas modalidades, a região Fc liga-se especificamente à molécula não integrina captadora da molécula de adesão intercelular 3 e específica das células dendríticas (DCSIGN).

[0012] Em alguns aspectos, o método compreende ainda identificar o ser humano em necessidade do tratamento. Em algumas modalidades, a identificação compreende o uso de um sistema de imagiologia. Em certas modalidades, o sistema de imagiologia compreende uma radiografia, uma imagiologia por ressonância magnética, uma ultrassonografia, uma ultrassonografia com Doppler de alta

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4/143 potência, ou qualquer combinação destas. Em algumas modalidades, o ser humano expressa um ou mais biomarcadores associados à inflamação das articulações.

[0013] Em alguns aspectos, o fator de coagulação é selecionado a partir do grupo que consiste em fator VII (FVII), fator Vila (FVIIa), fator VIII (FVIII), fator IX (FIX), fator X (FX), fator de von Willebrand (VWF), uma sua porção de ligação ao antígeno que se liga especificamente a FIX e FX, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a proteína quimérica compreende FVIII-Fc. Em outras modalidades, a proteína quimérica compreende FIX-Fc. Em uma modalidade, a proteína quimérica compreende uma porção de fator VIII e uma porção de VWF, em que a porção de FVIII compreende um polipeptídeo de FVIII ou um fragmento do mesmo, em que a porção de VWF compreende um polipeptídeo de VWF ou um fragmento do mesmo, em que a porção de FVIII está ligada a uma primeira região Fc, em que a porção de VWF está ligada a uma segunda região Fc, e em que a primeira região Fc e a segunda região Fc estão associadas uma com a outra.

[0014] Em algumas modalidades, a proteína quimérica compreende ainda uma porção de extensão de meia-vida. Em certas modalidades, a porção de extensão de meia-vida compreende albumina ou um fragmento do mesmo, uma porção de ligação à albumina, uma sequência PAS, uma sequência HAP, transferrina ou um fragmento da mesma, polietileno glicol (PEG), ácido polissiálico, hidroxietil amido (HES), um derivado do mesmo, ou qualquer combinação destes.

[0015] Em alguns aspectos, a quantidade eficaz da composição, por exemplo, a proteína quimérica, compreendendo FVIII e uma região Fc é de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 300 IU/kg. Em algumas modalidades, a proteína quimérica compreendendo FVIII-Fc é administrada em um intervalo de dosagem de aproximadamente dois

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5/143 dias, aproximadamente três dias, aproximadamente quatro dias, aproximadamente cinco dias, aproximadamente seis dias, aproximadamente sete dias, aproximadamente oito dias, aproximadamente nove dias, aproximadamente dez dias, aproximadamente 11 dias, aproximadamente 12 dias, aproximadamente 13 dias, aproximadamente 14 dias, aproximadamente 15 dias, aproximadamente 16 dias, aproximadamente 17 dias, aproximadamente 18 dias, aproximadamente 19 dias, aproximadamente 20 dias, aproximadamente 21 dias, aproximadamente 23 dias, ou aproximadamente 24 dias.

[0016] Em outros aspectos, a quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo FIX-Fc é de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg. Em algumas modalidades, a proteína quimérica compreendendo FIX-Fc é administrada em um intervalo de dosagem de aproximadamente três dias, quatro dias, cinco dias, seis dias, sete dias, oito dias, nove dias, dez dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias ou 28 dias.

[0017] Em uma modalidade particular, a proteína quimérica compreende uma porção de FVIII, uma porção de VWF, uma primeira região Fc e uma segunda região Fc; em que a porção de FVIII compreende um polipeptídeo de FVIII ou um fragmento do mesmo; em que a porção de VWF compreende um polipeptídeo de VWF ou um fragmento do mesmo; em que a porção de FVIII está ligada à primeira região Fc; em que a porção de VWF está ligada à segunda região Fc; e em que a primeira região Fc e a segunda região Fc estão associadas uma à outra.

MODALIDADES [0018] E1. Método para tratar artropatia hemofílica reversível de uma articulação em um ser humano tendo hemofilia compreendendo administrar ao ser humano uma quantidade eficaz de uma proteína

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6/143 quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. [0019] E2. O método de E1, em que a artropatia hemofílica reversível compreende sinovite.

[0020] E3. O método de E1 ou E2, em que a artropatia hemofílica reversível compreende uma micro-hemorragia.

[0021] E4. Método para tratar sinovite em um ser humano que tem hemofilia compreendendo administrar ao ser humano uma quantidade eficaz de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc.

[0022] E5. O método de E4, em que a sinovite está associada à artropatia hemofílica.

[0023] E6. Método para prevenir ou reduzir a ocorrência de remodelação vascular em uma articulação de um ser humano que tem hemofilia compreendendo administrar ao ser humano uma quantidade eficaz de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc.

[0024] E7. Método para melhorar o tecido mole circundante de uma articulação de um ser humano que tem hemofilia compreendendo administrar ao ser humano uma quantidade eficaz de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc.

[0025] E8. O método de qualquer um de E1 a E7, em que a administração melhora um escore de saúde articular (HJHS) no ser humano.

[0026] E9. O método de E8, em que o escore de saúde articular é uma soma dos totais das articulações e do escore Global Gait.

[0027] E10. O método de E9, em que os totais das articulações são medidos com base no inchaço, duração do inchaço, atrofia muscular, crepitação em movimento, perda de flexão, perda de extensão, dor nas articulações, e força.

[0028] E11. O método de E9, em que o escore Global Gait é

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7/143 medido com base em andar, subir, correr ou pular em uma perna. [0029] E12. O método de qualquer um de E1 a E11, em que a administração reduz a dor nas articulações no ser humano.

[0030] E13. O método de qualquer um de E1 a E12, em que a articulação é selecionada a partir do grupo que consiste em um ambos os cotovelos, um ou ambos os joelhos, um ou ambos tornozelos, um ou ambos os ombros, um ou ambos os quadris, um ambos os pulsos, uma ou mais articulações da mão, uma ou mais articulações do pé, e qualquer combinação dos mesmos.

[0031] E14. O método articulação é um cotovelo.

[0032] E15. O método articulação é um joelho.

[0033] E16. O método articulação é um tornozelo.

[0034] E17. O método região Fc se liga especificamente a um receptor da região Fc da gama ou os ou de de de de qualquer qualquer qualquer qualquer um um um um de de de de

E13,

E13,

E13,

E16, em em em em que que que que imunoglobulina de baixa afinidade ll-b (FcyRIIB).

[0035] E18. O método de qualquer um de E1 a E17, em que a região Fc se liga especificamente à molécula não integrina captadora da molécula de adesão intercelular 3 e específica das células dendríticas (DC-SIGN).

[0036] E19. O método de qualquer um de E1 a E18, compreendendo ainda identificar o ser humano que precisa de tratamento.

[0037] E20. O método de E19, em que a identificação compreende o uso de um sistema de imagiologia.

[0038] E21. O método de E20, em que o sistema de imagiologia compreende uma radiografia, uma imagiologia por ressonância magnética, uma ultrassonografia, uma ultrassonografia com Doppler de alta potência ou qualquer combinação dos mesmos.

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8/143 [0039] E22. O método de E21, em que o ser humano expressa um ou mais biomarcadores associados à inflamação das articulações.

[0040] E23. O método de qualquer um de E1 a E22, em que o fator de coagulação é selecionado a partir do grupo que consiste em fator VII (FVII), fator Vila (FVIIa), fator VIII (FVIII), fator IX (FIX), fator X (FX), fator de von Willebrand (VWF), uma porção de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a FIX e FX, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0041] E24. O método de qualquer um de E1 a E23, em que a proteína quimérica compreende FVIII-Fc.

[0042] E25. O método de qualquer um de E1 a E23, em que a proteína quimérica compreende FIX-Fc.

[0043] E26. O método de qualquer um de E1 a E24, em que a proteína quimérica compreende uma porção de fator VIII e uma porção de VWF, em que a porção de FVIII compreende um polipeptídeo de FVIII ou um fragmento do mesmo, em que a porção de VWF compreende um polipeptídeo de VWF ou um fragmento do mesmo, em que a porção de FVIII está ligada a uma primeira região Fc, em que a porção de VWF está ligada a uma segunda região Fc, e em que a primeira região Fc e a segunda região Fc estão associadas uma à outra.

[0044] E27. O método de qualquer um de E23, E24 e E26, em que o polipeptídeo de FVIII compreende FVIII maduro de comprimento total.

[0045] E28. O método de qualquer um de E23, E24 e E26, em que o polipeptídeo FVIII compreende um FVIII com o domínio B deletado.

[0046] E29. O método de E28, em que o FVIII de domínio B deletado compreende uma deleção de todo ou parte do domínio B de FVIII.

[0047] E30. O método de E28 ou E29, em que o FVIII de domínio

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B deletado compreende uma deleção dos resíduos de aminoácidos 746 a 1648 de FVIII maduro.

[0048] E31. O método de qualquer um de E23, E24 e E25 a E30, em que o polipeptídeo de VWF compreende um fragmento de VWF compreendendo um domínio D’ e um domínio D3 de VWF.

[0049] E32. O método de qualquer um de E1 a E31, em que a proteína quimérica compreende ainda uma porção de extensão de meia-vida.

[0050] E33. O método de E32, em que a porção de extensão de meia-vida compreende albumina ou um fragmento da mesma, uma porção de ligação à albumina, uma sequência PAS, uma sequência HAP, transferrina ou um fragmento da mesma, polietileno glicol (PEG), ácido polissiálico, hidroxietil amido (HES), um derivado do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0051] E34. O método de E32 ou E33, em que a porção de extensão de meia-vida é inserida dentro do fator de coagulação.

[0052] E35. O método de E32 ou E33, em que a porção de extensão de meia-vida é inserida entre o fator de coagulação e a região Fc.

[0053] E36. O método de qualquer um de E24 e E26 a E35, em que a quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo FVIII e uma região Fc é de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 300 IU/kg.

[0054] E37. O método de E36, em que a quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo FVIII-Fc é de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 275 IU/kg, aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 250 IU/kg, aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 200 IU/kg, aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 175 IU/kg, aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 150 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 125 IU/kg, de

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10/143 aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 90 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 80 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 70 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg para aproximadamente 60 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 50 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 40 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 30 IU/kg, de aproximadamente 30 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 40 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 50 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 60 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 70 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 80 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 90 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 100 IU/kg a aproximadamente 200 IU/kg, de aproximadamente 150 IU/kg a aproximadamente 200 IU/kg, de aproximadamente 200 IU/kg a aproximadamente 300 IU/kg, de aproximadamente 225 IU/kg a aproximadamente 300 IU/kg, de aproximadamente 250 IU/kg a aproximadamente 300 IU/kg, de aproximadamente 275 IU/kg a aproximadamente 300 IU/kg, ou de aproximadamente 25 IU/kg a aproximadamente 75 IU/kg.

[0055] E38. O método de E36 ou E37, em que a quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo FVIII-Fc é de aproximadamente 25 IU/kg a aproximadamente 65 IU/kg.

[0056] E39. O método de qualquer um de E24 e E26 a E38, em que a proteína quimérica compreendendo FVIII-Fc é administrada em um intervalo de dosagem de aproximadamente dois dias, aproximadamente três dias, aproximadamente quatro dias, aproximadamente cinco dias, aproximadamente seis dias, aproximadamente sete dias aproximadamente oito dias, aproximadamente nove dias, aproxi

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11/143 madamente dez dias, aproximadamente 11 dias, aproximadamente 12 dias, aproximadamente 13 dias, aproximadamente 14 dias, aproximadamente 15 dias, aproximadamente 16 dias, aproximadamente 17 dias, aproximadamente 18 dias, aproximadamente 19 dias 20 dias, aproximadamente 21 dias, aproximadamente 22 dias, aproximadamente 23 dias, ou aproximadamente 24 dias.

[0057] E40. O método de qualquer um de E24 e E26 a E38, em que a proteína quimérica compreendendo FVIII-Fc é administrada em um intervalo de dosagem de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 13 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 12 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 11 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 9 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 7 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 dias, de aproximadamente 2 a aproximadamente 14 dias, de aproximadamente 3 a aproximadamente 14 dias, de aproximadamente 4 a aproximadamente 14 dias, de aproximadamente 5 a aproximadamente 14 dias, de aproximadamente 6 a aproximadamente 14 dias, de aproximadamente 7 a aproximadamente 14 dias, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14 dias, de aproximadamente 9 a aproximadamente 14 dias, de aproximadamente 10 a aproximadamente 14 dias, de aproximadamente 11 a aproximadamente 14 dias, de aproximadamente 12 a aproximadamente 14 dias, de aproximadamente 13 a aproximadamente 14 dias, ou de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 dias.

[0058] E41. O método de qualquer um de E24 e E26 a E40, em

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12/143 que a proteína quimérica compreendendo FVIII-Fc é administrada em um intervalo de dosagem de aproximadamente 3 dias a aproximadamente 5 dias.

[0059] E42. O método de E25, em que a quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo FIX-Fc é de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg.

[0060] E43. O método de E25 ou E42, em que a quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo FIX-Fc é de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 30 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 40 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 50 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 60 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 70 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 80 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 90 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 90 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 80 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 70 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 60 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 50 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 40 IU/kg, ou de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 30 IU/kg.

[0061] E44. O método de qualquer um de E25 e E42 a E44, em que a quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo FIX-Fc é de aproximadamente 50 IU/kg a E100 IU/kg.

[0062] E45. O método de qualquer um de E25 e E42 a E44, em que a proteína quimérica compreendendo FIX-Fc é administrada em um intervalo de dosagem de aproximadamente três dias, quatro dias, cinco dias, seis dias, sete dias, oito dias, nove dias, dez dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20

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13/143 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias ou E28 dias.

[0063] E46. O método de qualquer um de E25 e E42 a E45, em que a proteína quimérica compreendendo FIX-Fc é administrada em um intervalo de dosagem de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 19 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 18 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 17 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 16 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 13 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 12 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 11 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 9 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 7 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 dias, de aproximadamente 2 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 3 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 4 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 5 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 6 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 7 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 8 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 9 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 10 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 11 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 13 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 14 a aproximadamente 21 dias, de aproxima

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14/143 damente 15 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 16 dias a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 17 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 18 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 19 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 20 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 dias, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15 dias, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 dias.

[0064] E47. O método de qualquer um de E25 e E42 a E46, em que a proteína quimérica compreendendo FIX-Fc é administrada em um intervalo de dosagem de aproximadamente 7 dias, aproximadamente 8 dias, aproximadamente 9 dias, aproximadamente 10 dias, aproximadamente 11 dias, aproximadamente 12 dias, aproximadamente 13 dias, ou aproximadamente 14 dias.

[0065] E48. O método de qualquer um de E1 a E32, em que a proteína quimérica compreende uma porção de FVIII, uma porção de VWF, uma primeira região Fc e uma segunda região Fc; em que a porção de FVIII compreende um polipeptídeo de FVIII ou um fragmento do mesmo; em que a porção de VWF compreende um polipeptídeo de VWF ou um fragmento do mesmo; em que a porção de FVIII está ligada à primeira região Fc; em que a porção de VWF está ligada à segunda região Fc; e em que a primeira região Fc e a segunda região Fc estão associadas uma à outra.

[0066] E49. O método de qualquer um de E1 a E47, em que a região Fc da proteína quimérica facilita a localização da proteína quimérica na articulação.

[0067] E50. O método de qualquer um de E1 a E49, em que o ser humano tem menos de 6 anos de idade.

[0068] E51. O método de qualquer um de E1 a E49, em que o ser humano tem 6 anos a menos de 12 anos de idade.

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15/143 [0069] E52. O método de qualquer um de E1 a E49, em que o ser humano tern 12 anos de idade ou mais.

[0070] E53. O método de qualquer um de E1 a E52, em que o fator de coagulação se distribui aos tecidos fora do compartimento de plasma bem como no compartimento de plasma.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0071] As Figuras 1A-1F mostram taxas de hemorragias anualizadas (ABRs) pré-estudo (Figuras. 1A, 1C e 1E) e medianas em estudo (Figuras 1B, 1D e 1F) para indivíduos a partir do estudo de FVIII-Fc (Figuras 1A e 1B) e estudo de FVIII-Fc para crianças (Figuras 1C-1F) com articulações alvo na linha de base. As Figuras 1C-1D mostram dados combinados do estudo de FVIII-Fc para crianças, enquanto as Figuras 1E-1F mostram os mesmos dados estratificados com base na idade do indivíduo (menos de 6 anos de idade e entre 6 e menos de 12 anos de idade).

[0072] As Figuras 2A-2B mostram a alteração média no Escore de Saúde Articular na Hemofilia total modificada (mHJHS; eixo y) a partir da linha de base do estudo FVIII-Fc através do estudo de extensão ano 2 (Figura 2A; eixo x) e através do estudo de extensão ano 3 (Figura 2B; eixo x). A Figura 2B distingue entre a presença (sim; triângulos) e a ausência (não; círculos) das articulações alvo na linha de base.

[0073] As Figuras 3A-3C mostram a alteração média no mHJHS total (eixo y) a partir da linha base do estudo de FVIII-Fc através do estudo de extensão ano 2 (Figura 3A; eixo x) e estudo de extensão ano 3 (Figura 3B) e do estudo com FVIII -Fc para crianças através da extensão ano 2 (Figura 3C; eixo x) para indivíduos que recebem tratamento profilático pré-estudo e indivíduos que recebem tratamento episódico pré-estudo (sob demanda).

[0074] A Figura 4 mostra a alteração média no mHJHS total (eixo

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y) da linha de base do estudo de FVIII-Fc até o ano 2 (eixo x) para indivíduos que têm articulações alvo na linha de base do estudo de FVIII-Fc (quadrados) e indivíduos que não têm articulações alvo na linha de base de estudo de FVIII-Fc (diamantes).

[0075] A Figura 5 mostra a alteração média no mHJHS total (eixo y) a partir da linha de base do estudo de FVIII-Fc até o ano 2 (eixo x) para indivíduos no quartil mais baixo de comprometimento (Q1; > 110) nos escores de mHJHS na linha de base do estudo com FVIII- Fc (diamantes), no segundo quartil mais baixo de comprometimento (Q2; > 10-22) nos escores de mHJHS na linha de base do estudo de FVIIIFc (quadrados); no segundo quartil mais alto de comprometimento (Q3; > 22-34) nos escores de mHJHS no estudo de FVIII-Fc na linha de base do estudo de FVIII-Fc (triângulos) e o quartil mais alto de comprometimento (Q4; > 34-37) nos escores de mHJHS na linha de base do estudo de FVIII-Fc (diamantes).

[0076] A Figura 6 mostra a alteração média no mHJHS total (eixo y) a partir da linha de base do estudo de FVIII-Fc até o ano 2 (eixo x) para indivíduos com articulações alvo na linha de base do estudo de FVIII-Fc.

[0077] A Figura 7 mostra a alteração média no mHJHS total (eixo y) a partir da linha de base do estudo de FVIII-Fc até o ano 2 (eixo x) para as articulações alvo que suportam peso (diamantes) e as articulações alvo que não suportam peso (quadrados).

[0078] A Figura 8 mostra a alteração média em mHJHS (eixo y) a partir da linha base do estudo de FVIII-Fc até o ano 2 (eixo x) para inchaço (diamantes), amplitude de movimento (quadrados), e força (triângulos).

[0079] A Figura 9 mostra a alteração média (SEM) no mHJHS (eixo y) em pacientes de estudo de FVIII-Fc para instabilidade articular (quadrados cinza escuros), inchaço (triângulos pretos), atrofia

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17/143 muscular (quadrados cinza claros), dor nas articulações (diamantes cinza claros), crepitação (quadrados pretos) e força (círculos cinza claros). Os escores da linha de base total (BL) para cada medição de mHJHS são mostrados.

[0080] As Figuras 10A-10B mostram as taxas de hemorragia anualizadas (ABRs) pré-estudo (Figura 10A) e mediana em estudo (Figura 10B) (IQR) para indivíduos a partir de um estudo de rFIXFc. A Figura 10B mostra ainda ABR global em estudo (círculos escuros), ABR global da articulação alvo (diamantes cinzas) e ABR espontâneo da articulação alvo (triângulos cinzas). WP = profilaxia semanal; IP = profilaxia do intervalo individualizado; e MP = profilaxia modificada (Figura 10A-10B).

[0081] A Figura 11 é uma representação gráfica que mostra o número de articulações alvo avaliadas (tornozelo, joelho, cotovelo, quadril, punho e ombro) resolvidas e não resolvidas nesses indivíduos (n = 37) com ao menos doze meses de tempo de acompanhamento consecutivo que tiveram não foi submetido à cirurgia articular no prazo de doze meses desde o início do acompanhamento. O número (n) de cada articulação alvo é sobreposto aos dados relevantes, com um total de 93 articulações alvo avaliadas. A porcentagem de articulações alvo resolvidas (100%) e não resolvidas (0%) é mostrada abaixo do eixo x.

[0082] As Figuras. 12A-12C são imagens de tomografia de emissão de fóton simples (SPECT) de camundongos administrados com FIX marcado com ¹²⁵I-SIB (Figura 12A), FIXFc marcado com ¹²⁵lSIB (Figura 12B), ou FIX GlicoPEGuilado marcado com ¹²⁵I-SIB (Figura 12C). As Figuras 12D-12G mostram comparações diretas de camundongos aos quais foi administrado FIX marcado com ¹²⁵I-SIB, FIXFc marcado com ¹²⁵I-SIB ou FIX GlicoPEGuilado marcado com ¹²⁵lSIB em vários momentos. Os mapas de calor indicam a concentração relativa (% ID/g) do marcador ¹²⁵I-SIB em cada camundongo (Figura

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12A-12G).

[0083] As Figuras 13A-13B são gráficos que ilustram a intensidade da localização do marcador ¹²⁵I-SIB nos camundongos mostrados nas Figura 12A-12G, após administração de FIX marcado com ¹²⁵I-SIB, FIXFc marcado com ¹²⁵I-SIB, ou FIX GlicoPEGuilado marcado com ¹²⁵I-SIB ao longo do tempo nos joelhos (Figura 13A) e ombros (Figura 13B). Os dados foram coletados tanto para os joelhos direito e esquerdo quanto para os ombros direito e esquerdo, que foram combinados para gerar os dados mostrados (Figuras 13A e 13B, respectivamente).

[0084] A Figura 14A é um gráfico que ilustra a atividade relativa de FIX marcado e FIXFc marcado, em comparação com FIX e FIXFc não marcados, e conforme medido por ensaio cromogênico ou ensaio de um estágio. A Figura 14B é um gráfico que ilustra a farmacocinética de moléculas FIX marcadas e não marcadas em camundongos HemB.

[0085] As Figuras 15A-15F são desenhos que ilustram a faixa de movimentos para as articulações do cotovelo (flexão: Figura 15A; e extensão: Figura 15B), joelho (flexão: Figura 15C; e extensão: Figura 15D) e tornozelo (flexão plantar: Figura 15E, e flexão dorsal: Figura 15F), com os escores de saúde articular na hemofilia modificada (SHJ) e graus de flexão/extensão sobrepostos.

[0086] A Figura 16 é um fluxograma, delineando os métodos utilizados para investigar os efeitos de rFVIIIFc na ligação de FcyR, internalização, sinalização e produção de citocinas, e alterações da expressão gênica, bem como interações e efeitos subsequentes sobre células T in vitro.

[0087] As Figuras 17A-17C são representações gráficas dos níveis relativos de expressão de superfície de macrófagos e células dendríticas dos recetores de Fey CD16 (Figura 17A), CD32 (Figura 17B) e CD64 (Figura 17C) após tratamento com complexos imunes de

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19/143 peroxidase de rábano (HRP-IC; controle positivo), lgG1, FVIII recombinante (rFVIII), ou uma proteína de fusão de Fc rFVIII (rFVIIIFc). Os asteriscos (*) indicam o grau de significância (η = 3; * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0,005, a significância para HRP-IC em comparação com os outros tratamentos não é mostrada).

[0088] As Figuras 18A-18C são representações gráficas que ilustram a sinalização relativa após tratamento com rFVIII ou rFVIIIFc. A Figura 18A mostra a sinalização, medida por fosforilação de Syk, na linhagem celular monocítica THP-1 (THP-1), monócitos, macrófagos derivados de monócitos de sangue periférico (macrófago), e células dendríticas derivadas de monócitos de sangue periférico tratadas com HRP-IC, lgG1, rFVIII ou rFVIIIFc durante 15 minutos. A Figura 18B mostra a fosforilação relativa de Syk em macrófagos tratados com rFVIIIFc (WT), rFVIIIFc mutante que é incapaz de se ligar ao receptor Fc neonatal (FcRn mutante) ou com rFVIIIFc mutante que é incapaz de se ligar a FcyR (mutante FcgR). A Figura 18C mostra a produção relativa das citocinas pró-inflamatórias interleucina 1b (IL-1 b), IL-6, IL8, IL-10, e fator de necrose tumoral alfa (TNFa) em macrófagos vinte e quatro horas após o tratamento com HRP-IC, lgG1, rFVIII ou rFVIIIFc.

[0089] A Figura 19 mostra o estado de fosforilação relativa da fosfatase 1 contendo domínio da região 2 de homologia de Src (SHP1), pSHP2, fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato 5-fosfatase 1 (SHIP1), e pSHIP2 um minuto, cinco minutos e trinta minutos após o tratamento com rFVIII ou rFVIIIFc. Os asteriscos (*) indicam o grau de significância (n = 3; ** P < 0,01, *** P < 0,005).

[0090] As Figuras 20A-20M são representações gráficas de padrões de expressão gênica de macrófagos tolerogênicos após tratamento com rFVIII ou rFVIIIFc. Figuras. 20A-20B são diagramas de Venn, ilustrando a distribuição de genes que foram significativamente reprimidos (Figura 20A) e a distribuição de genes que foram

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20/143 significativamente induzidos (Figura 20B) em macrófagos derivados de monócitos tratados com lgG1, rFVIII ou rFVIIIFc durante seis horas (n = 3). As Figuras 20C-20G são gráficos que mostram as expressões relativas de vários genes da via do metabolismo lipídico e NRF2, tais como heme oxigenase 1 (Hmoxl; Figura 20C), receptor gama ativado por proliferador de peroxissoma (PPARy; Figura 20D), lipoproteína lipase (LPL; Figura 20E), resposta de crescimento precoce 2 (EGR2; Figura 20F) e membro da família do transportador de ânions orgânico de portador de soluto 4A1 (SLCO4A1; Figura 20G); CD206 às 6 horas (Figura 20I) e 12 horas (Figura 20J) após tratamento; e arginase 1 (ARG1; Figura 20L) medida por PCR quantitativa, após tratamento com rFVIII ou rFVIIIFc. Os asteriscos (*) indicam o grau de significância (n = 8; * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,005; Figuras 20C20G). As Figuras 20K e 20M são gráficos que mostram o número de células coletadas por citometria de fluxo expressando CD206. Além disso, verificou-se que os macrófagos educados com rFVIIIFc exibem um fenótipo semelhante a M2 característico (Figura 20I-20M). Em particular, os macrófagos tratados com rFVIIIFc apresentavam expressão de CD206 relativa mais elevada (também conhecido como receptor de manose do tipo 1; MRC1) do que as células tratadas com rFVIII após 6 horas (Figura 20I) e após 24 horas (Figura 20J), e macrófagos tratados com rFVIIIFc teve uma expressão relativa de ARG1 mais elevada do que as células tratadas com rFVIII após 24 horas (Figura 20M).

[0091] A Figura 21A é um fluxograma que descreve os métodos utilizados para determinar os efeitos do tratamento com rFVIIIFc na diferenciação de células T. A Figura 21B é uma representação gráfica da porcentagem de células T reguladoras seis dias após os macrófagos ou células dendríticas terem sido tratados com lgG1 (controle), rFVIII ou rFVIIIFc durante 24 horas e depois colocados em

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21/143 co-cultura com células T CD4 positivas virgens. A Figura 21C é uma representação gráfica da porcentagem de células T reguladoras após a cultura de células T positivas para CD4 virgens, no meio condicionado de macrófagos ou células dendríticas pré-tratadas com lgG1, rFVIII ou rFVIHFc.

[0092] A Figura 22 é uma ilustração do mecanismo proposto de diferenciação de células T reguladoras de rFVIHFc.

[0093] A Figura 23 é uma ilustração dos efeitos propostos de rFIXFc em macrófagos.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0094] A presente descrição fornece métodos para tratar artropatia hemofílica reversível de uma articulação em um ser humano que tem hemofilia compreendendo administrar ao ser humano uma quantidade eficaz de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc ou uma composição compreendendo um fator de coagulação e um Região Fc. A proteína quimérica aqui descrita também pode ser utilizada para tratar sinovite, uma inflamação microbiana, inflamação de uma ou mais articulações, remodelação vascular ou qualquer combinação das mesmas em uma articulação de um ser humano com hemofilia. Em certas modalidades, os métodos da presente invenção melhoram o tecido mole circundante de uma articulação de um ser humano que tem hemofilia.

DEFINIÇÕES [0095] Nota-se o termo uma entidade refere-se a uma ou mais dessa entidade; por exemplo, entende-se que uma sequência de nucleotídeos representa uma ou mais sequências de nucleotídeos. Como tal, os termos um (ou uma), um ou mais e pelo menos um podem ser utilizados de forma intercambiável neste documento.

[0096] Além disso, e/ou, quando usado aqui, é para ser tomado como descrição específica de cada uma das duas características ou

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22/143 componentes especificados com ou sem o outro. Assim, o termo e/ou, como utilizado em uma frase tal como A e/ou B, é aqui destinado a incluir A e B, A ou B, A (sozinho) e B (sozinho). Da mesma forma, o termo e/ou como usado em uma frase como A, B e/ou C destina-se a abranger cada um dos seguintes aspectos: A, B e C; A, B ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (sozinho); B (sozinho); e C (sozinho).

[0097] Entende-se que sempre que os aspectos são descritos aqui com a linguagem compreendendo, de outra forma aspectos análogos descritos em termos de consistindo de e/ou consistindo essencialmente em também são fornecidos.

[0098] A menos que indicado ao contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um versado na técnica ao qual esta descrição está relacionada. Por exemplo, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2^a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3^a ed., 1999, Academic Press; e Oxford Dictionary of Biochemistry And Molecular Biology, Revisado, 2000, Oxford University Press, fornece uma habilidade com um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta descrição.

[0099] Unidades, prefixos e símbolos são indicados em sua forma aceita pelo Sistema Internacional de Unidades (SI). Os intervalos numéricos incluem os números que definem o intervalo. A menos que indicado ao contrário, as sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação de amino para carboxi. Os títulos fornecidos aqui não são limitações dos vários aspectos da descrição, que podem ser obtidos por referência à especificação como um todo. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente definidos por referência à especificação na sua

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23/143 totalidade.

[00100] O termo aproximadamente é usado aqui para significar aproximadamente, em torno, ou nas regiões de. Quando o termo aproximadamente é usado em conjunto com um intervalo numérico, ele modifica esse intervalo estendendo os limites acima e abaixo dos valores numéricos estabelecidos. Assim, aproximadamente 10-20 significa aproximadamente 10 a aproximadamente 20. Em geral, o termo aproximadamente pode modificar um valor numérico acima e abaixo do valor declarado por uma variância de, por exemplo, 10 por cento, para cima ou para baixo (superior ou inferior).

[00101] Administrar, como aqui utilizado, significa fornecer uma composição farmaceuticamente aceitável, por exemplo, uma proteína quimérica, aqui descrita a um indivíduo através de uma via farmaceuticamente aceitável. As vias de administração podem ser intravenosas, por exemplo, injeção intravenosa e infusão intravenosa. As vias de administração adicionais incluem, por exemplo, administração subcutânea, intramuscular, oral, nasal e pulmonar. Proteínas quiméricas e proteínas híbridas podem ser administradas como parte de uma composição farmacêutica compreendendo ao menos um excipiente. Em algumas modalidades, a composição, por exemplo, a proteína quimérica é administrada a um ser humano através de uma terapia gênica, por exemplo, em que um ou mais polinucleotídeos que codificam o fator de coagulação e/ou a região Fc são administrados ao ser humano e o fator de coagulação e/ou a região Fc são expressos no ser humano.

[00102] Tratar, tratamento ou tratando, como é usado no presente documento, refere-se, por exemplo, à redução na gravidade de uma doença ou condição; à redução na duração de um curso de doença; à melhora ou deleção de um ou mais sintomas associados a uma doença ou condição; ao fornecimento de efeitos benéficos para

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24/143 um indivíduo com uma doença ou condição, sem necessariamente curar a doença ou condição, mas não inclui a profilaxia ou prevenção da artropatia hemofílica ou seus sintomas. Em uma modalidade, o termo tratando ou tratamento significa melhorar um índice de Saúde Articular na Hemofilia (HJHS) ou um HJHS modificado (mHJHS) para um indivíduo. Em algumas modalidades, o HJHS global ou mHJHS é melhorado. Em algumas modalidades, o escore individual para uma ou mais articulações alvo é melhorada. Em algumas modalidades, o termo tratando ou tratamento significa melhorar um escore de qualidade de vida (QoL) para um indivíduo. Em certas modalidades, um escore de QoL analisa a disposição do indivíduo relacionada a esportes e lazer, saúde física, lidar com hemofilia, planejamento familiar, sentimento (para a hemofilia) futuro, parceria e sexualidade, tratamento, visão (de si mesmo), trabalho e escola, ou qualquer combinação dos mesmos. Em outras modalidades, o termo tratando ou tratamento significa reduzir os efeitos e/ou a gravidade de um ou mais micro-hemorragias. Em outra modalidade, o termo tratando ou tratamento significa reduzir o inchaço e/ou inflamação e/ou dor em uma ou mais articulações alvo. Em outra modalidade, o termo tratando ou tratamento significa reduzir a remodelação vascular em uma ou mais articulações alvo.

[00103] Prevenir ou prevenindo, como usado aqui, refere-se a diminuir ou reduzir a ocorrência ou gravidade de um determinado resultado. Em algumas modalidades, a prevenção de um resultado é conseguida através de tratamento profilático.

[00104] O termo comparável, como aqui utilizado, significa uma taxa ou nível comparado resultante do uso, por exemplo, do polipeptídeo quimérico é igual, substancialmente igual a, ou similar à taxa ou nível de referência. O termo similar, como aqui utilizado, significa uma taxa ou nível comparado com uma diferença de não mais de 10%

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25/143 ou não mais de 15% da taxa ou nível de referência (por exemplo, taxa de geração de FXa por um polipeptídeo quimérico consistindo essencialmente de ou consistindo de duas porções de Fc e FVIII processado, em que o dito FVIII processado é fundido a um Fc das duas porções de Fc). O termo substancialmente igual significa que uma taxa ou nível comparado tem uma diferença de não mais que 0,01%, 0,5% ou 1% da taxa ou nível de referência.

[00105] Distúrbio hemostático, como usado aqui, significa uma condição herdada ou adquirida geneticamente, caracterizada por uma tendência à hemorragia, espontaneamente ou como resultado de trauma, devido a uma capacidade prejudicada ou incapacidade de formar um coágulo de fibrina. Exemplos de tais distúrbios incluem as hemofilias. As três formas principais são hemofilia A (deficiência do fator VIII), hemofilia B (deficiência do fator IX ou doença de natal) e hemofilia C (deficiência do fator XI, tendência a sangramento leve). Outros distúrbios hemostáticos incluem, por exemplo, doença de Von Willebrand, deficiência do fator XI (deficiência de PTA), deficiência do fator XII, deficiências ou anormalidades estruturais no fibrinogênio, protrombina, fator V, fator VII, fator X ou fator XIII, síndrome de Bernard-Soulier, que é um defeito ou deficiência em GPIb. GPIb, o receptor para VWF, pode ser defeituoso e levar à falta de formação de coágulos primários (hemostasia primária) e aumento da tendência ao sangramento, e trombastenia de Glanzman e Naegeli (trombastenia de Glanzmann). Na insuficiência hepática (formas aguda e crônica), há produção insuficiente de fatores de coagulação pelo fígado; isso pode aumentar o risco de sangramento.

[00106] Área sob a curva de concentração plasmática versus tempo (AUG), como usado aqui, é o mesmo que o termo da técnica em farmacologia, e é baseado na taxa e extensão de absorção de FVIII após administração. AUC é determinada ao longo de um período

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26/143 de tempo especificado, tal como 12, 18, 24, 36, 48 ou 72 horas, ou para infinito usando extrapolação com base na inclinação da curva. A menos que indicado ao contrário, a AUC é determinada para o infinito. A determinação da AUC pode ser realizada em um único indivíduo, ou em uma população de indivíduos para os quais a média é calculada. [00107] O termo atividade pró-coagulante significa a capacidade do fator de coagulação, por exemplo, uma proteína FVIII ou FIX, da invenção, de participar na cascata de coagulação no sangue, substituindo o fator de coagulação nativo, por exemplo, o FVIII ou FIX nativo. Por exemplo, uma proteína FIX recombinante da invenção tem atividade pró-coagulante quando pode converter o Fator X (FX) em Fator X ativado (FXa) na presença do Fator VIII (FVIII), como testado, por exemplo, em um ensaio cromogênico. Em outra modalidade, a atividade de FIX é uma capacidade de gerar um complexo tenase. Em outras modalidades, a atividade de FIX é uma capacidade de gerar trombina (ou um coágulo).

[00108] As referências feitas à numeração de aminoácidos de imunoglobulinas ou fragmentos de imunoglobulina, ou regiões, são todas baseadas em Kabat e outros 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Saúde Pública de U.S., Bethesda; MD, aqui incorporado por referência em sua totalidade. (O receptor FcRn foi isolado a partir de várias espécies de mamíferos incluindo seres humanos. As sequências de FcRn humano, FcRn de camundongo e FcRn de camundongo são conhecidas (Story e outros, J. Exp. Med. 180: 2377 (1994), aqui incorporadas, por referência na sua totalidade). Um Fc pode compreender os domínios CH2 e CH3 de uma imunoglobulina com ou sem a região de dobradiça da imunoglobulina. Variantes de Fc exemplificativas são fornecidas em WO 2004/101740 e WO 2006/074199, aqui incorporados por referência em sua totalidade.

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27/143 [00109] Os polipeptídeos e proteínas híbridos, tal como aqui utilizados, significam uma combinação de um polipeptídeo quimérico com um segundo polipeptídeo. O polipeptídeo quimérico e o segundo polipeptídeo em um híbrido podem estar associados entre si através de interações proteína-proteína, tal como interações carga-carga ou hidrofóbicas. O polipeptídeo quimérico e o segundo polipeptídeo em um híbrido podem estar associados um ao outro através de dissulfeto ou outra(s) ligação(ões) covalente(s). Os híbridos são descritos nos documentos WO 2004/101740 e WO 2006/074199, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Ver também as Patentes US. Nos. 7.404.956 e 7.348.004, cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade. O segundo polipeptídeo pode ser uma segunda cópia do mesmo polipeptídeo quimérico ou pode ser um polipeptídeo quimérico não idêntico.

[00110] Como aqui utilizado, um aminoácido correspondente a, sítio correspondente a ou aminoácido equivalente em uma sequência de proteína é identificado por alinhamento para maximizar a identidade ou similaridade entre uma primeira sequência de proteína, por exemplo, uma sequência de FVIII ou FIX, e uma segunda sequência de proteína, por exemplo, uma segunda sequência de FVIII ou uma segunda sequência de FIX. O número utilizado para identificar um aminoácido equivalente em uma segunda sequência de proteína baseia-se no número utilizado para identificar o aminoácido correspondente na primeira sequência de proteína.

[00111] Como aqui utilizado, o termo sítio de inserção refere-se a um número de resíduos de aminoácidos em um polipeptídeo (tipicamente um polipeptídeo maduro; por exemplo, um polipeptídeo FVIII maduro ou um FIX maduro), ou fragmento, variante ou derivado deste, que está imediatamente a montante da posição em que uma porção heteróloga pode ser inserida. Um sítio de inserção é

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28/143 especificado como um número, o número sendo o número da sequência de proteína especificadas para os aminoácidos a que corresponde o sítio de inserção, o qual é imediatamente N-terminal à posição da inserção. Por exemplo, a frase o domínio EGF2 compreende uma porção heteróloga em um sítio de inserção que corresponde ao aminoácido 105 de uma determinada sequência indica que a porção heteróloga está localizada entre dois aminoácidos correspondentes ao aminoácido 105 e ao aminoácido 106 da sequência. No entanto, um versado na técnica seria facilmente capaz de identificar uma posição correspondente em qualquer variante da proteína indicada, e a presente descrição não está limitada a inserções feitas apenas nas variantes especificamente descritas aqui. De preferência, as inserções aqui descritas podem ser feitas em quaisquer variantes relacionadas ou seus fragmentos tendo atividade em uma posição que corresponde a uma posição das variantes aqui descritas.

[00112] A frase imediatamente à jusante de um aminoácido, tal como é aqui utilizada, refere-se à posição logo em seguida ao grupo carboxil terminal do aminoácido. Do mesmo modo, a frase imediatamente a montante de um aminoácido refere-se à posição logo em seguida ao grupo amina terminal do aminoácido. Por conseguinte, a frase entre dois aminoácidos de um sítio de inserção, como aqui utilizada, refere-se a uma posição na qual uma porção heteróloga (por exemplo, uma porção de extensão da meia-vida) inserida entre dois aminoácidos adjacentes.

[00113] Os termos inserido, é inserido, inserido em ou termos gramaticalmente relacionados, como usados aqui, referem-se à posição de uma porção heteróloga (por exemplo, uma porção de extensão de meia-vida) em um polipeptídeo de fusão em relação à posição análoga na proteína especificada (por exemplo, uma proteína FVIII ou FIX). Os versados na técnica compreenderão como identificar

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29/143 posições de inserção correspondentes em relação a outras sequências polipeptídicas, por exemplo, outras variantes de FVIII e FIX. Como aqui utilizado, os termos referem-se às características do polipeptídeo recombinante aqui descrito e não indicam, implicam ou inferem em quaisquer métodos ou processos através dos quais o polipeptídeo de fusão foi produzido. Por exemplo, em referência a um polipeptídeo de fusão aqui fornecido, a frase uma unidade heteróloga é inserida no domínio EGF2 imediatamente à jusante do resíduo 105 do polipeptídeo FIX significa que o polipeptídeo de fusão compreende uma porção heteróloga imediatamente à jusante de um aminoácido que corresponde ao aminoácido 105 em uma variante particular de FIX, por exemplo, ligado por aminoácidos correspondentes aos aminoácidos 105 e 106 da variante de FIX.

[00114] Uma proteína de fusão ou quimérica compreende uma primeira sequência de aminoácidos ligada a uma segunda sequência de aminoácidos com a qual não está naturalmente ligada na natureza. As sequências de aminoácidos que normalmente existem em proteínas separadas podem ser reunidas no polipeptídeo de fusão, ou as sequências de aminoácidos que normalmente existem na mesma proteína podem ser colocadas em um novo arranjo no polipeptídeo de fusão, por exemplo, fusão de um domínio FVIII ou um domínio FIX da invenção com um domínio Ig Fc. Uma proteína de fusão é criada, por exemplo, por síntese química, ou criando e traduzindo um polinucleotídeo no qual as regiões peptídicas são codificadas na relação desejada. Uma proteína de fusão pode ainda compreender uma segunda sequência de aminoácidos associada com a primeira sequência de aminoácidos por uma ligação covalente, não peptídica ou uma ligação não covalente.

[00115] Os termos heteróloga e porção heteróloga significam que um polinucleotídeo, polipeptídeo ou outra porção é derivado de

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30/143 uma entidade distinta da entidade à qual está sendo comparada. Por exemplo, um polipeptídeo heterólogo pode ser sintético, ou derivado de uma espécie diferente, tipo de célula diferente de um indivíduo, ou o mesmo ou diferente tipo de célula de indivíduos distintos. Em um aspecto, uma porção heteróloga é um polipeptídeo fundido com outro polipeptídeo para produzir um polipeptídeo ou proteína de fusão. Em outro aspecto, uma porção heteróloga é um não polipeptídeo, tal como PEG conjugado com um polipeptídeo ou proteína.

[00116] Os termos ligados e fundidos, como aqui utilizados, referem-se a uma primeira sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos covalentemente ou não covalentemente ligada a uma segunda sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos, respectivamente. A primeira sequência de aminoácidos ou de nucleotídeos pode ser diretamente ligada ou justaposta à segunda sequência de aminoácido ou de nucleotídeos ou, alternativamente, uma sequência interveniente pode ligar covalentemente a primeira sequência à segunda sequência. O termo ligado significa não apenas uma fusão de uma primeira sequência de aminoácidos com uma segunda sequência de aminoácidos no C terminal ou no N terminal, mas também inclui a inserção da primeira sequência inteira de aminoácidos (ou da segunda sequência de aminoácidos) em quaisquer dois aminoácidos na segunda sequência de aminoácidos (ou na primeira sequência de aminoácidos, respectivamente). Em uma modalidade, a primeira sequência de aminoácidos está ligada a uma segunda sequência de aminoácidos por uma ligação peptídica ou um ligante. A primeira sequência de nucleotídeos pode ser ligada a uma segunda sequência de nucleotídeos por uma ligação fosfodiéster ou um ligante. O ligante pode ser um peptídeo ou um polipeptídeo (para cadeias de polipeptídeos) ou um nucleotídeo ou uma cadeia de nucleotídeos (para cadeias de nucleotídeos) ou qualquer porção química (para cadeias de

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31/143 polipeptídeos e de polinucleotídeos). O termo ligado também é indicado por um hífen (-).

[00117] Como aqui utilizado, o termo associado a refere-se a uma ligação covalente ou não covalente formada entre uma primeira cadeia de aminoácidos e uma segunda cadeia de aminoácidos. Em uma modalidade, o termo associado a significa uma ligação covalente, não peptídica ou uma ligação não covalente. Essa associação pode ser indicada por dois pontos, ou seja, (:). Em outra modalidade, significa uma ligação covalente, exceto uma ligação peptídica. Por exemplo, o aminoácido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação ou ponte dissulfeto com um grupo tiol em um segundo resíduo de cisteína. Na maioria das moléculas IgG de ocorrência natural, as regiões CH1 e CL estão associadas por uma ligação dissulfeto e as duas cadeias pesadas estão associadas por duas ligações dissulfeto nas posições correspondentes a 239 e 242 utilizando o sistema de numeração de Kabat (posição 226 ou 229, sistema de numeração EU). Exemplos de ligações covalentes incluem, mas não estão limitados a uma ligação peptídica, uma ligação metálica, uma ligação de hidrogênio, uma ligação dissulfeto, uma ligação sigma, uma ligação pi, uma ligação delta, uma ligação glicosídica, uma ligação agnóstica, uma ligação bent, uma ligação dipolar, um backbond de Pi, uma ligação dupla, uma ligação tripla, uma ligação quádrupla, uma ligação quíntupla, uma ligação sêxtupla, conjugação, hiperconjugação, aromaticidade, hapticidade ou antiligação. Exemplos não limitantes de ligação não covalente incluem uma ligação iônica (por exemplo, ligação cátion-pi ou ligação salina), uma ligação metálica, uma ligação de hidrogênio (por exemplo, ligação di-hidrogênio, complexo di-hidrogênio, ligação de hidrogênio de baixa barreira ou ligação hidrogênio simétrica), força de van der Walls, força de dispersão de London, uma ligação mecânica, uma ligação halogênio,

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32/143 aurofilicidade, intercalação, empilhamento, força entrópica, ou polaridade química.

[00118] Como aqui utilizado, o termo sítio de divagem ou sítio de divagem enzimática refere-se a um sítio reconhecido por uma enzima. Certos sítios de divagem enzimática compreendem um sítio de processamento intracelular. Em uma modalidade, um polipeptídeo tem um sítio de divagem enzimática clivado por uma enzima que é ativada durante a cascata de coagulação, de tal modo que a divagem de tais sítios ocorre no sítio de formação de coágulos. Exemplos desses sítios incluem, por exemplo, aqueles reconhecidos pela trombina, Fator Xla ou Fator Xa. Outros sítios de divagem enzimática são conhecidos na técnica.

[00119] Como aqui utilizado, o termo sítio de processamento ou sítio de processamento intracelular refere-se a um tipo de sítio de divagem enzimática em um polipeptídeo que é um alvo para enzimas que funcionam após a tradução do polipeptídeo. Em uma modalidade, tais enzimas funcionam durante o transporte do lúmen de Golgi para o compartimento trans-Golgi. As enzimas de processamento intracelular clivam polipeptídeos antes da secreção da proteína a partir da célula. Exemplos de tais sítios de processamento incluem, por exemplo, aqueles visados pela família de endopeptidases PACE/furina (em que PACE é um acrônimo para enzima de Clivagem de aminoácidos básicos pareados). Estas enzimas estão localizadas na membrana de Golgi e clivam proteínas no lado carboxi terminal da sequência do motivo Arg- [qualquer resíduo] - (Lys ou Arg) -Arg. Como aqui utilizado, a família das enzimas furina inclui, por exemplo, PCSK1 (também conhecido como PC1/Pc3), PCSK2 (também conhecido como PC2), PCSK3 (também conhecido como furina ou PACE), PCSK4 (também conhecido como PC4), PCSK5 (também conhecido como PC5 ou PC6), PCSK6 (também conhecido como PACE4) ou PCSK7 (também

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33/143 conhecido como PC7/LPC, PC8 ou SPC7). Outros sítios de processamento são conhecidos na técnica.

[00120] Em construtos que incluem mais de um sítio de processamento ou divagem, entende-se que tais sítios podem ser iguais ou diferentes.

[00121] Um ligante processável, tal como é aqui utilizado, referese a um ligante compreendendo ao menos um sítio de processamento intracelular, que é aqui adicionalmente descrito.

[00122] Linha de base, como usado aqui, é o menor nível plasmático medido de um determinado analito, por exemplo, um fator de coagulação (por exemplo, FVIII ou FIX), em um indivíduo antes da administração de uma dose. Os níveis plasmáticos podem ser medidos em dois momentos antes da dosagem: em uma visita de triagem e imediatamente antes da dosagem. Alternativamente, (a) a linha de base em indivíduos cuja atividade do fator de coagulação prétratamento é < 1%, que não têm antígeno detectável do fator de coagulação e têm genótipos não senso pode ser definida como 0%, (b) a linha de base para indivíduos com atividade do fator de coagulação pré-tratamento < 1% e que têm antígeno detectável do fator de coagulação pode ser definida como 0,5%, (c) a linha de base para indivíduos cuja atividade do fator de coagulação pré-tratamento está entre 1 - 2% é Cmin (a atividade mais baixa durante o estudo PK), e (d) a linha de base para indivíduos cuja atividade do fator de coagulação pré-tratamento é > 2% pode ser definida como 2%.

[00123] Dose equivalente, como é usado no presente documento, significa a mesma dose de atividade do fator de coagulação, por exemplo, atividade de FVIII ou atividade de FIX, como expresso em Unidades Internacionais, que é independente do peso molecular do polipeptídeo em questão. Por exemplo, uma unidade internacional (IU) de atividade de FVIII corresponde aproximadamente à quantidade de

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FVIII em um mililitro de plasma humano normal. Estão disponíveis vários ensaios para medir a atividade do fator de coagulação, incluindo o ensaio de substrato cromogênico da Farmacopeia Européia e um ensaio de coagulação de um estágio.

[00124] Intervalo de dosagem, como usado aqui, significa a dose de tempo que decorre entre múltiplas doses sendo administradas a um indivíduo. A comparação do intervalo de dosagem pode ser realizada em um único indivíduo ou em uma população de indivíduos e, em seguida, a média obtida na população pode ser calculada.

[00125] Indivíduo, como usado aqui, significa um indivíduo humano. O indivíduo pode ser um paciente que está sofrendo atualmente de um distúrbio de sangramento ou espera-se que esteja precisando de tal tratamento. Em algumas modalidades, o indivíduo nunca foi previamente tratado com o fator de coagulação (isto é, o indivíduo é um indivíduo anteriormente não tratado ou paciente previamente não tratado). Em algumas modalidades, o indivíduo é um feto e os métodos compreendem administrar a composição, por exemplo, o polipeptídeo quimérico, à mãe do feto e a administração ao indivíduo ocorre a partir da mãe através da placenta. Em algumas modalidades, o indivíduo é uma criança ou um adulto. Em algumas modalidades, o indivíduo é uma criança com menos de um ano de idade, menos de dois anos de idade, menos de três anos de idade, menos de quatro anos de idade, menos de cinco anos de idade, menos do que seis anos de idade, menos de sete anos de idade, menos de oito anos de idade, menos de nove anos de idade, menos de dez anos de idade, menos de onze anos de idade, ou menos de doze anos de idade. Em algumas modalidades, a criança tem menos de um ano de idade. Em certas modalidades, o indivíduo tem menos de 6 anos de idade. Em outras modalidades, o indivíduo tem entre 6 e menos de 12 anos de idade. Em outras modalidades, o indivíduo tem

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35/143 anos de idade ou mais. Em algumas modalidades, a criança ou indivíduo adulto desenvolve um distúrbio de sangramento, em que o início dos sintomas da doença de sangramento ocorre após a idade de um ano. Em algumas modalidades, a administração da composição, por exemplo, o polipeptídeo quimérico, ao indivíduo é suficiente para prevenir, inibir ou reduzir o desenvolvimento de uma resposta imune selecionada a partir de uma resposta imune humoral, uma resposta imune mediada por células, ou tanto a resposta imune humoral e uma resposta imune mediada por células contra o fator de coagulação.

[00126] Uma dose terapêutica, dose, dose eficaz ou quantidade de dosagem, tal como aqui utilizada (indistintamente), significa uma dose que atinge um objetivo terapêutico, como aqui descrito. Em algumas modalidades, uma dose terapêutica significa uma dose que melhora um escore de HJHS, mHJHS ou QoL, em comparação com o escore HJHS, mHJHS ou QoL antes do tratamento. Em algumas modalidades, uma dose terapêutica significa uma dose que reduz o inchaço, inflamação e/ou dor em uma ou mais articulações em um indivíduo em comparação com o nível de inchaço, inflamação e/ou dor na articulação antes do tratamento. Em algumas modalidades, uma dose terapêutica significa uma dose que reduz os efeitos e/ou a gravidade de um ou mais micro-hemorragias, em comparação com os efeitos e/ou gravidade da micro-hemorragia antes do tratamento. Em outra modalidade, uma dose terapêutica significa uma dose que reduz a remodelação vascular em uma ou mais articulações alvo, em comparação com a remodelação vascular antes do tratamento.

[00127] Estão também incluídos na presente invenção fragmentos ou variantes de polipeptídeos e qualquer combinação destes. O termo fragmento ou variante quando se refere a polipeptídeos utilizados nos métodos da presente descrição inclui quaisquer polipeptídeos que retenham ao menos algumas das propriedades (por exemplo, variante

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36/143 de Fc ou atividade de coagulação para uma variante de FVIII ou FIX) do polipeptídeo de referência. Os fragmentos de polipeptídeos incluem fragmentos proteolíticos, bem como fragmentos de deleção, em adição aos fragmentos de anticorpo específicos aqui discutidos, mas não incluem o polipeptídeo de comprimento total de ocorrência natural (ou polipeptídeo maduro). Variantes de domínios de ligação ao polipeptídeo ou moléculas de ligação utilizadas nos métodos da presente descrição incluem fragmentos como descrito acima, e também polipeptídeos com sequências de aminoácidos alteradas devido a substituições, deleções ou inserções de aminoácidos. As variantes podem ocorrer naturalmente ou não naturalmente. Variantes de ocorrência não natural podem ser produzidas utilizando técnicas de mutagênese conhecidas na técnica. Os polipeptídeos variantes podem compreender substituições, deleções ou adições conservativas ou não conservativas de aminoácidos. Uma variante particular de FIX aqui descrita é a variante de FIX R338L (Padua). Ver, por exemplo, Simioni, P., e outros, X-Linked Thrombophilia with a Mutant Factor IX (Fator IX Padua), NEJM 361: 1671-75 (outubro de 2009), que é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[00128] Uma substituição conservativa de aminoácido é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e

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37/143 cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, se um aminoácido em um polipeptídeo é substituído por outro aminoácido da mesma família de cadeias laterais, a substituição é considerada conservativa. Em outra modalidade, uma cadeia de aminoácidos pode ser substituída conservativamente por uma cadeia estruturalmente similar que difere na ordem e/ou composição dos membros da cadeia lateral.

[00129] O termo identidade de sequência percentual entre duas sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos refere-se ao número de posições correspondentes idênticas pelas sequências ao longo de uma janela de comparação, levando em consideração adições ou deleções (isto é, espaços) que devem ser introduzidas para o alinhamento ótimo das duas sequências. Uma posição correspondente é qualquer posição em que um nucleotídeo ou aminoácido idêntico é apresentado em ambas as sequências alvo e de referência. Os espaços apresentados na sequência alvo não são contados uma vez que os espaços não são nucleotídeos ou aminoácidos. Do mesmo modo, os espaços apresentados na sequência de referência não são contados uma vez que os nucleotídeos ou aminoácidos da sequência alvo são contados, não nucleotídeos ou aminoácidos da sequência de referência.

[00130] A porcentagem de identidade de sequência é calculada determinando o número de posições nas quais o resíduo de aminoácido ou base de ácido nucleico idênticos ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. A comparação de sequências e a determinação da porcentagem de identidade de sequência entre duas sequências podem ser realizadas

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38/143 utilizando software prontamente disponível, tanto para uso online quanto para transferência. Programas de software adequados estão disponíveis a partir de várias fontes, e para o alinhamento de ambas as sequências de proteínas e nucleotídeos. Um programa adequado para determinar a porcentagem de identidade de sequência é o bl2seq, parte do conjunto de programas BLAST disponível no site BLAST do governo dos Estados Unidos para o Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (blast.ncbi.nlm.nih.gov). BI2seq realiza uma comparação entre duas sequências usando ou o algoritmo BLASTN ou BLASTP. O BLASTN é utilizado para comparar sequências de ácido nucleico, enquanto o BLASTP é utilizado para comparar sequências de aminoácidos. Outros programas adequados são, por exemplo, Needle, Stretcher, Water, ou Matcher, parte do conjunto de programas de bioinformática EMBOSS e também disponibilizados pelo Instituto Europeu de Bioinformática (EBI) em www.ebi.ac.uk/Tools/psa.

[00131] Diferentes regiões dentro de uma única sequência alvo de polinucleotídeo ou polipeptídeo que se alinha com uma sequência de referência de polinucleotídeo ou polipeptídeo podem, cada uma, ter a sua própria porcentagem de identidade de sequência. Observa-se que o valor de porcentagem de identidade de sequência é arredondado para o décimo mais próximo. Por exemplo, 80,11, 80,12, 80,13 e 80,14 são arredondados para 80,1, enquanto 80,15, 80,16, 80,17, 80,18 e

80,19 são arredondados para 80,2. Nota-se também que o valor do comprimento será sempre um inteiro.

[00132] Um versado na técnica apreciará que a geração de um alinhamento de sequência para o cálculo de uma porcentagem de identidade de sequência não está limitada a comparações de sequência - sequência binária exclusivamente conduzidas por dados de sequência primária. Alinhamentos de sequência podem ser

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39/143 derivados de múltiplos alinhamentos de sequência. Um programa adequado para gerar múltiplos alinhamentos de sequências é o ClustalW2, disponível em www.clustal.org. Outro programa adequado é o MUSCLE, disponível em www.drive5.com/muscle/. ClustalW2 e MUSCLE estão alternativamente disponíveis, por exemplo, a partir do EBI.

[00133] Será também apreciado que os alinhamentos de sequência podem ser gerados integrando dados de sequência com dados de fontes heterogêneas, tais como dados estruturais (por exemplo, estruturas de proteínas cristalográficas), dados funcionais (por exemplo, localização de mutações), ou dados filogenéticos. Um programa adequado que integra dados heterogêneos para gerar um alinhamento de múltiplas sequências é o T-Coffee, disponível em www.tcoffee.org, e alternativamente disponível, por exemplo, a partir do EBI. Será também apreciado que o alinhamento final utilizado para calcular a porcentagem de identidade de sequência pode ser curado automática ou manualmente.

[00134] As variantes de polinucleotídeos podem conter alterações nas regiões codificantes, nas regiões não codificantes ou em ambas. Em uma modalidade, as variantes de polinucleotídeos contêm alterações que produzem substituições, adições ou deleções silenciosas, mas não alteram as propriedades ou atividades do polipeptídeo codificado. Em outra modalidade, as variantes de nucleotídeos são produzidas por substituições silenciosas devido à degenerescência do código genético. Em outras modalidades, variantes em que 5-10, 1-5 ou 1-2 aminoácidos são substituídos, deletados ou adicionados em qualquer combinação. Variantes de polinucleotídeos podem ser produzidas para uma variedade de razões, por exemplo, para otimizar a expressão de códons para um hospedeiro particular (alterar os códons no mRNA humano para outros, por exemplo, um

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40/143 hospedeiro bacteriano tal como E. coli).

[00135] As variantes de ocorrência natural são chamadas variantes alélicas e referem-se a uma das várias formas alternativas de um gene que ocupa um determinado lócus em um cromossomo de um organismo (Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, Nova Iorque (1985)). Estas variantes alélicas podem variar ou ao nível do polinucleotídeo e/ou do polipeptídeo e estão incluídas na presente descrição. Alternativamente, variantes de ocorrência não natural podem ser produzidas por técnicas de mutagênese ou por síntese direta.

[00136] Usando métodos conhecidos de engenharia de proteínas e tecnologia de DNA recombinante, as variantes podem ser geradas para melhorar ou alterar as características dos polipeptídeos. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser deletados do N terminal ou C terminal da proteína secretada sem perda substancial da função biológica. Ron e outros, J. Biol. Chem. 268: 2984 a 2988 (1993), aqui incorporada por referência em sua totalidade, relatou proteínas KGF variantes tendo atividade de ligação à heparina mesmo após a deleção de 3, 8 ou 27 resíduos de aminoácidos do terminal amino. De modo similar, o interferon gama exibiu até dez vezes mais atividade após a deleção de 8-10 resíduos de aminoácidos do terminal carboxi desta proteína. (Dobeli e outros, J. Biotechnology 7: 199 a 216 (1988), aqui incorporado por referência em sua totalidade).

[00137] Além disso, uma ampla evidência demonstra que variantes muitas vezes retêm uma atividade biológica semelhante à da proteína que ocorre naturalmente. Por exemplo, Gayle e colaboradores (J. Biol. Chem 268: 22105 a 22111 (1993), aqui incorporado por referência em sua totalidade) conduziram uma análise mutacional extensa da citocina humana IL-1 a. Eles usaram a mutagênese aleatória para gerar mais de 3.500 mutantes individuais de IL-1a, com uma média de 2,5

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41/143 alterações de aminoácidos por variante ao longo de todo o comprimento da molécula. Múltiplas mutações foram examinadas em todas as posições possíveis de aminoácidos. Os pesquisadores descobriram que a maioria da molécula pode ser alterada com pouco efeito ou sobre a ligação ou atividade biológica. (Ver Resumo). De fato, apenas 23 sequências de aminoácidos únicas, de mais de 3500 sequências de nucleotídeos examinadas, produziram uma proteína que diferiu significativamente em atividade de ocorrência natural.

[00138] Como afirmado acima, as variantes de polipeptídeos incluem, por exemplo, polipeptídeos modificados. As modificações incluem, por exemplo, acetilação, acilação, ribosilação de ADP, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídio derivado ou lipídio, ligação covalente de fosfotidilinositol, ligação cruzada, ciclização, formação de ligações dissulfeto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação (Mei e outros, Blood 116: 270-79 (2010), que é aqui incorporado por referência em sua totalidade), processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição mediada por RNA de transferência de aminoácidos a proteínas tal como arginilação, e ubiquitinação. Em algumas modalidades, o FVIII é modificado, por exemplo, peguilado, em qualquer localização conveniente. Em algumas modalidades, o FVIII é peguilado a um aminoácido de superfície exposta de FVIII, por exemplo, uma cisteína de superfície exposta, que pode ser uma cisteína modificada. Em algumas modalidades, o FVIII modificado, por exemplo, o FVIII peguilado, é um FVIII quimérico ou de fusão.

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42/143 [00139] O termo à jusante refere-se a uma sequência de nucleotídeos que está localizada 3’ de uma sequência de nucleotídeos de referência. À jusante pode também referir-se a uma sequência de peptídeos que está localizada no C terminal de uma sequência de peptídeos de referência.

[00140] O termo a montante refere-se a uma sequência de nucleotídeos que está localizada 5’ de uma sequência de nucleotídeos de referência. A montante pode também referir-se a uma sequência de peptídeos que está localizada no N terminal a uma sequência de peptídeos de referência.

[00141] Como aqui utilizado, o termo região reguladora refere-se a sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências não codificantes 5’), dentro ou à jusante (sequências não codificantes 3’) de uma região codificante, e que influenciam a transcrição, processamento de RNA, estabilidade, ou tradução da região codificante associada. As regiões reguladoras podem incluir promotores, sequências líder de tradução, introns, sequências de reconhecimento de poliadenilação, sítios de processamento de RNA, sítios de ligação efetores e estruturas haste - alça. Se uma região codificante é destinada à expressão em uma célula eucariótica, a sequência de terminação de transcrição e sinal de poliadenilação estará normalmente localizada 3’ em relação à sequência de codificação.

[00142] Um polinucleotídeo, que codifica um produto gênico, por exemplo, um polipeptídeo, pode incluir um promotor e/ou outros elementos de controle de transcrição ou tradução operacionalmente associados a uma ou mais regiões codificantes. Outros elementos de controle da transcrição, além de um promotor, por exemplo, estimuladores, operadores, repressores e sinais de terminação de transcrição, podem também estar operativamente associados a uma região codificante para dirigir a expressão do produto gênico.

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43/143 [00143] Uma variedade de regiões de controle de transcrição é conhecida pelos versados na técnica. Estas incluem, sem limitação, regiões de controle de transcrição, que funcionam em células de vertebrados, tais como, mas não limitadas a, segmentos promotores e potenciadores de citomegalovírus (o promotor precoce imediato, em conjunto com o íntron-A), o vírus símio 40 (o promotor precoce), e retrovirus (tal como o vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle de transcrição incluem aquelas derivadas de genes de vertebrados, tais como actina, proteína de choque térmico, hormônio do crescimento bovino e beta-globina de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a expressão gênica em células eucarióticas. As regiões de controle de transcrição adequadas adicionais incluem promotores e potenciadores específicos de tecidos, bem como promotores induteis por linfoquinas (por exemplo, promotores induzidos por interferons ou interleucinas).

[00144] Da mesma forma, uma variedade de elementos de controle de tradução é conhecida para aqueles versados na técnica. Estes incluem, mas não estão limitados a, sítios de ligação ao ribossoma, códons de iniciação e terminação de tradução, e elementos derivados de picornavírus (particularmente um sítio de entrada no ribossoma interno, ou IRES, também chamado de uma sequência CITE).

[00145] O termo expressão, tal como é aqui utilizado, refere-se a um processo pelo qual um polinucleotídeo produz um produto gênico, por exemplo, um RNA ou um polipeptídeo.

[00146] Um vetor refere-se a qualquer veículo para a clonagem e/ou transferência de um ácido nucleico para uma célula hospedeira. Um vetor pode ser um replicon ao qual outro segmento de ácido nucleico pode ser ligado de modo a provocar a replicação do segmento ligado. Um replicon refere-se a qualquer elemento genético (por exemplo, plasmídeo, fago, cosmídeo, cromossomo, vírus) que

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44/143 funciona como uma unidade autônoma de replicação in vivo, ou seja, capaz de replicação sob seu próprio controle. O termo vetor inclui veículos virais e não virais para introduzir o ácido nucleico em uma célula in vitro, ex vivo ou in vivo. Um grande número de vetores é conhecido e utilizado na técnica, incluindo, por exemplo, plasmídeos, vírus eucarióticos modificados, ou vírus bacterianos modificados. A inserção de um polinucleotídeo em um vetor adequado pode ser conseguida ligando os fragmentos de polinucleotídeos apropriados em um vetor escolhido que tenha terminais coesivos complementares.

[00147] O termo plasmídeo refere-se a um elemento extracromossômico frequentemente carregando um gene que não faz parte do metabolismo central da célula, e geralmente na forma de moléculas de DNA de fita dupla circular. Tais elementos podem ser sequências de replicação autônoma, sequências de integração do genoma, sequências de fagos ou nucleotídeos, lineares, circulares ou superenroladas, de um DNA ou RNA de fita simples ou dupla, derivado de qualquer fonte, em que um número de sequências de nucleotídeos foram ligadas ou recombinadas em uma construção única que é capaz de introduzir um fragmento promotor e uma sequência de DNA para um produto gênico selecionado juntamente com a sequência 3’ não traduzida apropriada em uma célula.

[00148] Os vetores virais eucarióticos que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a vetores de adenovirus, vetores de retrovirais, vetores de vírus adenoassociados e poxvirus, por exemplo, vetores de vírus vaccinia, vetores de baculovírus, ou vetores de herpesvirus. Vetores não virais incluem plasmídeos, lipossomas, lipídios eletricamente carregados (citofectinas), complexos DNAproteína, e biopolímeros.

[00149] Um vetor de clonagem refere-se a um replicon, que é um comprimento unitário de um ácido nucleico que replica sequen

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45/143 cialmente e que compreende uma origem de replicação, tal como um plasmídeo, fago ou cosmídeo, ao qual outro segmento de ácido nucleico pode ser anexado de modo a provocar a replicação do segmento anexado. Certos vetores de clonagem são capazes de replicação em um tipo de célula, por exemplo, bactérias e expressão em outras, por exemplo, células eucarióticas. Os vetores de clonagem compreendem tipicamente uma ou mais sequências que podem ser utilizadas para a seleção de células compreendendo o vetor e/ou um ou mais múltiplos sítios de clonagem para inserção de sequências de ácido nucleico de interesse.

[00150] O termo vetor de expressão refere-se a um veículo concebido para permitir a expressão de uma sequência de ácido nucleico inserida após a inserção em uma célula hospedeira. A sequência de ácido nucleico inserida é colocada em associação operacional com regiões reguladoras como descrito acima.

[00151] Os vetores são introduzidos em células hospedeiras por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, transfecção, eletroporação, microinjeção, transdução, fusão celular, DEAE dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, lipofecção (fusão com lisossoma), uso de uma pistola de genes, ou um transportador de vetor de DNA.

[00152] Um polipeptídeo isolado ou um fragmento, variante ou derivado refere-se a um polipeptídeo que não está em seu meio natural. Nenhum nível particular de purificação é necessário. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode simplesmente ser removido do seu ambiente nativo ou natural. Os polipeptídeos e proteínas produzidos de forma recombinante expressos em células hospedeiras são considerados isolados para o objetivo da invenção, assim como polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados ou parcialmente ou substancialmente purificados por

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46/143 qualquer técnica adequada.

[00153] Como aqui utilizado, o termo célula hospedeira refere-se a uma célula ou uma população de células que abrigam ou são capazes de abrigar um ácido nucleico recombinante. As células hospedeiras podem ser células procarióticas (por exemplo, E. coli), ou alternativamente, as células hospedeiras podem ser eucarióticas, por exemplo, células fúngicas (por exemplo, células de levedura tal como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris ou Schizosaccharomyces pombe), e várias células de animais, tais como células de inseto (por exemplo, Sf-9) ou células de mamífero (por exemplo, HEK293F, CHO, COS-7, NIH-3T3).

[00154] Volume de distribuição em estado estacionário (Vss), como usado aqui, tem o mesmo significado que o termo usado em farmacologia, que é o espaço aparente (volume) em que um fármaco se distribui. Vss = a quantidade de fármaco no corpo dividida pela concentração plasmática no estado estacionário.

II. MÉTODOS DA INVENÇÃO [00155] A presente descrição é baseada na descoberta de que um fator de coagulação fundido a uma região Fc pode ser usado para reverter a artropatia hemofílica. A artropatia hemofílica era anteriormente conhecida por ser irreversível uma vez que foi desenvolvida, como as alterações dos tecidos moles só podiam ser visualizadas por MRI. As opções atualmente conhecidas para um indivíduo que sofre de artropatia hemofílica incluem uma cirurgia ou um agente esclerosante para remover a sinóvia hipertrofiada. Um agente esclerosante, seja material radioativo ou químico, pode impedir ainda mais a deterioração de cartilagens e ossos; no entanto, não é capaz de reverter a artropatia hemofílica. A artroplastia do joelho e do quadril tem sido bem-sucedida na redução da dor e perda de movimento quando outros esforços para controlar a hipertrofia sinovial

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47/143 falham. Hilgartner M., Current Opinion in Pediatrics: Fevereiro de 2002, V14, Issue 1, pág. 46 a 49.

[00156] A presente descrição fornece, portanto, métodos para tratar a artropatia hemofílica de uma articulação em um ser humano que tem hemofilia, compreendendo administrar ao ser humano uma quantidade eficaz de uma composição, por exemplo, uma proteína quimérica, compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc ou um polinucleotídeo codificando a proteína quimérica. O tratamento da artropatia hemofílica pode reverter, parcial ou completamente, a artropatia hemofílica (por exemplo, um ou mais sintomas de artropatia hemofílica). Por conseguinte, em uma modalidade, a presente descrição fornece um método para tratar um ser humano com hemofilia que já desenvolveu artropatia hemofílica, por exemplo, sinovite.

[00157] Em geral, a artropatia hemofílica refere-se à doença articular que ocorre em um indivíduo humano que sofre de hemofilia como uma consequência a longo prazo ou hemorragia repetida nas articulações do indivíduo. A hemorragia espontânea em uma ou mais articulações é comum em pacientes com hemofilia. As articulações com várias hemorragias consecutivas dentro de um período de 6 meses são frequentemente chamadas de articulações alvo e estas articulações progridem frequentemente para artropatia hemofílica.

[00158] A artropatia hemofílica pode apresentar-se com vários sintomas, incluindo, mas não limitados a, hiperplasia sinovial, inflamação crônica (incluindo sinovite), fibrose, hemossiderose, formação de cistos subarticulares, dor, redução da amplitude de movimento, atrofia muscular, anquilose, osteoporose, degeneração da cartilagem com colapso do espaço da articulação, e qualquer combinação dos mesmos. A artropatia hemofílica inclui vários estágios: (i) Estágio I incluindo inchaço dos tecidos moles, mas sem

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48/143 anomalias esqueléticas; (ii) Estágio II incluindo supercrescimento e osteoporose da epífise, a integridade da articulação é mantida. Não há cistos ósseos e nem estreitamento do espaço da cartilagem articular. O Estágio Radiológico II é paralelo ao estágio clínico da artropatia hemofílica subaguda; (iii) Estágio III incluindo estreitamento mínimo e moderado do espaço articular com cistos subcondrais. Alargamento da incisura intercondilar do joelho e entalhe troclear da ulna. No joelho, pode haver quadratura da patela. A cartilagem articular ainda está preservada e a artropatia hemofílica ainda é reversível; (iv) Estágio IV incluindo destruição da cartilagem articular com estreitamento severo do espaço articular. As outras alterações ósseas encontradas no estágio III são mais pronunciadas; e (v) Estágio V incluindo perda total do espaço articular com anquilose fibrosa da articulação. Há incongruência marcada das estruturas articulares com hipertrofia irregular severa da epífise.

[00159] A presente descrição fornece que o tratamento com uma composição, por exemplo, uma proteína quimérica, compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc é capaz de reduzir e/ou melhorar os sintomas da artropatia hemofílica reversível. Em algumas modalidades, a composição, por exemplo, a proteína quimérica, pode tratar um ou mais estágios da artropatia hemofílica, por exemplo, Estágios I, II e/ou III. Como aqui utilizado, uma artropatia hemofílica reversível é uma manifestação de artropatia hemofílica que pode reverter parcial ou completamente ao seu estado saudável original após o tratamento. Em contraste, uma artropatia hemofílica irreversível é uma manifestação de artropatia hemofílica que é permanente e que não melhorará após o tratamento. Portanto, os presentes métodos podem melhorar, reduzir ou melhorar (ou reverter parcial ou completamente) um ou mais sintomas de artropatia hemofílica, por exemplo, hiperplasia sinovial, inflamação crônica

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49/143 (incluindo sinovite), hemossiderose, formação de cisto subarticular, dor, redução da amplitude de movimento, inchaço, remodelação vascular, ou qualquer combinação dos mesmos.

[00160] A artropatia hemofílica (reversível) tratada com os métodos da presente descrição pode afetar qualquer articulação do corpo. Em algumas modalidades, a articulação é uma articulação de suporte de carga, por exemplo, uma articulação selecionada a partir do grupo que consiste em um ou ambos os joelhos, um ou ambos os tornozelos, um ou ambos os quadris, uma ou mais articulações do pé e qualquer combinação das mesmas. Em outra modalidade, a articulação é uma articulação não dotada de carga, por exemplo, uma articulação selecionada a partir do grupo que consiste em um ou ambos os cotovelos, um ou ambos os ombros, um ou ambos os punhos, uma ou mais articulações da mão, ou qualquer combinação das mesmas. Em outra modalidade, a articulação é um joelho.

[00161] Em algumas modalidades, a artropatia hemofílica reversível compreende sinovite. A sinovite refere-se à inflamação da membrana sinovial, que envolve a articulação. Em algumas modalidades, a sinovite é de qualquer articulação no corpo. Em algumas modalidades, a sinovite apresenta-se como inchaço da articulação, e os métodos da presente descrição reduzem o inchaço da articulação. Em algumas modalidades, a sinovite apresenta-se como dor na articulação e os métodos da presente descrição reduzem a dor na articulação. Em outras modalidades, a sinovite apresenta uma amplitude de movimento diminuída da articulação e os métodos da presente invenção aumentam a amplitude de movimento da articulação.

[00162] Em outras modalidades, a artropatia hemofílica reversível compreende uma micro-hemorragia em uma articulação. Em algumas modalidades, a artropatia hemofílica reversível é o resultado de uma micro-hemorragia. Uma micro-hemorragia refere-se a uma hemorragia

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50/143 muito pequena em uma ou mais articulações, o que pode levar à artropatia hemofílica após ocorrências repetidas. Em algumas modalidades, a artropatia hemofílica reversível compreende uma hemorragia articular aguda. Em algumas modalidades, a artropatia hemofílica reversível é o resultado de uma hemorragia articular aguda. Uma hemorragia articular aguda refere-se a um episódio de hemorragia mais substancial em uma ou mais articulações.

[00163] Em certas modalidades, a artropatia hemofílica reversível compreende a inflamação de uma ou mais articulações. Em algumas modalidades, a inflamação está em qualquer articulação no corpo. Em algumas modalidades, a inflamação apresenta-se como inchaço da articulação, e os métodos da presente descrição reduzem o inchaço da articulação. Em algumas modalidades, a inflamação apresenta-se como dor na articulação, e os métodos da presente descrição reduzem a dor na articulação. Em outras modalidades, a inflamação apresentase como amplitude de movimento diminuída da articulação e os métodos da presente invenção aumentam a amplitude de movimento da articulação. Em certas modalidades, o método fornece ainda medir a inflamação em uma ou mais articulações antes da administração da quantidade eficaz de uma composição ou de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. Em algumas modalidades, o método fornece ainda medir a inflamação em uma ou mais articulações após a administração da quantidade eficaz de uma composição ou de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc.

[00164] Em outras modalidades, a artropatia hemofílica é evidenciada pela expressão de um ou mais biomarcadores associados à inflamação articular e/ou lesão articular. Em algumas modalidades, um ou mais biomarcadores são induzidos no ser humano, indicando um aumento da inflamação das articulações e/ou danos nas articulações.

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Em algumas modalidades, um ou mais biomarcadores são reprimidos no ser humano, indicando um aumento da inflamação das articulações e/ou danos nas articulações. Em algumas modalidades, um ser humano em necessidade de tratamento é identificado com base na expressão de um ou mais biomarcadores associados ao aumento da capacidade de resposta ao tratamento utilizando os métodos da presente descrição.

[00165] Em algumas modalidades, os presentes métodos aumentam a localização do fator de coagulação para uma ou mais articulações alvo. Em certas modalidades, a composição ou uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc localiza-se em uma articulação alvo após a administração mais do que o fator de coagulação isoladamente. Em certas modalidades, a composição ou uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc permanece localizada em uma ou mais articulações alvo por um período de tempo mais longo do que o fator de coagulação isoladamente após a administração.

[00166] Ainda em outras modalidades, os presentes métodos compreendem ainda identificar um indivíduo que exibe um ou mais marcadores para artropatia hemofílica reversível e depois administrar uma composição ou uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc.

[00167] Em algumas modalidades, os métodos da presente invenção previnem ou reduzem a ocorrência de remodelação vascular em uma articulação de um ser humano com hemofilia. Um elemento comum associado à artropatia hemofílica é a remodelação da vasculature que envolve uma articulação, em particular uma articulação alvo. A remodelação vascular pode ser caracterizada pelo aumento da angiogênese e o aumento da ocorrência de micro-hemorragias na articulação. Em algumas modalidades, a presente descrição fornece

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52/143 um método para tratamento profilático ou redução de remodelação vascular em uma articulação de um ser humano tendo hemofilia compreendendo administrar ao ser humano uma quantidade eficaz de uma composição ou proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. Em outras modalidades, a presente descrição fornece um método de reverter a remodelação vascular existente associada à artropatia hemofílica em uma articulação de um ser humano que tem hemofilia compreendendo administrar ao ser humano uma quantidade eficaz de uma composição ou uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. Em algumas modalidades, a remodelação vascular está em qualquer articulação no corpo. Em certas modalidades, a remodelação vascular está em uma articulação alvo. Em outras modalidades, a remodelação vascular está em uma articulação que não seja uma articulação alvo. Em certas modalidades, a remodelação vascular está em uma articulação de suporte de carga, por exemplo, uma articulação selecionada a partir do grupo que consiste emum ou ambos os joelhos, um ou ambos os tornozelos, um ou ambos os quadris, uma ou mais articulações do pé, e qualquer combinação das mesmas. Em outra modalidade, a remodelação vascular está em uma articulação sem carga, por exemplo, uma articulação selecionada a partir do grupo que consiste em um ou ambos os cotovelos, um ou ambos os ombros, um ou ambos os punhos, uma ou mais articulações da mão, ou qualquer combinação dos mesmos. Em outra modalidade, a remodelação vascular está em um joelho. Em algumas modalidades, a remodelação vascular está em um músculo. Em algumas modalidades, a remodelação vascular está no baço e/ou no fígado.

[00168] Em certas modalidades, os métodos da presente invenção melhoram o tecido mole circundante de uma articulação de um ser humano que tem hemofilia. Outra patologia comum da artropatia

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53/143 hemofílica é a hiperproliferação do tecido mole da articulação. Em algumas modalidades, o tecido mole melhorado pelos métodos da presente descrição está em qualquer articulação no corpo. Em certas modalidades, o tecido mole melhorado pelos métodos da presente descrição está em uma articulação alvo. Em outras modalidades, o tecido mole melhorado pelos métodos da presente descrição está em uma articulação que não uma articulação alvo.

[00169] Em algumas modalidades, os métodos da presente invenção reduzem a gravidade de um ou mais sintomas associados com hiperproliferação do tecido mole de uma articulação. Em algumas modalidades, a hiperproliferação do tecido mole de uma articulação apresenta-se como inchaço da articulação, e os métodos da presente descrição reduzem o inchaço da articulação. Em algumas modalidades, a hiperproliferação do tecido mole de uma articulação apresenta-se como dor na articulação, e os métodos da presente descrição reduzem a dor na articulação. Em outras modalidades, a hiperproliferação do tecido mole de uma articulação apresenta uma amplitude de movimento da articulação diminuída, e os métodos da presente invenção aumentam a amplitude de movimento da articulação.

[00170] Os métodos aqui descritos podem ser praticados em um indivíduo que foi tratado e mostrou artropatia hemofílica diminuída para evitar desenvolvimentos adicionais de artropatia hemofílica de uma ou mais articulações. Em algumas modalidades, os métodos da presente descrição são aplicados a um indivíduo para tratar uma artropatia hemofílica existente de uma ou mais articulações e para prevenir o desenvolvimento de artropatia hemofílica adicional de uma mesma articulação ou articulação diferente.

[00171] Em algumas modalidades, o método da presente descrição permite que o fator de coagulação seja distribuído para tecidos fora do compartimento plasmático, bem como no compartimento plasmático.

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54/143 [00172] Os métodos da presente descrição melhoram a saúde articular de uma ou mais articulações de um ser humano com hemofilia. A saúde articular pode ser medida usando quaisquer métricas conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, a saúde articular é medida utilizando o sistema de escore de saúde articular na hemofilia (HJHS) (ver Feldman e outros, Hemophilia Joint Health Score (HJHS) 2.1, disponível em http://www.wfh.org/en/page.aspx?pid= 885 (ultimo acesso em 18 de novembro de 2016), que é aqui incorporado por referência em sua totalidade). O HJHS mede a saúde articular, no domínio da estrutura e função do corpo (ou seja, insuficiência), das articulações mais comumente afetadas por hemorragia na hemofilia: joelhos, tornozelos e cotovelos. Embora tenha sido projetado principalmente para crianças com hemofilia com idades entre 4 e 18 anos com comprometimento articular leve (por exemplo, tratados com profilaxia), ele pode ser aplicado em qualquer população. Em algumas modalidades, o HJHS mede inchaço, duração (do inchaço), atrofia muscular, crepitação em movimento, perda de flexão, perda de extensão, dor nas articulações, e força para cada um dos cotovelos esquerdo e direito, joelhos esquerdo e direito, e tornozelos esquerdo e direito de um ser humano com hemofilia. Em algumas modalidades, cada parâmetro recebe um escore numérico. Em uma modalidade particular, o padrão HJHS, versão 2.1 é usado para medir a saúde articular. Em algumas modalidades, o inchaço é classificado de 0 a 3, com 0 não sendo inchaço, e 3 sendo inchaço grave. Em algumas modalidades, a duração do inchaço é classificada de 0 a 1, com 0 sendo não inchaço ou inchaço por menos de 6 meses, e 1 sendo inchaço por 6 meses ou mais. Em algumas modalidades, a atrofia muscular é classificada de 0 a 2, sendo 0 sem atrofia e 2 sendo atrofia grave. Em algumas modalidades, a crepitação em movimento é classificada de 0 a 2,

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55/143 sendo 0 sem crepitação em movimento e 2 sendo crepitação grave em movimento. Em algumas modalidades, a perda de flexão é classificada de 0 a 3, 0 sendo inferior a 5^o de perda de flexão, e 3 sendo maior que 20° de perda de flexão. Em algumas modalidades, a perda de extensão é classificada de 0 a 3, sendo 0 inferior a 5^o de perda de extensão, e 3 sendo maior que 20° de perda de extensão. Em algumas modalidades, a dor articular é classificada de 0 a 2, com 0 sendo nenhuma dor através da amplitude de movimento ativa, e 2 sendo dor através da amplitude de movimento ativa. Em algumas modalidades, a marcha global é classificada, com 0 refletindo que todas as habilidades estão dentro dos limites normais; 1, 2 e 3, refletindo que 1, 2 e 3 habilidades, respectivamente, não estão dentro dos limites normais; e 4 refletindo que nenhuma habilidade está dentro dos limites normais. Em certas modalidades, o escore da marcha global é medido com base em andar, subir escadas, correr e/ou saltar em uma perna. Em algumas modalidades, os escores são combinados para gerar um escore total. Em outras modalidades, os escores individuais para uma ou mais articulações são avaliados como uma indicação da saúde de uma ou mais articulações.

[00173] Em outras modalidades, um sistema HJHS modificado é usado para medir a saúde articular. Em algumas modalidades, o mHJHS difere do padrão HJHS, versão 2.1, pelo fato de que as opções de resposta para dor e marcha articular foram condensadas em menos categorias, uma avaliação para instabilidade foi adicionada, e o escore total é menor (intervalo, 0-116; 0 indica função articular normal, 116 indica doença grave) em comparação com o padrão HJHS (intervalo, 0-124). Os escores precedidos por uma hemorragia dentro de 2 semanas foram excluídos. Os escores para articulações que foram submetidas à intervenção cirúrgica foram inseridos usando a última observação transportada. Para avaliar a alteração ano a ano, os

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56/143 participantes do estudo de extensão de rFVIIIFc que tinham dados mHJHS em 4 pontos no tempo (linha de base principal de fase 3 de rFVIIIFc, linha de base de estudo de extensão de rFVIIIFc, estudo de extensão de rFVIIIFc Ano 1, e estudo de extensão de rFVIIIFc Ano 2) foram incluídos nesta análise post hoc. A alteração no escore mHJHS a partir da linha de base principal do ensaio de fase 3 de rFVIIIFc para o estudo de extensão de rFVIIIFc Ano 2 (valor negativo indica melhora) foi resumida utilizando a estatística descritiva. A alteração no escore mHJHS a partir da linha de base principal do teste de fase 3 de rFVIIIFc para as visitas de acompanhamento foi resumida para: (1) escore total (intervalo, 0 a 116; pelo regime pré-estudo (profilático versus episódico); pela gravidade do comprometimento funcional com base em mHJHS inicial; e pela presença de articulações alvo no início na linha de base, (2) articulações alvo (intervalo, 0-19: soma de todas as questões para uma única articulação alvo), (3) articulações de sustentação de peso (por exemplo, tornozelo e joelho) e articulações de não sustentação de peso (por exemplo, cotovelo) (intervalo, 0 a 38: soma das articulações direita e esquerda de uma única localização); e (4) componentes individuais (amplitude de movimento (intervalo, 0 a 36: combinação de questões perda de extensão [flexão dorsal dos tornozelos] e Perda de flexão [flexão plantar dos tornozelos] de todas as articulações), inchaço (intervalo, 0 a 24: combinação de questões Inchaço e Duração do inchaço de todas as articulações); e força (intervalo , 0 a 6: soma de todas as articulações)).

[00174] Em algumas modalidades, o escore de articulações é feito separadamente para as 6 articulações (tornozelo esquerdo-LA, tornozelo direito-RA, cotovelo esquerdo-LE, cotovelo direito-RE, joelho esquerdo-LK, joelho direito-RK). Em algumas modalidades, o inchaço é classificado de acordo com o seguinte: 0 = nenhum; 1 = leve; 2 = moderado; 3 = grave. Em algumas modalidades, a duração do inchaço

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57/143 é classificada de acordo com o seguinte: 0 = sem inchaço ou < 6 meses; 1 => 6 meses. Em algumas modalidades, a atrofia muscular é classificada de acordo com o seguinte: 0 = nenhum; 1 = leve; 2 = grave. Em algumas modalidades, a crepitação em movimento é classificada de acordo com o seguinte: 0 = ausente; 1 = presente. Em algumas modalidades, a perda de flexão, incluindo a perda de flexão plantar dos tornozelos, é classificada de acordo com o seguinte: 0 = nenhum; 1 = leve; 2 = moderada; 3 = grave. Em algumas modalidades, a perda de extensão, incluindo a perda da flexão dorsal dos tornozelos, é classificada de acordo com o seguinte: 0 = nenhum; 1 = leve; 2 = moderada; 3 = grave. Em algumas modalidades, a instabilidade é classificada de acordo com o seguinte: 0 = nenhum; 1 = frouxidão articular patológica significativa. Em algumas modalidades, a dor nas articulações é classificada de acordo com o seguinte: 0 = sem dor, ou através da amplitude ou no fim da amplitude de movimento; 1 = presente. Em algumas modalidades, a força é classificada de acordo com o seguinte: 0 = normal (mantém a posição contra a gravidade e a resistência máxima); 1 = diminuição mínima (mantém a posição contra a gravidade e resistência moderada, mas não a resistência máxima); 2 = diminuição leve (mantém a posição contra a gravidade ou resistência mínima); 3 = diminuição moderada (capaz de mover a articulação se a gravidade for eliminada); 4 = diminuição severa (traço ou ausência de contração muscular). Em certas modalidades, para classificar a perda de flexão e perda de extensão nos joelhos e cotovelos, o seguinte é aplicado: nenhum = aproximadamente 0 a 5 graus; leve = aproximadamente 5 a 10 graus; moderado = aproximadamente 11 a 20 graus; e severa = aproximadamente > 20 graus.

[00175] Em algumas modalidades, a marcha é classificada uma vez (intervalo é 0-2), em que 0 = sem dificuldade para andar ou subir/descer escadas; 1 = sem dificuldade para andar, mas dificuldade

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58/143 com escadas; e 2 = dificuldade para andar e com escadas.

[00176] Em certas modalidades, o escore das articulações é feito separadamente para as 6 articulações (tornozelo esquerdo-LA, tornozelo direito-RA, cotovelo esquerdo-LE, cotovelo direito-RE, joelho esquerdo-LK, joelho direito-RK) de acordo com as seguintes categorias e escalas (o intervalo é 0 a 19 para cada articulação e 0 a 114 para todas as seis articulações): inchaço (0 = nenhum; 1 = leve; 2 = moderado; 3 = severo); duração do inchaço (0 = sem inchaço ou < 6 meses; 1 => 6 meses); atrofia muscular (0 = nenhuma; 1 = leve; 2 = severa); crepitação em movimento (0 = ausente; 1 = presente); perda de flexão, incluindo perda de flexão plantar dos tornozelos (0 = nenhuma; 1 = leve; 2 = moderada; 3 = severa); perda de extensão, incluindo perda de flexão dorsal dos tornozelos (0 = nenhuma; 1 = leve; 2 = moderada; 3 = severa); instabilidade (0 = nenhuma; 1 = frouxidão articular patológica significativa); dor nas articulações (0 = sem dor, seja na amplitude ou na amplitude de movimento; 1 = presente); força (0 = normal (mantém a posição contra a gravidade e resistência máxima); 1 = diminuição mínima (mantém a posição contra a gravidade e resistência moderada, mas não resistência máxima); 2 = diminuição leve (mantém a posição contra a gravidade ou resistência mínima); diminuição moderada (capaz de mover a articulação se a gravidade for eliminada); 4 = diminuição severa (traço ou ausência de contração muscular), em que, para avaliar a perda de flexão e a perda de extensão nos joelhos e cotovelos, o seguinte se aplica: nenhum = aproximadamente 0 a 5 graus; leve = aproximadamente 5 a 10 graus, moderado = aproximadamente 11 a 20 graus; e severo = aproximadamente > 20 graus.

[00177] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um método para tratar artropatia hemofílica reversível de uma articulação em um ser humano que tem hemofilia compreendendo administrar ao

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59/143 ser humano uma quantidade eficaz de uma composição ou uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc, em que a administração melhora o escore HJHS do humano em relação ao escore HJHS antes da administração. Em algumas modalidades, o escore HJHS é um escore HJHS total, que inclui a soma de todos os escores de articulações medidos e não um escore global. Em algumas modalidades, o escore HJHS é um escore HJHS total, que inclui a soma de todos os escores de articulação medidos e não um escore global. Em outras modalidades, o escore HJHS é para um ou ambos os cotovelos, um ou ambos os joelhos, um ou ambos os tornozelos, ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade particular, o escore HJHS é para um cotovelo. Em outra modalidade, o escore HJHS é para um joelho. Em outra modalidade, o escore HJHS é para um tornozelo. Em outra modalidade, o escore HJHS reflete a marcha global.

[00178] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um método para tratar artropatia hemofílica reversível de uma articulação em um ser humano que tem hemofilia compreendendo administrar ao ser humano uma quantidade eficaz de uma composição ou uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc, em que a administração reduz a dor nas articulações no ser humano. Em algumas modalidades, a dor nas articulações é reduzida em relação à dor nas articulações antes da administração. Em certas modalidades, o método fornece ainda medir a dor nas articulações em uma ou mais articulações antes da administração da quantidade eficaz de uma composição ou de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. Em algumas modalidades, o método fornece ainda medir a dor nas articulações em uma ou mais articulações após a administração da quantidade eficaz de uma composição ou de uma proteína quimérica compreendendo um fator

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60/143 de coagulação e uma região Fc.

[00179] Em certas modalidades, os efeitos dos presentes métodos são observados em uma ou mais articulações do ser humano. Em algumas modalidades, os efeitos dos presentes métodos são observados em ao menos uma articulação. Em algumas modalidades, os efeitos dos presentes métodos são observados em ao menos dois, ao menos três, ao menos quatro, ao menos cinco, ao menos seis, ao menos sete, ao menos oito, ao menos nove ou ao menos dez articulações.

[00180] Em algumas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem ainda identificar um ser humano em necessidade de tratamento, por exemplo, identificar um indivíduo com artropatia hemofílica. A artropatia hemofílica pode ser detectada e/ou monitorada utilizando quaisquer métodos conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, um sistema de imagiologia é usado para detectar e/ou monitorar uma artropatia hemofílica em um indivíduo. Em algumas modalidades, o sistema de imagiologia compreende qualquer sistema imagiologia conhecido na técnica que é utilizado para caracterizar as articulações. Por exemplo, em certas modalidades, o sistema de imagiologia compreende uma radiografia, uma imagiologia por ressonância magnética, uma ultrassonografia, uma ultrassonografia com Doppler de alta potência, ou qualquer combinação dos mesmos.

[00181] Em algumas modalidades, o indivíduo foi previamente tratado com uma proteína fator de coagulação não fundida a uma porção Fc. Este fator de coagulação pode ser um fator de coagulação de comprimento total ou maduro. Em algumas modalidades, tal fator de coagulação pode ser ADVATE®, RECOMBINATE®, KOGENATE FS®, HELIXATE FS®, XYNTHA®/REFACTO AB®, HEMOFIL-M®, MONARC-M®, MONOCLATE-P®, HUMATE-P®, ALPHANATE®, KOATE-DVI®, AFSTYLA® E HYATE: C®, IDELVION®.

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11.A. Proteínas quiméricas [00182] Os métodos de tratamento de artropatia hemofílica reversível aqui descritos são proteínas quiméricas ou composições geralmente aplicáveis compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc, em que o fator de coagulação pode ser qualquer fator de coagulação conhecido, fragmento do mesmo, ou sua variante, e em que região pode ser qualquer região Fc conhecida, seu fragmento, ou sua variante. Em algumas modalidades, a composição compreende uma proteína quimérica compreendendo o fator de coagulação e a região Fc. Em algumas modalidades, o fator de coagulação é selecionado a partir do grupo que consiste em fator VII (FVII), fator Vila (FVIIa), fator VIII (FVIII), fator IX (FIX), fator X (FX), fator de von Willebrand (VWF) ou qualquer combinação dos mesmos. Consequentemente, as presentes descrições referentes aos polipeptídeos quiméricos FVIIIFc e FIXFc, e as suas utilizações, são igualmente aplicáveis a outros polipeptídeos quiméricos compreendendo uma porção de fator de coagulação e uma porção Fc. Qualquer fator de coagulação ou qualquer fragmento ou qualquer variante do mesmo pode ser utilizado nos métodos da presente descrição.

[00183] Não sendo limitado por qualquer teoria, acredita-se que uma região Fc fundida a um fator de coagulação é útil no tratamento da artropatia hemofílica reversível. A inflamação na hemofilia ocorre durante a hemorragia nas articulações. Foi demonstrado que o TNF-a, uma citocina inflamatória envolvida na artropatia hemofílica, induz a sinalização de NF-κΒ e, portanto, aumenta a expressão de FcRn em monócitos humanos (Liu e outros, J Immunol, 2007. 179 (5): p. 2999 a 3011). O FcRn pode assim ser induzido em sítios de inflamação, permitindo que as proteínas contendo Fc se localizem em sítios de inflamação através da ligação aos receptores Fc como parte da regulação dos processos inflamatórios. A região Fc fundida a um fator

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62/143 de coagulação também pode interagir com receptores Fc inibidores que podem causar a modulação imune e a repressão de vias inflamatórias. Por exemplo, o rFVIIIFc pode bloquear o receptor neonatal Fc (FcRn) e ativar os receptores Fcy (FcyR), levando a níveis alterados de moléculas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias. Assim, em algumas modalidades, a região Fc da proteína quimérica facilita a localização da proteína quimérica na articulação, por exemplo, o sítio da inflamação e/ou lesão e/ou dano.

[00184] Em outras modalidades, o fator de coagulação pode ser um mimético do fator de coagulação. Os miméticos do fator de coagulação podem manifestar uma ou mais atividades do fator de coagulação. Por exemplo, um anticorpo ou sua porção de ligação ao anticorpo pode atuar como FVIII por ligação tanto ao Fator IX quanto ao Fator X. Tais anticorpos ou suas porções de ligação ao antígeno podem ser utilizados para os presentes métodos se os anticorpos ou suas porções de ligação ao antígeno contêm uma região Fc. Em outra modalidade, o fator de coagulação é um peptídeo que tem uma atividade de FVIII.

[00185] Nesse aspecto, a presente descrição fornece, em geral, um método para tratar artropatia hemofílica reversível em um indivíduo em necessidade de tratamento, compreendendo administrar ao indivíduo um polipeptídeo quimérico que compreende uma porção do fator de coagulação e uma porção Fc.

II.A.1. FATOR VIII [00186] O Fator VIII, abreviado ao longo do presente pedido de patente como FVIII, tal como aqui utilizado, significa o polipeptídeo FVIII funcional no seu papel normal na coagulação, a menos que indicado ao contrário. Assim, o termo FVIII inclui polipeptídeos variantes que são funcionais. Uma proteína FVIII é utilizada de forma intercambiável com o polipeptídeo (ou proteína) FVIII ou FVIII.

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Exemplos das funções de FVIII incluem, mas não estão limitados a uma capacidade para ativar a coagulação, uma capacidade para atuar como cofator para fator IX, ou uma capacidade de formar um complexo tenase com fator IX na presença de Ca²⁺ e fosfolipídios, que em seguida, converte o Fator X na forma ativada Xa. A proteína FVIII pode ser a proteína FVIII humana, suína, canina, de camundongo ou murina. Além disso, as comparações entre o FVIII de humanos e outras espéscies identificaram resíduos conservados que provavelmente serão necessários para a função (Cameron e outros, Thromb. Haemost. 79: 317-22 (1998); US 6.251.632). As sequências de polipeptídeos e polinucleotídeos de comprimento total são conhecidas, assim como muitos fragmentos funcionais, mutantes e versões modificadas. Várias sequências de aminoácidos e nucleotídeos de FVIII são descritas, por exemplo, em Publicações US. Nos. 2015/0158929 A1, 2014/0308280 A1 e 2014/0370035 A1 e Publicação Internacional No. WO 2015/106052 A1, cada uma das quais é incorporada por referência em sua totalidade. Os polipeptídeos FVIII incluem, por exemplo, FVIII de comprimento total, FVIII de comprimento total menos Met no N terminal, FVIII maduro (menos a sequência de sinal), FVIII maduro com um Met adicional no N terminal, e/ou FVIII com uma deleção total ou parcial do domínio B. As variantes de FVIII incluem deleções do domínio B, sejam deleções parciais ou completas.

[00187] Em algumas modalidades, o FVIII da proteína quimérica ou composição da presente descrição compreende um FVIII de domínio B deletado. Um domínio B de FVIII, como aqui utilizado, é o mesmo que o domínio B conhecido na técnica que é definido por identidade de sequência de aminoácidos interna e sítios de divagem proteolítica por trombina, por exemplo, resíduos Ser741-Arg1648 de FVIII humano maduro. Os outros domínios de FVIII humano são definidos pelos

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64/143 seguintes resíduos de aminoácidos, relativos a FVIII humano maduro: A1, resíduos Ala1-Arg372; A2, resíduos Ser373-Arg740; A3, resíduos Ser1690-lle2032; C1, resíduos Arg2033-Asn2172; C2, resíduos Ser2173-Tyr2332 de FVIII maduro. Os números de resíduos de sequência utilizados aqui sem referência a quaisquer números de SEQ ID correspondem à sequência de FVIII sem a sequência de peptídeos de sinal (19 aminoácidos) a menos que indicado de outro modo. A sequência A3-C1-C2, também conhecida como cadeia pesada de FVIII, inclui os resíduos Ser1690-Tyr2332. A sequência restante, resíduos Glu1649-Arg1689, é normalmente chamada de peptídeo de ativação de cadeia leve de FVIII. As localizações dos limites para todos os domínios, incluindo os domínios B, para FVIII de suíno, camundongo e canino são também conhecidos na técnica. Em uma modalidade, o domínio B de FVIII é deletado (FVIII com deleção no domínio B ou BDD FVIII). Um exemplo de um BDD FVIII é o REFACTO® (BDD FVIII recombinante). Em uma modalidade particular, a variante de FVIII com deleção no domínio B compreende uma deleção dos resíduos de aminoácidos 746 a 1648 de FVIII maduro.

[00188] Um FVIII com deleção no domínio B pode ter as deleções completas ou parciais descritas nas Patentes U.S. Nos. 6.316.226, 6.346.513, 7.041.635, 5.789.203, 6.060.447, 5.595.886, 6.228.620, 5.972.885, 6.048.720, 5.543.502, 5.610.278, 5.171.844, 5.112.950, 4.868.112 e 6.458.563 e Publicação Internacional No. WO 2015106052 A1 (PCT/US2015/010738). Em algumas modalidades, uma sequência de FVIII com deleção no domínio B utilizada nos métodos da presente descrição compreende qualquer uma das deleções descritas na col. 4, linha 4 a col. 5, linha 28 e Exemplos 1-5 da Patente No. 6.316.226 (também em US 6.346.513). Em outra modalidade, um Fator VIII com deleção no domínio B é o Fator VIII

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65/143 com deleção no domínio B de S743/Q1638 (SQ BDD FVIII) (por exemplo, Fator VIII tendo uma deleção do aminoácido 744 ao aminoácido 1637, por exemplo, Fator VIII tendo aminoácidos 1-743 e aminoácidos 1638-2332 de FVIII maduro). Em algumas modalidades, um FVIII com deleção no domínio B utilizado nos métodos da presente descrição tem uma deleção descrita na col. 2, linhas 26-51 e exemplos 5-8 da Patente U.S. No. 5.789.203 (também US 6.060.447, US 5.595.886 e US 6.228.620). Em algumas modalidades, um Fator VIII com deleção no domínio B tem uma deleção descrita na col. 1, linhas 25 a col. 2, linha 40 da patente US No. 5.972.885; col. 6, linhas 1-22 e exemplo 1 da Patente U.S. No. 6.048.720; col. 2, linhas 17-46 da Patente U.S. No. 5.543.502; col. 4, linha 22 a col. 5, linha 36 da Patente U.S. no. 5.171.844; col. 2, linhas 55-68, Figura 2 e exemplo 1 da Patente U.S. No. 5.112.950; col. 2, linha 2 a col. 19, linha 21 e tabela 2 da Patente U.S. No. 4.868.112; col. 2, linha 1 a col. 3, linha 19, col. 3, linha 40 a col. 4, linha 67, col. 7, linha 43 a col. 8, linha 26 e col. 11, linha 5 a col. 13, linha 39 da Patente U.S. No. 7.041.635; ou col. 4, linhas 25-53, da Patente U.S. No. 6.458.563. Em algumas modalidades, um FVIII com deleção no domínio B tem uma deleção da maior parte do domínio B, mas ainda contém sequências do terminal amino do domínio B que são essenciais para processamento proteolítico in vivo do produto de tradução primário em duas cadeias polipeptídicas, como descrito em WO 91/09122. Em algumas modalidades, um FVIII com deleção no domínio B é construído com uma deleção dos aminoácidos 747-1638, isto é, virtualmente uma deleção completa do domínio B. Hoeben R.C. e outros J. Biol. Chem. 265 (13): 7318 a 7323 (1990). Um Fator VIII com deleção no domínio B também pode conter uma deleção dos aminoácidos 771-1666 ou aminoácidos 868-1562 de FVIII. Meulien P. e outros, Protein Eng. 2 (4): 301-6 (1988). Deleções no domínio B adicionais que fazem parte

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66/143 da invenção incluem: deleção dos aminoácidos 982 a 1562 ou 760 a 1639 (Toole e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1986) 83, 5939 a 5942)), 797 a 1562 (Eaton, e outros Biochemistry (1986) 25: 8343 a 8347)), 741 a 1646 (Kaufman (pedido publicado PCT No. WO 87/04187)), 747 a 1560 (Sarver, e outros, DNA 1987) 6: 553 a 564)), 741 a 1648 (Pasek (Pedido PCT No. 88/00831)), ou 816 a 1598 ou 741 a 1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No. 82: 16 a 25, EP 295597)). Em uma modalidade particular, o FVIII com deleção no domínio B compreende uma deleção dos resíduos de aminoácidos 746 a 1648 de FVIII maduro. Em outra modalidade, o FVIII com deleção no domínio B compreende uma deleção dos resíduos de aminoácidos 745 a 1648 de FVIII maduro.

[00189] Em outras modalidades, o BDD FVIII inclui um polipeptídeo de FVIII contendo fragmentos do domínio B que retêm um ou mais sítios de glicosilação ligados a N, por exemplo, resíduos 757, 784, 828, 900, 963, ou opcionalmente 943, que correspondem à sequência de aminoácidos da sequência de FVIII de comprimento total. Exemplos dos fragmentos do domínio B incluem 226 aminoácidos ou 163 aminoácidos do domínio B tal como descrito por Miao, HZ e outros, Blood 103 (a): 3412 a 3419 (2004), Kasuda, A, e outros J. Thromb. Haemost. 6: 1352 a 1359 (2008), e Pipe, S. W., e outros, J. Thromb. Haemost. 9: 2235 a 2242 (2011) (isto é, os primeiros 226 aminoácidos ou 163 aminoácidos do domínio B são retidos). Ainda em outras modalidades, o BDD FVIII compreende ainda uma mutação pontual no resíduo 309 (de Phe para Ser) para melhorar a expressão da proteína BDD FVIII. Ver Miao, H.Z. e outros, Blood 103 (a): 3412 a 3419 (2004). Ainda em outras modalidades, o BDD FVIII inclui um polipeptídeo FVIII contendo uma porção do domínio B, mas não contendo um ou mais sítios de divagem de furina (por exemplo, Arg 1313 e Arg 1648). Ver Pipe, S. W., e outros, J. Thromb. Haemost. 9: 2235 a 2242 (2011). Em

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67/143 algumas modalidades, o BDD FVIII compreende um FVIII de cadeia simples que contém uma deleção nos aminoácidos 765 a 1652 correspondendo ao FVIII maduro de comprimento total (também conhecido como rVIII-SingleChain e AFSTYLA®). Ver Patente US No. 7.041.635. Cada uma das deleções anteriores pode ser feita em qualquer sequência de FVIII.

[00190] Um grande número de variantes funcionais de FVIII é conhecido, como é discutido acima e abaixo. Além disso, centenas de mutações não funcionais em FVIII foram identificadas em pacientes com hemofilia, e foi determinado que o efeito dessas mutações na função do FVIII é devido mais de onde elas se encontram dentro da estrutura tridimensional do FVIII do que à natureza da substituição (Cutler e outros, Hum. Mutat. 19: 274-8 (2002)), aqui incorporada por referência em sua totalidade. Além disso, as comparações entre o FVIII de humanos e outras espécies identificaram resíduos conservados que provavelmente serão necessários para a função (Cameron e outros, Thromb. Haemost. 79: 317-22 (1998); US 6.251.632), aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[00191] Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz da composição ou uma proteína quimérica compreendendo um FVIII e uma região Fc é equivalente a uma quantidade eficaz de FVIII sem a região Fc. Em certas modalidades, a quantidade eficaz é de aproximadamente 10 lU/Kg a aproximadamente 300 IU/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de aproximadamente 20 lU/Kg a aproximadamente 300 IU/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 250 IU/kg, aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 200 IU/kg, aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 190 IU/kg, aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 180 IU/kg, aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 170 IU/kg, aproximadamente 20 IU/kg a

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68/143 aproximadamente 160 IU/kg, aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 150 IU/kg, aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 140 IU/kg, aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 130 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 120 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 110 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 90 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 80 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 70 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg para aproximadamente 60 IU/kg, de aproximadamente 25 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 25 IU/kg a aproximadamente 90 IU/kg, de aproximadamente 25 IU/kg a aproximadamente 80 IU/kg, de aproximadamente 25 IU/kg/kg a aproximadamente 70 IU/kg, de aproximadamente 25 IU/kg a aproximadamente 65 IU/kg. Em uma modalidade particular, a quantidade eficaz é de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg. Em outra modalidade, a quantidade eficaz é de aproximadamente 25 IU/kg a aproximadamente 65 IU/kg. Em outras modalidades, a quantidade eficaz é de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 30 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 40 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 50 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 60 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 70 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 80 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, aproximadamente 90 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 90 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 80 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 70 IU/kg de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 60 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 50 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg

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69/143 a aproximadamente 40 IU/kg, ou de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 30 IU/kg.

[00192] Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de aproximadamente 10 IU/kg, aproximadamente 15 IU/kg, aproximadamente 20 IU/kg, aproximadamente 25 IU/kg, aproximadamente 30 IU/kg, aproximadamente 35 IU/kg, aproximadamente 40 IU/kg/kg, aproximadamente 45 IU/kg, aproximadamente 50 IU/kg, aproximadamente 55 IU/kg, aproximadamente 60 IU/kg, aproximadamente 65 IU/kg, aproximadamente 70 IU/kg, aproximadamente 75 IU/kg, aproximadamente 80 IU/kg aproximadamente 85 IU/kg, aproximadamente 90 IU/kg, aproximadamente 95 IU/kg, aproximadamente 100 IU/kg, aproximadamente 105 IU/kg, aproximadamente 110 IU/kg, aproximadamente 115 IU/kg, aproximadamente 120 IU/kg, aproximadamente 125 IU/kg, aproximadamente 130 IU/kg, aproximadamente 135 IU/kg, aproximadamente 140 IU/kg, aproximadamente 145 IU/kg, aproximadamente 150 IU/kg, aproximadamente 155 IU/kg, aproximadamente 160 IU/kg, aproximadamente 165 IU/kg/kg, aproximadamente 170 IU/kg, aproximadamente 175 IU/kg, aproximadamente 180 IU/kg, aproximadamente 185 IU/kg, aproximadamente 190 IU/kg, aproximadamente 195 IU/kg, aproximadamente 200 IU/kg, aproximadamente 225 IU/kg aproximadamente 250 IU/kg, aproximadamente 275 IU/kg ou aproximadamente 300 IU/kg. Em uma modalidade particular, a quantidade eficaz é de aproximadamente 50 IU/kg. Em outra modalidade, a quantidade eficaz é de aproximadamente 100 IU/kg. Em outra modalidade, a quantidade eficaz é de aproximadamente 200 IU/kg.

[00193] O intervalo de dosagem quando se administra a composição ou a proteína quimérica compreendendo FVIII e uma região Fc ou um fragmento do mesmo pode ser ao menos aproximadamente uma vez e meia superior ao intervalo de dosagem exigido para uma

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70/143 dose equivalente do dito fator de coagulação sem o domínio Fc. O intervalo entre doses pode ser de ao menos uma vez e meia a seis vezes mais, uma vez e meia a cinco vezes mais, uma vez e meia a quatro vezes mais, uma vez e meia a três vezes mais tempo, ou uma vez e metade a duas vezes mais do que o intervalo de dosagem exigido para uma dose equivalente do dito FVIII sem o domínio Fc.

[00194] Em algumas modalidades, a dose eficaz da composição ou da proteína quimérica compreendendo um FVIII e uma região Fc é administrada ao ser humano em um intervalo de dosagem de aproximadamente dois dias, aproximadamente três dias, aproximadamente quatro dias, aproximadamente cinco dias, aproximadamente seis dias, aproximadamente sete dias, aproximadamente oito dias, aproximadamente nove dias, aproximadamente dez dias, aproximadamente 11 dias, aproximadamente 12 dias, aproximadamente 13 dias, aproximadamente 14 dias, aproximadamente 15 dias, aproximadamente 16 dias, aproximadamente 17 dias, aproximadamente 18 dias, aproximadamente 19 dias, aproximadamente 20 dias, aproximadamente 21 dias, aproximadamente 22 dias, aproximadamente 23 dias, ou aproximadamente 24 dias. Em algumas modalidades, a dose eficaz da composição ou proteína quimérica compreendendo um FVIII e uma região Fc é administrada ao ser humano em um intervalo de dosagem de aproximadamente 25 dias, aproximadamente 26 dias, aproximadamente 27 dias, aproximadamente 28 dias, aproximadamente 29 dias, aproximadamente 30 dias, aproximadamente 45 dias, ou aproximadamente 60 dias.

[00195] Em algumas modalidades, a composição ou proteína quimérica compreendendo um FVIII e uma região Fc é administrada em um intervalo de dosagem de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 dias, aproximadamente 1 a aproximadamente 13 dias, aproximadamente 1 a aproximadamente 12 dias, aproximadamente 1

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71/143 a aproximadamente 11 dias, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 dias, aproximadamente 1 a aproximadamente 9 dias, aproximadamente 1 a aproximadamente 8 dias, aproximadamente 1 a aproximadamente 7 dias, aproximadamente 1 a aproximadamente 6 dias, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 dias 4 dias, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 dias, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 dias, aproximadamente 2 a aproximadamente 14 dias, aproximadamente 3 a aproximadamente 14 dias, aproximadamente 4 a aproximadamente 14 dias, aproximadamente 5 a aproximadamente 14 dias, aproximadamente 6 a aproximadamente 14 dias, aproximadamente 7 a aproximadamente 14 dias, aproximadamente 8 a aproximadamente 14 dias, aproximadamente 9 a aproximadamente 14 dias, aproximadamente 10 a aproximadamente 14 dias, aproximadamente 11 a aproximadamente 14 dias, aproximadamente 12 a aproximadamente 14 dias, aproximadamente 13 a aproximadamente 14 dias ou aproximadamente 5 a aproximadamente 10 dias. Em outras modalidades, a composição ou proteína quimérica compreendendo um FVIII e uma região Fc é administrada em um intervalo de dosagem de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 19 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 18 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 17 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 16 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 13 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 12 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 11 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 9 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 7 dias, de aproximadamente 1 a

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72/143 aproximadamente 6 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 dias, de aproximadamente 2 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 3 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 4 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 5 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 6 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 7 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 8 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 9 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 10 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 11 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 13 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 14 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 15 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 16 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 17 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 18 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 19 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 20 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 dias 15 dias, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 dias. Em certas modalidades, a composição ou proteína quimérica compreendendo um FVIII e uma região Fc é administrada em um intervalo de dosagem de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 dias. Em outras modalidades, a proteína quimérica compreendendo um FVIII e uma região Fc é administrada em um intervalo de dosagem de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 dias.

[00196] Em uma modalidade, a dose eficaz é de 25 a 65 IU/kg (25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 62,

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73/143 ou 65 IU/kg) e o intervalo entre doses é de uma vez a cada 3-5, 36, 3-7, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ou mais dias, ou três vezes por semana, ou não mais do que três vezes por semana. Em outra modalidade, a dose eficaz é de 65 IU/kg e o intervalo de dosagem é uma vez por semana ou uma vez a cada 6 a 7 dias. As doses podem ser administradas repetidamente, desde que sejam necessárias (por exemplo, ao menos 10, 20, 28, 30, 40, 50, 52 ou 57 semanas, ao menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 anos). Em uma modalidade particular, a dose eficaz é de aproximadamente 25 a 65 IU/kg e o intervalo de dosagem é uma vez a cada 3 a 5 dias.

[00197] A composição ou proteína quimérica compreendendo um FVIII e uma região Fc pode ser formulada para qualquer maneira apropriada de administração, incluindo, por exemplo, administração tópica (por exemplo, transdérmica ou ocular), oral, bucal, nasal, vaginal, retal ou parentérica.

[00198] O termo parentérica, tal como aqui utilizado, inclui injeção subcutânea, intradérmica, intravascular (por exemplo, intravenosa), intramuscular, espinhal, intracraniana, intratecal, intraocular, periocular, intraorbitária, intrassinovial e intraperitoneal, bem como qualquer técnica similar de injeção ou infusão. A composição também pode ser, por exemplo, uma suspensão, emulsão, formulação de liberação sustentada, creme, gel ou pó. A composição pode ser formulada como um supositório, com ligantes e carreadores tradicionais, tais como triglicerídeos.

[00199] Em um exemplo, a formulação farmacêutica é uma formulação líquida, por exemplo, uma solução aquosa isotônica, tamponada. Em outro exemplo, a composição farmacêutica tem um pH que é fisiológico ou próximo do fisiológico. Em outros exemplos, a formulação aquosa tem uma osmolaridade e salinidade fisiológicas ou próximas da fisiológica. Ela pode conter cloreto de sódio e/ou acetato

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74/143 de sódio.

[00200] Em algumas modalidades, a proteína quimérica compreendendo um FVIII e uma região Fc utilizada nos métodos da presente invenção é formulada em uma composição farmacêutica compreendendo: (a) o polipeptídeo quimérico; (b) um ou mais agentes estabilizantes selecionados a partir de sacarose, trealose, rafinose, arginina ou mistura dos mesmos; (c) cloreto de sódio (NaCI); (d) Lhistidina; e) cloreto de cálcio; e (f) polissorbato 20 ou polissorbato 80. Em certas modalidades, a composição farmacêutica compreende: (a) 50 lU/mL a 2500 UI/mL do polipeptídeo quimérico; (b) 10 mg/ml a 25 mg/ml de sacarose; (c) 8,8 mg/ml a 14,6 mg/ml de cloreto de sódio (NaCI); (d) 0,75 mg/ml a 2,25 mg/ml de L-histidina; (e) 0,75 mg/ml a

I, 5 mg/ml de cloreto de cálcio di-hidratado; e (f) 0,08 mg/ml a 0,25 mg/ml de polissorbato 20 ou polissorbato 80. Em alguns exemplos, a composição farmacêutica utilizada nos métodos da presente descrição é liofilizada.

[00201] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica não compreende uma célula imune. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica não compreende uma célula.

II. A.2. Fator IX [00202] O Fator IX Humano (FIX) é uma serina protease que é um componente importante da via intrínseca da cascata de coagulação sanguínea. Fator IX ou FIX, como aqui utilizado, refere-se a uma proteína e espécie do fator de coagulação e suas variantes de sequência, e inclui, mas não está limitado à sequência de aminoácidos 461 de cadeia simples do polipeptídeo precursor de FIX humano (prepro), a sequência de aminoácidos de cadeia única 415 de FIX humano maduro (e a variante R338L FIX (Padua). FIX inclui qualquer forma de molécula FIX com as características típicas de FIX de coagulação sanguínea. Como usado aqui Fator IX e FIX

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75/143 pretendem abranger polipeptídeos que compreendem os domínios Gla (região contendo resíduos de ácido γ-carboxiglutâmico), EGF1 e EGF2 (regiões contendo sequências homólogas ao fator de crescimento epidérmico humano), peptídeo de ativação (AP, formado pelos resíduos R136 -R180 do FIX maduro), e o domínio protease C-terminal (Pro), ou sinônimos desses domínios conhecidos na técnica, ou podem ser um fragmento truncado ou uma variante de sequência que retém ao menos uma porção da atividade biológica da proteína nativa. [00203] FIX ou variantes de sequência foram clonadas, como descrito nas Patentes US Nos. 4.770.999 e 7.700.734, e o cDNA que codifica para o Fator IX humano foi isolado, caracterizado e clonado em vetores de expressão (ver, por exemplo, Choo e outros, Nature 299: 178 a 180 (1982); Fair e outros, Blood 64: 194 a 204 (1984); e Kurachi e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 6461 a 6464 (1982)). Uma variante particular de FIX, a variante R338L FIX (Padua), caracterizada por Simioni e outros, 2009, compreende uma mutação de ganho de função, que está correlacionada com um aumento de quase 8 vezes na atividade da variante Padua em relação ao nativo. As variantes de FIX também podem incluir qualquer polipeptídeo FIX tendo uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, que não afetam a atividade FIX do polipeptídeo FIX.

[00204] Em algumas modalidades, o FIX compreende fator de coagulação IX (recombinante), proteína de fusão de albumina (também conhecida como RIX-FP e IDELVION®).

[00205] O polipeptídeo FIX é de 55 kDa, sintetizado como uma cadeia de prepró-polipeptídeo composta de três regiões: um peptídeo sinal de 28 aminoácidos (aminoácidos 1 a 28), um pró-peptídeo de 18 aminoácidos (aminoácidos 29 a 46), que é necessário para gamacarboxilação de resíduos de ácido glutâmico, e um Fator IX maduro de 415 aminoácidos. O pró-peptídeo é um terminal N da sequência de

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76/143 resíduos de 18 aminoácidos para o domínio gama-carboxiglutamato. O pró-peptídeo liga-se à gama carboxilase dependente de vitamina K e depois é clivado a partir do polipeptídeo precursor de FIX por uma proteinase endógena, muito provavelmente PACE (enzima de divagem de aminoácidos básicos pareados), também conhecida como furina ou PCSK3. Sem a gama carboxilação, o domínio Gla é incapaz de se ligar ao cálcio para assumir a conformação correta necessária para ancorar a proteína a superfícies fosfolipídicas carregadas negativamente, tornando assim o Fator IX não funcional. Mesmo se estiver carboxilado, o domínio Gla também depende da divagem do pró-peptídeo para a função adequada, uma vez que o pró-peptídeo retido interfere nas alterações conformacionais do domínio Gla necessárias para uma ótima ligação ao cálcio e ao fosfolipídeo. Em humanos, o Fator IX maduro resultante é secretado pelas células do fígado na corrente sanguínea como um zimogênio inativo, uma proteína de cadeia única com 415 resíduos de aminoácidos que contém aproximadamente 17% de carboidrato em peso (Schmidt, A. E, e outros (2003)). Trends Cardiovasc Med, 13: 39).

[00206] O FIX maduro é composto de vários domínios que em uma configuração de N terminal para C terminal são: um domínio GLA, um domínio EGF1, um domínio EGF2, um domínio de peptídeo de ativação (AP) e um domínio de protease (ou catalítico). Um ligante curto conecta o domínio EGF2 ao domínio AP. O FIX contém dois peptídeos de ativação formados por R145-A146 e R180-V181, respectivamente. Após a ativação, o FIX de cadeia simples torna-se uma molécula de 2 cadeias, na qual as duas cadeias são ligadas por uma ligação dissulfeto. Fatores de coagulação podem ser concebidos substituindo seus peptídeos de ativação, resultando em especificidade de ativação alterada. Nos mamíferos, o FIX maduro deve ser ativado pelo Fator XI ativado para produzir o Fator IXa. O domínio da protease

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77/143 fornece, após a ativação do FIX para FIXa, a atividade catalítica de FIX. O fator VIII ativado (FVIIIa) é o cofator específico para a expressão completa da atividade de FIXa.

[00207] Em outras modalidades, um polipeptídeo FIX compreende uma forma alélica Thr148 do Fator IX derivado de plasma e tem características estruturais e funcionais similares ao Fator IX endógeno. [00208] Um grande número de variantes de FIX funcionais é conhecido. A publicação internacional No. WO 02/040544 A3 descreve mutantes que exibem resistência aumentada à inibição por heparina na página 4, linhas 9-30 e página 15, linhas 6-31. A publicação internacional No. WO 03/020764 A2 descreve mutantes de FIX com imunogenicidade de células T reduzida nas Tabelas 2 e 3 (nas páginas 14-24) e na página 12, linhas 1-27. A publicação internacional No. WO 2007/149406 A2 descreve moléculas FIX mutantes funcionais que exibem maior estabilidade proteica, meia-vida aumentada in vivo e in vitro, e maior resistência a proteases na página 4, linha 1 a página 19, linha 11. O documento WO 2007/149406 A2 também descreve moléculas de FIX quiméricas e outras variantes na página 19, linha 12 a página 20, linha 9. A publicação internacional No. WO 08/118507 A2 descreve mutantes de FIX que exibem atividade de coagulação aumentada na página 5, linha 14 a página 6, linha 5. A publicação internacional No. WO 09/051717 A2 descreve mutantes de FIX tendo um número aumentado de sítios de glicosilação ligados a N e/ou O, o que resulta em um aumento da meia-vida e/ou recuperação na página 9, linha 11 à página 20, linha 2. A publicação internacional No. WO 09/137254 A2 descreve também mutantes do Fator IX com números aumentados de sítios de glicosilação na página 2, parágrafo [006] à página 5, parágrafo [011] e página 16, parágrafo [044] à página 24, parágrafo [057], A publicação internacional No. WO 09/130198 A2 descreve moléculas de FIX mutantes funcionais que têm um número

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78/143 aumentado de sítios de glicosilação, que resultam em um aumento da meia-vida, na página 4, linha 26 à página 12, linha 6. A publicação internacional No. WO 09/140015 A2 descreve mutantes de FIX funcionais que um número aumentado de resíduos Cys, que podem ser utilizados para conjugação de polímero (por exemplo, PEG), na página 11, parágrafo [0043] à página 13, parágrafo [0053]. Os polipeptídeos FIX descritos no Pedido Internacional No. PCT/US2011/043569 depositado em 11 de julho de 2011 e publicado como WO 2012/006624 em 12 de janeiro de 2012 também são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

[00209] Além disso, centenas de mutações não funcionais em FIX foram identificadas em indivíduos hemofílicos, muitas das quais são descritas na Tabela 5, nas páginas 11-14 da publicação internacional No. WO 09/137254 A2. Tais mutações não funcionais não estão incluídas na invenção, mas fornecem orientação adicional para as quais as mutações são mais ou menos prováveis de resultar em um polipeptídeo FIX funcional.

[00210] A atividade coagulante do Fator IX é expressa como Unidade(s) Internacional(ais) (IU). Uma UI de atividade de FIX corresponde aproximadamente à quantidade de FIX em um mililitro de plasma humano normal. Vários ensaios estão disponíveis para medir a atividade do Fator IX, incluindo o ensaio de coagulação de um estágio (tempo de tromboplastina parcial ativada; aPTT), tempo de geração de trombina (TGA) e tromboelastometria rotacional (ROTEM®). A invenção considera sequências que têm homologia com sequências FIX, fragmentos de sequência que são naturais, tais como de seres humanos, primatas não humanos, mamíferos (incluindo animais domésticos), e variantes de sequências não naturais que retêm, ao menos, uma porção da atividade biológica ou função biológica de FIX e/ou que são úteis para prevenir, tratar, mediar ou melhorar uma

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79/143 doença, deficiência, distúrbio ou condição relacionada com o fator de coagulação (por exemplo, episódios hemorrágicos relacionados a trauma, cirurgia, de deficiência de um fator de coagulação). Sequências com homologia ao FIX humano podem ser encontradas por técnicas de busca de homologia padrão, tal como NCBI BLAST. [00211] Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz da composição ou proteína quimérica compreendendo um FIX e uma região Fc é equivalente a uma quantidade eficaz do FIX sem a região Fc. Em certas modalidades, a quantidade eficaz é de aproximadamente 0,1 IU/kg a aproximadamente 500 IU/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de aproximadamente 10 lU/Kg a aproximadamente 400 IU/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de aproximadamente 20 lU/Kg a aproximadamente 300 IU/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 275 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 250 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 225 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 200 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 175 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 150 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 90 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 80 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 70 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 60 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg para aproximadamente 50 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 40 IU/kg, de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 30 IU/kg, de aproximadamente 30 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 40 IU/kg/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 50 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 60 IU/kg a aproximadamente 100

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80/143 lU/kg, de aproximadamente 70 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 80 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 90 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg, de aproximadamente 100 IU/kg a aproximadamente 200 IU/kg, de aproximadamente 150 IU/kg a aproximadamente 200 IU/kg, ou de aproximadamente 25 IU/kg a aproximadamente 75 IU/kg. Em uma modalidade particular, a quantidade eficaz é de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg.

[00212] Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de aproximadamente 10 IU/kg, aproximadamente 15 IU/kg, aproximadamente 20 IU/kg, aproximadamente 25 IU/kg, aproximadamente 30 IU/kg, aproximadamente 35 IU/kg, aproximadamente 40 IU/kg/kg, aproximadamente 45 IU/kg, aproximadamente 50 IU/kg, aproximadamente 55 IU/kg, aproximadamente 60 IU/kg, aproximadamente 65 IU/kg, aproximadamente 70 IU/kg, aproximadamente 75 IU/kg, aproximadamente 80 IU/kg aproximadamente 85 IU/kg, aproximadamente 90 IU/kg, aproximadamente 95 IU/kg, aproximadamente 100 IU/kg, aproximadamente 105 IU/kg, aproximadamente 110 IU/kg, aproximadamente 115 IU/kg, aproximadamente 120 IU/kg, aproximadamente 125 IU/kg, aproximadamente 130 IU/kg, aproximadamente 135 IU/kg, aproximadamente 140 IU/kg, aproximadamente 145 IU/kg, aproximadamente 150 IU/kg, aproximadamente 155 IU/kg, aproximadamente 160 IU/kg, aproximadamente 165 IU/kg, aproximadamente 170 IU/kg, aproximadamente 175 IU/kg, aproximadamente 180 IU/kg, aproximadamente 185 IU/kg, aproximadamente 190 IU/kg, aproximadamente 195 IU/kg, ou aproximadamente 200 IU/kg. Em uma modalidade particular, a quantidade eficaz é de aproximadamente 50 IU/kg. Em outra modalidade, a quantidade eficaz é de aproximadamente 100 IU/kg.

[00213] O intervalo de dosagem quando se administra a com

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81/143 posição ou proteína quimérica compreendendo FIX e uma região Fc ou um fragmento do mesmo pode ser de ao menos aproximadamente uma vez e meia mais longo do que o intervalo de dosagem exigido para uma dose equivalente do dito FIX sem o domínio Fc. O intervalo de dosagem pode ser de ao menos uma vez e meia a seis vezes mais, uma vez e meia a cinco vezes mais, uma vez e meia a quatro vezes mais, uma vez e meia a três vezes mais tempo, ou uma vez e meia a duas vezes mais do que o intervalo de dosagem exigido para uma dose equivalente do dito FIX sem o domínio Fc. Em algumas modalidades, o intervalo de dosagem é de ao menos aproximadamente uma e meia, duas, duas e meia, três, três e meio, quatro, quatro e meia, cinco, cinco e meia ou seis vezes mais do que o intervalo de dosagem exigido para uma dose equivalente do dito FIX sem o domínio Fc. O intervalo de dosagem pode ser de aproximadamente três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze ou quatorze dias ou mais. O intervalo de dosagem pode ser de ao menos aproximadamente meio a 5 dias, um dia e meio, 2, 3, 4 ou 5 dias ou mais. Para o tratamento sob demanda, o intervalo de dosagem do dito polipeptídeo quimérico ou híbrido é de aproximadamente uma vez a cada 24 a 36, 24 a 48, 24 a 72, 24 a 96, 24 a 120, 24 a 144, 24 a 168, 24, 25 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 ou 72 horas ou mais.

[00214] Em algumas modalidades, a dose eficaz da composição ou proteína quimérica compreendendo FIX e uma região Fc é administrada ao ser humano em um intervalo de dosagem de aproximadamente dois dias, aproximadamente três dias, aproximadamente quatro dias, aproximadamente cinco dias, aproximadamente seis dias, aproximadamente sete dias, aproximadamente oito dias, aproximadamente nove dias, aproximadamente dez dias, aproximadamente 11

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82/143 dias, aproximadamente 12 dias, aproximadamente 13 dias, aproximadamente 14 dias, aproximadamente 15 dias, aproximadamente 16 dias, aproximadamente 17 dias, aproximadamente 18 dias, aproximadamente 19 dias, aproximadamente 20 dias, aproximadamente 21 dias, aproximadamente 22 dias, aproximadamente 23 dias, ou aproximadamente 24 dias. Em algumas modalidades, a dose eficaz da composição ou proteína quimérica compreendendo FVIII e uma região Fc é administrada ao ser humano em um intervalo de dosagem de aproximadamente 25 dias, aproximadamente 26 dias, aproximadamente 27 dias, aproximadamente 28 dias, aproximadamente 29 dias, aproximadamente 30 dias, aproximadamente 45 dias, ou aproximadamente 60 dias. Em certas modalidades, a dose eficaz da composição ou proteína quimérica compreendendo FVIII e uma região Fc é administrada ao ser humano em um intervalo de dosagem de aproximadamente 7 dias, aproximadamente 8 dias, aproximadamente 9 dias, aproximadamente 10 dias, aproximadamente 11 dias, aproximadamente 12 dias, aproximadamente 13 dias, ou aproximadamente 14 dias. Em uma modalidade particular, a dose eficaz da composição ou proteína quimérica compreendendo FVIII e uma região Fc é administrada ao ser humano em um intervalo de dosagem de aproximadamente 2 dias (por exemplo, aproximadamente 48 horas). Em outra modalidade, a dose eficaz da composição ou proteína quimérica compreendendo FVIII e uma região Fc é administrada ao ser humano em um intervalo de dosagem de aproximadamente 7 dias. Em outra modalidade, a dose eficaz da composição ou proteína quimérica compreendendo FVIII e uma região Fc é administrada ao ser humano em um intervalo de dosagem de aproximadamente 10 dias. Em algumas modalidades, uma dose eficaz da composição ou proteína quimérica compreendendo FVIII e uma região Fc é administrada ao ser humano em um intervalo de dosagem de cada 6 a

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83/143 horas. Em certas modalidades, a dose eficaz da composição ou proteína quimérica compreendendo FVIII e uma região Fc é administrada ao ser humano em um intervalo de dosagem de todos os dias.

[00215] Em algumas modalidades, a composição ou proteína quimérica compreendendo FVIII e uma região Fc é administrada em um intervalo de dosagem de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 19 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 18 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 17 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 16 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 13 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 12 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 11 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 9 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 7 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 dias, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 dias, de aproximadamente 2 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 3 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 4 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 5 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 6 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 7 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 8 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 9 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 10 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 11 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 12 a

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84/143 aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 13 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 14 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 15 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 16 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 17 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 18 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 19 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 20 a aproximadamente 21 dias, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 dias, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15 dias, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 dias.

[00216] Em uma modalidade, a dose eficaz é uma dose que pode manter 1-50 UI/dL de FIX circulando (por exemplo, ao menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 lU/dl). Em outra modalidade, a dose eficaz é de 50 IU/kg e o intervalo de dosagem é uma vez por semana. Em outra modalidade, a dose eficaz é de 100 IU/kg, e o intervalo de dosagem é uma vez a cada 10 dias. As doses podem ser administradas repetidamente, desde que sejam necessárias (por exemplo, ao menos 10, 20, 28, 30, 40, 50, 52 ou 57 semanas, ao menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 anos).

[00217] A composição ou proteína quimérica compreendendo um FIX e uma região Fc pode ser formulada para qualquer maneira apropriada de administração, incluindo, por exemplo, administração tópica (por exemplo, transdérmica ou ocular), oral, bucal, nasal, vaginal, retal ou parentérica.

[00218] O termo parentérica, tal como aqui utilizado, inclui injeção subcutânea, intradérmica, intravascular (por exemplo, intravenosa), intramuscular, espinhal, intracraniana, intratecal, intraocular, periocular, intraorbitária, intrassinovial e intraperitoneal, bem como qualquer

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85/143 técnica similar de injeção ou infusão. A composição também pode ser, por exemplo, uma suspensão, emulsão, formulação de liberação sustentada, creme, gel ou pó. A composição pode ser formulada como um supositório, com ligantes e carreadores tradicionais, tais como triglicerídeos.

[00219] Em um exemplo, a formulação farmacêutica é uma formulação líquida, por exemplo, uma solução aquosa isotônica, tamponada. Em outro exemplo, a composição farmacêutica tem um pH que é fisiológico ou próximo do fisiológico. Em outros exemplos, a formulação aquosa tem uma osmolaridade e salinidade fisiológicas ou próximas da fisiológica. Ela pode conter cloreto de sódio e/ou acetato de sódio.

[00220] Em algumas modalidades, a proteína quimérica compreendendo um FIX e uma região Fc utilizada nos métodos da presente invenção é formulada em uma composição farmacêutica compreendendo: (a) o polipeptídeo quimérico; (b) uma mistura de carboidratos compreendendo sacarose e manitol; (c) cloreto de sódio (NaCI); (d) Lhistidina; e (e) polissorbato 20 ou polissorbato 80. Em certas modalidades, a composição farmacêutica compreende: (a) entre aproximadamente 25 IU/ml e aproximadamente 700 IU/ml do polipeptídeo Fator IX; (b) entre aproximadamente 10 mg/ml e aproximadamente 20 mg/ml de sacarose; (c) entre aproximadamente 20 mg/ml e aproximadamente 40 mg/ml de manitol; (d) entre aproximadamente 3 mg/ml e aproximadamente 4 mg/ml de NaCI; (e) entre aproximadamente 3 mg/ml e aproximadamente 6 mg/ml de L-histidina; (f) entre aproximadamente 0,08 mg/ml e aproximadamente 0,2 mg/ml de polissorbato 20 ou polissorbato 80; ou (g) qualquer combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, a composição farmacêutica utilizada nos métodos da presente descrição é liofilizada.

[00221] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica não

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86/143 compreende uma célula imune. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica não compreende uma célula.

II.A.3 Fc [00222] As composições ou proteínas quiméricas da descrição incluem um domínio Fc ou uma porção do mesmo que se liga a FcRn, FcyRIIB e/ou DC-SIGN. Em algumas modalidades, o domínio Fc é fundido com o fator de coagulação, por exemplo, como parte de uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. Em outras modalidades, o domínio Fc é fundido com um polipeptídeo que não o fator de coagulação, em que a composição compreende um (1) fator de coagulação e (2) uma proteína quimérica compreendendo um domínio Fc e um polipeptídeo adicional. Em algumas modalidades, o domínio Fc é coadministrado com o fator de coagulação. O domínio Fc ou uma porção do mesmo pode melhorar as propriedades farmacocinéticas ou farmacodinâmicas da proteína quimérica. Em certas modalidades, o domínio Fc ou uma porção do mesmo estende a meia-vida de uma molécula fundida ao domínio Fc ou uma porção do mesmo. Em algumas modalidades, a região Fc da proteína quimérica facilita a localização da proteína quimérica na articulação.

[00223] Como aqui utilizado, o termo domínio Fc ou região Fc, tal como aqui utilizado, significa a porção funcional de um polipeptídeo que corresponde ao domínio Fc de Ig nativa, isto é, como formado pela associação dimérica dos respectivos domínios Fc de suas duas cadeias pesadas. Um domínio Fc nativo forma um homodímero com outro domínio Fc. Em contraste, o termo região Fc geneticamente fundida ou região Fc de cadeia simples (região scFc), como aqui utilizado, refere-se a uma região Fc dimérica sintética compreendida de domínios Fc geneticamente ligados dentro de uma cadeia de polipeptídeo simples (isto é, codificada em uma única sequência

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87/143 genética contígua).

[00224] Em uma modalidade, a região Fc refere-se à porção de uma única cadeia pesada de Ig começando na região de dobradiça imediatamente a montante do sítio de divagem de papaína (isto é, resíduo 216 em IgG, tomando o primeiro resíduo da região constante de cadeia pesada para ser 114) e terminando no C terminal do anticorpo. Consequentemente, um domínio Fc completo compreende ao menos um domínio de dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3.

[00225] A região Fc de uma região constante de Ig, dependendo do isotipo de Ig, pode incluir os domínios CH2, CH3 e CH4, bem como a região de dobradiça. As proteínas quiméricas compreendendo uma região Fc de uma Ig conferem várias propriedades desejáveis a uma proteína quimérica incluindo estabilidade aumentada, meia-vida sérica aumentada (ver Capon e outros, Nature 337: 525, 1989) bem como ligação a receptores Fc tais como receptor Fc neonatal (FcRn) (Patentes US 6.086.875, 6.485.726, 6.030.613; WO 03/077834; US2003-0235536A1), que são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

[00226] Em algumas modalidades, a região Fc liga-se especificamente a FcRn. O receptor FcRn foi isolado de várias espécies de mamíferos, incluindo seres humanos. As sequências do FcRn humano, FcRn de macaco, FcRn de camundongo e FcRn de camundongo são conhecidas (Story e outros 1994, J. Exp. Med. 180: 2377). O receptor FcRn liga-se a IgG (mas não a outras classes de Ig como IgA, IgM, IgD e IgE) em pH relativamente baixo, transporta ativamente a IgG transcelularmente em uma direção luminal para serosa, e então libera a IgG em pH relativamente maior encontrado nos fluidos intersticiais. Ele é expresso em tecido epitelial adulto (Patentes US Nos. 6.485.726, 6.030.613, 6.086.875; WO 03/077834; US2003

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0235536A1) incluindo epitélio pulmonar e intestinal (Israel e outros 1997, Immunology 92:69) epitélio tubular proximal renal (Kobayashi e outros, 2002, Am. J. Physiol, Renal Physiol. 282: F358), bem como epitélio nasal, superfícies vaginais, e superfícies biliares.

[00227] As regiões Fc úteis na presente invenção abrangem moléculas que podem ligar-se especificamente a FcRn, FcyRIIB e/ou DC-SIGN, incluindo IgG integral, o fragmento Fc de IgG, e outros fragmentos que incluem a região de ligação completa do receptor FcRn. A região da porção Fc de IgG que se liga a FcRn, FcyRIIB, e/ou DC-SIGN foi descrita.

[00228] Em uma modalidade particular, a região Fc liga-se especificamente a um receptor ll-b da região Fc da gama imunoglobulina de baixa afinidade (FcyRIIB). FcyRIIB é um receptor Fc inibidor, que controla aspectos da resposta inflamatória. Em particular, a ativação de FcyRIIB inibe os sinais de ativação que levam à inflamação. Assim, com efeito, a ativação de FcyRIIB inibe a inflamação.

[00229] Em outra modalidade, a região Fc liga-se especificamente à não integrina captadora da molécula de adesão intercelular 3 e específica das células dendríticas (DC-SIGN). DC-SIGN, também conhecido como CD209) é um receptor de lectina do tipo C expresso pela maioria das células derivadas de mieloide, incluindo certos monócitos, células dendríticas e macrófagos. Estudos em camundongos revelaram que a ativação de DC-SIGN pode inibir a inflamação. Ver Nimerjahn, Capítulo 5, Pathways Involved in the Antiinflammatory Activity of IgG, Molecular Mechanisms of Antibody Activity, Nova Iorque, NY 2013: 113 a 138.

[00230] Especificamente ligado refere-se a duas moléculas que formam um complexo que é relativamente estável sob condições fisiológicas. A ligação específica é caracterizada por uma alta afinidade e uma capacidade baixa a moderada, distinguindo-se da ligação

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89/143 não específica que usualmente tem uma baixa afinidade com uma capacidade moderada a alta. Tipicamente, a ligação é considerada específica quando a constante de afinidade KA é maior do que 10⁶ M’¹, ou maior que 10⁸ M’¹. Se necessário, a ligação não específica pode ser reduzida sem afetar substancialmente a ligação específica variando as condições de ligação. As condições de ligação apropriadas, tais como concentração das moléculas, força iônica da solução, temperatura, tempo permitido para ligação, concentração de um agente bloqueador (por exemplo, albumina do soro, caseína de leite), etc., podem ser otimizadas por um versado na técnica utilizando técnicas de rotina.

[00231] Em certas modalidades, uma proteína quimérica da invenção compreende uma ou mais regiões Fc truncadas que são, no entanto, suficientes para conferir propriedades de ligação de FcRn, FcyRIIB e/ou DC-SIGN à região Fc. Por exemplo, a porção de uma região Fc que se liga a FcRn, FcyRIIB e/ou DC-SIGN (isto é, a porção de ligação FcRn, FcyRIIB, e/ou DC-SIGN) compreende aproximadamente aminoácidos 282-438 de lgG1, numeração EU (sendo os sítios de contacto primários os aminoácidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 e 314 do domínio CH2 e resíduos de aminoácidos 385-387, 428 e 433-436 do domínio CH3. Assim, uma região Fc da invenção pode compreender ou consistir de uma porção de ligação FcRn, FcyRIIB, e/ou DC-SIGN. As porções de ligação FcRn, FcyRIIB, e/ou DC-SIGN podem ser derivadas de cadeias pesadas de qualquer isotipo, incluindo lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4. Em uma modalidade, uma porção de ligação FcRn, FcyRIIB e/ou DC-SIGN de um anticorpo do isotipo humano lgG1 é usada. Em outra modalidade, é utilizada uma porção de ligação FcRn, FcyRIIB e/ou DC-SIGN de um anticorpo do isotipo lgG4 humano.

[00232] Em outra modalidade, a região Fc inclui uma sequência

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90/143 de aminoácidos de um domínio Fc ou derivada de um domínio Fc. Em certas modalidades, uma região Fc compreende ao menos um de: um domínio de dobradiça (por exemplo, região de dobradiça superior, média e/ou inferior) (aproximadamente aminoácidos 216-230 de uma região Fc do anticorpo de acordo com a numeração EU), um domínio CH2 (aproximadamente aminoácidos 231-340 de uma região Fc do anticorpo de acordo com a numeração EU), um domínio CH3 (aproximadamente os aminoácidos 341-438 de uma região Fc do anticorpo de acordo com a numeração EU), um domínio CH4 ou uma porção variante ou fragmento do mesmo. Em outras modalidades, uma região Fc compreende um domínio Fc completo (isto é, um domínio de dobradiça, um domínio CH2, e um domínio CH3). Em algumas modalidades, uma região Fc compreende, consiste essencialmente de, ou consiste em um domínio de dobradiça (ou uma porção do mesmo) fundido a um domínio CH3 (ou uma porção do mesmo), um domínio de dobradiça (ou uma porção do mesmo) fundido a um domínio CH2 (ou uma porção do mesmo), um domínio CH2 (ou uma porção do mesmo) fundido a um domínio CH3 (ou uma porção do mesmo), um domínio CH2 (ou uma porção do mesmo) fundido a ambos os domínios de dobradiça (ou uma porção do mesmo) e um domínio CH3 (ou uma porção do mesmo). Ainda em outras modalidades, uma região Fc não tem ao menos uma porção de um domínio CH2 (por exemplo, todo ou parte de um domínio CH2). Em uma modalidade particular, uma região Fc compreende ou consiste em aminoácidos correspondendo aos números EU 221 a 447.

[00233] As regiões Fc denotadas como F, F1, ou F2 aqui podem ser obtidas a partir de um número de diferentes fontes. Em uma modalidade, uma região Fc do polipeptídeo é derivada de uma Ig humana. Entende-se, no entanto, que uma região Fc pode ser derivada de uma Ig de outra espécie de mamífero, incluindo, por exemplo, um roedor

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91/143 (por exemplo, camundongo, rato, coelho ou porquinho da índia) ou espécie de primata não humano (por exemplo, chimpanzé, macaco). Além disso, o polipeptídeo dos domínios Fc ou suas porções pode ser derivado de qualquer classe de Ig, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer isotipo de Ig, incluindo lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4. Em outra modalidade, o isotipo humano lgG1 é utilizado.

[00234] Em certas modalidades, a variante de Fc confere uma alteração em ao menos uma função efetora conferida por uma região Fc compreendendo o domínio Fc de ocorrência natural (por exemplo, uma melhoria ou redução na capacidade da região Fc de se ligar a receptores Fc (por exemplo, redução na ligação a FcyRI ou FcyRI II ou melhora na ligação a FcRn ou FcyRII), proteínas do complemento (por exemplo, C1q) ou outros parceiros de ligação a Fc (por exemplo, melhora na ligação a DC-SIGN), ou citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose, ou citotoxicidade celular dependente de complemento (CDCC)). Em outras modalidades, a variante de Fc fornece um resíduo de cisteína modificado.

[00235] As regiões Fc da invenção podem empregar variantes de Fc reconhecidas na técnica que são conhecidas por conferirem uma alteração (por exemplo, um aumento ou redução) na função efetora e/ou na ligação a FcR. Especificamente, uma molécula de ligação da invenção pode incluir, por exemplo, uma alteração (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais das posições de aminoácidos descritas nas Publicações PCT Internacionais WO 88/07089A1, WO 96/14339A1, WO 98/05787A1, WO 98/23289A1, WO 99/51642A1, WO 99/58572A1, WO 00/09560A2, WO 00/32767A1, WO 00/42072A2, WO 02/44215 A2, WO 02/060919 A2, WO 03/074569 A2, WO 04/016750 A2, WO 04/029207 A2, WO 04/035752 A2, WO 04/063351 A2, WO 04/074455A2, WO 04/099249A2, WO 05/040217A2, WO 04/044859, WO 05/070963A1, WO 05/077981A2, WO 05/092925A2, WO

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05/123780A2, WO 06/019447A1, WO 06/047350A2 e WO 06/085967A2; Publicações de Patente US Nos. US 2007/0231329, US 2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US

2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US 20070286859, US 20080057056; ou Patentes US. Nos. 5.648.260, 5.739.277, 5.834.250, 5.869.046, 6.096.871, 6.121.022, 6.194.551, 6.242.195, 6.277.375, 6.528.624, 6.538.124, 6.737.056, 6.821.505, 6.998.253, 7.083.784, 7.404.956 e 7.317.091, cada uma das quais é aqui incorporada por referência. Em uma modalidade, a alteração específica (por exemplo, a substituição específica de um ou mais aminoácidos descritos na especialidade) pode ser feita em uma ou mais das posições de aminoácidos descritas. Em outra modalidade, pode ser feita uma alteração diferente em uma ou mais das posições de aminoácidos descritas (por exemplo, a diferente substituição de uma ou mais posições de aminoácidos descritas na técnica).

[00236] A região Fc pode ser modificada de acordo com procedimentos bem reconhecidos, tais como mutagênese sítio-dirigida e similares, para produzir fragmentos de Fc modificados ou porções dos mesmos que serão ligados por FcRn, FcyRIIB e/ou DC-SIGN. Tais modificações incluem modificações remotas a partir do sítios de contato FcRn, FcyRIIB e/ou DC-SIGN, bem como modificações nos sítios de contato que preservam ou até aumentam a ligação a FcRn, FcyRIIB e/ou DC-SIGN. Por exemplo, os seguintes resíduos de aminoácido isolados em lgG1 Fc humano (Fc y1) podem ser substituídos sem perda significativa de afinidade de ligação a FcRn, FcyRIIB, e/ou DC-SIGN: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A,

M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A,

D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A,

H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A,

Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A,

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Q311A,	D312A,	N315A,	K317A,	E318A,	K320A,	K322A,	S324A,
K326A,	A327Q,	P329A,	A330Q,	P331A,	E333A,	K334A,	T335A,
S337A,	K338A,	K340A,	Q342A,	R344A,	E345A,	Q347A,	R355A,
E356A,	M358A,	T359A,	K360A,	N361A,	Q362A,	Y373A,	S375A,
D376A,	A378Q,	E380A,	E382A,	S383A,	N384A,	Q386A,	E388A,
N389A,	N390A,	Y391F,	K392A,	L398A,	S400A,	D401A,	D413A,
K414A,	R416A,	Q418A,	Q419A,	N421A,	V422A,	S424A,	E430A,
N434A,	T437A,	Q438A, K439A, S440A, S444A e K447A, onde, por

exemplo, P238A representa prolina de ocorrência natural substituída poralanina na posição número 238.

[00237] Como um exemplo, uma modalidade específica incorpora a mutação N297A, removendo um sítio de N-glicosilação altamente conservado. Além da alanina, outros aminoácidos podem ser substituídos pelos aminoácidos de ocorrência natural nas posições especificadas acima. Mutações podem ser introduzidas isoladamente em Fc dando origem a mais de cem regiões Fc distintas do Fc nativo. Além disso, combinações de duas, três ou mais dessas mutações individuais podem ser introduzidas juntas, dando origem a centenas de outras regiões Fc. Ademais, uma da região Fc de um construto da invenção pode ser mutada e a outra região Fc do construto não mutado, ou ambas podem estar mutadas, mas com mutações diferentes.

[00238] Em uma modalidade, o domínio Fc ou uma porção do mesmo é um polipeptídeo incluindo a SEQ ID NO: 3 da Patente US. No. 5.739.277 e, opcionalmente, incluindo ainda uma sequência selecionada a partir das SEQ ID NOs: 11, 1, 2 e 31 da Patente No. 5.739.277.

[00239] Em certas modalidades, o domínio Fc ou uma porção do mesmo é hemiglicosilado. Por exemplo, a proteína quimérica compreendendo duas regiões Fc pode conter uma primeira região Fc

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94/143 glicosilada (por exemplo, uma região CH2 glicosilada) e uma segunda região Fc aglicosilada (por exemplo, uma região CH2 aglicosilada). Em uma modalidade, um ligante pode ser interposto entre as regiões Fc glicosilada e aglicosilada. Em outra modalidade, a região Fc é totalmente glicosilada, isto é, todas as regiões Fc são glicosiladas. Em outras modalidades, a região Fc pode ser aglicolisada, isto é, nenhuma das porções Fc é glicosilada.

[00240] Em certas modalidades, uma proteína quimérica da invenção compreende uma substituição de aminoácidos para um domínio Fc ou uma porção do mesmo (por exemplo, variantes de Fc), que altera as funções efetoras independentes de antígeno do domínio Fc, em particular a meia-vida em circulação da proteína.

[00241] Uma região Fc utilizada na invenção pode também compreender uma substituição de aminoácidos reconhecida na técnica que altera a glicosilação da proteína quimérica. Por exemplo, a região Fc da proteína quimérica ligada a uma proteína FVIII ou uma proteína FIX pode compreender uma região Fc tendo uma mutação que conduz a uma glicosilação reduzida (por exemplo, glicosilação N-ligada ou Oligada) ou pode compreender uma glicoforma alterada da porção de Fc de ocorrência natural (por exemplo, um glicano com baixa fucose ou sem fucose).

[00242] Em uma modalidade, uma proteína quimérica não processada da invenção pode compreender uma região Fc geneticamente fundida (isto é, região scFc) tendo duas ou mais de sua região constante constitutiva de Ig ou uma porção da mesma independentemente selecionada a partir da região constante de Ig ou uma porção da mesma aqui descrita. Em uma modalidade, as regiões Fc de uma região Fc dimérica são iguais. Em outra modalidade, ao menos duas das regiões Fc são diferentes. Por exemplo, as regiões Fc das proteínas da invenção compreendem o mesmo número de resíduos de

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95/143 aminoácidos ou podem diferir em comprimento por um ou mais resíduos de aminoácidos (por exemplo, por aproximadamente 5 resíduos de aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoácidos), aproximadamente 10 resíduos, aproximadamente 15 resíduos, aproximadamente 20 resíduos, aproximadamente 30 resíduos, aproximadamente 40 resíduos ou aproximadamente 50 resíduos). Ainda em outras modalidades, as regiões Fc da proteína da invenção podem diferir em sequência em uma ou mais posições de aminoácidos. Por exemplo, ao menos duas das regiões Fc podem diferir em aproximadamente 5 posições de aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 posições de aminoácidos), aproximadamente 10 posições, aproximadamente 15 posições, aproximadamente 20 posições, aproximadamente 30 posições, aproximadamente 40 posições, ou aproximadamente 50 posições).

[00243] Em algumas modalidades, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente descrição compreende mais de uma cadeia polipeptídica. Em algumas modalidades, a proteína quimérica compreende duas cadeias polipeptídicas. Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica compreende um fator de coagulação e uma primeira região Fc, e a segunda cadeia polipeptídica compreende uma segunda região Fc. Em certas modalidades, a primeira região Fc e a segunda região Fc estão associadas por uma ligação covalente. Em uma modalidade, a primeira região Fc e a segunda região Fc estão associadas por uma ligação peptídica. Em outra modalidade, a primeira região Fc e a segunda região Fc estão associadas por uma ligação dissulfeto.

[00244] Em uma modalidade particular, a proteína quimérica compreende uma porção de fator VIII e uma porção do fator de von Willebrand (VWF), em que a porção de FVIII compreende um polipeptídeo de FVIII ou um fragmento do mesmo, em que a porção de

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VWF compreende um polipeptídeo de VWF ou um fragmento do mesmo, em que a porção de FVIII está ligada a uma primeira região Fc, em que a porção de VWF está ligada a uma segunda região Fc, e em que a primeira região Fc e a segunda região Fc estão associadas uma à outra. Em certas modalidades, a porção de VWF compreende os domínios D’ e D3 de VWF. Em uma modalidade, o primeiro polipeptídeo, o segundo polipeptídeo, ou o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo compreendem adicionalmente uma ou mais porções que estendem a meia-vida.

[00245] Uma região Fc ou uma porção da mesma para a produção de uma proteína quimérica usada nos métodos da presente descrição pode ser obtida a partir de várias fontes diferentes. Em algumas modalidades, uma região Fc ou uma porção da mesma é derivada de uma Ig humana. Entende-se, no entanto, que a região Fc ou uma porção da mesma pode ser derivada de uma Ig de outra espécie de mamífero, incluindo, por exemplo, um roedor (por exemplo, camundongo, rato, coelho, porquinho da índia) ou espécie de primata não humano (por exemplo, chimpanzés, macacos). Além disso, a região Fc ou uma porção da mesma pode derivar de qualquer classe de Ig, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer isotipo de Ig, incluindo lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4. Em uma modalidade, é utilizado o isotipo lgG1 humano.

[00246] Uma variedade de sequências genéticas da região Fc (por exemplo, sequências do gene Fc humano) está disponível na forma de depósitos publicamente acessíveis. As sequências de Fc podem ser selecionadas tendo uma função efetora particular (ou sem uma função efetora particular) ou com uma modificação particular para reduzir a imunogenicidade. Foram publicadas muitas sequências de anticorpos e genes codificadores de anticorpos e sequências da região Fc adequadas podem ser derivadas destas sequências utilizando técnicas

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97/143 reconhecidas. O material genético obtido utilizando qualquer um dos métodos anteriores pode então ser alterado ou sintetizado para obter proteínas quiméricas utilizadas nos métodos da presente descrição. Será ainda apreciado que o escopo desta invenção abrange alelos, variantes e mutações de sequências de DNA de região constante. [00247] As sequências de Fc ou uma porção da mesma podem ser clonadas, por exemplo, utilizando a reação em cadeia da polimerase e iniciadores que são selecionados para amplificar o domínio de interesse. Para clonar uma sequência da região Fc ou uma porção da mesma a partir de um anticorpo, o mRNA pode ser isolado a partir de hibridoma, baço, ou células linfáticas, transcritas inversamente em DNA, e genes de anticorpo amplificados por PCR. Os métodos de amplificação por PCR são descritos em detalhes nas Patentes 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159, 4.965.188; e, por exemplo, em PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Innis e outros eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho e outros 1989. Gene 77:51; Horton e outros 1993. Métodos Enzymol. 217: 270). A PCR pode ser iniciada por iniciadores consenso da região constante ou por iniciadores mais específicos baseados nas sequências de DNA e de aminoácidos da cadeia pesada e leve publicadas. Como discutido acima, a PCR também pode ser utilizada para isolar clones de DNA que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo. Neste caso, as bibliotecas podem ser triadas quanto a iniciadores consenso ou sondas homólogas maiores, tais como sondas de região constante de camundongo. Numerosos conjuntos de iniciadores adequados para amplificação de genes de anticorpos são conhecidos na técnica (por exemplo, iniciadores 5’ baseados na sequência N terminal de anticorpos purificados (Benhar e Pastan. 1994. Protein Engineering 7: 1509); amplificação rápida de extremidades de cDNA (Ruberti, F. e outros, 1994, J. Immunol, Methods 173: 33), sequências líder de

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98/143 anticorpos (Larrick e outros, 1989, Biochem. Biophys. Res. Commun. 160: 1250). A clonagem de sequências de anticorpos é ainda descrita por Newman e outros, Patente US. No. 5.658.570, depositada em 25 de janeiro de 1995, que é aqui incorporada por referência.

II.B. Porções de Extensão de Meia-Vida [00248] Em algumas modalidades, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente descrição compreende ainda uma ou mais porções de extensão de meia-vida. A meia-vida de um fator de coagulação pode ser determinada por qualquer método conhecido dos versados na técnica, por exemplo, ensaios de atividade de FVIII (ensaio cromogênico ou ensaio de aPTT de coagulação de um estágio) para detectar níveis de atividade de FVIII no plasma ou FVIII/FIX ELISA para detectar o nível de antígeno de FVIII/FIX no plasma. Em uma modalidade particular, a meia-vida da atividade de coagulação de um fator de coagulação é determinada por ensaio de coagulação de um estágio. Em uma modalidade mais particular, a meia-vida da atividade de coagulação de um fator de coagulação é determinada em camundongos, ou camundongos HemA e camundongos nocaute (DKO) de Fator FVII e Fator de von Willebrand.

[00249] Em certos aspectos, uma porção heteróloga que aumenta meia-vida do fator de coagulação da invenção compreende, sem limitação, um polipeptídeo heterólogo, tal como a albumina, uma região Fc de imunoglobulina, uma sequência XTEN, o peptídeo Cterminal (CTP) da subunidade β da gonadotropina coriônica humana, uma sequência PAS, uma sequência HAP, uma transferrina, porções de ligação à albumina, ou quaisquer fragmentos, derivados, variantes ou combinações destes polipeptídeos. Em outros aspectos relacionados, uma porção de extensão de meia-vida pode incluir um sítio de ligação para uma porção não polipeptídica, tal como polietileno glicol (PEG), hidroxietil amido (HES), ácido polissiálico ou quaisquer

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99/143 derivados, variantes ou combinações destas porções. Em certas modalidades, a porção de extensão de meia-vida compreende albumina ou um fragmento da mesma, uma porção de ligação à albumina, uma sequência PAS, uma sequência HAP, transferrina ou um fragmento da mesma, polietileno glicol (PEG), ácido polissiálico, hidroxietil amido (HES), um derivado do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a porção de extensão de meia-vida não compreende um XTEN. Em outras modalidades, a porção de extensão de meia-vida compreende um XTEN.

[00250] Em outras modalidades, uma proteína quimérica da invenção é conjugada com um ou mais polímeros. O polímero pode ser solúvel em água ou não solúvel em água. O polímero pode ser covalentemente ou não covalentemente ligado ao fator de coagulação, o Fc, ou a outras porções conjugadas com o fator de coagulação ou com o Fc. Exemplos não limitantes do polímero podem ser poli (óxido de alquileno), poli (vinil pirrolidona), poli (vinil álcool), polioxazolina ou poli (acriloilmorfolina). Tipos adicionais, por exemplo, de FVIII conjugado com polímero são descritos na Patente US. No. 7.199.223, que é descrita por referência em sua totalidade.

[00251] Em certos aspectos, uma proteína quimérica da invenção pode compreender um, dois, três ou mais porções de extensão de meia-vida, que podem cada um ser as mesmas moléculas ou moléculas diferentes.

[00252] Em algumas modalidades, a porção de extensão de meiavida é fundida ao N terminal ou ao C terminal do polipeptídeo quimérico. Em algumas modalidades, a porção de extensão de meiavida é fundida ao N terminal ou ao C terminal do fator de coagulação. Em algumas modalidades, a porção de extensão de meia-vida é fundida ao N terminal ou ao C terminal de Fc. Em certas modalidades,

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100/143 a porção de extensão de meia-vida é inserida dentro do fator de coagulação da proteína quimérica.

[00253] Em algumas modalidades, a proteína quimérica compreende FVIII ou uma porção do mesmo, e a porção de extensão de meia-vida é inserida dentro do FVIII em uma ou mais posições descritas na Publicação de Patente US. No. 2015-0158929 A1 e/ou Publicação Internacional No. WO 2015106052 A1, que são aqui incorporadas por referência em sua totalidade. Em uma modalidade particular, a porção de extensão de meia-vida é inserida no domínio B (ou um fragmento do mesmo) do FVIII. Em uma modalidade particular, a porção de extensão de meia-vida é inserida dentro do FVIII imediatamente à jusante do resíduo de aminoácido 745 do FVIII maduro.

[00254] Em outras modalidades, a proteína quimérica compreende FIX ou uma porção do mesmo, e a porção de extensão de meia-vida é inserida dentro do FIX em uma ou mais posições descritas no Pedido Internacional No. PCT/US16/045401. Em uma modalidade particular, a porção de extensão de meia-vida é inserida no FIX em um sítio de inserção imediatamente à jusante de um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em aminoácido 103, aminoácido 105, aminoácido 142, aminoácido 149, aminoácido 162, aminoácido 166, aminoácido 174, aminoácido 224, aminoácido 226, aminoácido 228, aminoácido 413 de FIX Padua maduro. Em uma modalidade, a proteína quimérica compreende um FIX e uma região Fc, em que o FIX compreende uma porção de extensão de meia-vida inserida no domínio do peptídeo de ativação (AP) do FIX. Em uma modalidade particular, a proteína quimérica compreende um FIX e uma região Fc, em que o FIX compreende uma porção de extensão de meia-vida inserida no FIX imediatamente à jusante do resíduo de aminoácido 166 da de FIX Padua maduro.

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II.B.1. Albuminas [00255] Em certos aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente descrição compreende ao menos um polipeptídeo de albumina ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo. A albumina do soro humano (HSA, ou HA), uma proteína de 609 aminoácidos na sua forma de comprimento total, é responsável por uma proporção significativa da pressão osmótica do soro e também funciona como um carreador de ligandos endógenos e exógenos. O termo albumina, tal como aqui utilizado, inclui albumina de comprimento total ou um fragmento funcional, variante, derivado ou análogo do mesmo. Exemplos de albumina ou de seus fragmentos ou variantes são descritos na Publicação de Patente 2008/0194481A1, 2008/0004206 A1, 2008/0161243 A1, 2008/0261877 A1, ou 2008/0153751 A1 ou Publicação de Pedido PCT 2008/033413 A2, 2009/058322 A1, ou 2007/021494 A2, que são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

[00256] Os polipeptídeos de ligação à albumina (ABPs) podem comprometer, sem limitação, os domínios de ligação à albumina bacteriana, os peptídeos de ligação à albumina, ou os fragmentos de anticorpo de ligação à albumina que se podem se ligar à albumina. O domínio 3 da proteína G estreptocócica, como descrito por Kraulis e outros, FEBS Lett. 378: 190 a 194 (1996) e Linhult e outros, Protein Sei. 11: 206 a 213 (2002) é um exemplo de um domínio de ligação à albumina bacteriana. Exemplos de peptídeos de ligação à albumina são descritos por Dennis e outros, J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035 a 35043 (2002). Exemplos de fragmentos de anticorpo de ligação à albumina são descritos por Muller e Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. 9: 319 a 326 (2007); Roovers e outros, Cancer Immunol. Imunother 56: 303 a 317 (2007), e Holt e outros, Prot. Eng. Design Sci., 21: 283 a 288 (2008), que são aqui incorporados por referência

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102/143 em sua totalidade.

[00257] Em certos aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente descrição compreende ao menos um sítio de ligação para uma pequena molécula não polipeptídica, variante ou derivado que pode ligar-se à sua albumina. Por exemplo, a proteína quimérica pode incluir uma ou mais porções de ligação à albumina orgânica. Um exemplo de tais porções de ligação à albumina é 2- (3maleimidopropanamido)-6-(4- (4-iodofenil) butanamido) hexanoato (etiqueta Albu) como descrito por Trussel e outros, Bioconjugate Chem. 20: 2286 a 2292 (2009).

II.B.2. XTENs [00258] Em certos aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente descrição compreende ao menos um polipeptídeo XTEN ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo. Como aqui utilizado, a sequência XTEN refere-se a polipeptídeos de comprimento estendido com sequências substancialmente não repetitivas de ocorrência não natural que são compostas principalmente por pequenos aminoácidos hidrofílicos, com a sequência tendo um baixo grau ou nenhuma estrutura secundária ou terciária sob condições fisiológicas. Como o parceiro proteína quimérica, as XTENs podem servir como carreador, conferindo certas propriedades farmacocinéticas, físicoquímicas e farmacêuticas desejáveis, por exemplo, quando fundidas com ou inseridas no fator de coagulação da proteína quimérica. Tais propriedades desejáveis incluem, mas não estão limitadas a parâmetros farmacocinéticos e características de solubilidade melhorados.

[00259] Uma sequência de XTEN fundida com ou inserida no fator de coagulação da proteína quimérica utilizada nos métodos da presente descrição pode conferir à proteína quimérica uma ou mais das seguintes propriedades vantajosas: flexibilidade conformacional, solubilidade aquosa melhorada, grau elevado de resistência à

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103/143 protease, baixa imunogenicidade, baixa ligação a receptores de mamíferos, ou aumento de raios hidrodinâmicos (ou Stokes). Em certos aspectos, uma sequência de XTEN pode aumentar as propriedades farmacocinéticas, tal como a meia-vida mais longa (por exemplo, meia-vida in vivo) ou área aumentada sob a curva (AUC), de modo que a proteína quimérica permaneça in vivo e tenha atividade pró-coagulante por período de tempo aumentado em comparação com a proteína quimérica sem o XTEN.

[00260] Exemplos de sequências XTEN que podem ser inseridas em proteínas FVIII recombinantes da invenção são descritos, por exemplo, nas Publicações da Patente US. Nos. 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1,

2011/0077199 A1, ou 2011/0172146 A1, ou Publicações de Patente Internacional No. WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, WO 2011028344 A2 ou WO 2015106052 A1, cada uma das quais é incorporada aqui por referência em sua totalidade.

II.B.3. VWF ou um fragmento do mesmo [00261] Em certos aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente descrição compreende ao menos um polipeptídeo VWF ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo. O VWF (também conhecido como F8VWF) é uma glicoproteína multimérica grande presente no plasma sanguíneo e produzida constitutivamente no endotélio (nos corpos de Weibel-Palade), nos megacariócitos (grânulos a das plaquetas) e no tecido conjuntivo subendotelial. O monômero básico de VWF é uma proteína de 2813 aminoácidos. Cada monômero contém vários domínios específicos com uma função específica, o domínio D7 D3 (que se liga ao Fator VIII), o domínio A1 (que se liga ao receptor GPIb plaquetário, heparina e/ou possivelmente colágeno), o domínio A3 (que se liga ao colágeno),

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104/143 o domínio C1 (no qual o domínio RGD se liga à integrina plaquária αΙΙόβ3 quando é ativado), e o domínio nó de cisteína na extremidade C-terminal da proteína (que o VWF compartilha com o fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), fator de crescimento transformante - β (Τ6Ρβ) e gonadotrofina coriônica β humana fêHCG)).

[00262] Em uma modalidade, o polipeptídeo de VWF é um fragmento de VWF. O termo um fragmento de VWF, como aqui utilizado, inclui, mas não está limitado a, fragmentos funcionais de VWF compreendendo um domínio D’ e um domínio D3, que são capazes de inibir a ligação de VWF endógeno a FVIII. Em uma modalidade, a proteína quimérica utilizada nos métodos da presente descrição compreende um fator de coagulação, uma região Fc e um fragmento de VWF, em que o fator de coagulação compreende FVIII e em que o fragmento de VWF se liga à proteína FVIII. Em outra modalidade, o fragmento de VWF bloqueia o sítio de ligação de VWF à proteína FVIII, inibindo assim a interação da proteína FVIII com o VWF endógeno. Os fragmentos de VWF incluem derivados, variantes, mutantes ou análogos que retêm estas atividades de VWF. Em certas modalidades, o fragmento de VWF compreende o domínio D’ e o domínio D3 de VWF.

[00263] A sequência de aminoácidos do monômero 2813 para o VWF humano é relatada como Número de Acesso _NP_000543.2__ no Genbank. A sequência de nucleotídeos que codifica o VWF humano é relatada como Número de Acesso __NM_000552.3_ no

Genbank.

[00264] Em certas modalidades, a proteína VWF útil aqui pode ser ainda modificada para melhorar a sua interação com FVIII, por exemplo, para melhorar a afinidade de ligação ao FVIII. Em outras modalidades, as proteínas VWF úteis para a invenção podem ter

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105/143 outras modificações, por exemplo, a proteína pode ser peguilada, glicosilada, hesilada ou polissialilada. Exemplos de sequências de VWF úteis nos métodos da presente descrição são fornecidos, por exemplo, nas Publicações US. Nos. US 2015/0023959 A1, US 2015/0266943 A1 e US 2015/0158929. Em certas modalidades, a proteína VWF ou um fragmento da mesma é fundida ou coadministrada com um parceiro de ligação FcRn. Em algumas modalidades, a proteína VWF ou um fragmento da mesma é fundida a um Fc ou coadministrada com um Fc ou um polipeptídeo compreendendo um Fc. Em algumas modalidades, a proteína VWF ou um fragmento da mesma é fundida a uma albumina ou coadministrada com uma albumina ou um polipeptídeo compreendendo uma albumina.

II.B.4. CTP [00265] Em certos aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente descrição compreende ao menos um peptídeo C-terminal (CTP) da subunidade β da gonadotrofina coriônica humana ou seu fragmento, variante ou derivado. Sabe-se que os peptídeos CTP aumentam a meia-vida dessa proteína. Ver, por exemplo, Patente US. No. 5.712.122, aqui incorporada por referência em sua totalidade. Os peptídeos CTP exemplificativos não limitantes são descritos na Publicação de Pedido de Patente US. No. US 2009/0087411 A1, incorporado por referência.

II.B.5. PAS [00266] Em certos aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente descrição compreende ao menos um peptídeo PAS ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo. Um peptídeo PAS ou sequência PAS, tal como aqui utilizado, significa uma sequência de aminoácidos compreendendo principalmente resíduos de alanina e serina ou compreendendo principalmente resíduos de alanina, serina e prolina, a sequência de aminoácidos formando uma conformação

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106/143 helicoidal aleatória sob condições fisiológicas. Consequentemente, a sequência PAS é um bloco constituinte, um polímero de aminoácidos ou um cassete de sequências compreendendo, consistindo essencialmente de, ou consistindo de alanina, serina e prolina que podem ser utilizadas como parte da porção heteróloga na proteína quimérica. Um polímero de aminoácidos também pode formar uma conformação helicoidal aleatória quando outros resíduos diferentes de alanina, serina e prolina são adicionados como um constituinte minoritário na sequência PAS. Por constituinte minoritário entende-se que aminoácidos que não alanina, serina e prolina podem ser adicionados na sequência PAS até um certo grau, por exemplo, até aproximadamente 12%, isto é, aproximadamente 12 dos 100 aminoácidos da sequência PAS, até aproximadamente 10%, até aproximadamente 9%, até aproximadamente 8%, aproximadamente 6%, aproximadamente 5%, aproximadamente 4%, aproximadamente 3%, isto é, aproximadamente 2%, ou aproximadamente 1%, dos aminoácidos. Os aminoácidos diferentes de alanina, serina e prolina são selecionados a partir do grupo que consiste em Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gli, His, He, Leu, Lis, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr, e Vai. Sob condições fisiológicas, um peptídeo PAS forma uma conformação helicoidal aleatória e, desse modo, pode mediar um aumento da estabilidade in vivo e/ou in vitro para uma proteína recombinante da invenção, e tem atividade prócoagulante.

[00267] Exemplos não limitantes dos peptídeos PAS são descritos, por exemplo, na Publicação de Patente No. 2010/0292130 A1; Publicação de Pedido PCT No. WO 2008/155134 A1; e patente europeia EP2173890.

II.B.6. HAP [00268] Em certos aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente descrição compreende ao menos um peptídeo

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107/143 de polímero de homoaminoácido (HAP) ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo. Um peptideo HAP pode compreender uma sequência repetitiva de glicina, que tem ao menos 50 aminoácidos, ao menos 100 aminoácidos, 120 aminoácidos, 140 aminoácidos, 160 aminoácidos, 180 aminoácidos, 200 aminoácidos, 250 aminoácidos, 300 aminoácidos, 350 aminoácidos, 400 aminoácidos, 450 aminoácidos ou 500 aminoácidos de comprimento. Uma sequência HAP é capaz de estender a meia-vida de uma porção fundida ou ligada à sequência HAP. Exemplos não limitantes da sequência HAP incluem, mas não estão limitados a (Gly)_n, (Gly4Ser)_n ou S(Gly4Ser)_n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20. Em uma modalidade, n é 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40. Em outra modalidade, n é 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200. Ver, por exemplo, Schlapschy M e outros, Protein Eng. Design Selection, 20: 273 a 284 (2007).

II.B.7. Transferrina [00269] Em certos aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente descrição compreende ao menos um peptídeo de transferrina ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo. Qualquer transferrina pode ser fundida com a proteína quimérica utilizada nos métodos da presente descrição. Como um exemplo, a Tf (Tf) humana de ocorrência natural é uma proteína de 679 aminoácidos, de aproximadamente 75 kDa (não responsável pela glicosilação), com dois domínios principais, N (aproximadamente 330 aminoácidos) e C (aproximadamente 340 aminoácidos), que parecem originar de uma duplicação gênica. Ver os números de acesso do GenBank NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 e S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov), todos os quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

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108/143 [00270] A transferrina transporta o ferro através de endocitose mediada por receptor de transferrina (TfR). Depois que o ferro é liberado em um compartimento endossômico e o complexo Tf-TfR é reciclado para a superfície celular, o Tf é liberado de volta para o espaço extracelular para o próximo ciclo de transporte de ferro. Tf possui uma meia-vida longa que é superior a 14-17 dias (Li e outros, Trends Pharmacol. Sci. 23: 206 a 209 (2002)). As proteínas de fusão de transferrina foram estudadas quanto à extensão da meia-vida, entrega direcionada para terapias do câncer, entrega oral e ativação sustentada de pró-insulina (Brandsma e outros, Biotechnol. Adv., 29: 230 a 238 (2011); Bai e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 7292 a 7296 (2005), Kim e outros, J. Pharmacol, Exp. Ther., 334: 682 a 692 (2010), Wang e outros, J. Controlled Release 155: 386 a 392 (2011)).

II.B.8. PEG [00271] Em certos aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente descrição compreende ao menos um sítio de ligação para uma porção heteróloga não polipeptídica ou fragmento, variante, ou derivado da mesma. Por exemplo, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente descrição pode incluir uma ou mais porções de polietileno glicol (PEG) ligadas a um ou mais resíduos de aminoácidos no fator de coagulação e/ou na região Fc.

[00272] A PEGuilação de uma proteína pode referir-se a um conjugado formado entre a proteína e ao menos uma molécula de polietileno glicol (PEG). O PEG está comercialmente disponível em uma grande variedade de pesos moleculares e faixas de pesos moleculares médios. Exemplos típicos de faixas de peso molecular médio de PEG incluem, mas não estão limitados a aproximadamente 200, aproximadamente 300, aproximadamente 400, aproximadamente 600, aproximadamente 1000, aproximadamente 1300 a 1600, aproximadamente 1450, aproximadamente 2000, aproximadamente 3000,

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109/143 aproximadamente 3000 a 3750, aproximadamente 3350, aproximadamente 3000 a 7000, aproximadamente 3500 a 4500, aproximadamente 5000 a 7000, aproximadamente 7000 a 9000, aproximadamente 8000, aproximadamente 10000, aproximadamente 8500 a 11500, aproximadamente 16000 a 24000, aproximadamente 35000, aproximadamente 40000, aproximadamente 60000 e aproximadamente 80000 Daltons. Estes pesos moleculares médios são fornecidos meramente como exemplos e não são destinados a ser limitantes de qualquer forma.

[00273] Uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente descrição pode ser PEGuilada para incluir porções de mono- ou poli(por exemplo, 2-4) PEG. A PEGuilação pode ser realizada por qualquer das reações de PEGuilação conhecidas na técnica. Os métodos para a preparação de um produto de proteína PEGuilada incluirão geralmente (i) reagir um polipeptídeo com polietileno glicol (tal como um éster reativo ou um derivado aldeído de PEG) sob condições em que o peptídeo da invenção se liga a um ou mais grupos PEG; e (ii) obter o(s) produto(s) da reação. Em geral, as condições de reação ótimas para as reações serão determinadas caso a caso com base nos parâmetros conhecidos e no resultado desejado.

[00274] Existem vários métodos de ligação a PEG disponíveis para os versados na técnica, por exemplo, Malik F e outros, Exp. Hematol 20: 1028-35 (1992); Francis, Focus on Growth Fators 3 (2): 4 a 10 (1992); Patentes Européias Nos. EP0401384, EP0154316 e EP0401384; e Publicações de Pedido de Patente Internacional Nos. WO 92/16221 e WO 95/34326. Como um exemplo não limitante, as variantes de FVIII podem conter substituições de cisteina, e as cisteínas podem ser ainda conjugadas com o polímero de PEG. Ver Mei e outros, Blood 116: 270 a 279 (2010) e Patente US. No. 7.632.921, que são aqui incorporadas por referência em sua

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110/143 totalidade.

II.B.9. HES [00275] Em certos aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente descrição compreende ao menos um polímero de hidroxietil amido (HES). O HES é um derivado de amilopectina de ocorrência natural e é degradado pela alfa-amilase no corpo. O HES exibe propriedades biológicas vantajosas e é usado como um agente de reposição do volume sanguíneo e na terapia de hemodiluição nas clínicas. Ver, por exemplo, Sommermeyer e outros, Krankenhauspharmazie 8: 271 a 278 (1987); e Weidler e outros, Arzneim-Forschung/ Drug Res. 41: 494 a 498 (1991).

[00276] O HES é caracterizado principalmente pela distribuição do peso molecular e pelo grau de substituição. O HES tem um peso molecular médio (peso médio) de 1 a 300 kD, de 2 a 200 kD, de 3 a 100 kD ou de 4 a 70 kD. O hidroxietil amido pode ainda exibir um grau de substituição molar de 0,1 a 3, de 0,1 a 2, de 0,1 a 0,9, ou de 0,1 a 0,8, e uma relação entre a substituição C2:C6 na faixa de 2 a 20 com relação a grupos hidroxietila. O HES com um peso molecular médio de aproximadamente 130 kD é VOLUVEN® de Fresenius. VOLUVEN® é um coloide artificial, utilizado, por exemplo, para substituição de volume utilizado na indicação terapêutica para terapia e profilaxia de hipovolemia. Existem vários métodos de ligação de HES disponíveis para os versados na técnica, por exemplo, os mesmos métodos de ligação de PEG descritos acima.

II.B.10. PSA [00277] Em certos aspectos, uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente descrição compreende ao menos um polímero de ácido polissiálico (PSA). Os PSAs são polímeros não ramificados de ocorrência natural de ácido siálico produzidos por certas cepas bacterianas e em mamíferos em certas células. Ver, por exemplo, Roth

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J. e outros (1993) em Polysialic Acid: From Microbes to Man, eds. Roth J., Rutishauser U., Troy F.A. (BirkhãuserVerlag, Basiléia, Suíça), págs. 335 a 348. Os PSAs podem ser produzidos em vários graus de polimerização de η = aproximadamente 80 ou mais resíduos de ácido siálico até n = 2 por hidrólise ácida limitada ou por digestão com neuraminidases, ou por fracionamento das formas naturais derivadas de bactérias do polímero. Existem vários métodos de ligação de PSA disponíveis para os versados na técnica, por exemplo, os mesmos métodos de ligação de PEG descritos acima. Em certos aspectos, um PSA ativado pode também ser ligado a um resíduo de aminoácido cisteína dentro do fator de coagulação, por exemplo, em FVIII ou FIX, ou dentro da região Fc. Ver, por exemplo, Patente US. 5846951. II.B.11. Receptores de Depuração [00278] Em certos aspectos, a meia-vida de uma proteína quimérica utilizada nos métodos da presente descrição pode ser estendida, onde o fator de coagulação da proteína quimérica compreende FVIII e ao menos um fragmento de um receptor de depuração de FVIII ou fragmento de ligação a FVIII, variante ou derivado do mesmo. A inserção de formas solúveis de receptores de depuração, tais como o receptor de proteína relacionado com lipoproteína de baixa densidade LRP1, ou seus fragmentos, pode bloquear a ligação de FVIII a receptores de depuração e, deste modo, estender a sua meia-vida, por exemplo, meia-vida in vivo. A LRP1 é uma proteína de membrana integral de 600 kDa que está implicada na depuração mediada pelo receptor de uma variedade de proteínas, incluindo o FVIII. Ver, por exemplo, Lenting e outros, Haemophilia 16: 6 a 16 (2010). Outros receptores de depuração de FVIII adequados são, por exemplo, LDLR (receptor de lipoproteína de baixa densidade), VLDLR (receptor de lipoproteína de densidade muito baixa) e megalina (LRP-2), ou seus fragmentos. Ver, por exemplo, Bovenschen e outros, Blood 106: 906 a

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912 (2005); Bovenschen, Blood 116: 5439 a 5440 (2010): Martinelli e outrosf Blood 116: 5688 a 5697 (2010).

III. Polinucleotídeos, Vetores e Células Hospedeiras [00279] Em alguns aspectos, a presente descrição fornece um método de tratamento de artropatia hemofílica reversível de uma articulação em um ser humano que tem hemofilia compreendendo administrar ao ser humano uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo ou um conjunto de polinucleotídeos codificando um fator de coagulação e/ou um região Fc, por exemplo, que codifica uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo ou o conjunto de polinucleotídeos está dentro de um vetor de expressão ou um conjunto de vetores de expressão. Em certas modalidades, o vetor de expressão ou o conjunto de vetores de expressão está dentro de uma ou mais células hospedeiras.

[00280] O polinucleotídeo codificando um fator de coagulação e/ou uma região Fc, por exemplo, codificando uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação e uma região Fc, utilizado nos métodos da presente descrição pode ser uma única sequência de nucleotídeos, duas sequências de nucleotídeos, três sequências de nucleotídeos, ou mais. Em uma modalidade, uma sequência de nucleotídeos única codifica uma proteína quimérica compreendendo um fator de coagulação (por exemplo, um polipeptídeo FVIII ou FIX) e uma região Fc. Em outra modalidade, o polinucleotídeo compreende duas sequências de nucleotídeos, a primeira sequência de nucleotídeos que codifica um fator de coagulação (por exemplo, um FVIII) e a segunda sequência de nucleotídeos que codifica uma região Fc. Em outra modalidade, o polinucleotídeo compreende duas sequências de nucleotídeos, a primeira sequência de nucleotídeos que codifica um fator de coagulação (por exemplo, um FVIII ou um FIX) e uma região

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Fc, e a segunda sequência de nucleotídeos que codifica uma segunda região Fc. Em certas modalidades, os domínios Fc codificados formam uma ligação covalente após expressão.

[00281] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é códonotimizado.

[00282] Como aqui utilizado, um vetor de expressão refere-se a qualquer construto de ácido nucleico que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução de uma sequência de codificação inserida ou, no caso de um vetor viral de RNA, os elementos necessários para replicação e tradução, quando introduzidos em uma célula hospedeira apropriada. Os vetores de expressão podem incluir plasmídeos, fagemídeos, vírus e seus derivados.

[00283] Uma sequência de controle da expressão gênica, tal como aqui utilizada, é qualquer sequência de nucleotídeos reguladora, tal como uma sequência promotora ou combinação promotor-potenciador, que facilita a transcrição e tradução eficientes do ácido nucleico codificante ao qual está operativamente ligado. A sequência de controle da expressão gênica pode, por exemplo, ser um promotor de mamífero ou viral, tal como um promotor constitutivo ou induzível. Os promotores constitutivos de mamífero incluem, mas não estão limitados aos promotores para os seguintes genes: hipoxantina fosforribosil transferase (HPRT), adenosina desaminase, piruvato quinase, promotor de beta-actina, e outros promotores constitutivos. Os promotores virais exemplificativos que funcionam constitutivamente em células eucarióticas incluem, por exemplo, promotores a partir do citomegalovírus (CMV), vírus símio (por exemplo, SV40), vírus do papiloma, adenovirus, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus do sarcoma de Rous, citomegalovírus, repetições terminais longas (LTR) do vírus da leucemia de Moloney, e outros retrovirus, e o promotor da timidina quinase do vírus herpes simplex. Outros promo

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114/143 tores constitutivos são conhecidos pelos versados na técnica. Os promotores úteis como sequências de expressão gênica da invenção também incluem promotores induzíveis. Os promotores induzíveis são expressos na presença de um agente indutor. Por exemplo, o promotor da metalotioneína é induzido para promover a transcrição e a tradução na presença de certos íons de metal. Outros promotores induzíveis são conhecidos pelos versados na técnica.

[00284] Para os propósitos da presente invenção, numerosos sistemas de vetores de expressão podem ser empregados. Estes vetores de expressão são tipicamente replicáveis nos organismos de hospedeiros ou como epissomas ou como parte integral do DNA cromossômico do hospedeiro. Os vetores de expressão podem incluir sequências de controle de expressão incluindo, mas não limitados a promotores (por exemplo, promotores naturalmente associados ou heterólogos), potenciadores, sequências sinal, sinais de splice, elementos potenciadores, e sequências de terminação de transcrição. De preferência, as sequências de controle de expressão são sistemas promotores eucarióticos em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas. Os vetores de expressão também podem utilizar elementos de DNA que são derivados de vírus de animais tais como vírus do papiloma bovino, vírus polioma, adenovirus, vírus vaccinia, baculovírus, retrovirus (RSV, MMTV ou MOMLV), citomegalovírus (CMV) ou vírus SV40. Outros envolvem o uso de sistemas policistrônicos com sítios internos de ligação ao ribossoma.

[00285] Comumente, os vetores de expressão contêm marcadores de seleção (por exemplo, resistência à ampicilina, resistência à higromicina, resistência à tetraciclina ou resistência à neomicina) para permitir a detecção dessas células transformadas com as sequências de DNA desejadas (ver, por exemplo, Itakura e outros, Patente US.

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No. 4.704.362). As células que integraram o DNA nos seus cromossomos podem ser selecionadas através da introdução de um ou mais marcadores que permitem a seleção de células hospedeiras transfectadas. O marcador pode fornecer prototrofia a um hospedeiro auxotrófico, resistência a biocidas (por exemplo, antibióticos) ou resistência a metais pesados tal como o cobre. O gene marcador selecionável pode ser ou diretamente ligado às sequências de DNA a serem expressas, ou introduzido na mesma célula por cotransformação.

[00286] Um exemplo de um vetor útil para a expressão otimizada das proteínas quiméricas utilizadas nos métodos da presente descrição é NEOSPLA (Patente US. No. 6.159.730). Este vetor contém o promotor/potenciador de citomegalovírus, o principal promotor da beta globina de camundongo, a origem de replicação de SV40, a sequência de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino, éxon 1 e éxon 2 da neomicina fosfotransferase, o gene da di-hidrofolato redutase e sequência líder. Verificou-se que este vetor resulta em um nível muito elevado de expressão de anticorpos após a incorporação de genes da região variável e constante, transfecção em células, seguida de seleção em meio contendo G418 e amplificação de metotrexato. Os sistemas de vetor são também descritos nas Patentes US. Nos. 5.736.137 e 5.658.570, cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Este sistema fornece níveis elevados de expressão, por exemplo, > 30 pg/célula/dia. Outros sistemas de vetor exemplificativos são descritos, por exemplo, na Patente US. No. 6.413.777.

[00287] Em outras modalidades, os polipeptídeos da presente invenção são expressos usando construtos policistrônicos. Nestes sistemas de expressão, múltiplos produtos gênicos de interesse, tais como múltiplos polipeptídeos de proteína de ligação a multímeros,

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116/143 podem ser produzidos a partir de um único construto policistrônico. Estes sistemas utilizam vantajosamente um sítio interno de entrada no ribossoma (IRES) para fornecer níveis relativamente elevados de polipeptídeos em células hospedeiras eucarióticas. Sequências IRES compatíveis são descritas na Patente US No. 6.193.980 que também é aqui incorporada.

[00288] Mais geralmente, uma vez que o vetor ou sequência de DNA que codifica um polipeptídeo foi preparado, o vetor de expressão pode ser introduzido em uma célula hospedeira apropriada. Ou seja, as células hospedeiras podem ser transformadas. A introdução do plasmídeo na célula hospedeira pode ser realizada por várias técnicas bem conhecidas dos versados na técnica, como discutido acima. As células transformadas são cultivadas sob condições apropriadas para a produção da proteína quimérica, e ensaiadas para a síntese de proteína quimérica. As técnicas de ensaio exemplificativas incluem o ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), ou análise de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), imuno-histoquímica e similares.

[00289] Tendo agora descrito a presente invenção em detalhes, a mesma será mais claramente entendida por referência aos exemplos seguintes, os quais são aqui incluídos apenas para fins ilustrativos e não são destinados a serem limitantes da invenção.

EXEMPLO 1

Eficácia a longo prazo da profilaxia de rFVIIIFc em indivíduos pediátricos, adolescentes e adultos com articulações alvo e hemofilia A severa [00290] Para pessoas com hemofilia, o sangramento frequente na mesma articulação (uma articulação alvo) pode contribuir para a artropatia hemofílica (doença articular crônica). O rFVIIIFc foi desenvolvido para estender a meia-vida do fator VIII (FVIII) em comparação

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117/143 com os produtos convencionais de FVIII (Peters e outros, J. Thromb. Haemost. 11 (1): 132-41 (2013)). O ensaio clínico completo de fase 3 de rFVIIIFc (Identificador ClinicalTrials.gov: NCT01181128; Mahlangu, e outros, Blood 123 (3): 317-25 (2014)) e o ensaio pivotal fase 3 de rFVIIIFc de crianças (NCT01458106; Young e outros, J. Thromb Haemost. 13 (6): 967-77 (2015)) estabeleceram a segurança e a eficácia de rFVIIIFc entre adultos/adolescentes (pacientes com 12 anos de idade ou mais) e crianças (pacientes com menos de 12 anos de idade) com hemofilia A severa, respectivamente. A segurança a longo prazo e a eficácia do rFVIIIFc estão sendo avaliadas no estudo de extensão de rFVIIIFc em curso (NCT01454739; Nolan e outros, Haemophilia 22 (1): 72 a 80 (2016)).

[00291] O objetivo deste estudo é relatar dados cumulativos sobre a eficácia durável de rFVIIIFc e QOL em indivíduos com articulações alvo na entrada do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc e ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc de crianças, a partir do segundo estudo de extensão de rFVIIIFc intermediário ao corte de dados (8 de dezembro de 2014).

Métodos [00292] Indivíduos com > 1 de articulação alvo (articulação principal com > 3 episódios de hemorragia em um período de 6 meses (ver World Federation of Hemophilia, Guidelines for the Management of Hemophilia, 2^a ed., Blackwell Publishing: Montréal, Canadá (2012)) na entrada no estudo parental (ou seja, ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc ou ensaio pivotal de fase 3 com rFVIIIFc de crianças) que apresentavam dados pré-estudo (isto é, estudo pré-parental) e em estudo (específico da articulação alvo e geral). Existem 4 grupos de tratamento no estudo de extensão de rFVIIIFc (Tabela 1).

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TABELA 1: Regimes de tratamento do estudo de extensão de rFVIIIFc

Regime de Tratamento	Guia de Dosagem por Protocolo
Profilaxia individualizada	25-65 IU/kg de rFVIIIFc a cada 3 a 5 dias rFVIIIFc OR duas vezes por semana (20 a 65 IU/kg no Dia 1, 40 a 65 IU/kg no Dia 4); indivíduos pediátricos são permitidos ajustes na dose e frequência (a cada 2 a 5 dias).
Profilaxia semanal	65 IU/kg de rFVIIIFc a cada Ί dias.
Profilaxia modificada	Os investigadores personalizariam a dosagem para indivíduos em quem a profilaxia ótima não podería ser alcançada com a profilaxia individualizada ou semanal.
Tratamento episódico	Dosagem de rFVIIIFc baseada no tipo e na severidade do episódio de hemorragia.

[00293] Os indivíduos com idade > 12 anos de idade poderíam participar de qualquer regime de tratamento no estudo de extensão de rFVIIIFc, enquanto os indivíduos com idade < 12 anos de idade poderíam participar apenas dos regimes de tratamento de profilaxia individualizada e profilaxia modificada.

[00294] Os resultados para indivíduos com articulações alvo foram analisados post hoc ao longo da duração cumulativa do estudo parental através do corte de dados intermediários ao segundo estudo de extensão de rFVIIIFc. Os resultados incluíram ABRs, número e resolução de episódios de hemorragia da articulação alvo, e dose profilática e frequência de dosagem. A análise da resolução da articulação alvo foi realizada para indivíduos que tinham > 12 meses de tempo de acompanhamento consecutivo e que não tinham sido submetidos à cirurgia de grande porte (ou seja, substituição ou remoção) na articulação alvo desde o início do período de acompanhamento. Uma articulação alvo foi considerada clinicamente resolvida se houvesse < 2 episódios hemorrágicos espontâneos na articulação alvo durante um período consecutivo de 12 meses (Blanchette e outros, J Thromb Haemost. 12 (11): 1935-39 (2014)).

[00295] As medidas de QV foram avaliadas pelo índice Haem-AQOL em indivíduos com profilaxia que tinham > 17 anos de idade, tinham > 1 de articulação alvo resolvida durante o estudo, e tinham escores de Haem-A-QOL na linha de base do ensaio pivotal de fase 3

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119/143 de rFVIIIFc e estudo de extensão de rFVIIIFc Ano 2. Dentre os indivíduos do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc de crianças, QOL foi medido pela Canadian Hemophilia Outcomes - Kids Life Assessment Tool (CHO-KLAT).

Resultados

População de Estudo [00296] Dos 113 indivíduos do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc que tinham articulações alvo na linha de base, 111 indivíduos com regimes profiláticos pré-estudo ou episódicos e dados em estudo tinham 287 articulações alvo na linha de base (idade mediana, 31,0 anos; intervalo interquartil (IQR)) 24,0 a 44,0 anos, Tabela 2). Treze indivíduos do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc de crianças tinham 15 articulações alvo na linha de base e tinham dados pré-estudo e em estudo (idade mediana, 6,0 anos; IQR, 5,0 a 8,0 anos; Tabela 2).

TABELA 2: Características demográficas e de linha de base

	Estudo Parental
Característica	Ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc n = 111	Ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc de crianças n = 13
Idade mediana (IQR), anos	31,0(24,0-44,0)	6,0 (5,0-8,0)
Regime pré-estudo
Episódico	65 (58,6)	3(23,1)
Profilaxia	46 (41,4)	10(76,9)
Número total de articulações alvo, n	287	15
Número de articulações alvo, n (%)b
1	42 (37,8)	11 (84,6)
2	27 (24,3)	2(15,4)
3	7(6,3)	0
>3	35 (31,5)c	0
Localização da articulação alvo, n (%)
Cotovelo	69 (62,2)	4 (30,8)
Tornozelo	65 (58,6)	9 (69,2)
Joelho	48 (43,2)	1 (7,7)
Ombro	14(12,6)	0
Pulso	6 (5,4)	0
Quadril	5 (4,5)	0

IQR - intervalo interquartil. ^a Inclui indivíduos com > 1 articulação alvo na entrada no estudo parental e com um período de eficácia. Uma articulação alvo é definida como uma articulação principal (por exemplo, cotovelo, tornozelo, joelho, ombro, pulso e quadril) na qual

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120/143 ocorreu repetidas hemorragias (frequência > 3 episódios de hemorragia na mesma articulação em um período consecutivo de 6 meses).^b As porcentagens podem não totalizar 100,0% devido a arredondamentos. ^c A média de idade dos indivíduos foi de 39,9 anos.

Taxas de Hemorragia [00297] As ABRs globais em estudo (IQR) mediana com profilaxia de rFVIIIFc foram inferiores às taxas de hemorragia com a profilaxia pré-estudo para adultos/adolescentes e crianças, com 12 anos ou menos (Figura 1A-1D). Os ensaios pivotais de fase 3 de rFVIIIFc de crianças foram ainda estratificados pela idade dos pacientes, e ABRs pré-estudo intermediários e ABRs em estudo são mostrados nas Figura 1E e 1F. No pré-estudo, pacientes com menos de 6 anos de idade apresentaram uma ABR mediano menor (IQR) do que pacientes com idade entre 6 e < 12 anos (Figura 1E). Em estudo, os pacientes com menos de 6 anos de idade apresentaram um ABR em estudo global mais elevado, ABR global da articulação alvo, e ABR espontâneo da articulação alvo do que pacientes com idade entre 6 e < 12 anos (Figura 1F).

[00298] No ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc, 46,3% de profilaxia individualizada, 40,7% de profilaxia semanal, e 21,4% de indivíduos com profilaxia modificada não tiveram episódios de hemorragia de articulação alvo, enquanto 53,8% de indivíduos com profilaxia individualizada no ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc de crianças não teve episódios de hemorragia da articulação alvo.

Resolução Clínica da Articulação Alvo [00299] Dentre os indivíduos em profilaxia que tinham articulações alvo na linha de base e 12 meses de acompanhamento, 100% (93/93) do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc e 100% (7/7) dos ensaios pivotais de fase 3 de rFVIIIFc de crianças teve > 1 articulação alvo resolvida (ou seja, < 2 episódios de hemorragia espontânea durante 12

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121/143 meses consecutivos); e 98,3% (231/235) e 100% (9/9) das articulações alvo (com base em todas as hemorragias) no ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc e os indivíduos do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc de crianças foram resolvidos, respectivamente.

Consumo de Fator Profilático [00300] O consumo semanal de fator profilático mediano (IQR) entre o ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc (n = 105) e o ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc de crianças (n = 13) com articulações alvo foi de 76,0 (68,0 a 90,9) IU/kg e 83,5 (79,9 a 111,6) IU/kg, respectivamente.

[00301] O consumo foi similar aos indivíduos nos estudos parentais que estavam em profilaxia antes do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIHFc/ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc de crianças e durante o ensaio pivotal de fase 3 de rFVIHFc/ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc de crianças e o estudo de extensão de rFVIIIFc e dispunham de dados de dosagem disponíveis pré-estudo e em estudo (ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc, n = 79, 75,0 [70,0 a 113,8] IU/kg; ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc de crianças, n = 54, 95,0 [75,0 a 113,0] IU/kg).

[00302] Para ambas as populações de doentes, os intervalos de dosagem medianos (IQR) foram também similares entre os indivíduos com profilaxia com articulações alvo na linha de base (ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc, n = 105, 3,8 [3,5 a 5,6] dias; ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc de crianças, n = 13, 3,5 [3,5 a 3,5] dias) e indivíduos com profilaxia no estudo parental que dispunham de dados de dosagem disponíveis pré-estudo e em estudo (ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc, n = 79, 3,5 [3,0 a 5,0] dias; ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc de crianças, n = 54, 3,5 [3,5 a 3,5] dias).

[00303] Os dados do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc de crianças foram ainda estratificados pela idade do paciente. O consumo semanal médio em pacientes com menos de 6 anos foi de 89,6 (75,3 a

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97,5; η = 6) IU/kg em um intervalo de dosagem de 3,5 (3,5 a 3,5) dias. Para pacientes com idade entre 6 e menos de 12 anos de idade, o consumo médio semanal foi de 82,2 (79,4 a 113,2) IU/kg em um intervalo de dosagem de 3,5 (3,0 a 3,6) dias.

Qualidade de Vida [00304] A QV melhorou em 18% no estudo de extensão de rFVIIIFc Ano 2 entre adultos/adolescentes (n = 48) em comparação com a linha de base do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc (Tabela 3). Entre o ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc de crianças, os indivíduos que auto-relataram escores CHO-KLAT na linha de base do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc de crianças e estudo de extensão de rFVIIIFc Ano 1 (n = 6), o escore de linha de base médio (desvio padrão [SD]) foi

85,5 (12,1); no estudo de extensão de rFVIIIFc Ano 1, os escores CHO-KLAT melhoraram em 28% (melhora média [SD] de 24,1 [15,3]).

TABELA 3: Análise Haem-A-QOL em indivíduos com articulações alvo na linha de base

	Escore médio (SD)a na linha de base de ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc N= 30-48c	Escore médio (SD)a no estudo de extensão de rFVIIIFc Mês 24 N= 30-48c	Alteração média (SD)	Valor pb
Total	30,3(15,7)	24,9 (15,7)	-5,4 (10,8)	0,001
Esportes & Lazer	51,5 (26,9)	40,8 (27,6)	-10,7 (21,7)	0,008
Saúde física	42,7 (21,7)	32,1 (27,8)	-10,6 (19,8)	0,0005
Lida com a hemofilia	17,0 (13,6)	15,3 (15,9)	-1,7 (17,5)	NS
Planejamento familiar	15,5 (19,8)	11,5 (18,3)	-4,0 (16,3)	NS
Sentimento (em direção à hemofilia)	23,0 (21,8)	15,4 (19,2)	-7,7 (16,0)	0,002
Futuro	38,9 (20,9)	33,8 (23,1)	-5,1 (15,4)	0,03
Relacionamento & sexualidade	12,6 (20,2)	12,2 (21,4)	-0,4 (20,6)	NS
Tratamento	28,3 (16,6)	23,3 (14,1)	-5,0 (15,7)	0,03
Visão (de si mesmo)	34,2 (22,7)	32,1 (21,1)	-2,1 (16,8)	NS
Trabalho & Escola	19,6 (20,0)	13,7 (19,1)	-6,0 (12,1)	0,002

NS, não significativo ^a Os escores Haem-A-QOL variam de 0 a 100, com maiores escores representando um maior comprometimento em QOL para cada subescore e o escore total.

^b Baseado no teste t pareado de 2 caudas.

^c 48 pacientes foram avaliados para todos os resultados, exceto esportes & lazer (n = 33), planejamento familiar (n = 30), relacionamento e sexualidade (n = 45) e trabalho & escola (n = 44).

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Conclusões [00305] Os dados de eficácia do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc e ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc de crianças e o estudo de extensão de rFVIIIFc em curso revelaram baixas taxas de hemorragia anualizadas alvo (ABRs) e resolução da articulação alvo eficaz em indivíduos pediátricos, adolescentes e adultos com hemofilia A severa em profilaxia a longo prazo com rFVIIIFc. O consumo semanal de fator profilático nesta análise de indivíduos com articulações alvo na linha de base foi consistente com o das populações globais do estudo pivotal de fase 3 de rFVIIIFc publicado anteriormente, e do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc de crianças. A melhora na qualidade de vida (QOL) foi observada em indivíduos com resolução de articulação alvo com profilaxia de rFVIIIFc sem alterações no consumo de fator profilático ou intervalo de dosagem.

EXEMPLO 2

Resultados dos Escores de Saúde Articular em Hemofilia Modificados Longitudinais (mHJHS) com Profilaxia da Proteína de Fusão de Fator VIII Fc Recombinante (rFVIIIFc) em Indivíduos com Hemofilia A Severa [00306] A artropatia hemofílica permanece um desafio no gerenciamento da hemofilia (Knobe e outros, J Comorbidity. 2011; 1 (1): 51 a 59; Simpson e outros, Expert Rev Hematol. 2012; 5 (4): 459-68). O Escore de Saúde Articular na Hemofilia (HJHS) é uma ferramenta de primeira linha que pode ser usada para detectar o desenvolvimento de artropatia hemofílica (Oymak e outros, J Pediatr Hematol Oncol. 2015; 37 (2): e80-5). A melhora nos resultados músculo-esqueléticos é uma medida importante da eficácia do tratamento profilático para a hemofilia A (Blanchette e outros, Haemophilia. 2004; 10 (Suplemento S4): 97 a 104). A segurança a longo prazo e a eficácia de rFVIIIFc entre adultos/adolescentes e crianças que completaram o ensaio pivotal de

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124/143 fase 3 de rFVIIIFc (Mahlangu e outros Blood. 2014; 123 (3): 317 a 325) e estudos pivotais de fase 3 de rFVIIIFc de crianças (Young e outros J Thromb Haemost. 2015; 13 (6): 967 a 977), respectivamente, foram estabelecidos usando dados provisórios a partir do estudo de extensão de rFVIIIFc em curso (Nolan e outros Haemophilia. 2016; 22 (1): 72 a 80). Determinar o impacto a longo prazo de rFVIIIFc nos resultados músculo-esqueléticos exigirá mais estudos.

[00307] O objetivo deste estudo é relatar dados de saúde articular longitudinal a partir do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc e estudo de extensão de rFVIIIFc usando os Escores de Saúde Articular na Hemofilia modificados (mHJHS).

Participantes do Estudo e Projeto [00308] A população de análise incluiu adultos/adolescentes (> 12 anos) que completaram o ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc e participaram do estudo de extensão de rFVIIIFc durante 2 anos. Os pacientes podem ter estado em profilaxia pré-estudo ou tratamento episódico. A saúde articular foi avaliada utilizando o mHJHS no ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc (após alteração do protocolo) e na linha de base, e depois anualmente após o estudo de extensão de rFVIIIFc.

[00309] O mHJHS difere do HJHS padrão, versão 2.1, pelo fato de que as opções de resposta para dor nas articulações e marcha articular foram condensadas em menos categorias, uma avaliação para instabilidade foi adicionada, e o escore total é menor (intervalo, 0 a 116; 0 indica função articular normal, 116 indica doença severa) em comparação com o padrão HJHS (intervalo, 0 a 124) (ver Tabela 4). Os escores precedidos por uma hemorragia dentro de 2 semanas foram excluídos. Os escores para articulações que foram submetidas à intervenção cirúrgica foram inseridos usando a última observação transportada. Para avaliar a alteração ano a ano, indivíduos do estudo de extensão de rFVIIIFc que tinham dados mHJHS em 4 pontos no

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125/143 tempo (linha de base de ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc, linha de base de estudo de extensão de rFVIIIFc, estudo de extensão de rFVIIIFc Ano 1, e estudo de extensão de rFVIIIFc Ano 2) foram incluídos nesta análise post hoc. A alteração no escore mHJHS a partir da linha de base do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc para o estudo de extensão de rFVIIIFc Ano 2 (valor negativo indica melhora) foi resumida utilizando a estatística descritiva. A alteração no escore mHJHS a partir da linha de base do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc para as visitas de acompanhamento foi resumida para: (1) escore total (intervalo, 0 a 116; pelo regime pré-estudo (profilático versus episódico): pela severidade do comprometimento funcional com base em mHJHS inicial; e pela presença de articulações alvo na linha de base, (2) articulações alvo (intervalo, 0 a 19: soma de todas as questões para uma única articulação alvo), (3) articulações de sustentação de peso (por exemplo, tornozelo e joelho) e articulações de não sustentação de peso (por exemplo, cotovelo) (intervalo, 0 a 38: soma das articulações direita e esquerda de uma única localização) e (4) componentes individuais (amplitude de movimento (intervalo, 0 a 36: combinação de questões perda de extensão [flexão dorsal dos tornozelos] e Perda de flexão [flexão plantar dos tornozelos] de todas as articulações), inchaço (intervalo, 0 a 24: combinação de questões Inchaço e Duração do inchaço de todas as articulações): e força (intervalo, 0 a 6: soma de todas as articulações)).

TABELA 4 - Diferenças entre HJHS e mHJHS

HJHS	mHJHS
Crepitação de movimento (Escore 0-2)	Crepitação de movimento (Escore 0 ou 1)
Dor na articulação (Escore 0-2)	Dor na articulação (Escore 0 ou 1)
Marcha global (Escore 0-4)	Marcha global (Escore descritivo)
-	Instabilidade (Escore 0 ou 1)
Escore total (0 a 124)	Escore total (0 a 116a)

^a 0 = função articular normal; 116 = doença severa

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126/143 [00310] As diferenças entre a linha de base do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc e o estudo de extensão de rFVIIIFc Ano 2 foram analisadas utilizando um teste t pareado. Os valores de P não foram utilizados para inferir significância estatística, porque esta análise foi ad hoc. Para análises de subgrupos, apenas estatísticas descritivas são fornecidas.

Resultados

Características de Linha de Base [00311] As características de linha de base foram similares entre a população de completadores incluídos nesta análise (n = 47) e a população de pacientes para quem o mHHS foi coletado na linha de base do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc e que se inscreveram no estudo de extensão de rFVIIIFc (n = 74) (Tabela 5).

TABELA 5: Características da linha de base

	Linha de base de ensaio pivotal de Fase 3 de rFVIIIFc e Arrolados no Estudo de extensão de FVIIIFc n=74a	Completador do Ensaio pivotal de Fase 3 de rFVIIIFc e Estudo de extensão de rFVIIIFc Ano 2 b n = 47
Idade média (SD), anos	31,6 (11,9)	32,3 (12,8)
Peso médio (SD) na entrada do estudo parental, kg	72,7 (15,1)	73,5 (15,7)
2 IMC médio (SD), kg/m	23,8 (4,3)	24,0 (4,1)
Escore mHJHS médio (SD) de linha de base	22,1 (18,0)	23,4 (18,3)
Articulações alvo, %	55,4	51,1
Tratamento pré-estudo, %	68,9	63,8
Profilaxia Sob demanda	31,1	36,2
ABR pré-estudo médio (SD)	15,8 (20,0)	16,5 (18,4)

^a 74 indivíduos em profilaxia com rFVIIIFc inscritos no ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc, com escores mHJHS, e subsequentemente entraram no estudo de extensão de rFVIIIFc.^b 47 pacientes em profilaxia atingiram o ano 2 no estudo de extensão de rFVIIIFc com dados disponíveis na linha de base do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc, linha de base do estudo de extensão de rFVIIIFc, e Anos 1 e 2.

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Saúde Articular Longitudinal [00312] A melhora contínua foi observada no escore mHJHS a partir da linha de base do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc através do estudo de extensão de rFVIIIFc Ano 2, com uma diminuição média no escore total de 23,4 para 19,3 (Figura 2A). Dos setenta e quatro indivíduos, vinte e quatro foram avaliados no estudo de extensão Ano 3, e essas melhoras nos escores do mHHS foram observadas no estudo de extensão Ano 3, independentemente da presença de articulações alvo na linha de base do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc (Figura 2B). A duração média de acompanhamento foi de 2,8 (2,5 a 3,3) anos. Melhora contínua foi observada independentemente do tratamento pré-estudo do paciente (Figura 3) ou da presença de articulações alvo na linha de base do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc (Figura 4). Nos pacientes avaliados no estudo de extensão Ano 3, a o escore total de mHJHS médio para adultos/adolescentes com dados em todos os pontos no tempo foi de 25,0 (erro padrão da média [SEM], 2,9) na linha de base. A alteração média (SEM) a partir da linha de base foi de -2,0 (1,2) na linha de base do estudo de extensão, -3,8 (1,5) no estudo de extensão Ano 1, -4,5 (1,6) no estudo de extensão Ano 2, e -5,1 (1,5) no estudo de extensão Ano 3 (Figura 3B). A alteração a partir da linha de base para o estudo de extensão Ano 3 foi estatisticamente significativa (P < 0,002). A população de análise do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc de crianças (n = 24) também mostrou uma melhora média estatisticamente significativa (SEM) desde a linha de base até o estudo de extensão Ano 2 (-1,2 [0,56]; P < 0,05) (Figura 3C). Indivíduos com o quartil mais alto de comprometimento nos escores mHJHS na linha de base do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc mostraram a maior melhora no escore total de mHJHS desde a linha de base até o estudo de extensão de rFVIIIFc Ano 2 (Figura 5). A melhora contínua nos escores de

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128/143 articulação alvo mHJHS foi observada a partir da linha de base do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc ao estudo de extensão de rFVIIIFc Ano 2, com uma melhora de uma média de 7,0 na linha de base para uma média de 5,3 no estudo de extensão de rFVIIIFc ano 2 (Figura 6). Os escores de articulação mHJHS para articulações de sustentação de peso diminuíram de uma média de 8,0 para uma média de 6,8 e para articulações sem sustentação de carga de uma média de 6,7 para uma média de 4,8 a partir da linha de base de ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc para o estudo de extensão de rFVIIIFc Ano 2 (Figura 7). Para o cálculo do escore de articulações de sustentação de peso (tornozelo e joelho) e de articulações sem sustentação de carga (cotovelo), um escore foi derivado primeiro como a soma dos escores por articulação de um par de articulações direita e esquerda (tornozelo, joelho ou cotovelo). Em seguida, o escore da articulação de sustentação de peso foi calculado como a média dos escores para tornozelo e joelho, e o escore das articulações sem sustentação de carga foi igual ao escore para o cotovelo. Além disso, melhoras específicas no inchaço, amplitude de movimento e força também foram observadas a partir da linha de base do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc até o estudo de extensão de rFVIIIFc Ano 2, que representou os fatores contribuintes mais significativos para alterar o escore total de mHJHS (Figura 8).

[00313] As melhoras médias estatisticamente significativas a partir da linha de base do ensaio pivotal de fase 3 de rFVIIIFc foram observadas para articulações de sustentação de peso e articulações sem sustentação de peso (-1,1 [SEM, 0,5; P = 0,036] e -3,0 [SEM, 0,8; P = 0,001], respectivamente) no ano 3. Os componentes individuais do mHJHS que apresentaram redução de > 20% a partir da linha de base ao ano 3 foram inchaço (-47%), atrofia muscular (-26%), crepitação (20%) (P < 0,05 para todos os 3 componentes) e instabilidade articular

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129/143 (-89%), dor nas articulações (-31%) e força (-26%) (Figura 9). EXEMPLO 3

Resultados de Articulações Alvo com Profilaxia com rFIXFc em Adultos e Adolescentes com Hemofilia B [00314] Em pacientes com hemofilia B severa, a hemorragia repetida nas articulações sem tratamento suficiente pode levar à doença articular crônica incapacitante, dor e redução da qualidade de vida (Djambas Khayat, J Blood Med. 7: 275-82 (2016)). O tratamento profilático com proteína de fusão Fc de fator IX recombinante (rFIXFc) resultou em menores taxas de hemorragia anualizadas (ABRs) e menos eventos hemorrágicos espontâneos/traumáticos em adolescentes e adultos com hemofilia B severa (Kavakli e outros, Haemophilia 22 (3): 381- 88 (2016); Powell e outros, Engl J Med. 369 (24): 2313-23 (2013); Powell e outros, Br J Haematol. 168 (1): 124-34 (2015); Powell e cols. Br J Haematol 168 (1): 113-23 2015)). Além da prevenção do dano articular e da redução dos eventos hemorrágicos, o tratamento profilático tanto com rFIX convencional quanto com rFIX de ação prolongada pode resultar em menos tempo fora do trabalho ou da escola, menos internações hospitalares, monitoramento menos frequente, e melhor qualidade de vida (Kavakli e outros, Haemophilia 22 (3): 381-88 (2016); Wyrwich e outros, Haemophilia 22 (6): 866-72 (2016)). O tratamento profilático iniciado precocemente reduz a hemorragia e evita danos nas articulações. Quando iniciado mais tarde, uma vez que o dano articular tenha ocorrido, o tratamento profilático ainda pode reduzir significativamente o número de hemorragias, incluindo hemorragias nas articulações (Fischer e outros, Haemophilia 20 (Suppl 4): 106-13 (2014)). Adultos/adolescentes com hemofilia B severa que completaram o ensaio pivotal de fase 3 de rFIXFc (NCT01027364) poderíam se inscrever no estudo de extensão a longo prazo (NCT01425723; Pasi e outros, Thromb Haemost. 117 (3): 508-18

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130/143 (2017)) que avaliou a segurança e a eficácia de rFIXFc. Resultados longitudinais de indivíduos com articulações alvo na entrada do ensaio pivotal de fase 3 de rFIXFc durante o estudo de extensão a longo prazo são relatados aqui.

[00315] O objetivo deste estudo é apresentar os principais resultados de dados longitudinais de ensaio pivotal de fase 3 de rFIXFc a partir de indivíduos com articulações alvo na entrada até o segundo corte de dados intermediários do estudo de extensão (11 de setembro de 2015).

Métodos

Concepção do estudo e população [00316] Indivíduos com hemofilia B severa (< 2 lU/dL de FIX endógeno) que completaram o ensaio pivotal de fase 3 de rFIXFc inscritos em 1 de 4 grupos de tratamento no estudo de extensão: (1) profilaxia semanal (WP; 20 a 100 IU/kg a cada 7 dias); (2) profilaxia de intervalo individualizado (IP; 100 IU/kg a cada 8 a 16 dias); (3) profilaxia modificada (MP; os investigadores poderíam personalizar a dosagem para indivíduos que não atingiram a dosagem ideal com IP ou WP); e (4) tratamento episódico (ET; dosagem sob demanda baseada no tipo e severidade dos episódios hemorrágicos). Os indivíduos poderíam mudar de grupo de tratamento na inscrição para o estudo de extensão e em qualquer momento durante o estudo. Os indivíduos que mudaram de grupo de tratamento foram incluídos nas análises de cada grupo de tratamento para o período gasto naquele regime de tratamento, de modo que indivíduos individuais pudessem ser contados em mais de um grupo de tratamento na análise. Foram avaliados indivíduos com > 1 articulação alvo (articulação principal com > 3 episódios de hemorragia em um período de 3 meses) no ensaio pivotal de fase 3.

Medidas de Resultados e Análises Estatísticas

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131/143 [00317] Os resultados foram analisados ao longo da duração cumulativa do ensaio pivotal de fase 3 de rFIXFc através do segundo corte de dados intermediário B-YOND (11 de setembro de 2015). Uma análise da resolução da articulação alvo foi realizada. A resolução da articulação alvo foi definida como < 2 hemorragias espontâneas na articulação alvo ao longo de um período consecutivo de 12 meses (Blanchette e outros, J Thromb Haemost. 12 (11): 1935-39 (2014)). Resultados [00318] As características de linha de base para indivíduos com articulações alvo são mostradas na Tabela 6. Dos 117 indivíduos que entraram no ensaio pivotal de fase 3 de rFIXFc com dados em estudo, sessenta tinham um total de 166 articulações alvo na linha de base. Estes indivíduos receberam rFIXFc para uma média cumulativa (intervalo interquartil [IQR]) com uma duração de 3,4 (1,4 a 4,2) anos.

Tabela 6: Características de linha de base

Característica	N = 60
Regime pré-estudo
Episódico	44 (73,3)
Profilaxia	16 (26,7)
Número de articulações alvo
1	20 (33,3)
2	13 (21,7)
3	7 (11,7)
> 3	20 (33,3)
Localização da articulação alvo
Joelho	42 (70,0)
Tornozelo	33 (55,0)
Cotovelo	28 (46,7)
Quadril	6 (10,0)
Ombro	3 (5,0)
Pulso	3 (5,0)

[00319] Todos os dados são n (%). rFIXFc, proteína de fusão Fc do fator IX recombinante. Inclui indivíduos com > 1 articulações alvo na entrada em B-LONG e com um período de eficácia (definido como a soma de todos os intervalos de tempo durante os quais os indivíduos foram tratados com rFIXFc de acordo com os regimes de tratamento

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132/143 do estudo, excluindo períodos de reabilitação cirúrgica); A articulação alvo é definida como uma articulação principal (por exemplo, joelho, tornozelo, cotovelo, quadril, ombro e punho) na qual ocorreu hemorragia repetida (frequência de > 3 episódios de sangramento na mesma articulação em um período de 3 meses consecutivos). Dosagem Profilática [00320] Dosagem semanal média e intervalo de dosagem resumidos na Tabela 7.

Tabela 7: Resumo da dosagem profilática média de rFIXFc e intervalo de dosagem

Grupo de Tratamento	WP (n = 40)	IP (n = 12)	MP (n = 12)
Dose semanal média, IU/kg	45,2 (37,3-55,8)	64,7 (46,7-82,3)	59,7(40,0-109,8)
Intervalo de dosagem, d	6,98 (6,9-7,0)	10,25 (8,9-13,2)	6,57 (4,9-6,9)

[00321] Todos os dados são medianos (IQR). IP, Profilaxia de intervalo individualizado; MP, profilaxia modificada; rFIXFc, proteína de fusão Fc de fator IX recombinante; WP, profilaxia semanal. Apenas os indivíduos com dose em estudo disponível e dados de intervalo de dosagem foram incluídos nesta análise. Os indivíduos são incluídos em cada regime de tratamento em que participaram durante o período de tempo nesse regime e, como tal, podem aparecer em mais do que um regime de tratamento.

Taxas de Hemorragia [00322] Os dados de hemorragia pré-estudo e em estudo são mostrados nas Figura 10A e 10B, respectivamente. Os indivíduos que receberam profilaxia com rFIXFc e que não tiveram uma re-hemorragia de articulação alvo em estudo foram os seguintes: WP: 15 de 40 (37,5%); IP: 1 de 12 (8,3%); MP: 4 de 12 (33,3%); ET: 0 de 14 (0%). Em indivíduos com articulações alvo na linha de base, ABRs geral em estudo de de articulação alvo com profilaxia com rFIXFc foram inferiores às taxas de hemorragia com tratamento pré-estudo (Figuras

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10Ae 10B).

Taxas de hemorragia anualizadas para vinte e dois indivíduos tratatos com um intervalo de dosagem > 14 dias, bem como dezesseis indivíduos que terminaram o tratamento em um intervalo de dosagem >14 dias são mostrados na Tabela 8.
ABR Geral	1,7 (0,6-4,2)	1,4 (0,6-2,0)
ABR Espontâneo	0,7 (0,3-1,3)	0,7 (0,3-1,0)
ABR de articulação	1,1 (0,3-2,7)	0,6 (0,2-1,5)
ABR espontâneo de articulação	0,3 (0,0-1,3)	0,3 (0,0-0,8)

Resolução de Articulação Alvo [00323] Em geral, 100% (93/93) das articulações alvo (em 37 indivíduos) foi resolvido, como indicado duas ou menos hemorragias espontâneas em um período de doze meses (Figura 11).

Conclusões [00324] Em adultos/adolescentes com hemofilia B severa, a profilaxia a longo prazo com rFIXFc resultou na resolução da articulação alvo em 100% dos indivíduos com articulações alvo avaliadas na linha de base e em baixas ABRs de articulação alvo em todos os grupos de tratamento. Os médicos devem considerar os resultados benéficos e significativamente melhorados a longo prazo para os pacientes com articulações alvo atingidas com rFIXFc ao projetar planos de profilaxia de tratamento.

EXEMPLO 4

Biodistribuição de FIX marcado com ¹²⁵l, FIX, e FIX GlicoPEGuilado em camundongos HemB por Tomografia de Emissão de Fóton Único (SPECT) in vivo [00325] Foi realizado um estudo em camundongos in vivo para avaliar a biodistribuição de proteínas FIX em múltiplos tempos pós-dosagem por Tomografia de Emissão de Fóton Único (SPECT) in vivo. As proteínas FIX foram marcadas em resíduos de lisina utilizando um ligante SIB marcado com ¹²⁵l. As proteínas FIX marcadas foram administradas a camundongos HemB com 7 a 12 semanas de idade por uma dose única terapeuticamente relevante. O ¹²⁵I-SIB-FIX foi admi

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134/143 nistrado como uma dose única de 1 mg/kg (η = 3); O ¹²⁵I-SIB-FIXFc foi administrado como uma dose única de 2 mg/kg (n = 3) e o ¹²⁵I-SIBFIX-PEG foi administrado como uma dose única de 1 mg/kg (n = 3).

[00326] A localização das proteínas FIX marcadas foi obtida a partir de 0,5 horas, 2,5 horas, 20 horas, 48 horas, 92 horas, 120 horas, 168 horas e/ou 216 horas (Figuras 10A-10C). A localização específica para áreas articulares (por exemplo, joelho direito/esquerdo e ombro direito/esquerdo), o coração (ventrículo esquerdo) e o fígado foi analisada utilizando a localização da região de interesse (ROI). As ROI do Ventrículo Esquerdo e do Fígado foram objetos de volume fixo, colocadas dentro do órgão correto. A ROI da articulação do joelho foi definida pela colocação de um cilindro ao redor do osso a partir de aproximadamente metade do fêmur até a metade da tíbia/fíbula. A ROI do ombro foi definida colocando uma esfera uniforme no centro do ombro e, em seguida, limitando o osso dentro dessa esfera, seguido por uma dilatação da ROI.

[00327] Descobriu-se que o FIXFc marcado se distribuiu para as áreas em torno das articulações aos 30 minutos (Figura 12D) e 2,5 horas (Figura 12E) pós-dosagem, que persistiu durante 48-216 horas pós-dosagem (Figura 12F-12G), representando a meia-vida e cinco vezes a meia-vida, respectivamente. A localização de FIXFc nos joelhos (Figura 13A) e nos ombros (Figura 13B) foi mais pronunciada do que a localização de FIX e GlicoPEG-FIX nas mesmas áreas articulares.

[00328] A marcação com ¹²⁵I-SIB não afetou a atividade de FIX das proteínas FIX marcadas (Figura 14A), nem a marcação afetou as propriedades farmacocinéticas das proteínas FIX, em comparação com as proteínas FIX não marcadas, após a administração a camundongos HemB (Figura 14B).

EXEMPLO 5

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Avaliação Articular de Linha de Base

Avaliação Articular de Linha de Base [00329] Seis articulações (tornozelo esquerdo-LA, tornozelo direitoRA, cotovelo esquerdo-LE, cotovelo direito-RE, joelho esquerdo-LK, joelho direito-RK) serão classificadas em uma escala de 0 a 19 de acordo com os seguintes critérios: inchaço, duração, atrofia muscular, crepitação, perda de flexão, perda de extensão, instabilidade, dor nas articulações e força. A marcha será classificada em uma escala de 0 a 2, com base na caminhada e na subida de escadas. O escore total será a soma dos escores de todas as 6 articulações mais o escore da marcha (variação de 0 a 116, com 0 sendo normal e 116 sendo a doença mais severa).

Visita de Triagem [00330] O cotovelo, joelho e tornozelo de cada lado do corpo serão avaliados quanto à doença articular na triagem. A função articular deve ser avaliada na ausência de um episódio ativo de hemorragia. Um escore articular de zero reflete um estado normal.

Detalhes do Escore [00331] 1. O escore articular será feito separadamente para as 6 articulações (LA, RA, LE, RE, LK, RK) de acordo com essas categorias e escalas (intervalo é 0 a 19 para cada articulação e 0 a 114 para todas as seis articulações): inchaço (0 = nenhum; 1 = leve; 2 = moderado; 3 = severo); duração do inchaço (0 = sem inchaço ou < 6 meses; 1 => 6 meses); atrofia muscular (0 = nenhuma; 1 = leve; 2 = severa); crepitação em movimento (0 = ausente; 1 = presente); perda de flexão, incluindo perda de flexão plantar dos tornozelos (0 = nenhuma; 1 = leve; 2 = moderada; 3 = severa); perda de extensão, incluindo perda de flexão dorsal dos tornozelos (0 = nenhuma; 1 = leve; 2 = moderada; 3 = severa); instabilidade (0 = nenhuma; 1 = frouxidão articular patológica significativa); dor nas articulações (0 =

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136/143 sem dor, seja na amplitude ou na amplitude de movimento; 1 = presente); força (0 = normal (mantém a posição contra a gravidade e resistência máxima); 1 = diminuição mínima (mantém a posição contra a gravidade e resistência moderada, mas não resistência máxima); 2 = diminuição leve (mantém a posição contra a gravidade ou resistência mínima); diminuição moderada (capaz de mover a articulação se a gravidade for eliminada); 4 = diminuição severa (traço ou ausência de contração muscular). Para o escore de perda de flexão e perda de extensão nos joelhos e cotovelos, o seguinte se aplica: nenhuma = aproximadamente 0 a 5 graus; aproximadamente 5 a 10 graus, moderada = aproximadamente 11 a 20 graus e severa = aproximadamente > 20 graus.

[00332] 2. A marcha será classificada uma vez (o intervalo é de 0 a

2), em que 0 = nenhuma dificuldade em caminhar ou subir/descer escadas; 1 = sem dificuldade para andar, mas dificuldade com escadas; e 2 = dificuldade em andar e com escadas.

[00333] Este escore de saúde articular na hemofilia modificado (HJHS) é baseado no sistema de escore usado em um estudo de confiabilidade de escore articular em meninos com hemofilia (Hilliard, Funk e outros, Haemophilia 12 (5): 518 a 525 (2006), que é aqui incorporado por referência em sua totalidade). Ele tem sido usado como uma ferramenta para avaliar os resultados músculo-esqueléticos em uma coorte de 20 meninos com idades entre 4 e 17 anos (Saulyte Trakymiene, Ingerslev e outros, Haemophilia 16 (3): 479 a 486 (2010), que é aqui incorporado por referência em sua totalidade). As modificações foram feitas para adaptar o sistema de escore a uma população adulta com hemofilia e de acordo com comentários em um recente estudo de validação pelo grupo internacional de estudo de profilaxia da hemofilia (Feldman, Funk e outros, 2010) que é incorporado aqui por referência em sua totalidade).

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EXEMPLO 6 [00334] A principal complicação da terapia de reposição com fator na hemofilia A é a formação de inibidores (anticorpos neutralizantes anti-fator VIII) em aproximadamente 30% dos pacientes com hemofilia

A. O desenvolvimento do inibidor afeta a eficácia do tratamento, bem como a qualidade de vida dos indivíduos afetados. O entendimento adicional de como o sistema imune responde ao fator III recombinante (rFVIII) é um esforço contínuo na pesquisa sobre hemofilia para efetivamente erradicar os inibidores. A meia-vida estendida da proteína de fusão rFVIII Fc (rFVIIIFc) é uma terapia eficaz e bem tolerada para prevenir e controlar episódios hemorrágicos. A região Fc desta molécula não é apenas responsável pelo aumento da meia-vida de rFVIII, mas pode promover tolerância específica ao antígeno, como mostrado em um modelo animal pré-clínico (Krishnamoorthy S, e outros, Cell Immunol. 301: 30 a 39 (2016)) e como sugerido pelos relatos de casos de indução de tolerância imune (Groomes CL, e outros, Pediatr Blood Cancer 63 (5): 922-24 (2016); Malec LM, e outros, Haemophilia 22 (6): e552-e554 (2016); Ragni MV, e outros, Haemophilia 22 (5): e462-e464 (2016)).

Métodos [00335] APCs humanas derivadas de sangue periférico ou células monocíticas THP-1 foram usadas para investigar os efeitos de rFVIIIFc na ligação de FcyR, internalização, sinalização e produção de citocinas, e alterações de expressão gênica, bem como interações e efeitos subsequentes em células T in vitro (Figura 16).

Resultados [00336] A diminuição da expressão da superfície celular de FcyR indica internalização após o tratamento com rFVIIIFc (Figuras 17A17C). Os macrófagos derivados de monócitos e células dendríticas foram tratados com complexos imunes de peroxidase de rábano (HRP

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IC) como controle positivo, imunoglobulina humana G1 (lgG1) como controle negativo, e com fator VIII recombinante (rFVIII) ou proteína de fusão rFVIII Fc (rFVIIIFc) em concentrações equimolares (200 nM) durante 24 horas. A expressão da superfície celular dos receptores Fcy (FcyR) CD16 (Figura 17A), CD32 (Figura 17B) e CD64 (Figura 17C) foi medida por citometria de fluxo (n = 3; ** P < 0,01, ** * P < 0,005, significância para HRP-IC para outros tratamentos não mostrados). O tratamento com rFVIIIFc correlacionou-se com a expressão da superfície celular diminuída de CD16 (Figura 17A), CD32 (Figura 17B) e CD64 (Figura 17C), em comparação com a expressão da superfície após tratamento com rFVIII.

[00337] O rFVIIIFc se liga a FcyR e induz a sinalização em monócitos e macrófagos, sem produção subsequente de citocinas próinflamatórias (Figuras 18A-18C). A linhagem celular monocítica THP-1, monócitos, macrófagos derivados de monócitos de sangue periférico e células dendríticas derivadas de monócitos de sangue periférico foram tratados com HRP-IC, lgG1, rFVIII ou rFVIIIFc durante 15 minutos (Figura 18A). A fosforilação de Syk foi medida em lisados celulares usando a plataforma MSD (n = 3 a 7, * P < 0,05). A fosforilação de Syk foi medida após tratamento de macrófagos com rFVIIIFc (WT), com rFVIIIFc mutante que é incapaz de se ligar ao receptor Fc neonatal (mutante FcRn), ou com rFVIIIFc mutante que é incapaz de se ligar a FcyR (mutante FcyR) (n = 4, * P < 0,05) (Figura 18B). A produção de citocina pró-inflamatória dos macrófagos tratados em 24 horas foi medida por MSD ELISA (n = 4, significância não mostrada) (Figura 18C).

[00338] O rFVIIIFc fosforila moléculas que participam da imunorregulação, em vez de moléculas que desempenham papel na ativação e na produção de citocinas pró-inflamatórias (Tabela 9 e Figura 19). As proteínas fosforiladas em lisados de macrófagos derivados de monó

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139/143 citos tratados com rFVIIIFc durante quinze minutos foram questionadas utilizando as matrizes de fosfo-quinase e fosfoimunorreceptor Proteome Profiler. Uma lista de moléculas fosforiladas em macrófagos tratados com rFVIIIFc identificadas pelos ensaios de Proteome Profiler é mostrada na Tabela 9. A fosforilação das fosfatases responsáveis pela sinalização inibidora foi medida usando a plataforma MSD (n = 3; ** P < 0,01, *** P < 0,005) (Figura 19).

Tabela 9: Moléculas fosforiladas em macrófagos tratados com rFVIIIFc identificadas por ensaios de Proteome Profiler.

Proteínas Fosforiladas
Imunorreceptores	ILT6/CD85e	NKp46/NCR1	FcH5/IRTA2	Quinases	SRC	STAT5
KIR2DL4	Siglec9	Siglec2/CD22	CREB	cJun
SLAMF8	SLAMF4	CDCIR/CLEC4a	PRAS40	p53
FcyRIIIA/B	FcyRIIA	DECTIN-1/CLEC7a	ERK1/2	WNK1
PECAM/CD31	FcRH4/IRTA1	KNKp44/NCR2	HSP27	p70S6
CLEC-2	SHP2	Siglec7	JNK1/2/3	FAK
TREM2	ILT2/CD85j	SLAMF5	AMPKa2	GSK-3a/(3
SHP1	ILT3/CD85k	Siglec3/CD33	STAT2	RSK1/2/3
TREML1/TLT-1	ILT4/CD85d	Siglec5	STAT6	p53

[00339] O rFVIIIFc induz o padrão de expressão gênica característico de macrófagos tolerogênicos (Figura 20A-20G). A sequenciação de RNA exploratório foi realizada em macrófagos derivados de monócitos tratados com lgG1, rFVIII ou rFVIIIFc durante seis horas (n = 3) para genes que foram significativamente reprimidos (Figura 20A) e para genes que foram significativamente induzidos (Figura 20B), e foi realizada uma análise da via nos genes induzidos por rFVIIIFc para investigar as vias moleculares representadas seletivamente nestas células, em comparação com as células tratadas com rFVIII (Tabela 9). Verificou-se que vários genes das vias NRF2 e PPAR-gama foram induzidos, bem como vários outros imunorreguladores (Figura 20H). Genes selecionados das vias de metabolismo dos lípidos e NRF2 foram validados por Q-PCR (n = 8; *

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P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,005) (Figuras 20C-20G). Além disso, verificou-se que os macrófagos educados com rFVIIIFc exibem um fenótipo semelhante a M2 característico (Figuras 20I-20M). Em particular, os macrófagos tratados com rFVIIIFc apresentavam expressão de CD206 relativamente maior do que as células tratadas com rFVIII após 6 horas (Figura 20I) e após 24 horas (Figura 20J) e os macrófagos tratados com rFVIIIFc tinham expressão relativa de ARG1 mais alta em relação às células tratadas com rFVIII após 24 horas (Figura 20M).

Tabela 9: Análise da via de corrida nos genes induzidos por rFVIIIFc para investigar as vias moleculares representadas seletivamente nestas células, em comparação com células tratadas com rFVIII.

Nome da Via	Tamanho Definido	Candidatos contidos	Valor P	Valor q
Via NRF2	142	10 (7,0%)	4,07e-06	0,000273
Metabolismo de lipoproteína	68	7 (10,3%)	1,01e-05	0,000338
Digestão, mobilização e transporte de lipídios	110	8 (7,3%)	3,06e-05	0,000684
Metabolismo de cisteína e metionina -Homo sapien (ser humano)	45	5 (11,1%)	0,000137	0,00229
Rede de fator de transcrição C-MYB	86	6 (7,0%)	0,000389	0,00521
Meta-via de receptores nucleares	316	11 (3,5%)	0,000813	0,00908

[00340] As células apresentadoras de antígeno tratadas com rFVIIIFc influenciam a diferenciação de células T reguladoras que exigem contato célula-célula APC-T (Figura 21A-21C). Os macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico foram tratados com IgG 1, rFVIII ou rFVIIIFc, depois colocados em co-cultura com células T CD4+ virgens isoladas a partir do sangue periférico do mesmo doador. Após seis dias em co-cultura (Figura 21A), a porcentagem de células T reguladoras (CD4+ CD25+ FoxP3+) foi quantificada utilizando citometria de fluxo (n = 4) (Figura 21B). A porcentagem de células T reguladoras foi também quantificada quando as células T virgens foram cultivadas no meio condicionado de APCs pré-tratadas com lgG1, rFVIII ou rFVIIIFc (n = 4) (Figura 21C).

Conclusão

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141/143 [00341] rFVIIIFc parece ligar e induzir a internalização e a sinalização através de receptores Fcy em APCs. Essa sinalização não se traduz em produção de citocinas pró-inflamatórias e não ativa as APCs (dados não mostrados). Os eventos de sinalização imunomoduladora são iniciados após o tratamento com rFVIIIFc. Estes eventos parecem conduzir à diferenciação de macrófagos em direção a um fenótipo semelhante a M2 caracterizado pela indução das vias de NRF2 e PPARy (Figura 20H), bem como a indução das moléculas de CD206 e arginase 1. Vários outros imunorreguladores também apresentaram expressão aumentada, enquanto ao menos a subunidade beta solúvel da guanilato ciclase 1 (2GUCY1B2), protoporfirinogênio oxidase (PPOX), e o supressor da sinalizao da citocina 3 (SOCS3) apresentaram expressão reduzida em células tratadas com rFVIIIFc (Figura 20H). Estes macrófagos podem executar os efeitos imunológicos benéficos anteriormente relatados, tais como diferenciação de células T reguladoras, tolerância ao FVIII e redução do inibidor de anti-FVIII (Figuras 22 e 23).

EXEMPLO 7 [00342] O perfil farmacocinético (PK) do fator IX (FIX) é consistente com um modelo de dois compartimentos onde o FIX se distribui em grande parte para um espaço fora do compartimento plasmático (espaço extravascular). Foi mostrado anteriormente usando imagiologia SPECT que os perfis de biodistribuição de rFIXFc e rFIX em camundongos com hemofilia B são consistentes com a hipótese de que o FIX pode se distribuir para tecidos fora do compartimento plasmático, enquanto o glicoPEGuilado-rFIX permanece principalmente no compartimento plasmático devido a modificações impostas pela porção PEG. Neste estudo foi avaliada a distribuição de rFIX e rFIXFc em primatas não humanos (NHP).

[00343] rFIXFc e rFIX foram marcados em resíduos de lisina

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142/143 utilizando um 1241-SIB (sucinimidil iodobenzoato). Os macacos Cynomolgus receberam uma injeção de bolus IV única com uma dose traço de ~ 2 mCi de 1241-SIB-rFIXFc (2 mg/kg) ou 1241-SIB-rFIX (1 mg/kg). A PET/TC reconstruída de corpo inteiro foi usada para gerar imagens de projeção de intensidade máxima (MIP) e a biodistribuição in vivo foi determinada para análise de regiões de interesse (ROls).

[00344] A imagiologia PET em NHP mostrou uma distribuição precoce de 1241-SIB-rFIXFc e 1241-SIB-rFIX no acúmulo de sangue, coração, fígado e rins. Posteriormente, rFIXFc e rFIX mostraram distribuição para as articulações do ombro, bem como outras articulações ósseas (punho, tornozelo e mandíbula) com rFIXFc exibindo distribuição significativamente maior para essas áreas, mesmo em momentos em que os níveis plasmáticos do FIX estavam abaixo do nível de detecção. Os dados in vivo e ex vivo mostraram a depuração do acúmulo sanguíneo de rFIXFc e rFIX. Dados de precipitação de TOA mostraram que > 95% da radioatividade foi associada ao FIX.

[00345] Os perfis de biodistribuição de rFIXFc e rFIX NHP são semelhantes aos observados em camundongos com hemofilia B e são consistentes com a hipótese de que FIX pode se distribuir para tecidos fora do compartimento plasmático. A distribuição significativamente maior de rFIXFc para áreas de articulações em comparação com rFIX poderia potencialmente refletir a retenção nesses tecidos por um mecanismo mediado por Fc ou PK melhorado. Embora o papel da distribuição extravascular na prevenção de hemorragias e na proteção geral da saúde articular permaneça uma área de investigação, este estudo é consistente com as observações em camundongos que demonstraram diferenças de biodistribuição para variantes de FIX sugerindo que os níveis plasmáticos podem não ser comparáveis ou ter o mesmo significado, através de variantes de FIX.

[00346] A descrição anterior das modalidades específicas revelará

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143/143 completamente a natureza geral da invenção que outros podem, através da aplicação de conhecimentos dentro da técnica, facilmente modificar e/ou adaptar para várias aplicações tais modalidades específicas, sem experimentação indevida, sem abandonar o conceito geral da presente invenção. Por conseguinte, essas adaptações e modificações estão dentro do significado e faixa de equivalentes das modalidades descritas, com base nos ensinamentos e orientações aqui apresentados. Deve ser entendido que a fraseologia ou terminologia aqui usada é para o propósito de descrição e não de limitação, de modo que a terminologia ou fraseologia da presente especificação é interpretada pelo versado na técnica face aos ensinamentos e à orientação.

[00347] Outras modalidades da invenção serão evidentes para os versados na técnica a partir da consideração da especificação e prática da invenção aqui descrita. Pretende-se que a especificação e os exemplos sejam considerados apenas como exemplificativos, com um verdadeiro escopo e espírito da invenção sendo indicados pelas reivindicações seguintes.

[00348] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes aqui descritos são incorporados por referência na mesma medida como se cada publicação individual, patente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Uso de uma proteína quimérica ou composição, caracterizado pelo fato de que compreende um fator de coagulação e uma região Fc em um método para tratar artropatia hemofílica reversível de uma articulação em um ser humano que tem hemofilia.
2. 2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a artropatia hemofílica reversível compreende sinovite, micro-hemorragia ou ambas.
3. 3. Uso de uma proteína quimérica ou composição, caracterizado pelo fato de que compreende um fator de coagulação e uma região Fc em um método para reduzir a ocorrência de remodelação vascular em uma articulação de um ser humano que tem hemofilia ou para ou tratamento profilático da mesma.
4. 4. Uso de uma proteína quimérica ou composição, caracterizado pelo fato de que compreendeum fator de coagulação e uma região Fc em um método para melhorar o tecido mole circundante de uma articulação de um ser humano que tem hemofilia.
5. 5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   4, caracterizado pelo fato de que a administração melhora um escore de saúde articular (HJHS) no ser humano.
6. 6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   5, caracterizado pelo fato de que a administração reduz a dor nas articulações no ser humano.
7. 7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   6, caracterizado pelo fato de que a articulação é selecionada a partir do grupo que consiste em um ou ambos os cotovelos, um ou ambos os joelhos, um ou ambos os tornozelos, um ou ambos os ombros, um ou ambos os quadris, um ou ambos os pulsos, uma ou mais articulações da mão, uma ou mais articulações do pé, e qualquer combinação dos mesmos.

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8. 8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a região Fc se liga especificamente a um receptor ll-b da região Fc da gama imunoglobulina de baixa afinidade (FcyRIIB).
9. 9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende aindaidentificar o ser humano em necessidade de tratamento usando um sistema de imagiologia selecionado a partir do grupo que consiste emradiografia, ressonância magnética, ultrassonografia, sonografia com Doppler de alta potência ou qualquer combinação dos mesmos.
10. 10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o fator de coagulação é selecionado a partir do grupo que consiste em fator VII (FVII), fator Vila (FVIIa), fator VIII (FVIII), fator IX (FIX), fator X (FX), fator de von Willebrand (VWF), uma porção de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a FIX e FX, ou qualquer combinação dos mesmos.
11. 11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizado pelo fato de que a proteína quimérica compreende FVIII-Fc ou FIX-Fc.
12. 12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo FVIII-Fc é de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 300 IU/kg.
13. 13. Uso, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a proteína quimérica compreendendo FVIII-Fc é administrada em um intervalo de dosagem de aproximadamente dois dias, aproximadamente três dias, aproximadamente quatro dias, aproximadamente cinco dias, aproximadamente seis dias, aproximadamente sete dias, oito dias, aproximadamente nove dias, aproxima

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    3/3 damente dez dias, aproximadamente 11 dias, aproximadamente 12 dias, aproximadamente 13 dias, aproximadamente 14 dias, aproximadamente 15 dias, aproximadamente 16 dias, aproximadamente 17 dias, aproximadamente 18 dias, aproximadamente 19 dias, aproximadamente 20 dias, aproximadamente 21 dias, aproximadamente 22 dias, aproximadamente 23 dias, ou aproximadamente 24 dias.
14. 14. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a quantidade eficaz da proteína quimérica compreendendo FIX-Fc é de aproximadamente 20 IU/kg a aproximadamente 100 IU/kg.
15. 15. Uso, de acordo com a reivindicação 11 ou 14, caracterizado pelo fato de que a proteína quimérica compreendendo FIX-Fc é administrada em um intervalo de dosagem de aproximadamente três dias, quatro dias, cinco dias, seis dias, sete dias, oito dias, nove dias, dez dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias ou 28 dias.
16. 16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o fator de coagulação se distribui para os tecidos fora do compartimento plasmático bem como no compartimento plasmático.