BRPI0307724B1

BRPI0307724B1 - Sistemas para distribuição de imunógenos sintéticos estabilizados

Info

Publication number: BRPI0307724B1
Application number: BRPI0307724-1A
Authority: BR
Inventors: Kenneth K. Sokoll
Original assignee: United Biomedical, Inc.
Priority date: 2002-02-14
Filing date: 2003-02-14
Publication date: 2019-06-18
Also published as: AU2003213091C1; BRPI0307724B8; JP2010265291A; EP1572074A4; EP1572074A2; AU2003213091A1; AU2003213091B2; TW200307557A; WO2003068169A3; US8084015B2; ES2383172T3; CA2475102C; MXPA04007935A; US8088388B2; JP5237997B2; CN101001646A; BR0307724A; US20040009897A1; CN101001646B; TWI359025B

Abstract

"sistemas para distribuição de imunógenos sintéticos estabilizados". a presente invenção refere-se a um complexo imunoestimulador, adaptado especificamente para atuar como um adjuvante e como um estabilizador de imunógeno de peptídeo. o complexo imunoestimulador compreende um oligonucleotídeo de cpg e um imunógeno de peptídeo biologicamente ativo. o complexo imunoestimulador é em partículas e pode apresentar eficazmente imunógenos de peptídeo às células do sistema imunológico, para produzir uma resposta imune. o complexo imunoestimulador pode ser formulado como uma suspensão para administração parenteral. o complexo imunoestimulador também pode ser formulado na forma de emulsões de a/o, como uma suspensão em combinação com uma suspensão de sais minerais ou com um polímero gelificante in situ, para a distribuição eficaz de um imunógeno às células do sistema imunológico de um indivíduo após a administração parenteral, para produzir uma resposta imune, que também pode ser uma resposta imune protetora.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para SISTEMAS PARA DISTRIBUIÇÃO DE IMUNÓGENOS SINTÉTICOS ESTABILIZADOS.

A presente invenção refere-se a um complexo imunoestimulador estabilizado e um método para preparar o complexo imunoestimulador estabilizado. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a complexos imunoestimuladores sintéticos, estabilizados, que são úteis em sistemas de distribuição de vacinas, com repostas imunológicas aperfeiçoadas in vivo. Esses complexos imunoestimuladores também são úteis para preparar formulações de vacinas destinadas a funcionar como reservatório para liberação controlada do complexo imunoestimulador. O complexo imunoestimulador também pode ser incorporado em formulações destinadas a atingir tipos de células específicos, para aperfeiçoar sinergicamente a qualidade das respostas imune provocadas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Vacinas têm sido usadas com sucesso por muitos anos em composições profiláticas para a prevenção de doenças infecciosas e, mais recentemente, em composições terapêuticas para o tratamento de câncer e doenças não-infecciosas.

Tradicionalmente, as vacinas eram derivadas de agentes patogênicos atenuados ou exintos e provaram ser muito eficazes contra doenças, tal como vírus da pólio e Bordetella pertussis. Apesar desses sucessos, há preocupações crescentes sobre a segurança dessas vacinas. Isso levou ao desenvolvimento de vacinas de subunidades, derivadas de componentes desses agentes patogênicos ou imunógenos de peptídeo totalmente sintéticos.

Exemplos de vacinas de subunidades incluem o antígeno toxóide de tétano e de superfície de hepatite B. Esses antígenos muitas vezes são pouco imunogênicos e necessitam, portanto, de adjuvantes para aperfeiçoar as respostas imune obtidas. Compostos biologicamente ativos, bem30 caracterizados, tal como peptídeos sintéticos, são substratos preferidos para induzir respostas biológicas, para fins de segurança e de regularização. Porém, esses imunógenos não são ótimos, e induzem respostas protetoras

parciais ou insignificantes em modelos animais. Os peptídeos sintéticos requerem tanto estabilização como facilitação para a indução de uma resposta . imune eficaz in vivo.

Diversos métodos têm sido usados para proteger imunógenos * 5 de peptídeos sintéticos contra degradação in vitro e in vivo, mediados por diversos processos, inclusive caminhos químicos e físicos.¹ (Os números em sobrescrito referem-se a publicações, que descrevem mais detalhadamente o estado da técnica ao qual esta invenção se refere. As descrições dessas referências são pelo presente incorporadas por referência. A citação de cada 10 referência é encontrada no final deste capítulo).

Diversos métodos têm sido usados para aperfeiçoar a solubilidade de peptídeos ou proteger um peptídeo contra degradação in vivo.² Os . mesmos geralmente incluem procedimentos simples, tal como modificar a concentração de sal e/ou o pH da solução. Os peptídeos também têm sido ’ 15 modificados quimicamente por conjugação com compostos solúveis em água, tal como polietilenoglicol (PEG) ou óxido de polietileno (PEO), ambos para aperfeiçoar sua solubilidade aquosa e tempo de circulação in vivo.³ Foi documentado que adjuvantes derivados de PEG ou PEO podem regular para baixo o sistema imunológico.⁴ Desse modo, não se espera que peptí20 deos modificados com PEG ou PEO funcionem eficazmente como adjuvantes. A adição de lisinas múltiplas para adicionar carga a um peptídeo pode aperfeiçoar sua solubilidade aquosa, mas, em geral, não resulta em imunogenicidade aperfeiçoada.

O objetivo dessas diversas estratégias é aperfeiçoar o tempo de 25 circulação in vivo ou minimizar ou eliminar problemas de imunogenicidade associados com as condições físicas (por exemplo, sal, pH, temperatura, tipo de tampão) e/ou incompatibilidades químicas, quando peptídeos são usados em uma formulação de vacina.

Copolímeros de bloco de poliéter, que compreendem polímeros 30 policatiônicos, foram descritos por Kabanov et al., Patente U.S. N° 5.656.611⁵ para estabilizar polinucleotídeos ou oligonucleotídeos. Os complexos de copolímero de bloco de poliéter-polinucleotídeo são usados para

facilitar o transporte do polinucleotídeo através de uma membrana de célula para atividade biológica aperfeiçoada. Porém, esses polinucleotídeoscopolímeros de bloco de poliéter não são imunogênicos e não são apropriados como vacinas.

Allcock et al, patente U.S. N° 5.562.909⁶ descreve um imunoadjuvante derivado de polieletrólitos de fosfazeno. O imunoadjuvante foi misturado diretamente com um antígeno em solução e pode ser preparado como micropartículas por secagem por pulverização de uma solução do polímero e o antígeno ou por um processo descrito por Cohen na patente U.S. N° 10 5.149.543⁷. Embora tenha sido mostrado uma facilitação aumentada para esses sistemas, há dificuldades na preparação de composições de micropartículas, devido aos processos mecânicos trabalhosos usados, que seriam difíceis de ser dimensionados proporcionalmente para produção comercial. Além disso, a estabilidade do complexo antígeno de polímero formado desse 15 modo é altamente dependente da concentração de sais e condições de pH.

Uma abordagem diferente é descrita em Moss et al, WO 91/04052⁸, no qual uma composição de vacina sólida é preparada de um antígeno, que pode ser um peptídeo, uma saponina e um adjuvante policatiônico, tal como dextrano de DEAE. Vacinas formuladas dessa combinação 20 oferecem longevidade aperfeiçoada, tornando essas combinações apropriadas para uso como implantes. Porém, o antígeno precisa ser primeiramente conjugado quimicamente a uma molécula veículo e purificado exaustivamente. O veículo de antígeno purificado foi depois combinado com uma saponina e um adjuvante policatiônico, para formar uma composição sólida.

Esse processo não oferece controle sobre as propriedades físicas, tal como tamanho de partícula, do produto.

Numerosos adjuvantes e/ou sistemas de distribuição baseados em reservatório, por via parenteral, mucosal ou transdérmica, destinados para uso com vacinas humanas ou veterinárias foram desenvolvidos para 30 intensificar a resposta imune. Os mesmos incluem o uso de sais minerais, emulsões de água-em-óleo (a/o), lipossomas, micropartículas poliméricas, nanopartículas e géis/hidrogéis.⁹ Tem sido realizado um grande número de

testes clínicos usando diversas composições de emulsões (a/o).

Apesar desse vasto conjunto de pesquisas clínicas, formulações parenterais típicas, administradas subcutaneamente ou por via intramuscular, são preparadas com adjuvantes derivados de sais de alumínio, tal como 5 fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio. Sais de alume são apropriados e eficazes para muitas vacinas baseadas em patógenos atenuados, patógenos extintos e antígenos de subunidade derivados de agentes biológicos. Porém, os adjuvantes baseados em alumínio freqüentemente são totalmente ineficazes para imunógenos baseados em peptídeos sintéticos, devido à 10 grande dose de peptídeo necessária e a necessidade de um adjuvante muito mais forte. A combinação de uma grande dose de imunógeno com um alume adjuvante fraco em uma composição de vacina não é ideal, pois pode levar à tolerância ao imunógeno e reactogenicidade, isto é, reações colaterais indesejáveis, tal como inchaço e vermelhidão no local da injeção.

O adjuvante completo de Freund (FCA), uma suspensão de micobactérias extintas por calor de M. tuberculosis em óleo mineral, que contém um tensoativo, foi reconhecido como um dos adjuvantes mais potentes. No entanto, têm sido documentadas reações adversas graves, que variam de uma irritação menor a lesões e abscessos estéreis no local da injeção.

Devido a essas reações negativas, FCA foi banido de aplicações humanas e veterinárias.

Há, portanto, uma clara necessidade de desenvolver adjuvantes que sejam seguros, sem os problemas toxicológicos e/ou reatogênicos associados a alume ou FACA e que possam intensificar eficazmente a imuno25 genicidade e prolonga a eficácia de imunógenos de peptídeo, para evitar o problema de tolerância associado ao alume. Também, é altamente desejável desenvolver composições e métodos que possam, ambos, estabilizar um imunógeno de peptídeo e facilitar as respostas imune em uma única composição.

Jones et al.¹⁰ descreveram dois oligonucleotídeos de CpG específicos que podem ser co-administrados com uma vacina contra malária baseada em peptídeos em macacos Aotus, para intensificar as respostas imu-

ne. No estudo de Jones, o ponto de ionização (IP) do peptídeo usado é de 5,96. Isso corresponde ao pH no qual o peptídeo terá uma carga teórica de zero.¹¹ Em virtude de sua composição de aminoácidos, o peptídeo usado seria eficazmente descarregado no pH fisiológico no solvente aquoso selecionado. Portanto, não pode ocorrer nenhuma complexação com os dois oligômeros de CpG. É esperado que a mistura resultante, quando formulada em uma emulsão de a/o, seja momentaneamente facilitada. Para alcançar um nível útil de imunogenicidade, seriam necessárias múltiplas injeções e uma grande quantidade de adjuvante. Além disso, a estabilidade de longo prazo de uma composição desse tipo é questionável. Efetivamente, Jones et al. descreveram que era necessário usar uma dose grande de oligonucleotídeo de CpG, 500 gg por injeção. Além disso, os métodos usados para preparar as emulsões de a/o não podem ser facilmente dimensionados proporcionalmente para aplicações comerciais. Deve ser observado que Jones et al. ensinaram que diferentes oligômeros de CpG são úteis para diferentes espécies de mamíferos. Por exemplo, um oligômero de CpG, CpG ODN 1826, é mitogênico para camundongos e um primata inferior, mas não para chimpanzés ou seres humanos e o efeito não é previsível.

Krieg et al., patente U.S. N° 6.194.388 B1¹² descrevem oligonucleotídeos de CpG não-metilados, particularmente úteis para aplicações terapêuticas, com base em sua capacidade em estimular respostas imune quando misturados com um antígeno. Krieg et al., US 6.207.646 B1¹³ descrevem, ainda, o uso de oligonucleotídeos de CpG não-metilados para redirecionar uma resposta de Th2 para uma reposta de Th1. Em ambas, a eficácia dos oligômeros de CpG foi demonstrada por estimulação de células B, sendo que as células foram cultivadas com oligômeros de CpG modificados tioato de fósforo. Não há descrição ou sugestão sobre como os oligômeros de CpG podem ser usados para obter um complexo imunoestimulador estabilizado ou uma vacina.

Outra área de intenso interesse e pesquisa foi focalizada em métodos para formular imunógenos sintéticos para vias de distribuição alternativas, tal como por via mucosal, transdérmica ou oral. A imunidade muco6

sal é mediada pela indução de imunoglobulina secretora (slgA), encontrada em secreções externas (por exemplo, lavagens intestinais, brônquicas ou nasais). Acredita-se que a distribuição transdérmica ou mucosal de vacinas seria eficaz contra uma grande quantidade de organismos patogênicos, que entram por intermédio de superfícies de mucosas. Por exemplo, uma vacina contra cólera administrada por via oral mostrou ser muito superior ao análogo administrado por via parenteral.¹⁴

Friede et al., WO 99/52549¹⁵ ensina que composições de vacinas destinadas ao uso mucosal podem ser derivadas de uma combinação de um antígeno com um éter de polioxietileno ou éster de polioxietileno como adjuvante principal. Foi sugerido que o antígeno alvo poderia ser um peptídeo sintético. Friede et al. também sugerem a adição de oligonucleotídeos de CpG na composição de vacina, para obter respostas aperfeiçoadas. Mostraram que uma combinação de um éter de polioxietileno ou éster de polioxietileno com um oligonucleotídeo de CpG poderia aperfeiçoar respostas mucosais quando co-administrada com um antígeno. Porém, os resultados mostraram uma falta de qualquer facilitação por simples misturas de oligonucleotídeos de CpG com antígeno descritas.

Vacinas administradas por via transdérmica representam uma área de interesse recente. Idealmente, dispositivos, isto é, emplastros ou injetares a jato, isentos de agulhas, podem ser usados para atingir as células de Langerhan intradérmicas, isto é, as células dendríticas. Essas células especializadas são responsáveis pelo processamento eficaz e apresentação de um imunógeno e podem ser usadas para induzir diretamente respostas humorais e celulares sistêmicas. Em alguns casos, a imunização intramuscular foi obtida por métodos transdérmicos.¹⁶ Por exemplo, um documento recente descreveu uma vacina contra difteria administrada como um emplastro. Anticorpos sistêmicos para o toxóide de difteria foram encontrados para diversas composições, quando co-administradas com adjuvantes.

Embora a técnica anterior tenha ilustrado o potencial de diversas formulações de vacinas, existem diversas limitações práticas para o desenvolvimento de formulações de vacina sintéticas, baseadas em peptídeos, zr para distribuição mucosal ou transdérmica. As mesmas incluem:

1) degradação dos imunógenos por fluídos ou secreções mucosais e/ou enzimas proteolíticas na superfície mucosal ou dentro da intraderme;

2) adsorção insignificante através do epitélio mucosal ou através das camadas intradérmicas; e

3) diluição do imunógeno para uma concentração abaixo da necessária para induzir um nível apropriado de respostas imune.

Existem poucas estratégias que tanto estabilizam como facilitam 10 um imunógeno baseado em peptídeo sintético em uma única composição de vacina. Essa composição seria essencial para o desenvolvimento de vacinas baseadas em peptídeo parenterais, mucosais ou transdérmicas altamente eficazes.

Também é desejável prolongar a duração das respostas imuno- 15 gênicas, a fim de reduzir o número de administrações necessário. Isso re* sultaria em um melhor atendimento e redução do custo total da vacinação.

Diversos métodos podem ser usados para facilitar imunógenos baseados em peptídeos sintéticos, mas normalmente é necessário um veículo ou sistema de reservatório para respostas imunogênicas de longo prazo 20 eficazes. Exemplos dignos de nota incluem adsorção do imunógeno sobre um sal mineral ou gel. Por exemplo, encapsular um imunógeno de peptídeo dentro de uma matriz polimérica (matriz monolítica) ou gel, ou dispondo um material polimérico em camadas em torno de um imunógeno de peptídeo (núcleo-revestimento) pode ser uma estratégica eficaz. Ou um imunógeno 25 pode ser incorporado em um tipo de formulação de lipossoma ou vesicular, com o imunógeno embutido na matriz lipídica ou fisicamente incorporado na fase aquosa interna. Outra estratégia pode usar um óleo de base mineral, base vegetal ou base animal, com uma solução aquosa do imunógeno em diversas proporções, para preparar uma emulsão de água-em-óleo (a/o) ou 30 uma emulsão dupla de água-em-óleo-em-água (a/o/w).¹⁸

Diversos tamanhos de partícula, morfologias, hidrofobicidade e carga de superfície residual são variáveis possíveis para consideração, de8

pendentes da formulação. Sabe-se que o controle desses parâmetros é importante para a fagocitose de partículas de tamanho mícron via administração parenteral^19,20 e para a absorbância de partículas em células M especializadas das Placas de Peyers dentro do trato intestinal^{21, 22}, para distribui5 ção oral. De modo similar, mostrou-se que esses parâmetros são importantes para acesso ao tecido linfóide do trato naso-faríngeo, associado à região nasal, um objetivo de distribuição nasal.^23,24

Krone et al., Patente U.S. N° 5.700.459²⁵ descrevem o uso de complexos de polieletrólitos em forma de micropartículas, derivados de poli10 ácidos e polibases, em que o agente de complexação é um polímero. São descritos diversos usos desses complexos e incluem composições de vacina, que compreendem antígenos ou peptídeos antigênicos. Algumas das composições são formulações de liberação controlada, que usam materiais potencialmente biodegradáveis. Em um dos exemplos, é descrito um método 15 para incorporar um antígeno em micropartículas de complexo de polieletrólito. Porém, o processo mecânico descrito para preparar micropartículas por trituração da mistura de partículas com tamanho de 100 μΜ para 1-4 μΜ é trabalhoso. Isso não seria facilmente dimensionado proporcionalmente para produção comercial.

Eldridge et al.²⁶ desenvolveram microesferas poliméricas, biodegradáveis, produzidas de copolímeros de poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo, para a liberação controlada de um antígeno in vivo. Os polímeros descritos como úteis para encapsular um antígeno em micropartículas incluem poliD,L-lactídeo, poliglicolídeo, policaprolactona, polianidridos, poliortoésteres e 25 poli(a-ácido hidroxibutírico).

Embora a liberação controlada de um antígeno tenha sido obtida na técnica anterior, foram encontradas dificuldades quando as micropartículas foram produzidas pelos métodos descritos. Os métodos descritos são difíceis de dimensionar proporcionalmente. Além disso, a exposição de ma30 teriais biológicos a solventes orgânicos e processamento mecânico pode levar à desnaturação e redução para eficiências de encapsulamento modestas. Além disso, antígenos hidrofílicos são encapsulados de modo inefi9 caz nos processos descritos.

Henry et al., Patente U.S. N°s 5,126,141 e 5,135,751^{271 28} descrevem composições de gel aquosas, termicamente reversíveis, formadas de um polímero de polióxialquileno e um polissacarídeo iônico, para aplicação a áreas lesionadas do corpo para evitar aderência. Rosenberg et al., WO 93/01286²⁹ descreveram o uso do mesmo tipo de polímeros de polioxialquileno para a administração local de oligonucleotídeos de anti-sentido à superfície exposta cirurgicamente de vasos sanguíneos, para tratamento de restenose. Nem Henry et al., nem Rosenberg et al. ensinaram ou sugeriram o uso de uma composição de gel como uma vacina.

Dunn et al., Patentes U.S. Nos. 4.938.763 e 5.702.716^30,31 descrevem composições poliméricas úteis para a liberação controlada de materiais biologicamente ativos. Um solvente biocompatível foi usado para preparar soluções ou suspensões de antígeno para injeção parenteral direta, após a qual gelificação in situ resulta na formação de implante. Foi reivindicada utilidade para diversos antígenos, inclusive imunógenos baseados em peptídeos sintéticos pequenos. Porém, Dunn et al., US 5.702.716³¹, afirmou que as composições de liberação controlada necessitam de até 15% em peso de um agente de gel retardador de velocidade de gelificação. Os agentes retardadores foram adicionados para modular a velocidade de gelificação e eram necessários para maior eficácia de encapsulamento de antígenos, que são facilmente extraídos in vivo. Como a extração de solvente é em grande parte regulada por difusão, isso apesenta um problema maior para imunógenos sintéticos pequenos do que para antígenos mairoes, baseados em proteínas ou sub-unidades.

Nem US 4.938.763³⁰ nem US 5.702.716³¹ ensinaram ou sugeriram imunógeno baseado em peptídeos sintético estabilizado como um complexo imunoestimulador suspenso dentro de um solvente biocompatível. Além disso, nem US 4,938,763³⁰ nem US 5,702,716³¹ ensinaram ou sugeriram composições que sejam auto-adjuvantes e possam regular para cima respostas imune tanto na fase inicial como na fase de reforço.

É um objetivo desta invenção desenvolver complexos imunoes10 timuladores estáveis de imunógenos de peptídeos sintéticos e moléculas de estabilização, que possuem propriedades de autofacilitação in vivo. É um outro objetivo da presente invenção prover um método simples para estabilizar um imunógeno de peptídeo sintético in vitro e in vivo.

É ainda um outro objetivo da presente invenção obter veículos de distribuição de liberação continuada ou controlada, compatíveis com esses complexos imunoestimuladores baseados em peptídeos sintéticos, estabilizados.

É ainda um outro objetivo da invenção desenvolver formulações usando uma combinação de complexos imunoestimuladores baseados em peptídeos sintéticos, estabilizados, e imunógenos não-combinados em um sistema de distribuição de liberação controlada, para obter um aumento sinérgico da resposta imune, inclusive respostas protetoras.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção está voltada para um complexo imunoestimulador estabilizado, que compreende um peptídeo catiônico e molécula ou oligonucleotídeo ou polinucleotídeo aniônico e um método para estabilizar um peptídeo catiônico por complexação com uma molécula ou oligonucleotídeo ou polinucleotídeo aniônico por intermédio de associação eletrostática. O complexo imunoestimulador estabilizado pode ser incorporado em uma composição farmacêutica como um sistema de distribuição de imunógenos.

Um peptídeo catiônico, tal como descrito no presente, refere-se a um peptídeo que está carregado positivamente a um pH na faixa de 5,0 a 8,0. A carga líquida no peptídeo ou coquetel de peptídeos é calculada atribuindo uma carga de +1 lisina (K), arginina (R) ou histidina (H), uma carga de -1 a cada ácido aspártico (D) ou ácido glutâmico (Ε) e uma carga de 0 para os outros aminoácidos dentro da seqüência. As contribuições de carga dos grupos terminais da amina de terminal N (+1) e carboxilato de terminal C (-1) de cada peptídeo efetivamente se cancelam uma à outra quando não substituídas. As cargas são somadas para cada peptídeo e expressas como a carga média líquida. Um imunógeno de peptídeo apropriado tem uma carga positiva média, líquida, de +1. Preferivelmente, o imunógeno de peptídeo

Χ5 tem uma carga positiva líquida na faixa que é maior do que +2.

Os imunógenos de peptídeo compreendem epitopos de célula B e epitopos de Th. Os epitopos de Th podem ser intrínsecos ao peptídeo ou adicionados ao mesmo, tal como descrito na técnica anterior. Imunógenos 5 de peptídeo apropriados estão descritos abaixo, no presente.

Uma molécula aniônica, tal como descrita no presente, referese a moléculas que são carregadas negativamente a um pH na faixa de 5,08,0. A carga negativa líquida no oligômero ou polímero é calculada atribuindo uma carga de -1 a cada grupo fosfodiéster ou tioato de fósforo no oligô10 mero. Um oligonucleotídeo aniônico apropriado é uma molécula de DNA de filamento único com 8 a 64 bases de nucleotídeo, com o número de repetições do motivo de CpG na faixa de 1 a 10. Preferivelmente, as moléculas de DNA de filamento único imunoestimuladoras de CpG contêm 18-48 bases de nucleotídeo, com o número de repetições do motivo de CpG na faixa de 3 a 15 8.

Mais preferivelmente, o oligonucleotídeo aniônico é representado pela fórmula: 5' X¹CGX² 3', em que C e G são não-metilados: e X¹ é selecionado do grupo que consiste em A (adenina), G (guanina) e T(timina); e X²é C (citosina) ou T (timina). Ou, o oligonucleotídeo aniônico é representado 20 pela fórmula 5' (X³)2CG(X⁴)2 3', em que C e G são não-metilados; e X³ é selecionado do grupo que consiste em A, T ou G; e X⁴ é C ou T.

De modo especialmente preferido, o oligonucleotídeo de CpG é selecionado de um grupo que consiste em 5' TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT 3' (CpG1) SEQ ID NO: 1, um oligômero com com25 primento de 32 bases, e 5'nTC GTC GTT TTG TCG TTT TGT CGT T 3' (CpG2) SEQ ID NO: 2, um oligômero com comprimento de 24 bases, mais um grupo tioato de fósforo (designado por n no terminal 5').

O complexo imunoestimulador resultante está na forma de partículas com um tamanho, tipicamente, na faixa de 1-50 mícrons e é uma fun30 ção de muitos fatores, inclusive a estequiometria de carga relativa e peso molecular da espécies em interação.³² O complexo imunoestimulador em partículas tem a vantagem adicional de oferecer facilitação e regulagem para ··· ·· ···· ·· ········ ·· · • · · ·· · · ···· lí?···· ····

111.···· · · ···· ········ · ·φ ··· ·· ·· ·· · φ ····· cima de respostas imune específicas in vivo. Adicionalmente, o complexo imunoestimulador estabilizado é apropriado para preparar formulações de vacinas por diversos processos, incluindo emulsões de água-em-óleo, suspensões de sais minerais e géis poliméricos.

O termo estabilizar pode ser realizado pelo uso de qualquer material que proteja o imunógeno de peptídeo sintético contra degradação in vitro ou in vivo. Isso pode ser realizado em virtude da modificação química e/ou associação física. Um estabilizador pode aumentar as propriedades fisiológicas de um imunógeno de peptídeo sintético, um glicopeptídeo modificado com oligossacarídeo ou um peptídeo lipidado, para obter uma formulação mais eficaz.

O termo adjuvante, tal como descrito no presente, refere-se a qualquer material que possa intensificar ou regular para cima as respostas imune provocadas por um imunógeno em seres humanos ou animais. O adjuvante em si pode ou não induzir uma resposta imunogênica.

O estabilizador também pode funcionar, preferivelmente, em uma vacina como um adjuvante, regulando eficazmente para cima as respostas imune. O estabilizador pode atuar como um adjuvante facilitando ativamente a apresentação do imunógeno para processamento profissional de células do sistema imune, tal como células macrófagas e dendríticas. Na presente invenção, o complexo imunoestimulador estabilizado permanece idealmente como uma unidade integral em solução quando administrado.

O complexo imunoestimulador estabilizado também pode ser formulado para liberação controlada e permanecer como um complexo em uma forma concentrada, em um reservatório próximo ao local da administração. Essas formulações combinam sinergicamente os benefícios de um imunógeno facilitado por adjuvante, estabilizado, associado a uma liberação local continuada de imunógeno para células causadoras de imunidade. Em algumas composições, o papel do adjuvante em si também pode envolver a atração de células do sistema imunológico para a vizinhança do reservatório de imunógeno e estimular essas células a provocar uma resposta imune.

Em um segundo aspecto desta invenção, é obtido um método

para preparar uma composição de vacina que contém um complexo imunoestimulador. Em uma forma de realização preferida, o complexo imunoestimulador tem a vantagem adicional de ser um imunógeno baseado em peptídeo sintético, estabilizado, in vitro e, ao mesmo tempo ser auto-facilitador, 5 com regulagem para cima de respostas imune específicas in vivo.

Em um terceiro aspecto desta invenção, é obtido um método para preparar uma composição de vacina do complexo imunoestimulador. O complexo imunoestimulador ou uma mistura do complexo imunoestimulador com o imunógeno não-complexado pode ser formulado como uma suspen10 são em solução, uma emulsão de água-em-óelo, uma suspensão em combinação com uma suspensão de sais minerais ou uma suspensão reconstituída em uma solução biocompatível. O complexo imunoestimulador sozinho . ou em mistura com imunógenos não-complexados também pode ser co* formulado em um solvente biocompatível em um gel polimérico.

Esta invenção está voltada, ainda, para a produção de sistemas de distribuição de imunógeno úteis, para administração por várias vias, inclusive vias parenterais, orais, intranasais, retais, bucais, vaginais e transdérmicas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS '

A presente invenção é entendida, ainda, com referência aos desenhos.

A Figura 1 é uma representação esquemática mostrando o processo de complexação de imunógenos de peptídeos catiônicos e oligonucleotídeos de CpG.

A Figura 2 mostra a distribuição de tamanhos típica para os complexos imunoestimuladores estabilizados preparados de imunógenos de peptídeos de LHRH e oligonucleotídeos de CpG1 em diversas proporções, tal como determinado por medições de difração de laser.

A Figura 3 é uma representação esquemática do processo para preparar uma emulsão de água-em-óleo (a/o), usando técnicas de homogeneização ou extrusão.

A Figura 4 mostra uma fotomicrografia típica para uma emulsão de a/o preparada por intermédio de homogeneização de ISA Montanide® 51 e complexos imunoestimuladores de LHRH:CpG1, onde LHRH:CpG1 é 4:1, a uma concentração de peptídeo total, final, fixa, de 100 gg/ml.

A Figura 5 mostra uma fotomicrografia típica para uma emulsão de a/o preparada por intermédio de extrusão de ISA Montanide® 720 e complexos imunoestimuladores de LHRH:CpG1, onde LHRH:CpG1 é 4:1, a uma concentração de peptídeo de LHRH final, fixa, de 200 μg/ml.

A Figura 6 é uma representação esquemática detalhando o processo de gel polimérico in-situ, usando reconstituição.

A Figura 7 mostra as respostas de IgG de soro em porquinhosda-índia imunizados por via intramuscular (I.M.) de acordo com os protocolos de imunização descritos no Exemplo 7.

A Figura 8 mostra as repostas de IgG de soro em porquinhosda-índia imunizados por via intramuscular (I.M.) de acordo com os protocolos 15 de imunização descritos no Exemplo 7. Nenhum soro foi obtido para os animais imunizados com o complexo imunoestimulador derivado de peptídeos de CD4 e CpG2 na semana 17. Isso está indicado por um asterisco na Figura 8.

A Figura 9 mostra as respostas de IgG de soro em porquinhos20 da-índia imunizados por via intramuscular (I.M.) de acordo com os protocolos de imunização descritos no Exemplo 7.

A Figura 10 mostra as repostas de IgG de soro em porquinhosda-índia imunizados por via intramuscular (I.M.) de acordo com os protocolos de imunização descritos no Exemplo 7. Nenhum soro foi obtido para os ani25 mais imunizados com o complexo imunoestimulador derivado de peptídeos de CD4 e CpG2 na semana 17. Isso está indicado por um asterisco na Figura 10.

A Figura 11 mostra as respostas de IgG de soro em porquinhosda-índia imunizados por via intramuscular (I.M.) de acordo com os protocolos 30 de imunização descritos no Exemplo 8.

A Figura 12 mostra as repostas de IgG de soro em porquinhosda-índia imunizados por via intramuscular (I.M.) de acordo com os protocolos

de imunização descritos no Exemplo 8.

A Figura 13a mostra as repostas de IgG de soro e 13b mostra a testosterona de soro total em ratos machos imunizados por via intramuscular (I.M.) de acordo com os protocolos de imunização, tal como descritos no Exemplo 10.

A Figura 14a mostra as repostas de IgG de soro e 14b e 14c mostram a testosterona de soro total em babuínos machos imunizados por via intramuscular (I.M.) de acordo com os protocolos de imunização, tal como descritos no Exemplo 11.

A Figura 15a mostra as repostas de IgG de soro, 15b mostra a testosterona de soro total e 15c mostra o ganho de peso médio por grupo em varrões imunizados por via intramuscular (I.M.) ao longo do período do ensaio, de acordo com os protocolos de imunização, tal como descritos no Exemplo 13.

A Figura 16 é uma representação esquemática detalhando o processo de preparar uma suspensão mista de complexo imunoestimulador e um sal mineral.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

De acordo com um primeiro aspecto da invenção, um imunógeno de peptídeo catiônico é complexado com um DNA de filamento único, aniônico, para formar um complexo imunoestimulador estável.

O imunógeno de peptídeo catiônico é um peptídeo com uma carga positiva líquida, a um pH na faixa de 5,0 a 8,0. A carga líquida no peptídeo ou coquetel de peptídeos é calculada atribuindo uma carga de +1 a cada lisina (K), arginina (R) ou histidina (H), uma carga de -1 a cada ácido aspártico (D) ou ácido glutâmico (E) e uma carga de 0 aos outros aminoácidos dentro da seqüência. As contribuições de carga dos grupos terminais da amina de terminal N (+1) e carboxilato de terminal C (-1) de cada peptídeo efetivamente se cancelam uma à outra quando não substituídas. As cargas são somadas para cada peptídeo e expressas como a carga média líquida. Preferivelmente, a carga positiva líquida do imunógeno de peptídeo é de pelo menos +2.

O imunógeno de peptídeo catiônico pode ter intrinsecamente

uma carga positiva líquida, tal como calculada acima, com base em sua seqüência de aminoácidos. Pode ser levado a ter uma carga positiva pela adição de uma lisina, uma arginina ou uma histidina ou uma mistura desses 5 aminoácidos ao terminal N ou terminal C do imunógeno de peptídeo. Outros componentes sintéticos, tal como iminas de polietileno ou poliaminas, que conferem uma carga positiva ao imunógeno de peptídeo em solução aquosa, também podem ser adicionados.

O imunógeno de peptídeo catiônico compreende um epitopo de 10 Th e um epitopo de célula B de alvo. O epitopo de Th pode ser intrínseco ao peptídeo ou adicionado sinteticamente a um peptídeo, que funciona como um epitopo de célula B de alvo. Imunógenos de peptídeo apropriados incluem peptídeos que provocam respostas imune protetoras ou terapêuticas e são derivados de patógenos ou proteínas conhecidas por causar doenças. 15 Os mesmos incluem: peptídeos de IgE humano ou animal para a imunoterapia de alergias, por exemplo, os imunógenos de peptídeo de IgE descritos em WO 99/67293⁵¹; peptídeos de HIV para imunidade protetora e imunoterapia para infecção de HIV, descritos em US 5.763.160⁵²; peptídeos de CD4 para imunidade protetora de HIV e imunoterapia de infecção de HIV e distúr20 bios imunológicos descritos em US 6.090.388⁵³; peptídeos de Hormônio de Liberação de Hormônio Luteinizante (LHRH) para imunoterapia de tumores dependentes de androgênio e estrogênio, controle de natalidade e imunocastração, e remoção de infecção de varrões, descritos em US 5.749.551⁵⁴ e US 6.025.468⁵⁵; peptídeos de β-amilóide para prevenção e imunoterapia do 25 Mal de Alzheimer, descritos em USSN 09/865.294⁵⁶; peptídeos de vírus de febre aftosa para imunidade protetora contra febre aftosa, descritos em US 6.107.021⁵⁷; peptídeos de pelo bacterianos, para imunidade protetora contra infecção do trato urinário, descritos em USSN 09/747802⁵⁸; peptídeos de Plasmodium para imunidade protetora contra malária, descritos em WO 30 99/66957⁵⁹; e peptídeos de somatostatina para promoção de crescimento em animais de criação, descritos em WO 99/6695O.⁶⁰ Os imunógenos de peptídeo específicos citados no presente são exemplos, apenas para fins de • · · · · · ····· ······ · · · •· ·· · · ···· · ilustração, e não devem, de modo algum, ser interpretados como constituindo uma limitação do âmbito da invenção.

O DNA de filamento único aniônico é um polinucleotídeo ou oligonucleotídeo que está carregado negativamente, a um pH na faixa de

5,0-8,0. A carga negativa líquida no polinucleotídeo ou oligonucleotídeo é calculada atribuindo uma carga de -1 a cada grupo fosfodiéster ou tioato de fósforo no oligômero. Um oligonucleotídeo aniônico apropriado é uma molécula de DNA de filamento único, com 8 a 64 bases de nucleotídeo, com um motivo de CpG repetido e o número de repetições do motivo de CpG está na 10 faixa de 1 a 10. Preferivelmente, as moléculas de DNA de filamento único imunoestimuladoras de CpG contêm 18-48 bases de nucleotídeo, com o número de repetições do motivo de CpG na faixa de 3 a 8.

Preferivelmente, o oligonucleotídeo aniônico é representado pela fórmula: 5' X¹CGX² 3', em que C e G são não-metilados: e X¹ é selecionado 15 do grupo que consiste em A (adenina), G (guanina) e T(timina); e X² é C (citosina) ou T (timina). Ou, o oligonucleotídeo aniônico é representado pela fórmula 5' (X³)₂CG(X⁴)2 3', em que C e G são não-metilados; e X³ é selecionado do grupo que consiste em A, T ou G; e X⁴ é C ou T. O oligonucleotídeo de CpG pode estar modificado no terminal 5' com um tioato de fósforo ou um 20 glicopolímero de tiol-acetamido.³⁴

De modo especialmente preferido, o oligonucleotídeo de CpG é selecionado de um grupo que consiste em 5 TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT 3' (CpG1) SEQ ID NO: 1, um oligômero com comprimento de 32 bases, e 5'nTC GTC GTT TTG TCG TTT TGT CGT T 3' 25 (CpG2) SED ID NO: 2, um oligômero com comprimento de 24 bases, mais um grupo de ponte de tioato de fósforo (designado por n no terminal 5').

Além disso, é sabido que as seqüências de DNA derivadas de dinucleotídeos de citosina-guanina não-metilados (CpG) ativam linfócitos e podem intensificar as respostas imune de um paciente, inclusive respostas 30 de IL-6, TNF-α, IL-12, IFN-γ³³. Essas moléculas representam substratos complementares preferidos, que podem tanto estabilizar os imunógenos de peptídeo catiônico sintético como obter um novo sistema de distribuição de

imunógeno, com base nessas conclusões. Os complexos imunoestimuladores, estabilizantes, da presente invenção também obtêm autofavorecimento das respostas imune in vivo, sem diluição significativa no local da injeção.

A formação de complexos imunoestimuladores distintos, deriva5 dos de imunógenos de peptídeo catiônico é, principalmente, uma função de neutralização de carga. Espera-se que complexos estáveis possam ser formados de moléculas de DNA imunoestimuladoras, contendo CpG, derivadas tanto de seqüências de nucleotídeos naturais como modificadas sinteticamente. Além disso, podem ser realizados aperfeiçoamentos na estabilidade 10 de um complexo imunoestimulador aumentando a carga catiônica que reside no imunógeno de peptídeo. Os mesmos incluem prolongar os peptídeos com lisina, arginina ou histidina adicional ou outros componentes sintéticos, que conferem uma carga positiva ao peptídeo modificado em uma solução aquosa, tal como descritos acima.

Espera-se que seqüências imunoestimuladoras contendo nãoCpG (ISS) sejam identificadas e que seja considerado que esses substratos de DNA de filamento único podem revelar-se como sendo materiais úteis para formar complexos imunoestimuladores dos mesmos, quando combinados com imunógenos de peptídeos catiônicos sintéticos em solventes aquo20 sos apropriados.

Motivos de CpG modificados também estão previstos, sendo que um DNA de filamento único aniônico, definido, foi conjugado quimicamente a uma oura molécula biologicamente funcional, tal como lectinas, açúcares ou lipídeos para intensificar a absorbância e amanchamento de objetivo especí25 ficos da célula, ou polímeros, copolímeros e copolímeros de enxerto, tal como PEG, para circulação aperfeiçoada in vivo. O DNA conjugado quimicamente pode ser polianiônico e pode, subseqüentemente ser complexado com um imunógeno de peptídeo catiônico, para obter um complexo imunoestimulador modificado, com propriedades físicas ou biológicas potencial30 mente novas.^34,35

Considera-se que copolímeros de bloco e de enxerto, derivados de oligômeros polianiônicos e polietilenoglicol, representam outra classe de

moléculas aniônicas, que também podem oferecer estabilidade aperfeiçoada e facilitação aperfeiçoada.

Em outro aspecto desta invenção, um complexo imunoestimulador pode ser preparado de um oligonucleotídeo de CpG modificado, em que 5 um tioato de fósforo adicional ou outro grupo de ponte foi adicionado ao terminal 5' do oligômero, para complexação aperfeiçoada.

Preferivelmente, os complexos imunoestimuladores têm uma distribuição de tamanho de partícula agregada, média, na faixa de aproximadamente 1 a 50 μηι. Mais preferivelmente, os complexos imunoestimula10 dores têm uma distribuição de tamanho de partícula agregada, média, na faixa de aproximadamente 1 a 30 pm. De modo especialmente preferido, os complexos imunoestimuladores têm uma distribuição de tamanho de partícula agregada, média, na faixa de aproximadamente 1 a 15 pm.

Existem indicações de que o número de repetições de motivo de 15 CpG influencia o grau de facilitação intrínseca e estimulação imunológica, sendo necessário um número mínimo de repetições de CpG. Além disso, existem fortes indicações de que a escolha de bases de nucleotídeo flanqueadoras, adjacentes ao CpG, é muito importante, pois isso parede causar um impacto direto sobre a facilitação em uma maneira específica para as 20 espécies.¹⁰·³⁶ Por exemplo, foi demonstrado por Kreig et al.¹³ que ocorria atividade imunoestimuladora intensificada de células humanas quando oligonucleotídeos contendo motivos de CpG são representados pela fórmula X¹X²CGX³X⁴, em que C e G eram não-metilados e X¹X² foram selecionados dos grupos GpT, GpG, GpA e ApA e/ou X³X⁴ foram selecionados dos grupos 25 TpT, CpT e GpT.

Embora oligonucleotídeos de CpG possam funcionar como mitógenos de células B³⁷ e sejam adjuvantes úteis, foi demonstrado que as respostas imune geralmente têm um pico 2 semanas após a administração para um antígeno misturado com oligonucleotídeos de CpG em uma forma solú30 vel. Isso necessita de múltiplas repetições de injeções para manter títulos de anticorpos altos, para garantir proteção.³⁸ Portanto, um método para distribuição eficaz de complexos com esses oligonucleotídeos em uma formula20

ção de liberação controlada é altamente desejável.

Com relação à estabilidade, as ligações de fosfodiésteres na estrutura principal de CpG são sensíveis à degradação por nucleases in vivo³³. Portanto, para aperfeiçoar a duração da resposta imune, os grupos fosfato podem ser modificados para grupos tioato de fósforo.

O complexo imunoestimulador da presente invenção pode ser formulado para distribuição por numerosos caminhos, inclusive parenteral, mucosal e transdérmico. O complexo imunoestimulador da presente invenção é particularmente desejável para formulações de vacina pelo fato de que os oligonucleotídeos de CpG no complexo são adjuvantes úteis para regular para cima tanto respostas parenterais como mucosais in vivo. ⁴⁰¹⁴¹

Os resultados de nossas experiências mostram que o tamanho de partícula agregado do complexo imunoestimulador varia com base na relação de imunógeno de peptídeo para o oligonucleotídeo de CpG. A estabilidade intrínseca do complexo imunoestimulador e a capacidade para controlar o tamanho da composição aumenta o potencial para fagocitose por uma via parenteral.¹⁹ A imunização mucosal tomando como objetivo células específicas, tal como células M localizadas em Placas de Peyer por intermédio da via oral²¹ ou o tecido linfóide nasal associado (NALT) por intermédio da via intranasal²³ é igualmente facilitada pelo uso do imunógeno estabilizado da presente invenção.

O complexo imunoestimulador da presente invenção é preparado por um processo de autoconstrução controlado, em que o oligonucleotídeo de CpG aniônico em solução aquosa é adicionado a uma solução aquosa do imunógeno de peptídeo catiônico. Soluções aquosas apropriadas para a preparação de um complexo imunoestimulador são selecionadas do grupo que consiste em água desionizada destilada (DDW), solução salina normal (NS) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). Água desionizada destilada e solução salina normal tipicamente apresentam um pH de aproximadamente 5,5, sendo que em PBS o pH é controlado em uma faixa de 7,2

7,4. O processo de complexação é uma função das relações de carga, do peso molecular dos eletrólitos em interação, pH e potência iônica do meio.³² • ·· ····

Moléculas aniônicas carregadas de modo múltiplo, tal como os oligômeros de CpG curtos, possuem uma carga negativa líquida quando o pH está na faixa de 5,5-7,4 em soluções aquosas. A carga líquida no imunógeno de peptídeo é dependente da composição de aminoácidos do peptídeo e pode ser afetada pelo pH da solução aquosa. Portanto, o meio aquoso é selecionado para garantir uma carga positiva líquida para complexação eficaz. Um exame do ponto de ionização (IP) ou ponto de carga zero para os peptídeos individuais pode orientar o processo de seleção. Em geral, o IP é determinado pelo movimento da molécula através de um gradiente de pH em um ensaio de focalização isoelétrico.¹¹ Para garantir que um peptídeo esteja carregado positivamente, o pH do meio aquoso selecionado deve ser menor que o ponto isoelétrico para o peptídeo em questão.

Para preparar um complexo imunoestimulador, são seguidas as seguintes etapas. Em primeiro lugar, a contribuição de carga positiva molar média é determinada para um imunógeno de peptídeo desejado ou para um coquetel de imunógenos de peptídeo, com base nas relações molares de peptídeos misturados uns aos outros e a contribuição de cada componente de peptídeo na composição de vacina final. Em segundo lugar, a contribuição de carga negativa molar é determinada para o oligonucleotídeo que está sendo complexado, com base na relação molar de oligômero e da contribuição de carga desse componente na composição de vacina final. Em terceiro lugar, a quantidade de imunógeno de peptídeo, baseada na carga positiva molar média, total, é dependente da quantidade de oligonucleotídeo usada para complexação e a carga negativa molar total do mesmo. Essa relação é usada para definir as quantidades relativas de imunógenos de peptídeo e oligonucleotídeos a ser combinadas em um solvente aquoso, para formar um complexo imunoestimulador. Um excesso do peptídeo imunógeno catiônico pode ser usado para obter uma mistura do complexo imunoestimulador e um excesso do peptídeo não-complexado. Ou um excesso do oligonucleotídeo também pode ser usado para obter um excesso do oligonucleotídeo. As quantidades relativas do imunógeno de peptídeo e do oligonucleotídeo sele cionadas estão baseadas na formulação de vacina desejada.

Finalmente, a quantidade calculada do oligonucleotídeo aniônico em um solvente aquoso compatível é adicionada por mistura às quantidades calculadas de imunógenos de peptídeo catiônicos igualmente dissolvidos em um solvente aquoso compatível. A quantidade em nmol do imunógeno de peptídeo catiônico usada está, em geral, em um âmbito para obter 8 cargas positivas a 0,5 carga positiva para a quantidade em nmol do oligonucleotídeo aniônico, para obter uma carga negativa. Isso é chamado de relação de carga. Quando a relação de carga é 8:1, há um grande excesso do imunógeno de peptídeo. Quando a relação de carga é 1:2, há um excesso moderado do oligonucleotídeo aniônico. O complexo forma-se espontaneamente na forma de uma suspensão em solução. Pode ser feita uma estimativa das quantidades residuais dos imunógenos de peptídeo ou oligonucleotídeos separando o complexo da solução e analisando as soluções sobrenadantes por espectrofotometria de ultravioleta (UV) ou por cromatografia de alto desempenho de fase inversa (RP-HPLC).

O complexo imunoestimulador, tal como preparado como uma suspensão, pode ser usado como uma composição de vacina. Se o complexo imunoestimulador for ser injetado por via parenteral, os solventes aquosos são selecionados de tal modo que a composição de vacina final seja isotônica e apropriada para essa finalidade. Em casos nos quais o complexo é primeiramente formado em água desionizada destilada, tampões aquosos com concentração de sal apropriada são adicionados, para garantir que a composição de vacina final seja isotônica.

O complexo imunoestimulador preparado como uma suspensão ou solução pode ser liofilizado. A composição liofilizada pode depois ser reconstituída e incorporada em diferentes formulações de vacina diferentes de acordo com o modo de distribuição desejado. O complexo imunoestimulador da presente invenção também pode ser formulado como uma emulsão de água-em-óleo, em combinação com uma suspensão de sal mineral ou um gel polimérico biocompatível.

De acordo com um outro aspecto da invenção, a invenção descreve um processo para isolar os complexos imunoestimuladores estabiliza-

··

·.♦· ···· *· ········ ·· · * · · · · · ····

3₇ dos como partículas estáveis por intermédio de liofilização. A reconstituição do complexo imunoestimulador estabilizado como uma suspensão em solventes aquosos ou solventes biocompatíveis não mostra, essencialmente, quaisquer alterações na distribuição do tamanho de partículas ou na potência in vivo. Isso representa uma importante vantagem sobre formulações que necessitam de refrigeração para manter a eficácia, tal como composições de vacina baseadas em alume. Essa característica amplia a utilidade potencial desses sistemas, para incluir a reconstituição direta antes da imunização e modos alternativos de distribuição, que necessitam de formas de dosagem em estado sólido estável, tal como um aerossol ou nebulização de pó seco para distribuição pulmonar ou intranasal.⁴²

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, a invenção provê diversos processos para preparar emulsões de água-em-óleo estáveis⁴³, que compreendem o complexo imunoestimulador estabilizado da presente invenção. Em uma emulsão desse tipo, a fase aquosa preferivelmente compreende o complexo imunoestimulador ou uma mistura do complexo imunoestimulador com o imunógeno de peptídeo não-complexado; e a fase oleosa contínua compreende um óleo sintético, mineral, animal ou vegetal. Adicionalmente, a fase oleosa também pode compreender um emulsificante imunoestimulador, um componente biocompatível ou metabolizável.

Em particular, os óleos úteis para preparar as emulsões de água-em-óleo da presente invenção incluem, mas não estão limitados a óleos sintéticos (por exemplo, miristato de isopropila), óleos vegetais (por exemplo, óleo de amendoim), óleos minerais (por exemplo, Drakeol® ou Marcol®), óleos animais metabolizáveis (por exemplo, esqualeno ou esqualano) e uma mistura dos mesmos. Os óleos minerais são preferidos. Os emulsificantes baseados em óleo úteis para estabilizar as emulsões incluem, mas não limitadas à família de oleatos de manida e derivados dos mesmos.

A quantidade relativa de emulsificante necessária é uma função do equilíbrio hidrófilo-lipófilo (HLB) e a estabilidade intrínseca da emulsão de água-em-óleo produzida sob condições especificadas. Métodos para escolher óleos e combinações de emulsificantes são bem-conhecidos para os • ·

versados na técnica.

A emulsão de a/o pode compreender entre 10 v/v% e 80 v/v% de água na fase aquosa interna. Para a maioria das finalidades, a concentração de água ótima está na faixa de 30 v/v% e 50 v/v%. A fase aquosa interna está constituída, caracteristicamente, de gotas muito finas, com tamanhos, tipicamente, na faixa de 1-10 pm, preferivelmente, 1-5 μιη. As preparações são estáveis quando mantidas à temperatura ambiente ou refrigeradas.

Outros agentes estabilizantes também podem ser usados para preparar a emulsão. Os mesmos incluem tensoativos, partículas coloidais, proteínas e outros agentes polimerizantes e estabilizantes, conhecidos dos versados na técnica.

A emulsão de a/o pode ainda compreender pelo menos um adjuvante lipofílico solúvel em óleo, tal como 3-O-desacil-4'-monofosforil lipídio A (MPL), N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (MDP), brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA), N,N-dioctadecil-N',N'-bis(2-hidroxietil)propanodiamina (Avridine), N-(2-deóxi-2-1 -leucilamino-p-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida hidroacetato (BAY-1005), 3p-[N-(N,N'-dimetilaminoetano)carbamoiljcolesterol (DC-Chol),NAc-Mur-L-Thr-D-isoGln-sn-glicerol dipalmitoíla (Murapalmitine) e misturas ou derivados dos mesmos. A emulsão de a/o também pode compreender na fase dispersa pelo menos um adjuvante solúvel em água, por exemplo, poli[di(carboxilatofenóxi)]fosfazeno (PCPP), Quillaja saponina (QS-21)Cholera Holotoxina (CT) ou Cholera Toxina B subunidade (CTB), Enterotoxina de E. Coli (LT), termicamente instável, ou Enterotoxina B subunidade de E. Coli (LTB), termicamente instável, e citocinas, tal como lnterleucina-1 β (IL-Ιβ), lnterleucina-2 (IL-2), lnterleucina-12 (IL-12), interferon-γ (IFN-γ) e misturas ou derivados dos mesmos. O adjuvante solúvel em água pode ser sintético ou natural. A presença de um adjuvante solúvel em água, com propriedades formadoras de filme, tal como um oligômero ou polímero, pode servir adicionalmente para estabilizar a emulsão. A emulsão de a/o pode facilitar a apresentação dos imunógenos ao sistema imune, para obter uma vacina mais eficaz.

Uma emulsão de água-em-óleo, que compreende um complexo imunoestimulador ou uma mistura do mesmo com imunógeno nãocomplexado, pode ser preparado tal como se segue. Em primeiro lugar, um complexo imunoestimulador é preparado de um imunógeno de peptídeo e um oligonucleotídeo, em uma relação que assegure a formação do complexo imunoestimulador sozinho ou em uma mistura com excesso de imunógeno de peptídeo residual em uma solução aquosa. Em segundo lugar, a solução aquosa é misturada com um óleo que contém emulsificantes e homogeneizada para obter uma emulsão de água-em-óleo, na qual a fase aquosa está dispersa em uma fase oleosa contínua. A emulsão de água-em-óleo , como tal, é apropriada para injeção parenteral.

A emulsificação da fase aquosa e da fase oleosa pode ser realizada por homogeneização ou por transferência entre duas seringas ou por extrusão dos componentes através de um filtro de membrana com tamanho de poros controlado. Os métodos semimanuais, de baixa energia, são rápidos. Porém, como há consideravelmente menos cisalhamento do que em outros processos, a emulsão produzida não é tão fina quanto a que é produzida usando sistemas mecânicos de alto cisalhamento. Exemplos de sistemas de alto cisalhamento incluem rotoestatores, microfluidificadores e sonificadores. Outros dispositivos semelhantes a esses sistemas de alto cisalhamento, que são bem-conhecidos para emulsificação, também podem ser usados.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, a invenção provê diversos processos para preparar suspensões fisiologicamente aceitáveis de sais minerais, que compreendem o complexo imunoestimulador estabilizado da presente invenção. Em um sistema misto desse tipo, a fase aquosa compreende uma suspensão de combinação de sal mineral e complexo imunoestimulador, que pode conter, adicionalmente, imunógenos de peptídeo residuais, não-ligados, em solução.

Em particular, os sais minerais úteis pra preparar as suspensões baseadas totalmente em água da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, hidróxido de alumínio (por exemplo, Alhydrogel®, Rehydragel • ·

HPA®, Rehydragel LV®, fosfato de alumínio (por exemplo, Adju-phos® ou Rehyraphos®) ou fosfato de cálcio (por exemplo, Calphos®) e misturas dos mesmos.

Métodos para escolher sais minerais e determinar a concentração preferida do sal mineral a ser usada ou combinações dos mesmos são bem-conhecidos daqueles versados na técnica.

Outros agentes estabilizantes também podem ser usados para preparar a suspensão de sais minerais. Os mesmos incluem tensoativos, antioxidantes, tampões fisiologicamente aceitáveis, tonificantes, conservantes e outros agentes conhecidos daqueles versados na técnica.

A suspensão de sais minerais pode compreender, ainda, pelo menos um adjuvante adicional (por exemplo, MPL, MDP, DDA, N,N-Avridine, BAY-1005, DC-Chol, Murapalmitine, PCPP, QS-21, CT ou CTB, LT ou LTB e citocinas, tal como IL-1 β, IL-2, IL-12, IFN-γ e misturas e derivados dos mesmos). O sal mineral pode facilitar a apresentação dos imunógenos ao sistema imune na forma de um reservatório ou atrair células específicas do sistema imune por um processo conhecido por quimiotaxia.

Uma suspensão de sais minerais que compreende um complexo imunoestimulador ou uma mistura de complexo imunoestimulador,em combinação com imunógenos não-complexados residuais, pode ser preparada tal como se segue. Em primeiro lugar, um complexo imunoestimulador é preparado de um imunógeno de peptídeo e um oligonucleotídeo em uma relação de carga que assegure a complexação completa de todos os imunógenos de peptídeo e do oligonucleotídeo em solução. Alternativamente, um complexo imunoestimulador é preparado de um imunógeno de peptídeo e um oligonucleotídeo em um relação de carga que assegure a complexação parcial dos imunógenos de peptídeo e componentes de oligonucleotídeo em solução; em segundo lugar, a suspensão aquosa é combinada com uma suspensão de sais minerais, por mistura, para obter uma suspensão aquosa completa de todos os componentes. A combinação de suspensão, como tal, é apropriada para injeção parenteral.

Em um método complementar, uma suspensão de sais minerais,

que compreende um complexo imunoestimulador ou mistura de imunógenos de peptídeo não-complexados, pode ser preparada tal como se segue. Em primeiro lugar, o imunógeno de peptídeo é misturado com uma suspensão de sais minerais. Dependendo das propriedades físicas do sal mineral, dos imunógenos de peptídeo e do tampão aquoso, diversas proporções de imunógeno podem ser absorvidas diretamente pelo sal mineral nesse estágio; em segundo lugar, a essa suspensão é adicionado um oligonucleotídeo, com agitação. Resulta uma complexação parcial ou total dos imunógenos de peptídeo residuais, não-ligados, em solução. A combinação de suspensão, como tal, é apropriada para injeção parenteral. Na Figura 16, são mostrados os dois métodos de preparação.

De acordo com outro aspecto desta invenção, é provido um processo para preparar um polímero biodegradável, gelificante in situ, no qual um complexo imunoestimulador estabilizado ou uma mistura de um complexo imunoestimulador estabilizado e imunógeno não-complexado é dispersa. O complexo imunoestimulador pode ser disperso ou em solução ou como uma suspensão dentro de um solvente biocompatível. O solvente biocompatível pode compreender, ainda, um adjuvante solúvel, que é sintético ou natural. A solução ou suspensão no polímero biodegradável, gelificante, está prevista para a distribuição do imunógeno a um hospedeiro. O polímero gelificante in situ é biodegradável e é um copolímero de poli-D,L-lactídeo-coglicolídeo (PLG) e poli-D,L-ácido láctico-co-ácido glicólico (PLGA), com um peso molecular na faixa de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 100.000 dáltons e uma viscosidade inerente de aproximadamente 0,2 a 1,0 dl/g. A fórmula do polímero gelificante in situ é:

R1 = O-alquila(PLG) ou OH (PLGA) R2 = H, na qual R1 é OH ou alcóxi, com 1 a 5 carbonos e R2 é H; x:y é a relação de cada unidade de monômero do copolímero, com x+y=1.

• ·

No caso de PLG, R1 é alcóxi e as unidades de monômero são lactídeo e glicolídeo e, no caso de PLGA, R1 é OH e as unidades de monômero são ácido láctico e ácido glicólico.

O complexo imunoestimulador estabilizado ou uma mistura do mesmo com o imunógeno não complexo,com o polímero gelificante in situ, pode ser preparado como uma fase única ou como uma suspensão em um solvente biocompatível.

O solvente biocompatível útil na presente invenção é selecionado do grupo que consiste em dimetil sulfóxido (DMSO), N-metil pirrolidina (NMP), triacetina e glicerina. É preferido DMSO. DMSO tem uma alta capacidade de solubilizar uma grande quantidade em porcento em peso do polímero. Tem sido amplamente usado como solvente para a gelificação in situ de polímeros. DMSO também pode ser usado para preparar uma suspensão do complexo imunoestimulador estabilizado da presente invenção.

De forma importante, foi demonstrado em modelos animais que há uma alta tolerância para DMSO quando usado em pequenas quantidades.⁴⁴. Portanto, preocupações com toxicidade são mínimas quando DMSO é administrado por intermédio de uma via parenteral.

Os polímeros biodegradáveis apropriados para a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, família de poliésteres de PLA ou PLGA. Esses materiais podem ser dissolvidos em diversos solventes biocompatíveis a uma concentração em uma faixa de 5 p/p % - 50 p/p %. Vários fatores físicos podem influenciar a quantidade prática de polímero, que pode ser dissolvido no solvente biocompatível. Os mesmos incluem a constituição, peso molecular, viscosidade intrínseca e cristalinidade do polímero. Para o coquetel de PLG/PLGA de copolímeros, esses fatores são altamente variáveis. Por exemplo, homopolímeros de poli D,L-ácido láctico (PLA) ou poli D,L-lactídeo (PL) e copolímeros de PLG ou PLGA, com blocos longos do componente de monômero de ácido láctico, são materiais altamente cristalinos, com viscosidades intrínsecas relativamente altas.

A percentagem em peso relativa desses materiais cristalinos, que podem ser solubilizados, é nitidamente mais baixa do que a de análogos

de PLG ou PLGA amorfos, sendo que a relação dos componentes de ácido láctico para ácido glicólico é aproximadamente igual, 1:1. Considera-se que a diferença na quantidade total de polímero que pode ser administrada por injeção, terá um impacto acentuado sobre a razão de degradação da matriz 5 e afetará a cinética de liberação para imunógenos encapsulados. Considerase que seja possível variar as misturas de polímeros e copolímeros fisicamente compatíveis com propriedades físicas variáveis em solventes biocompatíveis, para obter novos efeitos biológicos.

Outros polímeros biodegradáveis, apropriados para a presente invenção, são considerados e incluem, mas não estão limitados a, policaprolactonas, polianidridos, poliortoésteres e poli(a-ácido hidroxibutírico). Esses polímeros podem ser solubilizados em solventes biocompatíveis a percentagens em peso úteis e fornecem substratos formadores de matriz úteis.

De acordo com a presente invenção, é provida uma preparação de vacina de liberação controlada ou retardada, em forma estável, junto com um método para preparar uma preparação de vacina desse tipo. A matriz de gel da composição de vacina de liberação controlada ou retardada compreende um polímero biodegradável, selecionado do grupo que consiste em poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo (PLG) e poli-D,L-ácido láctico-co-ácido glicóli20 co (PLGA), policaprolactonas, polianidridos, poliortoésteres e poli(a-ácido hidroxibutírico), um solvente biocompatível e um complexo imunoestimulador estabilizado.

O gel polimérico pode compreender, ainda, pelo menos um adjuvante adicional, por exemplo, MPL, MDP, DDA, Ν,Ν-Avridine, BAY-1005, 25 DC-Chol, Murapalmitine, PCPP, QS-21, CT ou CTB, LT ou LTB ou uma citocina, tal como IL-1 β, IL-2, IL-12, IFN-γ e misturas e derivados dos mesmos.

As vantagens da composição de liberação controlada da presente invenção incluem:

(a) uma formação de gel, totalmente biodegradável e biocompa30 tível;

(b) uma liberação contínua do imunógeno para apresentação às células causadores de imunidade, resultando em uma imunogenicidade • ·

aperfeiçoada;

(c) uma alta carga do gel com um imunógeno desejado em uma composição estável; e (d) um modo de distribuição flexível, que inclui uma suspensão de um complexo imunoestimulador estabilizado, que é auto-adjuvante.

O peso molecular e a cristalinidade do polímero têm impacto direto sobre a eficácia de retenção in vivo. O material polimérico gelificante é miscível em solventes apróticos polares, tal como DMSO. Porém, ao ser injetado por via intramuscular ou subcutânea, o DMSO é extraído para os teci10 dos corporais circundantes, sendo que água penetra reversivelmente na solução rica em polímero. Esse processo serve como o mecanismo principal para controlar a formação de gel in situ. A velocidade à qual esse processo de desenvolve afeta diretamente o irrompimento inicial de liberação do imunógeno durante o intervalo de tempo quando o solvente biocompatível é 15 extraído ativamente para dentro do tecido corporal e trocado com soluções fisiológicas e antes da retenção do imunógeno pela formação do gel.⁴⁵ É sabido que controlar o processo de cristalização é um mecanismo chave importante, pelo qual a retenção de imunógenos dentro do gel pode ser aperfeiçoada.⁴⁶ Isto está intimamente ligado à morfologia interna do gel formado, 20 que limita as vias de difusão pelos quais os imunógenos podem ser liberados.

Os complexos imunoestimuladores fixados ou retidos são subseqüentemente liberados do gel em quantidades limitadas, de um modo contínuo, com uma descarga maior liberada quando a massa do polímero 25 formador da matriz é erodida. Isso varia na dependência de muitas das mesmas condições que influenciam a gelificação, tal como peso molecular, grau de cristalinidade, constituição, hidrofobicidade, e da presença de aditivos.

O potencial de uma resposta toxicológica adversa ao solvente

DMSO foi abordado em um estudo recente⁴⁴ no qual um dispositivo contendo um hormônio de peptídeo suspenso em DMSO foi cirurgicamente implantado subcutaneamente em um cão e em um ser humano. O volume de • ·

• · ···· ·· • · · · • · · · • · · ·

DMSO usado no estudo foi de 150 μΙ. O implante foi configurado para liberar o peptídeo pelo decurso de 1 ano e removido cirurgicamente no final do estudo. Nem no cão nem no ser humano foram observadas quaisquer reações de tecido adversas. A liberação controlada da mistura de peptídeo/DMSO do implante para tecidos fisiológicos é útil como modelo para avaliar preocupações de toxicidade potenciais para uma composição polimérica gelificante in situ, totalmente biodegradável. Estima-se que a quantidade de DMSO útil na presente invenção seja essencialmente a mesma como a usada no estudo.

Espera-se que haja uma extração inicial do complexo imunoestimulador em DMSO para o tecido corporal antes que o limite de solubilidade do polímero seja excedido. Ocorre a solidificação, retardando a liberação do complexo imunoestimulador estabilizado. Subseqüentemente, o complexo imunoestimulador estabilizado é liberado junto com DMSO por vias de difusão controlada ou retido no gel, com uma razão de liberação que é uma função das propriedades do polímero. É evidente que a difusibilidade dessas moléculas dentro do gel é governada por vários fatores, tal como a morfologia interna do gel e porosidade, o grau de penetração de água no gel e a hidrólise da massa do polímero.⁴⁵

No caso do complexo imunoestimulador estabilizado da presente invenção, que está disperso como uma suspensão através do gel, a extração inicial é, em grande parte, a do DMSO, com uma pequena quantidade do complexo imunoestimulador localizada próxima à frente de gelificação. Portanto, a pequena quantidade do complexo imunoestimulador, não retida eficazmente durante a fase de gelificação inicial, seria responsável pela preparação inicial da resposta imune in vivo. Subseqüentemente, espera-se que o DMSO continue a ser liberado por difusão, sendo que a massa do complexo imunoestimulador permanece retida na matriz de gel até que a massa do polímero tenha sido hidrolisada suficientemente, para resultar em uma liberação total do complexo imunoestimulador encapsulado.

Especificamente, géis poliméricos formulados de polímeros com peso molecular mais alto e mais cristalinos, derivados de ácidos a-hidróxi, se degradam por um período de tempo mais longo do que análogos amor• ·· · ··· ·«

fos, com peso molecular mais baixo. É sabido que esse fenômeno está associado à acessibilidade de água para as ligações de éster hidroliticamente instáveis.

Foi estabelecido que copolímeros amorfos aleatórios, compostos de 50% de D,L-lactídeo e 50% de glicolídeo, com um peso molecular na faixa de 8.000-50.000 dáltons, apresentam as razões de degradação mais altas. 50% em peso ou menos do polímero permanecem após aproximadamente 6-8 semanas, quando imersos em um tampão de PBS.⁴⁷

É desejável modificar os parâmetros que controlam a razão de gelificação, a cinética de liberação de imunógeno e a morfologia interna do gel. Especificamente, o uso de diversos agentes formadores de poros, plastificantes e estabilizadores, tal como tensoativos, açúcares, proteínas, polímeros e outros excipientes conhecidos daqueles versados na técnica, são úteis para esse fim.

As preparações são estáveis quando refrigeradas ou à temperatura ambiente. A composição de vacina da presente invenção, que usa DMSO, congela quando refrigerada, uma vez que o ponto de congelamento de DMSO é de aproximadamente 18°C. Foi constatado que o degelo não causa nenhuma alteração na eficácia da vacina in vivo.

De acordo com a presente invenção, o polímero biodegradável gelificante in situ e o complexo imunoestimulador estabilizado podem ser formulados separadamente. O polímero gelificante in situ pode ser solubilizado em um solvente biocompatível em um frasco, e o complexo imunoestimulador estabilizado em forma seca em um frasco separado. O complexo imunoestimulador em forma seca pode ser preparado por secagem por pulverização ou, preferivelmente, liofilização.^{48, 49} Os complexos imunoestimuladores secos podem depois ser reconstituídos em um solvente biocompatível e distribuídos por seringa, quer como solução quer como suspensão, na solução de polímero biodegradável. A mistura é depois usada imediatamente ou logo após, para imunização.

Usar frascos separados tem uma vantagem adicional de minimizar quaisquer problemas potenciais de estabilidade. Os mesmos incluem a • ··

degradação do polímero na presença do imunógeno de peptídeo, que pode ter cadeias laterais funcionais reativas, tal como grupos amina livres ou grupos carboxilato, ⁵⁰ ou a oxidação de aminoácidos seletivos, tal como cisteína e triptofano no imunógeno de peptídeo, na presença de DMSO.¹

Para preparar uma composição de polímero gelificante in situ, reconstituível, que contém um complexo imunoestimulador, um complexo imunoestimulador é preparado tal como descrito acima. Depois, essa solução aquosa é liofilizada para formar uma composição seca. A composição seca é depois reconstituída como uma suspensão em um solvente biocompatível, que contém uma percentagem em peso calculada de um polímero gelificante, biodegradável. A composição de vacina final representa um polímero gelificante in situ e é apropriada para injeção parenteral.

As composições da presente invenção são consideradas como sendo úteis como vacinas ou para fins terapêuticos. Outros materiais biológicos que podem ser modificados para possuir carga catiônica, a pHs geralmente variando de 4,0-8,0, para complexação eficaz com oligonucleotídeos de CpG, podem incluir proteínas, miméticos de proteína, bactérias, lisatos bacterianos, vírus, lisatos celulares infectados por vírus, antígenos, anticorpos, agentes farmacológicos, antibióticos, carboidratos, lipídios, citocinas, quemocinas, aminoácidos lipidados, glicolipídios, haptenos e combinações e misturas dos mesmos.

Essas composições podem ser administradas parenteralmente, por intermédio de injeção subcutânea ou intramuscular. Quando administradas parenteralmente, a resposta imune pode ser uma resposta mediada por célula ou uma resposta de anticorpo de soro ou local, para produzir anticorpos neutralizantes. Para composições administradas mucosalmente, as respostas imune incluem, adicionalmente, uma resposta de anticorpo secrecional local.

Fica facilmente evidente para quem tem experiência na técnica que complexos imunoestimuladores também podem ser misturados em emulsões baseadas em óleo-em-água (o/w). Outras possibilidades incluem encapsulamento de complexos imunoestimuladores estabilizados dentro de

emulsões duplas de água-em-óleo-em-água (a/o/w), micropartículas poliméricas biodegradáveis, vesículas de lipídío ou estruturas de lipossomas. A maioria desses sistemas de distribuição são atraentes para o desenvolvimento de formulações de liberação contínua.

Preferivelmente, o complexo imunoestimulador de peptídeo da presente invenção pode ser usado em emulsões baseadas em a/o, usando adjuvantes baseados em óleo de SERPIC, em combinação com sais minerais, tal como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio e fosfato de cálcio ou em uma formulação gelificante in situ, de dose única, de liberação controlada, baseada em copolímeros biodegradáveis de poli-D,L-lactídeo-coglicolídeo (PLG) ou poli-D,L-ácido láctico-co-ácido glicólico (PLGA).

De modo especialmente preferido, as composições de vacina da presente invenção compreendem um complexo imunoestimulador estabilizado do imunógeno de peptídeo com o oligonucleotídeo de CpG misturado com o imunógeno de peptídeo não-complexado.

Fica claramente evidente para aqueles versados na técnica que as diversas modalidades da presente invenção têm muitas aplicações nas áreas de medicina e, em particular, vacinação, diagnóstico e tratamento de infecções por patógenos, inclusive bactérias e vírus. Outros usos da presente invenção estão descritos abaixo.

Preparação de vacinas

Composições imunogênicas, apropriadas para serem usadas como vacinas, podem ser preparadas de um complexo imunoestimulador da presente invenção, como emulsão de a/o, como suspensão em combinação com uma suspensão de sal mineral ou como um polímero gelificante in situ ou uma combinação desses sistemas, tal como descrito no presente. A composição imunogênica que contém o complexo imunoestimulador é útil para provocar um resposta imune pelo hospedeiro ao qual foi administrada. A resposta imune inclui a produção de anticorpos pelo hospedeiro.

A composição imunogênica pode ser preparada como materiais injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas, como pós ou soluções liofilizados ou secos por pulverização. A composição, que compreende o

complexo imunoestimulador pode ser misturada com tampões ou excipientes fisiologicamente aceitáveis, tal como água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol e combinações dos mesmos. A vacina pode conter ainda substâncias adicionais, tal como agentes de umectação ou emulsificação, agentes tampões de pH ou adjuvantes, para intensificar adicionalmente a eficácia da mesma. A vacina pode conter ainda substâncias biocompatíveis adicionais, especificamente em conjunção com os polímeros gelificantes in situ, tal como dimetil sulfóxido (DMSO), N-metil pirrolidina (NMP), triacetina, glicerina e polivinilpirrolidona (PVP).

A vacina da presente invenção pode ser administrada parenteralmente, por exemplo, por injeção subcutânea, intramusculr ou transdérmica. As vacinas da presente invenção podem ser administradas mucosalmente, por via oral, intranasal, retal, vaginal ou ocular.

As vacinas são administradas de um modo compatível com a formulação e em uma quantidade tal que seja terapeuticamente eficaz, protetora e imunogênica. A quantidade a ser administrada depende do paciente ou da espécie a ser tratada, incluindo, por exemplo, a capacidade do sistema imunológico do paciente ou da espécie em sintetizar anticorpos e, caso necessário, em produzir respostas imune mediadas por células.

Quantidades precisas de óleos emulsificantes, sais minerais ou polímeros gelificantes e material com atividade biológica necessária para serem administradas para efeito, dependendo do critério do clínico ou veterinário. Porém, âmbitos de dosagem são facilmente determináveis por alguém com experiência na técnica e podem ser da ordem de microgramas a miligramas. Regimes apropriados para a administração inicial e doses de reforço também são variáveis, mas podem incluir uma administração inicial seguida de administrações subseqüentes. A dosagem da vacina também pode depender da via de administração e, desse modo, variar de um hospedeiro ou espécie para outro.

EXEMPLOS

A descrição acima descreve,em geral, a presente invenção. Um entendimento mais completo pode ser obtido por referência aos seguintes • ·

exemplos específicos. Esses exemplos estão descritos apenas para fins de ilustração e não pretendem limitar o alcance da invenção. Mudanças na forma e substituição de equivalentes são considerados, quando circunstâncias podem sugerir que as mesmas são necessárias para atingir um objetivo específico. Embora termos específicos tenham sido usados no presente, esses termos devem ser entendidos em um sentido descrito e não para fins de limitação.

Métodos de química, química orgânica, química de polímeros, bioquímica de proteínas e imunologia usados, mas não descritos explicitamente nesta descrição e nesses exemplos, estão amplamente relatados na literatura científica e estão bem dentro da capacidade daqueles na técnica. Preparação do complexo imunoestimulador

Em geral, um complexo imunoestimulador de um imunógeno de peptídeo sintético e um oligonucleotídeo de CpG em soluções aquosas é preparado pela adição em gotas de uma solução de peptídeo de matériaprima em um solvente aquoso apropriado em um frasco que contém uma solução de oligonucleotídeo de CpG de matéria-prima, suavemente agitada, dissolvida em um solvente aquoso apropriado. O modo inverso de adição é igualmente eficaz. Solventes aquosos compatíveis incluem, mas não estão limitados a, água desionizada destilada, solução salina normal (NS = 0,9% de NaCI) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS = 10 mM de tampão de fosfato, 0,9% de NaCI) ou misturas dos mesmos. O processo de complexação em grande parte não é afetado por tampões fisiológicos, oferecendo flexibilidade ao escolher um sistema de solvente compatível tanto para o imunógeno de peptídeo sintético como para o oligonucleotídeo de CpG.

O complexo forma-se imediatamente e pode ser identificado visualmente pela observação de um precipitado fino suspenso em solução. A quantidade de suspensão formada desse modo é uma função das quantidades relativas do oligonucleotídeo para o peptídeo catiônico em solução. O processo de precipitação é controlado pela neutralização eletrostática de moléculas carregadas de modo oposto. Em um processo termodinâmica-

mente favorável, o DNA de filamento único polianiônico, altamente carregado, liga-se com o imunógeno de peptídeo catiônico, carregado positivamente.

O oligonucleotídeo de CpG é selecionado de um grupo que consiste em 5' TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT 3' (CpG1) SEQ ID NO: 1, um oligômero com comprimento de 32 bases, e 5'nTC GTC GTT TTG TCG TTT TGT CGT T 3' (CpG2) SED ID NO: 2, um oligômero com comprimento de 24 bases, mais um grupo tioato de fósforo (designado por n na extremidade 5'). Os oligonucleotídeos de CpG foram sintetizados por Oligo's Etc. (Wilsonville, Oregon) e são obtidos em um estado seco, liofilizado. Esses materiais foram reconstituídos no solvente aquoso apropriado, antes do uso. CpG1 possui um motivo de CpG isolado dentro de uma seqüência de 8 bases de nucleotídeo e pode oferecer uma facilitação mais forte in vivo e estabilidade aperfeiçoada, pela ligação de peptídeos catiônicos com afinidades mais altas, do que oligonucleotídeos mais curtos. Um grupo tioato de fósforo modificado no terminal 5' de CpG2 aumenta a densidade de carga negativa molar e potencialmente promove uma ligação aperfeiçoada.

Os imunógenos de peptídeo foram sintetizados e foi usado o tampão apropriado para garantir que o peptídeo seja catiônico em solução. Essa é uma consideração importante em vacinas, nas quais é desejada a complexação do imunógeno de peptídeo com o oligonucleotídeo de CpG. O ponto de ionização ou IP para cada imunógeno de peptídeo e o pH do meio são usados para orientar a escolha do tampão apropriado. O pH de uma mistura aquosa de uma solução de peptídeo de matéria-prima dissolvida em água desionizada destilada ou solução salina normal (NS) foi de aproximadamente 5,5, enquanto em solução salina tamponada com fosfato (PBS) o pH das soluções de peptídeo de matéria-prima foi significativamente mais alto, a aproximadamente 7,2. A escolha cuidadosa de sistemas de solvente aquosos é feita para garantir protonização completa para peptídeos derivados de aminoácidos com cadeias laterais fracamente básicas, especialmente, histidina.

A Tabela 1 relaciona as propriedades físicas dos imunógenos de ··

peptídeo sintéticos e oligonucleotídeos de CpG usados para formar complexos imunoestimuladores. Três objetivos de imunógeno de peptídeo exemplificados estão representados na Tabela 1. Um coquetel de dois ou três imunógenos de peptídeo ou, em um caso, uma série combinatória de peptídeos contendo análogos do peptídeo foram usados para preparar cada vacina. Cada imunógeno de peptídeo compreende dois segmentos, um epitopo de objetivo de células B e um epitopo adjuvante de T. O epitopo de Th está incluído para aperfeiçoar a imunogenicidade do imunógeno de peptídeo.

Os epitopos de células B e adjuvantes de T foram selecionados após classificar séries de peptídeos nos modelos animais apropriados. Informações detalhadas com relação à identificação e composição desses componentes podem ser encontradas por referência à patente U.S. N° 6.090.388⁵³, patente U.S. N° 5.759.551⁵⁴ e WO 99/67293⁵¹ e US 6.107.021.⁵⁷ SEQ ID NOS: 7-9 na Tabela 1 compreendem os peptídeos imunógenos de LHRH e são úteis em uma vacina para imunoterapia de câncer de próstata, criada para tratamento de ablação de hormônio. SEQ ID NOS: 10-11 são úteis em uma vacina imunoterapêutica anti-lgE, para o tratamento de alergia. SEQ ID NOS: 4-6 são úteis em uma vacina imunoterapêutica anti-CD4, para o tratamento da infecção de HIV. SEQ ID NOS: 12-13 compreendem um coquetel combinatório de peptídeos de FMD e são úteis em uma vacina anti-FMD, para imunidade protetora contra febre aftosa.

O complexo imunoestimulador da presente invenção pode ser preparado com diversas relações de peptídeos catiônicos para oligonucleotídeos de CpG, para produzir propriedades físicas diferentes, tal como o tamanho dos complexos de micropartículas. A Tabela 2 mostra a carga positiva molar média, calculada, e o peso médio da fórmula para o imunógeno de peptídeo na mistura. A Tabela 2 também apresenta a contribuição de carga negativa molar média, calculada, de CpG1 (SEQ ID NO: 1) e CpG2 (SEQ ID NO: 2), respectivamente.

Exemplo 1: Preparação do complexo imunoestimulador de imunógenos de LHRH e oligonucleotídeos de CpG1

Esse exemplo ilustra a preparação do complexo imunoestimula39

dor de imunógenos de peptídeo de LHRH e oligonucleotídeos de CpG1 em diversas proporções. Um diagrama de operações do processo da formação do complexo, tal como descrito no presente, é mostrado na Figura 1.

Todos os artigos de vidro, barras de agitação e pontas de pipetas foram autoclavados por 40 minutos a 121°C, antes do uso. Todos os reagentes foram pesados, carregados, transferidos ou adicionados a recipientes de reação em uma cobertura de corrente laminar, para evitar contaminação.

Uma solução de matéria-prima de peptídeo de LHRH foi preparada por mistura de uma relação molar de 1:1:1 de peptídeos de SEQ ID NOS: 7-9, a uma concentração de 3 mg/ml em água desionizada, destilada. 33 μΙ da solução de matéria-prima (100 pg dos imunógenos de peptídeo) foram adicionados a cada uma de uma série de frascos de 2 ml equipados com microbarras de agitação. A essa solução foi adicionado 0,5 ml de água desionizada, destilada, como diluente. Uma solução de matéria-prima de 2,0 pg/μΙ de oligonucleotídeo de CpG1 foi preparada em água desionizada, destilada. Diversas quantidades de solução de matéria-prima de oligonucleotídeo foram adicionadas a cada frasco para formar o complexo imunoestimulador. A quantidade de oligonucleotídeo de CpG1 adicionada a cada frasco foi determinada por cálculo, para obter uma relação de carga de LHRH:CpG1 variando de 8:1, com um grande excesso de LHRH, a 1:2, com um excesso de CpG1. As respectivas quantidades de CpG1 usadas para preparar essas composições são mostradas na Tabela 3. Deve ser observado que a relação de LHRH:CpG1 é representada como relações de carga molares e está baseada nos cálculos mostrados na Tabela 3.

As adições foram feitas à temperatura ambiente com agitação contínua e equilibrada por 30 min. Em todos os casos, foi observado uma turvação da mistura de reação quando da adição da solução de matériaprima de oligonucleotídeo de CpG1. Após a adição completa do oligonucleotídeo de CpG1, foi observada uma suspensão em partículas finas, brancas. As partículas gradualmente se depositaram e puderam ser facilmente ressuspensas com suaves sacudidas.

Os complexos de micropartículas sólidas podem ser essencialmente removidos depois de terem se depositados e possibilitam que as soluções sobrenadantes separadas sejam analisadas por espectroscopia por ultravioleta para imunógenos de peptídeo residuais, não-complexados (a λ = 280 nm) ou para oligonucleotídeo de CpG1 residual (a λ = 260 nm). Para os complexos imunoestimuladores preparados usando um excesso de LHRH, em que LHRH:CpG1 = 8:1, 4:1 ou 2:1, foram detectadas quantidades de peptídeo em excesso.

O resultado obtido pela espectroscopia por ultravioleta é uma estimativa e pode ser ± 20% do número obtido pelas seguintes razões. Os cromóforos de peptídeo têm coeficientes de extinção consideravelmente menores em comparação com os oligonucleotídeos de CpG e as máximas de comprimento de onda usadas para detectar os peptídeos e CpG1 estão bastante próximas uma da outra. Portanto, as estimativas para peptídeo residual livre possivelmente podem ser exageradas. Além disso, uma pequena quantidade de nanopartículas do complexo de CpG de peptídeo pode estar presente no material sobrenadante. A interpretação desses resultados é complicada adicionalmente pela observação de que aumentar a quantidade em excesso do imunógeno de peptídeo em relação ao CpG geralmente resulta em agregados complexos com tamanhos de partícula médios menores.

Da Figura 2 pode ser observado que a escala de complexos de LHRH/CpG1 com relação à distribuição de tamanhos de partículas agregadas, média, é de ordem de LHRH:CpG1 2:1 > 4:1 > 8:1. Espera-se que a eficiência do processo de complexação varie com base nas propriedades físicas dos imunógenos de peptídeo e oligonucleotídeos de CpG selecionados e na proporção relativa de cada um na composição de vacina. Para o sistema de LHRH:CpG1, os níveis residuais de peptídeo não-complexado, tais como determinados pela espectroscopia por UV variam de 60-90% (LHRH:CpG1 = 8:1), 40-80% (LHRH:CpG1 = 4:1) e 25-65% (LHRH:CpG1 = 2:1) sobre a base, respectivamente. Para o complexo de LHRH:CpG1 preparado a uma relação de carga de 1:1 havia muito pouca concentração detectável de imunógeno de peptídeo residual, ~3%, ou oligonucleotídeo de CpG • ·

residual, ~2%. O grande aumento no tamanho de agregado desse complexo, associado à complexação essencialmente completa do imunógeno é coerente com o comportamento do polieletrólito esperado à carga neutra. Para a relação de carga de LHRH:CpG1 = 1:2 do complexo imunoestimulador, foi encontrado um excesso de CpG1, 48% de nível residual de CpG1 a λ = 260 nm. Essa quantidade de CpG1 residual aproxima-se da quantidade de CpG1 esperada se o primeiro equivalente de CpG1 foi totalmente complexado com o imunógeno de peptídeo em solução.

Os resultados do método de UV demonstram que composições de complexo imunoestimulador preparadas com um alto excesso de peptídeo para oligonucleotídeo (por exemplo, relação de carga de LHRH:CpG1 = 8:1) resulta em uma quantidade significativa de peptídeo livre em solução. De modo similar, complexos imunoestimuladores preparados com um excesso moderado de oligonucleotídeo para peptídeo (por exemplo.relação de carga de LHRH:CpG1 = 1:2) resultam em composições com excesso de oligonucleotídeo livre. A presença de oligonucleotídeo em excesso pode servir para estabilizar agregados menores, tal como mostrado na Figura 2.

Esse exemplo demonstra que podem não haver vantagens práticas em preparar o complexo imunoestimulador com um alto excesso de LHRH, relação de carga de LHRH:CpG1 = 8:1, em que uma quantidade significativa de peptídeo permanece livre em solução. De modo similar, não há vantagem prática no complexo imunoestimulador preparado com um excesso moderado de CpG1, relação de carga de LHRH:CpG1, em que é razoável presumir que após complexação completa no ponto de neutralidade elétrica, oligonucleotídeo em excesso pode servir apenas para estabilizar os agregados, tal como mostrado na Figura 2. Esse resultado revela que moléculas e/ou polímeros aniônicos compatíveis podem ser adicionados seqüencialmente a um complexo eletricamente neutro pré-formado em 1:1, afim de reduzir o tamanho de partícula eficaz da composição. Isso apresenta uma nova estratégia para complexação imunoestimuladora completa associada a controle de tamanho de partícula.

É um objeto desta invenção ligar eficazmente os imunógenos de • ·

peptídeo em solução para determinadas aplicações, para maximizar a estabilidade da vacina in vivo. Desse modo, é preferido um complexo imunoestimulador com relações de carga de imunógenos de peptídeo para oligonucleotídeos de CpG variando de 4:1 a 1:1, respectivamente. É um outro objeto desta invenção maximizar a facilitação do complexo imunoestimulador in vivo usando partículas menores, mais separadas (~10 mícrons ou menos) para apresentação ao sistema imune.

Foi constatado que a presença de peptídeo residual livre e nãocomplexado é mais desejável para formulações de vacina mais complexas, tais como emulsões de água-em-óleo ou absorbância em sais minerais. Nessas formulações, a facilitação das respostas imune pode resultar de imunógenos ligados como complexo imunoestimulador e também de imunógenos não-complexados dispersos dentro da emulsão de a/o ou adsorvidos diretamente no sal mineral. Desse modo, foi constatado que os complexos imunoestimuladores preparados com relações de carga de imunógenos de peptídeo para oligonucleotídeos de CpG variando de 8:1 a 2:1 são úteis para essas aplicações.

Mais preferivelmente, é encontrada uma combinação de complexação de peptídeo máxima, para estabilidade, e tamanho de partícula pequeno, para facilitação aperfeiçoada, para complexos imunoestimuladores preparados com relações de carga de imunógenos de peptídeo para oligonucleotídeos de CpG variando de 4:1 a 2:1.

Complexos imunoestimuladores especialmente preferidos são os preparados para possuir propriedades físicas, que os tomem apropriados para modalidades de distribuição alternativas. Especificamente, os tamanhos de partícula médios na ordem de 10 mícrons ou menos são desejáveis, particularmente, para distribuição retal, vaginal, oral e nasal.

Exemplo 2: Quantificação da eficácia da complexação de peptídeo de imunógeno e oligonucleotídeo por RP-HPLC

Esse exemplo ilustra um método preferível para determinar a eficácia da complexação com relação aos componentes de vacina de imunógeno de peptídeo e oligonucleotídeo usando cromatografia de líquido

de alto desempenho de fase inversa (RP-HPLC). Essa técnica permite a quantificação de cada peptídeo individual residual, não-complexado, em um coquetel de mistura de peptídeos, a ser separados e identificados (a λ = 226 nm) e pode ser usada para verificar a complexação total do oligonucleotídeo de CpG (a λ = 260 nm). Os complexos de micropartículas sólidas podem ser separadas da solução sobrenadante por centrifugação seguida de filtração. Dois programas de RP-HPLC separados são executados em amostras de material sobrenadante para identificar e quantificar imunógenos de peptídeo de LHRH e oligonucleotídeos de CpG1 residuais em solução.

O(s) peptídeo(s) foram decompostos por cromatografia de líquido de alto desempenho (HPLC) usando o Vydac 4.6 x 250 mm coluna C-18, cat. número 218TP54, com um gradiente de 95% da solução A (0,05% de TFA em água de qualidade de HPLC) e 5% de solução B (0,05% de TFA em acetonitrila de qualidade de HPLC) para 24% de solução A e 76% de solução B em 40 minutos, à velocidade de corrente de 1 ml/minuto. A absorbância de comprimento de onda de UV foi monitorada a 226 nm. A identidade de peptídeo foi determinada pelo tempo de retenção, usando peptídeos padrão.

O(s) oligonucleotídeo(s) foram decompostos por cromatografia de líquido de alto desempenho (HPLC) usando o PerSeptive Biosystem 4.6 x 100 mm, coluna Oligo R3, cat. número R330-050.com um gradiente de 95% da solução A (0,1 M de TEAA em água de qualidade de HPLC, pH=8) e 5% de solução B (acetonitrila de qualidade de HPLC) para 24% de solução A e 76% de solução B em 40 minutos, à velocidade de corrente de 1 ml/minuto. A absorveção de comprimento de onda de UV foi monitorada a 260 nm. A identidade de peptídeo foi determinada pelo tempo de retenção, usando oligonucleotídeos padrão.

Complexos imunoestimuladores de LHRH e CpG1, que variam de 8:1 a 1:1, foram preparados para este estudo tal como descrito no Exemplo 1 e no Exemplo 11. As respectivas quantidades de CpG1 usadas para preparar essas composições são mostradas na Tabela 3 e na Tabela 9. Deve ser observado que a relação de LHRH:CpG1 é representada como relações de carga molares e está baseada nos cálculos mostrados na Ta• ·

bela 3 e na Tabela 9.

Para os complexos imunoestimuladores preparados usando um excesso de LHRH, em que LHRH:CpG1 = 8:1, 4:1 ou 2:1, quantidades nãoequivalentes do peptídeo residual foram detectadas por RP-HPLC nas solu5 ções sobrenadantes indicando que o processo de complexação é seletivo. Essa técnica possibilita uma classificação dos imunógenos de peptídeo de LHRH, com preferências por oligonucleotídeo de CpG1 em solução, com base na afinidade de ligação. Em todos os casos, não pôde ser detectado nenhum oligonucleotídeo de CpG1 não-complexado, residual, por RP-HPLC, 10 indicando complexação total desse componente.

Para o complexo imunoestimulador preparado usando uma quantidade equivalente de LHRH para oligonucleotídeo baseado na relação de carga (LHRH:CpG1 = 1:1), não foi detectado, essencialmente, nenhum peptídeo e nenhum CpG1 por RP-HPLC indicando complexação total de to‘ 15 dos os componentes.

O conjunto completo de resultados para essas análises está representado na Tabela 8. É claro que a ligação de imunógenos de peptídeo de LHRH com oligonucleotídeo de CpG1 pode ser classificado como p607E > p667 > p500. Os três peptídeos têm pontos de ionização quase idênticos e 20 todos os três estão carregados positivamente, tal como calculado na Tabela

1. A preferência de oligonucleotídeo de CpG1 por p607E (carga de +4) sobre p667 (carga de +5), ambos os quais são preferidos a p500 (carga de +4), está possivelmente relacionada com o peso molecular e as cargas de distribuição dentro desses peptídeos.

Exemplo 3: Preparação de complexo imunoestimulador seco

Esse exemplo ilustra o procedimento usado para preparar um complexo imunoestimulador em estado seco.

Suspensões de complexos de LHRH/CpG1, preparadas tal como descrito no Exemplo 1, em 0,5-1,0 ml de solvente aquoso, água desionizada 30 destilada, solução salina normal ou solução salina tamponada com fosfato, foram postas em um banho de gelo seco/acetona e congeladas por 15 minutos. As amostras congeladas foram depois postas em um secador por

congelação (Vertis 25 LEZ) e a água foi removida por sublimação a 26,66 Pa (200 militorr) por três dias. Esse procedimento forneceu um produto acabado vítreo, praticamente transparente, no frasco. A aparência do sólido residual recuperado depende do solvente aquoso usado e pode variar de um vidro praticamente transparente até um sólido macio branco.

A reconstituição dos materiais secos no mesmo volume de solvente aquoso, regenerou uma suspensão de partículas separadas. As distribuições de tamanhos de partículas, determinadas tal como descrito no Exemplo 2, essencialmente não mostraram nenhuma alteração.

Isso demonstrou que o processo de secagem e ressuspensão não afeta as propriedades físicas dos complexos imunoestimuladores preparados. Desse modo, uma composição de vacina, que compreende os complexos imunoestimuladores da presente invenção, pode ser obtida na forma de uma suspensão, um sólido ou um pó seco.

Exemplo 4a: Preparação de Emulsões de áqua-em-óleo usando homogeneização por alto cisalhamento

Esse exemplo ilustra o processo da preparação de uma emulsão de água-em-óleo (a/o) de peptídeos catiônicos derivados de imunógenos de peptídeo de LHRH (SEQ ID NOS: 7-9 em uma relação molar de 1:1:1 em solução), imunógenos de peptídeo de IgE (SEQ ID NOS: 10-11 em uma relação molar de 2:1 em solução), imunógenos de peptídeo de C4 (SEQ ID NOS: 4-6 em uma relação molar em solução) ou complexo imunoestimulador derivado de imunógenos de LHRH, IgE ou CD4 e oligonucleotídeos de CpG1 ou CpG2 em diversas proporções, usando técnicas de homogeneização. Um diagrama de operações que ilustra o processo da formação de emulsão por intermédio de homogeneização, tal como descrito no presente, é mostrado na Figura 3.

Todos os artigos de vidro, barras de agitação e pontas de pipetas foram autoclavados por 40 minutos a 121 °C, antes do uso. Todos os reagentes foram pesados, carregados, transferidos ou adicionados a recipientes de reação em uma cobertura de corrente laminar, para evitar contaminação.

As emulsões de a/o foram otimizadas quanto à estabilidade, no que se refere à relação de volume da fase aquosa para a fase oleosa necessária. Para composições que usaram óleos Montanide® ISA 720 (SEPPIC, Inc.), a relação de água para óleo foi de 30:70 em volume. Para composições que usaram óleos ISA Montanide®51 ou ISA Montanide® 50v (SEPPIC, Inc.), a relação de água para óleo foi de 50:50 em volume.

Exemplo 4b: Preparação de emulsões de água-em-óleo de ISA Montanide® 720 e complexo imunoestimulador

A um recipiente de 10 ml foram adicionados 3,333 gg de imunógenos de peptídeo dissolvidos em um tampão aquoso apropriado (1,111 μΙ, 3 mg/ml) ou um complexo imunoestimulador preparado de 3,333 gg de imunógenos de peptídeo dissolvidos em um tampão aquoso apropriado (1,111 μΙ, 3 mg/ml) e oligonucleotídeos ou de CpG1 ou de CpG2. A Tabela 3 e a Tabela 4 mostram os cálculos pra determinar quantidades relativas de cada reagente usado.

Especificamente, para preparar um complexo imunoestimulador de imunógenos de peptídeo de LHRH, a uma relação de carga de LHRH:CpG1 de 4:1, foram usados 244 pg de oligonucleotídeo de CpG1 (122 μΙ, 2,0 μρ/ηΐΙ).

Especificamente, para preparar um complexo imunoestimulador de imunógenos de peptídeo de IgE, a uma relação de carga de lgE:CpG1 de 4:1, foram usados 387 μg de oligonucleotídeo de CpG1 (193,5 μΙ, 2,0 pg/μΙ). Para formar um complexo neutro de 1:1 de lgE:CpG1, foram usados 1,548 pg de oligonucleotídeo de CpG1 (774,0 μΙ, 2,0 μg/μl).

Especificamente, para preparar um complexo imunoestimulador de imunógenos de peptídeo de CD4, a uma relação de carga de de 2:1 CD4:CpG2, foram usados 402 μg de oligonucleotídeo de CpG2 (201 μΙ., 2,0 μg/μl). Para formar uma relação de carga de 1:2 de CD4:CpG2, foram usados 1608 μg de oligonucleotídeo de CpG2 (804 μΙ, 2,0 μg/μl).

A cada um dos recipientes foi adicionado solvente aquoso, diluente, adicional, de modo que o volume final da fase aquosa foi fixado em 3,0 ml para preparação de emulsões de a/o de ISA Montanide® 720, respecti47

vamente.

Verificou-se que para peptídeos de LHRH ou IgE solução salina normal era apropridado para complexação. O IP calculado para cada imunógeno de peptídeo é maior que 9,0 (Tabela 1), muito maior do que o pH do 5 solvente aquoso selecionado.

No caso de peptídeos de CD4, a escolha de solvente aquoso demonstrou ser importante. Na diluição quer com solução salina normal, quer com PBS, foi observado que um precipitado sólido formou-se rapidamente em solução. Essa instabilidade impossibilitaria o uso desse imunóge10 no por via parenteral. Um exame dos imunógenos de peptídeo revelou que a seqüência de peptídeo ID N°: 6 (Tabela 1) tem um ponto de ionização calculado de 6,91. Em PBS (pH —7,2), esse peptídeo tendería a agregar-se e está previsto que apresentasse instabilidade. Uma solução desse problema foi encontrada preparando primeiramente o complexo imunoestimulador em ' 15 água desionizada, destilada, seguido de diluição com solução salina ou PBS com potência iônica suficiente para garantir que a suspensão seja isotônica e apropriada para injeção.

Esse exemplo demonstra as vantagens de estabilizar os imunógenos em solução na forma de um complexo imunoestimulador de peptídeo 20 de LHRH, IgE ou CD4.

As soluções ou suspensões aquosas, diluídas, foram depois adicionadas lentamente a um recipiente de reação de 25 ml seco, com 7,0 ml de ISA Montanide® 720. As adições foram feitas durante a homogeneização (High Shear Laboratory Mixer, Sealed Unit, Silverson) da mistura a baixas 25 velocidades (2.000-3.000 rpm), para gerar uma emulsão grossa. Essa velocidade de processamento foi mantida até que a amostra aquosa tenha sido adicionada completamente e foi mantida por 2 minutos inteiros, para garantir uma mistura prévia uniforme das fases aquosa e oleosa. A velocidade de homogeneização foi depois aumentada (5.000-8.000 rmp) e mantida por 5 a 30 10 minutos adicionais, resultando na formação de uma emulsão de a/o finamente dispersa, branca, homogênea.

A concentração final de imunógenos, quando formulados como • ·

suspensões ou emulsões de água-em-óleo, tal como descrito acima, foi de 200 pg/ml.

Exemplo 4c: Avaliação da estabilidadé para emulsões de água-em-óleo preparadas por métodos de homogeneização

A consistência e estabilidade das emulsões de a/o preparadas por homogeneização foram testadas por diversos métodos. Para provar que a emulsão era de água-em-óleo (a/o) e não de óleo-em-água (o/a) ou de água-em-óleo-em-agua (a/o/a), uma gota da composição foi adicionada a um béquer contendo água desionizada, destilada. Uma gota de uma emulsão de a/o irá flutuar na superfície e não dispersar-se na água. Por outro lado, uma gota de uma emulsão de o/w irá dispersar-se instantaneamente na água e uma gota de uma emulsão dupla de a/o/w irá dispersar-se tanto na superfície como na massa da fase aquosa. Observou-se que gotas das emulsões preparadas de ISA Montanide® 720 flutuaram na superfície com dispersão mínima e observou-se que gotas das emulsões preparadas com óleos de ISA Montanide 51 flutuaram na superfície com essencialmente nenhuma dispersão. Esses resultados indicaram que as emulsões eram de a/o e, ainda, que a tendência à dispersão era mais alta para a emulsão de a/o preparada de ISA Montanide® 720. Isso está relacionado com a viscosidade inicial dos próprios óleos e a viscosidade das emulsões resultantes. Essa é uma consideração importante para maximizar o potencial de reservatório da formulação de vacina resultante.

A viscosidade aparente das emulsões e óleos acabados foi verificada (viscosímetro rotacional DV-1+ de Brookfield) quanto à consistência de lite para lite e quanto a testes de estabilidade de longo prazo. ISA Montanide® 720 tinha uma viscosidade de ~15 mPa a 25°C, enquanto a emulsão de a/o preparada com ISA Montanide® 720 tinha uma viscosidade de ~4550 mPa a 25°C. Isso forneceu um produto bastante fluído, que é desejável para facilitar o manuseio e a distribuição da vacina com uma seringa.

Em contraste, ISA Montanide® 51 tinha uma viscosidade de ~50 mPa a 20°C, enquanto as emulsões de a/o preparadas de ISA Montanide® tinham uma viscosidade de ~1.500-2.900 mPa a 25°C. Constatou-se que a

ampla variação na viscosidade era uma função da escolha do tampão (PBS = -2.900 mPa, NS = -2,500 mPa e água desionizada, destilada = -1.500 mPa). Material com essa viscosidade alta pode apresentar algumas dificuldade com relação à transferência e distribuição com uma seringa. Porém, a estabilidade de longo prazo dessas composições estava aperfeiçoada. A estabilidade de longo prazo da emulsão foi avaliada colocando 1 ml de cada emulsão em um frasco eppendorf de 1,5 ml e centrifugando o conteúdo sob alta velocidade (5.000 rpm) por 10 minutos. Essas condições não simulam as eficazes condições de armazenamento, mas podem ser usadas para prever a resistência da emulsão à separação. No caso de ISA Montanide® 720,

5-10% do volume separou-se, com uma fase oleosa transparente ou amarelo-palha observada na superfície. No caso de ISA Montanide® 51, 0-2% do volume separou-se, com uma fase oleosa transparente ou amarelo-palha observada na superfície. A viscosidade dos produtos de emulsão de ISA Montanide® 51 é responsável pela maior estabilidade à sedimentação e resistência à separação.

O tamanho e distribuição das partículas para a emulsão de a/o foram caracterizados, ainda, por microscopia óptica (Nikon DIAPHOT 200). Uma fotomicrografia de cada composição foi obtida e foi feita uma estimativa da variedade de tamanhos das partículas suando uma escala gerada por computador. A escala em si é referenciada externamente contra padrões de tamanhos de partícula conhecidos (micropartículas detectáveis por NIST Duke Scientific). Para emulsões de a/o preparadas quer de ISA Montanide® 720 quer de ISA Montanide® 51 e imunógenos de peptídeo, os tamanhos das partículas foram essencialmente os mesmos (aprox. 1-2 mícrons), com agregação ou aglutinação mínima. Para emulsões de a/o preparadas quer de ISA Montanide® 720 quer de ISA Montanide® 51 e complexo imunoestimulador, os tamanhos das partículas foram ligeiramente maiores (aprox. 1-3 mícrons), com agregação ou aglutinação mínima. A Figura 4 é uma fotomicrografia obtida de uma emulsão de a/o preparada por meio de homogeneização de ISA Montanide® 51 e complexo imunoestimulador derivado de 100 pg de imunógenos de peptídeo de LHRH, com LHRH:CpG1 em uma relação

de carga final de 4:1.

O tamanho de partícula médio, inicial, foi da ordem de 10 mícrons. O processo de homogeneização em suspensão aquosa de complexos imunoestimuladores sob alto cisalhamento resultou em um tamanho de partícula agregado médio menor. Foi obtida uma emulsão de a/o estável com gotas de tamanho na faixa de 1-3 mícrons.

Exemplo 5a: Preparação geral de emulsões de áqua-em-óleo usando extrusão de baixo cisalhamento

Esse exemplo ilustra o processo da formação da emulsão de a/o de peptídeos catiônicos derivados de imunógenos de LHRH, IgE ou CD4 e oligonucleotídeos de CpG1 ou CpG2 em diversas proporções suando técnicas de extrusão. A Tabela 3 e a Tabela 4 mostram os cálculos gerais para determinar as quantidades relativas de cada reagente usado. Um diagrama de operações ilustrando o processo da formação de emulsão por extrusão, tal como descrito no presente, é mostrado na Figura 3.

Todos os artigos de vidro, barras de agitação e pontas de pipetas e todo o mecanismo extrusor foram autoclavados por 40 minutos a 121°C, antes do uso. Todos os reagentes foram pesados, carregados, transferidos ou adicionados a recipientes de reação em uma cobertura de corrente laminar, para evitar contaminação.

O processo de extrusão envolve passar repetidamente uma fase aquosa carregada em uma seringa para uma fase oleosa carregada em uma segunda seringa através de um tubo oco estreito que une as duas seringas. A emulsificação ocorre quando os fluídos são impelidos através do furo estreito sob pressão, tipicamente 689,5 kPa (100 psi). Em contraste, um sistema de homogeneização opera, tipicamente, a uma pressão que é maior que

6894,76 kPa (1.000 psi). O número de passagens repetidas necessário para o processo de extrusão acima freqüentemente excede 20 a 30, antes que seja gerada uma emulsão de a/o visualmente uniforme. Esse processo de extrusão manual não pode gerar cisalhamento significativo e o número de trocas necessário para produzir eficientemente uma emulsão de a/o é altamente variável. As propriedades físicas das emulsões de a/o não são uni

formes e a estabilidade geral, e, conseqüentemente, a potência in vivo, são tipicamente não reprodutíveis. Apesar desses problemas, existem diversas aplicações possíveis para produtos produzidos por esse processo.

Para tratar dessas deficiências, foi desenvolvido um mecanismo extrusor (LiposoFast® Basic, Avestin, Inc., Ottawa, Canada). O dispositivo consiste em duas seringas (0,5 ml ou 1,0 ml), equipadas por intermédio de fixações de luer com uma passagem perfurada estreita, ligada a um suporte com uma membrana de policarbonato com um tamanho de poros definido colocada entre as duas seringas. O dispositivo, tal como projetado original10 mente, era para a preparação de lipossomas com um tamanho controlado.⁶³A aplicação desse dispositivo com um produto baseado em óleo compatível, para a preparação de emulsões de a/o parece não ter sido considerada. O . tamanho dos poros da membrana pode ser selecionado (Whatman Nucleopore, 0,005 μιη -10 pm). O tamanho de poros menor permite a extrusão de dispersões sob cisalhamento mais alto. O tamanho de poros maior pode ser selecionado para formulações nas quais as partículas têm um tamanho maior. Usando esse dispositivo, a eficiência de emulsificação foi aumentada. Foram necessárias menos passagens repetidas para obter um produto mais uniforme e estável. A potência in vivo de uma preparação desse tipo possi20 velmente seria mais reprodutível. Porém, ainda existem limitações, devido ao volume máximo pequeno, aprox. 1,0 ml, que pode ser usado na prática e as restrições práticas na escolha do componente de óleo.

O processo funciona bem para a preparação de emulsões a/o derivados de ISA Montanide® 720. Porém, as viscosidades mais altas de 25 emulsões derivadas de ISA Montanide® 51 resultam em contrapressão significativa, impedindo o uso desse dispositivo de extrusão. Como tal, esse método pode ser visto melhor como um processo para preparar emulsões de a/o instantâneas de óleos com viscosidades aparentes de menos de 1.500 mPa.

Particularmente, em casos em que os custos associados ao armazenamento e à estabilidade de vacinas são de interesse ou em que há a anuência do paciente ou em que está envolvida a aplicação como um medi52

camento paliativo, esse método de distribuição pode ser economicamente eficiente e prático. Idealmente, pode-se contar com clínicos treinados, tal como médicos ou farmacêuticos, para preparar formulações de a/o instantâA - , neas no local, para uso geral.

* 5 Esse dispositivo e protocolo podem ser usados para a preparação de microemulsões de o/a e a/o/a instantâneas, para as quais são necessários cisalhamento e extrusão controlados, ou para a preparação de produtos refinados.

Exemplo 5b: Preparação de emulsões de áqua-em-óleo de ISA Montanide® 10 720

A uma seringa de vidro de 1,0 ml (à prova de gás) foram adicionados 333 pg de imunógenos de peptídeo de LHRH, IgE ou CD4, dissolvi. dos em um tampão aquoso apropriado (111 μΙ, 3 mg/ml) ou um complexo imunoestimulador (com uma relação de carga de 4:1) preparado a partir de

J 15 333 pg de imunógenos de peptídeo de LHRH ou IgE ou um complexo imunoestimulador (com uma relação de carga de 2:1), preparado de 333 pg de imunógenos de peptídeo de CD4 dissolvidos em um solvente aquoso apropriado (111 μΙ, 3 mg/ml) e oligonucleotídeos de CpG1 ou CpG2 em relações apropriadas, tal como descrito nas Tabelas 3 e 4, respectivamente.

Especificamente, para preparar complexo imunoestimulador de imunógenos de peptídeo de LHRH, a uma relação de carga de LHRH:CpG1 de 4:1, foram adicionados 24,3 μ9 de oligonucleotídeo de CpG1 (12,2 μΙ, 2,0 μΟ/ηηΙ).

Para preparar o complexo imunoestimulador de imunógenos de peptídeo de IgE, a uma relação de carga de lgE:CpG1 de 4:1, foram adicionados 38,7 pg de oligonucleotídeo de CpG1 (19,4 μΙ, 2,0 μg/μl) ou, para formar um complexo neutro de 1:1 de lgE:CpG1, foram adicionados 154,8 pg de oligonucleotídeo de CpG1 (77,4 μΙ, 2,0 μg/μl).

Para preparar o complexo imunoestimulador de imunógenos de peptídeo de CD4, a uma relação de carga de CD4:CpG2 de 2:1, foram adicionados 40 μg de oligonucleotídeo de CpG2 (20 μΙ, 2,0 μς/μΙ) ou, para formar um complexo a uma relação de carga de CD4:CpG2 de 1:2, foram adiciona53 *· ···· ··

dos 160 gg de oligonucleotídeo de CpG2 (80 μΙ, 2,0 μg/μl).

Solvente aquoso diluente adicional foi adicionado, de modo que o volume final da fase aquosa era de 300 μΙ.

A uma segunda seringa de vidro de 1,0 ml (à prova de gás) fo5 ram adicionados 700 μΙ de ISA Montanide® 720. As seringas foram ligadas por meio de fixações de luer a uma unidade de carcaça de extrusão contendo um suporte de membrana e suporte para o filtro de membrana de policarbonato. Foram selecionados filtros de membrana com tamanhos de poros de 3 μίτι ou 5 μηΊ para emulsões de a/o a serem preparadas com imunógenos 10 de peptídeo na fase aquosa. Ao passo que foram selecionados filtros de membrana com tamanhos de poros de 5 pm e 10 pm para a preparação de emulsões de a/o com complexo imunoestimulador suspenso na fase aquosa.

, A fase aquosa foi então passada primeiramente através da membrana para a fase oleosa, tipicamente, com grande facilidade. As trocas subsequentes , 15 requerem pressão adicional, com a contrapressão aumentada gerada durante o processo de emulsão. Após 8-12 passagens, a contrapressão na extrusão equalizou-se e foi obtida, tipicamente, uma emulsão branca, homogênea.

A concentração final de imunógenos, quando formulados como soluções ou como complexo imunoestimulador em emulsões de água-emóleo, tal como descrito acima, foi de 200 pg/ml.

Exemplo 5c: Avaliação de estabilidade para emulsões de áqua-em-óleo preparadas por extrusão

Testes de estabilidade similares aos realizados no Exemplo 4c, preparados pelo processo de extrusão, confirmaram que essas composições eram emulsão de a/o. Observou-se que gotas colocadas na superfície de água desionizada, destilada, flutuaram com dispersão mínima. Constatou-se que as viscosidades das emulsões resultantes variaram de -35-40 mPa, uma ligeira redução se comparadas com o sistema homogeneizado com alta energia do Exemplo 4c. A distribuição de tamanhos das gotas de emulsão foi maior do que os sistemas homogeneizados análogos. Aproximadamente 1-3 mícrons para emulsões de a/o preparadas de imunógenos de peptídeo ou 254 mícrons para emulsões de a/o preparadas de complexo imunoestimulador. Para comparação, a Figura 5 é uma fotomicrografia obtida de uma amostra de emulsão de a/o preparada por meio de extrusão de ISA Montanide® 720 e um complexo imunoestimulador derivado de 200 μg de imunógenos de peptídeo de LHRH e oligonucleotídeos, em uma relação de carga final de LHRH:CpG1 de 4:1.

Em geral, o tamanho das gotas obtidas pelo processo de extrusão de baixa energia, tal como mostrado na Figura 5, foram maiores e mais altamente agregadas do que as gotas homogeneizadas por alta energia, tal como mostrado na Figura 4. No todo, essas emulsões de a/o instantâneas são suficientemente estáveis para uso imediato ou no mesmo dia.

Exemplo 6a: Preparação de géis poliméricos in situ

Esse exemplo ilustra o processo de formação de matriz de gel in situ e encapsulamento do complexo imunoestimulador derivado de imunógenos de IgE ou CD4 e oligonucleotídeos de CpG1 ou CpG2 em diversas proporções suando técnicas de reconstituição direta. Um diagrama de operações mostrando o processo de preparar uma formulação de gel in situ, quer com imunógenos de peptídeo quer com complexo imunoestimulador, por meio de reconstituição, tal como descrita no presente, é mostrado na Figura 6.

Em geral, percentagens em peso variáveis de copolímeros de PLG ou PLGA (Boehringer, Ingelheim) foram dissolvidas em solventes biocompatíveis, tal como dimetil sulfóxido anidro (DMSO, Aldrich). O processo de solubilização requerer agitação vigorosa para polímeros de peso molecular mais alto, com agitação contínua mantida por 4-6 horas, para garantir dissolução completa. A solução de polímero foi depois filtrada através de uma membrana compatível com solvente orgânico, com tamanho de poros ···· ··

de 0,45 mícrons (Phenomenex, PTFE). À mesma foi adicionada uma solução de imunógenos de peptídeo catiônico ou, mais preferivelmente, uma suspensão de complexo imunoestimulador em um solvente biocompatível apropriado. O imunógeno de peptídeo ou complexo de peptídeo/CpG ou uma mistura dos mesmos foi primeiramente liofilizado (tal como descrito no Exemplo 3) e subseqüentemente dissolvido ou ressuspenso em um solvente biocompatível apropriado, tal como DMSO.

O uso de solventes apróticos polares, tal como DMSO, pode apresentar alguns problemas com relação à estabilidade de longo prazo do peptídeo. DMSO é conhecido como um agente oxidante poderoso e peptídeos que contêm aminoácidos sensíveis, tais como cisteína e triptofano, podem ser quimicamente incompatíveis nessas soluções. Portanto, imunógenos de peptídeo que contêm esses radicais podem ter de ser reconstituídos no local para uso imediato.

Os imunógenos de peptídeo liofilizados ou complexo imunoestimulador ou uma mistura dos mesmos foram reconstituídos diretamente no frasco em uma solução de polímero em DMSO no momento do uso, desse modo evitando exposição prolongada dos imunógenos de peptídeo ao DMSO. A dissolução do imunógeno de peptídeo ou a ressuspensão do complexo imunoestimulador ou de uma mistura do complexo imunoestimulador com imunógenos de peptídeo foi rápida, exigindo agitação suave para garantir uniformidade da amostra.

Há questões mínimas de estabilidade e produção esperadas para essas composições genéricas. As soluções de polímero em DMSO anidro não são tão suscetíveis à degradação hidrolítica se comparadas com imunógenos de peptídeo dissolvidos ou suspensos em soluções aquosas. A solução de polímero pode ser congelada (DMSO congela a aprox. 18°C), sem alterações detectáveis nas propriedades físicas ao descongelar.Esperase que o peptídeo ou complexo imunoestimulador isolado no estado seco liofilizado também apresente estabilidade maior na ausência de água.

A mistura de polímero e imunógenos de peptídeo ou complexo imunoestimulador, como tal, constitui uma solução de fase única ou uma

suspensão apropriada para injeção subcutânea ou intramuscular.

É de importância para qualquer um dos sistemas a viscosidade da solução ou suspensão. Isso influencia diretamente a capacidade de introduzir na seringa e injetar as composições por uma via subcutânea ou intramuscular.

A viscosidade aparente desses sistemas é uma função de diversos fatores, inclusive a constituição, peso molecular, cristalinidade e viscosidade intrínseca dos copolímeros de PLG ou PLGA. Esses fatores delimitam a quantidade útil em peso para cada polímero que pode ser dissolvida, enquanto conserva características de fluência práticas. A Tabela 5 mostra as propriedades físicas para polímeros de PLG ou PLGA selecionados e a quantidade correspondente em percentagens em peso que pode ser dissolvida em DMSO para obter viscosidades de solução de uso prático. A viscosidade aparente dessas soluções foi determinada por um viscosímetro rotacional D-1+ de Brookfield.

100 mPa foram selecionados arbitrariamente como o limite superior desejado para essas composições. Na maioria dos casos, uma solução ou suspensão formulada como uma solução de polímero de geliflcação in situ, com uma viscosidade aparente menor que 200 mPa, pode ser distribuída uniformemente através de seringas convencionais.

Uma solução de polímero/DMSO.com polímero para solvente em excesso do que é necessário para obter uma viscosidade aparente de 100 mPa, seria valiosa para distribuição por uma modalidade alternativa, inclusive seringa convencional ou um método sem agulha. O comportamento de geliflcação quando da injeção e liberação de jorro do imunógeno está em parte relacionado com a concentração do polímero na composição. Conseqüentemente, maximizar a razão de geliflcação e reduzir a liberação do jorro de imunógeno seriam dois parâmetros de projeto adicionais para consideração no desenvolvimento de uma composição opcional de dose única, de liberação controlada.

• ··

Exemplo 6b: Preparação de géis de polímero de PLGA Resomer® TG 503H ou RG 504H

A dois frascos de 25 ml separados, equipados com barras de agitação, foram adicionados 2.200 mg de RH 504H ou 2.750 g de RG 503H, respectivamente. A cada frasco foram adicionados 10,0 ml de DMSO anidro (1,1 gm/ml) por pipeta de transferência. As misturas foram agitadas vigorosamente por aprox. 2-3 horas à temperatura ambiente, após o que os copolímeros estavam totalmente solubilizados. Após dissolução completa, as soluções de matéria-prima foram filtradas através de um filtro de membrana resistente a solvente orgânico, de 0,45 μιη (Phenomenex, PTFE). O percentual em peso final de polímero de RG 504H e RG 503H para solvente de DMSO foi de 20% e 25%, respectivamente.

ml da solução de polímero/DMSO preparada desse modo foram depois adicionados por meio de seringa a frascos contendo complexo imunoestimulador liofilizado (relação de carga de lgE:CpG1 de 4:1 ou relação de carga de CD4:CpG2 de 2:1), derivado de 2.000 pg de peptídeos de IgE misturados com 232 μρ de oligonucleotídeo de CpG1 (116 μΙ, 2,0 μο/μΙ) ou_2.000 μg de peptídeos de CD4 misturados com 241 μg de oligonucleotídeos de CpG2 (120,5 μΙ, 2,0 μ9/μΙ). A concentração final de imunógeno em solução ou na forma de um complexo imunoestimulador em suspensão era de 200 μg/ml. O imunógeno ou complexo imunoestimulador foi imediatamente reconstituído em solução ou suspensão com suave agitação, para garantir a uniformidade do conteúdo.

Foi verificado que as viscosidades aparentes das soluções preparadas desses polímeros, às relações de peso especificadas, eram próximas a 100 mPa (veja Tabela 5). As concentrações de Resomer® RG 503H, Resomer® RG 504H e Resomer® RG 756, para uma viscosidade de solução em torno de 100 mPa, eram críticas. Resomer RG 503H e Resomer® RG 504H têm viscosidades inerentes muito mais baixas e ambos são derivados de PLGA com natureza amorfa, sendo que a composição de monômeros era em torno de 50% de D,L-lactídeo e 50% de glicolídeo. Acredita-se que esses materiais degradem a uma velocidade de 6-8 semanas para 50%

do polímero in vivo. Portanto, os componentes encapsulados teriam de ter um perfil de liberação de dois-três meses, com geís preparados de Resomer RG 503H ou Resomer® RG 504H. Géis preparados desses materiais seriam mais apropriados para aplicações de dose única, de liberação controlada de curto prazo. Por outro lado, Resomer® RG 756 é um polímero mais cristalino, composto de 75% de radicais D,L-lactídeo para 25% de radicais glicolídeo. Podem ser necessários de 4-6 meses para que 50% do polímerop se degradem in vivo e o índice de liberação para componentes encapsulados, conseqüentemente, seria mais prolongado. Acredita-se que Resomer® RG 756 seja mais desejável para aplicações de dose única, de liberação controlada de longo prazo.

Exemplo 7: A Imunogenicidade de Imunóqenos de Peptídeo de IgE e CD4 formulados como Complexo Imunoestimulador ou como Emulsão de a/o ou em Combinações

Esse exemplo ilustra a imunogenicidade de imunógenos de peptídeo de IgE e CD4 formulados como complexos imunoestimuladores com oligonucleotídeos de CpG1 ou CpG2, como uma emulsão de a/o ou como complexo imunoestimulador disperso em uma emulsão de a/o em porquinhos-da-índia, que foram imunizadas por via intramuscular. As emulsões de a/o foram preparadas por homogeneização, tal como descrito no Exemplo 4a/4b ou por extrusão, tal como descrito no Exemplo 5a/5b.

Grupos de três porquinhos-da-índia fêmeas, com idade de 6 a 8 semanas (Covance Research Products Inc., Denver, PA) foram imunizados por via intramuscular (I.M.) nas semanas 0, 3 e 6, com as seguintes composições: 100 pg do complexo imunoestimulador de peptídeos de lgE/CpG1 (relação de carga de 4:1 e relação de carga de 1:1), preparado tal como descrito na Tabela 4, suspenso em um volume final de 250 μΙ de PBS, pH 7,4; complexos imunoestimuladores de peptídeos de CD4/CpG2 (relação de carga de 2:1 e relação de carga de 1:2), preparados tal como descrito na Tabela 4 em 75 μΙ, suspensos em um volume final de 250 μΙ de PBS, pH 7,4; peptídeos de IgE em 75 μΙ de PBS, emulsificados com ISA Montanide® 720 (175 μΙ): peptídeos de CD4 em 75 μΙ de água desionizada, destilada, emulsi59

ficados com ISA Montanide™ 720 (175 μΙ); complexo imunoestimulador de peptídeo de lgE/CpG1 em 75 μΙ, pH 7,4, preparado tal como descrito na Tabela 4 (relação de carga de 4:1 e relação de carga neutra de 1:1), emulsificado com ISA Montanide® 720 (175 μΙ), ou complexos imunoestimuladores de peptídeos de CD4/CpG2, preparados tal como descrito na Tabela 4 em 75 μΙ de água desionizada, estilada (relação de carga de 2:1 e relação de carga de 1:2), emulsificados com ISA Montanide® 720 (175 μΙ).

As porquinhos-da-índia não mostraram patologias flagrantes, nem mudanças de comportamento após receber complexos imunoestimula10 dores, emulsões de a/o contendo imunógenos de peptídeo ou emulsões de a/o contendo os complexos imunoestimuladores. Foram obtidos soros nas semanas +3, +5, +9, +11 e +17 e foram avaliados quanto à presença de an. ticorpos de anti-lgE no caso de imunógenos de IgE ou anticorpos de anti CD4, no caso de imunógenos de CD4, no caso de imunógenos de CD4, por *

. 15 ELISAs específicas para imunógenos.

Medição de anticorpos de anti-lgE

Foram determinados títulos de peptídeos anti-lgE por ELISA de peptídeo de IgE e reatividades cruzadas a IgE humano por ELISA de IgE humano. ELISAs de peptídeos para determinação da reatividade de peptí20 deos de anti-lgE foram rezalizados em placas de microtítulo revestidas com o peptídeo no local do antígeno de objetivo, sem o local de adjuvante de T, tal como descrito⁶⁴. Para determinação de reatividade cruzada de anti-lgE humano, foram realizados ELISAs de IgE humano em placas de microtítulos revestidas de modo similar com uma proteína de mieloma de IgE humano 25 (American Biosystems, Inc, cat. n° A113) a 5 pg/ml.

Anticorpos de antipeptídeo ou anti-lgE encapsulados foram detectados pelo anticorpo de cabra de IgG anti-porquinho-da-índia qualificados por peroxidase de armorácia. Os títulos de ELISA, expressos como log₁₀ e diluição recíproca, foram calculados com base em análise de regressão line30 ar das absorveções, com interrupção A492 fixada em 0,5. Esse valor de interrupção foi rigoroso, uma vez que os valores para amostras de controle de porquinhos-da-índia normais, diluídas, usados em cada análise foram de

menos de 0,15. Anti-soro de imunógeno de peptídeo de anti-lgE de porquinhos-da-índia hiperimunes foi usado como um controle positivo. Soros préimunes foram usados como controles negativos.

Medição de anticorpos anti-CD4

ELISAs para ligação a CD4 solúvel recombinante foram realizadas em placas de microtítulo de 96 cavidades, revestidas com rsCD4 (American Bio-Technologies) a 0,25pl/ml, usando 100 μΙ por cavidade em 10 mM de tampão de NaHCO3, pH 9,5. As cavidades foram bloqueadas com 250 μΙ de 3% de gelatina, lavadas com 0,05% de TWEEN 20 em solução salina 10 tamponada com fosfato (PBS) e secas. Cavidades de teste foram regidas com 100 μΙ de soro imune diluído por 1 hora, a 37°C. As cavidades foram lavadas com 0,05% de TWEEN 20 em PBS, reagidas com 100 μΙ de IgG anticamundongo de cabra qualificado por peroxidase de armorácia (Pierce), diluído 1:1000 em 1% de soro de cabra, 0,05% de TWEEN® 20 em PBS, e 15 lavadas. Foram adicionados por 15 minutos 100 μΙ de substrato de ortofenilenodiamina (OPD) a 0,04% em peso (Pierce) e 0,12% de H2O2 em tampão de citrato de sódio, pH 5,0.As reações foram interrompidas por adição de 100 μΙ de 1,0 M de H₂SO₄ e determinada a A492· Anti-soro de imunógeno de peptídeo de anti-CD4 de porquinhos-da-índia hiperimunes foi usado como 20 um controle positivo. Soros pré-imunes foram usados como controle negativo.

Medição de antigenicidade funcional por ELISA competitiva

Nessa ELISA competitiva, foi quantificada a antigenicidade funcional para imunógenos de CD4 testando os anticorpos produzidos quanto à 25 capacidade de inibir competitivamente um anticorpo monoclonal funcional, mAb B4, cuja especificidade conhecida era para o complexo de CD4 na superfície da célula hospedeira, que liga HIV. Esse anticorpo monoclonal de local de antiligação foi bem caracterizado por sua alta afinidade para o complexo de ligação de HIV, por ligar-se ao domínio 1 de CD4 recombinante 30 solúvel (rsCD4) e por sua capacidade de neutralizar os produtos de isolação primários de HIV-1.⁶⁵

O anticorpo monoclonal de local de antiligação foi purificado por

cromatografia de afinidade de proteína A e conjugado à peroxidase de rábano-silvestre. O conjugado de mAB B4-HRP foi usado na análise como um rastreador, a uma concentração de 0,5 pg/ml. Placas de microtítulo de 96 «

cavidades foram revestidas com proteína de CD4 solúvel,recombinante, 1 pg/ml em 0,1 M de tampão de carbonato de sódio, pH 9,5, com incubação durante a noite. As reações foram feitas nas cavidades de microtítulo em 100 μΙ de volume total de PBS/soro de cabra/gelatina/TWEEN® 20,com soro imune diluído em série (porquinho-da-índia, porco ou babuíno) e 30 μΙ da matéria-prima de trabalho mAb B4-HRP. Soro diluído e mAb B4-HRP foram pré-incubados antes da adição da mistura à cavidade. O controle positivo para o ELISA de competição foi de 5 μΙ de mAb de local de antiligação não qualificado a 0,5 μg/ml em soro normal, o controle negativo é soro normal.

. Da mistura de diluição de soro/anticorpo, 100 μΙ foram adicionados a uma * cavidade revestida e incubados por uma hora a 37°C. As placas foram dre. , 15 nadas e lavadas e mAB B4-HRP ligado foi detectado por reação com um cromógeno. O cromógeno foi 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) e um conjugado de mAb B4 ligado em TMB foi detectado em A450· Uma curva de calibração foi obtida com mAb B4 purificado, diluído em série, de 10 pg/ml em soro normal da espécie apropriada, de modo a obter um valor equivalente de 20 mAb para as diluições de soro imune que inibe competitivamente a ligação ao CD4 solúvel, recombinante, humano do mAb B4-HRP.

Análise de neutralização de vírus

A análise de microplaca de MT-2 foi realizada tal como descrito⁶⁶, exceto pelo fato de que soros inativados por calor foram diluídos em 25 série em 50% de DMEM de alta glicose com 15% de FBS, antibióticos, 2% de glutamina e tampão de bicarbonato e 50% de plasma humano normal, desfibrinado, combinado. Nessa análise, soro diluído é incubado com 20 pfu de HIV em cavidades de microtítulo. Células de MT-2 sensíveis a HIV são adicionadas e formadas em monocamadas por força centrífuga sob agarose 30 derretida. A infectação por vírus residual é detectada pela presença de placas tingidas com iodeto de propídio, uma semana mais tarde. O ponto terminal é a diluição do soro à qual houve uma redução de 50% ou 90% na con62

tagem das plaquetas.

Resultados de imunogenicidade

Os títulos de anticorpos de soro após a imunização de imunógenos de IgE, são mostrados na Figura 7 (sistemas homogeneizados) e na 5 Figura 9 (sistemas extrudados) e para imunógenos de CD4, são mostrados na Figura 8 (sistemas homogeneizados) e Figura 10 (sistemas extrudados). A Tabela 6 compara a inibição competitiva de um anticorpo monoclonal de B4 analisado em soros obtidos do estudo do peptídeo de CD4 (sistemas de emulsão de a/o homogeneizados e extrudados) na semana 9, semana 11 e 10 semana 17, respectivamente. A Tabela 7 compara a atividade de neutralização de vírus (50% e 90% de inibição, respectivamente), analisada em soros obtidos do estudo do peptídeo CD4 (sistemas de emulsão de a/o homoge. neizados e extrudados) na semana 9 e semana 11, respectivamente. Ensai os de controle demonstraram que peptídeio sem adjuvante era não-imuno. , 15 gênico ou fracamente imunogênico em todos os casos.

Tanto para vacinas de IgE como de CD4, os resultados das imunizações indicaram que complexos imunoestimuladores eram adjuvantes e os títulos na semana 9 foram ligeiramente menores ou comparáveis aos obtidos com emulsões de a/o, independentemente do fato de se as emulsões 20 foram preparadas por técnicas homogeneizadas ou extrudadas, tal como mostrado nas Figura 7-10.

Os sistemas de combinação com complexo imunoestimulador dispersos como emulsões de a/o, preparados por qualquer método, consistentemente forneceram as respostas imune contínuas mais altas. Tal como 25 representado nas Figuras 7-10, foi constatado que os títulos de anticorpos produzidos da semana 11 até a semana 17, tanto para imunógenos de IgE como de CD4, eram da ordem de uma unidade de log ou mais altos do que os títulos de anticorpos obtidos quer com o complexo imunoestimulador sozinho, quer com as emulsões de a/o com peptídeo sozinho. A única exceção 30 a isso são as emulsões de a/o de CD4 preparadas por homogeneização, nas quais essa separação não é encontrada até a semana 17.

Essa observação é apoiada ainda por dados obtidos de estudos

da inibição competitiva de peptídeo de CD4 e neutralização de vírus, focalizados nas Tabelas. 6 e 7, em que os sistemas de combinação de soros imunes para a emulsão de a/o com peptídeo de CD4/oligonucleotídeos de CpG (relação de carga de CD4:CpG2 = 2:1) inibiram competitivamente o nível to5 mais alto de anticorpo monoclonal de B4 comparado com os soros imunes *

com as emulsões de a/o simples ou complexo imunoestimulador com peptídeos de CD4, sozinho. Além disso, as mesmas formulações mostraram ser as mais eficazes na atividade de neutralização contra vírus infecciosos.

São observadas pequenas diferenças entre as preparações ho10 mogeneizadas ou extrudadas e incluem a velocidade à qual observou-se que os títulos extraídos para os imunógenos de IgE ou CD4, obtidos por ELISA, atingiram o pico. As respostas imune atingiram o pico mais cedo . (semana 9) para as emulsões de a/o extrudadas, embora a duração das ' respostas obtidas fosse boa (essencialmente equivalentes na semana 11 e . . 15 ligeiramente reduzidas na semana 17). O sistema homogeneizado análogo atingiu o pico um pouco mais tarde (semana 11) e forneceu respostas contínuas, tal como pode ser visto pelos altos títulos que persistiam na semana 17

Essa tendência também é apoiada por dados obtidos da análise 20 de inibição competitiva de peptídeo de CD4/mAb B4-HRP e os estudos de neutralização de vírus focalizados nas Tabelas 6 e 7.

Pela semana 9, análises de soros obtidos de animais imunizados pelo sistema de emulsão de a/o, preparado de peptídeos de CD4 nãocomplexados por meio de homogeneização (87,2%) ou por extrusão (88,6%) 25 mostraram inibir competitivamente altos níveis de anticorpo monoclonal de B4. Constatou-se que os mesmos eram da mesma ordem de magnitude (dentro do erro experimental) como para soros obtidos de animais imunizados com os sistemas de combinação de emulsão de a/o de peptídeo de CD4/oligonucleotídeos de CpG2 (2:1) preparados por meio de homogenei30 zação (70,1%) ou por extrusão (94,9%). Pela semana 17, análises sobre soros obtidos de animais imunizados pelo sistema de emulsão de a/o preparado de peptídeos de CD4 não-complexados por meio de homogeneização

(11,2%) ou por extrusão (42,6%) competitivamente inibiram dramaticamente níveis mais baixos de anticorpo monoclonal de B4. O grau de inibição não era mais comparável, em geral, com o obtido para soros de animais imunizados com os sistemas de combinação de emulsão de a/o de peptídeo de CD4/oligonucleotídeos de CpG2 (2:1) preparados por meio de processos de homogeneização (85,0%) ou por extrusão (77,2%).

Além disso, a mesma tendência é mostrada para soros obtidos de formulações de peptídeos de CD4 quando analisados quanto à neutralização de vírus de HIV-1 infeccioso.

Pela semana 9, análises de soros obtidos de animais imunizados pelo sistema de emulsão de a/o, preparado de peptídeos de CD4 nãocomplexados por meio de homogeneização (73% para 50% de neutralização de vírus ou 27% para 90% de neutralização de vírus) ou por extrusão (31 % para 50% de neutralização de vírus ou 12% para 90% de neutralização de vírus) neutralizaram essencialmente as mesmas percentagens de vírus de HIV-1 infeccioso (dentro de erro experimental). Análises de soros obtidos de animais imunizados com os sistemas de combinação de emulsão de a/o, preparados de peptídeo de CD4/oligonucleotídeo de CpG2 (2:1), preparados por meio de homogeneização (12% para 50% de neutralização de vírus ou <10% para 90% de neutralização de vírus) ou por extrusão (103% para 50% de neutralização de vírus ou 33% para 90% de neutralização de vírus) mostraram que o sistema homogeneizado é significativamente menos eficaz em gerar anticorpos neutralizantes contra vírus de HIV-1 infeccioso, nesse momento. Pela semana 11, análises de soros obtidos de animais imunizados pelo sistema de emulsão de a/o, preparado de peptídeos de CD4 nãocomplexados por meio de homogeneização (57% para 50% de neutralização de vírus ou 17% para 90% de neutralização de vírus) ou por extrusão (<10% para 50% de neutralização de vírus ou <10% para 90% de neutralização de vírus) demonstraram que a capacidade de neutralizar vírus de HIV-1 infeccioso é reduzida ou eliminada (dentro de erro experimental). Análises de soros obtidos de animais imunizados pelos sistemas de combinação de emulsão de a/o, de peptídeos de CD4/oligonucleotídeos de CpG (2:1), preparados por ·· ··

meio de homogeneização (40% para 50% de neutralização de vírus ou 30% para 90% de neutralização de vírus) ou por extrusão (120% para 50% de neutralização de vírus ou 39% para 9Ò% de neutralização de vírus) mostraram claramente que tanto o sistema homogeneizado como o sistema extru5 dado não eram eficazes em produzir respostas de anticorpos neutralizantes contra HIV infeccioso. A resposta para o sistema homogeneizado mostrou ser retardada em relação à composição extrudada.

Uma possível explicação para essas tendências pode ser que emulsões de a/o preparadas por meio de processos de extrusão de baixa 10 energia podem interagir ou apresentar imunógenos complexados mais eficazmente em momentos mais precoces a células causadoras de imunidade, enquanto o processo de homogeneização de alta energia fornece uma emulsão mais uniforme e atua essencialmente como um reservatório mais eficiente. É previsto que as respostas imune obtidas por um sistema desse 15 tipo sejam retardadas e potencialmente mais constantes.

Constatou-se que a combinação do complexo imunoestimulador e peptídeos não-complexados residuais dispersos em emulsões de a/o aumentam sinergicamente os títulos gerais tanto para imunógenos de igE como para imunógenos de CD4. O método de preparação pode influenciar a 20 cinética e duração das respostas, sendo que tanto a homogeneização como a extrusão mostraram ser compatíveis para preparar uma vacina eficaz.

Além disso, em um estudo separado examinamos o efeito de doses de CpG sobre respostas imune. Tanto para imunógenos de IgE como de CD4, foram preparados complexos imunoestimuladores de doses variá25 veis de oligonucleotídeos de CpG1 ou CpG2 (isto é, lgE:CpG1 = 4:1 ou 1:1 e CD4:CpG2 = 2:1 ou 1:2) e administradas em tampão aquosos ou dispersas em uma emulsão de a/o. Verificou-se que todas as composições eram imunogênicas, porém nos dois estudos a dose relativa menor de oligonucleotídeo (excesso de imunógeno de peptídeo sintético para oligonucleotídeo) 30 provocou respostas imune superiores em termos de título absoluto e duração. No caso de peptídeos de IgE/olignucleotídeos de CpG1, a classificação segue a ordem de relação de carga de 4:1 > relação de carga neutra 1:1,

enquanto para peptídeos de CD4/oligonucleotídeos de CpG2, a classificação segue a ordem de relação de carga de 2:1 > relação de carga de 1:2. Muito freqüentemente, uma facilitação aperfeiçoada pode ser correlacionada com doses crescentes de adjuvantes. Nesses exemplos demonstramos as vantagens inesperadas de co-formular o complexo imunoestimulador estabilizado e peptídeo não-complexado, para máxima sinergia de respostas imune.

Portanto, pode ser concluído que o complexo imunoestimulador preparado de imunógenos de IgE ou CD4, tal como descrito neste exemplo, pode facilitar eficazmente respostas imune in vivo. As respostas obtidas são comparáveis às encontradas para esses mesmos imunógenos dispersos em emulsões de a/o, porém é esperado que menos questões de reactogenicidade resultem do uso do complexo imunoestimulador dispersável, totalmente aquoso de imunógenos, em oposição à dispersão de imunógenos sintéticos como emulsões de a/o.

Nesse exemplo, demonstramos que a distribuição de imunógenos de IgE ou CD4 como complexos imunoestimuladores, em combinação com peptídeos não-complexados dispersos dentro de um veículo de emulsão de água-em-óelo forneceu a apresentação mais eficaz de imunógeno ao sistema imunológico. As respostas imune obtidas para o sistema combinado são significativamente maiores do que a soma das respostas imune obtidas para cada sistema independentemente.

Além disso, análises de soros obtidos de animais imunizados com combinações de complexo imunoestimulador de imunógenos de CD4 e imunógenos de CD4 não-complexados, dispersos dentro de um veículo de emulsão de água-em-óleo mostraram ser mais eficazes do que emulsões de a/o simples, de imunógenos de CD4 não-complexados, em inibir competitivamente anticorpos monoclonais de B4. Além disso, esses mesmos sistemas mostraram ser os mais eficazes em neutralizar o vírus de HIV-1 infeccioso.

No modelo de porquinho-da-índia, a quantidade e longevidade das respostas imune obtidas indicaram que o complexo imunoestimulador derivado de combinações de lgE/CpG1 e CD4/CpG2 eram preferidas. Foi • J. jí : : ; .· ··;·

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determinado experimentalmente que composições derivadas do pares alternativos de lgE/CpG2 e CD4/CpG1 eram facilitadoras, embora não na mesma extensão.

A possibilidade de menos regimes de dosagem e mais baixos (imunógeno/adjuvante) é indicada por esses resultados. Em casos nos quais a reactogenicidade é um problema, o sistema de combinação abre a possibilidade de administrar um volume menor de emulsão, com níveis de imunogenicidade similares ou mais altos.

Especificamente, esse exemplo indica fortemente o potencial dessas novas formulações baseadas em combinação para desenvolvimento de formas de dosagem eficazes.

Exemplo 8: A imunoqenicidade de imunógenos de peptídeo de IgE e CD4 formulados como complexo imunoestimulador ou como soluções de polímero qeleificante in situ ou em combinações

Esse exemplo ilustra a imunogenicidade de imunógenos de peptídeo de IgE e CD4 formulados como complexo imunoestimulador com oligonucleotídeos de CpG1 ou CpG2 ou como polímeros gelificantes in situ e solventes biocompátíveis ou como complexo imunoestimulador suspenso em polímeros gelificantes in situ e solventes biocompátíveis em proquinhos-daíndia, que foram imunizadas por via intramuscular. Imunógenos de peptídeo ou complexo imunoestimulador, derivado de imunógenos de peptídeo e oligonucleotídeos de CpG, liofilizados, foram preparados tal como descrito no Exemplo 3. Os polímeros gelificantes in situ foram preparados tal como descrito no Exemplo 6a/6b.

Para examinar a imunogenicidade de imunógenos de peptídeo de IgE e CD4, formulados como polímeros gelificantes in situ (Resomer® RG 504H) ou como complexos imunoestimuladores com oligonucleotídeos de CpG1 ou CpG2 suspensos em polímeros gelificantes in situ (Resomer® RG 504H), formados de acordo com a presente invenção, grupos de três porquinhos-da-índia fêmeas com 6 a 8 semanas de idade (Covance Research Products Inc., Denver, PA) foram imunizados por via intramuscular (I.M.) com as seguintes quantidades de imunógeno na semana 0: 300 pg de com30

• · •· ···· ·· plexo imunoestimulador de peptídeos de lgE/CpG1 liofilizado (relação de carga de 4:1), reconstituído e suspenso em um volume final de 200 μΙ de PBS (pH 7,4), preparados tal como descrito na Tabela 4, ou 300 pg de complexo imunoestimulador de peptídeos de CD4/CpG2 (relação de carga de 5 2:1), reconstituído e suspenso em um volume final de 200 μΙ de PBS (pH

7,4), preparado tal como descrito na Tabela 4, ou 300 pg de peptídeos de IgE, reconstituídos e suspensos em 200 μΙ de Resomer® RG 504H (20% em peso), dissolvido em dimetil sulfóxido (DMSO), ou 300 pg de peptídeos de CD4, reconstituídos e suspensos em 200 μΙ de Resomer® RG 504H (20% 10 em peso), dissolvido em dimetil sulfóxido (DMSO), ou 300 pg de complexo imunoestimulador de peptídeos de lgE/CpG1 liofilizados (relação de carga de 4:1), preparado tal como descrito na Tabela 4, reconstituído e suspenso em 200 μΙ de Resomer® RG 504H (20% em peso), dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO), ou 300 pg de complexo imunoestimulador de peptídeos 15 de CD4/CpG2 (relação de carga de 2:1), preparado tal como descrito na Tabela 4, reconstituído e suspenso em 200 μΙ de Resomer® RG 504H (20% em peso), dissolvido em dimetil sulfóxido (DMSO).

Os porquinhos-da-índia não mostraram patologias flagrantes, nem mudanças de comportamento após receber um complexo imunoesti20 mulador, polímeros gelificantes in situ em DMSO contendo imunógenos de peptídeo ou polímeros gelificantes in situ em DMSO contendo complexo imunoestimulador. Foram obtidos soros nas semanas +3, +6, +9, +12 e foram avaliados quanto à presença de anticorpos de anti-lgE no caso de imunógenos de IgE, ou anticorpos de anti-CD4, no caso de imunógenos de 25 CD4, no caso de imunógenos de CD4, por ELISAs específicas para imunógenos, seguindo os procedimentos descritos no Exemplo 7.

Resultados de imunoqenicidade

Os títulos de anticorpos de soro após a imunização de dose única de imunógenos de IgE, são mostrados na Figura 11 e para imunógenos 30 de CD4, são mostrados na Figura 12. Ensaios de controle demonstraram que peptídio sem adjuvante era não-imunogênico ou fracamente imunogênico em todos os casos. Nos dois estudos, os resultados das imunizações in69 ·· ········

dicaram que o complexo imunoestimulador, sozinho, era moderadametne facilitador, com os. títulos atingindo o pico pela semana 9. Por outro lado, . imunógenos não-complexos, suspensos em polímeros gelificantes também eram fracamente facilitadores, com respostas de pico observadas na sema5 na 12.

Tanto para os imunógenos de IgE como de CD4, os complexos imunoestimuladores suspensos como polímero gelificante in situ, provocaram as respostas imune mais altas. Essas respostas atingiram o pico em tomo da semana 9 e eram contínuos até a semana 12. A quantidade e dura10 ção das respostas imune obtidas não foram encontradas nem com o complexo imunoestimulador, sozinho, nem com imunógenos não-complexados administrados em uma composição incluindo polímero gelificante in situ, so- zinho.

' É esperado que imunógenos com peso molecular pequeno, tais

- p 15 como peptídeos, podem difundir-se facilmente através de implantes e géis de polímero, resultando em grandes quantidades de liberação inicial quando da injeção. Os fatores físicos que controlam a geliflcação podem ser ajustados para retardar esse processo; porém, a massa de peptídeo liberada desse modo é essencialmente não facilitada e está sujeita a processos de de20 gradação padrão, que são normalmente experimentados in vivo. Além disso, não se pode esperar que as pequenas quantidades de material que permanecem encapsuladas sejam suficientes para uma descarga suficiente quando o polímero degradar-se, necessitando de doses muito maiores de peptídeos. O DMSO residual encapsulado dentro da matriz também apresenta questões de estabilidade, sendo que aminoácidos sensíveis contidos nos peptídeos podem ser oxidados. Além disso, foi bem demonstrado que água pode penetrar nesses materiais em razões variáveis, dependendo de diversos fatores, tal como micromorfologia de gel, hidrofobicidade e cristalinidade do polímero^45,46. Água que penetra na matriz estimula a hidrólise da massa, o principal mecanismo de degradação que opera em copolímeros de PLG/PLGA in vivo. Sabe-se que esse processo é acompanhado de dramáticas alterações de pH locais, que podem reduzir essencialmente o pH para 2

ou 3⁶⁷. Os peptídeos solubilizados, não-complexados, livres, podem não ser estáveis a um meio desse tipo e isso limita adicionalmente o potencial para esses sistemas. Agentes tampões ácidos podem ser usados para ajudar a eliminar esses problemas, mas não podem ser considerados ideais. Encapsular uma suspensão de imunógenos de peptídeo na forma de um complexo imunoestimulador confere várias vantagens de estabilidade e facilitação a esse sistema. Uma vez feita a injeção de polímero, as pequenas quantidades de complexo não efetivamente encapsuladas no gel (presumivelmente, localizadas na superfície, próximas à frente de gelificação) podem servir para iniciar ou preparar a resposta imune com mais eficácia do que imunógeno de peptídeo não-complexado, sozinho. O oligonucleotídeo de CpG permanece em contato íntimo com o imunógeno de peptídeo e na forma de uma porção complexa pode proteger e estabilizar adicionalmente o imunógeno de peptídeo contra digestão enzimática in vivo ou contra instabilidade química, que pode ser devida ao solvente de DMSO contido dentro da matriz.

Além disso, os imunógenos de peptídeo que permanecem encapsulados na matriz em uma forma em partículas, devem estar melhor protegidas contra o processo de acidificação do que peptídeos nãocomplexados, livres. Imunógenos apresentados nessa forma podem fornecer uma descarga de imunógeno mais eficaz ao sistema imunológico, provocando respostas imune mais fortes e mais duradouras do que possível de outro modo em uma formulação de liberação controlada, de dose única.

Em ensaios de controle, foi determinado que soluções de imunógenos de peptídeo não-complexados, dissolvidos em composições de polímero de RG 504H (20% em peso) em DMSO gelificavam rapidamente quando postos em contato com soluções de PBS. A separação da solução da fase de gel para essas amostras e a análise das soluções por espectroscopia de ultravioleta (a λ = 280 nm) revelaram que quantidades bastante grandes de peptídeo não-complexado (aprox. 50-70%) eram co-extraídas com o DMSO.

A combinação do complexo imunoestimulador e imunógenos de

peptídeo não-complexados, suspensos em polímeros gelificantes in situ, demonstrou aumentar sinergicamente os títulos gerais tanto para imunógenos de IgE como de CD4 nessas preparações de liberação controlada.

Um estudo separado para examinar o efeito da dosagem de oligonucleotídeo de CpG sobre respostas imune não foi realizado neste estudo. Seria de se esperar que aperfeiçoamento adicional nos títulos absolutos pudesse ser obtido usando complexo imunoestimulador preparado próximo à neutralidade elétrica ou com um excesso de carga negativa fornecida quer pelo oligonucleotídeo de CpG quer, alternativamente, por um excipiente compatível, adicional. Nessas composições, a maior parte do imunógeno de peptídeo está ligado como um complexo imunoestimulador e o processo de gelificação quando da injeção não resulta em maiores perdas de peptídeo sem adjuvante em virtude da co-extração no solvente biocompatível.

Portanto, pode ser concluído que o complexo imunoestimulador pode estabilizar tanto os imunógenos de peptídeo como complexo imunoestimulador e que essas composições, quando combinadas com um polímero gelificante in situ, podem facilitar eficazmente as respostas imune in vivo. Isso é particularmente importante para os sistemas de polímero que se destinam ao uso em dose única. A distribuição de imunógenos como complexo imunoestimulador, suspenso dentro de um veículo de polímero gelificante in situ, oferece a apresentação mais eficaz de imunógeno ao sistema imunológico. As respostas obtidas para o sistema combinado são significativamente maiores do que a soma das respostas imune obtidas para cada sistema, independentemente, e são constantes, diferentemente de géis in situ, preparados por simples reconstituição de imunógenos de peptídeo nãocomplexados de polímeros em solventes biocompatíveis.

No modelo de porquinho-da-índia, a quantidade e longevidade das respostas obtidas indicaram que complexos imunoestimuladores derivados de combinações de lgE/CpG1 e CD4/CpG2 eram preferidos. Foi determinado experimentalmente que composições derivadas dos pares alternativos de lgE/CpG2 e CD4/CpG1 eram facilitadoras, embora não na mesma medida.

!

A possibilidade de um regime de dose única é indicada por esses resultados. Especificamente, esse exemplo indica fortemente o potencial dessas novas formulações baseadas em combinações reconstituídas instantaneamente, para desenvolvimento como forma de dosagem de liberação *

controlada, eficaz.

Exemplo 9: Preparação da combinação de complexo imunoestimulador e suspensões de sal mineral

Esse exemplo ilustra o processo da preparação de uma suspensão de sal mineral de peptídeos catiônicos derivados de imunógenos de peptídeo de LHRH (SEQ ID NOS: 7-9 em uma razão molar de 1:1:1 em solução) ou um complexo imunoestimulador derivado de imunógenos de LHRH e oligonucleotídeo de CpG1 em diversas proporções. Um diagrama de ope. rações ilustrando o processo da preparação de uma suspensão mista, tal * como descrito no presente, é mostrado na Figura 16.

, , 15 Todos os artigos de vidro, barras de agitação e pontas de pipetas foram autoclavados por 40 minutos a 121°C, antes do uso. Todos os re' agentes foram pesados, carregados, transferidos ou adicionados a recipientes de reação em uma cobertura de corrente laminar, para evitar contaminação.

A um frasco de vidro de 5,0 ml, equipado com uma barra de agitação, foram adicionados 100 gg (250 gl, 0,4 mg/ml) ou 1.600 gg (534 μΙ, T 3,0 mg/ml) de imunógenos de peptídeo de LHRH, dissolvidos em uma solução aquosa. Complexos imunoestimuladores com uma de duas relações de carga (isto é, 4:1 ou 1,5:1) foram preparados de imunógenos de LHRH e oli25 gonucleotídeos de CpG1 em água desionizada, destilada.

Especificamente, a preparação de um complexo de 4:1 de 100 gg ou 1.600 gg de imunógenos de LHRH exigiu 7,3 gg ou 116,8 gg de oligonucleotídeo de CpG1 (2,0 mg/ml), enquanto a preparação de um complexo de 1,5:1 de 1.600 gg de imunógenos de LHRH exigiu 350,4 gg de oligonu30 cleotídeos de CpG1 (2,0 mg/ml), respectivamente.

A Tabela 9 mostra os cálculos usados para determinar a quantidade relativa de oligonucleotídeo de CpG1 necessária para complexação

com imunógenos de peptídeo para uma dosagem final, fixa, de 25 μ9/0,5 ml ou 400 pg/0,5 ml, no que se refere às relações de carga especificadas.

A um segundo frasco de vidro de 5,0 ml, foi adicionado 1,0 ml de suspensão de sal mineral Alhydrogel® (3,2 mg de alumínio (Al)/ml) em água desionizada, destilada. A suspensão de matéria-prima de Alhdrygel® usada foi primeiramente ajustado no pH para o pH 7,1-7,4 pela adição de 0,1 N de NaOH. As medições de pH foram feitas através de tiras indicadoras de pH, com uma resolução de +/- 0,3 unidades de pH.

A suspensão de sal mineral foi adicionada ao frasco que continha o complexo imunoestimulador e imunógenos não-ligados, residuais, e equilibrada com agitação por 30 minutos.

À mistura de Alhydrogel® e complexo imunoestimulador foram adicionados 90 μΙ de NaCI de 20% para tonicidade, 5,0 μΙ de conservante de

2-fenóxi-etanol (2-PE) (em casos selecionados) e água desionizada, destilada, adicional, para garantir o volume final da formulação equiparado a 2,0 ml.

A concentração final de imunógenos, quando formulados como uma suspensão de complexo imunoestimulador, combinado com sal mineral, tal como descrito acima, foi de 25 pg/0,5 ml ou 400 μ9/0,5 ml, respectivamente. A concentração final de Alhydrogel® preparada era dependente da espécie de objetivo. Formulações destinadas a roedores foram preparadas com 0,4 mg de AI/0,5 ml, enquanto formulações destinadas a primatas nãohumanos foram preparadas com 0,8 mg de AI/0,5 ml. Em todos os casos, as formulações acabadas foram ajustadas para tonicidade (0,9% de NaCI) e as usadas para os primatas não-humanos continham um conservante (0,25% v/v. 2-PE).

Exemplo 10: A imunoqenicidade de imunógenos de peptídeo de LHRH formulados como uma suspensão de complexo imunoestimulador com sal mineral, em roedores

Esse exemplo ilustra a imunogenicidade de imunógenos de peptídeo de LHRH formulados como complexos imunoestimuladores com oligonucleotídeos de CpG1, em combinação com sais minerais, que foram

imunizados por via intramuscular, em ratos machos. As suspensões de sal mineral foram preparadas tal como descrito no Exemplo 9.

Grupos de quatro ratos machos Sprague-Dawley, com 6 a 8 semanas de idade, foram imunizados por via intramuscular (I.M.) na semana 0, 5 4 e 8 com as seguintes composições: 25 pg de peptídeos de LHRH foram suspensos em um volume de 500 μΙ de água desionizada, destilada; 25 pg de peptídeos de LHRH foram suspensos em um volume de 250 μΙ de água desionizada, destilada e foram adicionados 250 μΙ de Alhydrogel® (1,6 mg de Al/ml); 25 pg de complexo imunoestimulador de peptídeos de 10 LHRH/CpG1 (relação de carga de 4:1), preparado tal como descrito na Tabela 9, foram suspensos em um volume de 500 μΙ de água desionizada, destilada; 25 pg de complexo imunoestimulador de peptídeos de LHRH/CpG1 (relação de carga de 4:1), preparado tal como descrito na Tabela 9, foram suspensos em um volume de 250 μΙ de água desionizada, 15 destilada e foram adicionados 250 μΙ de Alhydrogel® (1,6 mg de Al/ml). A cada formulação foram adicionados 45 μΙ de uma solução salina a 20% e 455,0 μΙ de água desionizada, destilada. O volume final de cada formulação foi de 1,0 ml.

Os ratos não apresentaram patologias flagrantes ou alterações 20 de comportamento após receber sais minerais contendo imunógenos de peptídeo ou sais minerais contendo o complexo imunoestimulador. Soros foram obtidos nas semanas +0, +4, +6, +8 e +12 e foram avaliados quanto à presença de anticorpos anti-LHRH por ELISA específico para imunógenos e quanto à testosterona no soro por análise imunológica RIA.

Medição de anticorpos anti-LHRH

As atividades dos anticorpos foram determinadas por ELISA usando placas de microtítulo de 96 cavidades, revestidas com peptídeo de LHRH⁵⁴ como imunossorvente.

Alíquotas (100 μΙ) da solução de imunógeno de peptídeo, a uma 30 concentração de 5 pg/ml, foram incubadas por 1 hora a 37°C. As cavidades foram subseqüentemente bloqueadas com uma solução de 3% de gelatina/PBS por 1 hora a 37°C. As placas foram depois secas e usadas para a • · ···· ·· • ··· ····

análise. Alíquotas (100 gg) dos soros imunes de teste, começando com uma diluição de 1:100 em um tampão de diluição de amostra e, depois, diluições de 10 vezes em série, foram adicionadas às placas revestidas com peptídeo. As placas foram incubadas por 1 -1,5 hora a 37°C. As placas foram lavadas seis vezes com 0,05% de TWEEN 20 em PBS. 100 μΙ de IgG anti-rato de cabra, qualificado com peroxidase de rábano-silvestre (Cappel), para análises realizadas em soros de rato, 100 μΙ de IgG antiporco de cabra, rotulado com peroxidase de rábano-silvestre (Pierce), para análises realizadas em soros de porcos, ou 100 μΙ de IgG anti-humano de cabra, rotulado com peroxidase de rábano-silvestre (Anogen), para análises realizadas em soros de babuínos, foram adicionados nas diluições apropriadas em tampão de diluição conjugado (PBS contendo 0,5 M de NaCI e soro de cabra normal). As placas foram incubadas por 1 hora a 37°C e lavadas, tal como descrito acima. Alíquotas (100 μΙ) de substrato de ortofenilenodiamina (OPD) a 0,04% em peso (Pierce) e 0,12% de H2O2 em tampão de citrato de sódio, pH 5,0, foram adicionadas por 15 minutos. As reações foram interrompidas pela adição de 50 μΙ de 2N de H2SO4 e A492 foi determinada para cada cavidade.

Títulos de ELISA foram calculados com base em análise de regressão linear das adsorbâncias, com interrupção A492, fixada em 0,5. Essa interrupção foi rigorosa, uma vez que os valores para amostras de controle normais, diluídas, usados com cada análise, foram de menos de 0,15. Medições de testosterona no soro

Os imunógenos foram avaliados quanto à eficácia por RIA para valores de testosterona no soro. Os níveis de testosterona no soro foram medidos usando um kit RIA de Diagnostic Products (Los Angeles, Califórnia) de acordo com as instruções do fabricante. O limite de detecção inferior para testosterona variou de 0,01 a 0,03 nmol/l. Cada amostra foi analisada em duplicata.

Amostras de soro foram avaliadas como estando em nível de castração, quando o nível de testosterona estava abaixo dos limites de detecção e como próximo à castração a < 0,1 nmol/l.

• ·

Resultados de imunoqenicidade

Os títulos de anticorpos no soro após a imunização de imunógenos de LHRH são mostrados na Figura 13a. Os níveis de testosterona no soro são mostrados na Figura 13b.

Os títulos de anticorpos determinados de soros obtidos de ratos machos neste estudo provaram que nem a composição de peptídeos de LHRH em tampão, nem peptídeos de LHRH em combinação com os sais minerais Alhydrogel® foram imunogênicos. Por outro lado, ambas as composições derivadas do complexo imunoestimulador de LHRH/CpG1, sozi10 nhas ou em combinação com o sal mineral Alhydrogel®, mostraram ser imunogênicas, tal como representado na Figura 13a.

As respostas de anticorpos desses dois últimos grupos mostraram-se semelhantes durante as primeiras 8 semanas. Na semana 12, os títulos de anticorpos encontrados para o sistema combinado do complexo 15 imunoestimulador de LHRH e sal mineral Alhydrogel® foram apenas marginalmente melhores (isto é, ~0,5 unidades de log) do que os determinados para o complexo imunoestimulador de LHRH, sozinho.

Os níveis de testosterona no soro correspondentes, determinados para composições de peptídeos de LHRH em tampão e peptídeos de 20 LHRH em combinação com os sais minerais Alhydrogel®, demonstraram igualmente que nem o peptídeo de LHRH nem peptídeo de LHRH com formulações de sais minerais foram capazes de obter imunocastração em ratos machos.

Por outro lado, tanto o complexo imunoestimulador derivado de peptídeos de LHRH/CpG1 sozinho, e a combinação de peptídeos de LHRH/oligonucleotídeos de CpG1 com sais minerais Alhydrogel® imunocastraram eficazmente todos os ratos em cada grupo, tal como mostrado na Figura 13b.

A imunocastração completa para cada rato na composição deri30 vada do complexo imunoestimulador de LHRH, combinado com os sais minerais Alhydrogel®, foi obtida pela semana 6 (2 semanas após a primeira carga). Um nível semelhante de imunocastração para a composição deriva77 ········ ··

da do complexo imunoestimulador de LHRH, sozinho, não foi obtido até a semana 10 (2 semanas após a segunda carga).

Nesse exemplo, demonstrou-se um novo regime de vacinação para obter imunocastração eficaz (tal como medida por testosterona no 5 soro), quer com a composição preparada de complexo imunoestimulador de

A

LHRH (em uma estratégia de imunização de 3 doses), quer com um complexo imunoestimulador de LHRH em combinação com um sal mineral (em uma estratégia de imunização de duas doses).

O sal mineral Alhydrogel® administrado sozinho com imunóge10 nos de peptídeo de LHRH provou ser um adjuvante ineficaz. Porém, quando formulado com os imunógenos de LHRH na forma de um complexo imunoestimulador, a combinação produziu resultados muito superiores sinergica. mente. O sal mineral em si pode agir de dois modos. O primeiro, pode ser * - fornecer um reservatório localizando o complexo imunoestimulador no local . . 15 da injeção e, em segundo lugar, recrutando células especializadas do sistema imunológico que podem facilitar a apresentação do imunógeno ao sistema imune.

Experiências concomitantes foram realizadas com sais minerais alternativos, Adju-phos® (derivados de fosfato de alumínio) e a imunocastra20 ção total em todos os ratos foi obtida na semana 8, apenas para o sistema derivado do complexo imunoestimulador de LHRH em combinação com o sal mineral Adju-phos®.

Exemplo 11: A imunoqenicidade dos imunógenos de peptídeo de LHRH formulados como uma suspensão de complexo imunoestimulador com sal mi25 neral em babuínos

Esse exemplo ilustra a imunogenicidade de imunógenos de peptídeo de LHRH formulados como complexos imunoestimuladores com oligonucleotídeos de CpG1 em diversas relações, em combinação com sais minerais, que foram imunizados por via intramuscular em babuínos machos.

As suspensões de sais minerais foram preparadas tal como descrito no Exemplo 9.

Grupos de dois babuínos machos, com 2 anos de idade, foram

• · imunizados por via intramuscular (I.M.) nas semanas 0, 4 e 8 com as seguintes composições: 400 μg de complexo imunoestimulador de peptídeos de LHRH/CpG1 (relações de carga de 4:1 ou 1,5:1), preparado tal como descrito na Tabela 9, foram suspensos em um volume de 500 μΙ de água 5 desionizada, destilada; 400 μg de complexo imunoestimulador de peptídeos de LHRH/CpG1 (relação de carga de 4:1 ou 1,5:1), preparado tal como descrito na Tabela 9, foram suspensos em um volume de 250 μΙ de água desionizada, destilada, e foram adicionados 250 μΙ de Alhydrogel® (3,2 mg de Al/ml). A cada formulação foram adicionados 45 μΙ de uma solução salina a 10 20%, 2,5 μΙ de 2-fenóxi-etanol e 452,5 μΙ de água desionizada, destilada. O volume final de cada formulação foi de 1,0 ml.

Os babuínos não apresentaram patologias flagrantes ou altera. ções de comportamento após receber complexo imunoestimulador em qual- • quer relação ou em combinação com o sal mineral Alhydrogel®. Soros foram * 15 obtidos nas semanas +0, +4, +6, +8, +12 e +14 (apenas para os complexos de 1,5:1) e foram avaliados quanto à presença de anticorpos anti-LHRH por ELISA específico para imunógenos e quanto a testosterona no soro por análise imunológica RIA.

Resultados de imunogenicidade

Os títulos dos anticorpos no soro após a imunização de imunógenos de LHRH são mostrados na Figura 14a. Os níveis de testosterona no soro correspondentes para cada babuíno são mostrados nas Figuras 14b e 14c, respectivamente.

Os títulos de anticorpos determinados de soros obtidos de ba25 buínos machos imunizados por complexos imunoestimuladores de LHRH preparados em uma relação de carga de 4:1 ou 1:5:1 ou em uma combinação de complexos imunoestimuladores de peptídeo de LHRH e sais minerais Alhydrogel®, preparados ou em uma relação de carga de 4:1 ou de 1,5:1, indicaram que todas as composições eram imunogênicas, tal como mostrado na Figura 14a.

Títulos de anticorpos marginalmente mais altos foram encontrados para ambos os sistemas preparados na relação de carga de 4:1 com ♦ ·· ·

relação aos títulos de anticorpos obtidos do sistema de 1,5:1, independentemente do fato do sal mineral Alhydrogel® estar presente ou não.

Os níveis de testosterona no soro correspondentes, determinados de soros obtidos de babuínos machos imunizados com complexos imunoestimuladores de LHRH preparados na relação de carga de 4:1, sem sal mineral Alhydrogel® provaram ser totalmente ineficazes para os dois babuínos em teste, tal como mostrado na Figura 14b.

Foi mostrado que o sistema formulado dos complexos imunoestimuladores, preparados na relação de carga de 1,5:1 sem sal mineral Alhydrogel®, regula mais eficazmente para baixo a resposta de testosterona no soro para um dos babuínos no teste, porém não foi obtida a imunocastração total, tal como mostrado na Figura 14c.

Para a composição preparada de um complexo imunoestimulador de peptídeo de LHRH (relação de carga de 4:1), em combinação com Alhydrogel® foi obtida imunocastração total em um babuíno na semana 10 e foi demonstrado que era constante até a semana 14, tal como mostrado na Figura 14b. Níveis de testosterona no soro próximos à castração foram obtidos no outro babuíno nesse grupo, embora essa resposta provasse ser temporária, tal como mostrado na Figura 14b.

Para a composição preparada de complexo imunoestimulador de LHRH (relação de carga de 1,5:1), em combinação com Alhydrogel®, os dois babuínos no estudo foram imunocastrados com sucesso (um babuíno alcançou isso na semana 8 e o outro, na semana 10) e esse efeito provou continuidade até a semana 14, tal como mostrado na Figura 14c.

Para formulações derivadas de complexos imunoestimuladores de LHRH, preparados a uma relação de carga de 4:1 ou de 1,5:1 (concentração de peptídeo de LHRH = 400 pg), a quantidade eficaz de imunógenos de peptídeo de LHRH ligados na forma de um complexo imunoestimulador varia significativamente. A Tabela 8 mostra a proporção de imunógeno de LHRH administrada nessa forma como uma função de relações de carga variáveis. Aproximadamente 16% (~63 gg) dos imunógenos de LHRH em solução estão ligados na forma de um complexo imunoestimulador quando

preparados a uma relação de carga de 4:1, enquanto aproximadamente 86% (~344 μg) estão ligados quando preparados na relação de 1,5:1.

A apresentação da maioria dos imunógenos de LHRH na forma de um complexo imunoestimulador, tal como no sistema da relação de 1,5:1, forneceu respostas de imunocastração mais duradouras e mais precoces em babuínos. Experimentalmente determinou-se que o sal mineral Alhydrogel® adsorve 10% adicionais dos imunógenos de LHRH não-ligados, livres, em solução, quando da adição. Desse modo, é provável que o mecanismo pelo qual o sal mineral aperfeiçoa a eficácia da vacina, quando combinado com o complexo imunoestimulador, está provavelmente ligado a efeitos imunomoduladores indiretos.

Experiências concomitantes foram realizadas com um sal mineral alternativo, Adju-phos® (derivado de fosfato de alumínio) e a imunocastração total foi demonstrada em um babuíno na semana 10, enquanto o outro babuíno em teste demonstrou níveis próximos à castração de testosterona no soro nessa ocasião.

Nesse exemplo, demonstrou-se que um complexo imunoestimulador de LHRH, em combinação com um sal mineral, é uma vacina eficaz para obter imunocastração (tal como medida por testosterona no soro) em um primata não-humano.

Além disso, mostrou-se que a cinética de formulação da resposta de imunocastração é uma função da relação de carga inicial de imunógenos de LHRH para oligonucleotídeos de CpG1 e seleção de sais minerais.

Especificamente, esse exemplo indica o potencial dessas novas formulações, baseadas em combinação, para o desenvolvimento de vacinas seguras úteis para ablação hormonal em animais ou seres humanos.

Além disso, esse exemplo indica fortemente o potencial dessas novas formulações baseadas em combinação para o desenvolvimento de vacinas seguras, apropriadas para o tratamento de câncer de próstata sensível a androgênio em seres humanos.

Exemplo 12: Preparação de emulsões de água-em-óleo de ISA Montanide® 50v, complexo imunoestimulador derivado de LHRH na presença de um fragmento de peptídeo derivado de IL-1 β

A um recipiente de 10 ml foram adicionados 1.000 pg de imunógenos de peptídeo de LHRH (SEQ ID NOS: 7-9 em uma relação molar de 1:1:1 em solução), dissolvidos em um tampão aquoso apropriado (2.500 pl, 0,4 mg/ml) e oligonucleotídeo de CpG1, para preparar um complexo imunoestimulador (relação de carga de 16:1) ou 1.000 pg de imunógenos de peptídeo dissolvidos em um tampão aquoso apropriado (2.500 pl, 0,4 mg/ml) mais um peptídeo derivado de IL-1 β (SEQ ID NO: 14, C*VQGEESNDKIPC*CO2H.HCI (em que C* indica ciclização entre duas cisteínas) em solução; ou 1.000 pg de imunógenos de peptídeo dissolvidos em um tampão aquoso apropriado (2.500 pl, 0,4 mg/ml) foram adicionados a uma mistura de peptídeo de CpG1 e IL-1 β, para preparar uma combinação de complexo imunoestimulador de LHRH (relação de carga de 16:1) e peptídeo de IL-1 β. A Tabela 9 mostra os cálculos usados para determinar a quantidade relativa de oligonucleotídeo de CpG1 necessária para complexação com imunógenos de peptídeo de LHRH para uma dosagem final fixa de 100 pg/1,0 ml, com relação à relação de carga especificada.

Sabe-se que fragmentos baseados em peptídeo derivados de IL1β possuem propriedades de facilitação. O peptídeo de IL-1 β usado no presente é relativamente pequeno (FW = 1421,5) e carregado negativamente quando dissolvido em tampões fisiológicos usuais. Usando os cálculos descritos no Exemplo 2, um nMol de peptídeo de IL-1 β contribuiu com 2 nMoles de carga negativa., Como tal, não estava previsto que essa molécula iria interagir fisicamente com os imunógenos de LHRH e não foi encontrado nenhum indício de complexação na forma de um precipitado, quando da mistura.

Especificamente, para preparar um complexo imunoestimulador de imunógenos de peptídeo de LHRH a uma relação de carga de 16:1 de LHRH:CpG1, foram usados 18,3 pg de oligonucleotídeo de CpG1 (9,2 pl, 2,0 pg/ml). Para preparar uma solução de imunógenos de peptídeo de LHRH e

IL-Ιβ, 10 pg de IL-Ιβ (5,0 pl, 2,0 pg/ml) foram adicionados em um tampão aquoso apropriado. Para preparar um complexo imunoestimulador de _ imunógenos de peptídeo de LHRH, a uma relação de carga de 16:1 de . LHRH:CpG1 mais IL-Ιβ, foram misturados 18,3pg de oligonucleotídeos de _m 5 CpG1 (9,2 pl, 2,0 pg/ml) e 10 pg de peptídeo de IL-Ιβ (5,0 pl, 2,0 pg/ml).

A cada um dos recipientes foi adicionado solvente aquoso dilu* ente adicional, de modo que o volume final da fase aquosa foi fixado em 5,0 ml para preparação de emulsões de a/o de ISA Montanide® 50v, respectivamente.

Para preparação do grupo placebo, foram usados 5,0 ml de solução salina normal para a fase aquosa.

Para os imunógenos de peptídeo de LHRH, constatou-se que . solução salina normal era apropriada para complexação. O IP calculado para * cada peptídeo é maior que 9,0 (Tabela 1), muito maior do que o pH do sol- » 15 vente aquoso selecionado.

Esse exemplo demonstra as vantagens de estabilizar imunógenos em solução, na forma de um complexo imunoestimulador. Mostrou-se que o processo de complexação é compatível na presença de imunomoduladores adicionais.

As suspensões aquosas, diluídas, de imunógenos de LHRH ou solução de placebo foram então adicionadas lentamente a um recipiente de reação de 25 ml seco, carregado com ISA Montanide® 50v (5,0 ml). As adições foram feitas durante a homogeneização (High Shear Laboratory Mixer, Sealed Unit, Silverson) da mistura a baixas velocidades (2.000-3.000 rpm), para gerar uma emulsão bruta. Essa velocidade de processamento foi mantida até que a amostra aquosa tivesse sido totalmente adicionada e foi prosseguida por 2 minutos completos, para garantir uma pré-mistura uniforme das fases aquosa e oleosa. A velocidade de homogeneização foi depois aumentada (5.000-8.000 rpm) e mantida por 5 a 10 minutos, resultando adicio30 nalmente na formação de uma emulsão de a/o branca, homogênea, finamente dispersa.

A concentração final de imunógenos quando formulados como

emulsões de água-em-óleo, tal como descrito acima, foi de 100 pg/ml. Exemplo 13: A imunogenicidade e efeitos estimuladores de crescimento de imunógenos de peptídeo de LHRH formulado como um complexo imunoestimulador ou com peptídeo de IL-Ι β ou como uma combinação de um com5 plexo imunoestimulador com peptídeo de IL-1 β em uma emulsão de a/o

Esse exemplo demonstra a imunogenicidade de imunógenos de ’ peptídeo de LHRH formulados como complexos imunoestimuladores, em combinação com uma emulsão de a/o ou com um imunomodulador (peptídeo de IL-1 β), em combinação com uma emulsão de a/o ou como complexos 10 imunoestimuladores combinados com um imunomodulador adicional (peptídeo de IL-1 β) em uma emulsão de a/o, que foram imunizados por via intramuscular, em varrões. As emulsões de a/o foram preparadas por homogeneização, tal como descrito no Exemplo 4a e no Exemplo 12.

* Grupos de cinco varrões (cada qual com 30 kg), foram imuniza. · 15 dos por via intramuscular (I.M.) nas semanas 0 e 8 com as seguintes composições: 100 gg de complexo imunoestimulador de peptídeos de LHRH/CpG1 (relação de carga de 16:1), preparado tal como descrito na Tabela 9, suspensos em um volume final de 500 μΙ de NaCI e dispersos com ISA Montanide® 50v (500 μΙ); peptídeos de LHRH/peptídeo de IL-1 β (1 pg) 20 foram suspensos em um volume final de 500 μΙ de NaCI e dispersos com ISA Montanide® 50v (500 μΙ); ou complexo imunoestimulador de peptídeos de LHRH/(CpG1 + peptídeo de IL-1 β (1 μρ)) (relação de carga de 16:1), preparado tal como descrito na Tabela 9, foi suspenso em um volume final de 500 μΙ de NaCI disperso com ISA Montanide® 50v (500 μΙ). Um grupo de controle de placebo de 500 μΙ de NaCI disperso com ISA Montanide® 50v (500 μΙ) foi preparado e um grupo de controle não-imunizado, incluído no estudo, foi castrado cirurgicamente.

Os varrões não apresentaram patologias flagrantes ou alterações de comportamento após receber emulsões de a/o de placebo, emul30 sões de a/o contendo imunógenos de peptídeo em combinação com peptídeo IL/1 β ou emulsões de a/o contendo o complexo imunoestimulador ou complexo imunoestimulador em combinação com peptídeo de IL-1 β. Soros

foram obtidos nas semanas +0, +8, +10, +12 e +14 e foram avaliados quanto à presença de anticorpos anti-LHRH por ELISAs específicas para imunógenos e quanto à testosterona no soro por análise imunológica RIA e quanto a ganho de peso.

Resultados de imunogenicidade

Os títulos dos anticorpos no soro após a imunização de imunó genos de LHRH são mostrados na Figura 15a. Os níveis de testosterona no soro correspondentes são mostrados na Figura 15b. Os efeitos de imunocastração após a imunização de imunógenos de LHRH versus castração 10 cirúrgica sobre o ganho de peso sobre o período de teste são mostrados na Figura 15c. Experimentos de controle demonstraram que peptídeo sem adjuvante era não-imunogênico ou fracamente imunogênico em todos os ca. sos.

• Os títulos de anticorpos determinados de soros obtidos de var. * 15 rões machos imunizados por complexos imunoestimuladores, peptídeos de

LHRH facilitados por uma citocina ou por um complexo imunoestimulador de LHRH co-formulado com uma citocina, administrados como emulsões de alo, indicaram que todas as três composições eram imunogênicas. Os títulos obtidos em todas as ocasiões durante o período de teste mostraram-se 20 comparáveis. Os grupos de controle negativos, de placebo e cirurgicamente castrados, não apresentaram quaisquer títulos, tal como mostrado na Figura 15a.

Os níveis de testosterona no soro correspondentes, determinados de soros obtidos de varrões imunizados por complexo imunoestimulador 25 LHRH em uma emulsão de alo ou peptídeos de LHRH facilitados por um peptídeo de IL-1 β em uma emulsão de alo ou por uma combinação de complexo imunoestimulador de LHRH e o peptídeo de IL-1 β, administrado como emulsão de alo, indicaram que os varrões machos nesses grupos foram eficazmente imunocastrados pela semana 12.

Notavelmente, as composições derivadas do complexo imunoestimulador de LHRH em emulsão de alo e os peptídeos de LHRH facilitados pelo peptídeo de IL-1 β em uma emulsão de alo não conseguiram manter

esse nível de testosterona no soro. Pela semana 14, mostrou-se que os níveis de testosterona no soro dos dois grupos estavam recuando e nenhum dos grupos pode ser descrito como tendo sido imunocastrado.

A vacina de LHRH, formulada como uma combinação de com5 plexo imunoestimulador e peptídeo de IL-1 β como uma emulsão de a/o, provou ser mais eficaz, mantendo o mesmo nível de imunocastração, sem indi’ cação de recuo precoce, tal como mostrado na Figura 15b.

O grupo de controle negativo de placebo apresentou valores de testosterona no soro amplamente variáveis, nas diversas ocasiões avalia10 das, em concordância com as variações esperadas em níveis hormonais mensais. Os grupos de controle positivo castrados cirurgicamente apresentaram níveis de testosterona no soro negativos em todas as ocasiões sobre _ o período de teste, tal como mostrado na Figura 15b.

• O nível de testosterona no soro em varrões antes de ser abati. - 15 dos foi correlacionado diretamente com a qualidade da carne produzida. Altos níveis de testosterona dão origem a produtos de sabor desagradável (verruga de varrão) e, portanto, controlar essa propriedade é uma consideração de mercado importante. O método padrão para garantir testosterona insignificante tem sido a castração cirúrgica. Um método de vacina viável 20 precisa mostrar-se eficaz pelo intervalo de tempo no qual os varrões são normalmente levados ao mercado. O ponto em que os varrões atingiram um peso entre 110-130 kg.

O estímulo de crescimento de varrões imunizados com 8 semanas de idade nesse estudo, foi acompanhado por 14 semanas. Os varrões 25 imunocastrados pelo complexo imunoestimulador de LHRH em uma emulsão de a/o ou por peptídeos de LHRH facilitados apenas pelo peptídeo de IL-1 β em uma emulsão de a/o, apresentaram ganhos de peso que se equiparavam aos do grupo castrado cirurgicamente. Os mesmos atingiram, em média, 110 kg pela semana 14, tal como mostrado na Figura 15c.

Inesperadamente, o grupo imunizado pela vacina de LHRH, formulada como uma combinação do complexo imunoestimulador de LHRH e peptídeo de IL-1 β em uma emulsão de a/o, mostrou-se consideravelmente

mais eficaz. Todos os varrões dentro desse grupo responderam rapidamente, indicando os ganhos de peso médios mais altos, em todas as ocasiões avaliadas, em comparação com os outros grupos em teste. Varrões desse grupo atingiram um peso médio ligeiramente abaixo de 120 kg pela semana 5 12 e atingiram 130 kg pela semana 14, tal como mostrado na Figura 15c.

A disparidade entre esse grupo e os outros em teste pode ser devido a uma combinação sinérgica de efeitos obtidos quando o complexo imunoestimulador de LHRH/CpG1 é apresentado ao sistema imunológico em combinação com o peptídeo de IL-1 β e peptídeo de LHRH não-complexado, 10 livre, em uma emulsão de a/o.

A formulação de combinação provou ser eficaz com quantidades muito pequenas de complexo imunoestimulador de LHRH/CpG1 presentes em suspensão. Nesse exemplo, uma relação de carga de 16:1 de LHRH:CpG1 forneceu respostas significativas em todos os porcos.

O grupo de controle de placebo mostrou-se o mais fraco em estimular crescimento sobre o período de teste. O ganho de peso médio para esse grupo foi signíficativamente reduzido em relação a todos os outros, tal como mostrado na Figura 15c.

Aperfeiçoamentos marginais em ganho de peso como uma con20 sequência de imunocastração em relação a controles de placebo foram observados no passado, porém nesse exemplo, demonstrou-se um novo método para obter imunocastração eficaz para a remoção de verruga de varrão (tal como medida por testosterona no soro) e obter um estímulo de crescimento superior (tal como medido por ganho de peso) sobre o período de 25 teste, com relação ao método usual de castração cirúrgica.

Além disso, varrões imunocastrados pelas vacinas de LHRH formuladas como uma combinação de um complexo imunoestimulador e um peptídeo de IL-1 β em uma emulsão de a/o, puderam ir ao mercado 2 semanas mais cedo do que varrões machos imunizados por qualquer formulação 30 alternativa, ou pelo atual método, de preferência, a castração cirúrgica.

Especificamente, as economias monetárias, em termos de evitar perdas devido a traumas cirúrgicos, custos reduzidos de alimentação e esta87

bulação e rendimento aperfeiçoado em termos de tempo de comercialização, são significativos, demonstrando as vantagens desse método aperfeiçoado _ de imunocastração e estímulo de crescimento.

Exemplo 14: Preparação de emulsões de água-em-óleo de ISA Montanide® . 5 50 v e complexos imunoestimuladores derivados de FMD

A um recipiente de 20 ml foram adicionados 4,000 gg de imunógenos de peptídeo de FMD (SEQ ID NOS: 12-13 em solução), dissolvidos em um tampão aquoso apropriado (2.000 gl, 2,0 mg/ml) ou foram adicionados 4.000 gg de imunógenos de peptídeo dissolvidos em um tampão aquoso 10 apropriado (2.000 gl, 2,0 mg/ml) e oligonucleotídeo de CpG1, para preparar um complexo imunoestimulador (relação de carga de 4:1). A Tabela 9 mostra os cálculos usados para determinar a quantidade relativa de oligonucleo. tídeo de CpG1 necessária para complexação com os imunógenos de peptí* deo de FMD, para uma dose final fixa de 200 gg/1,0 ml, com respeito à rela•15 ção de carga especificada.

Especificamente, para preparar um complexo imunoestimulador de imunógenos de peptídeo de FMD a uma relação de carga de 4:1 de FMD:CpG1, foram usados 125 gg de oligonucleotídeo de CpG1 (62,5 gl, 2,0 gg/ml).

A cada um dos recipientes, foi adicionado diluente de solvente aquoso adicional, de modo que o volume final da fase aquosa foi fixado em 10,0 ml para preparação de emulsões de ISA Montanide® 50v, respectivamente.

Para a preparação do grupo de placebo, foram usados 10,0 ml 25 de solução salina normal para a fase aquosa.

Para a biblioteca de imunógenos de peptídeo de FMD, solução salina normal foi considerada apropriada para complexação. O IP médio calculado para cada peptídeo derivou de um análogo posicionai na biblioteca maior do que 9,0 (Tabela 1), bem maior do que o pH do solvente aquoso 30 selecionado.

As suspensões aquosas diluídas de imunógenos de FMD ou solução de placebo foram depois adicionadas lentamente a um recipiente de

reação de 25 ml seco, carregado com ISA Montanide® 50v (10,0 ml). As adições foram feitas durante a homogeneização (HighShear Laboratory Mi_ xer, Sealed Unit, Silverson) da mistura a baixas velocidades (2.000-3.000 rpm), para gerar uma emulsão bruta. Essa velocidade de processamento foi . 5 mantida até que a amostra aquosa tivesse sido adicionada completamente e foi continuada por 2 minutos inteiros, para garantir uma pré-mistura uniforme *

das fases aquosa e oleosa. A velocidade de homogeneização foi depois aumentada (5.000-8.000 rpm) e mantida por 5 a 10 minutos, resultando adicionalmente na formação de uma emulsão de a/o homogênea, branca, fina10 mente dispersa.

A concentração final de imunógenos quando formulados em emulsões de água-em-óleo, tal como descrito acima, foi de 200 gg/ml.

- Exemplo 15: A imunogenicidade e proteção de imunógenos de peptídeo de * FMD formulados como um complexo imunoestimulador em uma emulsão de ’ \ 15 a/o

Esse exemplo ilustra a imunogenicidade de imunógenos de peptídeo de FMD formulados como uma emulsão de a/o ou como complexos imunoestimuladores de FMD em combinação com uma emulsão de a/o, que foram imunizados por via intramuscular em gado. As emulsões de a/o foram 20 preparadas por homogeneização, tal como descrito no Exemplo 4a e Exemplo 14.

Grupos de três cabeças de gado adultos foram imunizados por via intramuscular (I.M.) na semana 0 e 3 com as seguintes composições: 400 μg de peptídeos de FMD suspensos em um volume final de 1.000 μΙ de 25 NaCI e dispersos com ISA Montanide® 50v (1.000 μΙ); ou complexo imunoestimulador de peptídeos de FMD/oligonucleotídeo de CpG1 (relação de carga de 4:1), preparado tal como descrito na Tabela 9 e suspenso em um volume final de 1.000 μΙ de NaCI e dispersos com ISA Montanide® 50v (1.000 μΙ). Foi preparado um grupo de controle de placebo de 1.000 μΙ de 30 NaCI, emulsificado com ISA Montanide® 50v (1.000 μΙ).

O gado não apresentou patologias flagrantes ou alterações de comportamento após receber emulsões de a/o de placebo ou emulsões de

a/o contendo imunógenos de peptídeo de FMD ou complexos imunoestimuladores de FMD. Soros obtidos na semana +5 foram avaliados quanto à pre__ sença de anticorpos neutralizadores de FMD e na semana +6 o gado foi submetido a um teste de imunidade com vírus vivos, para determinar o nível 5 de proteção, em um teste com duração de 14 dias.

Medição de anticorpos de anti-FMD - Análise de neutralização

A análise de neutralização quantitativa (NA) para anticorpos de FMD foi realizada com células de BHK-21 em placas de microtítulo de fundo plano, classificada para cultura de tecidos. O teste é um teste de volumes 10 iguais em quantidades de 50 μΙ. Começando de uma diluição de 1:4, os soros foram diluídos em uma série de diluição de duas vezes em duplicata. Amostras de soro a serem testadas foram misturadas com um volume igual . do tipo de soro FMDV OManisa (200 TCID₅₀/0,05 ml) e incubadas por uma * hora a 37°C. Uma suspensão de células a 10⁶ células/ml foi preparada em

'.15 um meio contendo 10% de soro bovino. A cada cavidade foi adicionado um volume de 50 μΙ de suspensão de células. As placas foram vedadas e incu’ badas a 37°C por 2-3 dias.

O exame microscópico foi possível após 48 horas. A fixação foi realizada com 10% de formol/solução salina por 30 minutos. Para mancha20 mento, as placas foram imersas em 0,05% de azul de metileno em 10% de formalina por 30 minutos. Cavidades positivas (nas quais os vírus foram neutralizados e as células permaneceram intactas) mostraram conter células tingidas de azul. As cavidades negativas estão vazias. Os títulos foram expressos como a diluição final de soro presente na mistura de soro/vírus no 25 ponto terminal de 50%.

Protocolo de teste de imunidade em gado

No dia 35, todas as cabeças de gado que receberam vacina ou controles de placebo no dia 0 e no dia 21 foram separadas por grupos em salas de confinamento separadas. No dia 42, cada animal foi submetido a 30 teste de imunidade por via intradermolingual (IDL), com um total de 10⁴ BI50 FMDV O injetado em dois locais na superfície dorsal da língua.

Após o teste de imunidade, o gado foi observado quanto ao des90 • ·

envolvimento de sinais clínicos de FMD por 14 dias e a temperatura corporal foi registrada diariamente. Animais não protegidos apresentam lesões em locais diferentes da língua. Os animais de controle precisam desenvolver uma infecção generalizada, tal como mostrada por lesões em pelo menos , 5 três patas, para que o teste de imunidade de vírus seja considerado válido.

Resultados de imunoqenicidade ' Os títulos de anticorpos neutralizadores (N.A.) após a imunização de imunógenos de FMD e os resultados de proteção correspondentes são mostrados na Tabela 10.

Os títulos de N.A. determinados de soros obtidos de gado (semana +5) imunizados por imunógenos de peptídeo de FMD ou por complexos imunoestimuladores de FMD, administrados como emulsões de a/o, in. dicaram que as duas composições eram imunogênicas. Os títulos obtidos ° por ocasião da semana 5 eram altamente variáveis, mas em todos os casos . ’ 15 mostraram ser maiores que 16. A exigência mínima para prova de potência para uma vacina de febre aftosa, tal como estabelecida pelo Office Intemational des Epizooties (OIE) é um título de N.A. de 16. Cada touro no grupo de controle negativo de placebo apresentou títulos de N.A. insignificantes, todos os quais eram menores que 16, tal como mostrado na Tabela 10.

Prova conclusiva para proteção precisa ser obtida por teste de imunidade dos grupos imunizados com vírus vivos com título especificados. Vírus vivos foram administrados por via intradermolingual (IDL), com um total de 10⁴ BID₅o FMDV O injetado em dois locais na superfície dorsal da língua.

O protocolo do teste de imunidade foi iniciado na semana 6, uma semana após os títulos de N.A. terem sido estabelecidos para todos os grupos e os resultados na Tabela 10 provam que a formulação derivada de complexos imunoestimuladores de peptídeos de FMD/CpG1, em combinação com peptídeos de FMD não-ligados, administrados como uma emulsão de a/o, foi superior (3/3 protegidos) à formulação derivada de peptídeos de

FMD administrados como uma emulsão de a/o, sozinhos (1/3 protegido).

O grupo de controle de placebo confirmou que os vírus vivos usados para o teste de imunidade eram suficientemente virulentos, uma vez • · ·

que todas as três cabeças de gado nesse grupo foram infectadas e mostraram sinais da doença no espaço de 14 dias após o teste de imunidade (0/3 protegido), tal como mostrado na Tabela 10.

Os dois grupos formulados com imunógenos de FMD ou um 5 complexo imunoestimulador de FMD em uma emulsão de a/o obtiveram títulos de anticorpos de N.A. significativos pela semana +5.

Surpreendentemente, o estudo de imunidade demonstrou que a formulação de eficácia superior foi derivada da formulação que compreende o complexo imunoestimulador de FMD na emulsão de a/o. É provável que 10 essa composição aperfeiçoe, concomitantemente, as repostas de N.A. e seja mais eficaz em regular para cima um tipo específico de resposta imune importante para combater infecções virais.

Especificamente, o complexo imunoestimulador derivado de FMD e CpG1 apresentado na forma de uma emulsão de a/o pode aumentar, 15 efetivamente, o ramal Th-ι da resposta imune (por exemplo, IFN-gama). Esse papel dos oligonucleotídeos de CpG foi bem estabelecido em outros modelos e o IFN-gama em si mostrou ser um imunomodulador eficaz, obtendo proteção imunológica contra vírus da gripe.⁷²

O controle da febre aftosa, quando for identificada uma mani20 festação, freqüentemente é executado fazendo o aparte do rebanho infectado e de rebanhos vizinhos. A perda de produtos importantes, tais como gado, porcos e carneiros, muitas vezes é significativa. As estratégias de vacina existentes usam vírus mortos, que, em alguns casos, são produzidos localmente e de qualidade inferior. A produção com vírus vivos tem diversas 25 questões referentes à produção associadas a mesma e os produtos em si representam um risco de segurança potencial. Uma estratégia baseada em imunógenos derivados de peptídeos sintéticos representa um método aperfeiçoado para imunização eficaz e podem ser considerados de baixo risco.

Especificamente, esse exemplo demonstra que uma estratégia 30 de vacina baseada em peptídeos sintéticos pode proteger o gado com segurança e eficácia contra a febre aftosa.

Além disso, esse exemplo demonstra ainda a utilidade desse

método de vacina para a proteção geral de animais domésticos importantes, suscetíveis à febre aftosa.

Tabela 1

Imunógenos de Peptídeo Sintéticos e Oligonucleotídeos

Vacina	SEQ ID N°	Seqüência	IP	FW
Vacina contra HIV	4	ISITEIKGVIVHRIETILF- (εΚ) CNQGSFLTKGPSKLNDRADSRRSLWDQGNC	9,30	5646
5	KKKTDRVIEVLQRAGRAIL- (εΚ) CNQGSFLTKGPSKLNDRADSRRSLWDQGNC	10,30	5659
(CD4)	6	ISITEIKGVIVHRIETILF- (εΚ) CHASIYDFGSC	6,91	3493
Vacina	7	KKQYIKANSKFIGITELEHWSYGLRPG	9,70	3164
contra	8	TAKSKKFPSYTATYQFGGFFLLTRILTIPQSLEGGEHWSYGLRPG	9,70	5052
câncer de próstata (LHRH)	9	TAKSKKFPSYTATYQFGGLSEIKGVIVHRLEGVGGEHWSYGLRPG	9,60	4910
Vacina	10	KKKIITITRIITIITTID- (εΚ) CGETYQSRVTHPHLPRA-LMRSTTKC	10,31	5068
contra alergia (igE)	11	ISITEIKGVIVHRIETILF- (εΚ) CGETYQSRVTHPHLPRAIMR JL X 4\Awr	9,69	5165
Vacina	12	ISISEIKGVIVHKIETILF- (εΚ) YNGSCKYSDARVSNVRGDLQR- T RT TR	-9,39	6759-
contra	13	GDLQVIAQKAERCLPSSFNYGAIK		6851
febre af-		T
tosa (FMD)

Oligonucleotídeo	Seqüência	Tm	FW
SEQ ID NO: 1	5'- TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT -3'	77,1°C	10,295
SEQ ID NO: 2	5'- nTC GTC GTT TTG TCG TTT TGT CGT T -3' n = grupo tioato de fósforo	70,9°C	7,400

IP = potencial de ionização teórico (ref. 68)

FW = peso de fórmula, Tm = iniciador para o alvo Tm (em % em GC)

Tabela 2

Cálculos de Carga Molar

Imunógenos de Peptídeo Sintéticos e Oligonucleotídeos

Vacina	SEQ ID N°	Carga Líquida Calculada¹	Contribuição de % Molar de Peptídeo na Vacina	Equivalentes Molares Totais Médios Carga +'ve²	FW	FW³ de Peptídeo Total, Médio
Vacina CD4	4 5 6	4 +'ve 7 +'ve 2 +'ve	50% 25% 25%	1 nmol = 4,3 nmoles +'ve modificado	5646 5659 3493	5280,6
Vacina IgE	10 11	7 +'ve 9 +'ve	66,6% 33,3%	1 nmol = 7,7 nmoles +'ve modificado	5068 5165	5132,1
Vacina LHRH	7 8 9	4 +'ve 5 +'ve 4 +'ve	33,3% 33,3% 33,3%	1 nmol = 4,3 nmoles +'ve modificado	3164 5052 4910	4543,9
Vacina FMD	12	~3,5 +'ve	Biblioteca de peptídeo⁴	1 nmol ~ 3,5 nmoles +'ve modificado	6759-6851	6805⁵

1) Carga líquida: Calculada atribuindo uma carga +1 a cada lisina (K), arginina (R) ou histidina (H), uma carga -1 a cada ácido aspártico (D) ou ácido glutâmico (E) e uma carga de 0 a cada outro aminoácido dentro da seqüência. As cargas são somadas para cada peptídeo e expressas como a carga média líquida.

2) Equivalentes Molares Totais Médios de Carga +'ve de Peptídeos: Estimativas para a carga média da mistura de peptídeos combinados são calculadas somando a contribuição de carga molar total para cada componente dentro da mistura e tirando a média.

3) Peso de Fórmula de Peptídeos Total, Médio (FW): Estimativas para o FW de peptídeos total, médio, são calculadas somando a contribuição de massa molar total para cada componente dentro da mistura e tirando a média.

4) A vacina de FMD é derivada de uma biblioteca de peptídeos. A contribuição molar de cada componente é presumida como equivalente e os equivalentes molares totais, médios, da carga +'ve são calculados de modo similar.

5) Para a vacina de FMD, o peso da fórmula de peptídeos total, médio, é obtido somando o FW mais baixo e mais alto encontrado para os diversos peptídeos de FMD na biblioteca e tirando a média.

Equivalentes molares de carga -'va de oliqonucleotídeos de CpG: Cada grupo tioato de fósforo contribui com carga -1.

CpG1 (oligômero de 32 bases) -1 nmol CpG1 = 31,0 nmol carga -'va

CpG2 (oligômro de 24 bases + tioato de fósforo) -1 nmol CpG2 = 24,0 nmoles carga -'va

Tabela 3

Relações de Carga Molar Calculadas, Usadas para Preparar Complexos de Imunógenos de Peptídeo de LHRH e Qliqonucleotídeos de CpG1

Relação de Carga final (LHRH:CpG1)	nmoles de LHRH por carga para a relação de carga final de LHRH:CpG1 (LHRH de massa fixa)¹ (nmoles de carga +'ve)	nmoles teóricos de CpG1 necessários²	Massa eficaz (nmoles) de CpG1 usada FW= 10,925 pg/pmol (Tabela 1) (CpG1 = material A = 2,0 pg/pl) .
8:1 4:1 2:1 1:1 1:2	94,6/8 = 11,8 (razão —8:1) 94,6/4 = 23,7 (razão ~4:1) 94,6/2 = 47,3 (razão ~2:1) 94,6/1 = 94,6 (razão ~1:1) 94,6/0,5 = 189,4 (razão ~1:2)	11,8/31 = 0,38 nmoles CpG1 23,7/31 = 0,76 nmoles CpG1 47,3/31 = 1,53 nmoles CpG1 94,6/31 = 3,05 nmoles CpG1 189,4/31 =6,11 nmoles CpG 1	3.6 pg (0,37 nmoles) 7.3 pg (0,84 nmoles) 14,7 pg (1,45 nmoles) 29.3 pg (2,96 nmoles) 58.6 pg (5,91 nmoles)

CD cn

1) Carga molar +'ve total calculada para 100 uo de peptídeos de LHRH:

FW médio = 4543,9 pg/pmol (Tabela 2)

Total de carga molar +'ve de peptídeos de LHRH = 4,3 nmoles de carga +'ve/nmol de peptídeo de LHRH (Tabela 2)

Em 100 pg de peptídeos de LHRH, há 100 pg/4543,9 pg/pmol = 22,0 nmoles de imunógeno de LHRH

Total de carga molar +'ve = 22,0 nmoles x 4,3 nmoles carga +'ve/nmol de peptídeos de LHRH = 95,6 nmoles de carga +'ve

2) Cálculo da amostra:

Relação de carga molar final de 8:1 de imunógeno de LHRH para oligonucleotídeo de CpG1

100 pg de LHRH contribui com 94,6 nmoles de carga +'ve

Para estabelecer uma relação de carga molar de 8:1 de LHRH para CpG1 em solução, a quantidade de LHRH necessária que precisa ser neutralizada por CpG1 é calculada em 94,6 nmoles de carga +'ve/8 = 11,8 nmoles de carga +'ve

Portanto, 11,8 nmoles de carga +'ve contribuídos por LHRH precisam ser neutralizados por 11,8 nmoles de carga -'va contribuída por CpG1, nmol de CpG1 = 31 nmoles de carga -'va (Tabela 2).

Portanto, os nmoles totais de CpG1 necessários para contribuir 11,8 nmoles de carga -'va = 11,8/31 = 0,38 nmol de CpG1

Tabela 4

Cálculos da Relação de Carga Molar de Imunógenos de Peptídeo de IgE, CD4 e Oligonucleotídeos de CpG

Formulação	Dose de Peptídeo	Nmoles calculados de Carga de CpG Necessária para Peptídeo Especiflcado:Relação de Carga de CpG nmoles de lgE:nmoles de CpG1 (+/-)¹ nmoles de CD4: nmoles de CpG2 (+/-)²	nmol teóricos de CpG1 ou CpG2 (em massa) Necessários³	Massa Eficaz (nmoles) de CpG1 ou CpG2 Usados (CpG1 - Matéria-prima A = 2,0 pg/pl) (CpG2 - Matériaprima B = 2,0 pg/pl)
Emulsões de a/o de IgE	100 pg 100 pg	150:150,0 ~1:1, relação de carga neutra 150:37,5 ~ 4:1, relação de carga +'ve	150/31 = 4,8 nmoles CpG1 37,5/31 =1,2 nmoles CpG1	50 pg CpG1 (4,9 nmoles) 11,1 pg CpG1 (1,1 nmoles)
Géis de polímero de IgE	300 pg 300 pg	451:451 ~ 1:1, relação de carga neutra 451:112,8 ~ 4,1, relação de carga +'ve	451/31 = 14,5 nmoles CpG1 112,8/31 = 3,5 nmoles CpG1	150 pg CpG1 (14,6 nmoles) 33,3 pg CpG1 (3,2 nmoles)
Emulsões de a/o de CD4	100 pg 100 pg	81,3:163 ~ 1:2, relação de carga +'ve 81,3:40,7 ~ 2,1, relação de carga +'ve	163/24 = 6,8 nmoles CpG2 40,7/24= 1,7 nmoles CpG2	50 pg CpG2 (6,7 nmoles) 11,1 pg CpG2 (1,5 nmoles)
Géis de polímero de CD4	300 pg 300 pg	244,2:488,4 ~ 1:2, relação de carga +'ve 244,2:122,1 ~ 2,1, relação de carga +'ve	488,4/24 = 20,4 nmoles CpG2 122,1/24= 5,0 nmoles CpG2	150 pg CpG2 (20,2 nmoles) 33,3 pg CpG2 (4,5 nmoles)

1) Carga molar +'ve total calculada para 100 ug ou 300 ug de peptídeos de IgE:

FW médio = 5132,1 g/mol (Tabela 2);

Total de carga molar +'ve de peptídeos de IgE = 7,7 nmol de carga +'ve/nmol de peptídeos de IgE (Tabela 2)

Em 100 g de peptídeos de IgE, há 100 g/5132,1 g/mol = 19,5 nmol de imunógeno de IgE

Total de carga molar +'ve = 19,5 nmol x 7,7 nmoles carga +'ve/nmol de peptídeos de IgE = 150,1 nmoles de carga +'ve ......

Em 300 g de peptídeos de IgE há 300 g/5132,1 g/mol = 58,5 nmol de imunógeno de IgE

Total de carga molar +'ve = 58,5 nmol x 7,7 nmoles de carga +'ve/nmol de peptídeos de IgE = 450 nmoles de carga +'ve

2) Carga molar +'ve total calculada para 100 ug ou 300 pg de peptídeos de CD4: ’....’

FW médio = 5280,6 g/mol (Tabela 2); *...·*

Total de carga molar +'ve de peptídeos de CD4 = 4,3 nmol de carga +'ve/nmol de peptídeos de CD4 (Tabela 2).J

Em 100 g de peptídeos de CD4, há 100 g/5280,6 g/mol = 18,9 nmol de imunógeno de CD4 .····’

Total de carga molar +'ve = 18,9 nmol x 4,3 nmoles carga +'ve/nmol de peptídeos de CD4 = 81,3 nmoles de carga +'ve *····’

Em 300 g de peptídeos de CD4 há 300 g/5280,6 g/mol = 56,8 nmol de imunógeno de CD4 ***.J

Total de carga molar +'ve = 56,8 nmol x 4,3 nmoles de carga +'ve/nmol de peptídeos de CD4 = 244,2 nmoles de carga +'ve .... :

3) N° nmol de carga -'va contribuída por CpG1 ou CpG2:.

Total calculado de carga molar -'va para oligonucleotídeos de CpG1/CpG2 nmol de CpG1 = 31 nmol de carga -'va, FW = 10.295 g/mol (Tabela 1) nmol de CpG2 = 24 nmol de carga -'va, FW = 7.400 g/mol (Tabela 1) o

'-ST'.

Tabela 5

Comparação de Propriedades Físicas de Copolímeros de PLG/PLGA Dissolvidos em DMSO como uma Função de Percentual em Peso em Solução

Identidade do Polímero (relação de lactídeo de D,L:glicolídeo)	Propriedades do polímero Peso Molecular (g/mol) Viscosidade Inerente (dl/q)	% em peso de polímero em DMSO	Viscosidade (mPa)
RG 502 (50:50)	Pm = 8,033, I.V. = 0,2	44,0%	86,7
RG 503 (50:50)	Pm = 25,760, I.V. = 0,3	30,0%	226,2
RG 503 (50:50)	Pm = 257,760, I.V. = 0,3	24,0%	99,6
RG 503 (50:50)	Pm = 25,760, I.V. = 0,3	20,0%	55,1
RG 503 (50:50)	Pm = 25,760, I.V. = 0,3	17,3%	34,0
RG 504 (50:50)	Pm = 43,110, I.V. = 0,4	30,4%	418,4
RG 504 (50:50)	Pm = 43,110, I.V. =0,4	24,5%	187,5
RG 504 (50:50)	Pm = 43,110, I.V. = 0,4	20,5%	104,3
RG 504 (50:50)	Pm = 43,110, I.V. =0,4	17,6%	63,3
RG 504 (50:50)	Pm = 43,100, I.V. =0,4	15,4%	44,5
RG 756 (75:25)	Pm = 81,970, I.V. = 0,8	33,0%
RG 756 (75:25)	Pm = 81,970, I.V. =0,8	24,5%
RG 756 (75:25)	Pm = 81,970, I.V. = 0,8	19,4%	252,0
RG 756 (75:25)	Pm = 81,970, I.V. = 0,8	16,0%	138,3
RG 756 (75:25)	Pm = 81,970, I.V. =0,8	13,6%	102,2
RG 756 (75:25)	Pm = 81,970, I.V. =0,8	11,9%	68,0

Polímero	Percentual em peso necessário para uma solução com viscosidade aparente de -100 mPa
RG-503H	-24%
RG-504H	-20,5%
RG-756	-13,6%

Tabela 6

Análise de Inibição de B4-HRP de Soros Obtidos de Peptídeos de CD4, Complexos Imunoestimuladores de CD4/CpG2 ou

Combinações em Emulsões de a/o

Formulação	% de Inibição* (semana 9)	% de Inibição* (semana 11)	% de Inibição* (semana 17)
Peptídeo de CD4 sem adjuvante	5%	49,1%**	8,2%
CD4/CpG2 (2:1)	12,8%	2,7%	N.D.
CD4/emulsão de (a/o)***	87,2%	87,5%	11,2%
CD4/CpG2 (2:1)/emulsão de (a/o)***	70,1%	92,1%	85,0%
CD4/emulsão (de a/o)****	88,6%	61,4%	42,6%
Cd4/CpG2 (2:1)/emulsão (de a/o)****	94,9%	95,3%	77,2%

Controles positivos
mAb B4, 20 gg/ml	63%	63%	48,7%
mAb B4, 2,0 μ9/ιηΙ	23,5%	11,7%	11,7%

* N.D. amostras não foram analisadas ** O valor de 49,1% na semana 11 para peptídeo de CD4 sem adjuvante é inesperado e provavelmente devido a erro experimental *** Emulsão de água-em-óleo preparada com ISA 720 por meio de técnicas de homogeneização **** Emulsão de água-em-óleo preparado com ISA 720 por meio de técnicas de extrusão co

Tabela 7

Neutralização da Cepa V135 de HIV-1 por Soros Imunes a Peptídeos de CD4, complexos imunoestimuladores de CD4/CpG2 ou

Combinações em Emulsões de a/o (Análise de microplaca MT-2)

Formulação	50% de Inibição de HIV-1 CepaVL135* (semana 9)	50% de Inibição de HIV-1 CepaVL135* (semana 11)	90% de Inibição de HIV-1 CepaVL135* (semana 9)	90% de Inibição de HIV-1 Cepa V135* (semana 11)
Peptídeo de CD4 sem adjuvante	<10%	<10%	<10%	<10%
CD4/emulsão de (a/o)**	73%	27%	57%	17%
CD4/CpG2 (relação de carga de 2:1)/emulsão de (a/o)**	12%	40%	<10%	30%
CD4/emulsão (de a/o)***	31%	<10%	<10%	<10%
Cd4/CpG2 (relação de carga de 2:1)/emulsão (de a/o)***	103%	120%	33%	39%

Controles positivos
mAb B4	0,078 gg/mL	0,13 gg/mL	0,27 gg/mL	0,32 gg/mL
mAb B4	0,18 gg/mL	0,13 gg/mL	0,32 gg/mL	0,31 gg/mL

* Título recíproco antes da adição de um volume igual de vírus contendo 1-1,3 logs ** Emulsão de água-em-óleo preparada com ISA 720 por técnicas de homogeneização *** Emulsão de água-em-óleo preparada com ISA 720 por técnicas de extrusão

Tabela 8

Eficiência de Complexação como uma Função de Relação de Carga Molar de Peptídeo de LHRH:CpG1 por RP-HPLC (Massa de coquetel de peptídeos de LHRH fixada @ 400 g)

Relação de carga molar de peptídeo de LHRH/CpG1	% de cada peptídeo ligado 500:667:607E¹	% total de complexo de LHRH/CpG presente na mistura²	Dose eficaz de LHRH ligado na forma de um complexo de LHRH/CpG
~8:1	500 - 0,8% 667 - 3,7% 607E -13,8%	6,1%	24,4 pg
~ 4:1	500 - 7,8% 667-12,7% 607E - 27,2%	15,8%	63,2 pg
~2:1	500-23,3% 667 - 50,3% 607E - 97,8%	57,1%	228,4 pg
~ 1,5:1	500 - 69,5% 667 - 89,5% 607E-100%	85,9%	343,6 pg
~ 1:1	500 - 93,5% 667 - 99,2% 607E-100%	97,6%	390,4 pg

1) Percentuais de peptídeos ligados são calculados comparando ás áreas de pia» de RP-HPLC referentes à composição de

100

LHRH de controle analisada na ausência do oligonucleotídeo de CpG1

2) Percentuais para a quantidade total de peptídeo complexado de LHRH/CpG1 são calculados somando as áreas de pico totais de RP-HPLC obtidas da composição de controle examinada na ausência de oligonucleotídeo de CpG1 ··

Tabela 9

Cálculos de Relações de Carga Molares de Imunógenos de Petídeos de LHRH e FMD e Oligonucleotídeos de CpG

Formulação	Dose de Peptídeo	nmoles Calculados de Carga de CpG Exigida para a Relação de Carga Especificada de Peptídeo;CpG nmoles de lgE:nmoles de CpG1 (+/-)¹nmoles de CD4: nmoles de CpG2 (+/-)²	nmol teórico de CpG1 ou CpG2 (por massa) ou requerido	Massa atual (nmols) de CpG1 ou cpG2 usado (CpG1 - matéria prima A = 2,0 μ9/μί)
Sais minerais - LHRH	25 μg 400 μ3	23,7:5,9 ~4,1, relação de carga +'ve 378,4:252,3 -16:1, relação de carga +'ve	5,9/31 = 0,2 nmole CpG1 252,3/31 = 8,2 nmoles CpG1	1,83 μg CpG1 (0,2 nmol) 87,6 μρ CpG1 (8,5 nmoles)
Emulsões de a/o de LHRH	100 μg	94,6:11,8 -16:1, relação de carga +'ve	5,7/31 = 0,2 nmols CpG1	1,83 μρ CpG1 (0,2 nmol)
Emulsões de a/o de FMD	400 μg	205,8:51,4 -4,1, relação de carga +'ve	51,4/31 =1,6 nmol CpG1	12,5 μg CpG1 (1,3 nmol)

o

1) Carga molar +’ve total calculada para 25 g, 100 g ou 400 g de peptídeos de LHRH:

FW médio = 4543,9 g/mol (Tabela 2);

Total de carga molar +'ve de peptídeos de LHRH = 4,3 nmol de carga +'ve/nmol de peptídeos de LHRH (Tabela 2)

Em 25 g de peptídeos de LHRH, há 25 g/4543,9 g/mol = 5,5 nmol de imunógeno de LHRH

Total de carga molar +'ve = 5,5 nmol x 4,3 nmoles carga +'ve/nmol de peptídeos de LHRH = 23,7 nmoles de carga +'ve

Em 100 g de peptídeos de LHRH, há 100 g/4543,9 g/mol = 22,0 nmol de imunógeno de LHRH

Total de carga molar +'ve = 22,0 nmol x 4,3 nmoles carga +'ve/nmol de peptídeos de LHRH = 94,6 nmoles de carga +'ve

Em 400 g de peptídeos de LHRH há 400 g/4543,9 g/mol = 88,0 nmol de imunógeno de LHRH

Total de carga molar +'ve = 88,0 nmol x 4,3 nmoles de carga +'ve/nmol de peptídeos de LHRH = 378,4 nmoles de carga +'ve

2) Carga molar +'ve total calculada para 400 ug de peptídeos de FMD:

FW médio = 6805 g/mol (Tabela 2);

Total de carga molar +'ve de peptídeos de FMD = ~3,5 nmol de carga +'ve/nmol de peptídeos de FMD (Tabela 2)

Em 400 g de peptídeos de FMD, há 400 g/6805 g/mol = 58,8 nmol de imunógeno de FMD

Total de carga molar +'ve = 58,8 nmol x 3,5 nmoles carga +'ve/nmol de peptídeos de FMD = 205,8 nmoles de carga +'ve

3) N° nmol de carga -'va contribuída por CpG1:

Total calculado de carga molar -'va para oligonucleotídeos de CpG1 nmol de CpG1 = 31 nmol de carga -'va, FW = 10.295 g/mol (Tabela 1)

Tabela 10

Títulos de Anticorpos de Neutralização e Dados de Proteção obtidos em Gado Imunizado com Vacinas de FMD

Grupo de Animais #	Formulação	Título de Anticorpos de Neutralização (5 WPI)	Título de Vírus (ID₅₀) (Data do Teste de Imunidade 6 WPI)	Número de Cabeças de Gado Protegidas (8 WPI)
1	FMD/ISA 50v	724 256 64	10⁴	1/3
2	FMD/CpG1 (4:1)/ISA50v	256 128 512	10⁴	3/3
3	Placebo (ISA 50v)	3 3 8	10⁴	0/3

Teste de imunidade por via intradermolingual (IDL), com um total de 1O⁴BlgoFMDV O injetados em dois locais na superfície dorsal da língua

103 • ·

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106 • ·· · · ········ · ·

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110>	Sokoll, Kenneth K. Sokoll, Kenneth K.
<120>	SISTEMAS DE DISTRIBUIÇÃO DE IMUNÓGENOS SINTÉTICOS ESTABILIZADOS
<130>	Sistema de liberação de imunogene
<150>	US 10/076674
<151>	2002-02-14
<160>	13
<170>	Patentln version 3.1
<210>	1
<211>	32
<212>	DNA
<213>	Seqüência Artificial
<220>
<223>	Oligonucleotídeo sintético
<400>	1
4«· λτγ Έ /· Έ +· ζτ Έ t Έ Έ* Φ” b* z** st Ί” Έ Έ Έ /t t* z· z^ t“ HH· L· L-.»L—> Lz G· k— k-J Vw- t— x\| L-. L» «k» L —j L* Lz >4 —— L·· L* t—· L4 L· Lz* LJ L» t,,,,- 32

<210> <211> <212> <213>	2 24 DNA Seqüência Artificial
<220> <223>	Oligonucleotídeo sintético
<220> <221> <222> <223>	característica mista d).. (D n indicando grupo tioato de fósforo

<400> 2 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt

107

<210> 3 <211> 24 <212> DNA <2ΐ3> Seqüência artificial <220>

<223> Oligonucleotídeo sintético <400>3 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210>4 <211>50 <212> PRT <213> Humano <220> x , x. ..

<221> característica mista <222> (20)..(20) <223> x_aa indicando epsilon-Lys <400> 4

Ile 1

Ser

Ile Thr

Glu Ile Lys 5

Gly

Vai

Ile 10

Vai

His

Arg

Ile

Glu Thr 15

Ile

Leu

Phe

Xaa

Cys

Asn

Gin

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

20

25

30

Lys

Leu

Asn

Asp

Arg

Ale

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gin

Gly

40 45

Asn Cys <210> 5 <211> 50 <212> PRT <2i3> Humano <220>

¢(6

108

<221> característica mista <222> (20)..(20) <22^3> x_aa indicando epsilon-Lys <400> 5

Lys 1

Lys

Lys Thr Asp 5

Arg

Vai

Ile Glu

Vai Leu Gin 10

Arg Ala

Gly Arg 15

Ala

Ile

Leu

Xaa

Cys

Asn

Gin

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

20

25

30

Lys

Leu

Asn

Asp

Arg

Ala

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gin

Gly

35

40

45

Asn Cys <210> 6 <211> 31 <212> PRT <2i3> Humano <22.0>

<22i> característica mista <222> (20)..(20) <^223> x_aa indicando epsilon-Lys <400> 6

Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Vai Ile Vai His Arg Ile Glu Thr

10 15

Ile Leu Phe Xaa

Cys His Ala Ser

Ile Tyr Asp Phe Gly

Ser

Cys <210> 7 <211> 27 <212> PRT <2i3> Humano

109 • ·

···· <400> 7

Lys Lys Gin Tyr Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

1

' 5

10

15

Leu Glu His Trp Ser

Tyr

Gly

Leu

Arg

Pro

Gly

20

25

<210>

8

<211>

45

<212>

PRT

<213>

Humano

<400>

8

Thr Ale

i Lys Ser Lys

Lys

Phe

Pro

Ser

Tyr

Thr

Ala

Thr

Tyr

Gin

Phe

1

5

10

15

Gly Gly

' Phe Phe Leu

Leu

Thr

Arg

Ile

Leu

Thr

Ile

Pro

Gin

Ser

Leu

20

25

30

Glu Gly

’ Gly Glu His

Trp

Ser

Tyr

Gly

Leu

Arg

Pro

Gly

35

40

45

<210>

9

<211>

45

<212>

PRT

<213>

Humano

<400>

9

Thr Ala

Lys Ser Lys

Lys

Phe

Pro

Ser

Tyr

Thr

Ala

Thr

Tyr

Gin

Phe

1

5

10

15

Gly Gly

Leu Ser Glu

Ile

Lys

Gly

Val

Ile

Val

His

Arg

Leu

Glu

Gly

20

25

30

Val Gly

Gly Glu His

Trp

Ser

Tyr

Gly

Leu

Arg

Pro

Gly

35

40

45

110

<210>	10
<211>	44
<212>	PRT
<213>	Humano
<220> <221>	característica mista
<222>	(19)..(19)
<223>	Xaa indicando epsilon-Lys
<400>	10

Lys

Ile

Thr

Ile

Thr

Arg Ile

Ile

Thr

Ile

Thr

1

5

10

15

Ile

Asp

Xaa

Cys

Gly

Glu

Thr

Tyr

Gin Ser

Arg

Vai

Thr

His

Pro

His

20

25

30

Leu

Pro

Arg

Ala

Leu

Met

Arg

Ser

Thr Thr

Lys

Cys

40 <210> 11 <211> 45 <212> PRT <213> Humano <220>

<221> característica mista <222> (20)..(20) ^<223> Xaa indicando epsilon-Lys <400> 11

Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Vai Ile Vai His Arg Ile Glu Thr
1	5	10	15

Ile Leu Phe Xaa	Cys Gly Glu Thr Tyr Gin	Ser Arg Vai Thr His Pro
20	25	30

His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Cys

111

<210> 12 <211>65 <212> PRT <2ΐ3> Vírus da febre aftosa <400>12

Ile 1

Ser

Ile

Ser

Glu Ile Lys 5

Gly Vai

Ile Vai 10

His Lys

Ile Glu Thr 15

Ile

Leu

Phe

Lys

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Lys

Tyr

Ser

Asp

Ala

Arg

Vai

20

25

30

Ser

Asn

Cys

Arg

Gly

Asp

Leu

Gin

Arg

Gly

Asp

Leu

Gin

Vai

Leu

Ala

35

40

45

Gin

Lys

Ala

Glu

Arg

Cys

Leu

Pro

Ser

Phe

Asn

Tyr

Gly

Ala

Ile

50

55

60

Lys <210>13 <211>65 <212> PRT <2i3> Vírus da febre aftosa <400>13

Ile Ser 1

Ile Thr Glu 5

Ile Lys

Gly

Vai

Ile Vai 10

His

Lys

Ile Glu Thr 15

Ile

Leu

Phe

Lys

Tyr

Asn

Gly

Ser

Cys

Lys

Tyr

Ser

Asp

Ala

Arg

Vai

20

25

30

Ser

Asn

Vai

Arg

Gly

Asp

Leu

Gin

Arg

Gly

Asp

Leu

Gin

Vai

Leu

Ala

35

40

45

Gin Lys Ala Glu Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile 50 5560

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Complexo imunoestimulador estabilizado microparticulado, caracterizado pelo fato de que compreende um imunógeno de peptídeo catiônico, em que o imunógeno de peptídeo compreende um antígeno de célula B alvo ou um epítopos CTL e um epítopo de célula T auxiliar e oligonucleotídeo de CpG aniônico, sendo que o imunógeno de peptídeo catiônico tem uma carga positiva líquida, a um pH na faixa de 5,0 a 8,0, calculada atribuindo uma carga +1 a cada lisina (K), arginina (R) ou histidina (H), uma carga -1 a cada ácido aspártico (D) ou ácido glutâmico (E) e uma carga de 0 a todos os outros aminoácidos no imunógeno de peptídeo e sendo que o oligonucleotídeo de CpG aniônico tem uma carga negativa líquida, a um pH na faixa de 5,0-8,0 e é um DNA de filamento único, que compreende 8 a 64 bases de nucleotídeo com uma repetição de um motivo de citosina-guanidina e o número de repetições do motivo de CpG está na faixa de 1 a 10, e em que a razão de carga entre imunógeno de peptídeo catiônico: oligonucleotídeo CpG é na faixa de 8:1 a 1:2..
2. Complexo imunoestimulador microparticulado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o imunógeno de peptídeo catiônico é uma mistura de imunógenos de peptídeo sintético.
3. Complexo imunoestimulador microparticulado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a carga positiva líquida do imunógeno de peptídeo sintético catiônico é de pelo menos +2.
4. Complexo imunoestimulador microparticulado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a carga positiva líquida média da mistura de imunógenos de peptídeo sintético é pelo menos +2.
5. Complexo imunoestimulador microparticulado, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a carga negativa líquida do oligonucleotídeo é de pelo menos -2.
6. Complexo imunoestimulador microparticulado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo de CpG é uma molécula de DNA de filamento único, com 18-48 bases de nucleotídeo e

Petição 870190003764, de 14/01/2019, pág. 6/21 o número de repetições do motivo de CpG nas mesmas está na faixa de 3 a 8.
7. Complexo imunoestimulador microparticulado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo de CpG tem a fórmula: 5' X¹CGX² 3', na qual C e G são não-metilados; e X¹ é selecionado do grupo que consiste em A (adenina), G (guanina) e T (timina); e X² é C (citosina) ou T (timina).
8. Complexo imunoestimulador microparticulado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo de CpG é selecionado de um grupo que consiste em 5' TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT 3' (CpG1) SEQ ID NO: 1, um oligômero com comprimento de 32 bases, e 5'nTC GTC GTT TTG TCG TTT TGT CGT T 3' (CpG2) SEQ ID NO: 2, um oligômero com comprimento de 24 bases, mais um grupo tioato de fósforo designado por n.
9. Complexo imunoestimulador microparticulado, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo de CpG é 5' TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT 3' (CpG1) SEQ ID NO: 1.
10. Complexo imunoestimulador microparticulado, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o imunógeno de peptídeo catiônico é um peptídeo sintético conjugado a um epítopos de célula T auxiliar.
11. Complexo imunoestimulador microparticulado, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o imunógeno de peptídeo catiônico é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, 8 e 9 e uma mistura dos mesmos.
12. Complexo imunoestimulador microparticulado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a razão de carga entre imunógeno de peptídeo catiônico: CpG é na faixa de 4:1 e 1:1.
13. Processo para preparar um complexo imunoestimulador estabilizado, como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

Petição 870190003764, de 14/01/2019, pág. 7/21 (a) dissolver ou dispersar o imunógeno de peptídeo catiônico em uma fase aquosa selecionada do grupo que consiste em água desionizada, destilada, solução salina, PBS e uma mistura dos mesmos, com a condição de que o pH da fase aquosa seja mais baixo do que o ponto de ionização do imunógeno de peptídeo;

(b) dissolver o oligonucleotídeo de CpG em uma fase aquosa, selecionada do grupo que consiste em água desionizada, destilada, solução salina, PBS e uma mistura dos mesmos;

(c) adicionar o oligonucleotídeo na fase aquosa, em gotas, à solução ou dispersão do imunógeno de peptídeo catiônico, em uma quantidade para formar um complexo imunoestimulador estabilizado do imunógeno de peptídeo e do oligonucleotídeo de CpG, em uma relação de carga do imunógeno de peptídeo catiônico para o oligonucleotídeo de CpG na faixa de 16:1 a 1:1.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, a etapa de remover a fase aquosa da suspensão do complexo imunoestimulador obtido.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a fase aquosa é removida por liofilização ou secagem por pulverização.
16. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o complexo imunoestimulador tem um tamanho de partícula médio na faixa de 1 a 50 pm.
17. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a quantidade de imunógeno de peptídeo e o oligonucleotídeo de CpG adicionada está em uma relação de carga na faixa de 16:1 do imunógeno de peptídeo catiônico para o nucleotídeo de CpG.
18. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a quantidade de imunógeno de peptídeo e o oligonucleotídeo de CpG adicionada está em uma relação de carga na faixa de 16:1 do imunógeno de peptídeo catiônico para o nucleotídeo de CpG.
19. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado

Petição 870190003764, de 14/01/2019, pág. 8/21 pelo fato de que a quantidade de imunógeno de peptídeo e o oligonucleotídeo de CpG adicionada está em uma relação de carga na faixa de 4:1 do imunógeno de peptídeo catiônico para o nucleotídeo de CpG.
20. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a quantidade de imunógeno de peptídeo e o oligonucleotídeo de CpG adicionada está em uma relação de carga na faixa de 4:1 do imunógeno de peptídeo catiônico para o nucleotídeo de CpG.
21. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a quantidade de imunógeno de peptídeo e o oligonucleotídeo de CpG adicionada está em uma relação de carga na faixa de 2:1 do imunógeno de peptídeo catiônico para o nucleotídeo de CpG.
22. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a quantidade de imunógeno de peptídeo e o oligonucleotídeo de CpG adicionada está em uma relação de carga na faixa de 2:1 do imunógeno de peptídeo catiônico para o nucleotídeo de CpG.
23. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a quantidade de imunógeno de peptídeo e o oligonucleotídeo de CpG adicionada está em uma relação de carga de 1,5:1 do imunógeno de peptídeo catiônico para o nucleotídeo de CpG.
24. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a quantidade de imunógeno de peptídeo e o oligonucleotídeo de CpG adicionada está em uma relação de carga de 1,5:1 do imunógeno de peptídeo catiônico para o nucleotídeo de CpG.
25. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a quantidade de imunógeno de peptídeo e o oligonucleotídeo de CpG adicionada está em uma relação de carga de 1:1 do imunógeno de peptídeo catiônico para o nucleotídeo de CpG.
26. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a quantidade de imunógeno de peptídeo e o oligonucleotídeo de CpG adicionada está em uma relação de carga de 1:1 do imunógeno de peptídeo catiônico para o nucleotídeo de CpG.
27. Processo para preparar uma emulsão de água-em-óleo, que

Petição 870190003764, de 14/01/2019, pág. 9/21 compreende um complexo imunoestimulador, como definido na reivindicação

1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(a) preparar um complexo imunoestimulador em fase aquosa, selecionada do grupo que consiste em água desionizada, destilada, solução salina e solução salina tamponada com fosfato;

(b) adicionar o complexo imunoestimulador na fase aquosa a uma fase oleosa contínua, selecionada do grupo que consiste em um óleo sintético, um óleo vegetal, um óleo mineral, um óleo animal metabolizável e uma mistura dos mesmos;

(c) dispersar, sob cisalhamento mecânico, o complexo imunoestimulador na fase aquosa na fase oleosa contínua, para formar uma emulsão de água-em-óleo homogênea.
28. Processo para preparar uma emulsão de água-em-óleo, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) compreende:

(a) carregar uma primeira seringa com a fase aquosa que contém um complexo imunoestimulador;

(b) carregar uma segunda seringa com a fase oleosa, que tem uma viscosidade inerente de menos de 1.500 mPa;

(c) ligar as primeira e segunda seringas através de um tubo oco estreito a um suporte de membrana, que aloja uma membrana com um tamanho de poros controlado (0,05-20 pm);

(d) extrudar a fase aquosa na fase oleosa por trocas repetidas através da membrana, até que seja formada a emulsão de a/o homogênea.
29. Processo, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a fase oleosa é selecionada do grupo que consiste em um óleo metabolizável ou não-metabolizável, selecionado do grupo que consiste em Montanide® ISA 720, Montanide® ISA 51, Montanide® ISA 50v ou uma mistura dos mesmos.
30. Processo, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a fase oleosa é selecionada do grupo que consiste em um óleo metabolizável ou não-metabolizável, selecionado do grupo que consiste

Petição 870190003764, de 14/01/2019, pág. 10/21 em Montanide® ISA 720, Montanide® ISA 51, Montanide® ISA 50v ou uma mistura dos mesmos.
31. Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a fase aquosa possa ainda compreender um tensoativo, um estabilizador de emulsão ou uma combinação dos mesmos.
32. Processo, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a fase aquosa pode compreender, ainda, um tensoativo, um estabilizador de emulsão ou uma combinação dos mesmos.
33. Processo, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o estabilizador de emulsão é selecionado do grupo que consiste em oleato de manida e um derivado do mesmo.
34. Processo, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o estabilizador de emulsão é selecionado do grupo que consiste em oleato de manida e um derivado do mesmo.
35. Processo, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a fase oleosa compreende, ainda, um adjuvante, selecionado do grupo que consiste em MPL, MDP, DDA, Avridine, BAY-1005, DC-Chol, Murapalmitine e um derivado dos mesmos.
36. Processo, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a fase oleosa compreende, ainda, um adjuvante, selecionado do grupo que consiste em MPL, MDP, DDA, Avridine, BAY-1005, DC-Chol, Murapalmitine e um derivado dos mesmos.
37. Processo, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a fase aquosa compreende, ainda, um adjuvante aquoso, solúvel, selecionado do grupo que consiste em PCPP, uma saponina, uma toxina de cólera, uma enterotoxina termicamente instável de E. Coli e uma citocina, selecionada do grupo que consiste em IL-1 β, IL-2, IL-12, IFN-g e um derivado dos mesmos.
38. Processo, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o derivado de citocina é um fragmento de peptídeo derivado de IL-1b, SEQ ID NO: 14.
39. Processo, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado

Petição 870190003764, de 14/01/2019, pág. 11/21 pelo fato de que a fase aquosa compreende, ainda, um adjuvante aquoso, solúvel, selecionado do grupo que consiste em PCPP, uma saponina, uma toxina de cólera, uma enterotoxina termicamente instável de E. Coli e uma citocina, selecionada do grupo que consiste em IL-1 β, IL-2, IL-12, IFN-γ e um derivado dos mesmos.
40. Processo, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o derivado de citocina é um fragmento de peptídeo derivado de IL-1b, SEQ ID NO: 14.
41. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, as etapas de:

(a) preparar uma solução de um polímero gelificante in situ, selecionado do grupo que consiste em copolímero de poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo, copolímero de poli-D,L-ácido láctico-co-ácido glicólico, policaprolactona, polianidrido, poliortoéster e poli(a-ácido hidroxibutírico)em um solvente biocompatível, selecionado do grupo que consiste em dimetil sulfóxido (DMSO), N-metil-pirrolidona (NMP), triacetina e glicerina;

(b) reconstituir o complexo imunoestimulador em forma seca na solução do polímero gelificante in situ no solvente biocompatível.
42. Processo, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que na etapa (b), o complexo imunoestimulador em forma seca usado foi obtido por liofilização.
43. Processo, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o polímero biodegradável é

R1 = O-alquila(PLG) ou OH (PLGA) R2 = H, na qual R1 é OH ou alcóxi, com 1 a 5 carbonos e R2 é H; x:y é a relação de cada unidade de monômero do copolímero, com x+y=1.
44. Processo, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o referido polímero biodegradável é

Petição 870190003764, de 14/01/2019, pág. 12/21

R1 = O-alquila(PLG) ou OH (PLGA) R2 = H, na qual R1 é OH ou alcóxi, com 1 a 5 carbonos e R2 é H; x:y é a relação de cada unidade de monômero do copolímero, com x+y=1.
45. Processo de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o copolímero apresenta um peso molecular na faixa de 2000100000 daltons e uma viscosidade inerente de 0,1 a 1,0 dl/g.
46. Processo, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o copolímero tem um peso molecular na faixa de 2.000100.000 dáltons e uma viscosidade inerente de 0,1-1,0 dl/g.
47. Processo, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o peso do polímero gelificante in situ biodegradável dissolvido no solvente biocompatível é na faixa de 5% p/p a 50% p/p.
48. Processo, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o peso do polímero biodegradável, gelificante in situ, dissolvido no solvente biocompatível, está na faixa de 5% p/p a 50% p/p.
49. Processo, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) compreende, ainda, dissolver um adjuvante solúvel em óleo, selecionado do grupo que consiste em 3-O-desacil-4'-monofosforil lipídio A (MPL), N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutmina (MDP), brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA), N,N-dioctadecil-N',N'-bis(2-hidroxietil)propanodiamina (Avridine), hidroacetato de N-(2-desóxi-2-1-leucilamino-b-D-glucopiranosil)-N-octadecil-dodecanoilamida (BAY-1005), 3b-[N-(N,N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol (DC-Chol),NAc-Mur-L-Thr-D-isoGln-snglicerol dipalmitoíla (Murapalmitine) e uma citocina, selecionada do grupo que consiste em IL-1 β, IL-2, IL-12, IFN-g e um derivado dos mesmos no solvente biocompatível.
50. Processo, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado

Petição 870190003764, de 14/01/2019, pág. 13/21

9 pelo fato de que a etapa (c) compreende, ainda, dissolver um adjuvante solúvel em óleo, selecionado do grupo que consiste em 3-O-desacil-4'-monofosforil lipídio A (MPL), N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutmina (MDP), brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA), N,N-dioctadecil-N',N'-bis(2-hidroxietil)propanodiamina (Avridine), hidroacetato de N-(2-deóxi-2-1-leucilamino-b-D-glucopiranosil)-N-octadecil-dodecanoilamida (BAY-1005), 3b-[N-(N,N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol (DC-Chol),NAc-Mur-L-Thr-D-isoGln-snglicerol dipalmitoíla (Murapalmitine) e uma citocina, selecionada do grupo que consiste em IL-1 β, IL-2, IL-12, IFN-g e misturas e derivados dos mesmos no solvente biocompatível.
51. Processo para preparar uma suspensão, que compreende um complexo imunoestimulador, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(a) preparar um Complexo imunoestimulador, como definido na reivindicação 1, em uma fase aquosa selecionada do grupo que consiste em água desionizada, destilada, solução salina e solução salina tamponada com fosfato;

(b) preparar uma suspensão de um sal mineral, selecionado do grupo que consiste em hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio e fosfato de cálcio, em uma fase aquosa selecionada do grupo que consiste em água desionizada, destilada, solução salina e solução salina tamponada com fosfato;

(c) adicionar o complexo imunoestimulador na fase aquosa a uma fase aquosa que contém a suspensão de sal mineral;

(d) misturar o complexo imunoestimulador com a suspensão de sal mineral, para formar uma suspensão mista.
52. Processo para preparar uma suspensão, que compreende um complexo imunoestimulador, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(a) preparar uma solução de um imunógeno de peptídeo, selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 3-13 em uma fase aquosa, selecionado do grupo que consiste em água desionizada, destilada, solução salina e solução salina tamponada com fosfato;

Petição 870190003764, de 14/01/2019, pág. 14/21 (b) preparar uma suspensão de um sal mineral, selecionado do grupo que consiste em hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio e fosfato de cálcio, em uma fase aquosa selecionada do grupo que consiste em água desionizada, destilada, solução salina e solução salina tamponada com fosfato;

(c) adicionar, com mistura, a solução de peptídeo à suspensão de sal mineral;

(d) adicionar um nucleotídeo de CpG, selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, com mistura, para formar uma suspensão mista de um complexo imunoestimulador e um sal mineral.
53. Processo, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o sal mineral é selecionado do grupo que consiste em Alhydrogel® (fosfato de alumínio), Adju-phos® (hidróxido de alumínio) e uma mistura dos mesmos.
54. Processo, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o sal mineral é selecionado do grupo que consiste em Alhydrogel® (fosfato de alumínio), Adju-phos® (hidróxido de alumínio) e uma mistura dos mesmos.
55. Processo de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a fase aquosa pode ainda compreender um tensoativo, um tonificante, um conservante ou qualquer combinação dos mesmos.
56. Processo, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a fase aquosa pode compreender, ainda, um tensoativo, um tonificante, um conservante ou qualquer combinação dos mesmos.
57. Processo, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a fase aquosa compreende um tonificante selecionado do grupo que consiste em um PBS, salina e uma mistura dos mesmos.
58. Processo, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que a fase aquosa compreende um tonificante, selecionada do grupo que consiste em um PBS ou solução salina e uma mistura dos mesmos.
59. Processo, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, adicionar à fase aquosa um conservante, selecionado do grupo que consiste em 2-fenóxi-etanol e um derivado do

Petição 870190003764, de 14/01/2019, pág. 15/21 mesmo.
60. Processo, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, adicionar à fase aquosa um conservante, selecionado do grupo que consiste em 2-fenóxi-etanol e um derivado do

5 mesmo.
61. Processo, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, adicionar à fase aquosa um adjuvante, selecionado do grupo que consiste em MPL, MDP, DDA, Avridine, BAY-1005, DC-Chol, Murapalmitine, PCPP, uma saponina, uma toxina de cólera, uma

10 enterotoxina termicamente instável de E. Coli e uma citocina, selecionada do grupo que consiste em IL-1 β, IL-2, IL-12, IFN-g e um derivado dos mesmos.
62. Processo, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, adicionar à fase aquosa um adjuvante, selecionado do grupo que consiste em MPL, MDP, DDA, Avridine, BAY-1005,

15 DC-Chol, Murapalmitine, PCPP, uma saponina, uma toxina de cólera, uma enterotoxina termicamente instável de E. Coli e uma citocina, selecionada do grupo que consiste em IL-1 β, IL-2, IL-12, IFN-g e um derivado dos mesmos.
63. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma suspensão de um complexo imunoestimulador, como defi-

20 nido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 em um solvente aquoso, selecionado do grupo que consiste em água desionizada, destilada, solução salina e solução salina tamponada com fosfato.
64. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma emulsão de água-em-óleo de um complexo imunoestimula-

25 dor, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
65. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 63, caracterizada pelo fato de que compreende, ainda, um adjuvante, selecionado do grupo que consiste em MPL, MDP, DDA, Avridine, BAY-1005, DCChol, Murapalmitine, PCPP, uma saponina, uma toxina de cólera, uma ente-

30 rotoxina termicamente instável de E. Coli e uma citocina, selecionada do grupo que consiste em IL-1 β, IL-2, IL-12, IFN-g e um derivado dos mesmos.
66. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que

Petição 870190003764, de 14/01/2019, pág. 16/21 compreende um gel de um complexo imunoestimulador, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o gel é formado in situ pela adição do complexo imunoestimulador em forma seca a uma solução de um polímero biocompatível, gelificante in situ, selecionado do grupo que consiste em copolímero de poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo, copolímero de poli-D,Lácido láctico-co-ácido glicólico, policaprolactona, polianidrido, poliortoéster e poli(a-ácido hidroxibutírico) em um solvente biocompatível, selecionado do grupo que consiste em dimetil sulfóxido (DMSO), N-metil-pirrolidona (NMP), triacetina e glicerina.
67. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 66, caracterizada pelo fato de que o polímero biodegradável é

R1 = O-alquila(PLG) ou OH (PLGA) R2 = H, na qual R1 é OH ou alcóxi, com 1 a 5 carbonos e R2 é H; x:y é a relação de cada unidade de monômero do copolímero, com x+y=1.
68. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que o polímero biodegradável tem um peso molecular na faixa de 2.000-100.000 dáltons e uma viscosidade inerente de 0,11,0 dl/g.
69. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma suspensão aquosa de um sal mineral e um complexo imunoestimulador, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o sal mineral é selecionado do grupo que consiste em hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, fosfato de cálcio.
70. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 69, caracterizada pelo fato de que a fase aquosa é selecionada do grupo que consiste em água desionizada, destilada, solução salina, PBS e uma mistura dos mesmos.
71. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 69,

Petição 870190003764, de 14/01/2019, pág. 17/21 caracterizada pelo fato de que compreende, ainda, um conservante selecionado do grupo que consiste em 2-fenóxi-etanol e um derivado do mesmo na fase aquosa.
72. Composição de acordo com a reivindicação 63, caracterizada 5 pelo fato de que é para uso como uma substancia farmaceuticamente ativa.