BRPI0411994B1

BRPI0411994B1 - molécula de ácido nucléico codificando proteínas úteis para aumentar os níveis de óleo em plantas, cassete de expressão e método de produzir uma planta tendo níveis aumentados de produção de óleo

Info

Publication number: BRPI0411994B1
Application number: BRPI0411994A
Authority: BR
Inventors: E Wyrick Annette; R Ledeaux John; P Ravanello Monica; J Foley Terry; J Savage Thomas
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2003-06-27
Filing date: 2004-06-25
Publication date: 2020-01-28
Also published as: EP1639100B1; EP1639100A4; WO2005003312A3; WO2005003312A2; JP2007524394A; EP1639100A2; US7179956B2; BRPI0411994A; CA2530427A1; AU2004254373A1; CA2530427C; AU2004254373B2; MXPA06000275A; US20050005327A1; US20070283458A1

Abstract

"elevação dos níveis de óleo nas plantas". esta presente invenção proporciona um método para aumentar os níveis de óleo no tecido da semente do milho por expressão de um alelo de gbss de ho1001. a presente invenção também proporciona moléculas de ácido nucléico isoladas que codificam um polipeptídeo de gbss de h01001.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO CODIFICANDO PROTEÍNAS ÚTEIS PARA AUMENTAR OS NÍVEIS DE ÓLEO EM PLANTAS, CASSETE DE EXPRESSÃO E MÉTODO DE PRODUZIR UMA PLANTA TENDO NÍVEIS AUMENTADOS DE PRODUÇÃO DE ÓLEO.

[001] Este pedido reivindica o benefício da data de depósito do

Pedido Provisório U.S. Número de Série 60/483.491, depositado em 27 de junho de 2003, o qual é incorporado aqui por referência.

[002] A presente invenção relaciona-se aos campos da química do ácido nucléico e à biotecnologia agrícola. Em particular, a presente invenção está dirigida na identificação de ácidos nucléicos que codificam proteínas úteis para aumentar os níveis de óleo em plantas de milho e criar plantas de milho que incluam tais ácidos nucléicos.

[003] As plantas são uma fonte principal de óleos para alimentação, alimento, e usos industriais. Embora os tecidos da maior parte das espécies de planta contenham pouco óleo, o cultivo de certos tipos de plantas, sobre muitos acres, permite que sejam produzidas grandes quantidades de óleos vegetais. Se o teor de óleo destas plantas pudesse ser aumentado, então os óleos vegetais poderiam ser produzidos mais eficientemente. Por exemplo, o teor normal de óleo do milho dentado amarelo n^o 2 é aproximadamente 4%. Se o teor de óleo do milho pudesse ser aumentado para 8% ou mesmo 12%, sem afetar significativamente o rendimento, a mesma quantidade de óleo poderia ser produzida a partir da metade ou até um terço do número de acres.

[004] Atualmente, os níveis de óleo nas colheitas de sementes oleosas têm aumentado de modo incremental por métodos tradicionais de multiplicação e seleção. Existem poucas referências a plantas transgênicas com níveis aumentados de óleo. Em contraste, têm sido

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2/77 atingidos aumentos nas proporções de alguns ácidos graxos estratégicos pela introdução ou manipulação de diversos genes da biossíntese de ácidos graxos vegetais em sementes oleosas. Por exemplo, Voelker e outros, Science, 257:72-74 (1992), demonstraram que a expressão em Brassicaceae de uma acil-ACP tioesterase graxa de cadeia média da Baía de Califórnia aumentou o teor de ácido láurico (12:0). Hitz e outros, Proc. 9^th International Cambridge Rapeseed Congress UK, páginas 470-472 (1995), aumentaram as proporções de ácido oléico em Glycine max por co-supressão usando um constructo com sentido codificando uma FAD-2-(A12) dessaturase microssômica vegetal. Embora o uso destes transgenes vegetais resultasse em uma produção aumentada de ácido láurico na canola e proporções alteradas de ácido oléico na soja, não houve nenhuma evidência de teor de ácido graxo total aumentado, ou produção de óleo aumentada nestes transgênicos.

[005] Certos trabalhadores têm tentado aumentar ou modular o teor de óleo das plantas por manipulação dos genes da via biossintética do óleo. Por exemplo, a Patente U.S. 6.268.550, de Gengenbach e outros, proporciona ácidos nucléicos de acetil CoA carboxilase do milho para alterar o teor de óleo das plantas. Adicionalmente, a Patente U.S. 5.925.805 de Ohlrogge e outros proporciona um gene da acetil CoA carboxilase de Arabidopsis que pode ser usado para aumentar o teor de óleo das plantas. Entretanto, a síntese de ácidos graxos requer a atividade coordenada de muitas enzimas, nenhuma das quais, quando somente supra-regulada, tem sido verificada aumentar substancialmente o teor de óleo.

[006] Existe, portanto, uma necessidade por um método aperfeiçoado para alterar o teor de óleo das plantas, e em particular aumentar o teor de óleo das plantas e das sementes.

[007] Além do óleo, o amido do milho também é significativo

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3/77 agrícola e comercialmente. O amido compreende um componente principal de alimentos para animais e alimento humano. O amido também é usado industrialmente na produção de papel, materiais têxteis, plásticos, e adesivos, bem como proporciona a matéria-prima para alguns biorreatores.

[008] Nas plantas superiores, o amido consiste em glicanos de cadeias lineares e ramificados, conhecidos como amilose e amilopectina, respectivamente. O amido com diversas quantidades de amilose e amilopectina é encontrado em diferentes plantas.

Tipicamente, o amido do milho contém aproximadamente 25% de amilose, o restante sendo amilopectina. A amilopectina contém cadeias curtas e cadeias longas, as cadeias curtas variando de 5-30 unidades de glicose e as cadeias longas variando de 30-100 unidades de glicose, ou mais. A razão de amilose para amilopectina, bem como a distribuição das cadeias curtas para as longas na fração de amilopectina, afetam as propriedades físicas do amido (por exemplo, a estabilização térmica, a retrogradação, e a viscosidade).

[009] O lócus WAXY do milho determina o teor de amilose no pólen e no endosperma do grão (Shure e outros, Cell, 35(1):225-233 (1983)), resultando em amido tendo propriedades únicas. A maioria das mutações no lócus WAXY do milho, que codifica a amido sintase ligada a grânulo (GBSS), resulta em um endosperma opaco de amido não córneo, firme, liso, compreendendo principalmente amilopectina e uma quantidade reduzida de amilose no endosperma, pólen e saco embrionário (“fenótipo de WAXY”) (ver Okagaki e Wessler, Genetics, 120(4):1137-1143 (1988)). Quando nenhuma GBSS de funcionamento for sintetizada no mutante de WAXY homozigoto, ele também não tem amilose (Echt e Schwartz, Genetics, 99:275-284 (1981)).

[0010] Adicionalmente, o WAXY recessivo, clássico, tem um pequeno efeito (aproximadamente 0,5% de aumento) sobre a

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4/77 porcentagem de óleo no grão quando comparado ao milho amarelo n^o2 (Pfahler e Linskens, Theoretical and Applied Genetics, 41(1):2-4 (1971)). Em comparação, a linhagem endógama HOI001, um mutante de WAXY dominante endógamo descrito na Publicação de Patente U.S. N^o 20030172416, aqui incorporada por referência, tem concentrações de óleo no grão inteiro maiores do que quatro vezes aquela do milho amarelo n^o 2.

Sumário da Invenção [0011] A presente invenção descreve e proporciona moléculas de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo de GBSS de HOI001. Além disso, esta invenção se relaciona às moléculas de ácidos nucléicos que são complementares à molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo de GBSS de HOI001. Ademais, esta invenção relaciona-se aos cassetes de expressão compreendendo estas moléculas de ácidos nucléicos. Adicionalmente, esta invenção se relaciona às plantas de milho transgênicas contendo estes cassetes de expressão. Além disso, esta invenção se relaciona às sementes destas plantas de milho transgênicas. Esta invenção adicionalmente se relaciona ao óleo e ao alimento para animal, obtidos a partir das sementes destas plantas de milho transgênicas.

[0012] Em uma outra modalidade, a presente invenção se relaciona a um constructo de DNA recombinante, associado com a produção aumentada de óleo nas plantas, compreendendo uma molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo de GBSS de HOI001 operavelmente ligado a um promotor, o qual é funcional em uma célula vegetal.

[0013] A presente invenção descreve e proporciona um método de aumentar o óleo em uma planta de milho por expressão de um gene de GBSS de HOI001. Esta invenção adicionalmente proporciona um método de alterar a composição do grão em uma planta de milho por

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5/77 expressão de um gene de GBSS de HOI001. Esta invenção adicionalmente descreve e proporciona seqüências de um gene de GBSS de HOI001 a partir de Zea mays. Esta invenção adicionalmente proporciona constructos de vetores para a transformação da planta e a expressão específica para o tecido de um gene de GBSS de HOI001. Esta invenção adicionalmente proporciona plantas de milho transformadas com o gene de GBSS com níveis de óleo mais elevados comparadas às plantas com base genética igual ou similar, porém não contendo o gene de GBSS de HOI001 inserido. Esta invenção adicionalmente proporciona sementes a partir destas plantas de milho. Esta invenção adicionalmente proporciona grãos a partir das plantas de milho transformadas com o gene de GBSS de HOI001 contendo um nível mais elevado de óleo quando comparadas aos grãos de plantas de milho com base genética igual ou similar, porém não contendo o gene de GBSS de HOI001 inserido. Esta invenção também proporciona óleo e alimento para animal produzido a partir destas sementes e grãos.

[0014] A presente invenção adicionalmente proporciona um método de multiplicação auxiliada por marcador, útil na multiplicação de níveis de óleo mais elevados no milho.

Breve Descrição das Figuras [0015] A Figura 1 mostra o alinhamento das seqüências de ácidos nucléicos do gene da amido sintase ligada a grânulo, isolado de HOI001 (GBSS de HOI001, pMON72506) [SEQ ID N°: 1], comparado ao gene da amido sintase ligada a grânulo (GBSS) a partir do endógamo LH59 (pMON72510), e seqüência publicada do gene da GBSS descrito em Shure e outros, supra, (X03935). Para uma comparação adicional, é dada a seqüência de codificação para o gene da GBSS publicado (CDS22509).

[0016] A Figura 2 mostra o alinhamento das seqüências de

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6/77 aminoácidos preditas correspondentes a partir do gene da GBSS isolado de HOI001 (GBSS de HOI001 a partir de pMON72506) [SEQ ID N°: 3], e do gene da GBSS descrito em Shure e outros, supra, [SEQ ID N°: 4], respectivamente.

[0017] A Figura 3 mostra o alinhamento das seqüências de aminoácidos preditas correspondentes a partir do gene da GBSS de Zea mays isolado do endógamo LH59 [SEQ ID N°: 10], e do gene da amido sintase ligada a grânulo de Zea mays descrito em Shure e outros, supra, respectivamente.

[0018] A Figura 4 representa um mapa de plasmídio de pMON72506.

[0019] A Figura 5 representa um mapa de plasmídio de pMON72510.

[0020] As Figuras 6A e 6B representam graficamente a diferença nos níveis de óleo de grãos de plantas transformadas com pMON72506 contendo a GBSS a partir de HOI001 (SEQ ID N°: 1, 6A) e pMON72510 contendo a GBSS a partir de LH59 (SEQ ID N°: 8, 6B). Os grãos positivos de genes e negativos de genes são comparados a partir de cada ocorrência. Somente as ocorrências com alterações estatisticamente significativas no óleo (14 de 29) são mostradas em 6A.

[0021] A	Figura	7	representa	um	mapa	de	plasmídio	de
pMON81464.
[0022] A	Figura	8	representa	um	mapa	de	plasmídio	de
pMON68298.
[0023] A	Figura	9	representa	um	mapa	de	plasmídio	de

pMON81465.

Breve Descrição das Seqüências [0024] A SEQ ID N°: 1 é a seqüência de ácidos nucléicos da amido sintase ligada a grânulo a partir de HOI001 (GBSS de HOI001 a

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7/77 partir de pMON72506).

[0025] A SEQ ID N°: 2 é a seqüência de ácidos nucléicos publicada da GBSS de Zea mays a partir de Shure e outros, supra.

[0026] A SEQ ID N°: 3 descreve a seqüência de aminoácidos predita de GBSS de HOI001 a partir de pMON72506.

[0027] A SEQ ID N°: 4 descreve a seqüência de aminoácidos predita a partir de GBSS de Zea mays como publicada por Shure e outros, supra.

[0028] A SEQ ID N°: 5 é uma seqüência de iniciador para o

Iniciador número 14543.

[0029] A SEQ ID N°: 6 é uma seqüência de iniciador para o

Iniciador número 14547.

[0030] A SEQ ID N°: 7 descreve uma seqüência de ácidos nucléicos de uma molécula de DNA que codifica uma GBSS a partir da linhagem de milho LH59.

[0031] A SEQ ID N°: 8 descreve a seqüência de aminoácidos predita da GBSS a partir da linhagem de milho LH59.

[0032] A SEQ ID N°: 9 é uma seqüência de iniciador para o

Iniciador número 20095.

[0033] A SEQ ID N°: 10 é uma seqüência de iniciador para o

Iniciador número 20092.

[0034] A SEQ ID N°: 11 descreve a região de codificação do cDNA de GBSS de HOI001.

Descrição Detalhada da Invenção [0035] As seguintes definições são proporcionadas como um auxílio para entender a descrição detalhada da presente invenção.

[0036] As expressões “seqüência de codificação”, “região de codificação”, “seqüência estrutural” e “seqüência de ácidos nucléicos estrutural” referem-se a uma estrutura física compreendendo um arranjo de nucleotídeos ordenado. Os nucleotídeos estão arranjados

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8/77 em uma série de trincas que, cada, formam um códon. Cada códon codifica um aminoácido específico. Assim, a seqüência de codificação, a seqüência estrutural, e a seqüência de ácidos nucléicos estrutural codificam uma série de aminoácidos que formam uma proteína, polipeptídeo, ou seqüência peptídica. A seqüência de codificação, a seqüência estrutural, e a seqüência de ácidos nucléicos estrutural podem estar contidas dentro de uma molécula de ácido nucléico, vetor, ou similar, maior. Além disso, o arranjo ordenado de nucleotídeos nestas seqüências pode ser representado na forma de uma listagem de seqüências, figura, tabela, meio eletrônico, ou similar. [0037] A expressão “degeneração do códon” refere-se à divergência no código genético, que permite variação da seqüência de nucleotídeos sem afetar a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado. Desse modo, a presente invenção relacionase a qualquer fragmento de ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica todas as, ou uma parte substancial das, seqüências de aminoácidos representadas aqui. O técnico versado está bem a par da “preferência por códon” exibida por uma célula hospedeira específica no uso dos códons de nucleotídeos para especificar um dado aminoácido. Portanto, quando sintetizando um fragmento de ácido nucléico para a expressão aperfeiçoada em uma célula hospedeira, é desejável projetar o fragmento de ácido nucléico de modo tal que a sua freqüência de uso do códon assemelhe-se à freqüência de uso do códon preferido da célula hospedeira.

[0038] O termo “cDNA” refere-se a um DNA de filamento duplo que é complementar ao, e derivado do, mRNA.

[0039] As expressões “seqüência de DNA”, “seqüência de ácidos nucléicos” e “molécula de ácido nucléico” referem-se a uma estrutura física compreendendo um arranjo ordenado de nucleotídeos. A

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9/77 seqüência de DNA ou a seqüência de nucleotídeos pode estar contida dentro de uma molécula de nucleotídeo, vetor, ou similar, maior. Além disso, o arranjo ordenado de ácidos nucléicos nestas seqüências pode ser representado na forma de uma listagem de seqüências, figura, tabela, meio eletrônico, ou similar.

[0040] A “expressão” refere-se à transcrição de um gene para produzir o mRNA correspondente e à tradução deste mRNA para produzir o produto de gene correspondente (isto é, um peptídeo, polipeptídeo, ou proteína).

[0041] A “expressão do RNA anti-sentido” refere-se à transcrição de um DNA para produzir uma primeira molécula de RNA capaz de hibridizar até uma segunda molécula de RNA, segunda molécula de RNA esta que codifica um produto de gene que é desejavelmente infra-regulado.

[0042] Conforme usado aqui, o “gene” refere-se a um fragmento de ácido nucléico que expressa uma proteína específica, incluindo as seqüências reguladoras precedendo (seqüências de não codificação em 5') e seguindo (seqüências de não codificação em 3') a seqüência de codificação. O “gene nativo” refere-se a um gene como encontrado na natureza, com suas próprias seqüências reguladoras. O “gene quimérico” refere-se a qualquer gene que não seja um gene nativo, compreendendo seqüências reguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natureza. Desse modo, um gene quimérico pode compreender seqüências reguladoras e seqüências de codificação que sejam derivadas de fontes diferentes, ou seqüências reguladoras e seqüências de codificação derivadas da mesma fonte, porém arranjadas em um modo diferente daquele visto na natureza. O “gene endógeno” refere-se a um gene nativo em sua posição natural no genoma de um organismo. Um “gene exógeno” ou “transgene” refere-se a um gene não nativo que tenha sido introduzido no genoma

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10/77 por um procedimento de transformação.

[0043] “Hemizigoto” refere-se a um indivíduo diplóide tendo somente uma cópia de um gene particular (por exemplo, porque um cromossomo foi perdido). “Homozigoto” refere-se a um par de genes tendo alelos idênticos em dois cromossomos homólogos.

[0044] “Heterólogo” refere-se à relação entre duas ou mais seqüências de ácidos nucléicos ou proteínas que são derivadas de fontes diferentes. Por exemplo, um promotor é heterólogo em relação a uma seqüência de codificação se uma tal combinação não for normalmente verificada na natureza. Além disso, uma seqüência particular pode ser “heteróloga” em relação a uma célula ou organismo no qual ela está inserida (isto é, não ocorre naturalmente nesta célula ou organismo particular).

[0045] A “homologia” refere-se ao nível de similaridade entre duas ou mais seqüências de ácidos nucléicos ou aminoácidos em termos de porcentagem de identidade posicional (isto é, similaridade ou identidade de seqüência). A homologia também se refere ao conceito de propriedades funcionais similares entre diferentes ácidos nucléicos ou proteínas.

[0046] A “hibridização” refere-se à capacidade de uma primeira filamento de ácido nucléico de unir-se com uma segunda filamento via emparelhamento de bases por ligação de hidrogênio, quando as duas filamentos de ácido nucléico tiverem complementaridade de seqüência suficiente. Conforme usado aqui, uma molécula de ácido nucléico é dita ser o “complemento” de uma outra molécula de ácido nucléico se elas exibirem complementaridade completa. Conforme usado aqui, as moléculas são ditas exibirem “complementaridade completa” quando cada nucleotídeo de uma das moléculas for complementar a um nucleotídeo da outra. Assim, duas filamentos de ácido nucléico são ditas terem complementaridade suficiente quando elas puderem

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11/77 hibridizar uma com a outra, com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas uma à outra sob condições apropriadas.

[0047] As expressões “seleção auxiliada por marcador” ou “multiplicação auxiliada por marcador” referem-se ao uso de marcadores genéticos para identificar e selecionar plantas com potencial fenotípico superior. Os marcadores genéticos, determinados previamente estarem associados com um locus (“lócus”) de característica ou loci de característica, são usados para revelar o genótipo nos loci de característica em virtude da ligação entre o locus do marcador e o locus de característica. As plantas contendo alelos de característica desejados são escolhidas com base em seus genótipos nos loci dos marcadores ligados.

[0048] A expressão “população de multiplicação” refere-se à coleção geneticamente heterogênea de plantas criadas para o propósito de identificar um ou mais indivíduos com características fenotípicas desejadas. O termo “fenótipo” refere-se à expressão observada de uma ou mais características da planta.

[0049] Um “marcador genético” é qualquer diferença fenotípica morfológica, bioquímica, ou baseada em ácido nucléico que revele um polimorfismo de DNA. Os exemplos de marcadores genéticos incluem, porém não estão limitados aos, RFLPs, RAPDs, alozimas, SSRs, e AFLPs.

[0050] A expressão “lócus do marcador” refere-se à posição geneticamente definida dos polimorfismos do DNA como revelados por um marcador genético. Um “lócus de característica” refere-se a uma posição geneticamente definida para uma coleção de um ou mais genes (alelos) que contribuem para uma característica observada.

[0051] A expressão “polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição” (RFLP) refere-se a um marcador genético baseado em

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DNA, no qual são observadas diferenças de tamanho nos fragmentos de DNA gerados pela endonuclease de restrição, via hibridização (Botstein e outros, Am. J. Hum. Genet., 32:314-331 (1980)).

[0052] A expressão “DNA polimórfico amplificado aleatório” (RAPD) refere-se a um marcador genético baseado na amplificação do DNA, no qual são usados iniciadores arbitrários de seqüência curta e os produtos da amplificação resultantes são separados por tamanho e as diferenças nos padrões de amplificação observadas (Williams e outros, Nucleic Acids Res., 18:6531-6535 (1990)).

[0053] A expressão “repetição de seqüência simples” (SSR) refere-se a um marcador genético baseado na amplificação do DNA, no qual são amplificados trechos curtos de motivos de seqüência repetidos em série e os produtos da amplificação resultantes são separados por tamanho e as diferenças no comprimento da repetição de nucleotídeos são observadas (Tautz, Nucleic Acids Res., 112:41274138 (1989)).

[0054] O termo “AFLP” refere-se a um marcador genético baseado na amplificação do DNA, no qual fragmentos de DNA gerados pela endonuclease de restrição são ligados a fragmentos de DNA curtos que facilitam a amplificação dos fragmentos de DNA restritos (Vos e outros, Nucleic Acids Res., 23:4407-4414 (1995)). Os fragmentos amplificados são separados por tamanho e as diferenças nos padrões de amplificação observadas.

[0055] A expressão “operavelmente ligado(a)” refere-se ao arranjo espacial funcional de duas ou mais regiões de ácidos nucléicos ou seqüências de ácidos nucléicos. Por exemplo, uma região de promotor pode estar posicionada em relação a uma seqüência de ácidos nucléicos de modo tal que a transcrição da seqüência de ácidos nucléicos seja orientada pela região de promotor. Assim, uma região de promotor está “operavelmente ligada” à seqüência de ácidos

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13/77 nucléicos.

[0056] Os termos “promotor” ou “região de promotor” referem-se a uma seqüência de ácidos nucléicos normalmente encontrada a montante (5') de uma seqüência de codificação que é capaz de orientar a transcrição de uma seqüência de ácidos nucléicos no mRNA. O promotor ou a região de promotor tipicamente proporciona um sítio de reconhecimento para a RNA polimerase e os outros fatores necessários para a iniciação adequada da transcrição. Conforme contemplado aqui, um promotor ou região de promotor inclui as variações dos promotores derivados por inserção ou remoção de regiões reguladoras, sujeição do promotor à mutagênese aleatória ou orientada para o sítio, e similar. A atividade ou potência de um promotor pode ser medida em termos da quantidade de RNA que ele produz, ou da quantidade de acúmulo de proteína em uma célula ou tecido, em relação a um segundo promotor que seja similarmente medido.

[0057] A expressão “seqüências de não codificação em 3'“ referese às seqüências de nucleotídeos localizadas a jusante de uma seqüência de codificação e incluem as seqüências de reconhecimento de poliadenilação e as outras seqüências que codificam os sinais reguladores capazes de afetar o processamento do mRNA ou a expressão do gene. O sinal de poliadenilação é caracterizado normalmente por afetar a adição dos tratos de poli(ácido adenílico) à extremidade de 3' do precursor de mRNA. O uso de diferentes seqüências de não codificação em 3' é exemplificado por Ingelbrecht e outros, Plant Cell, 1:671-680 (1989).

[0058] A “seqüência principal de tradução” ou a “região não traduzida em 5'“ ou a “5'-UTR”, todas referem-se a uma seqüência de nucleotídeos localizada entre a seqüência de promotor de um gene e a seqüência de codificação. A 5'-UTR está presente no mRNA

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14/77 inteiramente processado a montante da seqüência de iniciação da tradução. A 5'-UTR pode afetar o processamento do transcrito primário no mRNA, a estabilidade do mRNA, ou a eficiência de tradução. Foram descritos exemplos de seqüências principais de tradução (Turner e Foster, Molecular Biotechnology, 3:225(1995)).

[0059] O “transcrito de RNA” refere-se ao produto resultante da transcrição de uma seqüência de DNA catalisada pela RNA polimerase. Quando o transcrito de RNA for uma cópia complementar perfeita da seqüência de DNA, ele é referido como o transcrito primário, ou pode ser uma seqüência de RNA derivada do processamento pós-transcricional do transcrito primário e é referido como o RNA maduro. O “RNA mensageiro” (mRNA) refere-se ao RNA que está sem íntrons e que pode ser traduzido para polipeptídeo pela célula. O “RNA com sentido” refere-se a um transcrito de RNA que inclui o mRNA e, assim, pode ser traduzido para um polipeptídeo pela célula. O “RNA anti-sentido” refere-se a um transcrito de RNA que é complementar a um mRNA alvo, resultando em duplexes de RNA:RNA específicos sendo formados por emparelhamento de bases entre o substrato do RNA anti-sentido e o mRNA alvo.

[0060] O “vetor recombinante” refere-se a qualquer agente pelo, ou no, qual um ácido nucléico de interesse é amplificado, expresso, ou armazenado, tal como um plasmídio, cosmídio, vírus, seqüência que se replica autonomamente, fago, ou seqüência de filamentos de DNA ou RNA único linear, filamento simples circular, filamento duplo linear, ou filamento duplo circular. O vetor recombinante pode ser derivado de qualquer fonte e é capaz de integração genômica ou replicação autônoma.

[0061] A “seqüência reguladora” refere-se a uma seqüência de nucleotídeos localizada a montante (5'), dentro, ou a jusante (3') em relação a uma seqüência de codificação. Adicionalmente, os íntrons

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15/77 podem ter atividade reguladora. A transcrição e a expressão da seqüência de codificação é tipicamente impactada pela presença ou ausência da seqüência reguladora.

[0062] “Substancialmente homólogas” refere-se a duas seqüências que são pelo menos cerca de 90% idênticas na seqüência, como medido pelo método de CLUSTAL W no programa Omiga, usando parâmetros preestabelecidos (Versão 2.0; Accelrys, San Diego, CA).

[0063] “Substancialmente purificada” refere-se a uma molécula separada de substancialmente todas as outras moléculas normalmente associadas com ela em seu estado nativo. Mais preferivelmente, uma molécula substancialmente purificada é a espécie predominante presente em uma preparação. Uma molécula substancialmente purificada pode estar mais do que cerca de 60% isenta, preferivelmente cerca de 75% isenta, mais preferivelmente cerca de 90% isenta, e mais preferivelmente ainda cerca de 95% isenta das outras moléculas (exclusive do solvente) presentes na mistura natural. A expressão “substancialmente purificada” não é pretendida incluir as moléculas presentes em seu estado nativo.

[0064] O termo “transformação” refere-se à introdução do ácido nucléico em um hospedeiro receptor. O termo “hospedeiro” refere-se às células de bactérias, fungos, animais ou células de animais, plantas ou sementes, ou quaisquer partes ou tecidos das plantas, incluindo as células vegetais, os protoplastos, os calos, as raízes, os tubérculos, as sementes, os caules, as folhas, as mudas, os embriões, e o pólen.

[0065] Conforme usado aqui, uma “planta transgênica” é uma planta tendo um ácido nucléico estavelmente introduzido em seu genoma, por exemplo, os genomas nucleares ou de plastídios.

[0066] Os termos “sementes” e “grãos” são entendidos serem equivalentes no significado. O termo grão é freqüentemente usado na descrição da semente de uma planta de milho ou arroz. Em todas as

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16/77 plantas, a semente é o óvulo maduro consistindo em uma casca da semente, o embrião e, nas plantas da presente invenção, um endosperma.

Ácidos Nucléicos de GBSS de HOI001 [0067] A presente invenção proporciona ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos substancialmente homólogos a uma amido sintase ligada a grânulo a partir da planta endógama HOI001 (GBSS de HOI001). Em uma modalidade, estas moléculas de ácido nucléico são usadas no contexto da presente invenção para aumentar o teor de óleo dos tecidos vegetais. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um ácido nucléico isolado que codifica uma proteína GBSS de HOI001, ácido nucléico este que é selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID N°: 1 e seus complementos, e os ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos tendo pelo menos cerca de 94% de identidade de seqüência com a SEQ ID N°: 3. A porcentagem de identidade de seqüência dos polipeptídeos codificados pelos ácidos nucléicos desta invenção é preferivelmente pelo menos cerca de 95%; e mais preferivelmente pelo menos cerca de 98%.

[0068] A presente invenção também proporciona vetores contendo tais ácidos nucléicos de GBSS de HOI001. Como descrito em mais detalhe aqui abaixo, os ácidos nucléicos preferidos incluem elementos reguladores apropriados operavelmente ligados aos mesmos que facilitam a expressão eficiente dos ácidos nucléicos inventivos em um hospedeiro, incluindo, sem limitação, os hospedeiros bacterianos, fúngicos, ou vegetais. Os vetores úteis no contexto da presente invenção podem incluir tais elementos reguladores.

[0069] Os ácidos nucléicos e os vetores incluídos pela presente invenção não necessitam ter as seqüências de ácidos nucléicos exatas descritas aqui. Em vez disso, as seqüências destes ácidos nucléicos e vetores podem variar, desde que o ácido nucléico realize a

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Π7 função para a qual ele é pretendido ou tenha alguma outra utilidade, por exemplo, como sonda de ácido nucléico para ácidos nucléicos complementares. Por exemplo, é permitida alguma variabilidade da seqüência em qualquer parte do ácido nucléico de GBSS de HOI001, desde que a transformação de uma planta com o polipeptídeo, ou polipeptídeos, mutante ou variante resulte em um fenótipo substancialmente similar àquele de GBSS de HOI001. Mais preferivelmente, a variabilidade da seqüência antes mencionada resulta em acúmulo aumentado de óleo nos tecidos vegetais, em comparação com as plantas de genótipo igual ou similar, porém sem o transgene.

[0070] Os ácidos nucléicos fragmentos e variantes de SEQ ID N°:

também são incluídos pela presente invenção. Os fragmentos de ácidos nucléicos incluídos pela presente invenção são de três tipos gerais. Primeiro, os ácidos nucléicos fragmentos que não são de tamanho natural, porém de fato realizam a sua função pretendida, estão incluídos na presente invenção. Segundo, os fragmentos de ácidos nucléicos identificados aqui, que são úteis como sondas de hibridização, também estão incluídos na invenção. E, terceiro, os fragmentos de ácidos nucléicos identificados aqui podem ser usados nas tecnologias de supressão conhecidas na técnica, tais como, por exemplo, a tecnologia anti-sentido ou a inibição do RNA (RNAi), que proporciona a redução do fluxo de carbono em uma planta para o óleo, tornando disponível mais carbono para acúmulo de proteína ou amido, por exemplo. Assim, os fragmentos de uma seqüência de nucleotídeos, tal como a SEQ ID NO; 1, podem variar de pelo menos cerca de 15 nucleotídeos, cerca de 17 nucleotídeos, cerca de 18 nucleotídeos, cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos ou mais. Em geral, um ácido nucléico fragmento da presente invenção pode ter qualquer limite de tamanho

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18/77 superior, desde que esteja relacionado, na seqüência, aos ácidos nucléicos da presente invenção, porém não inclua o tamanho natural.

[0071] Conforme usado aqui, as “variantes” têm seqüências substancialmente similares ou substancialmente homólogas quando comparadas à seqüência de referência ou do tipo selvagem. Para as seqüências de nucleotídeos que codificam proteínas, as variantes também incluem aquelas seqüências que, por causa da degeneração do código genético, codificam a seqüência de aminoácidos idêntica da proteína de referência. Os ácidos nucléicos variantes também incluem aqueles que codificam polipeptídeos que não têm seqüências de aminoácidos idênticas àquela das proteínas identificadas aqui, porém que codificam uma proteína ativa com mudanças conservativas na seqüência de aminoácidos.

[0072] A presente invenção não está limitada às mudanças silenciosas nas presentes seqüências de nucleotídeos, porém também inclui as seqüências de ácidos nucléicos variantes que alteram de modo conservativo a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo da presente invenção. Porque é a capacidade interativa e a natureza de uma proteína que definem a atividade funcional biológica desta proteína, certas substituições de seqüências de aminoácidos podem ser feitas em uma seqüência protéica e, obviamente, em sua seqüência de codificação de DNA básica e, contudo, ainda pode ser obtida uma proteína com propriedades similares. É, assim, contemplado pelos inventores que diversas mudanças podem ser feitas nas seqüências peptídicas das proteínas ou fragmentos da presente invenção, ou nas seqüências de DNA correspondentes que codificam os peptídeos, sem perda apreciável de sua utilidade ou atividade biológica. De acordo com a presente invenção, então, os ácidos nucléicos variantes e de referência da presente invenção podem diferir na seqüência de aminoácidos codificada em uma ou

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19/77 mais substituições, adições, inserções, remoções, fusões, e truncamentos, que podem estar presentes em qualquer combinação, desde que uma proteína GBSS de HOI001 ativa seja codificada pelo ácido nucléico variante. Tais ácidos nucléicos variantes não codificarão exatamente a mesma seqüência de aminoácido que o ácido nucléico de referência, porém terão mudanças conservativas na seqüência. Os códons capazes de codificar tais substituições de aminoácidos conservativas são bem conhecidos na técnica.

[0073] Pode ser considerada uma outra abordagem para identificar as substituições de aminoácidos conservativas, que requer a análise do índice hidropático dos aminoácidos. A importância do índice hidropático dos aminoácidos em conferir função biológica interativa a uma proteína é geralmente entendida na técnica (Kyte e Doolittle, J. Mol. Biol., 157:105-132 (1982)). É aceito que o caráter hidropático relativo do aminoácido contribui para a estrutura secundária do polipeptídeo resultante que, por sua vez, define a interação da proteína com as outras moléculas, por exemplo, as enzimas, os substratos, os receptores, o DNA, os anticorpos, os antígenos, e similares.

[0074] Cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático com base em sua hidrofobicidade e características de carga (Kyte e Doolittle, J. Mol. Biol., 157:105-132 (1982)); estes são isoleucina (+4,5), valina (+4,2), leucina (+3,8), fenilalanina (+2,8), cisteína/cistina (+2,5), metionina (+1,9), alanina (+1,8), glicina (-0,4), treonina (-0,7), serina (-0,8), triptofano (-0,9), tirosina (-1,3), prolina (-1,6), histidina (3,2), glutamato (-3,5), glutamina (-3,5), aspartato (-3,5), asparagina (3,5), lisina (-3,9), e arginina (-4,5).

[0075] Ao fazer tais mudanças, é preferida a substituição dos aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de ±2, aqueles que estão dentro de ±1 são particularmente preferidos, e aqueles

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20/77 dentro de ±0,5 são ainda mais particularmente preferidos.

[0076] Também é entendido na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita efetivamente na base da hidrofilicidade. A Patente U.S. 4.554.101 estabelece que a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, como ditada pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com uma propriedade biológica da proteína.

[0077] Conforme detalhado na Patente U.S. 4.554.101, os seguintes valores de hidrofilicidade foram atribuídos aos resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0), lisina (+3,0), aspartato (+3,0±1), glutamato (+3,0±1), serina (+0,3), asparagina (+0,2), glutamina (+0,2), glicina (0), treonina (-0,4), prolina (-0,5±1), alanina (-0,5), histidina (0,5), cisteína (-1,0), metionina (-1,3), valina (-1,5), leucina (-1,8), isoleucina (-1,8), tirosina (-2,3), fenilalanina (-2,5), e triptofano (-3,4).

[0078] Ao fazer tais mudanças, é preferida a substituição dos aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ±2, aqueles que estão dentro de ±1 são particularmente preferidos, e aqueles dentro de ±0,5 são ainda mais particularmente preferidas.

[0079] Os ácidos nucléicos variantes com mudanças silenciosas e conservativas podem ser definidos e caracterizados pelo grau de homologia ao ácido nucléico de referência. Os ácidos nucléicos variantes preferidos são substancialmente homólogos aos ácidos nucléicos de referência da presente invenção. Conforme reconhecido por alguém de habilidade na técnica, tais ácidos nucléicos substancialmente similares podem hibridizar, sob condições severas, com os ácidos nucléicos de referência identificados por SEQ ID N°: 1, aqui. Estes tipos de ácidos nucléicos substancialmente homólogos são incluídos por esta invenção.

[0080] Os ácidos nucléicos variantes podem ser detectados e

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21/77 isolados por procedimentos padrões de hibridização. A hibridização para detectar ou isolar tais seqüências é geralmente efetuada sob condições “moderadamente severas” e, preferivelmente, sob condições “severas”. As condições de hibridização moderadamente severas e as condições de lavagem da hibridização moderadamente severas e severas associadas, usadas no contexto dos experimentos de hibridização de ácidos nucléicos, tais como a hibridização Southern e northern, são dependentes da seqüência, e são diferentes sob parâmetros ambientais diferentes. As seqüências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas mais altas. Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization with Nucleic Acid Probes, página 1, Capítulo 2 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays” Elsevier, NY (1993). Ver também J. Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, páginas 9.31-9.58 (1989); J. Sambrook e outros, Molecular

Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY (3^a ed. 2001).

[0081] A presente invenção também proporciona os métodos para a detecção e o isolamento de ácidos nucléicos derivados ou variantes codificando as proteínas proporcionadas aqui. Os métodos envolvem hibridizar pelo menos uma porção de um ácido nucléico compreendendo qualquer parte da SEQ ID N°: 1 com relação às seqüências relacionadas à GBSS de HOI001, com um ácido nucléico de amostra, desse modo formando um complexo de hibridização; e detectar o complexo de hibridização. A presença do complexo correlaciona-se com a presença de um ácido nucléico derivado ou variante que pode ser adicionalmente caracterizado por seqüenciamento de ácido nucléico, expressão de RNA e/ou proteína e

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22/77 teste para determinar se o derivado ou a variante conserva a capacidade de aumentar os níveis de óleo no tecido da planta, quando transformado naquela planta. Em geral, a porção de um ácido nucléico compreendendo qualquer parte da SEQ ID N°: 1 usada para a hibridização é preferivelmente pelo menos cerca de quinze nucleotídeos, e a hibridização é sob condições de hibridização que são suficientemente severas para permitir a detecção e o isolamento de ácidos nucléicos substancialmente homólogos; preferivelmente, as condições de hibridização são “moderadamente severas”, mais preferivelmente as condições de hibridização são “severas”, conforme definidas aqui e no contexto das práticas biológicas moleculares convencionais bastante conhecidas na técnica.

[0082] Geralmente, as condições de hibridização e de lavagem altamente severas são selecionadas para serem cerca de 5°C mais baixas do que o ponto de fusão térmico (T_m) para a seqüência de filamento duplo específica em uma concentração iônica e um pH definidos. Por exemplo, sob “condições altamente severas” ou “condições de hibridização altamente severas”, um ácido nucléico hibridizará com o seu complemento até um grau detectavelmente maior do que as outras seqüências (por exemplo, pelo menos duas vezes sobre a base). Pelo controle da severidade das condições de hibridização e/ou das de lavagem, os ácidos nucléicos tendo 100% de complementaridade podem ser identificados e isolados.

[0083] Tipicamente, as condições severas serão aquelas nas quais a concentração de sal é menos do que cerca de 1,5 M de íon Na, tipicamente uma concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de íon Na (ou outros sais), em pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para as sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para as sondas longas (por exemplo, mais do que 50 nucleotídeos). As condições severas também podem ser

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23/77 atingidas com a adição de agentes de desestabilização, tais como a formamida, em cujo caso as temperaturas de hibridização podem ser diminuídas. O sulfato de dextrano e/ou a solução de Denhardt (50X de Denhardt é 5% de Ficoll, 5% de polivinilpirrolidona, 5% de BSA) também podem ser incluídos nas reações de hibridização.

[0084] As condições de baixa severidade ilustrativas incluem a hibridização com uma solução tampão de 30 a 50% de formamida, 5X SSC (20X SSC é NaCl a 3M, citrato de trissódio a 0,3 M), fosfato de sódio a 50 mM, pH 7, EDTA a 5 mM, 0,1% de SDS (dodecil sulfato de sódio), 5X de Denhardt com 100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado a 37°C, e uma lavagem em 1X a 5X SSC (20X SSC definido como NaCl a 3,0 M e citrato de trissódio a 0,3 M), 0,1% de SDS a 37°C. As condições de severidade moderada ilustrativas incluem a hibridização em 40 a 50% de formamida, 5X SSC, fosfato de sódio a 50 mM, pH 7, EDTA a 5 mM, 0,1% de SDS, 5X de Denhardt com 100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado a 42°C, e uma lavagem em 0,1X a 2X SSC, 0,1% de SDS a 42 até 55°C. As condições de alta severidade ilustrativas incluem a hibridização em 50% de formamida, 5X SSC, fosfato de sódio a 50 mM, pH 7,0, EDTA a 5 mM, 0,1% de SDS, 5X de Denhardt com 100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado a 42°C, e uma lavagem em 0,1X SSC, 0,1% de SDS a 60 até 65°C.

[0085] Em uma outra modalidade da presente invenção, os ácidos nucléicos inventivos são definidos pela porcentagem da relação de identidade entre os ácidos nucléicos particulares e os outros membros da classe, usando protocolos analíticos bastante conhecidos na técnica. Tais protocolos analíticos incluem, porém não estão limitados ao: CLUSTAL no programa PC/Gene (disponível da Intelligenetics, Mountain View, CA) ou no programa Omiga versão 2.0, da Accelrys Inc., San Diego, CA; o programa ALIGN (Versão 2.0); e GAP,

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BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA no Pacote de Softwares Wisconsin Genetics, Versão 8 (disponível da Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, WI). Os alinhamentos usando estes programas podem ser efetuados usando parâmetros preestabelecidos. O programa CLUSTAL está bem descrito por Higgins e outros, Gene, 73:237-244 (1988); Higgins e outros, CABIOS, 5:151-153 (1989); Corpet e outros, Nucleic Acids Res., 16:1088110890 (1989); Huang e outros, CABIOS, 8:155-165 (1992); e Pearson e outros, Meth. Mol. Biol., 24:307-331 (1994). O programa ALIGN é baseado no algoritmo de Meyers e Miller, Computer Applic. Sci., 4:1117 (1988). Os programas BLAST de Altschul e outros, J. Mol. Biol., 215:403 (1990), são baseados no algoritmo de Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:2264-2268 (1990). Para obter os alinhamentos divergentes para propósitos de comparação, o Gapped BLAST (no BLAST 2.0) pode ser utilizado, conforme descrito em Altshcul e outros, Nucleic Acids Res., 25:3389 (1997).

Alternativamente, o PSI-BLAST (no BLAST 2.0) pode ser usado para efetuar uma busca repetida que detecta relações distantes entre as moléculas. Ver Altschul e outros, supra. Quando utilizando o BLAST, o Gapped BLAST, o PSI-BLAST, podem ser usados os parâmetros preestabelecidos dos respectivos programas (por exemplo, BLASTN para as seqüências de nucleotídeos, BLASTP para as proteínas). O programa BLASTN (para as seqüências de nucleotídeos) utiliza como parâmetros preestabelecidos um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, um corte de 100, M = 5, N = -4, e uma comparação de ambas as filamentos. Para as seqüências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como parâmetros preestabelecidos um comprimento de palavras (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de classificação BLOSUM62 (ver Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:10915 (1989))

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[0086] Para os propósitos da presente invenção, a comparação das seqüências de nucleotídeos, para a determinação da porcentagem de identidade de seqüência, com as seqüências de ácidos nucléicos aqui contidas é preferivelmente feita usando o programa BLASTN (versão 1.4.7 ou posterior) com os seus parâmetros preestabelecidos ou qualquer programa equivalente. Por “programa equivalente” é pretendido qualquer programa de comparação de seqüências que, para quaisquer duas seqüências em questão, gere um alinhamento tendo pares idênticos de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos e uma porcentagem de identidade de seqüência idêntica, quando comparado ao alinhamento correspondente gerado pelo programa preferido.

Vetores e Cassetes de Expressão [0087] Os vetores e os cassetes de expressão da presente invenção incluem os ácidos nucléicos codificando a GBSS de HOI001. Um transgene compreendendo uma GBSS de HOI001 pode ser subclonado em um vetor ou cassete de expressão, e a expressão da GBSS de HOI001 pode ser detectada e/ou quantificada. Este método de triagem é útil para identificar transgenes que proporcionam uma expressão de uma GBSS de HOI001, e expressão de uma GBSS de HOI001 em uma célula vegetal transformada.

[0088] Os vetores de plasmídios que proporcionam a fácil seleção, amplificação, e transformação do transgene em células procarióticas e eucarióticas incluem, por exemplo, os vetores derivados de pUC, os vetores derivados de pSK, os vetores derivados de pGEM, os vetores derivados de pSP, os vetores derivados de pBS, o pFastBac (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) para a expressão em baculovírus e o pYES2 (Invitrogen) para a expressão em levedura.

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Podem estar presentes elementos adicionais em tais vetores, incluindo as origens de replicação para proporcionar a replicação autônoma do vetor, os genes marcadores selecionáveis, preferivelmente codificando a resistência a antibióticos ou herbicidas, os sítios de clonagem múltiplos únicos proporcionando sítios múltiplos para inserir seqüências de DNA ou genes codificados no transgene, e as seqüências que intensificam a transformação de células procarióticas e eucarióticas. Um vetor que é útil para a expressão nas células tanto vegetais quanto procarióticas é o plasmídio Ti binário (como divulgado em Schilperoot e outros, Patente U.S. 4.940.838), conforme exemplificado pelo vetor pGA582. Este vetor de plasmídio Ti binário foi anteriormente caracterizado por An, Methods in Enzymology, 153:292 (1987). Este vetor Ti binário pode ser replicado em bactérias procarióticas, tais como E. coli e Agrobacterium. Estes vetores de plasmídios de Agrobacterium também podem ser usados para transferir o transgene para as células vegetais. Os vetores Ti binários preferivelmente incluem os lados da direita e da esquerda de T DNA para proporcionar uma transformação eficiente da célula vegetal, um gene marcador selecionável, sítios de clonagem múltiplos únicos nas regiões de lados T, a replicação colE1 de origem e um replicon de alcance de hospedeiro amplo. Os vetores Ti binários carregando um transgene da presente invenção podem ser usados para transformar as células tanto procarióticas quanto eucarióticas, porém são preferivelmente usados para transformar as células vegetais (ver Glassman e outros, Patente U.S. 5.258.300). Os exemplos de vetores de expressão de plantas incluem os vetores comerciais pBI101, pBI101.2, pBI101.3, e pBIN19 (Clontech, Palo Alto, CA).

[0089] Em geral, os vetores e os cassetes de expressão da presente invenção contêm pelo menos um promotor capaz de expressar o RNA em uma célula vegetal e um terminador, além de um

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27/77 ácido nucléico codificando uma GBSS de HOI001. Também podem estar presentes outros elementos nos cassetes de expressão da presente invenção. Por exemplo, os cassetes de expressão também podem conter intensificadores, íntrons, seqüências principais não traduzidas, sítios de clonagem, regiões de ligação da matriz para silenciar os efeitos dos elementos de controle cromossômicos, e outros elementos conhecidos para alguém de habilidade na técnica.

[0090] Os cassetes de expressão têm promotores que podem regular a expressão do gene. As regiões de promotores são tipicamente encontradas na seqüência de DNA de flanco, a montante das regiões de codificação, nas células tanto procarióticas quanto eucarióticas. Uma seqüência de promotor proporciona a regulação da transcrição da seqüência de gene a jusante e tipicamente inclui de cerca de 50 a cerca de 2.000 pares de bases de nucleotídeos. As seqüências de promotores também contêm seqüências reguladoras, tais como as seqüências intensificadoras que podem influenciar o nível de expressão do gene. Algumas seqüências de promotores iso ladas podem proporcionar a expressão de gene dos genes heterólogos, ou seja, um gene diferente do gene nativo ou homólogo. As seqüências de promotores também são conhecidas serem fortes ou fracas ou induzíveis. Um promotor forte proporciona um alto nível de expressão do gene, ao passo que um promotor fraco proporciona um nível muito baixo de expressão do gene. Um promotor induzível é um promotor que proporciona a ativação e a desativação da expressão do gene em resposta a um agente adicionado de maneira exógena ou a um estímulo ambiental ou de desenvolvimento. Os promotores podem também proporcionar uma regulação específica para o tecido ou de desenvolvimento. Uma seqüência de promotor isolada que seja um promotor forte para os genes heterólogos é vantajosa porque ela proporciona um nível suficiente de expressão de gene para permitir a

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28/77 detecção e a seleção fáceis de células transformadas e proporciona um alto nível de expressão do gene, quando desejado. As regiões de iniciação da transcrição, que são preferencialmente expressas no tecido da semente, e que não são detectáveis em outras partes da planta, são consideradas desejáveis para as modificações do óleo da semente, a fim de minimizar quaisquer efeitos disruptivos ou adversos do produto de gene.

[0091] Os promotores da presente invenção geralmente incluirão, porém não estão limitados aos, promotores que funcionam em bactérias, células vegetais, ou plastídios. Os promotores úteis para a expressão bacteriana são os promotores lacZ, T7, T5, ou glg C de E. coli. Os promotores úteis para as células vegetais incluem o promotor de glutenina de alto peso molecular do trigo (pb 2647-3895 do Acesso ao Genbank X12928, versão X12928.3, originalmente descrito em Anderson e outros, Nucleic Acids Res., 17:461-462 (1989)), o promotor de globulina (ver Belanger e Kriz, Genet., 129:863-872, (1991)), o promotor de gama zeína Z27 (ver o U.S. Número de Série 08/763.705; também, Lopes e outros, Mol Gen Genet., 247:603-613 (1995)), o promotor de oleosina L3 (Patente U.S. 6.433.252), o promotor do CaMV 35S (Odell e outros, Nature, 313:810 (1985)), o CaMV 19S (Lawton e outros, Plant Mol. Biol., 9:31F (1987)), nos (Ebert e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:5745 (1987)), Adh (Walker e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:6624 (1987)), sacarose sintase (Yang e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:4144 (1990)), tubulina, actina (Wang e outros, Mol. Cell. Biol., 12:3399 (1992)), cab (Sullivan e outros, Mol. Gen. Genet., 215:431 (1989)), o promotor de PEPCase (Hudspeth e outros, Plant Mol. Biol., 12:579 (1989)), ou aqueles associados com o complexo de gene R (Chandler e outros, The Plant Cell, 1:1175 (1989)).

[0092] De fato, em uma modalidade preferida, o promotor usado é

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29/77 altamente expresso no endosperma. Os promotores ilustrativos incluem aqueles das zeínas, que são um grupo de proteínas de armazenagem encontradas no endosperma do milho. Os clones genômicos para os genes de zeína foram isolados (Pedersen e outros, Cell, 29:1015-1026 (1982) e Russel e outros, Transgenic Res.,

6(2):157-168 (1997)) e os promotores a partir destes clones, incluindo os genes de 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, e 27 kD (Z27, U.S. Número de Série 08/763.705; também, Reina e outros, Nucl. Acids Res., 18:6426 (1990), Lopes e outros, Mol. Gen. Genet., 247:603-613 (1995)), também podem ser usados. Os outros promotores preferidos, conhecidos funcionarem no milho, e em outras plantas, incluem os promotores para os seguintes genes: WAXY (amido sintase ligada a grânulo; Shure e outros, Cell, 35:225-233 (1983); Russel e outros, Transgenic Res., 6(2):157-168 (1997)), Brittle 2 e Shrunken 2 (ADP glicose priofosforilase, Anderson e outros, Gene, 97:199-205 (1991), Russel e outros, Transgenic Res., 6(2):157-168 (1997)), Shrunken 1 (sacarose sintase, Yang e Russell, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:4144-4148 (1990)), enzimas de ramificação I e II, promotor WAXY do arroz (Terada e outros, Plant Cell Physiology, 41(7):881-888 (2000)), enzimas de des-ramificação, glutelinas (Zheng e outros, Plant J., 4:357-366 (1993), Russell e outros, Transgenic Res., 6(2):157-168 (1997)), e Betl1 (camada de transferência de endosperma basal; Hueros e outros, Plant Physiol., 121:1143-1152 (1999)). Outros promotores úteis na prática da presente invenção, que são conhecidos por alguém de habilidade na técnica, também são contemplados pela invenção.

[0093] Além disso, os intensificadores da transcrição ou as duplicações dos intensificadores podem ser usadas para aumentar a expressão a partir de um promotor particular. Os exemplos de tais intensificadores incluem, porém não estão limitados aos elementos a

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30/77 partir dos genes de promotor do CaMV 35S e octopina sintase (Last e outros, Patente U.S. 5.290.924). Visto que a seqüência de DNA entre o sítio de iniciação da transcrição e o início da seqüência de codificação, isto é, a seqüência principal não traduzida, pode influenciar a expressão do gene, pode-se também desejar empregar uma seqüência principal particular. Qualquer seqüência principal disponível para alguém de habilidade na técnica pode ser empregada. As seqüências principais preferidas orientam os níveis ótimos de expressão do gene ligado, por exemplo, aumentando ou mantendo a estabilidade do mRNA e/ou impedindo a iniciação inadequada da tradução (Joshi, Nucl. Acid Res., 15:6643 (1987)). A escolha de tais seqüências está na discrição daqueles de habilidade na técnica. As seqüências que são derivadas de genes que são altamente expressos em plantas superiores, e na soja, milho, e canola em particular, são contempladas.

[0094] Os cassetes de expressão da presente invenção também incluirão uma seqüência próxima à extremidade de 3' do cassete, que atua como um sinal para terminar a transcrição de um ácido nucléico heterólogo e que orienta a poliadenilação do mRNA resultante. Estas são comumente referidas como regiões não traduzidas em 3' ou 3' UTRs. Alguns elementos em 3' que podem atuar como sinais de terminação da transcrição incluem a 3' UTR HSP17 de trigo (bp532741 do GenBank X13431, versão X13431.1, McElvain e Spiker, Nucleic Acids Res., 17:1764 (1989)), aqueles a partir do gene de nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (Bevan e outros, Nucl. Acid Res., 11:369 (1983)), uma 3'UTR de napina (Kridl e outros, Seed Sci Res., 1:209-219 (1991)), uma 3' UTR de globulina (Belanger e Kriz, Genetics, 129:863-872 (1991)), ou um a partir de um gene de zeína, tal como Z27 (Lopes e outros, Mol. Gen Genet., 247:603-613 (1995)). Outros elementos em 3' conhecidos por alguém versado na técnica

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31/77 também podem ser usados nos vetores da presente invenção.

[0095] Os elementos reguladores, tais como o íntron de Adh 1 (Callis e outros, Genes Develop., 1:1183 (1987)), um íntron de actina do arroz (McElroy e outros, Mol. Gen. Genet., 231(1):150-160 (1991), o íntron de sacarose sintase (Vasil e outros, Plant Physiol., 91:5175 (1989)), o íntron de HSP70 do milho (Rochester e outros, EMBO J., 5:451-458 (1986)), ou o elemento de TMV ômega (Gallie e outros, The Plant Cell, 1:301 (1989)), podem adicionalmente ser incluídos, onde desejados. Estas seqüências reguladoras não traduzidas em 3' podem ser obtidas conforme descrito em An, Methods in Enzymology, 153:292 (1987) ou já estão presentes em plasmídios disponíveis a partir de fontes comerciais, tais como Clontech, Palo Alto, CA. As seqüências reguladoras não traduzidas em 3' podem ser operavelmente ligadas à extremidade de 3' de qualquer ácido nucléico heterólogo a ser expresso pelos cassetes de expressão contidos dentro dos presentes vetores. Outros tais elementos reguladores úteis na prática da presente invenção são conhecidos por alguém de habilidade na técnica e também podem ser colocados nos vetores da invenção.

[0096] Os vetores da presente invenção, bem como as regiões de codificação reivindicadas aqui, podem ser otimizados para a expressão nas plantas tendo um ou mais códons substituídos por outros códons codificando os mesmos aminoácidos, de modo que o polipeptídeo seja otimamente traduzido pelo mecanismo de tradução da espécie vegetal na qual o vetor é usado.

Marcadores Selecionáveis [0097] Os genes marcadores selecionáveis ou os genes relatores também são úteis na presente invenção. Tais genes podem conferir um fenótipo distinto às células expressando o gene marcador e, assim, permitem que tais células transformadas sejam distinguidas das

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32/77 células que não têm o marcador. Os genes marcadores selecionáveis conferem uma característica que se pode “selecionar” por meios químicos, isto é, através do uso de um agente seletivo (por exemplo, um herbicida, antibiótico, ou similar). Os genes relatores, ou genes examináveis, conferem uma característica que se pode identificar através de observação ou teste, isto é, por “triagem” (por exemplo, a característica do lócus R). Obviamente, muitos exemplos de genes marcadores adequados são conhecidos na técnica e podem ser empregados na prática da presente invenção.

[0098] Diversos genes marcadores selecionáveis são conhecidos na técnica e podem ser usados na presente invenção. Um gene marcador selecionável preferido, para uso na presente invenção, incluiria os genes que conferem resistência a herbicidas, como o glifosato, tal como EPSP (Della-Cioppa e outros, Bio/Technology, 5(6):579-84 (1987)). Um marcador selecionável particularmente preferido incluiria um gene que codifica uma proteína EPSP sintase alterada (Hinchee e outros, Biotech., 6:915 (1988)). Os outros marcadores selecionáveis possíveis, para uso em conexão com a presente invenção, incluem, porém não estão limitados a, um gene neo (Potrykus e outros, Mol. Gen. Genet., 199:183 (1985)), que codifica a resistência à canamicina e pode ser selecionado aplicando a canamicina, um análogo da canamicina, tal como a geneticina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), e similar; um gene bar que codifica para a resistência ao bialaphos; um gene de nitrilase, tal como bxn a partir de Klebsiella ozaenae, que confere resistência ao bromoxinil (Stalker e outros, Science, 242:419 (1988)); um gene de acetolactato sintase (ALS) mutante, que confere resistência à imidazolinona, à sulfoniluréia ou a outras substâncias químicas inibidoras da ALS (EP 154 204A1 (1985)); um gene de DHFR resistente ao metotrexato (Thillet e outros, J. Biol. Chem., 263:12500

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33/77 (1988)); um gene de dalapon desalogenase que confere resistência ao herbicida dalapon. Onde um gene de EPSP sintase mutante for empregado, pode ser realizado um benefício adicional através da incorporação de um peptídeo de transporte de plastídio adequado (CTP).

[0099] Os marcadores examináveis que podem ser empregados incluem, porém não estão limitados a, um gene de β-glicuronidase ou uidA (GUS), que codifica uma enzima para a qual diversos substratos cromogênicos são conhecidos; um gene de lócus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) nos tecidos vegetais (Dellaporta e outros, Em: Chromosome Structure and Function, páginas 263-282 (1988)); um gene de βlactamase (Sutcliffe, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75:3737 (1978)), que codifica uma enzima para a qual diversos substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene xylE (Zukowsky e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:1101 (1983)) que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos; um gene de α-amilase (Ikuta e outros, Biotech., 8:241 (1990)); um gene de tirosinase (Katz e outros, J. Gen. Microbiol., 129:2703 (1983)) que codifica uma enzima capaz de oxidar a tirosina para DOPA e dopaquinona, que, por sua vez, condensa-se para formar o composto facilmente detectável melanina; um gene de β-galactosidase, que codifica uma enzima para a qual existem substratos cromogênicos; um gene de luciferase (lux) (Ow e outros, Science, 234:856 (1986)), que permite a detecção por bioluminescência; ou um gene de aequorina (Prasher e outros, Biochem. Biophys. Res. Comm., 126:1259 (1985)), que pode ser empregado na detecção por bioluminescência sensível ao cálcio, ou um gene de proteína fluorescente verde (Niedz e outros, Plant Cell Reports, 14:403 (1995)). Em uma modalidade preferida, o

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34/77 gene marcador examinável está operavelmente ligado a um promotor específico para a aleurona, como descrito por Kriz e outros, na Patente U.S. 6.307.123.

[00100] Além da transformação nuclear da planta, a presente invenção também se estende para a transformação direta do genoma do plastídio das plantas. Portanto, a objetivação do produto de gene para um compartimento intracelular dentro das células vegetais também pode ser obtida por distribuição direta de um gene para o compartimento intracelular. Em algumas modalidades, a transformação direta do genoma do plastídio pode proporcionar benefícios adicionais sobre a transformação nuclear. Por exemplo, a transformação direta do plastídio da GBSS de HOI001 elimina a exigência por um peptídeo que objetive um plastídio e o transporte e o processamento pós-traducionais da pré-proteína derivada dos transformantes nucleares correspondentes. A transformação dos plastídios das plantas foi descrita por P. Maliga, Current Opinion in Plant Biology, 5:164-172 (2002), Heifetz, Biochimie, 82:655-666 (2000), Bock, J. Mol. Biol., 312:425-438 (2001), e Daniell e outros, Trends in Plant Science, 7:84-91 (2002); e as referências citadas nos mesmos.

[00101] Após construir um transgene contendo uma GBSS de HOI001, o vetor ou o cassete de expressão pode então ser introduzido em uma célula vegetal. Dependendo do tipo de célula vegetal, do nível de expressão do gene, e da atividade da enzima codificada pelo gene, a introdução do DNA codificando uma GBSS de HOI001 na célula vegetal pode resultar no teor de óleo aumentado nos tecidos vegetais. T ransformação da Planta [00102] São conhecidas na técnica as práticas para transfo rmar uma célula vegetal, um tecido vegetal, um órgão vegetal, ou uma planta com um constructo de ácido nucléico, tal como um vetor. Tais

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35/77 métodos envolvem técnicas de cultura de tecido vegetal, por exemplo. Conforme usado aqui, “transformar” refere-se à introdução do ácido nucléico em uma célula receptora e a expressão na mesma.

[00103] A célula vegetal, o tecido vegetal, o órgão vegetal, ou a planta pode ser contatada com o vetor por qualquer meio adequado, conforme conhecido na técnica. De preferência, é para ser produzida uma planta transgênica expressando a proteína desejada. Os diversos métodos para a introdução de uma seqüência de polinucleotídeo desejada, codificando a proteína desejada nas células vegetais, incluem, porém não estão limitados aos: (1) métodos físicos, tais como a microinjeção (Capecchi, Cell, 22(2):479-488 (1980)), a eletroporação (Fromm e outros, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 82(17):5824-5828 (1985); Patente U.S. 5.384.253), e a distribuição mediada por bombardeio de microprojéteis (Christou e outros, Bio/Technology, 9:957 (1991); Fynan e outros, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 90(24);11478-11482 (1993)); (2) métodos de distribuição mediados por vírus (Clapp, Clin. Perinatol., 20(1):155-168 (1993); Lu e outros, J. Exp. Med., 178(6);2089-2096 (1993); Eglitis e Anderson, Biotechnique, 6(7):608-614 (1988)); e (3) métodos de transformação mediados por Agrobacterium.

[00104] Os métodos mais comumente usados para a transformação das células vegetais são o processo de transferência de DNA mediado por Agrobacterium (Fraley e outros, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803 (1983)) e o processo mediado por bombardeio de microprojéteis. Tipicamente, a transformação nuclear é desejada, porém onde for desejável transformar especificamente os plastídios, tais como os cloroplastos ou os amiloplastos, os plastídios das plantas podem ser transformados utilizando uma distribuição mediada por bombardeio de microprojéteis do polinucleotídeo desejado para certas espécies de plantas, tais como o tabaco, Arabidopsis, batata, e a

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36/77 espécie de Brassica.

[00105] A transformação mediada por Agrobacterium é obtida através do uso de uma bactéria do solo geneticamente engenheirada, pertencente ao gênero Agrobacterium. Diversas espécies de Agrobacterium medeiam a transferência de um DNA específico , conhecido como “T-DNA”, que pode ser geneticamente engenheirado para carregar qualquer pedaço desejado do DNA para muitas espécies vegetais. As ocorrências principais que marcam o processo da patogênese mediada por T-DNA são: indução dos genes de virulência, processamento, e transferência do T-DNA. Este processo é o assunto de muitas revisões (Ream, Ann. Rev. Phytopathol., 27:583-618 (1989); Howard e Citovsky, Bioassays, 12:103-108 (1990); Kado, Crit. Rev. Plant Sci., 10:1-32 (1991); Zambryski, Annual Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 43:465-490 (1992); Gelvin, Em: Transgenic Plants, Kung e Wu, (eds.), Academic Press, San Diego, CA, páginas 49-87 (1993); Binns e Howitz, Em: Bacterial Pathogenesis of Plants and Animals, Dang, (ed.). Berlim: Springer Verlag, páginas 119-138 (1994);

Hooykaas e Beijersbergen, Ann. Rev. Phytopathol., 32:157-179 (1994); Lessl e Lanka, Cell, 77:321-324 (1994); Zupan e Zambryski, Annual Rev. Phytopathol., 27:583-618 (1995)).

[00106] A transformação genética das plantas mediada por Agrobacterium envolve diversas etapas. A primeira etapa, na qual o Agrobacterium virulento e as células vegetais são primeiramente colocados em contato um com o outro, é geralmente chamada “inoculação”. A solução contendo Agrobacterium é então removida do contato com o explante por drenagem ou aspiração. Seguindo a inoculação, o Agrobacterium e as células/tecidos vegetais são deixados serem desenvolvidos juntos por um período de diversas horas até diversos dias ou mais, sob condições adequadas para o crescimento e a transferência do T-DNA. Esta etapa é chamada “co

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37/77 cultura”. Seguindo a co-cultura e a distribuição do T-DNA, as células vegetais são tratadas com agentes bactericidas ou bacteriostáticos para matar o Agrobacterium que permanece em contato com o explante e/ou no vaso contendo o explante. Se isto for feito na ausência de quaisquer agentes seletivos, para promover o crescimento preferencial de células vegetais transgênicas versus não transgênicas, então esta é tipicamente referida como a etapa de “retardo”. Se feito na presença de células vegetais transgênicas que favorecem a pressão seletiva, então ela é referida como uma etapa de “seleção”. Quando um “retardo” for usado, ele é tipicamente seguido por uma ou mais etapas de “seleção”. Ambas as etapas de “retardo” e de “seleção” tipicamente incluem agentes bactericidas ou bacteriostáticos para matar quaisquer células de Agrobacterium restantes, porque o crescimento de células de Agrobacterium é indesejável após o processo de infecção (inoculação e co-cultura).

[00107] Diversas cepas do tipo selvagem e acalmadas de Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes, abrigando os plasmídios Ti ou Ri, podem ser usadas para a transferência do gene para as plantas. Os hospedeiros de Agrobacterium contêm plasmídios Ti e Ri acalmados que não contêm os oncogenes que causam tumorigênese ou rizogênese, respectivamente, que são usados como os vetores e contêm os genes de interesse que são subseqüentemente introduzidos nas plantas. As cepas preferidas incluiriam, porém não estão limitadas à cepa de Agrobacterium tumefaciens C58, uma cepa do tipo nopalina que é usada para mediar a transferência de DNA para uma célula vegetal, às cepas do tipo octopina, tais como LBA4404, ou às cepas do tipo succinamopina, por exemplo, EHA101 ou EHA105. A molécula de ácido nucléico, preparada como uma composição de DNA in vitro, é introduzida em um hospedeiro adequado, tal como E. coli, e unida ao Agrobacterium,

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38/77 ou diretamente transformada no Agrobacterium adequado. Estas práticas são bastante conhecidas para aqueles de habilidade na técnica.

[00108] O Agrobacterium pode ser preparado inoculando um líquido, tal como o meio de Luria Burtani (LB), diretamente de um estoque de glicerol, ou riscando o Agrobacterium sobre um meio solidificado a partir de um estoque de glicerol, permitindo que as bactérias cresçam sob as condições seletivas apropriadas, geralmente de cerca de 26°C-30°C, ou cerca de 28°C, e retirando uma única colônia ou um pequeno laço de Agrobacterium da placa e inoculando um meio de cultura de líquido contendo os agentes seletivos. Aqueles de habilidade na técnica estão familiares com os procedimentos para o crescimento e as condições de cultura adequadas para Agrobacterium, bem como os procedimentos subseqüentes de inoculação. A densidade da cultura de Agrobacterium usada para a inoculação e a razão de células de Agrobacterium para explante podem variar de um sistema para o seguinte e, portanto, é esperada a otimização destes parâmetros para qualquer método de transformação.

[00109] Tipicamente, uma cultura de Agrobacterium é inoculada a partir de uma placa riscada ou estoque de glicerol e é desenvolvida durante a noite e as células bacterianas são lavadas e suspensas novamente em um meio de cultura adequado para a inoculação do explante.

[00110] Com relação ao bombardeio de microprojéteis (Patentes U.S. 5.550.318; 5.538.880; e 5.610.042; e Publicação PCT WO

95/06128; cada uma das quais é especificamente incorporada aqui por referência em sua totalidade), as partículas são revestidas com ácidos nucléicos e distribuídas para as células por uma força de propulsão. As partículas ilustrativas incluem aquelas compreendidas de tungstênio, platina, e preferivelmente, ouro. É contemplado que em

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39/77 algumas situações a precipitação do DNA sobre as partículas de metais não seria necessária para a distribuição do DNA para uma célula receptora usando bombardeio de microprojéteis. Entretanto, é contemplado que as partículas podem conter o DNA, em vez de serem revestidas com o DNA. Portanto, propõe-se que as partículas revestidas com DNA possam aumentar o nível de distribuição de DNA via bombardeio de partículas, porém não são, em si e de si próprias, necessárias.

[00111] Para o bombardeio, as células em suspensão são concentradas sobre filtros ou meio de cultura sólido. Alternativamente, embriões imaturos ou outras células-alvo podem ser dispostos sobre o meio de cultura sólido. As células a serem bombardeadas são posicionadas em uma distância apropriada, abaixo da placa de interrupção do microprojétil.

[00112] Uma modalidade ilustrativa de um método para a distribuição de DNA para as células vegetais por bombardeio de microprojéteis é o Sistema de Distribuição de Partículas Biolistics (BioRad, Hercules, CA), que pode ser usado para propelir as partículas revestidas com o DNA ou as células através de uma tela, tal como uma tela de aço inoxidável ou Nytex, para uma superfície de filtro revestida com células de plantas monocotiledôneas cultivadas em suspensão. A tela dispersa as partículas, de modo que elas não são distribuídas para as células receptoras em agregados grandes. Acredita-se que uma tela intermediária, entre o aparelho de projétil e as células a serem bombardeadas, reduz o tamanho dos agregados de projéteis e pode contribuir para uma freqüência maior de transformação por redução do dano imposto sobre as células receptoras pelos projéteis que são muito grandes.

[00113] Para o bombardeio de microprojéteis, ligar-se-á (isto é, “revestir-se-á”) o DNA aos microprojéteis, de modo tal que ele seja

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40/77 distribuído para as células receptoras em uma forma adequada para a sua transformação. Com relação a isto, pelo menos algo do DNA de transformação deve estar disponível para a célula-alvo para a transformação ocorrer, embora, ao mesmo tempo, durante a distribuição, o DNA deva estar ligado ao microprojétil. Portanto, a disponibilidade do DNA de transformação a partir do microprojétil pode compreender a inversão física das ligações entre o DNA de transformação e o microprojétil, seguindo a distribuição do microprojétil para a célula-alvo. Este não necessita ser o caso, entretanto, visto que a disponibilidade para uma célula-alvo pode ocorrer como um resultado do rompimento dos segmentos não ligados de DNA ou de outras moléculas, que compreendem a ligação física ao microprojétil. A disponibilidade pode ocorrer adicionalmente como um resultado do rompimento das ligações entre o DNA de transformação e as outras moléculas, que estão direta ou indiretamente ligadas ao microprojétil. É adicionalmente contemplado que a transformação de uma célulaalvo pode ocorrer por meio da recombinação direta entre o DNA de transformação e o DNA genômico da célula receptora. Portanto, conforme usado aqui, um microprojétil “revestido” será um que seja capaz de ser usado para transformar uma célula-alvo, pelo fato de que o DNA de transformação será distribuído para a célula-alvo, contudo estará acessível para a célula-alvo de modo que a transformação possa ocorrer.

[00114] Pode ser usada qualquer técnica para revestir microprojéteis, a qual permita a distribuição do DNA de transformação para as células-alvo. Foram especificamente descritos aqui métodos para revestir microprojéteis, os quais foram demonstrados funcionar bem com a presente invenção. Entretanto, o DNA pode ser ligado às partículas de microprojéteis usando técnicas alternativas. Por exemplo, as partículas podem ser revestidas com estreptavidina e a

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41/77 extremidade do DNA marcada com cadeias de nucleotídeos biotiniladas cliváveis com tiol de cadeia longa. O DNA adere às partículas devido à interação entre estreptavidina-biotina, porém é liberado na célula por redução da ligação de tiol através de agentes redutores presentes na célula.

[00115] Alternativamente, as partículas podem ser preparadas funcionalizando a superfície de uma partícula de óxido de ouro, proporcionando grupos amina livres. O DNA, tendo uma forte carga negativa, se liga às partículas funcionalizadas. Além disso, as partículas carregadas podem ser depositadas em arranjos controlados sobre a superfície de discos mylar que se movem rapidamente, usados no dispositivo PDS-1000 Biolistics, desse modo facilitando a distribuição controlada das partículas distribuídas para o tecido-alvo.

[00116] Conforme acima descrito, é adicionalmente proposto que a concentração de DNA usado para revestir os microprojéteis possa influenciar a recuperação dos transformantes contendo uma única cópia do transgene. Por exemplo, uma concentração de DNA mais baixa pode não necessariamente alterar a eficiência da transformação, porém pode, em vez disso, aumentar a proporção dos eventos de inserção de cópia única. Em relação a isto, aproximadamente 1 ng a 2000 ng de DNA de transformação podem ser usados por cada 1,8 mg de microprojéteis de partida. Em outras modalidades da presente invenção, aproximadamente 2,5 ng a 1000 ng, 2,5 ng a 750 ng, 2,5 ng a 500 ng, 2,5 ng a 250 ng, 2,5 ng a 100 ng, ou 2,5 ng a 50 ng de DNA de transformação podem ser usados por cada 1,8 mg de microprojéteis de partida.

[00117] As técnicas de bombardeio de microprojéteis são amplamente aplicáveis, e podem ser usadas para transformar virtualmente qualquer espécie de planta. Os exemplos de espécies que têm sido transformadas pelo bombardeio de microprojéteis

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42/77 incluem as espécies monocotiledôneas, tais como o milho (Publicação PCT WO 95/06128), a cevada, o trigo (Patente U.S. 5.563.055, especificamente incorporada aqui por referência em sua totalidade), o arroz, a aveia, o centeio, a cana-de-açúcar, e o sorgo; bem como diversas dicotiledôneas, incluindo o tabaco, a soja (Patente U.S. 5.322.783, especificamente incorporada aqui por referência em sua totalidade), o girassol, o amendoim, o algodão, o tomate, e os legumes em geral (Patente U.S. 5.563.055, especificamente incorporada aqui por referência em sua totalidade).

[00118] Para a transformação por bombardeio de microprojéteis de acordo com a presente invenção, ambos os parâmetros físicos e biológicos podem ser otimizados. Os fatores físicos são aqueles que envolvem manipular o precipitado de DNA/microprojétil ou aqueles que afetam a trajetória e a velocidade dos macro- ou dos microprojéteis. Os fatores biológicos incluem todas as etapas envolvidas na manipulação das células antes e imediatamente após o bombardeio, tais como o ajuste osmótico das células-alvo para auxiliar a aliviar o trauma associado com o bombardeio, a orientação de um embrião imaturo ou outro tecido-alvo em relação à trajetória da partícula, e também a natureza do DNA de transformação, tal como o DNA linearizado ou os plasmídios superenrolados intactos. Acredita-se que as manipulações de pré-bombardeio sejam especialmente importantes para a transformação bem-sucedida dos embriões imaturos.

[00119] Desse modo, contempla-se que se possa desejar ajustar os diversos parâmetros de bombardeio em estudos de pequena escala, para otimizar completamente as condições. Pode-se particularmente desejar ajustar os parâmetros físicos, tais como a concentração de DNA, a distância da abertura, a distância da trajetória, a distância do tecido, e a pressão de hélio. Contempla-se adicionalmente que o grau de hélio possa afetar a eficiência da transformação. Podem-se

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43/77 também otimizar os fatores de redução do trauma (TRFs) modificando as condições que influenciam o estado fisiológico das células receptoras e que podem, portanto, influenciar as eficiências de transformação e integração. Por exemplo, o estado osmótico, a hidratação do tecido, e o estágio de subcultura ou o ciclo celular das células receptoras pode ser ajustado para a transformação ótima. [00120] Também podem ser usados outros métodos de transformação da célula e incluem, porém não estão limitados à introdução de DNA nas plantas por transferência direta do DNA para o pólen (Hess e outros, Intern Rev. Cytol., 107:367 (1987); Luo e outros, Plant Mol Biol. Reporter, 6:165 (1988)), por injeção direta do DNA nos órgãos reprodutivos de uma planta (Pena e outros, Nature, 325:274 (1987)), ou por injeção direta do DNA nas células de embriões imaturos, seguida pela reidratação dos embriões dessecados (Neuhaus e outros, Theor. Appl. Genet., 75:30 (1987)).

[00121] A regeneração, o desenvolvimento, e o cultivo das plantas a partir de transformantes de protoplastos de plantas individuais ou a partir de diversos explantes transformados são bem conhecidos na técnica (Weissbach e Weissbach, Em: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, CA, (1988)). Este processo de regeneração e crescimento inclui tipicamente as etapas de seleção das células transformadas, cultivo daquelas células individualizadas através dos estágios comuns de desenvolvimento embriônico através do estágio de plantinhas com raízes. Os brotos com raízes transgênicos resultantes são, após isso, plantados em um meio de crescimento de planta apropriado, tal como o solo.

[00122] É bem conhecido na técnica o desenvolvimento ou a regeneração das plantas contendo o gene exógeno que codifica uma proteína de interesse. De preferência, as plantas regeneradas são autopolinizadas para proporcionar plantas transgênicas homozigóticas.

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Também, o pólen obtido a partir das plantas regeneradas é cruzado com plantas de sementes desenvolvidas de linhagens agronomicamente importantes. Inversamente, o pólen das plantas destas linhagens importantes é usado para polinizar as plantas regeneradas. Uma planta transgênica da presente invenção contendo um polipeptídeo desejado é cultivada usando métodos bastante conhecidos para alguém versado na técnica.

[00123] Existe uma variedade de métodos para a regeneração das plantas a partir do tecido vegetal. O método particular de regeneração dependerá do tecido vegetal de partida e da espécie de planta particular a ser regenerada.

[00124] Foram desenvolvidos ensaios para a expressão do gene com base na expressão transiente dos constructos de ácidos nucléicos clonados, introduzindo-se as moléculas de ácido nucléico nas células vegetais por tratamento com polietileno glicol, eletroporação, ou bombardeio de partículas (Marcotte e outros, Nature, 335:454-457 (1988); Marcotte e outros, Plant Cell, 1:523-532 (1989); McCarty e outros, Cell, 66:895-905 (1991); Hattori e outros, Genes Dev., 6:609618 (1992); Goff e outros, EMBO J., 9:2517-2522 (1990)). Os sistemas de expressão transiente podem ser usados para analisar funcionalmente os constructos de gene (ver, de um modo geral, Maliga e outros, Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995)).

[00125] Quaisquer das moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem ser introduzidas em uma célula vegetal, em um modo permanente ou transiente, em combinação com outros elementos genéticos, tais como os vetores, os promotores, os intensificadores, etc. Ademais, quaisquer das moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem ser introduzidas em uma célula vegetal, em um modo que permita a expressão ou a superexpressão da proteína ou de seu

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45/77 fragmento codificado pela molécula de ácido nucléico.

[00126] As plantas transgênicas podem encontrar uso na manufatura comercial de proteínas ou outras moléculas, tais como os óleos, onde as moléculas de interesse são extraídas ou purificadas das partes das plantas, das sementes, e similares. As células ou os tecidos das plantas também podem ser cultivados, desenvolvidos in vitro, ou fermentados para manufaturar tais moléculas.

[00127] Os cultivos codificados pelo DNA recombinante podem ser transferidos, por exemplo, das células de uma espécie para as células de outra espécie, por exemplo, por fusão de protoplasto. As plantas transgênicas também podem ser usadas em programas de multiplicação comercial, ou podem ser cruzadas ou reproduzidas com plantas de espécie de colheita relacionada. Por exemplo, um ácido nucléico da presente invenção, operavelmente ligado a um promotor, pode ser introduzido em uma variedade de planta particular por cruzamento, sem a necessidade de sempre transformar diretamente uma planta daquela variedade dada. Portanto, a presente invenção não somente inclui uma planta diretamente regenerada de células que tenham sido transformadas de acordo com a presente invenção, como também a progênie de tais plantas.

[00128] A presente invenção também proporciona um método de expressar estavelmente uma GBSS de HOI001 de interesse em uma planta, que inclui contatar a célula vegetal com um vetor da presente invenção que tem um ácido nucléico codificando a GBSS de HOI001 de interesse, sob condições efetivas para transferir e integrar o vetor no genoma nuclear da célula. Um promotor dentro do cassete de expressão pode ser quaisquer dos promotores aqui pro porcionados, por exemplo, um promotor constitutivo, um promotor induzível, um promotor específico para o tecido, ou um promotor específico para a semente. Tais promotores podem proporcionar a expressão de uma

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GBSS de HOI001 em um tempo desejado, ou em um estágio de desenvolvimento desejado, ou em um tecido desejado. O vetor também pode incluir um gene marcador selecionável. Quando usando o vetor com Agrobacterium tumefaciens, o vetor pode ter uma origem de replicação de Agrobacterium tumefaciens.

Plantas [00129] As plantas para uso com os vetores da presente invenção preferivelmente incluem as monocotiledôneas, especialmente as espécies produtoras de óleo, mais preferivelmente o milho (Zea mays). As outras espécies contempladas pela presente invenção incluem a alfafa (Medicago sativa), o arroz-preto (Oryza sativa), a cevada de 6 carreiras (Hordeum vulgare), o painço (Panicum miliaceum), o centeio (Secale cereale), o trigo (Triticum aestivum), e o sorgo (Sorghum bicolor).

[00130] Quaisquer das plantas ou partes destas da presente invenção podem ser processadas para produzir um alimento, farinha grossa, proteína, ou preparação de óleo. Uma parte da planta particularmente preferida para este propósito é uma semente. Os métodos para produzir o alimento, a farinha grossa, a proteína, e as preparações de óleos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. 4.957.748; 5.100.679; 5.219.596; 5.936.069; 6.005.076; 6.146.669; e 6.156.227.

Caracterização das Plantas T ransformadas [00131] Para confirmar a presença do transgene na planta regenerada, uma variedade de técnicas está disponível, as quais são bastante conhecidas na técnica. Os exemplos destas técnicas incluem, porém não estão limitados aos: (a) ensaios moleculares de integração de DNA ou expressão de RNA, tais como Southern ou northern blotting (“mancha do Sul ou do Norte”), tecnologia TAQMAN ® (Applied Biosystems, Foster City, CA) e PCR; (b) ensaios bioquímicos que

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47/77 detectam a presença do produto protéico, tais como ELISA, western blotting (“mancha ocidental”), ou por função enzimática; ou (c) análise química da parte da planta visada, tal como o tecido da semente, para a determinação qualitativa e quantitativa de óleo, proteína, ou amido.

[00132] Os exemplos que seguem são proporcionados para ilustrar a presente invenção e não são pretendidos para limitar a invenção de modo algum.

Exemplo 1 [00133] Este Exemplo descreve o isolamento e o seqüenciamento do gene de GBSS de HOI001 a partir da linhagem de milho HOI001. A HOI001 é uma planta endógama derivada de MGSC 915E (Maize Genetic Stock Center, Urbana, IL), e é mais inteiramente descrita nas Publicações de Patentes U.S. N^ 20030172416 e 20030154524, ambas as quais são incorporadas aqui por referência.

[00134] O DNA genômico foi extraído do tecido da semente de milho a partir de HOI001, 22 dias após a polinização, usando o seguinte procedimento. Entre 50-100 mg de tecido da semente dissecado foram colocados em um tubo Bio101 Multimix (Qiagen, Carlsbad, CA, N^o do Cat. 657-601) com tampão de extração e glóbulos de vidro. O tampão de extração consistia em Tris-HCl a 100 mM (pH 8,0), EDTA a 50 mM, NaCl a 100 mM, DTT a 5 mM, e 1% de SDS. O tecido foi então rompido usando a máquina Bio 101 FASTPREP® (Qiagen) com 3 pulsos de 20 segundos, cada. Seguindo uma incubação de 15 minutos a 65°C, 330 μl de acetato de potássio a 5M foram adicionados a cada tubo. Os tubos foram então incubados a 0°C por 20 minutos, para precipitar o SDS, seguido por centrifugação a 12.000 rpm (Modelo Eppendorf 54172) por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e 100 μl de acetato de amônio a 5M (pH 7,0) e 700 μl de isopropanol foram adicionados para precipitar o DNA. Os tubos foram misturados por inversão e

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48/77 centrifugados a 14.000 rpm por 10 minutos. Após descartar o sobrenadante, o pélete foi suspenso novamente em 500 μl de etanol a 70% e recuperado por centrifugação a 14.000 rpm, por 5 minutos. O pélete recuperado contendo o DNA foi suspenso novamente em 50 μΐ de tampão de TE e armazenado a 4°C.

[00135] O gene de GBSS de HOI001 foi isolado do DNA genômico extraído usando a metodologia de PCR que foi adaptada a partir da Advantage GC (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). Os seguintes iniciadores foram projetados com base na seqüência publicada da GBSS de Zea mays de Shure e outros, Cell, 35(1):225233 (1983) [SEQ ID N°: 2]:

[00136] Iniciador em 5' (Iniciador número 14543) 5'-TCAGCCGTTCGTGTGGCAAGATTCATCTGTTGTCTC-3' [SEQ ID N°: 5] [00137] Iniciador em 3' (Iniciador número 14547) 5'-TCAGCGGGATTATTTACTCCACCACTACAGGTCCATTT-3' [SEQ ID N°: 6].

[00138] A seguinte reação PCR foi montada para um volume total de 50 μί:

pl água grau PCR pl 5X tampão de PCR Advantage GC pl 50X Mistura de dNTP (10 mM cada) pl 50X Mistura de Polimerase Advantage GC

2,5 pl iniciador 14543

2,5 pl iniciador 14547 pl DNA genômico [00139] Os parâmetros dos ciclos foram: 95°C por 1 minuto, 35 ciclos de 95°C por 30 segundos e 68°C por 3 minutos.

[00140] Os produtos da PCR foram separados por eletroforese em agarose e foi observado um fragmento de 4,7 kB contendo o gene de

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49/77 interesse. Cinco microlitros da reação PCR original foram utilizados como um molde para a amplificação adicional, usando os mesmos iniciadores e as condições acima descritas. Os produtos de amplificação de 4,7 kB a partir de reações de amplificação independentes foram isolados por eletroforese em gel de agarose, clonados no vetor de clonagem de PCR 2.1 usando o kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen), então transformados em um hospedeiro de E. coli. O DNA de plasmídio foi preparado de culturas desenvolvidas a partir de cada colônia, e então os insertos de 3 preparações de plasmídios separadas foram seqüenciados. O alinhamento destas seqüências gerou uma seqüência de consenso altamente homóloga, porém não idêntica, ao gene de GBSS publicado, embora nenhuma seqüência específica do inserto fosse equivalente ao consenso. Um clone (designado pCGN9480-2) tinha uma seqüência de inserto com menos alterações na seqüência em relação ao consenso. Um clone contendo o consenso foi então gerado por excisão mediada por enzima de restrição da seqüência de não consenso e ligação novamente com fragmentos contendo a seqüência de consenso, obtidos por digestão dos outros clones ou através de amplificação por PCR a partir do DNA genômico de HOI001. A seqüência de consenso, incluindo 1,5 kB a montante do sítio de iniciação da transcrição e aproximadamente 300 pares de bases a jusante do códon de interrupção, é listada como SEQ ID N°: 1.

[00141] O gene de GBSS a partir de uma linhagem endógama de milho de elite LH59[SEQ. ID N° 7] foi isolado usando os procedimentos e iniciadores descritos acima, e clonado dentro do vetor binário pMON68203. O plasmídeo resultante contendo o GBSS LH59 é nomeado pMON72510 (Figura 5).

[00142] A Figura 1 mostra o alinhamento de seqüência de ácido nucléico da GBSS HOI001[SEQ ID N°:1] comparado à seqüência

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50/77 publicada de Shure e outros, supra [SEQ ID N°: 2] e da GBSS a partir de LH59[SEQ ID N°: 7], usando o pacote de software Omiga 2.0, (Accelrys Inc., San Diego, CA). O alinhamento mostra que existem os seguintes polimorfismos únicos para a seqüência GBSS HOI001, o que não é encontrado na seqüência de GBSS HOI001 nem na seqüência publicada de Shure e outros, supra:

1. Polimorfismos de nucleotídeos individuais:

a. T >C na posição158

b. G>A na posição337

c. C>A na posição343

d. C>A na posição349

e. G>A na posição441

f. C>T na posição666

g. G>C na posição777

h. T >A na posição 878

i. C>T na posição 980

j. T>A na posição 1210

k. C>T na posição 1216

l. A>T na posição 1450

m. T>C na posição 1709

n. A>G na posição 1720

o. T>A na posição 1721

p. G>C na posição 1722

q. C>T na posição 1761

r. G>A na posição 1836

s. C>T na posição 1852

t. G>A na posição 1953

u. C>T na posição 2043

v. C>T na posição 2109

w. C>G na posição 2110

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x.	G>C na posição 2115
y.	A>T na posição 2448
z.	C>T na posição 2454
aa.	T >G na posição 2609
bb.	A>G na posição 2929
cc.	G>T na posição 2933
dd.	C>T na posição 2946
ee.	G>T na posição 3875
ff	T >A na posição 4008
gg. hh. ii.	T>C na posição 4018 T>G na posição 4023 C>A na posição 4025
kk.	C>T na posição 4169 A>T na posição 4225
ll.	C>A na posição 4562

2. Inserções:

a.	Seqüência g na posição 632
b.	Seqüência atgc na posição 1185-1189
c.	Seqüência tgcaccagcagc na posição 1456-1467
d.	Seqüência atgca na posição 1746-1750
e.	Seqüência catcaca na posição 1868-1874
f.	Seqüência ct na posição 2100-2101
g. h.	Seqüência ccat na posição 2488-2491 Seqüência tat na posição 3810-3812

3. Remoções:

a.	Seqüência cgt na posição 288-290
b.	Seqüência aa na posição 704-705
c.	Seqüência c na posição 882
d.	Seqüência atccg na posição 1139-1143
e.	Seqüência ctctctg na posição 1256-1262

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f. Seqüência tc na posição 1714-1715

g. Seqüência tgcaactgcaaatgca na posição 1917-1932

h. Seqüência g ou a na posição 3790

i. Seqüência cgagccaggggt(t ou c)gaaggcgaggagatcgcg ccg ctcgccaaggagaacgtggccgcgccctgaagagttcggcct na posição 4393-4467 [00143] A Figura 2 mostra o alinhamento das seqüências de aminoácidos preditas correspondentes a partir do gene de GBSS isolado de HOI0001 [SEQ ID N°: 3], e do gene de GBSS descrito em Shure e outros, supra [SEQ ID N°: 4], respectivamente. Os resultados indicam que há uma seqüência de resíduos de aminoácidos adicionais sobre a extremidade de carbóxi da GBSS de HOI001 começando aproximadamente na posição 1441 e uma área de não alinhamento na região do resíduo de aminoácido 55-60.

[00144] A Figura 3 mostra o alinhamento das seqüências de aminoácidos preditas correspondentes a partir do gene da GBSS de Zea mays isolado do endógamo LH59 [SEQ ID N°: 8], e do gene da amido sintase ligada a grânulo de Zea mays descrito em Shure e outros, supra, respectivamente. Os resultados indicam que há uma seqüência de resíduos de aminoácidos adicionais sobre a extremidade carbóxi da GBSS de HOI001 começando aproximadamente na posição 1441 e uma área de não alinhamento na região do resíduo de aminoácido 55-60.

Exemplo 2 [00145] Este Exemplo descreve a construção de vetores de transformação de plantas contendo as seqüências da GBSS de HOI001 e da GBSS da linhagem endógama LH59, [SEQ ID N°^s: 1 e 7, respectivamente].

[00146] A seqüência da GBSS de HOI001 foi cortada da versão de consenso corrigido de pMON9480-2, usando a enzima de restrição

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EcoRI. O fragmento de 4,7 kb resultante foi purificado seguindo o protocolo do fabricante para o kit miniprep da Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA). As extremidades do fragmento foram engrossadas seguindo o protocolo da fabricante no kit de polimento de PCR da Stratagene (Stratagene, Inc., La Jolla, CA). O fragmento foi então purificado em gel usando o kit de Extração em Gel da Qiagen (Qiagen), e clonado no pMON68203, um vetor binário para a transformação de plantas. O vetor binário, pMON68203, contém lados da esquerda e da direita para a transferência de T-DNA, um elemento marcador selecionável de planta de promotor de CaMV 35S::nptII::3' UTR de nos (descrito na Patente U.S. 6.255.560), e seqüências de cassetes de expressão de plantas que incluem um promotor Z27 de

1,1 kb (pb 19-1117 de N^o de Acesso S78780, Lopes e outros, Mol. Gen. Genet., 247(5):603-613 (1995)) para a expressão do endosperma, um íntron de hsp70 de milho (pares de bases 4-153 do gene do milho para o éxon de choque térmico 70, N^o de Acesso X03679, Rochester e outros, EMBO J., 5:451-458 (1986), e uma 3' UTR de nos, (pares de bases 2924-2671 do plasmídio Ti da cepa de Agrobacterium tumefaciens C58, N^o de Acesso AE009420, Wood e outros, Science, 294:2317-2323 (2001)). O vetor binário pMON68203 foi digerido com Stu1, desfosforilado por incubação com a fosfatase alcalina de camarão (Roche Applied Science, Indianópolis, IN) a 37°C por 60 minutos e ligado com o fragmento purificado em gel de 4,7 kb da GBSS de HOI001, descrito acima. O plasmídio resultante foi chamado pMON72506 (Figura 4).

[00147] A GBSS a partir da linhagem do milho LH59, [SEQ ID N°: 7], foi similarmente clonada no vetor binário pMON68203, para formar o pMON72510.

Exemplo 3 [00148] Este Exemplo descreve a transformação do milho com a

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GBSS de HOI001 e a GBSS da linhagem de milho LH59, usando os vetores descritos no Exemplo 2.

[00149] Os vetores de transformação pMON72506 e pMON72510 foram usados para transformar as plantas de milho usando o procedimento que segue.

[00150] As plantas do milho são desenvolvidas em uma estufa, sob práticas padrão. Foram feitas polinizações controladas. As espigas das plantas foram colhidas quando os embriões híbridos resultantes eram

1,5 a 2,0 mm de comprimento, normalmente 10-15 dias após a polinização. Após remover as palhas dos milhos, os grãos sobre as espigas foram esterilizados na superfície pulverizando com, ou macerando em, etanol a 80%.

[00151] A cepa de Agrobacterium ABI, e um sistema de vetor binário de Agrobacterium tumefaciens foram usados para a transformação. Os plasmídios pMON72506 e pMON72510 foram transformados no Agrobacterium tumefaciens de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Antes da inoculação das células de milho, as células de Agrobacterium foram desenvolvidas durante a noite, na temperatura ambiente, em meio de AB (Chilton e outros, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 71:3672-3676 (1974)) compreendendo antibióticos apropriados para a manutenção do plasmídio e acetossiringona a 200 μM. Imediatamente antes da inoculação, as células de Agrobacterium foram transformadas em péletes por centrifugação, e suspensas novamente em meio CRN122 (2,2 g/L de sais basais de MS (Murashige e Skoog, Physiol. Plant, 15:473-497 (1962)), 2 mg/L de glicina, 0,5 g/L de niacina, 0,5 g/l de L-piridoxina-HCl, 0,1 g/L tiamina, 115 mg/L de L-prolina, 36 g/L de glicose, e 68,5 g/L de sacarose, pH 5,4) ou meio CRN347 (meio CRN122, exceto com 0,44 g/L de sais de MS, 10 g/L de glicose, 20 g/L de sacarose, e 100 mg/L de ácido ascórbico) contendo acetossiringona a 200 μM e Ag NO3 a 20 μM.

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55/77 [00152] Os embriões imaturos do milho foram excisados dos grãos individuais, imersos em uma suspensão de Agrobacterium, e incubados na temperatura ambiente por 5-15 minutos. A solução de Agrobacterium é então removida, e os embriões imaturos inoculados foram transferidos, com o lado do escutelo para cima, do meio de inoculação CRN122 para o meio de co-cultivação CRN123 (meio CRN122, exceto com 0,5 mg/L de tiamina-HCl adicional, 20 g/L de sacarose, 10 g/L de glicose e 3 mg/L de 2,4 D) contendo acetossiringona a 200 μM e nitrato de prata a 20 μM e incubados a 23°C por 1 dia. Alternativamente, os embriões excisados foram cultivados por 8-11 dias em meio 211V (3,98 g/L de sais de N6 de Chu (Chu, C.C., The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops, em Plant Tissue Culture Plant Tissue Culture. Proceedings of the Peking Symposium, Boston, MA (1981), 43-50), 0,5 mg/L de tiamina HCl, 0,5 mg/L de ácido nicotínico; 1,0 mg/L de 2,4 D, 20 g/L de sacarose, 0,69 g/L de L-prolina, 0,91 g/L de monoidrato de L-asparagina, 1,6 g/L de hexaidrato de MgCh, 0,1 g/L de hidrolisado de caseína, 0,5 g/L de MES, 0,1 g/L de mio-inositol, e 16,9 mg/L de nitrato de prata, pH 5,8 solidificado com 2 g/L de Gelgro) e os calos foram inoculados com suspensões de meio CRN347 de Agrobacterium a 23°C por 3 dias, sem adicionar meios adicionais.

[00153] Os embriões foram então transferidos para o meio de seleção CRN220 (4,4 g/L de sais de MS, 1,3 mg/L de ácido nicotínico, 0,25 mg/L de piridoxina HCl, 0,25 mg/L de tiamina HCl, 0,25 mg/L de pantotenato de cálcio, 30 g/L de sacarose, prolina a 12 mM, 0,05 g/L de casaminoácidos, 500 mg/L de carbenicilina, 200 mg/L de paromomicina, 2,2 mg/L de picloram, 0,5 mg/L de 2,4 D e 3,4 mg/L de nitrato de prata, pH 5,6 solidificado com 7 g/L de Phytagar), ou os calos são transferidos para o meio de seleção CRN344 (3,98 g/L de sais de N6 de Chu, 1,0 mg/L de tiamina HCl, 0,5 mg/L de ácido

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56/77 nicotínico; 1,0 mg/L de 2,4 D, 20 g/L de sacarose, 0,69 g/L de Lprolina, 0,91 g/L de monoidrato de L-asparagina, 1,6 g/L de hexaidrato de MgCl2, 0,1 g/L de hidrolisado de caseína, 0,5 g/L de MES, 0,1 g/L de mio-inositol, 500 mg/L de carbenicilina, 200 mg/L de paromomicina e 16,9 mg/L de nitrato de prata, pH 5,8 solidificado com 6 g/L de Phytagar). Após 2-3 semanas a 27°C no escuro, os tecidos sobreviventes foram transferidos para o mesmo meio de seleção e cultivados por até umas 2 semanas adicionais ou transferidos para o meio de regeneração, como descrito abaixo.

[00154] A regeneração da planta é obtida transferindo o calo transgênico putativo do meio CRN220 para o CRN232 (meio CRN220 não tendo o picloram, o 2,4-D, e o nitrato de prata, e contendo 3,52 mg/L de benzilaminopurina (BAP) e 250 mg/L de carbenicilina) ou do meio CRN344 para o meio 217A (211RTTV não tendo nitrato de prata, 2,4 D, e paromomicina e contendo 3,52 mg/L de BAP e 250 mg/L de carbenicilina) e incubando por 5-7 dias a 27°C. O tecido é então transferido do meio CRN232 para o meio CRN264 (4,4 g/L de sais de MS, 1,3 g/L de ácido nicotínico, 0,25 mg/L de piridoxina HCl, 0,25 mg/L de tiamina HCl, 0,25 mg/L de pantotenato de cálcio, 10 g/L de glicose, 20 g/L de maltose, L-asparagina a 1 mM, 0,1 g/L de mio-inositol, 250 mg/L de carbenicilina e 100 mg/L de paromomicina, pH 5,8 solidificado com 6 g/L de Phytagar) ou do meio 217A para o meio CRN346 (4,4 g/L de sais de MS, vitaminas de MS, 60 g/L de sacarose, 0,05 g/L de mioinositol, 250 mg/L de carbenicilina, 75 mg/L de paromicina, pH 5,8 solidificado com 6 g/L de KOH) em Phytatrays, e incubado na luz a 28°C até que fossem produzidos brotos com raízes bem desenvolvidas (tipicamente 2-3 semanas). Estas plantinhas em desenvolvimento foram então transferidas para o solo, fortificadas em uma câmara de crescimento a 27°C, 80% de umidade, e baixa intensidade de luz por aproximadamente 1 semana, e então transferidas para uma estufa e as

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57/77 plantas de R0 foram desenvolvidas sob as condições padrão da estufa. As plantas de R0 foram reciprocamente cruzadas e tanto os grãos imaturos/em desenvolvimento quanto os grãos maduros foram colhidos de cada uma das plantas resultantes para as análises subseqüentes. Os resultados das análises são descritos abaixo, no Exemplo 6.

[00155] Estas plantinhas em desenvolvimento foram então transferidas para o solo, fortificadas em uma câmara de crescimento a 27°C, 80% de umidade, e baixa intensidade de luz por aproximadamente 1 semana, e então transferidas para uma estufa. As plantas de R0 foram então desenvolvidas sob as condições padrão da estufa. As plantas de R0 férteis foram cruzadas com um endógamo recorrente não transgênico, com a planta de R0 servindo como a fêmea ou o macho (ou ocasionalmente ambos) no cruzamento. Ambos os grãos em desenvolvimento e maduros de F1 foram colhidos e analisados, a partir de cada uma das espigas resultantes, conforme descrito no Exemplo 4. Os resultados das análises são descritos abaixo, no Exemplo 5.

Exemplo 4 [00156] Este Exemplo proporciona os procedimentos analíticos para determinar os níveis de óleo, proteína, e amido nos grãos de plantas transgênicas contendo o gene de GBSS de HOI001 ou o gene de GBSS de LH59.

[00157] Análise do Teor de Óleo: Os níveis de óleo (em uma base de massa e como uma porcentagem de peso do tecido) de grãos de milho individuais da primeira geração e embrião e endosperma dissecados são determinados por ressonância magnética nuclear (RMN) de ¹H de baixa resolução (Tiwari e outros, JAOCS, 51:104-109 (1974); ou Rubel, JAOCS, 71:1057-1062 (1994)), com o que são medidos os tempos de relaxamento da RMN das amostras de grãos individuais, e os níveis de óleo são calculados com base na análise de

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58/77 regressão usando uma curva padrão gerada a partir da análise dos grãos de milho com níveis variados de óleo, como determinado de modo gravimétrico seguindo a extração com solvente acelerada. [00158] Para comparar as análises de óleo dos grãos transgênicos e não transgênicos, a presença ou a ausência do transgene é determinada por detecção (ou sua ausência) de um produto da PCR de 517 pb específico para o transgene, usando uma seqüência dentro do íntron de Hsp70 como um iniciador em 5', e uma seqüência dentro do gene de GBSS de HOI001 como um iniciador em 3'.

[00159] iniciador em 5' (iniciador número 19056): 5'-ATCTTGCTCGATGCCTTCTC-3 [SEQ ID N°: 16], [00160] iniciador em 3' (iniciador número 18986): 5-GCCTTCGCTTGTCGTGGGT-3' [SEQ ID N°: 17].

[00161] Os níveis de óleo na semente de geração avançada são determinados por espectroscopia de NIT, com o que são medidos os espectros de NIT das amostras de sementes reunidas, colhidas das plantas individuais, e os níveis de óleo são calculados com base na análise de regressão, usando uma curva padrão gerada a partir da análise dos grãos de milho com níveis variados de óleo, conforme determinados de modo gravimétrico seguindo a extração com solvente acelerada ou a análise elementar (%N), respectivamente.

[00162] A análise da variância em um modo e o teste T de Student são efetuados para identificar as diferenças significativas em óleo (% de peso do grão) entre a semente de plantas positivas para marcadores e negativas para marcadores.

[00163] Alternativamente, os níveis de óleo dos grãos reunidos a partir de espigas individuais são determinados por ressonância magnética nuclear (RMN) de ¹H de baixa resolução (Tiwari e outros, JAOCS, 51:104-109 (1974); ou Rubel, JAOCS, 71:1057-1062 (1994)), com o que são medidos os tempos de relaxamento da RMN das

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59/77 uniões de grãos, e os níveis de óleo são calculados com base na análise de regressão usando uma curva padrão gerada a partir da análise dos grãos de milho com níveis variados de óleo, como determinado de modo gravimétrico seguindo a extração com solvente acelerada.

[00164] Análises das Proteínas: Para a análise da proteína do grão, são medidas amostras de pequeno tamanho consistindo em 50-100 grãos para cada tratamento, usando a espectroscopia de refletância próxima ao infravermelho (modelo InfraTec 1221, Teccator, Hogannas, Suécia). Este procedimento é baseado na observação que existe uma relação linear entre a absorção de radiação próxima ao infravermelho e a quantidade de constituintes químicos compreendidos em uma amostra de grão típica. Antes de analisar as amostras desconhecidas, o dado espectral é coletado com amostras de aferição, que são subseqüentemente analisadas usando uma técnica de análise de combustão de nitrogênio (Murray, I., e P.C. Williams, 1987, Chemical Principles of Near-infrared Technology, Em: Near-Infrared Technology in the Agricultural and Food Industries, P. Williams e K. Norris eds.). Um modelo de múltiplas variáveis é desenvolvido usando o dado espectral do espectrômetro e o dado primário. No presente caso, um modelo de múltiplas variáveis PLS-1 (Tipo Regressão por Mínimos Quadrados Parciais I) é construído usando 152 amostras de aferição. Cada amostra desconhecida é varrida sobre o espectrômetro pelo menos 5 vezes e o seu teor protéico predito com cada varredura. Cada vez que a amostra é varrida, ela é adicionada de volta para a cubeta de amostra para minimizar os efeitos de varredura multiplicativos, os quais não estão correlacionados à propriedade química de interesse. Tira-se a média do amido predito para as múltiplas varreduras e então ele é descrito para cada amostra.

[00165] Análises do Amido: Para a análise do amido do grão, são

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60/77 medidas amostras de pequeno tamanho consistindo em 50-100 grãos para cada tratamento, usando a espectroscopia de refletância próxima ao infravermelho (modelo InfraTec 1221, Teccator, Hogannas, Suécia). Este procedimento é baseado na observação que existe uma relação linear entre a absorção de radiação próxima ao infravermelho e a quantidade de constituintes químicos compreendidos em uma amostra de grão típica. Antes de analisar as amostras desconhecidas, o dado espectral é coletado com amostras de aferição, que são subseqüentemente analisadas usando uma técnica analítica química úmida padrão (Murray, I., e P.C. Williams, 1987, Chemical Principles of Near-infrared Technology, Em: Near-Infrared Technology in the Agricultural and Food Industries, P. Williams e K. Norris eds.). Um modelo de múltiplas variáveis é desenvolvido usando o dado espectral do espectrômetro e o dado primário. Cada amostra desconhecida é varrida sobre o espectrômetro pelo menos 5 vezes e o seu teor de amido predito com cada varredura. Cada vez que a amostra é varrida, ela é adicionada de volta para a cubeta de amostra para minimizar os efeitos de varredura multiplicativos, os quais não estão correlacionados à propriedade química de interesse. Tira-se a média do amido predito para as múltiplas varreduras e então ele é descrito para cada amostra.

Exemplo 5 [00166] Este Exemplo descreve a análise dos grãos de plantas transformadas com a GBSS de HOI001 e a GBSS de LH59.

[00167] Os grãos de um total de 54 eventos transgênicos, expressando o alelo transgênico de GBSS de HOI001, foram analisados usando os procedimentos descritos no Exemplo 4. A Tabela 1 mostra os níveis de óleo de grãos inteiros de grãos transgênicos (positivos) e não transgênicos (negativos) de F1 a partir de espigas de 20 eventos transgênicos, analisados pelo procedimento

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61/77 de RMN do grão individual descrito no Exemplo 4. São mostrados somente os resultados dos eventos com um aumento estatisticamente significativo em óleo (p<0,05).

[00168] Os resultados demonstram que os grãos transgênicos das espigas de 20 dos 54 eventos tiveram aumentos estatisticamente significativos no teor de óleo do grão inteiro (% de peso seco) em relação aos grãos não transgênicos na mesma espiga. Nenhum evento teve uma diminuição estatisticamente significativa no óleo.

TABELA 1

	Positiva	Negativa
Linhagem	N	Média	N	Média	Delta	Prob>F
ZM S67336/LH172	12	4,22	12	3,19	1,03	0,0000
ZM S66829/LH172	8	4,33	16	3,44	0,89	0,0013
ZM S67359/LH172	12	4,36	12	3,52	0,84	0,0003
ZM S71593/LH172	14	3,09	10	2,40	0,69	0,0258
ZM S67345/LH172	8	3,31	15	2,67	0,64	0,0199
ZM S67335/LH172	9	3,85	15	3,25	0,61	0,0000
ZM S71577/LH172	4	3,50	20	2,92	0,59	0,0298
ZM S66804/LH172	10	3,50	14	2,94	0,56	0,0017
ZM S67348/LH172	6	3,76	16	3,20	0,56	0,0000
ZM S67351/LH172	11	3,73	13	3,19	0,54	0,0173
ZM S69437/LH172	9	3,70	15	3,16	0,54	0,0002
ZM S67331/LH172	13	3,70	11	3,17	0,53	0,0026
ZM S67330/LH172	12	3,90	12	3,43	0,47	0,0071
LH172/ZM S71581	17	3,47	7	3,07	0,40	0,0004
ZM S66805/LH172	11	3,76	13	3,37	0,39	0,0151
LH172/ZM S69443	11	3,23	13	2,86	0,37	0,0243
LH172/ZM S67360	11	3,34	13	2,98	0,36	0,0080
LH172/ZM S67338	17	3,01	7	2,68	0,34	0,0287
ZM S71569/LH172	11	2,99	12	2,74	0,25	0,0354
LH172/ZM, S66817	14	3,05	9	2,83	0,22	0,0391

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62/77 [00169] Os grãos transgênicos de plantas de R0 polinizadas por pólen endógamo não transgênico (por exemplo, a linhagem ZM_S67336/LH172, positiva) tiveram tanto uma maior freqüência de um aumento de óleo significativo (15/29 plantas analisadas) quanto um aumento de óleo significativo médio maior (0,61%), em relação aos grãos de plantas endógamas não transgênicas, polinizadas por pólen transgênico (por exemplo, a linhagem LH172/ZM_S66817, negativa) de uma origem macho de R0 (5/37 plantas analisadas, 0,34% de aumento de óleo significativo). Estes resultados sugerem que a dosagem de transgene maior verificada no endosperma dos grãos das plantas de R0, devido aos efeitos da hereditariedade maternal, pode resultar em um aumento maior no óleo.

[00170] Similarmente, foram analisados os grãos de um total de 15 eventos transgênicos contendo o alelo transgênico de GBSS de LH59. Nenhum dos grãos a partir das espigas de quaisquer dos eventos teve aumentos estatisticamente significativos no teor de óleo de grão inteiro (% de peso seco), em relação aos grãos não transgênicos na mesma espiga, indicando que o aumento no óleo era único para o alelo de GBSS de HOI001.

Exemplo 6 [00171] Este Exemplo descreve o aumento nos níveis de óleo obtido nos grãos transgênicos de F2 a partir de plantas desenvolvidas no campo.

[00172] Para verificar o impacto do gene de GBSS de HOI001 sobre os níveis de óleo dos grãos de plantas desenvolvidas no campo, foram plantadas em uma sementeira de campo 24-48 sementes de segregação de F1 de cada um dos 40 eventos. As plantas em desenvolvimento foram examinadas quanto à presença do cassete transgênico por um ensaio de resistência à canamicina não letal, com o que é aplicada uma solução de antibiótico (0,1% (p/v) de canamicina

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63/77 e 0,1% (p/v) de paromomicina) à superfície da folha e classificou-se quanto à presença (não transgênica) ou à ausência (transgênica) de lesões necróticas 1 semana após a aplicação do antibiótico. Os grãos foram isolados das espigas tanto das plantas transgênicas quanto das plantas não transgênicas, e então foram testados quanto ao óleo, proteína, e amido do grão por Espectroscopia de Transmitância Próxima ao Infravermelho.

[00173] A Tabela 2 mostra os níveis médios de óleo do grão inteiro e o aumento nos níveis de óleo do grão inteiro (Delta) nas espigas de plantas contendo (positivas) e não contendo (negativas) o cassete transgênico contendo o marcador selecionável e o gene de GBSS de HOI001. Os níveis de óleo foram determinados pelo procedimento de NIT descrito no Exemplo 4, e somente os eventos com um aumento estatisticamente significativo no óleo (p<0,05) são mostrados.

TABELA 2

	Positiva	Negativa
Evento	N	Média	N	Média	Delta	Prob>F
ZM S67359	8	4,76	7	3,83	0,93	<0,0001
ZM S71546	5	5,42	3	4,50	0,92	0,0012
ZM S67354	2	4,85	13	4,02	0,83	<0,001
ZM S66817	3	4,37	1	3,70	0,67	0,0099
ZM S71577	3	4,60	8	3,95	0,65	<0,0001
ZM S67343	5	4,42	4	3,78	0,65	0,0142
ZM S71555	5	5,10	3	4,47	0,63	0,0343
ZM S71551	9	4,69	6	4,07	0,62	0,041
ZM S69437	3	4,57	8	3,95	0,62	0,0002
ZM S66804	7	5,04	7	4,44	0,60	0,0016
ZM S67338	7	4,30	6	3,73	0,57	0,0068
ZM S71573	3	4,87	3	4,40	0,47	0,0405
ZM S67331	4	4,35	12	3,92	0,43	0,0025
ZM S71594	2	4,35	8	3,95	0,40	0,0037

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	Positiva	Negativa
Evento	N	Média	N	Média	Delta	Prob>F
ZM S67340	12	4,04	11	3,72	0,32	0,0115
ZM S66800	1	4,30	8	3,95	0,30	0,0398

[00174] Os resultados mostram que o nível de óleo do grão inteiro foi aumentado nas espigas transgênicas em relação às espigas não transgênicas (p<0,05) em 16 dos 36 eventos analisados.

[00175] A Tabela 3 mostra os níveis médios de amino do grão (%) e a mudança nos níveis de amido do grão nas espigas de plantas contendo (positivas) e não contendo (negativas) o cassete transgênico contendo o marcador selecionável e o gene de GBSS de HOI001. Somente os eventos com um aumento estatisticamente significativo no óleo (p<0,05) são mostrados.

[00176] A Tabela 4 mostra os níveis médios de proteína do grão (%) e a mudança nos níveis de proteína do grão nas espigas de plantas contendo (positivas) e não contendo (negativas) o cassete transgênico contendo o marcador selecionável e o gene de GBSS de HOI001. Somente os eventos com um aumento estatisticamente significativo no óleo (p<0,05) são mostrados.

[00177] Com base na análise de NIT, os níveis de amido nos eventos com aumentos no óleo foram ligeiramente diminuídos (Tabela 3), e os níveis de proteína estiveram foram, na maioria das vezes, inalterados (Tabela 4).

TABELA 3

Positiva Negativa

Evento	N	Média	N	Média	Delta	Prob>F
ZM_S67359	8	69,15	7	70,94	-1,79	0,0004
ZM_S71546	5	70,10	3	71,33	-1,23	0,0451
ZM_S67354	2	69,50	13	71,12	-1,62	0,0024
ZM_S66817	3	69,73	1	70,00	-0,27	0,5286
ZM_S71577	3	71,47	8	71,40	0,07	0,8702

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ZM_S67343	5	69,92	4	71,20	-1,28	0,0187
ZM_S71555	5	70,30	3	71,23	-0,93	0,118
ZM_S71551	9	70,49	6	71,23	-0,74	0,117
ZM_S69437	3	69,77	8	71,40	-1,63	0,0018
ZM_S66804	7	71,19	7	72,27	-1,09	0,0073
ZM_S67338	7	69,81	6	71,25	-1,44	0,0009
ZM_S71573	3	69,77	3	70,67	-0,90	0,1352
ZM_S67331	4	70,10	12	71,23	-1,13	0,0026
ZM_S71594	2	70,75	8	71,40	-0,65	0,1906
ZM_S67340	12	70,82	11	71,35	-0,53	0,0257
ZM_S66800	1	70,50	8	71,40	-0,90	0,16
TABELA 4 Evento	Positiva N Média	Negativa N Média	Delta	Prob>F
ZM_S67359	8	11,84	7	11,29	0,55	0,2942
ZM_S71546	5	12,86	3	12,30	0,56	0,1775
ZM_S67354	2	12,55	13	12,07	0,48	0,2885
ZM_S66817	3	12,70	1	14,40	-1,70	0,1336
ZM_S71577	3	9,50	8	12,03	-2,53	0,0005
ZM_S67343	5	11,46	4	11,40	0,06	0,929
ZM_S71555	5	12,58	3	12,43	0,15	0,6995
TABELA 4 ZM_S71551	Positiva 9 12,23	Negativa 6 11,97	0,27	0,4938
ZM_S69437	3	11,80	8	12,03	-0,23	0,7384
ZM_S66804	7	12,14	7	11,07	1,07	0,0304
ZM_S67338	7	12,26	6	11,87	0,39	0,452
ZM_S71573	3	11,37	3	11,30	0,07	0,8416
ZM_S67331	4	12,18	12	12,23	-0,05	0,9133
ZM_S71594	2	11,80	8	12,03	-0,23	0,6682
ZM_S67340	12	11,44	11	11,28	-0,16	0,578
ZM_S66800	1	11,40	8	12,03	-0,63	0,412

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Exemplo 7 [00178] Este Exemplo descreve o aumento nos níveis de óleo obtido nos grãos híbridos transgênicos de F2 a partir de plantas desenvolvidas no campo.

[00179] Para verificar o impacto do gene de GBSS de HOI001 sobre os níveis de óleo dos grãos de plantas híbridas desenvolvidas no campo, foram plantadas em uma sementeira de campo 24-48 sementes de segregação de F1 de cada um de 40 eventos, tendo semente suficiente. As plantas em desenvolvimento foram examinadas quanto à presença do cassete transgênico pelo ensaio de resistência à Canamicina não letal, descrito acima no Exemplo 6. O pólen das plantas transgênicas foi usado para polinizar o endógamo de talo duro LH244. A semente transgênica de segregação de F1 gerada foi então plantada e as plantas resultantes foram examinadas quanto à presença do transgene pelo ensaio de resistência à Canamicina não letal. Os grãos híbridos de F2 foram isolados das espigas de plantas transgênicas e plantas não transgênicas, e testados quanto ao óleo do grão por Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear, conforme descrito no Exemplo 4.

[00180] A Tabela 5 mostra os níveis médios de óleo do grão inteiro e o aumento (Delta) nos níveis de óleo do grão inteiro nas espigas de plantas híbridas contendo (positivas) e não contendo (negativas) o cassete transgênico contendo o marcador selecionável e o gene de GBSS de HOI001. Os níveis de óleo foram determinados pelo procedimento de RMN de tamanho estabelecido descrito no Exemplo 4, e somente os eventos com um aumento estatisticamente significativo no óleo (p<0,05) são mostrados. Os dados indicam que o nível de óleo do grão inteiro foi aumentado nas espigas transgênicas em relação às espigas não transgênicas (p<0,05) em 9 de 14 eventos analisados.

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TABELA 5

	Positiva	Negativa
Evento	N	Média	N	Média	Delta	Prob>F
ZM S67354	6	4,43	1	3,00	1,43	0,0431
ZM S67346	9	3,90	8	3,13	0,78	0,0003
ZM S71546	9	4,24	5	3,58	0,66	0,0016
ZM S71556	10	4,12	4	3,48	0,65	0,0044
ZM S71577	8	3,94	6	3,30	0,64	0,0047
ZM S71594	10	3,91	7	3,30	0,61	0,0041
ZM S71573	10	4,02	6	3,42	0,60	0,0001
ZM S67343	10	3,72	4	3,15	0,57	0,0009
ZM S67331	8	3,80	3	3,40	0,40	0,0281

Exemplo 8 [00181] Este Exemplo descreve a elevação da atividade da GBSS no tecido do endosperma do milho expressando o gene de GBSS de HOI001.

[00182] As espigas em desenvolvimento a partir das plantas de F1, examinadas quanto à presença do cassete transgênico pelo ensaio de resistência à Canamicina não letal, foram colhidas e imediatamente congeladas em 24 dias após a polinização. Os grãos de segregação de F2 foram removidos da espiga, então dissecados em frações de embrião e endosperma. Os grãos individuais dissecados foram identificados como transgênicos ou não transgênicos examinando-se quanto à capacidade de amplificar por PCR uma porção do cassete transgênico a partir do DNA genômico, isolado de embriões individuais usando iniciadores específicos para o transgene, conforme descrito no Exemplo 4. Para cada um de seis eventos, aproximadamente 10 endospermas dos grãos transgênicos e não transgênicos correspondentes foram reunidos separadamente.

[00183] Cada união de endospermas foi moída até um pó fino com um gral e pilão, sob nitrogênio líquido, e os grânulos de amido foram

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68/77 isolados em triplicata de acordo com o procedimento de Shure e outros, Cell, 35(1):225-233 (1983). A atividade da amido sintase ligada a grânulo foi testada sobre os grânulos isolados usando o método de Vos-Scheperkeuter e outros, Plant Physiol., 82:411-416 (1986).

[00184] A Tabela 6 mostra a atividade da amido sintase ligada a grânulo (pmol/min/mg de amido) no endosperma em desenvolvimento de F2 contendo ou não o cassete transgênico de GBSS de HOI001. Os valores mostrados são as médias e os erros padrão de ensaios em triplicata. O dado indica que os grânulos de amido a partir dos grãos transgênicos geralmente tinham atividade da GBSS elevada, indicando que o efeito do alelo de HOI001 sobre os níveis de óleo não é uma função da redução da atividade da GBSS global, porém funciona pela adição de uma atividade unicamente codificada pelo gene de GBSS de HOI001.

TABELA 6

Transgênico Não Transgênico

Evento	Média	EP	Média	EP	p>F
S67338	585	41	455	15	0,0392
S67359	583	20	521	15	0,0665
S71546	635	16	540	23	0,0281
S66804	587	50	454	20	0,0702
S71551	588	9	574	11	0,3712
S71555	486	24	464	12	0,4641

Exemplo 9 [00185] Este Exemplo descreve o isolamento e o seqüenciamento da região de codificação do cDNA de GBSS a partir da linhagem do milho HOI001.

[00186] O mRNA foi extraído do tecido de endosperma do milho em desenvolvimento a partir de HOI001, 22 dias após a polinização, usando um procedimento adaptado de Opsahl-Ferstad e outros, Plant J., 12(10):235-246 (1997). Resumidamente, o endosperma em

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69/77 desenvolvimento a partir de 3 grãos separados foi reunido, congelado em nitrogênio líquido, e então pulverizado com um gral e pilão. Aproximadamente 50 mg de endosperma em pó congelado foram extraídos com 0,5 mL de tampão (LiCl a 0,5 M, EDTA a 10 mM, ditiotreitol a 5 mM, Tris-HCl a 100 mM, pH 8,0, 1% (p/v) de SDS). Este extrato aquoso foi então extraído com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:21), e a fração orgânica foi descartada. Os ácidos nucléicos foram precipitados da fração aquosa por adição de um volume igual de álcool isopropílico, seguido por centrifugação. O sobrenadante resultante foi descartado. O pélete contendo o mRNA foi lavado duas vezes com etanol a 70%, seco, e então suspenso novamente em 50 μL de água contendo 0,1% (v/v) de pirocarbonato de dietila.

[00187] O cDNA do primeiro filamento foi sintetizado a partir do mRNA isolado usando o sistema de síntese de cDNA SMART^® da Clontech (BD Biosciences). Este cDNA do primeiro filamento foi usado como molde para amplificar as seqüências de cDNA da GBSS de HOI001, usando iniciadores contendo um sítio de restrição de EcoRV, seguido por 18 pb do sítio de iniciação traducional predito (iniciador em 5') e um sítio de restrição de Sse83871, seguido por 17 pb da extremidade de 3' predita até o sítio de interrupção da tradução (iniciador em 3'):

[00188] Iniciador em 5' (iniciador número 20095):

5'-GGATATCACCATGGCGGCTCTGGCCACG-3 [SEQ ID N°: 9], [00189] Iniciador em 3' (iniciador número 20092):

5'-GTCCTGCAGGCTACACATACTTGTCCA-3' [SEQ ID N°: 10].

[00190] Os produtos da amplificação de 1,8 kB resultantes, a partir de reações de amplificação independentes, foram isolados por eletroforese em gel de agarose, clonados independentemente no vetor de clonagem de PCR 2.1 usando o kit de clonagem TOPO TA

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70/77 (Invitrogen), e então transformados em um hospedeiro de E. coli. Múltiplas colônias foram isoladas de cada transformação, o DNA de plasmídio foi preparado de culturas desenvolvidas a partir de cada colônia, e então o inserto em cada preparação de plasmídio foi seqüenciado. O alinhamento destas seqüências gerou uma seqüência de consenso contendo um quadro de leitura aberto, equivalente àquele predito ser codificado pelo gene de GBSS de HOI001, embora nenhuma seqüência específica do inserto fosse equivalente ao consenso. Um clone (designado 7345705-10) tinha uma seqüência de inserto com uma única remoção de par de bases em relação ao consenso. Este clone foi usado para gerar um plasmídio (designado pMON81463) contendo a seqüência de consenso por inserção do nucleotídeo adicional usando o kit de mutagênese Quick-Change (Stratagene). Esta seqüência, representando a região de codificação do cDNA da GBSS de HOI001, é listada na SEQ ID N°: 11.

Exemplo 10 [00191] Este Exemplo descreve a construção de vetores de transformação de plantas contendo a região de codificação de cDNA da GBSS de HOI001 [SEQ ID N°: 11], projetados para obter níveis diferentes, padrões reguladores e espaciais da expressão, e a transformação subseqüente do milho.

[00192] Foi construído um vetor de transformação de planta contendo a região de codificação de GBSS de HOI001 orientada por um promotor Z27. A região de codificação de GBSS de HOI001 foi isolada de pMON81463 através de digestão por restrição com EcoRV e Sse83871, e clonada no vetor binário pMON71274. Este vetor binário contém lados da esquerda e da direita para a transferência de T DNA; um elemento marcador selecionável de planta de promotor de Actina do arroz::íntron de Actina do arroz::CP4::3' UTR de nos; e seqüências de cassetes de expressão de plantas que incluem um

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71/77 promotor Z27 de 1,1 kb (pb 19-1117 de N^o de Acesso do GenBank S78780, Lopes e outros, Mol. Gen. Genet., 247(5):603-613 (1995)) para a expressão do endosperma; um íntron de hsp70 de milho (pares de bases 4-153 do gene do milho para o exon 2 de choque térmico 70, N^o de Acesso do GenBank X03679, Rochester e outros, EMBO J., 5:451-458 (1986), e uma 3' UTR de globulina. O plasmídio resultante foi chamado pMON81464 (Figura 7).

[00193] Foi construído um segundo vetor binário de expressão de planta, contendo o promotor de glutenina de alto peso molecular do trigo (pb 2647-3895 do Acesso do GenBank X12928, versão X12928.3, originalmente descrito em Anderson e outros, Nucleic Acids Res., 17:461-462 (1989)) e o íntron de hsp70 do milho, fundido à região de codificação da GBSS, fundida à HSP17n3' UTR do trigo (pb 532-741 do Acesso do GenBank X13431, versão X13431.1, McElvain e Spiker, Nucleic Acids Res., 17:1764 (1989)). Uma seqüência contendo o promotor de glutenina de alto peso molecular do trigo fundido ao íntron de hsp70 do milho foi amplificada a partir de um vetor intermediário usando os iniciadores em 5' e 3' contendo os sítios de restrição de AscI e NotI, respectivamente:

[00194] Iniciador em 5' (iniciador número 21084):

5'-GGCGCGCCGTCGACGGTATCGATAAGCTTGC-3' [SEQ ID N°: 12], [00195] Iniciador em 3' (iniciador número 21085): 5'-GCGGCCGCCCGCTTGGTATCTGCATTACAATG-3' [SEQ ID N°: 13].

[00196] O produto da amplificação, contendo o fragmento de promotor e íntron com os sítios de restrição introduzidos, foi purificado por eletroforese em gel de agarose e clonado em pCR2.1 TOPO (Invitrogen) para gerar um vetor de plasmídio para a transformação em E. coli (pOP28). Após a transformação em um vetor de E. coli, o DNA

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72/77 do plasmídio foi isolado, digerido com AscI e Notl, e o fragmento purificado foi clonado no vetor binário pMON71247 para gerar um vetor (pOP29) contendo um cassete com o promotor de glutenina de alto peso molecular do trigo fundido ao íntron de HSP70 do milho, fundido à 3' UTR de globulina. A região de codificação da GBSS de HOI001 foi isolada por digestão de pMON81464 com NotI/Sse83871 e clonada em pOP29 para gerar o vetor binário pOP31 contendo um cassete de expressão com o promotor de glutenina de alto peso molecular do trigo fundido ao íntron de HSP70 do milho, fundido à região de codificação de GBSS de HOI001, fundida à 3' UTR de globulina. O fragmento de promotor/íntron/região de codificação de GBSS de HOI001 foi então isolado de pOP31 por digestão com AscI/Sse83771 e então clonado no vetor binário de planta pMON71290 contendo um gene do cassete de interesse com a 3' UTR de TR7 para gerar pOP35, contendo um cassete de expressão com o promotor de glutenina de alto peso molecular do trigo fundido ao íntron de HSP70 do milho, fundido à região de codificação de GBSS de HOI001 fundida à 3' UTR de TR7. O fragmento de promotor/íntron/região de codificação de GBSS de HOI001 foi então isolado de pOP35 por digestão com AscI/Sse83871 e então clonado no vetor binário de planta pMON67647, contendo um gene do cassete de interesse com a 3' UTR de HSP17 do trigo. O plasmídio resultante continha um cassete de expressão com o promotor de glutenina de alto peso molecular do trigo fundido ao íntron de HSP70 do milho, fundido à região de codificação de GBSS de HOI001 fundida à 3' UTR de HSP17 do trigo. Este plasmídio, que foi chamado pMON68298, é mostrado na Figura 8.

[00197] Foi construído um terceiro vetor binário de expressão de planta contendo o promotor e a 5' UTR do gene de GBSS de HOI001 fundido à região de codificação de GBSS de HOI001, fundida à 3' UTR

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73/77 de globulina do milho. O promotor de GBSS de HOI001 e a 5' UTR (que também continha o primeiro íntron predito) foram isolados através de amplificação por PCR a partir de pMON72506, usando um iniciador em 5' que contém o sítio de restrição para PmeI:

[00198] Iniciador em 5' (iniciador número 20362):

5'-GATCGTTTAAACGTTCGTGTGGCAGATTCATC-3' [SEQ ID N°: 14], [00199] Iniciador em 3' (iniciador número 20363):

5'-GACGTGGCCAGAGCCGCCATGCCGATTAATCCACTGCATAG-3' [SEQ ID N°: 15].

[00200] O produto da amplificação, um fragmento contendo 1125 pb a montante do sítio de iniciação traducional de GBSS de HOI001 predito e 20 pb da seqüência de codificação predita a partir de pMON72506 (correspondendo ao pb 17-1162 da SEQ ID N°: 1), foi purificado por eletroforese em gel de agarose e clonado em pCR2.1 TOPO (Invitrogen) para gerar pMON81466.

[00201] A região de codificação de GBSS de HOI001 foi removida de pMON81463 e clonada no vetor pMON81466 para gerar pMON81468, contendo o promotor de GBSS de HOI001/5' UTR fundido à região de codificação de GBSS de HOI001, com 45 pb da seqüência poliligadora externa entre os elementos de promotor/UTR e região de codificação. Esta seqüência externa foi então removida por digestão de pMON81468 com MluI para remover um fragmento de 780 pb transpondo a seqüência externa, então anelando novamente com o fragmento de 735 pb análogo (não tendo a seqüência externa), gerando pMON81469. Este fragmento de 735 pb foi gerado por digestão de pMON72506 com MluI e isolamento do fragmento resultante. Esta seqüência inteira de promotor/UTR/região de codificação foi então isolada de pMON81469 por digestão com PmeI e Sse8371, e clonada no vetor binário pMON71274 para gerar o vetor binário pMON81465. Este vetor continha um cassete de expressão com o promotor e a 5' UTR do gene de GBSS de HOI001 fundido à

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74/77 região de codificação de GBSS fundida à 3' UTR de globulina do milho (Figura 9).

[00202] Estes três vetores de transformação de planta são transformados em um endógamo do milho de elite (LH244) (Corn States Hybrid Serv., LLC, Des Moines, IA). Resumidamente, as espigas contendo os embriões imaturos são colhidas aproximadamente 10 dias após a polinização e mantidas refrigeradas a 4°C até o uso (até 5 dias após a colheita). O tamanho preferido do embrião para este método de transformação é ~1,0-2,0 mm. Este tamanho é atingido normalmente 10 dias após a polinização dentro da estufa, com as condições de crescimento de uma temperatura média de 30,56°C (87°F), duração do dia de 14 horas com iluminação suplementar fornecida pelas lâmpadas de Sódio de Alta Pressão de 1000 Watts da GE.

[00203] Os embriões imaturos são isolados de espigas com superfícies esterilizadas e deixados cair diretamente na suspensão de células de Agrobacterium preparada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. O isolamento permanece continuamente por 15 minutos. O tubo é então colocado de lado por 5 minutos, resultando em um tempo de inoculação total, para os embriões individuais, de 5 a 20 minutos. Após a suspensão de células de Agrobacterium ser removida usando uma pipeta de transferência estéril com ponta fina, os embriões imaturos são transferidos para um meio de co-cultura (Tabela 7). Os embriões são então colocados sobre o meio com o lado do escutelo faceando para cima. Os embriões são cultivados em uma incubadora escura (23°C) por aproximadamente 24 horas.

[00204] Os embriões são então transferidos para um meio de MS modificado (MSW50, Tabela 7) suplementado com glifosato a 0,1 ou 0,25 mM e 250 mg/L de carbenicilina, para inibir o Agrobacterium nas placas de Petri (100 mm x 25 mm). As culturas são incubadas em uma

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75/77 sala de cultura escura a 27°C por 2-3 semanas. Todos os pedaços de calo são então transferidos individualmente para o primeiro meio de regeneração (MS/6BA, Tabela 7) suplementado com os mesmos níveis de glifosato. As culturas são desenvolvidas sobre este meio e em uma sala de cultura com fotoperíodo de luz por 16 horas/escuro por 8 horas e 27°C por 5-7 dias. Elas são então transferidas para o segundo meio de regeneração 15 (MSOD, Tabela 7) em placas de Petri (100 mm x 25 mm) por aproximadamente 2 semanas. Todos os pedaços de calo com brotos de regeneração e tecido vivo são transferidos para o mesmo meio contido em phytatrays para os brotos desenvolverem-se mais antes de serem transferidos para o solo (aproximadamente 2-4 semanas). Os meios de regeneração (MS6BA e MSOD) são todos suplementados com 250 mg/L de carbenicilina e glifosato a 0,1 ou 0,25 mM.

[00205] Estas plantinhas em desenvolvimento são então transferidas para o solo, fortificadas em uma câmara de crescimento a 27°C, 80% de umidade, e baixa intensidade de luz por aproximadamente uma semana, e então transferidas para uma estufa e desenvolvidas sob as condições padrão da estufa. Os grãos resultantes são colhidos e analisados conforme descrito no Exemplo 4. Os resultados indicam que os diferentes promotores têm diferentes impactos sobre o acúmulo de óleo com base na intensidade e regulagem da expressão da região de codificação de GBSS de HOI001.

Tabela 7. Composição dos meios usados na transformação do milho.

Componente	Meios de Co-cultura	MSW50	MS/6BA	MSOD
Sais de MS	2,2 g/L	4,4 g/L	4,4 g/L	4,4 g/L
Sacarose	20 g/L	30 g/L	30 g/L
Maltose				20 g/L
Glicose	10 g/L			10 g/L

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1-Prolina	115 mg/L	1,38 g/L	1,36 g/L
Casaminoácidos		500 mg/L	50 mg/L
Glicina	2 mg/L	2 mg/L
1-Asparagina				150 mg/L
Mio-inositol	100 mg/L	100 mg/L		100 mg/L
Ácido nicotínico	0,5 mg/L	0,5 mg/L	1,3 mg/L	1,3 mg/L
Piridoxina HCl	0,5 mg/L	0,5 mg/L	0,25 mg/L	0,25 mg/L
Tiamina-HCl	0,5 mg/L	0,6 mg/L	0,25 mg/L	0,25 mg/L
Pantotenato de Ca			0,25 mg/L	0,25 mg/L
2,4-D	3 mg/L	0,5 mg/L
Picloram
Nitrato de Prata	1,7 mg/L
BAP			3,5 mg/L

[00206] O meio de co-cultura foi solidificado com 5,5 mg/l de agarose com baixo teor de EEO. Todos os outros meios foram solidificados com 7 g/l de Phytagar para a seleção de NPTII e com 3 g/l de phytagel para a seleção de glifosato.

Exemplo 11 [00207] Este Exemplo descreve o uso dos polimorfismos no gene de GBSS de HOI001 como marcadores moleculares para acelerar a incorporação dos polimorfismos das seqüências de GBSS de HOI001 em outros germoplasmas do milho com o resultando do óleo crescente no grão.

[00208] A presente invenção proporciona uma planta de milho com óleo de milho aumentado selecionado pelo uso de multiplicação auxiliada por marcador, em que uma população de plantas é selecionada quanto à presença de uma seqüência de polimorfismo única para o gene de GBSS de HOI001 (SEQ ID N°: 1). O Exemplo 1, acima descrito, lista os polimorfismos únicos para a seqüência de GBSS de HOI001, que não são verificados na seqüência de GBSS de LH59 ou na seqüência publicada (Shure e outros, supra).

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77/77 [00209] A seleção de plantas tendo o gene de GBSS de HOI001 para alto teor de óleo compreende sondar o DNA genômico das plantas resultantes, através do processo de seleção, quanto à presença do marcador molecular para o gene de GBSS de HOI001. O marcador molecular é uma molécula de DNA representando um polimorfismo único no gene de GBSS de HOI001 que funciona como uma sonda ou iniciador para uma GBSS de HOI001 alvo em um genoma da planta. O polimorfismo selecionado pode ou não ser a partir de uma região de codificação do gene. As plantas contendo o gene de GBSS de HOI001 são continuadas no processo de multiplicação e seleção.

Claims

1. Molécula de ácido nucléico, caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo consistindo em:

a) uma molécula de ácido nucléico compreendendo a SEQ

ID N°: 1 ou o seu complemento, ou sequências de nucleotídeo degeneradas das mesmas codificando a mesma sequência de aminoácidos; e

b) uma molécula de ácido nucléico compreendendo a SEQ

ID N°: 11 ou o seu complemento, ou sequências de nucleotídeo degeneradas das mesmas codificando a mesma sequência de aminoácidos;

em que a molécula de ácido nucleico é operacionalmente ligada a um promotor heterólogo que é funcional em uma célula vegetal.

2. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 1.

3. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que está contido em uma célula vegetal.

4. Método de produzir uma planta tendo níveis aumentados de produção de óleo, caracterizado pelo fato de compreende:

(a) transformar uma planta com um cassete de expressão compreendendo uma molécula de ácido nucléico selecionada a partir do grupo consistindo em:

i) uma molécula de ácido nucléico compreendendo a SEQ

ID N°: 1 ou o seu complemento, ou sequências de nucleotídeo degeneradas das mesmas codificando a mesma sequência de aminoácidos; e ii) uma molécula de ácido nucléico compreendendo a SEQ

ID N°: 11 ou o seu complemento , ou sequências de nucleotídeo

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2/2 degeneradas das mesmas codificando a mesma sequência de aminoácidos;

em que o dito cassete de expressão adicionalmente compreende uma região de promotor funcional em uma célula vegetal, operavelmente ligada à dita molécula de ácido nucléico; e (b) desenvolver a planta transformada.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a planta é uma monocotiledônea.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a planta monocotiledônea é o milho.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a região de promotor é uma região de promotor de endosperma.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a região de promotor é o promotor Z27.