BRPI0614590B1

BRPI0614590B1 - Peptídeos antigênicos de rejeição tumoral derivado de glipicano-3 (gpc3) úteis para pacientes hla-a2 positivos, e produto farmacêutico contendo os mesmos

Info

Publication number: BRPI0614590B1
Application number: BRPI0614590-6A
Authority: BR
Inventors: Yasuharu Nishimura; Tetsuya Nakatsura; Hiroyuki Komori
Original assignee: Oncotherapy Science, Inc
Priority date: 2005-08-09
Filing date: 2006-08-08
Publication date: 2025-01-21

Abstract

PEPTÍDEOS ANTIGÊNICOS DE REJEIÇÃO TUMORAL DERIVADOS DE GLIPICANO-3 (GPC3) ÚTEIS PARA PACIENTES HLA-A2-POSITIVOS, E PRODUTO FARMACÊUTICO CONTENDO OS MESMOS. Um objetivo da presente invenção é identificar um peptídeo derivado de glipicano-3, que possa ligar-se a HLA-A2 e ativar células T assassinas humanas, de modo a proporcionar um meio para a condução de uma imunoterapia que seja capaz de atingir como alvo aproximadamente 40% dos pacientes japoneses que sofram de vários tipos de cânceres, que expressam GPC3 em um nível elevado. A presente invenção provê um peptídeo conforme qualquer um dos seguintes (A) ou (B): (A) um peptídeo que tem a seqüência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3; e (b) um peptídeo que tem uma seqüência de aminoácidos que contém uma susbstituição ou adição de um ou dois aminoácidos em relação à seqüência de aminoácidos mostrada em qualquer umas das SEQ ID NOS: 1 a 3, e que tem a capacidade de induzir células T assassinas.

Description

Área Técnica

A presente invenção refere-se a novos peptideos que são eficazes como vacina para os cânceres com alta expressão de glipicano-3 (GPC3), tais como carcinoma hepatocelular ou melanoma maligno (melanoma), e um produto farmacêutico que contém os já mencionados peptideosf usado 10 para tratamento e prevenção de tumores.

Técnica Antecedente

O carcinoma hepatocelular primário é uma doença maligna que ocorre com alta freqüência em vários países no mundo todo. Como resultado de grandes epidemias de hepatite 15 B e C no mundo inteiro, a incidência de carcinoma hepatocelular vem aumentando rapidamente em países asiáticos e europeus. Considerando o longo período de incubação desde a infecção com o vírus da hepatite até o início da doença, prevê-se que essa tendência continuará ao 20 longo do próximos cinquenta anos. 0 carcinoma hepatocelular cujas condições pioraram tem um mau prognóstico. Assim, é desejável que se desenvolva rapidamente uma nova estratégia para o seu tratamento.

Por outro lado, com o desenvolvimento da biologia 25 molecular e da imunologia tumoral nos últimos anos, revelou-se que as células T citotoxicas (assassinas; e células T auxiliares reconhecem peptideos formados por decomposição de proteínas altamente expressos especificamente em células cancerosas, que se apresentam 30 nas superficies das células cancerosas ou células que apresentam antígenos via moléculas HLA e que elas mostram uma reação imunológica para destruir as referidas células cancerosas. Além disso, foi identificado um grande número de proteínas e peptideos antigemcos tumorais que estimulam. a referida reação imunológica para atacar cânceres, e a aplicação clínica de uma imunoterapia tumoral antígeno- específica avançou muito.

As moléculas HLA classe I são expressas nas superfícies de todas as células nucleares em um corpo. Os peptídeos derivados de proteínas citoplasmáticas e nucleares decompostas ligam-se a moléculas HLA classe I, e são expressos nas superfícies dessas células. Nas superfícies das células normais, os peptídeos derivados de proteínas autólogas normais se ligam a moléculas HLA classe I, e as células T do sistema imunológico nem reconhecem, nem respondem a tais peptídeos ligados a moléculas HLA classe I. Por outro lado, em um processo no qual as células normais se convertem em um câncer, tais células cancerosas podem expressar grandes quantidades de proteínas que raramente são expressas, ou que são expressas somente em quantidades pequenas nas células normais. Se um peptideo gerado por decomposição no citoplasma de uma proteína que é altamente e especificamente expressa em uma célula cancerosa se ligar a uma molécula HLA classe I e for expresso na superfície da referida célula cancerosa, uma célula T assassina reconhecerá o peptideo e destruirá somente a célula cancerosa. Além disso, administrando-se um tal antígeno ou peptideo câncer-específico a um determinado corpo, é possível destruir células cancerosas e reprimir o crescimento de um câncer, sem prejudicar as células normais. Isso é chamado de imunoterapia do câncer por uso de um antígeno câncer-específico. Além disso, uma molécula HLA classe II é expressa principalmente na superfície de uma célula que apresenta um antígeno. Essa molécula HLA classe II liga-se a um peptideo derivado de um antígeno câncer-específico gerado pela incorporação do antígeno câncer-específico de fora da célula e sua decomposição na célula, e é expressa na superfície da célula. Uma célula T auxiliar que tiver reconhecido o peptideo ligado pela molécula HLA classe II será ativada para gerar várias citoquinas que ativam outras células imunocompetentes, de modo a induzir ou reforçar uma reação imunológica contra um tumor.

Assim, se uma imunoterapia tendo como alvo um antigeno que é altamente e especificamente expresso no referido câncer puder ser desenvolvida, ela poderá tornar-se um método de tratamento para efetivamente eliminar apenas o câncer, sem prejudicar os órgãos autólogos normais. Além do mais, prevê-se que uma tal imunoterapia possa tornar-se um método de tratamento aplicável a pacientes que sofrem de um câncer em estágio terminal, com os quais nenhum outro tratamento possa ser usado. Além disso, se um antigeno e peptideo câncer-específico forem administrados na forma de uma vacina a um humano que apresente alto risco de desenvolver o referido câncer, existe uma possibilidade de se prevenir o estabelecimento do câncer.

Foi relatado que, nos tecidos normais, uma alfa- fetoproteína (AFP) é expressa somente no período pré-natal e que ela é o que se chama de uma proteína carcinoembriônica cuja expressão é ativada novamente em muitos carcinomas hepatocelulares. Além disso, vários tipos de células T de camundongos e humanas reconhecem um epítopo de peptideo derivado de uma AFP apresentada por uma molécula MIIC classe I. Durante o estágio de desenvolvimento, o feto é exposto à AFP existente em alto nível no plasma. Entretanto, as células T maduras não adquirem total tolerância à AFP, e células T AFP- específicas são encontradas no sangue periférico. Isto quer dizer que a referida proteína carcinoembriônica pode ser um alvo da imunoterapia.

Existem vários métodos para o tratamento do carcinoma hepatocelular. Entretanto, o prognóstico do referido carcinoma hepatocelular é pior do que os prognósticos para outros tipos de câncer e, assim sendo, esse câncer é considerado intratável. Isso pode ser porque o carcinoma hepatocelular se desenvolve com base na cirrose do figado e, assim, as funções hepáticas dos pacientes com carcinoma hepatocelular não são boas. Isso também pode ser porque embora uma massa de câncer tenha sido tratada, um outro câncer se desenvolve vindo de outro local. Consequentemente, tornou-se necessário desenvolver rapidamente uma nova estratégia de tratamento. Se uma imunoterapia cujo alvo é um antígeno altamente e especificamente expresso no carcinoma hepatocelular puder ser desenvolvida, haverá uma possibilidade da referida imunoterapia tornar-se um método terapêutico para eliminar efetivamente apenas o câncer, sem prejudicar os órgãos autólogos normais. Além do mais, prevê-se que a já mencionada imunoterapia possa ser um método terapêutico disponível para os pacientes que estão no estágio terminal do câncer e, também, para os pacientes cujas funções hepáticas são demasiadamente precárias para que outros tratamentos possam ser realizados. Atualmente diz-se que, no Japão, mais de 2.000.000 de pessoas estão infectadas com o vírus da hepatite C e gue essas pessoas são pacientes de carcinoma hepatocelular em potencial. Existe a possibilidade de que a já mencionada imunoterapia seja aplicada também para evitar que esses pacientes infectados venham a sofrer realmente de carcinoma hepatocelular.

O melanoma é um tipo de câncer da pele que muitas vezes é chamado de melanoma maligno. Há muitos tipos de câncer de pele. Entre esses cânceres de pele, o melanoma é classificado como o que tem o mais alto grau de malignidade e, por isso, é muito temido. Entre as células que constituem a pele, várias células geram o pigmento melanina. Essas células são chamadas de melanócitos. Quando esses melanócitos se tornam cancerosos, ocorre o melanoma.

No Japão, a incidência de melanoma varia de 1,5 a 2 pessoas em cada 100.000, na população em geral. Assim, estima-se que aproximadamente de 1500 a 2000 pessoas desenvolvam o melanoma por ano. Por outro lado, nos paises ocidentais, mais que uma dúzia de pessoas em cada 100.000, na população em geral desenvolvem o melanoma. Especificamente, na Austrália vinte ou mais pessoas em cada 100.000, na população em geral, desenvolvem o melanoma e, assim, diz-se que a incidência de melanoma na Austrália é a mais alta do mundo. Sob tais circunstâncias, as pessoas que vivem na Europa, Estados Unidos e Austrália estão interessadas no melanoma e estão atentas à ocorrência do melanoma. Além disso, a frequência da ocorrência do melanoma tem aumentado, principalmente entre caucasianos, como resultado do aumento da exposição aos raios ultravioleta devido à redução da camada de ozônio na atmosfera, causada pela destruição ambiental. Além disso, a ocorrência de melanoma tende a crescer ano após ano no Japão também. De acordo com estudos recentes, o número de mortes causadas pelo melanoma no Japão aumentou para aproximadamente 450 por ano. O melanoma se desenvolve independentemente da idade. No entanto, a incidência dessa doença aumenta para as pessoas acima de 40 anos e atinge o seu ponto mais alto entre as pessoas de 60 e 70 anos. O estabelecimento dessa doença na infância é extremamente raro, mas isso não significa que a doença nunca se desenvolve na infância. Recentemente a ocorrência do melanoma tem aumentado entre pacientes jovens de 20 e 30 anos. O melanoma se desenvolve independentemente do sexo e tanto os pacientes masculinos como femininos sofrem dessa doença. No caso dos pacientes j aponeses, o local onde o melanoma tem maior probabilidade de se desenvolver é na sola dos pés, e esse é o local de 30% de todos os casos de melanoma. Como uma característica dos pacientes japoneses, o melanoma também se desenvolve no pé e nas partes dos dedos cobertas pelas unhas. Além disso, como no caso dos pacientes ocidentais, entre os pacientes j aponeses o 5 melanoma também se desenvolve em todas as partes da pele, como no tórax, mão, pé, face e cabeça.

Primeiramente, os presentes inventores realizaram uma análise da expressão gênica de genomas em geral, inclusive em relação a 23.040 tipos de genes humanos, utilizando 10 analise em microsseries de cDNA. Os inventores analisaram os perfis de expressão desses genes em 20 casos de carcinomas hepatocelulares primários e em vários tipos de órgãos normais, inclusive os presentes no período pré- natal. Como resultado, os inventores descobriram que o 15 glipicano-3 (GPC3) é expresso no fígado, rins e pulmões durante o período pré-natal, e também que o referido glipicano-3 é altamente expresso em muitos carcinomas hepatocelulares, embora raramente seja expresso em orgaos adultos normais, apesar de ser expresso na placenta. Os 20 inventores relataram ainda que o referido GPC3 é uma proteína secretória, que o referido GPC3 pode ser detectado no soro de 40% dos pacientes de carcinoma hepatocelular pelo método ELISA, e que isso o torna útil como um novo marcador tumoral do carcinoma hepatocelular (Nakatsura, T. e outros, Biochem. Biophys. Res. Coπunun. 306, 16-2 5 (2003) ) . Além disso, relataram também que o GPC3 e detectado no soro dos pacientes de melanoma, e que isso o torna útil como marcador tumoral do melanoma (Nakatsura, T. e outros, Clin. Câncer Res. 10:6612-6621 (2004)).

Os presentes inventores j a identificaram um peptideo de GPC3, que se liga a HLA-A24 e é apresentado a uma célula T assassina humana e que é útil para uma imunoterapia cujo alvo sejam pacientes com carcinoma hepatocelular ou melanoma HLA-A24 positives. Os inventores realizaram uma experiência com animais usando camundongos BALB/C que expressam moléculas K0 de camundongos, às quais se liga um peptideo que tem a mesma estrutura que um peptideo que se liga a HLA-A24. Por meio dessa experiência, eles demonstraram a eficácia da imunoterapia que usa o já mencionado peptideo e j a relataram os resultados (Pedido de Patente Internacional No. PCT/JP2004/016374; Data do Depósito Internacional: 28 de outubro de 2004) . Nos órgãos normais, como o GPC3 é expresso apenas na placenta e no figado no periodo pré-natal, mesmo quando uma imunoterapia cujo alvo é o GPC3 é realizada para reprimir o crescimento do tumor, eventos adversos como doença autoimune não ocorrem. Isso foi confirmado por uma experiencia em que foram usados camundongos.

Até hoje, com relação ao glipicano-3 (GPC3) como antigeno de rejeição tumoral, os presentes inventores identificaram um peptideo que é apresentado principalmente por HLA-A24 a uma célula T assassina (Pedido de Patente Internacional No. PCT/JP03/10459; Data de Depósito Internacional: 19 de agosto de 2003) . Entretanto, com apenas os referidos peptídeos apresentados por ±ILA~A24 as células T assassinas, as vacinas de peptideo só podem ser administradas a 60% da população japonesa que tem HLA-A24. Se um peptideo apresentado a uma célula T assassina por HLA-A2, para o qual 40% da população japonesa tem teste positivo, puder ser identificado, aproximadamente 85% da população japonesa poderá tornar-se o alvo dos dois tipos de vacinas de peptideos. Além disso, como entre os caucasianos dos paises ocidentais a frequencia de HLA-A2 e relativamente alta, o referido peptideo apresentado por HLA-A2 pode ser aplicado a muitas populações ocidentais. Consequentemente, a identificação do já mencionado peptideo apresentado por IILA“A2 a uma celulex T asoassina e um importante objetivo. Especificamente, como o melanoma é um câncer que se desenvolve com frequência em caucasianos nos países ocidentais e para o qual uma imunoterapia é eficaz e, mais ainda, como o carcinoma hepatocelular também tem aumentado rapidamente nos paises ocidentais, presume-se que haverá um grande número de pacientes em quem poderá ser aplicada uma imunoterapia usando o peptideo GPC3 que se liga a HLA-A2.

Descrição da Invenção Problemas a Serem Resolvidos pela Invenção

Um objetivo da presente invenção é identificar peptideos apresentados por HLA-A2 a uma célula T assassina, de modo a proporcionar um meio para se realizar uma imunoterapia que possa ter como alvo aproximadamente 40% dos pacrentes japoneses que sofrem de vários tipos de cânceres que expressam GPC3 em nível elevado.

Meios para Resolver os Problemas

Anteriormente, os presentes inventores haviam identificado o glipicano~3 (GFC3) como uma nova proteína carcinoembriônica que é especificamente e excessivamente expressa no carcinoma hepatocelular humano, com base na análise em microsséries de cDNA. Os inventores também haviam esclarecido que uma proteína GPC3 solúvel é detectada no soro de um paciente com carcinoma hepatocelular, e que o referido GPC3 pode ser um novo marcador tumoral do carcinoma hepatocelular. Os presentes inventores haviam descoberto que o GPC3 e expresso em uma linha de células B16 de melanoma murino e é expresso em nível elevado no melanoma, bem como no carcinoma hepatocelular. Assim, os inventores julgaram que o GPC3 também pode se tornar um util marcador tumoral do me-Lcmoma. Como resultado de uma experiência confirmatória, eles haviam descoberto que o GPC3 age como um marcador tumoral do melanoma, possibilitando um diagnóstico precoce, o que nunca havia sido percebido até então. Desta vez, os presentes inventores estimularam células T assassinas humanas CDS-positivas por meio de sua co-cultura in vitro juntamente com células dendriticas derivadas do monócitos de sangue periférico humano, às quais havia sido pulsado um peptideo GPC3 humano tendo um motif que se liga a HLA-A2, induzindo, desse modo, células T assassinas GPC3- especificas. A presença ou ausência de indução de células T assassinas especificas para cada peptideo GPC3 foi detectada por um método ELISPOT que detecta y-interferon (IFN-y) gerado pelas células T assassinas ativadas que reconhecem os peptideos apresentados por HLA-A2, e foi identificado um novo peptideo GPC3 que poderia ser um candidato para um antigeno alvo aplicável a uma imuno t e r ap i a.

Isso quer dizer que a presente invenção provê as seguintes características de invenção. (1) Um peptideo, sendo qualquer um dos seguintes (A) ou (B): (A) um peptideo que tem a sequência de aminoácidos conforme mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3; ou (B) um peptideo que tem uma seqüência de aminoácidos que compreende uma suhs t i tuiç ao ou adiçao de um ou doi s aminoácidos em relação à seqüência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3, e que tem a capacidade de induzir células T assassinas. (2) Um indutor imunológico usado para cânceres, que consiste em pelo menos um tipo do peptideo de (1) acima. (3) Um produto farmacêutico para tratar e/ou prevenir tumores, que compreende pelo menos um tipo do peptideo de (1) acima. (4) Um agente para induzir células apresentadoras de antigenos que tem uma alta capacidade de induzir células T tumor-reativas, que consiste no peptideo de (1) acima. (5) Um agente para induzir células que apresentam antigenos, tendo alta capacidade de induzir células T tumor-reativas, que consiste em um gene que codifica um peptideo, sendo qualquer um dos seguintes (A) ou (B). (A) um peptideo que tem a sequência de aminoácidos conforme mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3, ou (B) um peptideo que tem uma sequência de aminoácidos que compreende uma substituição ou adição de um ou mais aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos conforme mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3, e que tem capacidade de induzir células I assassinas* (6) Um agente para induzir células T tumor-reativas, que consiste do peptideo de (1) acima. (7) Um anticorpo contra o peptideo de (1) acima. (8) Uma célula T auxiliar, uma célula T assassina, ou uma população de imunócitos compreendendo as referidas células, que é induzida usando-se o peptideo de (1) acima. (9) uma célula apresentadora de antigeno, que apresenta um complexo que consiste de uma molécula HLA e o peptideo de (1) acima. (10) A célula apresentadora de antigeno de (9) acima, que é induzida usando o agente de (4) ou (5) acima.

Melhor Maneira de Executar a Invenção (1) 0 peptideo da presente invenção e indutor imunológico usando o referido peptideo para cânceres.

O peptideo da presente invenção é qualquer um dos seguintes peptideos (A) ou (B): (A) um peptideo que tem a seqüência de aminoácidos como mostra qualquer uma das SEQ ID NOS: de 1 a 3; ou (B) um peptideo que tem uma seqüência de aminoácidos que compreende uma substituição ou adiçao de um ou dois aminoácidos em relação à seqüência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: de 1 a 3, e que tem a capacidade de induzir células T assassinas.

A expressão "peptideo que tem a capacidade de induzir células T assassinas" é usada na presente especificação para designar um peptideo que tem uma atividade indutora de células T, estimulando as células T assassinas (linfócitos T citotóxicos - CTL).

O método para se obter/produzir o peptideo da presente invenção não é particularmente limitado. Pode-se usar uma proteína sintetizada quimicamente, ou uma proteína recombinante produzida por recombinação genética.

Quando se trata de um peptideo sintetizado quimicamente, o peptideo da presente invenção pode ser sintetizado por um método de síntese química como um método Fmoc (fluorenil-metiloxi-carbonil) ou um método tBoc (t- butiloxi-carbonil), por exemplo. Além disso, o peptideo da presente invenção também pode ser sintetizado usando-se vários tipos de sintetizadores de peptídeos disponíveis no mercado.

Quando o peptideo da presente invenção é produzido na forma de uma proteína recombinante, obtém-se DNA que tenha uma sequência de nucleotídeos que codifique o peptideo já mencionado, um mutante do mesmo, ou um homólogo do mesmo e ele é então introduzido em um sistema de expressão adequado, de modo a produzir o peptideo da presente invenção.

Como vetor de expressão, pode-se usar preferivelmente um vetor capaz de se replicar autonomamente em uma célula hospedeira, ou capaz de ser incorporado no cromossomo de uma célula hospedeira. Usa-se um vetor de expressão que contenha um promotor em uma posição capaz de expressar um gene que codifique o peptideo. Além disso, um transformante tendo um gene que codifique o peptideo da presente invenção pode ser produzido introduzindo-se o já mencionado vetor de expressão em um hospedeiro. Como hospedeiro, pode-se usar qualquer um dos seguintes: uma bactéria, uma levedura, uma célula de animal, e uma célula de inseto. 0 vetor de expressão pode ser introduzido em um hospedeiro por meio de um método conhecido, dependendo do tipo de hospedeiro.

Na presente invenção, o transformante produzido conforme exposto acima é cultivado e o peptideo da presente invenção é então gerado e acumulado em uma cultura. Depois disso, o peptideo da presente invenção é coletado da cultura, de modo a isolar-se um peptideo recombinante.

Quando o transformante é um procariote como Escherichia coli, ou um eucariote como levedura, o meio usado para cultivar esses microorganismos pode ser um meio natural ou um meio sintético, desde que contenha uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, sais inorgânicos e semelhantes, que possam ser assimilados pelos referidos microorganismos, e desde que seja capaz de realizar eficientemente a cultura do transformante. Além disso, a referida cultura pode ser conduzida sob condições que são comumente aplicadas na cultura dos referidos microorganismos. Apos a conclusão da cultura, o peptideo da presente invenção pode ser isolado da cultura do transformante e purificado, de acordo com um método comum de isolamento e purificação de peptideos.

Um peptideo tendo uma sequencia de aminoácidos que contém uma substituição ou adição de um ou dois amino ácidos em relação à seqüência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3 pode ser adequadamente produzido ou adquirido por J.ofisslonais experientes nessa arte, com base em informações a respeito da seqüência de nucleotideos do DNA que codifica a seqüência de aminoácidos como é mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS. de 1 a 3. Isto é, um gene que codifica um peptideo que tem uma seqüência de aminoácidos contendo uma substituição ou adição de um ou dois aminoácidos em relação à seqüência de aminoácidos como mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3 e que tem capacidade de induzir células T assassinas pode ser produzido por qualquer método conhecido pelos prof issiofiais experientes na arte, tal como sincese química/ meios da engenharia genética ou mutagênese. Por exemplo, a mutagênese sítio-dirigida como um meio da engenharia genética é útil porque trata-se de um meio para introduzir uma mutação especifica em uma posição específica. A referida mutagênese sítio-dirigida pode ser realizada por um método descrito em Molecular Cloning: A Laboraty Manual, 2nd. Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (doravante aqui denominada simplesmente Molecular Cloning 2& ed.) , Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1 to 38, John Wiley & Sons (1987-1997) (doravante aqui denominada simplesmente Current Protocols in Molecular Biology) , etc.

Conforme descrição nos exemplos abaixo, o já mencionado peptideo da presente invenção é capaz de induzir imunidade contra cânceres. Assim, a presente invenção provê um indutor imunológico usado para cânceres, que consiste do peptideo da presente invenção. indutor imunológico da presente invenção usado para cânceres é usado in vitro ou in vivo e, preferivelmente, in vitro, de modo que possa induzir uma célula T auxiliar, uma célula T assassina, ou uma população de imunócitos contendo as referidas células, conferindo, desse modo, imunidade contra cânceres.

(2) 0 anticorpo da presente invenção

A presente invenção também se refere a um anticorpo que reconhece uma parte ou todo o já mencionado peptideo da presente invenção como um epítopo (antigeno), e a uma célula T assassina induzida por estimulação in vi tro usando-se a já mencionada proteína ou peptideo. Em geral, a referida célula T assassina exibe uma atividade antitumoral que é mais forte do que a de um anticorpo.

O anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal. O referido anticorpo pode ser produzido de acordo com um método comum.

Por exemplo, um anticorpo policlonal pode ser produzido imunizando-se um mamifero ou primata com o peptideo da presente invenção usado como antígeno e, depois, coletando—se sangue do mamífero ou primata e separando-se e purificando-se o anticorpo do sangue coletado. Por exemplo, podem ser imunizados mamíferos ou primatas, como um camundongo, um hamster, uma cobaia, uma galinha, um rato, uma lebre, um canino, uma cabra, um carneiro, ou um bovino. 0 referido método de imunização é conhecido pelos profissionais experientes nessa arte. Por exemplo, um antígeno pode ser administrado 2 ou 3 vezes, a intervalos de 7 a 30 dias. Como dosagem, aproximadamente de 0,05 a 2 mg de antígeno podem ser administrados uma vez, por exemplo. A rota de administração não é limitada, e pode se selecionar entre admimstraçao subcutânea, administração intracutânea, administração intraperitoneal, administração intravenosa, administração intramuscular, etc., conforme for mais adequado. Além disso, o antígeno pode ser dissolvido em um tampao adequado, por exemplo, um tampão adequado que contenha um adjuvante de Freund completo ou um adjuvante comumente usado, como óxido de alumínio, para ser, então, usado. 0 mamífero ou primata assim imunizado é criado por um determinado período de tempo. Depois disso, se a titulagem de anticorpo aumentar, pode ser feito um reforço, usando-se de 100 a 1000 μg de antígeno, por exemplo. Um ou dois meses após a imunização final, coleta—se sangue do mamífero ou primata imunizado. O sangue coletado é então separado e purificado por um método comum, incluindo centrifugação, precipitação usando-se sulfato de amónio ou polietileno glicol, cromatografia, como a cromatografia de filtraçao em gel, cromatografia de troca iônica, ou cromatografia de afinidade, etc., de modo a obter-se um anticorpo policlonal que reconheça o peptideo da presente invenção na forma de um anti-soro policlonal.

Por outro lado, um anticorpo monoclonal pode ser obtido preparando-se um hibridoma. Por exemplo, tal hibridoma pode ser obtido pela fusão celular de uma célula geradora de anticorpos com uma célula de mieloma. Um hibridoma que gera o anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser obtido pelo seguinte método de fusão celular.

Como célula geradora de anticorpos, usa-se uma célula esplénica, uma célula de nódulo linfático, um linfócito B, ou semelhante, retirada do animal imunizado. Como antigeno, usa se o peptideo da presente invenção. Como animal a ser imunizado, pode-se usar um camundongo, um rato, ou semelhante. Administra-se um antigeno ao referido animal, de acordo com um método comum. Por exemplo, uma suspensão ou emulsão liquida, contendo um adjuvante como o adjuvante de Freund completo ou adjuvante de Freund incompleto e o peptideo da presente invenção usado como um antigeno, é administrada ao animal via administração intravenosa, administração subcutânea, administração intracutânea, administração intraperitoneal, etc., várias vezes, de modo a imunizar o animal. Depois disso, uma célula geradora de anticorpos tal como uma célula esplénica é obtida do animal imunizado e a célula espiem ca assim obtida e então fundida com uma célula de mieloma de acordo com um método conhecido (G. Kohler et al., Nature, 256495 (1975)), produzindo-se, dessa ILL 3.11S 1 J? CL / um hibridoma.

Os exemplos de linhagens de célula de mieloma usadas na fusão celular incluem uma linhagem P3X63Ag8, uma linhagem P3U1 e uma linhagem Sp2/0, no caso de um camundongo. Quando essa fusão celular e realizada, usa—se um promotor de fusão como o polietileno glicol ou o virus Sendai. Para selecionar um hibridoma após a conclusão da fusao celular, usa se um meio de hipoxantma, am.inopterina e timidina (meio HAT) , de acordo com um método comum. O hibridoma obtido como resultado da fusão celular é clonado por um método de diluição limitante. Além disso, conforme necessário, faz-se uma seleção por imuno-ensaio enzimático usando o peptideo da presente invenção, de modo a obter-se uma linhagem celular que gere um anticorpo monoclonal que reconheça especificamente o peptideo da presente invenção.

Para se produzir o anticorpo monoclonal em questão a partir do hibridoma assim obtido, o hibridoma pode ser cultivado por um método comum de cultura celular ou método de formação de ascites, e o anticorpo monoclonal em questão pode então ser purificado da cultura sobrenadante ou ascites. O anticorpo monoclonal pode ser purificado do sobrenadante da cultura ou ascites de acordo com um método comum. Por exemplo, fracionamento com sulfato de amónio, filtraçao em gel, cromatografia de troca lonica, cromatografia de afinidade, e outros métodos podem ser combinados e usados, conforme for adequado.

Além disso, os fragmentos do já mencionado anticorpo também estão incluidos na abrangência da presente invenção. Exemplos de fragmentos do anticorpo incluem um fragmento F(ab')2 e um fragmento Fab' .

(3) Célula T auxiliar, Célula T assassina, ou uma populaçao de imunocitos contendo as referidas células

A presente invenção também se refere a uma célula T auxiliar, uma célula T assassina, ou uma população de imunócitos contento as referidas células, que é induzida por estimulação in vitro usando se o peptideo da presente invenção. Por exemplo, quando linfócitos do sangue periférico ou linfócitos que se infiltram nos tumores são estimulados in vitro usando-se o peptideo da presente invenção, células T ativadas tumor—reativas sao induzidas.

As células T assim ativadas podem ser efetivamente usadas para uma imunoterapia adotiva. Alem disso, células dendriticas, que constituem fortes células apresentadoras de antígenos, podem expressar o peptideo da presente invenção in vivo ou in vitro, e as células dendriticas que expressam antígenos são então usadas para realizar a indução imunológica.

Preferivelmente, uma célula T auxiliar, uma célula T assassina, ou uma população de imunócitos contendo as referidas células podem ser induzidas por estimulação ín vitro usando-se o peptideo da presente invenção e um imuno- estimulador. Exemplos do referido imuno-estimulador usado na presente invenção incluem um fator de crescimento das células e uma citoquina.

A célula T auxiliar, a célula T assassina, ou a população de imunócitos contendo as referidas células obtida dessa maneira é transferida para um corpo, de modo que o tumor possa ser reprimido e o câncer possa ser prevenido e/ou tratado.

Além disso, usando-se o peptideo da presente invenção, pode-se produzir uma célula T auxiliar, uma celular T assassina, ou uma populaçao de imunócitos contendo tais células, que é capaz de reprimir o tumor conforme descrição acima. Consequentemente, a presente invenção provê uma solução para cultura de células que contém o peptideo da presente invenção. Usando-se a referida solução para cultura celular, pode-se produzir uma célula T auxiliar, uma célula T assassina, ou uma população de imunócitos contendo tais células, que é capaz de reprimir tumores. Ainda mais, a presente invenção também provê um kit de cultura celular para a produção de uma célula T auxiliar, uma célula T assassina, ou uma população de imunócitos contendo essas células, que consiste da já mencionada solução de cultura celular e um vaso para cultura celular.

(4) Produto farmacêutico da presente invenção para o tratamento e/ou prevenção do cancer

Como o peptideo da presente invenção é capaz de induzir células T assassinas especificas para células 5 cancerosas, pode-se esperar que ele seja um agente para o tratamento e/ou prevenção do câncer. Por exemplo, bactérias como BCG {Bacillus Calmette-GuErin) transformadas com DNA recombinante produzido incorporando-se um gene que codifica o peptideo da presente invenção em um vetor adequado, ou 10 vírus como TOcmua VULÍS, em cujo genoma foi incorporado o DNA que codifica o peptideo da presente invenção, podem ser usados efetivamente como uma vacina para o tratamento e/ou prevenção de cânceres humanos. Deve-se notar que a dosagem e o método de admimstraçao da referida vacina contra o 15 câncer são os mesmos que os usados no caso da vacinação comum contra a variola ou da vacinação com BCG.

Isto é, o DNA que codifica o peptideo da presente invenção (que e usado como se apresenta, ou na forma de DNA plasmidico incorporado num vetor de expressão), ou um virus 20 recombinante, ou uma bactéria recombinante contendo o já mencionado DMA, podem ser administrados como uma vacina contra o cancer a mamíferos, inclusive humanos, diretamente, ou num estado em que ficam dispersos num adjuvante.

Exemplos de um adjuvante usando na presente invenção incluem o adjuvante de Freund incompleto, BCG, dimicolato de trealose (TDM), lipopolissacarideo (LPS), um adjuvante de aluminio e um adjuvante de silica. Do ponto de vista da capacidade para induzir anticorpos, um adjuvante de Freund

A presente especificação não se refere a um tipo de câncer em especial. Os exemplos específicos de câncer incluem câncer do esôfago, câncer de mama, câncer da tireoide, câncer do cólon, câncer do pâncreas, melanoma maliano (melanoma), linfoma maliαno, osteosarcoma, feocromocitoma, cancer da cabeça e pescoço, câncer uterino, câncer do ovário, tumor cerebral, leucemia mielógena crônica, leucemia mieiogena aguaa, câncer renai, cancer αa próstata, câncer do pulmão, câncer estomacal, câncer hepático, câncer da vesícula biliar, câncer testicular, câncer da bexiga e sarcoma, u peptideo da presente invenção age como um epitopo de célula T e induz uma célula T assassina específica contra células cancerosas. Assim, o peptideo da presente invenção é útil como um agente para prevenir e/ou tratar cânceres numanos. Aiém disso, se o anticorpo da presente invenção é caoaz de inibir a atividade do GPC3 como um antíaeno de câncer, ele também é útil como um agente para prevenir e/ou tratar os cânceres humanos. Na prática, o peptideo ou anticorpo da presente invenção pode ser administrado como um produto inietável, diretamente ou iuntamente com um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável e, se necessário, também juntamente com as substâncias auxiliares citadas abaixo. Além disso, o peptideo ou anticorpo da presente invenção também pode ser administrado por outros métodos, como por aspersão, via absorção transdérmica através de mucosa. O termo "veículo" é usado no presente com o significado de albumina de soro numano, por exemplo. Além disso, como diluente, pode-se usar PBS, áaua destilada ou semelhantes.

Quanto à dosagem, o peptideo ou anticorpo da presente invenção podem ser administrados dentro da faixa entre 0,01 a 100 ma por adulto, por administração. Entretanto, a dosagem não se limita à faixa citada acima. A forma de dosagem também não é limitada. Um produto congelado seco, ou um granulado produzido adicionando-se um excipiente como o acúcar também podem ser disponibilizados.

Os exemplos de uma substância auxiliar que pode ser adicionada ao agente da presente invenção para aumentar a atividade indutora de células T tumor reativas incluem: muramil-dipeptideo (MDP); componentes bacterianos como bactérias BCG; ISCOM descrito em Nature, vol. 344, p. 873 (1990); Saponin QS-21, descrito em J. Immunol. Vol. 148, p.1438 (1992); lipossomo, e óxido de alumínio. Além disso, imuno-estimuladores como Lentinan, Esquizofilan ou Picibanil também podem ser usados como substâncias auxiliares. Outros exemplos de produtos usados aqui como substâncias auxiliares incluem: citoquinas para aumentar o crescimento ou diferenciação das células T, tais como IL-2, IL-4, IL-12, IL-1, IL-6, ou TNF; alfa-galactosilceramida para ativar as células NKT; CpG, que se liga a um receptor "Toll-like" para ativar um sistema imunológico inato, e lipopolissacarídeo (LPS).

Além disso, o já mencionado peptideo antígeno é acrescentado in vitro a células coletadas de um paciente, ou células (alogenéicas) de qualquer outra pessoa com quem compartilhe alelos HLA, seguido pela apresentação de antígenos das células. Depois disso, as células são administradas ao vaso sanguíneo do paciente, de modo que as células T assassinas possam ser efetivamente induzidas no corpo do paciente. Também, o peptideo da presente invenção é adicionado aos linfócitos do sangue periférico do paciente, e a mistura obtida é então cultivada in vitro. Dessa maneira, as células T assassinas podem ser induzidas in vitro, e podem então ser devolvidas ao vaso sanguíneo do paciente. Essa terapia, envolvendo a transferência de células, ja for conduzida como um método para o tratamento do câncer; portanto, trata-se de um método bem conhecido pelos profissionais experientes na arte.

Introduzindo-se o peptideo da presente invenção em um corpo, as células T assassinas sao induzidas e ativadas e, como resultado, pode-se prever um efeito antitumoral. Além do mais, quando linfócitos são estimulados pelo peptideo da presente invenção in vitro, células T ativadas são induzidas. As células T ativadas são injetadas em uma área afetada. Assim, essa técnica pode ser eficazmente usada como uma imunoterapia adotiva.

A presente invenção será adicionaliaente descrita nos exemplos seguintes. Entretanto, esses exemplos não se destinam a limitar o escopo da presente invenção.

Exemplos Exemplo 1 (1) Seleção do peptideo GPC3 que exibe capacidade de ligar-se a HLA-A2

A seqüência de aminoácidos do GPC3 humano foi investigada por um sistema BIMAS, e foram selecionados 4 tipos de seqüências que têm uma afinidade de ligação com HLA-A2 estimada em 20 ou mais. Tabela 1

Exemplo 2 Indução de células T assassinas humanas pelo peptideo GPC3 que se liga a HLA-A2 (1) Coleta de sangue

Foi obtido o consentimento informado de pacientes com carcinoma hepatocelular HLA-A2-positivos que estavam em terapia na Cirurgia Gastroenterológica da Escola de Medicina da Universidade Kumamoto e no Hospital Leste, Centro Nacional do Câncer. Isso feito, foram obtidas amostras de 30 ml do sangue de cada paciente e as células mononucleares do sanαue periférico foram então isoladas usando-se o meroao ae centniugaçao por graaienic uensiaaae ae Ficoll-Conray, de acordo com o método relatado anteriormente (Nakatsura, T< et ai., Eur. J. ímmunojL. 826-836 (2002)).

(2) Separação das células CD8-positivas e células CD14- positivas das células mononucleares do sangue periférico e indução de células T assassinas

Das células mononucleares de sangue periférico isoladas, células T assassinas foram induzidas pelo método anteriormente relatado (Monji, M. et al., Clin Cancer Res 10, 6047-6057, 2004) . Primeiramente, as células CD8- positivas e as células CD14-positivas foram separadas das células mononucleares do sangue periférico usando-se MACS. As células CD14-positivas foram cultivadas na presença de GM-CSF (100 ng/ml) e IL-4 (20 ng/ml) por 5 dias, para que fosse induzida a diferenciação de células dendriticas. Depois disso, adicionou-se TNF-alfa (20 ng/ml) para maturação. No 7 o dia, cada peptideo GPC3 (10 μM) foi adicionado, sendo então conduzida a co-cultura com células CD8-positivas. Essa estimulação do antigeno com células dendriticas derivadas de células CD14 positivas análogas foi repetida 3 ou 4 vezes cada semana, de modo que fossem induzidas células T assassinas peptideo-especificas. Durante a indução, metade do meio foi trocada pela mesma quantidade de meio novo a cada dois dias e foi adicionado IL-2 em uma concentração de 10 U/ml.

(3) Análise da atividade das células T assassinas GPC3- especificas pelo método ELISPOT

A presença ou ausência de uma célula T que reage confiavelmente e especificamente com o GPC3 e produz INF-y nas células T assassinas induzidas foi examinada pelo método ELISPOT. 0 INF-v foi detectado usando-se o conjunto ELISPOT (BD) para IFN-y assassina (efetora) reage com uma célula estimuladora (alvo) para gerar IFN-y, cada IFN-y è αetectaαo como uma júencna vermelha. Como células alvo, foram usadas células SK-Hep-1 como células genitoras, que são HLA-Az-posiuivas e não expressam GPC3, e células SK-Hep-1/GPC3, nas quais o gene de GPC3 foi introduzido e células SK-Hep-1 para expressar a proteína GPC3. Primeiramente, uma placa ELISPOT 9BD Bioscience) foi recoberta com anticorpo IFN-y anti- humano por 18 horas. Depois disso, foi bloqueada com 10%- FCS/RPMI por 2 horas. As células efetoras (100 μl/pogo) foram misturadas com as células alvo (100 gl/poço) e a mistura foi então cultivada a 37°C por 22 horas. Foi conduzida uma experiência com uma proporção entre efetoras e alvos (proporção E/A) de 5:1. Depois disso, a placa foi lavada com água esterilizada e permitiu-se então que reagisse com um anticorpo IFN-y anti-humano biotinilado por 2 horas e, então, com estreptavidina-HRP por uma hora. Depois disso, manchas positivas de IFN-y foram detectadas com uma solução de substrato. O número de manchas foi contado usando-se um programa de computação para análise automática da MINERVA TECH. Como resultado, a atividade da célula T assassina GPC3-específica pode ser detectada no caso das células T assassinas induzidas pelos peptídeos GPC3 44-52, 144-152, 155-163. Entretanto, a atividade das células T assassinas GPC3-específicas não foi detectada no caso das células T assassinas induzidas por um peptideo GPC3 169-177 (Figuras 1 e 2) . Os resultados analíticos das células T assassinas induzidas por um peptideo GPC3 155-163 são mostrados na Figura 1.

(4) Análise da atividade citotóxica das células T assassinas por teste de citotoxicidade.

A atividade citotóxica das células T assassinas induzidas foi analisada por um teste de citotoxicidade em que foram usadas, como células estimuladas, células SK-Hep- 1 como células genitoras, que são HLA-A2-positivas e não expressam GPC3, e células SK-Hep-l/GPC3, em que o gene de GPC3 foi introduzido em células SK-Hep-1 para expressar a proteína GPC3. A atividade citotóxica das células 1 assassinas foi avaliada por um teste de citotoxicidade em que foi usado Terascan VP. Primeiramente, as células alvo foram rotuladas fluorescentemente com uma solução corante de calceina/AM a 37UC, por 30 minutos, Essas células foram co-cultivadas com células T assassinas em uma placa Coster de meia área com 96 poços e com o passar do tempo foram detectadas as células fluorescentemente rotuladas, medindo- se desse modo o grau de citotoxicidade. A análise foi conduzida usando-se o programa de computação para teste de citotoxicidade CalCt-961 da MINERVA TECH, de acordo com o método de fluorescência. Foi feita uma experiência com a proporção E/A de 20:1. Como resultado, uma atividade citotóxica GPC3-específica foi confirmada nas células T assassinas induzidas pelos peptideos GPC3 44-52, 144-152, e 155-163. Entretanto, não foi observada uma atividade citotóxica GPC3-especifica nas células T assassinas induzidas por um peptideo GPC3 169-177 (Figura 2).

Aplicabilidade Industrial

A eficácia de uma imunoterapia para o câncer que tem como alvo um peptideo GPC3 apresentado por HLA-A24 foi confirmada em uma experiência com animais em que foram usados camundongos. Entretanto, usando-se esses peptideos apresentados por HLA-A24 a células T assassinas, vacinas do peptideo só poderiam ser administradas a 60% da população do Japão. Desta vez, tendo sido identificado um peptideo apresentado a uma célula T por HLA-A2, aproximadamente 85% da população japonesa podem tornar-se alvo da combinação dos dois tipos de vacinas de peptideo. Se a eficácia da terapia experimental com o uso do peptideo apresentado por HLA-A2 a uma célula T assassina for demonstrada, há uma alta probabilidade de que o referido peptideo venha a ser clinicamente aplicado também a caucasianos nos países ocidentais. Além disso, identificando-se um tal peptideo apresentado por HLA-A2 a uma célula T assassina, o peptideo identificado pode não apenas ser aplicado a 40% dos pacientes japoneses que sofrem de carcinoma hepatocelular e melanoma, mas pode ser aplicado também a muitos caucasianos em que a f r eqüênc ia de HLA-A2 é mais alta do que a frequência em japoneses.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 mostra os resultados representativos obtidos pela análise ELISPOT, o IFN-y produzido por células T assassinas, que reconheceram especificamente os peptídeos GPC3 e foram ativadas, Com relação às células T assassinas induzidas estimulando-se células CDβ-positivas no sangue periférico de um paciente com carcinoma hepatocelular por meio de células dendriticas derivadas de monócitos CD14- positivos carregados com um peptideo GPC3 155-163, o número de manchas e a área total das referidas manchas no caso em que células SK-Hep-l/GPC3 nas quais um gene de GPC3 havia sido introduzido em células SK-Hep-1 para expressar a proteína GPC3 foram usadas como células estimuladoras (lado direito da figura) foram significativamente maiores do que o número de manchas e sua área total no caso em que células SK-Hep-l como células genitoras, que eram HLA-A2-positivas e não expressavam GPC3, foram usadas como células estimuladoras (lado esquerdo da figura). Com base nesses resultados, ficou determinado que o peptideo GPC3 155-163 é um peptideo epítopo capaz de induzir células T assassinas GPC3-específicas.

A Figura 2 mostra os resultados da análise ELISPOT e um teste de citotoxicidade. Foram selecionadas células T CD8-positivas do sangue periférico de um paciente com carcinoma hepatocelular HLA-A2-positivo, e as células selecionadas foram então estimuladas por células dendríticas derivadas de monócitos carregados com cada peprídeo GPC3. 0 teste ELISPOT examinou se as células T assassinas obtidas dessa maneira reagiram ou não especificamente com células de expressão de GPC3 e produziram lFN-y. Além disso, um teste de citotoxicidade examinou se as já mencionadas células T assassinas destruíram ou não especificamente as células que expressam GPC3. Foram usadas como células alvo, células SK-Hep-1 como células genitoras, que eram HLA--A2-posit ivas e não expressavam GPC3, e células SK-Hep-1/GPC3 nas .quais o gene de GPC3 havia sido introduzido em células SK-HEP-1 para que expressassem a proteína GPC3. Como resultado, as células T assassinas induzidas pelos peptideos GPC3 44-52, 144-152 e 155-163 reconheceram especificamente as células SK-Hep- 1/GPC3 e produziram IFN-y, e exibiram também uma forte atividade citotóxica. Em contraste, as células T assassinas induzidas por um peptideo GPC3 169-177 não exibiram uma atividade GPC3-específica. Com base nesses resultados, ficou demonstrado que os peptideos GPC3 44-52, 144-152, e 155-163 são peptideos epítopos capazes de induzir células T assassinas GPC3~específicas.

Claims

1. Indutor imunológico usado para cânceres, caracterizado por compreender um peptídeo que consiste na sequência de aminoácidos selecionada do grupo identificado na SEQ ID NOS: 1 a 3 e um adjuvante selecionado do adjuvante de Freund incompleto, BCG, dimicolato de trealose (TDM), lipopolissacarídeo (LPS), adjuvante de alumínio e adjuvante de sílica.

2. Produto farmacêutico para tratamento e / ou prevenção de tumores, caracterizado por compreender um peptídeo que consiste na sequência de aminoácidos selecionada do grupo identificado na SEQ ID NOS: 1 a 3 e um adjuvante selecionado do adjuvante de Freund incompleto, BCG, dimicolato de trealose (TDM), lipopolissacarídeo (LPS), adjuvante de alumínio e adjuvante de sílica.

3. Agente para induzir células apresentadoras de antígenos com alta capacidade de induzir células T reativas a tumores, caracterizado por compreender um peptídeo que consiste na sequência de aminoácidos selecionada do grupo identificado na SEQ ID NOS: 1 a 3 e um adjuvante selecionado do adjuvante de Freund incompleto, BCG, dimicolato de trealose (TDM), lipopolissacarídeo (LPS), adjuvante de alumínio e adjuvante de sílica.

4. Agente para indução de células T reativas ao tumor, caracterizado por compreender um peptídeo que consiste na sequência de aminoácidos selecionada do grupo identificada na SEQ ID NOS: 1 a 3 e um adjuvante selecionado do adjuvante de Freund incompleto, BCG, dimicolato de trealose (TDM), lipopolissacarídeo (LPS), adjuvante de alumínio e adjuvante de sílica.