BRPI0823004A2 - process for preparing insulin compounds - Google Patents
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Abstract
PROCESSO PARA PREPARAçãO DE COMPOSTOS DE INSULINA. A presente invenção se relaciona à preparação de compostos de insulina incluindo seus análogos ou derivados de suas formas precursoras correspondentes por uma reação enzimática de uma etapa envolvendo 'o uso combinatório e concorrente de quantidades ótimas de tripsina e carboxipeptidase B que trabalham de forma sinérgica direcionando a reação de forma controlada para evitar a produção de subprodutos aleatórios indesejáveis. Particularmente, as reações de conversão enzimática da invenção oferecem vantagens de redução no número de etapas operacionais, maior rendimento e pureza dos produtos finais desejados.PROCESS FOR PREPARING INSULIN COMPOUNDS. The present invention relates to the preparation of insulin compounds including their analogs or derivatives of their corresponding precursor forms by a one-step enzymatic reaction involving the combinatorial and concurrent use of optimal amounts of trypsin and carboxypeptidase B that work synergistically targeting controlled reaction to avoid the production of unwanted random by-products. In particular, the enzymatic conversion reactions of the invention offer advantages in reducing the number of operational steps, greater yield and purity of the desired end products.
Description
PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS DE INSULINAPROCESS FOR PREPARATION OF INSULIN COMPOUNDS
ÁREA DA INVENÇÃOINVENTION AREA
A presente invenção se relaciona à preparação de compostos de insulina incluindo seus análogos ou derivados de suas formas precursoras correspondentes por uma reação enzimática de uma etapa envolvendo o uso combinatório e concorrente de quantidades ótimas de tripsina e carboxipeptidase B que trabalham de forma sinérgica direcionando a reação de forma controlada para evitar a produção de subprodutos aleatórios indesejáveis. Particularmente, as reações de conversão enzimática da invenção oferecem vantagens de redução no número de etapas operacionais, maior rendimento e pureza dos produtos finais desejados.The present invention relates to the preparation of insulin compounds including analogues or derivatives of their corresponding precursor forms by a one-step enzymatic reaction involving the combinatorial and concurrent use of optimal amounts of trypsin and carboxypeptidase B which work synergistically directing the reaction. in a controlled manner to avoid the production of unwanted random by-products. Particularly, the enzyme conversion reactions of the invention offer advantages of reduction in the number of operating steps, higher yield and purity of the desired end products.
ANTECEDENTES E MODELOS ANTERIORMENTE CONHECIDOS DA INVENÇÃOBACKGROUND AND PREVIOUSLY KNOWN MODELS OF THE INVENTION
Os métodos de engenharia genética estão cada vez mais permitindo que formas precursoras de insulina se expressem em microorganismos (EP-A-347 781, EP-A-367 163). As seqüências pró e pré são normalmente clivadas química e/ou enzimaticamente (DE-P-3 440 988, EP-A-0264250). Os métodos conhecidos de conversão enzimática se baseiam em clivagem com tripsina e carboxipeptidase B (Kemmler W. et al. J. Biol. Chem., 246 (1971) 6786-6791; EP-A-195 691; EP-B- 89007). No processo típico de conversão da molécula precursora de insulina para a molécula correspondente, o peptídio ligador entre as cadeias A e B é removido. A reação enzimática com tripsina é uma reação enzimática e complexa que cliva não apenas as ligações de peptídio cuja clivagem produz insulina humana ou os produtos finais desejados mas também, em uma reação concorrente, a clivagem em outros locais suscetíveis produz uma diversidade de subprodutos indesejáveis.Genetic engineering methods are increasingly allowing precursor forms of insulin to express themselves in microorganisms (EP-A-347 781, EP-A-367 163). The pro and pre sequences are usually chemically and / or enzymatically cleaved (DE-P-3,440,988, EP-A-0264250). Known methods of enzyme conversion are based on cleavage with trypsin and carboxypeptidase B (Kemmler W. et al. J. Biol. Chem., 246 (1971) 6786-6791; EP-A-195 691; EP-B-89007) . In the typical process of converting the insulin precursor molecule to the corresponding molecule, the linker peptide between chains A and B is removed. The enzymatic reaction with trypsin is a complex enzymatic reaction that cleaves not only the peptide bonds whose cleavage produces human insulin or the desired end products but also, in a concurrent reaction, cleavage at other susceptible sites produces a variety of undesirable byproducts.
Métodos de modelos anteriormente conhecidos incluem o uso de tripsina e uma segunda enzima carboxipeptidase de tal maneira que a segunda enzima carboxipeptidase é acrescentada quando o intermediário necessário será formado na reação. A desvantagem desses métodos é a formação de grandes quantidades de subprodutos de impurezas que só podem ser removidos da solução de reação com dificuldade. No caso particular da conversão da forma precursora humana em insulina humana (insulina humana, Hl), há a formação de grandes quantidades de des-Thr-(B30)-insulina humana (des-Thr(B30)-HI).Previously known model methods include the use of trypsin and a second carboxypeptidase enzyme such that the second carboxypeptidase enzyme is added when the required intermediate will be formed in the reaction. The disadvantage of these methods is the formation of large amounts of impurities by-products that can only be removed from the reaction solution with difficulty. In the particular case of the conversion of the human precursor form to human insulin (human insulin, H1), large amounts of human des-Thr- (B30) -insulin (des-Thr (B30) -HI) are formed.
Pelo que se viu acima, fica evidente que seria vantajoso seguir um processo de reação enzimática mais simples para a clivagem de compostos de insulina precursores, seus análogos e derivados de insulina através de uma etapa muito mais simples que remova as possíveis formações de impurezas poliméricas da forma mais completa possível e, ao mesmo tempo, aumente a concentração do produto final desejado de insulina o máximo possível. Uma condição adicional é a necessidade garantir um alto rendimento geral aumentando a facilidade de operação, qualidade bem como a quantidade do produto final desejado.From the above, it is apparent that it would be advantageous to follow a simpler enzymatic reaction process for cleavage of precursor insulin compounds, their analogs and insulin derivatives through a much simpler step that removes possible polymeric impurity formations from the enzyme. as complete as possible and at the same time increase the concentration of the desired final insulin product as much as possible. An additional condition is the need to ensure high overall throughput by increasing ease of operation, quality as well as quantity of the desired end product.
As desvantagens dos processos conhecidos foram solucionadas pelas reações enzimáticas realizadas nesta invenção, e resultou que o aumento no rendimento sem subprodutos desejados é relativo à concentração ótima de tripsina e carboxipeptidase usada sob condições de reação conducentes. Os inventores se esforçaram para desenvolver um processo aperfeiçoado de reação enzimática de uma etapa envolvendo o uso combinatório e concorrente de quantidades ótimas de tripsina e carboxipeptidase B que trabalham sinergicamente para fornecer os produtos finais desejados, aumentando a facilidade de operação, pureza e rendimento dos produtos finais.The disadvantages of the known processes were solved by the enzymatic reactions performed in this invention, and it was found that the increase in yield without desired byproducts is relative to the optimal concentration of trypsin and carboxypeptidase used under conducive reaction conditions. The inventors strove to develop an improved one-step enzymatic reaction process involving the concurrent and combinatorial use of optimal amounts of trypsin and carboxypeptidase B that work synergistically to provide the desired end products, enhancing product ease of operation, purity and yield. finals.
OBJETIVOS DA INVENÇÃOOBJECTIVES OF THE INVENTION
O principal objetivo da presente invenção é obter um processo para preparação de compostos de insulina e seus análogos ou derivados de seus precursores correspondentes com a mínima formação de subprodutos indesejados que seja habilitado por uma reação enzimática de uma etapa envolvendo o uso combinatório e concorrente de tripsina e carboxipeptidase B trabalhando sinergicamente para fornecer os produtos finais desejados.The main object of the present invention is to obtain a process for the preparation of insulin compounds and their analogues or derivatives of their corresponding precursors with the minimum formation of undesired by-products that is enabled by a one step enzymatic reaction involving the combined and concurrent use of trypsin. and carboxypeptidase B working synergistically to provide the desired end products.
Outro principal objetivo da presente invenção é fornecer um precursor análogo de insulina como representado pelo SEQ IDs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 e que possa ser usado como material iniciador. Tais precursores podem ser em forma de líquido ou de cristal.Another major object of the present invention is to provide an insulin analog precursor as represented by SEQ IDs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8 and which may be used as a starting material. Such precursors may be in liquid or crystal form.
Outro objetivo da presente invenção é fornecer um vetor de expressão para a expressão de pró-insulina e seus análogos ou derivados que inclua a seqüência de DNA respectiva que codifique a molécula precursora.Another object of the present invention is to provide an expression vector for the expression of proinsulin and its analogs or derivatives that includes the respective DNA sequence encoding the precursor molecule.
Outro objetivo da presente invenção é fornecer um microorganismo/hospedeiro adequado que seja transformado com tal vetor de expressão e posteriormente forneça um processo para preparar os compostos de insulina respectivos, que inclua a cultura de tal microorganismo transformado em um meio de fermentação e condições de fermentação adequadas para produzir as formas precursoras de insulina.Another object of the present invention is to provide a suitable microorganism / host that is transformed with such an expression vector and further provides a process for preparing the respective insulin compounds, which includes culturing such transformed microorganism in a fermentation medium and fermentation conditions. suitable for producing the precursor forms of insulin.
Outro objetivo da presente invenção inclui o método de converter as formas precursoras de compostos de insulina para as suas respectivas formas ativas através de uma reação enzimática de uma etapa em que a tripsina e a carboxipeptidase são acrescentadas juntas em quantidades ótimas que permitam uma reação sinérgica e controlada minimizando a produção de produtos finais indesejáveis.Another object of the present invention includes the method of converting the precursor forms of insulin compounds to their respective active forms by a one-step enzymatic reaction in which trypsin and carboxypeptidase are added together in optimal amounts to allow a synergistic reaction. controlled by minimizing the production of unwanted end products.
Outro objetivo da presente invenção é obter um processo para obter insulina ou seus análogos ou derivados de seus respectivos correspondentes precursores incluindo a realização sucessiva das etapas em ordem seqüencial.Another object of the present invention is to obtain a process for obtaining insulin or its analogs or derivatives of their respective precursors including successive carrying out of the steps in sequential order.
Outro objetivo da presente invenção é obter uma molécula de insulina.Another object of the present invention is to obtain an insulin molecule.
Outro objetivo da presente invenção é obter uma molécula de insulina selecionada do grupo contendo insulina, lispro, asparte, glulisina ou IN-105.Another object of the present invention is to obtain an insulin molecule selected from the group containing insulin, lispro, asparte, glulisine or IN-105.
DECLARAÇÃO DA INVENÇÃODECLARATION OF INVENTION
Assim, a presente invenção se relaciona a um processo para preparação de compostos de insulina e seus análogos ou derivados de seus precursores correspondentes, o que inclui o tratamento de tal precursor com tripsina e carboxipeptidase usados de forma combinatória e concorrente, contanto que a proporção de concentração de tripsina em relação à carboxipeptidase seja de certa de 5:1 a cerca de 50:1; um processo para obter insulina ou seus análogos ou derivados de seus precursores correspondentes incluindo a realização sucessiva das seguintes etapas na seguinte ordem seqüencial (a) dissolver a quantidade ótima do precursor de insulina ou derivado de insulina em uma solução tampão; (b) preparar várias alíquotas da solução precursora em faixas de pH de aproximadamente 7,0 a 9,0; (c) introduzir as enzimas tripsina e carboxipeptidase de forma concorrente às várias alíquotas preparadas na Etapa (b) e incubar a mistura por aproximadamente 4 a 10 horas; (d) precipitar o produto desejado de insulina pela adição de tampão de ácido cítrico e ZnCI2; uma molécula de insulina preparada e uma molécula de insulina do grupo incluindo insulina, lispro, asparte, glulisina ou IN-105,Thus, the present invention relates to a process for preparing insulin compounds and their analogs or derivatives of their corresponding precursors, which includes treating such a precursor with combinatorial and concurrently used trypsin and carboxypeptidase, provided that the proportion of trypsin concentration relative to carboxypeptidase is from about 5: 1 to about 50: 1; a process for obtaining insulin or its analogs or derivatives of their corresponding precursors including successively performing the following steps in the following sequential order (a) dissolving the optimal amount of the insulin precursor or insulin derivative in a buffer solution; (b) preparing various aliquots of the precursor solution in pH ranges from approximately 7.0 to 9.0; (c) introducing trypsin and carboxypeptidase enzymes concurrently with the various aliquots prepared in Step (b) and incubating the mixture for approximately 4 to 10 hours; (d) precipitating the desired insulin product by adding buffer of citric acid and ZnCl2; a prepared insulin molecule and an insulin molecule of the group including insulin, lispro, asparte, glulisine or IN-105,
BREVE DESCRIÇÃO DAS LISTAS ACOMPANHANTES DE SEQÜÊNCIA SEQ ID 1: Seqüência de aminoácidos da molécula precursora de Asparte. SEQ ID 2: Seqüência de aminoácidos da molécula precursora de Asparte. SEQ ID 3: Seqüência de aminoácidos da molécula precursora de Asparte. SEQ ID 4: Seqüência de aminoácidos da molécula precursora de Lispro. SEQ ID 5: Seqüência de aminoácidos da molécula precursora de Lispro. SEQ ID 6: Seqüência de aminoácidos da molécula precursora de Lispro. SEQ ID 7: Seqüência de aminoácidos da molécula precursora de Glulisina. SEQ ID 8: Seqüência de aminoácidos da molécula precursora de Glulisina. SEQ ID 9: Seqüência de aminoácidos da molécula precursora de Glulisina.BRIEF DESCRIPTION OF ACCOMPANYING SEQUENCE LISTS SEQ ID 1: Amino acid sequence of the Asparte precursor molecule. SEQ ID 2: Amino acid sequence of the Asparte precursor molecule. SEQ ID 3: Amino acid sequence of the Asparte precursor molecule. SEQ ID 4: Amino acid sequence of the Lispro precursor molecule. SEQ ID 5: Amino acid sequence of Lispro precursor molecule. SEQ ID 6: Amino acid sequence of the Lispro precursor molecule. SEQ ID 7: Amino acid sequence of Glulisine precursor molecule. SEQ ID 8: Amino acid sequence of Glulisine precursor molecule. SEQ ID 9: Amino acid sequence of Glulisine precursor molecule.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃODETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
A presente invenção se relaciona a um processo de preparação de compostos de insulina e seus análogos ou derivados de seus precursores correspondentes representado pela fórmula:The present invention relates to a process for preparing insulin compounds and their analogs or derivatives of their corresponding precursors represented by the formula:
<formula>formula see original document page 6</formula><formula> formula see original document page 6 </formula>
onde,Where,
Ré hidrogênio ou um resíduo de aminoácido química ou enzimaticamente clivável ou um peptídio química ou enzimaticamente clivável incluindo pelo menos dois resíduos de aminoácido.R is hydrogen or a chemically or enzymatically cleavable amino acid residue or a chemically or enzymatically cleavable peptide comprising at least two amino acid residues.
Ri é OH ou um resíduo de aminoácido, ou Y1-Y2 no qual Y é um resíduo de aminoácido.R1 is OH or an amino acid residue, or Y1-Y2 wherein Y is an amino acid residue.
As metades A1 a A21 correspondem à cadeia de insulina e as metades B1 a Β27 correspondem à cadeia de insulina B incluindo substituição, exclusão e/ou adições de aminoácido.Halves A1 to A21 correspond to the insulin chain and halves B1 to Β27 correspond to the insulin chain B including amino acid substitution, deletion and / or additions.
R2 é Z1-Z2 onde Zi é selecionado de Pro1 Lys, Asp e Z2 é selecionado de Lys ou Pro ou Glu ou Zi-Z2-Z3 onde Zi é selecionado de Pro1 Lys1 Asp e Z2 é selecionado de Lys ou Pro ou Glu e Z3 é treonina ou uma metade de peptídio de pelo menos três resíduos de aminoácido com a condição de que o aminoácido correspondente a B30 is treonina.R2 is Z1-Z2 where Zi is selected from Pro1 Lys, Asp and Z2 is selected from Lys or Pro or Glu or Zi-Z2-Z3 where Zi is selected from Pro1 Lys1 Asp and Z2 is selected from Lys or Pro or Glu and Z3 is threonine or a peptide half of at least three amino acid residues with the proviso that the amino acid corresponding to B30 is threonine.
X é um polipeptídio que conecta a cadeia A à cadeia B1 que pode ser clivado enzimaticamente sem perturbar a cadeia A ou a cadeia B contendo pelo menos dois aminoácidos onde o primeiro e o último aminoácido é Iisina ou arginina.X is a polypeptide that connects chain A to chain B1 that can be enzymatically cleaved without disrupting chain A or chain B containing at least two amino acids where the first and last amino acid is lysine or arginine.
O que inclui o tratamento de tal precursor com tripsina e carboxipeptidase usados de forma combinatória e concorrente, contanto que a proporção de concentração de tripsina em relação à carboxipeptidase seja de cerca de 5:1 a 50:1.This includes treating such precursor with trypsin and carboxypeptidase in a combinatorial and concurrent manner, provided that the ratio of trypsin concentration to carboxypeptidase is about 5: 1 to 50: 1.
Em outra configuração da presente invenção, a respectiva molécula precursora inclui uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 85% homóloga à seqüência de aminoácidos como especificada em SEQ IDs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9.In another embodiment of the present invention, the respective precursor molecule includes an amino acid sequence that is at least 85% homologous to the amino acid sequence as specified in SEQ IDs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 and 9.
Em outra configuração da presente invenção a quantidade relativa de tripsina em relação à do precursor de insulina fica na faixa de 1:10 a 1:500 aproximadamente.In another embodiment of the present invention the relative amount of trypsin relative to that of the insulin precursor is in the range of approximately 1:10 to about 1: 500.
Em outra configuração da presente invenção a quantidade relativa de tripsina em relação à do precursor de insulina é de cerca de 1:100.In another embodiment of the present invention the relative amount of trypsin relative to that of the insulin precursor is about 1: 100.
Em outra configuração da presente invenção a quantidade relativa de carboxipeptidase em relação à do precursor de insulina é de cerca de 1:500.In another embodiment of the present invention the relative amount of carboxypeptidase relative to that of the insulin precursor is about 1: 500.
Em outra configuração da presente invenção a proporção da concentração de tripsina em relação à de carboxipeptidase é de 5:1 a 50:1 aproximadamente. Em outra configuração da presente invenção a proporção da concentração de tripsina em relação à de carboxipeptidase é de 5:1 aproximadamente.In another embodiment of the present invention the ratio of trypsin to carboxypeptidase concentration is from about 5: 1 to about 50: 1. In another embodiment of the present invention the ratio of trypsin to carboxypeptidase concentration is approximately 5: 1.
Em outra configuração da presente invenção a concentração de tripsina usada para a reação de conversão é de pelo menos 0,01 mg/mlIn another embodiment of the present invention the trypsin concentration used for the conversion reaction is at least 0.01 mg / ml.
Em outra configuração da presente invenção a concentração de carboxipeptidase usada para a reação de conversão é de pelo menos 0,001 mg/mlIn another embodiment of the present invention the concentration of carboxypeptidase used for the conversion reaction is at least 0.001 mg / ml.
Em outra configuração da presente invenção o precursor está em forma de líquido ou de cristal.In another embodiment of the present invention the precursor is in liquid or crystal form.
Em outra configuração da presente invenção a reação de conversão é realizada a um pH de 6,5 a 10.In another embodiment of the present invention the conversion reaction is performed at a pH of 6.5 to 10.
Em outra configuração da presente invenção a reação de conversão é realizada a um pH de 7 a 9.In another embodiment of the present invention the conversion reaction is performed at a pH of 7 to 9.
Em outra configuração da presente invenção a reação de conversão é realizada a uma faixa de temperatura de 2°C a 40°C.In another embodiment of the present invention the conversion reaction is performed at a temperature range of 2 ° C to 40 ° C.
Em outra configuração da presente invenção a reação de conversão a duração da reação de conversão enzimática é de 2 a 24 horas.In another embodiment of the present invention the conversion reaction the duration of the enzyme conversion reaction is from 2 to 24 hours.
Em outra configuração da presente invenção o meio de reação contém pelo menos 30% de água ou solvente miscível em água.In another embodiment of the present invention the reaction medium contains at least 30% water or water miscible solvent.
Em outra configuração da presente invenção o solvente miscível em água é selecionado do grupo incluindo metanol, etanol, acetona ou N,N-dimetilformamida.In another embodiment of the present invention the water miscible solvent is selected from the group including methanol, ethanol, acetone or N, N-dimethylformamide.
Em outra configuração da presente invenção o meio de reação inclui ainda um sal que age como agente tamponador.In another embodiment of the present invention the reaction medium further includes a salt which acts as a buffering agent.
Em outra configuração da presente invenção o sal é selecionado do grupo incluindo TRIS, etilenadiamina, trietanolamina, glicina, HEPES (Ν-2-hidróxi- etilpiperazina-N'-2-ácido etanossulfônico). Em outra configuração da presente invenção a concentração de sal usado no meio de reação é de 10mM a 1M aproximadamente.In another embodiment of the present invention the salt is selected from the group including TRIS, ethylenediamine, triethanolamine, glycine, HEPES (β-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid). In another embodiment of the present invention the concentration of salt used in the reaction medium is from about 10mM to about 1M.
Em outra configuração da presente invenção a concentração de sal usado no meio de reação é de cerca de 0,6M.In another embodiment of the present invention the concentration of salt used in the reaction medium is about 0.6M.
A presente invenção se relaciona a um processo para obter insulina ou seusThe present invention relates to a process for obtaining insulin or its
análogos ou derivados de seus respectivos correspondentes precursores incluindo a realização sucessiva das seguintes etapas na seguinte ordem seqüencial (a) Dissolver uma quantidade ótima do precursor de insulina ou derivado de insulina em uma solução tampão.analogs or derivatives of their corresponding precursors including successively performing the following steps in the following sequential order (a) Dissolve an optimal amount of the insulin precursor or insulin derivative in a buffer solution.
(b) Preparar várias alíquotas da solução precursora em faixas de pH de aproximadamente 7,0 a 9,0.(b) Prepare several aliquots of the precursor solution in pH ranges from approximately 7.0 to 9.0.
(c) introduzir as enzimas tripsina e carboxipeptidase de forma concorrente às várias alíquotas preparadas na Etapa (b) e incubar a mistura por aproximadamente 4 a 10 horas.(c) introducing trypsin and carboxypeptidase enzymes concurrently with the various aliquots prepared in Step (b) and incubating the mixture for approximately 4 to 10 hours.
(d) Precipitar o produto desejado de insulina pela adição de tampão de ácido cítrico e ZnCl2.(d) Precipitate the desired insulin product by the addition of citric acid buffer and ZnCl2.
A presente invenção se relaciona a uma molécula de insulina preparada de acordo com qualquer das reivindicações anteriores.The present invention relates to an insulin molecule prepared according to any preceding claim.
A presente invenção se relaciona a uma molécula de insulina preparada de acordo com qualquer das reivindicações anteriores selecionada do grupo contendo insulina, lispro, asparte, glulisina ou IN-105.The present invention relates to an insulin molecule prepared according to any preceding claim selected from the group containing insulin, lispro, asparte, glulisine or IN-105.
Agora será feita referência detalhada às configurações atualmente preferidas da invenção, as quais, juntamente com o exemplo a seguir, servem para explicar os princípios da invenção.Detailed reference will now be made to the presently preferred embodiments of the invention which, together with the following example, serve to explain the principles of the invention.
Ao descrever e reivindicar a presente invenção será usada a seguinte terminologia de acordo com as definições aqui especificadas.In describing and claiming the present invention the following terminology will be used in accordance with the definitions specified herein.
A menos que aqui definido de outra forma, termos científicos e técnicos usados em ligação com a presente invenção terão os significados comumente entendidos pelas pessoas de conhecimento normal do ofício. Além disso, a menos que exigido de outra forma pelo contexto, expressões no singular incluem o plural e expressões no plural incluem o singular. Os métodos e técnicas da presente invenção são normalmente realizados de acordo com os métodos convencionais bem conhecidos no ofício. Em geral, as nomenclaturas vinculadas e técnicas aqui descritas são as bem conhecidas e comumente utilizadas no ofício. Os métodos e técnicas da presente invenção são normalmente realizados de acordo com os métodos convencionais bem conhecidos no ofício.Unless otherwise defined herein, scientific and technical terms used in connection with the present invention will have the meanings commonly understood by those of ordinary skill in the art. In addition, unless otherwise required by context, singular expressions include the plural and plural expressions include the singular. The methods and techniques of the present invention are usually performed according to conventional methods well known in the art. In general, the linked and technical nomenclatures described herein are those well known and commonly used in the art. The methods and techniques of the present invention are usually performed according to conventional methods well known in the art.
Da forma usada aqui, "aminoácido" se refere a seqüências de peptídios ou proteínas ou partes delas. Os termos "proteína", "peptídio" e "polipeptídio" são usados de forma intercambiável.As used herein, "amino acid" refers to sequences of peptides or proteins or parts thereof. The terms "protein", "peptide" and "polypeptide" are used interchangeably.
O termo "insulina" aqui abrange a insulina de qualquer espécie, como insulina suína, bovina e humana e complexos destas, tais como complexos de zinco incluindo dímeros e oligômeros, por exemplo, hexâmeros destes. Além disso, o termo "insulina" aqui também inclui os chamados "análogos de insulina". Um análogo de insulina é uma molécula de insulina contendo uma ou mais mutações, substituições, exclusões e/ou adições das cadeias de aminoácido A e/ou B em relação à molécula de insulina humana nativa. Mais especificamente um ou mais dos resíduos de aminoácido podem ter sido trocados com outro resíduo de aminoácido e/ou um ou mais resíduos de aminoácido podem ter sido excluídos e/ou um ou dois resíduos de aminoácido podem ter sido acrescentados, com a condição deque tal análogo de insulina tenha uma atividade de insulina suficiente. Os análogos de insulina são, de preferência, aqueles em que um ou mais dos resíduos de aminoácido de ocorrência natural, de preferência um, dois ou três, tenham sido substituídos por um resíduo de aminoácido codificável. Exemplos de análogos de insulina são descritos nas seguintes patentes e equivalentes. US 5,618,913, EP 254,516, EP 280,534, US 5,750,497 e US 6,01 1 ,007. Exemplos de análogos específicos de insulina são a insulina asparte (isto é, insulina humana AspB28) e a insulina Iispro (isto é, insulina humana LysB28, ProB29) e a "insulina glulisina" (insulina humana Lys B(3), Glu B(29)).The term "insulin" herein encompasses insulin of any species, such as porcine, bovine and human insulin and complexes thereof, such as zinc complexes including dimers and oligomers, for example hexamers thereof. In addition, the term "insulin" herein also includes so-called "insulin analogues". An insulin analogue is an insulin molecule containing one or more mutations, substitutions, deletions and / or additions of amino acid chains A and / or B relative to the native human insulin molecule. More specifically one or more amino acid residues may have been exchanged with another amino acid residue and / or one or more amino acid residues may have been deleted and / or one or two amino acid residues may have been added, provided that insulin analogue has sufficient insulin activity. Insulin analogs are preferably those wherein one or more of the naturally occurring amino acid residues, preferably one, two or three, have been replaced by an encodable amino acid residue. Examples of insulin analogues are described in the following patents and equivalents. US 5,618,913, EP 254,516, EP 280,534, US 5,750,497 and US 6,01,007. Examples of specific insulin analogues are asparte insulin (ie AspB28 human insulin) and Iispro insulin (ie LysB28 human insulin, ProB29) and "insulin glulisine" (Lys B (3) human insulin, Glu B ( 29)).
Um aspecto da invenção se relaciona aos compostos precursores de insulina representados pela seguinte fórmula:One aspect of the invention relates to the insulin precursor compounds represented by the following formula:
<formula>formula see original document page 11</formula><formula> formula see original document page 11 </formula>
onde,Where,
R é hidrogênio ou um resíduo de aminoácido química ou enzimaticamente clivável ou um peptídio química ou enzimaticamente clivável incluindo pelo menos dois resíduos de aminoácido.R is hydrogen or a chemically or enzymatically cleavable amino acid residue or a chemically or enzymatically cleavable peptide comprising at least two amino acid residues.
R1 é OH ou um resíduo de aminoácido, ou Y1-Y2 no qual Y é um resíduo de aminoácido.R1 is OH or an amino acid residue, or Y1-Y2 wherein Y is an amino acid residue.
As metades A1 a A21 correspondem à cadeia de insulina e as metades B1 a B27 correspondem à cadeia de insulina B incluindo substituição, exclusão e/ou adições de aminoácido. R2 é Z1-Z2 onde Z1 é selecionado de Pro1 Lys1 Asp e Z2 é selecionado de Lys ou Pro ou Glu ou Z1-Z2-Z3 onde Z1 é selecionado de Pro1 Lys1 Asp e 72 è selecionado de Lys ou Pro ou Glu e Z3 é treonina ou uma metade de peptídio de pelo menos três resíduos de aminoácido com a condição de que o aminoácido correspondente a B30 is treonina.Halves A1 to A21 correspond to the insulin chain and halves B1 to B27 correspond to the insulin chain B including amino acid substitution, deletion and / or additions. R2 is Z1-Z2 where Z1 is selected from Pro1 Lys1 Asp and Z2 is selected from Lys or Pro or Glu or Z1-Z2-Z3 where Z1 is selected from Pro1 Lys1 Asp and 72 is selected from Lys or Pro or Glu and Z3 is threonine or a peptide half of at least three amino acid residues provided that the amino acid corresponding to B30 is threonine.
X é um polipeptídio que conecta a cadeia A à cadeia B1 que pode ser clivado enzimaticamente sem perturbar a cadeia A ou a cadeia B contendo pelo menos dois aminoácidos onde o primeiro e o último aminoácido é Iisina ou arginina.X is a polypeptide that connects chain A to chain B1 that can be enzymatically cleaved without disrupting chain A or chain B containing at least two amino acids where the first and last amino acid is lysine or arginine.
Um aspecto da presente invenção se relaciona especificamente com a molécula IN-105. IN-105 é uma molécula de insulina conjugada no aminoácido épsilon Lisina na posição B29 da cadeia B de insulina com um oligômero anfifílico de fórmula estrutural CH30-(C4H20)3-CH2-CH2-C00H. A molécula pode ser monoconjugada em A1, B1 e B29, diconjugada em várias combinações de A1, B1 e B29 ou triconjugadas em várias combinações de A1, B1 e B29.One aspect of the present invention relates specifically to the IN-105 molecule. IN-105 is an insulin molecule conjugated to the amino acid epsilon Lysine at position B29 of the insulin B chain with an amphiphilic oligomer of the formula CH30- (C4H20) 3-CH2-CH2-C00H. The molecule may be monoconjugated at A1, B1 and B29, diconjugated into various combinations of A1, B1 and B29 or triconjugated into various combinations of A1, B1 and B29.
Em um aspecto, a molécula precursora de insulina isolada que inclui uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de seqüência de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 81% de identidade de seqüência de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 82% de identidade de seqüência de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 83% de identidade de seqüência de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 84% de identidade de seqüência de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüência de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 86% de identidade de seqüência de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 87% de identidade de seqüência de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 88% de identidade de seqüência de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 89% de identidade de seqüência de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 90% de identidade de seqüência de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 91% de identidade de seqüência de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 92% de identidade de seqüência de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 93% de identidade de seqüência de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 94% de identidade de seqüência de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 95% de identidade de seqüência de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 96% de identidade de seqüência de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 97% de identidade de seqüência de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 98% de identidade de seqüência de ácido nucleico e alternativamente pelo menos cerca de 99% de identidade de seqüência de ácido nucleico para uma molécula de polipeptídio como representada pela SEQ IDs 1, 2, 3, 4, 5 e 6;In one aspect, the isolated insulin precursor molecule that includes an amino acid sequence with at least 80% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 81% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 82%. % nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 83% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 84% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 85% sequence identity nucleic acid, alternatively at least about 86% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 87% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 88% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 89% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 90% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 91% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 92% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 93 % nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 94% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 95% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 96% sequence identity nucleic acid sequence, alternatively at least about 97% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 98% nucleic acid sequence identity and alternatively at least about 99% nucleic acid sequence identity for a polypeptide molecule as represented by SEQ IDs 1, 2, 3, 4, 5 and 6;
Tripsina é uma típica protease de serina e hidrolisa uma proteína ou um peptídio no terminal de carboxila de um resíduo de arginina ou Iisina (Enzymes, pp 261-262(1979), ed. Dixon, M. & Webb, E. C., Longman Group Ltd., Londres). Em particular, a hidrólise fácil ocorre em um local bibásico onde existem dois resíduos sucessivos de arginina ou lisina, e é sabido que a hidrólise ocorre mais rapidamente nos casos em que o local bibásico se localiza dentro ou próximo a uma estrutura β- volta (Rholam, M., et al. FEBS Lett., 207, 1-6(1986).The Enzyme Vol. II, 3a Edição, Editor Boyer, Acad. Press NY. Pp. 249-275). Em particular a tripsina cliva as ligações de peptídio nos resíduos de arginina (Arg) ou lisina (Lys) do terminal C. A clivagem tríptica das moléculas precursoras de insulina pode ocorrer simultaneamente em diferentes locais de clivagem. Em razão dos muitos lados de clivagem dentro de uma molécula precursora de insulina específica, muitos produtos colaterais indesejáveis podem se formar durante a reação de clivagem tríptica.Trypsin is a typical serine protease and hydrolyzes a carboxyl-terminal protein or peptide from an arginine or lysine residue (Enzymes, pp 261-262 (1979), ed. Dixon, M. & Webb, EC, Longman Group Ltd ., London). In particular, easy hydrolysis occurs at a bibasic site where there are two successive arginine or lysine residues, and hydrolysis is known to occur more rapidly in cases where the bibasic site is located within or near a β-loop structure (Rholam , M., et al., FEBS Lett., 207, 1-6 (1986) .The Enzyme Vol. II, 3rd Edition, Boyer Editor, Acad. Press NY (pp. 249-275). In particular trypsin cleaves the peptide bonds at the C-terminal arginine (Arg) or lysine (Lys) residues. The tryptic cleavage of insulin precursor molecules can occur simultaneously at different cleavage sites. Because of the many cleavage sides within a specific insulin precursor molecule, many undesirable side products may form during the tryptic cleavage reaction.
A tripsina pancreática suína recombinante tem um peso molecular de cerca de 23.000 dáltons e uma atividade enzimática ótima a um pH 8.0 A tripsina é usada no processo industrial de produção de insulina e análogos de insulina. A produção dessas biomoléculas é descrita na literatura e foram escolhidas várias abordagens.Recombinant porcine pancreatic trypsin has a molecular weight of about 23,000 Daltons and an optimal enzymatic activity at pH 8.0. Trypsin is used in the industrial process of producing insulin and insulin analogues. The production of these biomolecules is described in the literature and several approaches were chosen.
A carboxipeptidase B preferencialmente hidrolisa os aminoácidos básicos lisina, arginina e ornitina da posição terminal C de polipeptídios. A carboxipeptidase B é uma exopeptidase que catalisa uma liberação hidrolítica dos resíduos de aminoácido básicos de terminal C de arginina e lisina de peptídios e proteínas.Carboxypeptidase B preferably hydrolyses the basic amino acids lysine, arginine and ornithine from the C-terminal position of polypeptides. Carboxypeptidase B is an exopeptidase that catalyzes a hydrolytic release of the C-terminal basic amino acid residues of arginine and lysine from peptides and proteins.
A expressão "peptídio C" ou "peptídio ligador" da forma aqui utilizada inclui todas as formas de peptídio C de insulina, incluindo peptídios nativos ou sintéticos. Tais peptídios C de insulina podem ser peptídios humanos, ou podem ser de espécies e gêneros animais, de preferência mamíferos. Assim, as variantes e modificações do peptídio C de insulina nativo são incluídas contanto que retenham a atividade de peptídio C de insulina. Sabe-se no ofício como modificar as seqüências de proteínas ou peptídios retendo sua atividade útil, e isso pode ser obtido usando- se técnicas que são padrão no ofício e amplamente descritas na literatura, por exemplo, mutagênese aleatória ou direcionada ao local, clivagem e ligação de ácidos nucleicos, etc. Assim, variantes funcionalmente equivalentes ou derivados de seqüências de peptídio C de insulina nativa podem ser prontamente preparadas de acordo com as técnicas bem conhecidas no ofício e incluem seqüências de peptídio com atividade funcional, por exemplo, biológica de um peptídio C de insulina nativa.The term "C-peptide" or "linker peptide" as used herein includes all forms of insulin C-peptide, including native or synthetic peptides. Such insulin C peptides may be human peptides, or may be of animal species and genera, preferably mammalian. Thus, variants and modifications of native insulin C-peptide are included as long as they retain insulin C-peptide activity. It is well known in the art how to modify protein or peptide sequences retaining their useful activity, and this can be achieved using techniques that are standard in the craft and widely described in the literature, for example, random or site-directed mutagenesis, cleavage, and cleavage. nucleic acid binding, etc. Thus, functionally equivalent variants or derivatives of native insulin peptide C sequences may be readily prepared according to techniques well known in the art and include peptide sequences with functional, e.g. biological, activity of a native insulin C peptide.
Todos esses análogos, variantes, derivados ou fragmentos de peptídio C de insulina são especialmente incluídos no escopo desta invenção e são agrupados na expressão "peptídio C de insulina".All such insulin peptide C analogs, variants, derivatives or fragments are especially included within the scope of this invention and are grouped under the expression "insulin C peptide".
Os principais requisitos de um peptídio C é que deve ser de extensão suficiente para permitir uma formação de ligação dissulfeto entre as cadeias AeBe que possa ser clivável desde o precursor de insulina até a formação de insulina. Um dipeptídio típico usado como peptídio C é -Arg-Arg-. Peptídios C podem ser de qualquer extensão que comece com Arg ou Lys e termine com Arg ou Lys.The main requirements of a C-peptide is that it must be of sufficient length to allow for a disulfide bond formation between the AeBe chains that can be cleavable from the insulin precursor to the formation of insulin. A typical dipeptide used as a C-peptide is -Arg-Arg-. C peptides can be any length starting with Arg or Lys and ending with Arg or Lys.
A invenção fornece vetores incluindo DNA que codifica qualquer dos genes aqui descritos. Também é fornecida uma célula hospedeira incluindo qualquer desses vetores. Como exemplo, as células hospedeiras podem ser bacterianas, fúngicas ou mamíferas.The invention provides vectors including DNA encoding any of the genes described herein. Also provided is a host cell including any of these vectors. As an example, the host cells may be bacterial, fungal or mammalian.
A invenção emprega uma célula hospedeira recombinante na qual é produzida pelo menos uma parte da seqüência de ácido nucleico que expressa o precursor do composto de insulina. Um sistema de expressão recombinante é selecionado de hospedeiros procarióticos e eucarióticos. Os hospedeiros eucarióticos incluem células de levedura (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris), células mamíferas ou células vegetais. Células bacterianas eucarióticas estão disponíveis em diferentes fontes, incluindo fontes comerciais para os experientes no ofício, por exemplo, a Coleção de Cultura de Tipo Americano (ATCC; Rockville, Md.). As fontes comerciais das células usadas para expressão de proteína recombinante também fornecem instruções para o uso das células. A escolha do sistema de expressão depende dos recursos desejados para o polipeptídio expressado.The invention employs a recombinant host cell in which at least a portion of the nucleic acid sequence expressing the precursor of the insulin compound is produced. A recombinant expression system is selected from prokaryotic and eukaryotic hosts. Eukaryotic hosts include yeast cells (e.g., Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris), mammalian cells or plant cells. Eukaryotic bacterial cells are available from different sources, including commercial sources for those skilled in the art, for example, the American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, Md.). Commercial sources of cells used for recombinant protein expression also provide instructions for the use of cells. The choice of expression system depends on the desired resources for the expressed polypeptide.
Mais preferencialmente relacionadas aos aspectos da presente invenção, as células hospedeiras mais preferidas são a leveduras metilotróficas. Cepas de levedura metilotrófica que podem ser modificadas usando a presente invenção incluem, entre outras, cepas de levedura capazes de crescer no metanol, tais como leveduras do gênero Pichia, Candida, Hansenula ou Torulopsis. As leveduras metilotróficas preferidas são do gênero Pichia. As cepas de levedura metilotrófica que podem ser modificadas usando os presentes métodos também incluem as cepas de levedura metilotrófica que foram projetadas para expressar uma ou mais proteínas heterólogas de interesse. A célula hospedeira de maior preferência de acordo com a presente invenção é Pichia pastiris, é GS115.More preferably related to aspects of the present invention, the most preferred host cells are methylotrophic yeast. Metilotrophic yeast strains that may be modified using the present invention include, but are not limited to, yeast strains capable of growing in methanol, such as yeasts of the genus Pichia, Candida, Hansenula or Torulopsis. Preferred methylotrophic yeasts are from the genus Pichia. Methylotrophic yeast strains that can be modified using the present methods also include methylotrophic yeast strains that are designed to express one or more heterologous proteins of interest. The most preferred host cell according to the present invention is Pichia pastiris, is GS115.
A célula hospedeira ou organismo pode ser projetada para expressar a proteína recombinante ou peptídio usando técnicas padrão. Por exemplo, a proteína recombinante pode ser expressa de um vetor ou de um gene exógeno inserido no genoma do hospedeiro.The host cell or organism may be designed to express recombinant protein or peptide using standard techniques. For example, the recombinant protein may be expressed from a vector or exogenous gene inserted into the host genome.
Os vetores que podem ser usados para expressar proteínas exógenas são bem conhecidos no ofício e são descritos abaixo. Os vetores preferidos da presente invenção que carregam genes da molécula precursora de insulina incluem, entre outros, pPIC9K.Vectors that can be used to express exogenous proteins are well known in the art and are described below. Preferred vectors of the present invention carrying insulin precursor molecule genes include, but are not limited to, pPIC9K.
O aspecto mais significativo da presente invenção se relaciona a um processo para conversão de compostos de insulina e seus análogos ou derivados de seus precursores correspondentes representado pela fórmulaThe most significant aspect of the present invention relates to a process for converting insulin compounds and their analogs or derivatives of their corresponding precursors represented by the formula.
<formula>formula see original document page 16</formula><formula> formula see original document page 16 </formula>
onde, R é hidrogênio ou um resíduo de aminoácido química ou enzimaticamente clivável ou um peptídio química ou enzimaticamente clivável incluindo pelo menos dois resíduos de aminoácido.where R is hydrogen or a chemically or enzymatically cleavable amino acid residue or a chemically or enzymatically cleavable peptide including at least two amino acid residues.
R1 é OH ou um resíduo de aminoácido, ou Y1-Y2 no qual Y é um resíduo de aminoácido.R1 is OH or an amino acid residue, or Y1-Y2 wherein Y is an amino acid residue.
As metades A1 a A21 correspondem à cadeia de insulina e as metades B1 a B27 correspondem à cadeia de insulina B incluindo substituição, exclusão e/ou adições de aminoácido.Halves A1 to A21 correspond to the insulin chain and halves B1 to B27 correspond to the insulin chain B including amino acid substitution, deletion and / or additions.
R2 é Z1-Z2 onde Z1 é selecionado de Pro1 Lys, Asp e Z2 é selecionado de Lys ou Pro ou Glu ou Z1-Z2-Z3 onde Z1 é selecionado de Pro1 Lys1 Asp e 72 ê selecionado de Lys ou Pro ou Glu e Z3 é treonina ou uma metade de peptídio de pelo menos três resíduos de aminoácido com a condição de que o aminoácido correspondente a B30 is treonina.R2 is Z1-Z2 where Z1 is selected from Pro1 Lys, Asp and Z2 is selected from Lys or Pro or Glu or Z1-Z2-Z3 where Z1 is selected from Pro1 Lys1 Asp and 72 is selected from Lys or Pro or Glu and Z3 is threonine or a peptide half of at least three amino acid residues with the proviso that the amino acid corresponding to B30 is threonine.
X é um polipeptídio que conecta a cadeia A à cadeia B, que pode ser clivado enzimaticamente sem perturbar a cadeia A ou a cadeia B contendo pelo menos dois aminoácidos onde o primeiro e o último aminoácido é Lisina ou Arginina.X is a polypeptide that connects chain A to chain B, which can be enzymatically cleaved without disrupting chain A or chain B containing at least two amino acids where the first and last amino acid is Lysine or Arginine.
O que inclui o tratamento de tal precursor com tripsina e carboxipeptidase usados de forma combinatória e concorrente, contanto que a proporção de concentração de tripsina em relação à carboxipeptidase seja de cerca de 5:1 a 50:1.This includes treating such precursor with trypsin and carboxypeptidase in a combinatorial and concurrent manner, provided that the ratio of trypsin concentration to carboxypeptidase is about 5: 1 to 50: 1.
A molécula precursora pode ser em forma de líquido ou de cristal.The precursor molecule may be in liquid or crystal form.
O processo de conversão da molécula precursora de insulina à sua molécula de insulina correspondente é realizado em meio aquoso composto de pelo menos cerca de 40% de água; no entanto, ele não impede a presença de pelo menos cerca de 30%, ou cerca de 50%, ou cerca de 60% ou cerca de 70% ou cerca de 80% de água e também a presença de solventes miscíveis em água tais como metanol, etanol, acetona, Ν,Ν-dimetilformamida e similares.The process of converting the insulin precursor molecule to its corresponding insulin molecule is carried out in an aqueous medium composed of at least about 40% water; however, it does not prevent the presence of at least about 30% or about 50% or about 60% or about 70% or about 80% of water and also the presence of water miscible solvents such as methanol, ethanol, acetone, α, β-dimethylformamide and the like.
O meio de reação também pode incluir qualquer sal com propriedades tamponadoras. De preferência, o meio de reação inclui Tris como sal na concentração na faixa de 10mM a 1M. De forma mais preferível, a concentração de Tris usado no meio de reação é de 0,6M.The reaction medium may also include any salt with buffering properties. Preferably, the reaction medium includes Tris as salt in the concentration in the range of 10mM to 1M. Most preferably, the concentration of Tris used in the reaction medium is 0.6M.
A conversão é realizada em qualquer das temperaturas em uma faixa ampla, geralmente de cerca de O0C a 40°C. De preferência a reação é conduzida a uma temperatura de cerca de 10°C a cerca de 30°C e de forma mais preferível de cerca de 15°C até cerca de 25°C.Conversion is performed at any temperature over a wide range, usually from about 0 ° C to 40 ° C. Preferably the reaction is conducted at a temperature from about 10 ° C to about 30 ° C and more preferably from about 15 ° C to about 25 ° C.
O pH da mistura da reação pode estar num ponto qualquer entre cerca de 2 e cerca de 12. No entanto, são obtidos melhores resultados com um cuidadoso controle de pH de forma que a reação progrida em uma faixa de pH de cerca de 6,5 a 10. De preferência a reação ocorre a uma faixa de pH de 7 a 9,5, De preferência de cerca de 8 a 9, e quando controlada com precisão a um pH de 8,5.The pH of the reaction mixture can be anywhere from about 2 to about 12. However, better results are obtained with careful pH control so that the reaction progresses over a pH range of about 6.5. Preferably the reaction takes place at a pH range of 7 to 9.5, preferably about 8 to 9, and when precisely controlled at a pH of 8.5.
O controle de pH é efetuado por uso de um agente tamponador. Qualquer um na ampla faixa de tampões adequados usados inclui TRIS, etilenadiamina, trietanolamina, glicina, HEPES (N-2-hidróxi-etilpiperazina-N'-2-ácido etanossulfônico) e similares.The pH control is performed by use of a buffering agent. Any of the wide range of suitable buffers used include TRIS, ethylenediamine, triethanolamine, glycine, HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid) and the like.
A quantidade de tripsina e carboxipeptidase B que geralmente é usada e relacionada tanto entre as duas enzimas quanto à quantidade da molécula precursora de insulina. As enzimas podem ser incorporadas nas misturas da reação seja na solução ou usando técnicas reconhecidas como imobilização em um suporte adequado e assim disponibilizadas no meio de reação.The amount of trypsin and carboxypeptidase B that is generally used is related both between the two enzymes and the amount of the insulin precursor molecule. Enzymes may be incorporated into the reaction mixtures either in solution or using techniques recognized as immobilization on a suitable support and thus made available in the reaction medium.
Numa relação peso:peso, a tripsina geralmente estará presente em uma quantidade relativa à do precursor de insulina numa faixa de cerca de 1:10 a cerca de 1:500, de preferência, de cerca de 1:10 a cerca de 1:200, de forma ainda mais preferencial, de cerca de 1:10 a cerca de 1:100 ou de 1:10 a cerca de 1:50 ou de cerca de 1:10 a cerca de 1:25. A concentração mais preferível de tripsina em relação à concentração de insulina utilizada é de 1:100. A concentração de tripsina usada para a reação de conversão é de pelo menos 0,01 mg/mlIn a weight to weight ratio, trypsin will generally be present in a relative amount to that of the insulin precursor in a range from about 1:10 to about 1: 500, preferably from about 1:10 to about 1: 200. even more preferably from about 1:10 to about 1: 100 or from 1:10 to about 1:50 or from about 1:10 to about 1:25. The most preferable trypsin concentration over the insulin concentration used is 1: 100. The trypsin concentration used for the conversion reaction is at least 0.01 mg / ml.
Numa relação peso:peso, a carboxipeptidase B geralmente estará presente em uma quantidade relativa à do precursor de insulina numa faixa de cerca de 1:500 ou cerca de 3:500. A concentração mais preferível de carboxipeptidase em relação à concentração de insulina utilizada é de 1:500. A concentração de carboxipeptidase usada para a reação de conversão é de pelo menos 0,001 mg/mlIn a weight to weight ratio, carboxypeptidase B will generally be present in a relative amount to that of the insulin precursor in a range of about 1: 500 or about 3: 500. The most preferred concentration of carboxypeptidase over the insulin concentration used is 1: 500. The concentration of carboxypeptidase used for the conversion reaction is at least 0.001 mg / ml.
Outro parâmetro significativo da presente invenção é a proporção de tripsina em relação à carboxipeptidase B na mistura da reação. Em geral, em termos de peso, a proporção de tripsina em relação à carboxipeptidase B está na faixa de 5:1a 50:1. De preferência, em termos de peso, a proporção de tripsina em relação à carboxipeptidase B é de cerca de 50:3 a cerca de 5:3. A proporção mais preferível de tripsina em relação à carboxipeptidase B é de cerca de 5:1.Another significant parameter of the present invention is the ratio of trypsin to carboxypeptidase B in the reaction mixture. In general, by weight, the ratio of trypsin to carboxypeptidase B is in the range of 5: 1 to 50: 1. Preferably, by weight, the ratio of trypsin to carboxypeptidase B is from about 50: 3 to about 5: 3. The most preferable ratio of trypsin to carboxypeptidase B is about 5: 1.
A duração da reação pode ir de 2 a 48 horas. De preferência a duração da reação é de cerca de 2 a 24 horas.The duration of the reaction may range from 2 to 48 hours. Preferably the reaction time is about 2 to 24 hours.
Assim também, presente invenção relacionada a um processo para obter insulina ou seus análogos ou derivados de seus respectivos correspondentes precursores inclui a realização sucessiva das seguintes etapas em ordem seqüencial com disposto abaixo:Thus also, the present invention related to a process for obtaining insulin or its analogs or derivatives of their respective precursors includes successively performing the following steps in sequential order as set forth below:
(a) Dissolver uma quantidade ótima do precursor de insulina ou derivado de insulina em uma solução tampão. (b) Preparar várias alíquotas da solução precursora em faixas de pH de aproximadamente 7,0 a 9,0.(a) Dissolve an optimal amount of the insulin precursor or insulin derivative in a buffer solution. (b) Prepare several aliquots of the precursor solution in pH ranges from approximately 7.0 to 9.0.
(c) introduzir as enzimas tripsina e carboxipeptidase de forma concorrente às várias alíquotas preparadas na Etapa (b) e incubar a mistura por aproximadamente 4 a 10 horas.(c) introducing trypsin and carboxypeptidase enzymes concurrently with the various aliquots prepared in Step (b) and incubating the mixture for approximately 4 to 10 hours.
(d) Precipitar o produto desejado de insulina pela adição de tampão de ácido cítrico e ZnCl2.(d) Precipitate the desired insulin product by the addition of citric acid buffer and ZnCl2.
A configuração preferida da invenção é descrita abaixo nos Desenhos e Descrição das Configurações Preferidas. Enquanto essas descrições descrevem diretamente as configurações acima, fica entendido que as pessoas com habilidade no ofício podem conceber modificações e/ou variações às configurações específicas aqui demonstradas e descritas. Qualquer dessas modificações ou variações que cair no escopo desta descrição se destina a ser nela incluída também. A menos que especificamente observado, é a intenção do inventor que as palavras e frases na e especificação e reivindicações tenham os significados comuns e costumeiros às pessoas de conhecimento normal do(s) ofício(s) aplicável(is). A descrição de uma configuração preferida e melhor forma conhecida da invenção pelo solicitante no momento de encaminhar a solicitação foi apresentada e se destina somente a ilustração e descrição. Não se pretende esgotar ou limitar a invenção à forma precisa divulgada, e muitas modificações e variações são possíveis à luz dos ensinamentos acima. A configuração foi escolhida e descrita para explicar da melhor forma os princípios da invenção e sua aplicação prática e para permitir a outros com habilidade no ofício a utilizar da melhor forma a invenção Em diversas configurações e com várias modificações como seja adequado ao uso particular contemplado.The preferred embodiment of the invention is described below in the Drawings and Description of Preferred Configurations. While these descriptions directly describe the above configurations, it is understood that persons skilled in the art may conceive modifications and / or variations to the specific configurations disclosed and described herein. Any such modifications or variations that fall within the scope of this disclosure are intended to be included as well. Unless specifically noted, it is the inventor's intention that the words and phrases in the specification and claims have the meanings common and customary to persons of ordinary knowledge of the applicable trade (s). The description of a preferred embodiment and best known form of the invention by the applicant at the time of submitting the request has been provided and is for illustration and description only. It is not intended to exhaust or limit the invention to the precise form disclosed, and many modifications and variations are possible in light of the above teachings. The embodiment has been chosen and described to best explain the principles of the invention and their practical application and to enable others skilled in the art to make the best use of the invention. In various configurations and with various modifications as appropriate to the particular use contemplated.
A invenção é ainda detalhada com a ajuda dos seguintes exemplos. No entanto, esses exemplos não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção.The invention is further detailed with the help of the following examples. However, these examples should not be construed as limiting the scope of the invention.
EXEMPLO 1A:EXAMPLE 1A:
Precursor de Asparte (Seq ID 1, 2 e 3)Aspart Precursor (Seq ID 1, 2 and 3)
Precursor de asparte da Fórmula X- [Cadeia B de Asparte (B1-B30)]-Y- [cadeia A de Asparte (A1-A21)], onde X é uma seqüência de peptídio líder, a cadeia B é a seqüência da cadeia B de Asparte de B1-B30, Y é uma seqüência de peptídio ligadora entre a cadeia Bea cadeia A, a cadeia A é a cadeia A de Asparte. A seqüência pode ser desprovida de líder ou outro peptídio líder (por exemplo, EEAEAEAEPR ou GAVR). O peptídio Iigador Y pode ser qualquer um do exemplo R, e RDADDR.Asparte precursor of Formula X- [Asparte Chain B (B1-B30)] - Y- [Asparte Chain A (A1-A21)], where X is a leader peptide sequence, chain B is the chain sequence Asparte B of B1-B30, Y is a linker peptide sequence between the B chain and the A chain, the A chain is the Asparte A chain. The sequence may be devoid of leader or other leader peptide (for example, EEAEAEAEPR or GAVR). Linker Y peptide can be any of Example R, and RDADDR.
(Comentário: o "RR" no peptídio ligador foi removido, favor remover em outros locais, se eu tiver esquecido).(Comment: the "RR" in the linker peptide has been removed, please remove it elsewhere if I have forgotten).
A seqüência precursora é representada por SEQ IDs 1 e 2. O precursor pode ser produzido por qualquer sistema de expressão adequado tomo Escherichia coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, células CHO, etc.The precursor sequence is represented by SEQ IDs 1 and 2. The precursor can be produced by any suitable expression system such as Escherichia coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, CHO cells, etc.
O precursor de asparte foi clonado no quadro com o peptídio de sinal Mat-alfa no vetor de expressão Pichia, pPIC9K. A cepa hospedeira Pichia pastoris GS115 foi transformada com o plasmídio recombinante para obter um clone expressando o precursor de asparte.The aspart precursor was cloned in the frame with the Mat-alpha signal peptide in the Pichia expression vector, pPIC9K. The host strain Pichia pastoris GS115 was transformed with the recombinant plasmid to obtain a clone expressing the aspart precursor.
O precursor de asparte é secretado por Pichia pastoris no meio de cultura. O caldo é centrifugado e as células são separadas do sobrenadante. Existem múltiplas opções disponíveis para a captura do precursor incluindo cromatografia de troca de íons e cromatografia hidrofóbica. Para esta invenção, foi usada a cromatografia de troca de cátions e HIC para capturar o precursor específico.The aspart precursor is secreted by Pichia pastoris in the culture medium. The broth is centrifuged and the cells are separated from the supernatant. There are multiple options available for precursor capture including ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography. For this invention, cation exchange chromatography and HIC were used to capture the specific precursor.
EXEMPLO 1B: Precursor de Lispro (Seq ID 3, 4 e 5)EXAMPLE 1B: Lispro Precursor (Seq ID 3, 4 and 5)
Precursor de asparte da Fórmula X- [Cadeia B de Lispro (B1-B30)]-Y-[cadeia A de Lispro (A1-A21)], onde X é uma seqüência de peptídio líder, a cadeia B é a seqüência da cadeia B de Lispro de B1-B30, Y é uma seqüência de peptídio Iigadora entre a cadeia Bea cadeia A, a cadeia A é a cadeia A de Lispro. A seqüência pode ser desprovida de líder ou outro peptídio líder. O peptídio Iigador Y pode ser qualquer um do exemplo R, ou RDADDR. A seqüência precursora é representada por SEQ IDs 3 e 4. O precursor pode ser produzido por qualquer sistema de expressão adequado tomo Escherichia coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, células CHO, etc.Aspartic precursor of Formula X- [Lispro Chain B (B1-B30)] - Y- [Lispro Chain A (A1-A21)], where X is a leader peptide sequence, chain B is the chain sequence Lispro B from B1-B30, Y is a linker peptide sequence between the Bea chain and the A chain, the A chain is the Lispro A chain. The sequence may be devoid of leader or other leader peptide. Linker Y peptide can be any of Example R, or RDADDR. The precursor sequence is represented by SEQ IDs 3 and 4. The precursor can be produced by any suitable expression system such as Escherichia coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, CHO cells, etc.
O precursor de Lispro foi clonado no quadro com o peptídio de sinal Mat-alfa no vetor de expressão Pichia, pPIC9K. A cepa hospedeira Pichia pastoris GS115 foi transformada com o plasmídio recombinante para obter um clone expressando o precursor de Lispro.The Lispro precursor was cloned in the frame with the Mat-alpha signal peptide in the Pichia expression vector, pPIC9K. The host strain Pichia pastoris GS115 was transformed with the recombinant plasmid to obtain a clone expressing the Lispro precursor.
O precursor de Lispro é secretado por Pichia pastoris no meio de cultura. O caldo é centrifugado e as células são separadas do sobrenadante. Existem múltiplas opções disponíveis para a captura do precursor incluindo cromatografia de troca de íons e cromatografia hidrofóbica. Para esta invenção, foi usada a cromatografia de troca de cátions e HIC para capturar o precursor específico.The precursor of Lispro is secreted by Pichia pastoris in the culture medium. The broth is centrifuged and the cells are separated from the supernatant. There are multiple options available for precursor capture including ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography. For this invention, cation exchange chromatography and HIC were used to capture the specific precursor.
EXEMPLO 1C:EXAMPLE 1C:
Precursor de Glulisina (Seq ID 5, 6 e 7)Glulisine precursor (Seq ID 5, 6 and 7)
Precursor de asparte da Fórmula X-[Cadeia B de Glulisina (B1-B30)]-Y- [cadeia A de Glulisina (A1-A21)], onde X é uma seqüência de peptídio líder, a cadeia B é a seqüência da cadeia B de Glulisina de B1-B30, Y é uma seqüência de peptídio ligadora entre a cadeia Bea cadeia A, a cadeia A é a cadeia A de Glulisina. A seqüência pode ser desprovida de líder ou outro peptídio líder. O peptídio ligador Y pode ser qualquer um do exemplo R, ou RDADDR. A seqüência precursora é representada por SEQ IDs 5 e 6. O precursor pode ser produzido por qualquer sistema de expressão adequado tomo Escherichia coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, células CHO, etc. O precursor de Glulisina foi clonado no quadro com o peptídio de sinal Mat-alfa no vetor de expressão Pichia, pPIC9K. A cepa hospedeira Pichia pastoris GS115 foi transformada com o plasmídio recombinante para obter um clone expressando o precursor de Glulisina.Aspartic precursor of Formula X- [Glulisine Chain B (B1-B30)] - Y- [Glulisine Chain A (A1-A21)], where X is a leader peptide sequence, chain B is the chain sequence B1-B30 Glulisine B, Y is a peptide linker sequence between the Bea chain A chain, the A chain is the Glulisine A chain. The sequence may be devoid of leader or other leader peptide. The Y-linker peptide may be any of Example R, or RDADDR. The precursor sequence is represented by SEQ IDs 5 and 6. The precursor may be produced by any suitable expression system such as Escherichia coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, CHO cells, etc. The Glulisine precursor was cloned in the frame with the Mat-alpha signal peptide in the Pichia expression vector, pPIC9K. The Pichia pastoris GS115 host strain was transformed with the recombinant plasmid to obtain a clone expressing the Glulisine precursor.
O precursor de Glulisina é secretado por Pichia pastoris no meio de cultura. O caldo é centrifugado e as células são separadas do sobrenadante. Existem múltiplas opções disponíveis para a captura do precursor incluindo cromatografia de troca de íons e cromatografia hidrofóbica. Para esta invenção, foi usada a cromatografia de troca de cátions e HIC para capturar o precursor específico.Glulisine precursor is secreted by Pichia pastoris in the culture medium. The broth is centrifuged and the cells are separated from the supernatant. There are multiple options available for precursor capture including ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography. For this invention, cation exchange chromatography and HIC were used to capture the specific precursor.
Cristalização de PrecursorPrecursor Crystallization
O precursor diferente de composto de insulina capturado do caldo de fermentação usando a etapa de cromatografia de troca de cátions foi cristalizado com o objetivo de remoção de cor e armazenamento. A cristalização foi feita de forma tal que a concentração de precursor no começo da cristalização era de cerca de 2 1 20 g/L, de preferência 8 a 14 g/L. A cristalização foi feita acrescentando-se ZnCl2 e fenol e depois ajustando o pH entre 3,0 e 8,0, de preferência entre 3,5 e 5,5.The different precursor of insulin compound captured from the fermentation broth using the cation exchange chromatography step was crystallized for the purpose of color removal and storage. Crystallization was such that the precursor concentration at the beginning of crystallization was about 2120 g / l, preferably 8 to 14 g / l. Crystallization was done by adding ZnCl2 and phenol and then adjusting the pH between 3.0 and 8.0, preferably between 3.5 and 5.5.
O fenol pode ser acrescentado de 0,1 a 0.5% do volume de poço de eluição de CIEX. Uma solução de 4% de ZnCI2 pode ser acrescentada de 3 a 15% do volume de poço de eluição de CIEX. O pH pode ser ajustado usando qualquer álcali, de preferência NaOH ou TRIS. O processo de cristalização pode ser feito a uma temperatura entre 2 e 30°C e a pasta é armazenada por algum tempo para que os cristais se formem completamente. Os cristais precursores podem ser separados do sobrenadante por centrifugação ou decantação.Phenol may be added from 0.1 to 0.5% of the CIEX elution well volume. A 4% solution of ZnCl2 may be added from 3 to 15% of the CIEX elution well volume. The pH may be adjusted using any alkali, preferably NaOH or TRIS. The crystallization process can be carried out at a temperature between 2 and 30 ° C and the paste is stored for some time so that the crystals form completely. Precursor crystals may be separated from the supernatant by centrifugation or decantation.
EXEMPLO 2A:EXAMPLE 2A:
Exemplo de cristalização de Lispro Precursor 463 ml do poço de eluição (concentração de precursor 13,8 g/L) foram retirados e 2,315 ml de fenol (0,5% do volume do poço de eluição) foram acrescentados após o descongelamento apropriado. A isso se seguiu a adição de 57,875 ml de 4% de solução de ZnCI2 (12,5% do volume do poço de eluição). O pH era 4,08 neste estágio e foi ajustado para 4,8 acrescentando-se 420 ml de 2,5N NaOH. O líquido mãe foi mantido sob condições de baixa agitação por 15 minutos e depois transferido para a sala fria (2 a 8DC), onde foi mantido de um dia para o outro. Depois a mistura toda foi centrifugada a 5000 rpm por 20 minutos em uma centrífuga Beckman CouIterAvanti J-26 XP. A perda no sobrenadante foi de 1,55%.Example of Lispro Precursor crystallization 463 ml elution well (precursor concentration 13.8 g / l) was removed and 2.315 ml phenol (0.5% elution well volume) was added after appropriate thawing. This was followed by the addition of 57.875 ml of 4% ZnCl2 solution (12.5% elution well volume). The pH was 4.08 at this stage and was adjusted to 4.8 by adding 420 ml of 2.5N NaOH. The mother liquor was kept under low agitation conditions for 15 minutes and then transferred to the cold room (2-8 ° C), where it was kept overnight. Then the entire mixture was centrifuged at 5000 rpm for 20 minutes in a Beckman CouIterAvanti J-26 XP centrifuge. The supernatant loss was 1.55%.
EXEMPLO 2B:EXAMPLE 2B:
Exemplo de cristalização de Asparte Precursor 500 ml do poço de eluição (concentração de precursor 2,9 g/L) foram retirados e 0,625 ml de fenol (0,125% do volume do poço de eluição) foram acrescentados após o descongelamento apropriado. A isso se seguiu a adição de 15,625 ml de 4% de solução de ZnCl2 (3,125% do volume do poço de eluição). O pH era 4,08 neste estágio e foi ajustado para 4,8 acrescentando-se 315 ml de 2,5N NaOH. O líquido mãe foi mantido sob condições de baixa agitação por 15 minutos e depois transferido para a sala fria (2 a 8°C), onde foi mantido por cinco horas. Depois o sobrenadante foi separado por centrifugação. A perda no sobrenadante foi de 4%.Example of Asparte Precursor crystallization 500 ml of the elution well (precursor concentration 2.9 g / l) were removed and 0.625 ml of phenol (0.125% of the volume of the elution well) was added after appropriate thawing. This was followed by the addition of 15.625 ml of 4% ZnCl2 solution (3.125% elution well volume). The pH was 4.08 at this stage and was adjusted to 4.8 by adding 315 ml of 2.5N NaOH. The mother liquor was kept under low agitation conditions for 15 minutes and then transferred to the cold room (2 to 8 ° C), where it was kept for five hours. Then the supernatant was separated by centrifugation. The loss in the supernatant was 4%.
Comentário: Podemos mudar a numeração (asparte como 2A e Iispro como 2B)? Nos demais locais estamos dando os exemplos mantendo a seqüência de A: Aspartel B: Lispro e C: Glulisina.Comment: Can we change the numbering (aspart as 2A and Iispro as 2B)? Elsewhere we are giving the examples keeping the sequence of A: Aspartel B: Lispro and C: Glulisine.
EXEMPLO 2C:EXAMPLE 2C:
Exemplo de cristalização de Glulisina PrecursoraExample of Crystallization of Precursor Glulisine
250 ml do poço de eluição do processamento de sefarose Sp da Glulisina Precursora (concentração de precursor 13,8 g/L) foram retirados e 0,31 ml de fenol (0,125% do volume do poço de eluição) foram acrescentados após o descongelamento apropriado. A isso se seguiu a adição de 7 ml de 4% de solução de ZnCl2 (3% do volume do poço de eluição). O pH era 4,13 neste estágio e foi ajustado para 4,9 acrescentando-se 2.5N NaOH. O líquido mãe foi mantido sob condições de baixa agitação por 30 minutos e depois transferido para a sala fria (2 a 8°C), onde foi mantido por cinco horas. Depois o sobrenadante foi separado por centrifugação. A perda no sobrenadante foi de 7%.250 ml of precursor Glulisine Sp sepharose processing elution well (precursor concentration 13.8 g / l) was removed and 0.31 ml of phenol (0.125% of elution well volume) was added after appropriate thawing. . This was followed by the addition of 7 ml of 4% ZnCl 2 solution (3% elution well volume). The pH was 4.13 at this stage and was adjusted to 4.9 by adding 2.5N NaOH. The mother liquor was kept under low agitation conditions for 30 minutes and then transferred to the cold room (2 to 8 ° C), where it was kept for five hours. Then the supernatant was separated by centrifugation. The loss in the supernatant was 7%.
EXEMPLO 3A:EXAMPLE 3A:
Reações enzimáticasEnzymatic reactions
Diferentes compostos de insulina podem ser preparados de seu precursor correspondente através de uma conversão enzimática. A conversão direta do precursor ao produto final pode ser obtida pela presença de duas enzimas protease. As reações enzimáticas foram realizadas de duas formas diferentes. Primeiro, o precursor tem que ser tratado com tripsina ou enzimas semelhantes de origem recombinante vegetal, animal ou microbiana. Quando a reação de tripsina tiver terminado, o intermediário nas mesmas misturas de reação foram tratados com a 2a enzima de protease carboxipeptidase B ou enzima semelhante de origem recombinante vegetal, animal ou microbiana. A carboxipeptidase B pode atuar no aminoácido básico e na extremidade de terminal C. Alternativamente, as enzimas de tripsina e carboxipeptidase foram acrescentadas na mistura da reação como um coquetel fluntas) e permitiu-se que as reações continuassem até acontecer a formação do produto ótimo correspondente.Different insulin compounds may be prepared from their corresponding precursor by enzymatic conversion. Direct conversion of the precursor to the final product can be achieved by the presence of two protease enzymes. Enzyme reactions were performed in two different ways. First, the precursor must be treated with trypsin or similar enzymes of recombinant plant, animal or microbial origin. When the trypsin reaction was terminated, the intermediate in the same reaction mixtures were treated with the 2nd protease carboxypeptidase B enzyme or similar enzyme of recombinant plant, animal or microbial origin. Carboxypeptidase B can act on the basic amino acid and C-terminal end. Alternatively, trypsin and carboxypeptidase enzymes were added to the reaction mixture as a flunt cocktail) and the reactions were allowed to continue until the formation of the corresponding optimal product occurred. .
EXEMPLO 4A:EXAMPLE 4A:
Quando somente tripsina foi acrescentada à mistura da reação precursora individual.When only trypsin was added to the individual precursor reaction mixture.
2gm de cristais precursores individuais de asparte, Iispro e glulisina foram solubilizados com 5ml de 6M de solução TRIS. A concentração do produto da mistura da reação individual foi mantida em 3 a 5 mg/ml. O pH da mistura da reação foi ajustado para 8,5. Foi acrescentada tripsina à mistura da reação individual a uma concentração de 50pg/ml. As reações foram realizadas a 4±0.5°C e a temperatura ambiente (24 ±0,5°C). Foi observado que o perfil cromatográfico ao final da mistura da reação não muda em relação à temperatura de reação, mas o tempo de conclusão da reação diminui à medida que a temperatura aumenta. A temperatura das reações foi mantida a 24 ±0.5°C. As reações foram continuadas por 8 horas e ao final das 8 horas as amostras foram analisadas.2gm individual precursor crystals of aspart, Iispro and glulisine were solubilized with 5ml of 6M TRIS solution. The concentration of the product of the individual reaction mixture was maintained at 3 to 5 mg / ml. The pH of the reaction mixture was adjusted to 8.5. Trypsin was added to the individual reaction mixture at a concentration of 50pg / ml. Reactions were performed at 4 ± 0.5 ° C and at room temperature (24 ± 0.5 ° C). It was observed that the chromatographic profile at the end of the reaction mixture does not change with respect to the reaction temperature, but the reaction completion time decreases as the temperature increases. The reaction temperature was maintained at 24 ± 0.5 ° C. Reactions were continued for 8 hours and at the end of 8 hours the samples were analyzed.
De forma semelhante, o precursor individual de asparte, lispro e glulisina foi solubilizado em solução Tris e 50% de solvente dimetilformamida a uma concentração de 3 a 5mg/ml. O pH da mistura da reação foi ajustado para 8,5 e a temperatura da mistura da reação foi mantida a 24 ±0,5°C. Foi acrescentada tripsina à mistura da reação individual a uma concentração de 50Mg/ml.Similarly, the individual precursor of aspart, lispro and glulisine was solubilized in Tris solution and 50% dimethylformamide solvent at a concentration of 3 to 5 mg / ml. The pH of the reaction mixture was adjusted to 8.5 and the temperature of the reaction mixture was maintained at 24 ± 0.5 ° C. Trypsin was added to the individual reaction mixture at a concentration of 50 µg / ml.
Observação:Note:
O precursor de asparte foi convertido para B-30 Des-treonina asparte e Des octapeptídio insulina A percentagem de Des treonina asparte foi de 45% e a de desoctapeptídio insulina foi de 36%. A formação do intermediário necessário, asparte com resíduo extra de arginina na posição B31, é de cerca de 10 a 14%. Assim, mesmo a 2a enzima carboxipeptidase B sendo acrescentada à mistura da reação, o rendimento geral para fazer o produto final seria de <10-15%.The aspart precursor was converted to B-30 Des-threonine aspart and Des octapeptide insulin. The percentage of des threonine aspart was 45% and that of desoctapeptide insulin was 36%. The formation of the required intermediate, aspart with extra arginine residue at position B31, is about 10 to 14%. Thus, even if the 2nd carboxypeptidase B enzyme is added to the reaction mixture, the overall yield for making the final product would be <10-15%.
Um perfil semelhante do produto foi encontrado quando a reação foi realizada com solvente 50%. Mas o índice de reação é muito lento na presença de solvente. Para se obter um tipo semelhante de perfil as reações têm que continuar por quase 18 horas.A similar product profile was found when the reaction was performed with 50% solvent. But the reaction rate is very slow in the presence of solvent. To obtain a similar type of profile reactions have to continue for almost 18 hours.
Assim, não seria possível a geração de asparte do precursor correspondente através da reação sucessiva de protease. Assim, ficou entendido que o B-29Lys do asparte é o local mais potente para clivagem de tripsina e, à medida que a reação continua, o local B-22Arg também fica com tendência de clivagem de tripsina e, ao final da reação, obtemos uma população mista de B-30 Des treonina e Des- octapeptídio em cada precursor individual. O produto de clivagem em B-31 arginina é muito baixo em todo o produto do precursor.Thus, it would not be possible to generate aspart of the corresponding precursor by successive protease reaction. Thus, it was understood that asparte B-29Lys is the most potent site for trypsin cleavage, and as the reaction continues, the B-22Arg site also tends to trypsin cleavage and at the end of the reaction we obtain a mixed population of B-30 Desthreonine and Desocapeptide in each individual precursor. The arginine B-31 cleavage product is very low throughout the precursor product.
O precursor de lispro, sob condição semelhante, foi convertido para produto de lispro com resíduo extra de arginina na posição B31 juntamente com uma grande quantidade de Des-octapeptídio insulina. Um tipo semelhante de observação foi encontrado quando o precursor de glulisina foi tratado com tripsina sob condições idênticas. Mas os perfis cromatográficos na mistura da reação não foram nem um pouco limpos no caso de precursor de lispro e glulisina. Isso sugere que mesmo o produto final possível, lispro e glulisina, podem ser feitos através da reação sucessiva com a 2a carboxipeptidase B protease, mas o rendimento geral seria muito baixo.The lispro precursor, under similar condition, was converted to lispro product with extra arginine residue at position B31 along with a large amount of Desoctapeptide insulin. A similar type of observation was found when the glulisine precursor was treated with trypsin under identical conditions. But the chromatographic profiles in the reaction mixture were not cleaned at all in the case of lispro and glulisine precursor. This suggests that even the possible end product, lispro and glulisine, can be made by successive reaction with the 2nd carboxypeptidase B protease, but the overall yield would be very low.
A presença de 50% de dimetilformamida apenas retarda o índice de reação no caso do precursor de lispro bem como no de glulisina. Para verificar o conceito, um tipo semelhante de reação de tripsina foi testado no resíduo precursor IN-105 B-29Lys quando o precursor foi bloqueado no precursor ln-105 pela cadeia curta de molécula PEG bem como com a molécula precursora não conjugada. Foi observado que, no caso do precursor IN-105 conjugado, a tripsina se cliva mais preferivelmente no terminal c do resíduo de arginina do 31° aminoácido para gerar IN-105 com resíduo extra de arginina no terminal C da cadeia B. Juntamente com a arginina B031 IN-105, a Des Octa insulina também é gerada nesta mistura da reação. Mas quando o precursor IN-105 não conjugado foi tratado com tripsina, a protease se cliva preferivelmente no resíduo B-29 de Iisina da extremidade do terminal C para gerar Des-treonina insulina. O perfil cromatográfico no final da reação é o mesmo tanto na presença quanto na ausência de qualquer solvente na mistura da reação. Foi observado que a presença de solvente retarda o índice de reação.The presence of 50% dimethylformamide only delays the reaction rate in the case of lispro as well as glulisine precursor. To verify the concept, a similar type of trypsin reaction was tested on the precursor residue IN-105 B-29Lys when the precursor was blocked in precursor ln-105 by the short chain PEG molecule as well as the unconjugated precursor molecule. It has been observed that in the case of the conjugated IN-105 precursor, trypsin is more preferably cleaved at the c-terminus of the 31st amino acid arginine residue to generate IN-105 with extra C-terminus B-arginine residue. arginine B031 IN-105, Des Octa insulin is also generated in this reaction mixture. But when the unconjugated IN-105 precursor was treated with trypsin, the protease is preferably cleaved at the C-terminal lysine residue B-29 to generate De-threonine insulin. The chromatographic profile at the end of the reaction is the same both in the presence and absence of any solvent in the reaction mixture. It was observed that the presence of solvent slows the reaction rate.
EXEMPLOS 4B:EXAMPLES 4B:
Na próxima fase das condições experimentais, as reações foram realizadas acrescentando-se tripsina e carboxipeptidase B juntas em uma mistura da reação precursora individual.In the next phase of the experimental conditions, the reactions were performed by adding trypsin and carboxypeptidase B together in a mixture of the individual precursor reaction.
A concentração do precursor foi em geral de cerca de 5 a 50 g/L. A reação foi realizada com pH de 5 a 12 aproximadamente, de preferência aproximadamente de 8 a 10. A temperatura da reação foi de 0 a 40°C aproximadamente, de preferência aproximadamente de 2 a 25°C. Foi usado tris-hidroximetil-aminometano (TRIS) ou outros sistemas tamponadores em diferentes forças iônicas para manter o pH necessário. O tempo de reação foi variável e foi afetado por outras condições de reação. A reação foi continuada até que a pureza do produto começa a diminuir em razão da hidrólise do produto. Geralmente leva cerca de 30 minutos a 24 horas e na maioria dos casos de 4 a 10 horas aproximadamente.The concentration of the precursor was generally about 5 to 50 g / l. The reaction was carried out at a pH of from about 5 to 12, preferably from about 8 to 10. The reaction temperature was from about 0 to 40 ° C, preferably from about 2 to 25 ° C. Trishydroxymethylaminomethane (TRIS) or other buffering systems at different ionic strengths were used to maintain the required pH. The reaction time was variable and was affected by other reaction conditions. The reaction was continued until product purity began to decrease due to product hydrolysis. It usually takes about 30 minutes to 24 hours and in most cases about 4 to 10 hours approximately.
A concentração da enzima foi determinada dependendo da concentração de substratos e atividade enzimática. Por exemplo, a tripsina cristalina disponível no mercado foi usada de preferência em uma concentração de cerca de 10 a 100 mg/L.Enzyme concentration was determined depending on substrate concentration and enzymatic activity. For example, commercially available crystalline trypsin was preferably used at a concentration of about 10 to 100 mg / L.
EXEMPLO: 4B (I)EXAMPLE: 4B (I)
4gm do cristal precursor de asparte foi dissolvido em 20ml de solução de 1M de TRIS. A concentração do produto da solução foi mantida em 5mg/ml e a concentração de TRIS foi mantida a 0,6 M pelo acréscimo. Alíquotas de certas quantidades foram tiradas ajustando-se o pH da mistura da reação em 2,5N NaOH ou 2N de ácido acético glacial. Foram preparadas alíquotas da mistura da reação a um pH de 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0. 1 ml de cada uma dessa mistura da reação foi retirado em cada tubo como uma mistura da reação individual em diferentes condições. A reação foi realizada em todas as amostras acrescentando-se tripsina e carboxipeptidase B juntas em diferentes concentrações. Os parâmetros diferentes variados são tabulados.4gm of the aspart precursor crystal was dissolved in 20ml of 1M TRIS solution. The solution product concentration was maintained at 5mg / ml and the TRIS concentration was maintained at 0.6 M by the addition. Aliquots of certain amounts were taken by adjusting the pH of the reaction mixture to 2.5N NaOH or 2N glacial acetic acid. Aliquots of the reaction mixture were prepared at a pH of 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0. 1 ml of each of this reaction mixture was withdrawn into each tube as an individual reaction mixture under different conditions. The reaction was performed on all samples by adding trypsin and carboxypeptidase B together at different concentrations. The varied different parameters are tabulated.
Parâmetros Constantes:Constant Parameters:
• Concentração do produto 5g• Product concentration 5g
• Concentração de tampão TRIS 0,6M• 0.6M TRIS buffer concentration
Parâmetros Variados:Miscellaneous Parameters:
· Concentração de tripsina: 25-500 mg/L· Trypsin concentration: 25-500 mg / L
• Concentração de carboxipeptidase: 10-30mg/L• Carboxypeptidase concentration: 10-30mg / L
• pH: 7,0-9,0.• pH: 7.0-9.0.
<table>table see original document page 29</column></row><table> <table>table see original document page 30</column></row><table><table> table see original document page 29 </column> </row> <table> <table> table see original document page 30 </column> </row> <table>
Resultado:Result:
Foi observado que, quando a tripsina e a carboxipeptidase foram acrescentadas juntas na mistura da reação, não foi observada a forma Des octapeptídio e des-treonina. Ao final da reação, o asparte é o principal produto. A pureza e o rendimento do asparte gerado variam em condições individuais de reação. O melhor rendimento de 75% de asparte foi observado sob concentração de tripsina de 50mg/L. concentração de carboxipeptidase de 10mg/L e a um pH de 8,5.It was observed that when trypsin and carboxypeptidase were added together in the reaction mixture, the form Desocapeptide and desthreonine were not observed. At the end of the reaction, aspart is the main product. The purity and yield of the generated aspart vary under individual reaction conditions. The best 75% yield of aspart was observed under trypsin concentration of 50mg / L. carboxypeptidase concentration of 10mg / L and at a pH of 8.5.
EXEMPLO 4B (II):EXAMPLE 4B (II):
5gm do cristal precursor de lispro foi dissolvido em 25ml de solução de 1M de TRIS. A concentração do produto da solução foi mantida em 5mg/ml e a concentração de TRIS foi mantida a 0,6 M pelo acréscimo. Alíquotas de certas quantidades foram tiradas ajustando-se o pH da mistura da reação em 2,5N NaOH ou 2Ν de ácido acético glacial. Foram preparadas alíquotas da mistura da reação a um pH de 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0. 1 ml de cada uma das misturas de reação foi colocado em cada tubo e rotulado como amostra A, B, C1 etc. A reação foi realizada em todas as amostras acrescentando-se tripsina e carboxipeptidase B juntas em diferentes concentrações. As diferentes condições estão tabuladas.5gm of the lispro precursor crystal was dissolved in 25ml of 1M TRIS solution. The solution product concentration was maintained at 5mg / ml and the TRIS concentration was maintained at 0.6 M by the addition. Aliquots of certain amounts were taken by adjusting the pH of the reaction mixture to 2.5N NaOH or 2Ν glacial acetic acid. Aliquots of the reaction mixture were prepared at a pH of 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0. 1 ml of each of the reaction mixtures was placed in each tube and labeled as sample A, B, C1 etc. The reaction was performed on all samples by adding trypsin and carboxypeptidase B together at different concentrations. The different conditions are tabulated.
Parâmetros Constantes:Constant Parameters:
• Concentração do produto 5g• Product concentration 5g
• Concentração de tampão TRIS 0,6M• 0.6M TRIS buffer concentration
• Parâmetros Variados:• Miscellaneous Parameters:
• Concentração de tripsina: 25-200 mg/L• Trypsin concentration: 25-200 mg / L
• Concentração de carboxipeptidase: 10-30mg/L• Carboxypeptidase concentration: 10-30mg / L
• PH: 7.0-9.0.• PH: 7.0-9.0.
<table>table see original document page 31</column></row><table> <table>table see original document page 32</column></row><table><table> table see original document page 31 </column> </row> <table> <table> table see original document page 32 </column> </row> <table>
Resultados:Results:
Foi observado que, quando a tripsina e a carboxipeptidase foram acrescentadas juntas na mistura da reação, não foi observada a forma Des octapeptídio e des-treonina. O melhor rendimento de 78% de Iispro foi observado sob concentração de tripsina de 50mg/L. concentração de carboxipeptidase de 10mg/L e a um pH de 8,5.It was observed that when trypsin and carboxypeptidase were added together in the reaction mixture, the form Desocapeptide and desthreonine were not observed. The best yield of 78% Iispro was observed under trypsin concentration of 50mg / L. carboxypeptidase concentration of 10mg / L and at a pH of 8.5.
EXEMPLO 4B (III):EXAMPLE 4B (III):
5gm do cristal precursor de glulisina foi dissolvido em 25ml de solução de 1M de TRIS. A concentração do produto da solução foi mantida em 5mg/ml e a concentração de TRIS foi mantida a 0,6 M pelo acréscimo. Alíquotas de certas quantidades foram tiradas ajustando-se o pH da mistura da reação em 2,5N NaOH ou 2N de ácido acético glacial. Foram preparadas alíquotas da mistura da reação a um pH de 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0. 1 ml de cada uma das misturas de reação foi colocado em cada tubo e rotulado como amostra A, B, C, etc. A reação foi realizada em todas as amostras acrescentando-se tripsina e carboxipeptidase B juntas em diferentes concentrações. As diferentes condições estão tabuladas.5gm of the glulisine precursor crystal was dissolved in 25ml of 1M TRIS solution. The solution product concentration was maintained at 5mg / ml and the TRIS concentration was maintained at 0.6 M by the addition. Aliquots of certain amounts were taken by adjusting the pH of the reaction mixture to 2.5N NaOH or 2N glacial acetic acid. Aliquots of the reaction mixture were prepared at a pH of 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0. 1 ml of each of the reaction mixtures was placed in each tube and labeled as sample A, B, C, etc. The reaction was performed on all samples by adding trypsin and carboxypeptidase B together at different concentrations. The different conditions are tabulated.
Parâmetros Constantes:Constant Parameters:
• Concentração do produto 5g• Product concentration 5g
· Concentração de tampão TRIS 0,6M· 0.6M TRIS Buffer Concentration
Parâmetros Variados:Miscellaneous Parameters:
• Concentração de tripsina: 25-200 mg/L• Trypsin concentration: 25-200 mg / L
• Concentração de carboxipeptidase: 10-30mg/L• Carboxypeptidase concentration: 10-30mg / L
• PH: 7.0-9.0.• PH: 7.0-9.0.
<table>table see original document page 33</column></row><table> Exemplo 5:<table> table see original document page 33 </column> </row> <table> Example 5:
<table>table see original document page 34</column></row><table><table> table see original document page 34 </column> </row> <table>
ados: O melhor rendimento de 78% de glulisina foi observado sobThe best yield of 78% glulisine was observed under
Foram realizadas as melhores condições.explicadas acirna.para.as.reações concentração de tripsina ae 5umg/L. concentração de carboxipeptidase de 1Omg/L e de enzima para o precursor de lispro, asparte e glulisina.The best conditions were explained above for the reactions trypsin concentration at 5 µg / L. 10 mg / L carboxypeptidase concentration and enzyme for lispro, asparte and glulisine precursor.
A mistura da reação de enzima de extremidade individual foi precipitada acrescentando-se tampão de ácido cítrico e solução de ZnCl2, e ajustando-se o pH. (O tampão de ácido cítrico inclui 15,4 g/L de ácido cítrico (anídrico), 90 g/L de tampão de di-sódio ortofosfato (anídrico), pH ajustado a 6,3 + 0,1 χ com ácido o- fosfórico). A precipitação foi feita a uma faixa de pH de 4,0 a 10,0, de preferência de 6,0 a 8,0. A concentração do produto era de preferência de 1 a 10 g/L. Após a precipitação, o produto foi separado do sobrenadante limpo por centrifugação ou decantação do sobrenadante sem perturbar o precipitado assentado. O precipitado obtido foi lavado com água gelada para remover os íons não ligados presentes.The single-ended enzyme reaction mixture was precipitated by adding citric acid buffer and ZnCl2 solution, and adjusting the pH. (Citric acid buffer includes 15.4 g / l citric acid (anhydrous), 90 g / l dihydrogen phosphate buffer (anhydrous), pH adjusted to 6.3 + 0.1 χ with phosphoric). Precipitation was at a pH range of 4.0 to 10.0, preferably from 6.0 to 8.0. The concentration of the product was preferably from 1 to 10 g / l. After precipitation, the product was separated from the clean supernatant by centrifuging or decanting the supernatant without disturbing the settled precipitate. The obtained precipitate was washed with ice water to remove the unbound ions present.
O rendimento do processo de precipitação é de 85 a 90%. A descrição e os exemplos acima foram dados somente para facilidade de entendimento. Não se devem interpretar limitações desnecessárias desses exemplos, já que as modificações serão óbvias às pessoas hábeis no ofício que irão reconhecer que a invenção pode ser praticada com modificações e variações dentro do espírito das reivindicações anexas.The yield of the precipitation process is from 85 to 90%. The above description and examples are given for ease of understanding only. Unnecessary limitations on these examples should not be construed, as the modifications will be obvious to those skilled in the art who will recognize that the invention may be practiced with modifications and variations within the spirit of the appended claims.
As instrumentalidades aqui relatadas superam os problemas que são explicados acima e fazem o ofício progredir pelo fornecimento de um método de reação que inibe a perda do produto e possui relativa facilidade de operação em relação a outros métodos conhecidos. Este sistema reduz custos usando as metodologias descritas para obter uma determinada eficiência de conversão melhorada em relação a qualquer processo conhecido, dessa forma superando conhecidas desvantagens neste domínio de ofício.The instrumentalities reported here overcome the problems explained above and advance the craft by providing a reaction method that inhibits product loss and is relatively easy to operate compared to other known methods. This system reduces costs by using the methodologies described to achieve a certain improved conversion efficiency over any known process, thereby overcoming known disadvantages in this craft domain.
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