CA2518761A1

CA2518761A1 - Utilisation des genes leprotl1 et ob-rgrp pour le criblage de composes actifs sur la prise ou la perte de poids ou le diabete d'un sujet humain ou animal

Info

Publication number: CA2518761A1
Application number: CA002518761A
Authority: CA
Inventors: Bernard Bailleul; Yves Rouille; Karin Seron; Sandrine Belouzard
Original assignee: Individual
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2003-03-10
Filing date: 2004-03-10
Publication date: 2004-09-23
Also published as: FR2852397A1; WO2004080272A3; US20060068429A1; FR2852397B1; EP1601973A2; WO2004080272A2

Abstract

La présente invention concerne une méthode d'identification de composés acti fs sur la perte ou la prise de poids ou le diabète chez un sujet humain ou animal, caractérisé en ce que l'on mesure l'effet dudit composé sur (a) l'expression de l'un au moins des gènes LEPROTL1 et OB~ RGRP ou partie de ce ux- ci, et/ou (b) le transport intracellulaire jusqu'à la membrane cellulaire, et/ou (c) la présence au niveau de la membrane cellulaire, et/ou (d) l'internalisation depuis la membrane, des protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou partie de ceux-ci.

Description

2 PCT/FR2004/000572 DE COMPOSES ACTIFS SUR LA PRISE OU LA PERTE DE POIDS OU LE
DIABETE D'UN SUa7ET HUMAIN OU ANIMAL.
La présente invention concerne le domaine du diagnostic, de la prévention et du traitement de l'obésité
de la perte de poids, associé ou non à des désordres hormonaux et également au diabète cher l'homme ou l'animal.
L'invention vise plus particulièrement à offrir une nouvelle méthode de criblage de composas utiles pour traiter ou prévenir l'obésité ou la perte de poids, ou le diabète cher un sujet humain ou animal, basée sur l'utilisation des gènes LEPROTL1 et OB-RGRP et le trafic des protéines codées par ces gènes, respectivement l'endospanine et OB-RGRP.
On a décrit dans l'art antérieur une famille de petites protéines hydrophobes dont les représentants humain et murin appelés OB-RGRP (leptin receptor Bene related protein) proviennent d'un épissage alternatif au niveau du locus du récepteur de la leptine (OB-R), mais qui ne présentent pas de similarité de séquence avec les isoformes d'OB-R et dont la fonction n'a pas été élucidée (Bailleul, B. et al . , 1997, Nucleic Acids Res . , 25, 2752-2758 ) . Il a également été rapporté l'existence d°une protéine, nommée l'endospanine, très homologue à OB-RGRP, codée par le gène LEPROTL1 (leptin receptor overlapping transcript-lik.e 1) (Huang, Y. et al., 2001, Biochim. Biophys. Acta, 1517, 327-331). Au niveau cellulaire, ces protéines à quatre domaines transmembranaires sont localisées dans des domaines membranaires riches en cholestérol et glyco-sphingolipides (les rafts) (Séron, ~~ et al.; poster de congrès). Ces protéines sont exprimées dans un grand nombre de tissus et notamment dans la plupart des tissus périphériques.
Les travaux de recherche rés.lisés dans le ca.c~re de l'invention ont permis de suggérer le rôle d'OB-RGRP et de l'endospanine sur l'expression d'OB-R à la surface des cellules. Ainsi, l'étude de l'expression des gènes codant ces protéines montre une co-expression de ces deux gènes, en particulier dans les cellules d'organes exprimant OB-R
(~eicer~ Jo et ~?1.~ 2000~ ~o ï~eur~endocrin~lo, 12, ~~~-X55)0 Il a en outre maintenant été mis en évidence que le gène codant l'endospanine participe au trafic intracellulaire d'OB-R et ainsi régule le taux d'OB-R au nives.u de la membrane externe de la cellule. Oes gènes jouent donc probablement un r~le sur la sensibilité de la cellule à la leptine et leur régulation permet de définir une nouvelle stratégie pharmacologique pour intervenir sur la sensibilité
à la leptine par l'augmentation ou la réduction de l'expression d'OB-R au niveau de la membrane des cellules et de traiter ou prévenir la perte ou prise de poids par les individus humains ou animaux.
Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de l'invention permettent également maintenant d'expliquer le dimorphisme sexuel, au niveau du taux de masse graisseuse et du taux de leptine circulante. I1 a en outre maintenant été
mis en évidence que LEPROTL1 et OB-RGRP sont régulés par certaines hormones sexuelles. Plus particulièrement, une régulation hormonale de ces deux gènes permet de rendre compte du polymorphisme sexuel et des variations durant la vie de la femme, du taux de leptine circulant et donc de la répartition et de la prise de masse adipeuse.
La présente invention a donc pour objet une méthode d'identification de composés actifs sur la prise ou perte de poids ou le diabète chez un sujet humain ou animal consistant à mesurer l'effet de ces composés sur (a) l'expression dry l'un au moins des gènes LEPROTLI et OB-RGRP
ou partie de ceux-ci et/ou (b) le transport intracellulaire jusqu'à la membrane cellulaire et/o~. (c) la présence au niveau de la membrane cellulaire des protéines et/ou (d)

3 l'internalisation depuis la membrane, des protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou partie de ceux-ci.
En effet, l'étude du trafic intracellulaire de l'endospanine, a permis de montrer que cette protéine passe à la starface cell~al~.ire et est ens~.ite en~?~cyt~sée puis dégradée dans les lysosomes. I1 est probable q~.e OE-RGRP
participe au même trafic intracellulaire.
Plus particulièrement la méthode de 1°invention comprend (i) la mise en contact d°~.n composé à tester avec des cellules exprimant 1 ° un au moins des gènes LL'P.~~TL1 et ~~-R~i~P ou fragments de ceux-ci, puis ( ii ) la mesure de la quantité de protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou partie de ceux-ci présente au niveau de la membrane desdites cellules et/ou leur internalisation.
Avantageusement, l'endospanine et/ou OB-RGRP ou partie de celles-ci sont marquées de façon à pouvoir être détectées et ainsi réaliser la mesure de la méthode de l' invention.
Tout type de marquage peut être envisagé dans le cadre de la méthode de 1°invention, mais on préfère un marquage de type tag peptidique.
La méthode de l'invention peut être mise en aeuvre in vitro sur un modèle de cellules en culture ou in vivo dans un modèle animal.
La méthode de l'invention peut comprendre également la mesure de l'expression et/ou du transport avantageusement jusqu' à la surface de la membrane des cellules d' OB-R, ou encore dans le cas d'un modèle animal, la mesure de la leptine circulante.
Les modèles cellulaires ou animaux mis en oeuvre dans le cadre oie la méthode de l'invention peuvent âtre du type soit exprimant LE°P.i~~TL1 et/ou ~~-RG1~P ou fragments de ceux ci de fanon endogène soit génétiquement modifié pour exprimer lesdits L~1~~~TL1 et/ou ~~-.F~~~P o~. fragments c~e ceux-ci sous la forme de protéines recombinantes.

4 A titre d'exemple de modèles cellulaires exprimant naturellement LEPROTL1 et/ou OB-RGRP on peut citer un modèle humain comme Hela, 293 ou HepG2 ou marin comme 3T3, des cultures primaires pourraient également être utilisées. Tout type de cellules peut être utilisé car l~. plu~aa2t eues lignées et tissus expriment l'endospanine et OE-l~Gà~P.
A titre d'exemple de modèles animaun exprimant n~.turellement LEPROTL1 et/ou OB-RGRP on peut citer 1~.
sou2is, le rat et le lapin.
On préfère toutefois, une mise en ouvre de l'invention sur des cellules transformées pour exprimer tout ou partie de l'un ou moins des gènes, LEPROTL1 et/ou OB-RGRP. I1 s'agit avantageusement de cellules en culture, mais l' invention peut être aussi mise en oeuvre sur des animaux obtenus par transgénèse selon des techniques décrites dans la littérature à partir de LEPROTLI et/ou OB-RGRP ou fragments de ceux-ci.
On préfère pour la mise en aeuvre de l' invention des cellules en culture qui ont été génétiquement modifiées pour exprimer l'un au moins de LEPROTL1 et/ou OB-R GRP ou fragments de ceux-ci.
Les séquences de l'ADNc de LEPR OTL1 humain et de 1°endospanine humaine et de souris sont données dans la liste de séquence en annexe respectivement sous les numéros SEQ ID N0.1, SEQ ID N0.2 et SEQ ID N0.3.
Les séquences de l'ADNc d'OB-RGRP humain et de la protéine humaine et marine sont données dans la liste de séquence en annexe respectivement sous les numéros SEQ ID
N0.4, SEQ ID N0.5 et SEQ ID N0.6.
Ces cellules génétiquemr~nt modifiées sont préparées par des techniques bir~n conn~.es de l'homme du métier mr~ttant en ouvre des vecteurs d'expression.
Il peut, bien entendu, s'a.gir ~.es formes humaines, marines, ou de toutes autres espèces dès lors que ceux-ci présentent avantageusement au moins 80~ d'homologie avec LEPROTL1 et OB-RGRP humains.
I1 peut aussi s'agir de fragments ou de séquences modifiées par l'addition, la délétion ou le changement d'un

5 ou plusieurs n~aclLotides~ de ces gèncss c~ès lors q~.e l~.
protéine coe~ée par ses fragments ou séq~.ences modifiées peut ètre transportée jusqu'à l~. membrane de la cellule et avantageusement ètre ens~.ite internalisée.
LTne forme préférée de l'invention consiste à exprimer une forme modifiée de LEPROTL1~ OB-RGRP ou fragments de ceu~~-ci de façon à produire des protéines marquées. Le marquage consiste avantageusement en un tag peptidique. On entend aussi par forme modifiée de ces gènes, des gènes codant pour des protéines tronquées, c'est-à-dire présentant une délétion d'un ou plusieurs acides aminés, utile notamment pour le marquage peptidique.
Comme indiqué précédemment l'endospanine et/ou OB-RGRP comprennent quatre domaines transmembranaires. Ainsi, à
titre d'exemple préféré, un fragment et une forme modifiée de LEPROTL1 ou OB-RGRP code pour une protéine modifiée comprenant au moins deux des quatre domaines transmembranaires et un marqueur peptidique sous la forme de protéines de fusion.
Le marqueur de l'endospanine et/ou d'OB-RGRP ou fragments de celles-ci peut être identique ou différent. A
titre d'exemple de marqueurs peptidiques généralement utilisés , on peut citer .
HA de séquence YPYDVPDYA (SEQ ID N0. 7) c-mec . séquence E~RLISEEDL (SEQ ID NO. 8) VSV-G . séquence YTDIEï~iNRLGT~ (sEO ID N~.
HisG . séquence HHHHHH (SEQ ID NO. 10) FL~.G . ~~q~a~n~e D~~DDDD~ ( sE~ ID i~~ . 11 )

6 L'insertion d'un marqueur peptidique dans la protéine complète peut s'effectuer à tout niveau de la protéine ou fragment de celle-ci dès lors qu'il ne modifie pas l'expression de la protéine à la membrane de la cellule et av~.ntageusea~.ent également scan internalisati~n.
t~insi dans le cas de l' enc~ospanine et c~' ~B-RGRP ~ on peut citer les sites entre les acides aminés des positions ~5 à 35 et des positions 32 à 100 de ~E~ ID NO. 2 et ~E~ ID
N'~. 5, c'est-à-dire les deux boucles extracellulaires.
L'extension en N ou C terminal par un marqueur peptidique sur une protéine tronquée est également possible en s'assurant que la délétion positionne l'extrémité terminale et le marqueur en position lumenale/extracellulaire.
Le cadre de lecture devra être intégré dans un vecteur d'expression de type, plasmide (pCI/pCIneo, Promega, pcDNA3, Invitrogen) ou virus (adéno, rétro, vaccine) pour des expressions soit transitoire ou stable.
Comme indiqué précédemment, l'endospanine et/ou OB
RGRP ou partie de celles-ci peuvent être marquées et l' on préfère un marquage de type tag peptidique. La mesure peut s'effectuer alors à l'aide d'un anticorps dirigé contre le marqueur peptidique, intégré par exemple dans l'une des deux boucles lumenales/extracellulaires de l'endospanine, OB-RGRP
ou fragments de celles-ci ou en prolongation de ces boucles dans les formes tronquées des protéines, par mise en contact de l'anticorps avec les cellules.
La méthode de l'invention peut également être mise en oeuvre sur de l'endospanine et/ou ~B-RGRP non marquées. Des anticorps dirigés contre l'une des deux boucles lumenale/extracellulaire de l'endospanine ou d'~B-RGRP
permettent de détecter la protéine endogène par mise en eontact avec les cellules.
l~. titre d'e~~emple, la position des polypeptides po~.r l'obtention de ces anticorps spécifiques, de préférence

7 monoclonaux, pour identifier l'endospanine et OB-RGRP
endogènes au niveau membranaire se situent entre les acides aminés en positions 25 à 35 et les acides aminés en positions S2 à 100 de SES ID NO. 2 et SES ID X10.5.
La mesure peut alors compren~?re la mise en c~~.vre d'an anticorps secondaire selon des techniques bien connues aie l' homme du métier .
On peut citer plusieurs techniques de l'art antérieur pour quantifier les protéines susceptibles d'être utilisées dans le cadre de l'invention. .
- ELISA . secondaire couplé à la peroxydase, à la phosphatase alcaline ou à une autre enzyme, réaction colorée quantifiable et automatisable, - le Western Blot, - le comptage radioactif (Iode), - l'immunofluorescence . anticorps secondaire fluorescent utile pour une mesure de la morphologie.
D'autres techniques de mesures peuvent être mises en oeuvre, comme par exemple .
- biotinylation de surface et streptavidine, - iodination de surface et immuno-précipitation L'effet du composé à tester selon la méthode de 1°invention peut être réalisé par comparaison des mesures sur des cellules avec et sans la mise en contact avec ledit composé. Cet effet peut être mesuré après ou pendant un temps déterminé de mise en contact des cellules avec ledit composé.
La spécificité du composé à tester vis-à-vis de a) l'expression de l'un au moins des gènes .IsL'P.P~~TLl et ~~-~~1~.1~
et/ou (b) le transport intracellulaire jusqu'à la membrane cellulaire et/ou (c) la présence agi. niveau de la membrane cellulaire des protéines et/ou (d) l'internalisation depuis

8 la membrane, des protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou partie de ceux-ci peut être déterminé en mesurant l'effet du traitement sur d'autres gènes ou protéines.
Ainsi, selon la méthode de l'invention I~téthode, l'effet du c~mp~sé à tester sur le trafic intracellaalaire de l' endospanine et/ou 0B-RGi~P est aussi mesuré à l' aide d' un anticorps dirigé contre une quelconque protéine membranaire de surf~.ce, une partie ou un marqueur de celles-ci.
~n peut citer à titre d'eâemple préféré le récepteur à
la transferine.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique pour la prévention ou le traitement de la prise ou perte de poids ou du diabète comprenant au moins un composé capable de modifier l'expression de l'un au moins des gènes LEPROTL1 et OB-RGRP ou partie de ceux-ci, et/ou (b) le transport intracellulaire jusqu'à la membrane cellulaire, et/ou (c) la présence au niveau de la membrane cellulaire, et/ou (d) l'internalisation depuis la membrane, des protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou partie de ceux-ci. Un tel composé est avantageusement un antagoniste ou un agoniste de l'une au moins des protéines endospanine et OB-RGRP.
L°invention concerne aussi le diagnostic de la prise ou perte de poids ou du diabète chez un sujet humain ou animal consistant à mesurer et avantageusement à comparer avec au moins un témoins, l'expression de 1°un au moins des gènes LEPROTLl et OB-RGRP ou partie de ceux-ci, et/ou (b) le transport intracellulaire jusqu'à la membrane cellulaire, et/ou (c) la présence au niveau de la membrane cellulaire, et/ou (d) l'intern~.lis~.tion depuis 1~. membrane, des protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou partie de ceux-ci

9 D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent, où il sera fait références aux dessins en annexe dans lesquels .
La figure 1 représente la séquence de l'ADNc d~. gène LEPl~~TL1 où le cadre de lecture est souligné.
La figure 2 représente l'alignement des séquences de l'endospanine et d'~B-RGRP humaine et murine. Les quatre domaines transmembrans.ires de ces protéines sont indiqués en ligne 1.
La figure 3 représente des cellules HeLa, en double marquage en immunofluorescence indirecte, exprimant l'endospanine-HA-B1, incubées en présence d'anticorps de souris anti-HA. La fluorescence verte révèle les anticorps anti-HA internalisés (A et C). La fluorescence rouge révèle l'endospanine, -HA-B1 et endogène, dans ces cellules (B et C).
La figure 4 représente la quantité de récepteur de la leptine en surface rapportée à la quantité totale de récepteur de la leptine cellulaire et normalisée à 100 pour le contrôle, de cellules HeLa co-infectées avec deux adénovirus recombinants afin d'exprimer une quantité
constante de OBRa et des quantités croissantes d'endospanine (multiplicité d'infection de 0 à 80).
La figure 5 représente l'expression de 1°ARNm de OB
RGRP (gauche) et de LEPROTL1 (droit) dans la lignée MCF7 sous traitement à l'oestradiol et à la progestérone par PCR
en temps réel.
La figure 6 représente la distribution et l'intensité
d'expression des ARNm, d'OB-RGRP (gauche) et de LEPROTLl (droit) dans cerveau et fétus de souris.
La figure 7 montre que la surexpression de la protéine CB-RGRP induit une diminution dose-dépendante de 1 ~ e~~pression en s~xrf ace d~. récepteur de la leptine.

Exemple 1 Transport d'une version marauée de l'endospanine de la membrane au cytoplasme 5 1 ) Ni~ah~des .
ITn épit~pe ( ou ' tag' ) HA ( 9 amino-acide . P~IâV~D~'~~ i' ) a été introduit par mutagénèse dirigée dans la première b~ucle (B1) extraeellulaire de l'endospanine, entre les résidus ~'3~
et 1~T31 ( figure 1 et 2 ) . Iâes résidus de liaison ont été

10 inclus de chaque c~té du tag ( respectivement GAS et GA, ) .
lâes cellules HeLa préalablement cultivées sur lamelles de verre ont été transfectées avec un plasmide permettant l'expression de la protéine ainsi marquée ; l'endospanine-HA-B1. Vingt-quatre heures après la transfection, les cellules ont été incubées pendant deux heures dans du milieu de culture contenant un anticorps monoclonal anti-HA. Les cellules ont été ensuite rincées puis incubées dans du milieu de culture dépourvu d'anticorps. Les cellules ont été
fixées dans une solution de paraformaldéhyde à 3~.
L'anticorps anti-HA internalisé a été révélé à l'aide d'un anticorps anti-IgG de souris marqué à l'alexa-488, après perméabilisation préalable des cellules par une incubation dans une solution contenant du triton X-100 à 0,1~.
L'endospanine a été révélé, à l'aide d°un antiserum de lapin anti-endospanine contre le dodecapeptide de la partie C-terminale et par un anticorps anti-IgG de lapin marqué à
l'alexa-594. Les préparations ont été observées sur un microscope à immunofluorescence.
2) Résultats.
tTn signal cytoplasmique ponctué a été observé, indiquant que des anticorps anti-HA avaient été internalisés depuis la membrane plasmique vers des compartiments endosomaux intra-cytoplasmiques (figure 3A et C). Pour

11 montrer que ce marquage correspondait bien à des protéines internalisées, un marquage total a été réalisé sur les mêmes cellules, après fixation, à l'aide d'un anticorps dirigé
contre la partie C-terminale de l'endospanine. Le pattern de ce marqus.ge tot~.l oiiffére c~nsi~érablement de celui correspon~.ant à la protéine intern~.lisée~ d'une p~.rt~ et reproduit le p~.ttern de l'endospanine endogéne(figure 3E et C). Ceci démontre que le marquage à l'anticorps anti-HA
résulte bien d'une internalisation ~.e 1~, protéine de surface et indique que l'adressage en surface cellulaire de la protéine marquée d'un épitoge HA ne résulte pas d'un artefact de surexpression, et qu'elle se comporte donc probablement comme la protéine endogène.
Comme contrôle, la même expérience a été effectuée en parallèle avec l'endospanine porteuse du même épitoge HA
dans sa boucle cytosolique (entre les résidus M62 et S63).
Cette boucle n'est pas exposée vers l'extérieur de la cellule. Elle est par conséquent inaccessible aux anticorps anti-HA présents dans le milieu de culture. Comme prévu, cette construction n'a pas permis d'observer d°internalisation de l'anticorps anti-HA.
Ces résultats démontrent que l'endospanine dans laquelle un épitoge HA a été inseré (dans sa première boucle extracellulaire) est adressée vers la membrane plasmique de la cellule, puis internalisée dans des endosomes. Quatre à
cinq heures après internalisation, le signal correspondant à
1°anticorps anti-HA ne pouvait plus étre détecté. Cette perte du marquage montre que l'endospanine a été transportée vers des compartiments intracellulaires, probablement des lysosomes, où. les anticorps internalisés ont été dégrs.dés.
Exem~ale 2 Modulation de l'ex ression du réce tsar de la le~otine ~. la surfs.ce des cellules far 1~endos~aanine.

12 1) Méthodes.
Des adénovirus recombinants exprimant une isoforme courte (OB-Ra) d'OB-R murin, d'une part, et l'endospanine humaine ont êtê construits par recombinaison homologue. OB-R
exprimê par cri vcsctea~r viral comporte un épitoge H~. à s~n extrêmité ~-terminale. Des cell~.les HeL~. ont êté co-infectées avec le virus exprimant le récepteur et des doses croissantes de virus exprimant l'endospanine. Après 2~
heures d'expression, les protéines de surf ace ont été
biotinylêes à 4~C. Les cellules ont ensuite êtê lycées puis les lysats cellulaires clarifiés par centrifugation. Les niveaux relatifs de récepteurs biotinylés (surface) ont été
quantifiés par immunoblot à partir du matériel purifiê par billes de streptavidine-agarose et révélation par immunoblot après séparation des protéines par électrophorèse en gel de polyacrylamide. Les récepteurs totaux (surface + interne) ont été quantifiés en parallèle par la même méthode à partir d'un dixième de chaque lysat cellulaire. OB-Ra a été révélé
avec un anticorps anti-HA. Les mêmes immunoblots ont ensuite été révélés grâce à un anticorps dirigé contre le récepteur de la transferrine. Les quantités de récepteurs de surface ont été exprimées par le rapport de la quantité de récepteur dans la fraction biotinylée sur la quantité de récepteur présente dans les lysats cellulaires totaux.
2) Résultats et conclusions.
L°expression en surface d'OB-R est affectée par la surexpression de 1°endospanine. La surexpression de l'endospanine induit une diminution dose-dépendante de l'expression en surface d'OB-R (figure 4) sans aucun impact sur l'expression en surface du récepteur de la transferrine.
Ces résultats démontrent la spécificité des effets observés sur 1°exgression en surface d'OB-R et saaggérent que

13 l'endospanine participe à la régulation de l'expression en surface de ce récepteur.
Exemple 3 Régulation hormonale de LEPR~TL1 et ~B-.~~1~P o 1) Méthodes.
L'expression des génes LEPE~TL1, ~E-E~EPo J3-~c~ine et ~~PDFI a été étudié par PCR quantitatif en temps réel sur l'appareil LightCycler (Roche) dans la lignée humaine de cancer du sein MCF7 soumis ou non au traitement soit par la progestérone, soit par l'estradiol. Les cellules MCF7 cultivées dans un milieu DMEM sans rouge de phénol, à 37°C
sous 5~ de CO2, sont privées de sérum pendant une nuit, puis traitées (1~M de progestérone ou d'estradiol) pendant 6 heures. Les ARN totaux ont été préparés en utilisant les kits . QIAGEN, RNeasy~. Les cDNA (2~tg d'ARN dans un volume de 25~L), sont obtenus à l'aide de la Reverse Transcriptase (M-MLV, Promega) et d'oligonucléotides Random p(dN6) (Roche) comme amorces et par la méthode recommandée par le fournisseur.
Nous avons utilisé le kit et les matériels de la société Roche ; (LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I, LightCycler Capillaries). Les quantifications ont été
effectuées avec des ADNc correspondant à 100ng d'ARN par la méthode recommandée par le fournisseur.
Les oligonucléotides pour les PCR en temps rêel sont les suivants.
LEPROTL1:
5'CAAATACTGGCCCCTCTTTGTTCATT3' (SEQ ID N0. 12) 5'TCAGTAATTTCTTTTCACCACTGCTGC3' (SEQ ID N0. 13) OB-RGRP .
5'AGCAGCCGCGGCCCCAGTTC3' (SEQ ID N0. 14) 5'A~.GGCCGCAGGCTCCCCATTT3' (SE~ ID N0. 15) l3-Actine

14 5'CACACTGTGCCCATCTACGAG3' (SEQ ID NO. 16) 5'CGTGGTGGTGAAGCTGTAGCC3' (SEQ ID NO. 17) GAPDH
5'GTGAAGGTCGGAGTCAACG3' (SES ID NO. 18) 5'CATGGGTGGA~~TCG~TATTGG~3~ (SES ID NO. 1°~) 2) Résultats Les saleurs d'expression d'OB-RGRP(ARNm) et de LEP.~OTLI (ARNm) , (normalisées par les ARNm de .~-Aoti.~ae et GAPDH) pour le traitement solvant seul et les deux traitements hormonal, incluant 1~inter~alle de confiance à
95% sont représentées dans la figure 5.
Les réductions d'expression d'OB-RGRP(ARNm) par les deux hormones et l'augmentation d'expression de LEPROTLl(ARNm) par la progestérone sont significatives (p<0,05 pour N=46 pour OB-RGRP/l3-Actine ou OB-RGRP/GAPDH, N=24 pour LEPROTL1/J3-Actine ou LEPROTL1/GAPDH) . Une réduction d'expression d'OB-R(ARNm) par ces mêmes hormones a été décrite (Duggal, P. S. et al., 2002, Reproduction 123(6), 899-905, Kitawaki, et al., 2000, J Clin Endocrinol Metab 85(5), 1946-50, Koshiba, et al., 2001, Mol Hum Reprod 7(6): 567-72. Ceci suggère que ce soit probablement le promoteur commun à OB-RGRP et OB-R qui est régulé par ces hormones.
La régulation de ces gènes par les hormones et leur rôle dans le trafic intracellulaire de la leptine pourraient rendre compte du dimorphisme sexuel humain dans le taux de masse graisseuse et le taux de leptine circulant (Hickey, M.
S. et al., 1996, Biochem Mol Med 59(1): 1-6.) ~0 Exemple 4 E~~ ression de LEPROTL1 et OB-RGRP cens cerceau et fétus de souris.

L'expression de LEPROTL1(ARNm) par Northern blots (Huang, Y. et al., 2001, Biochim. Biophys. Acta, 1517, 327-331) observée dans de nombreux tissus est analogue à
l'expression d'OB-RGRP(ARNm) (Eailleul, H. et al., 1997~
5 N~acleic Acids Reso, 25, 2752-2758). Nous avons analysé par hybridation in situ l'expression des ARNm de LEPROTLI cst OB-RGRP, dans cerveau et fétus de souris.
1) méthodes 1o La distributi~n de LEPROTLI(ARNm) et OB-RGRP(ARNm) sur des coupes de cerveau et de fétus a été étudiée par hybridation in situ par une technique décrite en détail précédemment, en utilisant des sondes marquées au 35S d'ARN
antisens reconnaissant les exons 3 et 4 d'OB-RGRP, (Mercer,

15 J. et al., 2000, J. Neuroendocrinol., 12, 649-655) ou les 415 paires de bases de LEPROTL1(ADNc) de souris, générées par PCR utilisant les primers suivants .
ACGAATTCACCGCCATGGCAGGCATC, (SEQ ID N0. 20) et ACTCTAGACCACTGCTGCCAGCTGAAG(SEQ ID NO. 21).
Les deux sondes ont été hybridées sur des 20um coronales adjacentes sections du cerveau de souris au niveau de l'hypothalamus (A; bregma 0.82mm B; bregma 1.46mm) ou de fétus de 13.5 jours p.c. avec le placenta (C).
2) Résultats Les signaux auto-radiographiques générés par hybridation in situ avec la sonde LEPROTL1 sont plus intenses que ceux observés avec la sonde OB-RGRP, à un même taux de radioactivité et une identique radioactivité
spécifique. L'expression de LEPROTL.Z est similaire en distribution et en abondance relative ~. l'expression d'OB-RGRP (Figure 5). Dans les coronales sections à travers l'hypothalamus, les deux, OB-R GRP et LEPROTLI anti-sens sondes hybrident avec un nombre de structures définies, avec

16 un signal d'intensité plus faible, largement distribué. La sonde sens montre un faible et uniforme signal (donnée non montrée). Les deux ARNm sont largement exprimés dans l'hippocampe, incluant le gyrus denté (DG). D'au.tres str~.ctures /tissus avec des, signaux ARNm distincts incluant le plexus chor~ïde (CP), le cortex piriforme, les noyaux paraventriculaire (PAN), arqué (ARC), ventromédian (~MH) et l' hypothalamus latéral ( LH ) ( f figure 6 ) . Dans les aires du systéme nerveux central décrit ci-dessus, la localisation au microscope des grains d'argent de l'épreuve est identique aux neurones colorées au bleu de toluidine.
Les sondes de LEPROTL1 et d'OB-RGRP montrent un profil similaire d'hybridation dans les coupes de fétus et de placenta. Dans les tissus embryonnaires, LEPROTLl est plus fortement exprimé dans le cerveau en développement et les poumons, où un enrichissement de signal est observé pour la sonde OB-RGRP.
Ces données suggèrent que, comme décrit pour OB-RGRP, l'expression de LEPROTL1 est répartie d'une manière étendue dans le cerveau et le fétus avec des régions de plus forte expression dans quelques régions incluant les noyaux hypothalamiques et les régions du cerveau qui expriment l'ARNm et la protéine d'OB-R.
Exemple 5 Modulation de 1°ex ression du réce teur de la leptine à la surface des cellules par la protéine OB-RGRP.
1) Méthodes Des adenovirus recombinants exprimant une isoforme courte (oH-Ra) du récepteur de la leptine marin, d'une part, et la protéine OH-RGRP humaine ont été construits par recombinaison homologue. Le récepteear de la leptine ex~arimé
par ce vecteur viral comporte un épitope HA à son extrémité

17 N-terminale. Des cellules HeLa ont été co-infectées avec le virus exprimant le récepteur et des doses croissantes de virus exprimant la protéine OB-RGRP. L'expression en surface du récepteur de la leptine a été quantifiée par biotin~lati~n ces protéines de surf~.ce~ lise ~?es cellules~
précipitation chu matériel biotinylé p~.r ces billes de streptavidinr~-agarose et révélation par immunoblot après séparation des protéines par électrophorèse en gel de polyacr~rlamide. Le récepteur de la leptine a été révélé avec un anticorps anti-HA. Une portion du lysat cellulaire a également été soumise à la méme analyse afin de déterminer la quantité totale de récepteurs (surface + interne). Les quantités de récepteur de surface ont été exprimées par le rapport de la quantité de protéine dans la fraction biotinylée sur la quantité de protéine présente dans les lysats cellulaires totaux.
2) Résultats L'expression en surface du récepteur de la leptine est affectée par la surexpression de la protéine OB-RGRP. La surexpression de la protéine OB-RGRP induit une diminution dose-dépendante de l'expression en surface du récepteur de la leptine (Figure 7). La quantité totale de récepteur de la leptine (surface + interne) n'est pas affectée par la surexpression de la protéine OB-RGRP. Ces résultats démontrent la spécificité des effets observés sur l'expression en surface du récepteur de la leptine et suggèrent que la protéine OB-RGRP participe à la régulation de l'expression en surface du récepteur de la leptine.

LISTAGE DE SEQUENCES
<110> Centre National de la Recherche Scientifique <120> TTtilisation des gènes LEPR~TL1 et OE-RGRP pour le criblage de composés actifs sur la prise ou la perte de p~ids ou le diaka~ae d'ur~ sujet humain ou animal <130> 27035/PCT
<140> PCTlFRO4/~~~~~~
<141> 2004-03-10 <150> F"R03/02931 <151> 2003-03-10 <160> 19 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 2705 <212> DNA
<213> Homo sapiens <220>
<221> DNA
<222> (1)..(2705) <223> ADNc du LEPROTL1 humain <220>
<221> CDS
<222> (85)..(480) <223> Cadre de lecture codant l'endospanine humaine <400> 1 ccgccgtagc gcgtcttggg tctcccggct gccgctgctg ccgccgccgc ctcgggtcgt 60 ggagccagga gcgacgtcac cgcc atg gca ggc atc aaa gct ttg att agt 111 Met Ala Gly Ile Lys Ala Leu Ile Ser ttg tcc ttt gga gga gca atc gga ctg atg ttt ttg atg ctt gga tgt 159 Leu Ser Phe Gly Gly Ala Ile Gly Leu Met Phe Leu Met Leu Gly Cys gcc ctt cca ata tac aac aaa tac tgg ccc ctc ttt gtt cta ttt ttt 207 Ala Leu Pro Ile Tyr Asn Lys Tyr Trp Pro Leu Phe Val Leu Phe Phe tac atc ctt tca cct att cca tac tgc ata gca aga aga tta gtg gat 255 Tyr Ile Leu Ser Pro Ile Pro Tyr Cys Ile Ala Arg Arg Leu Val Asp gat aca gat gct atg agt aac gct tgt aag gaa ctt gcc atc ttt ctt 303 Asp Thr Asp Ala Met Ser Asn Ala Cys Lys Glu Leu Ala Ile Phe Leu aca acg ggc att gtc gtg tca gct ttt gga ctc cct att gta ttt gcc 351 Thr Thr Gly Ile Val Val Ser Ala Phe Gly Leu Pro Ile Val Phe Ala aga gca cat ctg att gag tgg gga gct tgt gca ctt gtt ctc aca gga 399 Arg Ala His Leu Ile Glu Trp Gly Ala Cys Ala Leu Val Leu Thr Gly aac aca gtc atc ttt gca act ata cta ggc ttt ttc ttg gtc ttt gga 447 Asn Thr Val Ile Phe Ala Thr Ile Leu Gly Phe Phe Leu Val Phe Gly agc aat gac gac ttc agc tgg cag cag tgg tga aaagaaatta ctgaactatt 500 Ser Asn Asp Asp Phe Ser Trp Gln Gln Tri gtcaaatgga cttcctgtca tttgttggcc attcacgcac acaggagatg gggcagttaa 560 tgctgaatgg tatagcaagc ctcttggggg tattttaggt gctcccttct cacttttatt 620 gtaagCataC tattttCaCa gagaCttgCt gaaggattaa aaggattttC tCttttggga Gô~
aaagcttgac tgatttcaca cttatctata gtatgctttt tgtggtgtcc tgctgaattt 74.0 aaatatttat gtgtttttcc tgttaggttg attttttttg gaatcaatat gcaatgttaa 800 acactttttt taatgtaatc atttgcattg gttaggaatt cagaattccg ccggctctat 860 tactggtcaa gtacatcttt tctcttaaaa ttatttagcc tccattatta caaaaaatta 920 taaaaataag ttttcagtca gtcaggatga catcactccc aatgttatgc agacatacag 980 acggttggca tacgttatag actgtatact cagtgcaaat atagctgcat ttatacctca 1040 gaggggccaa gtgttaatgc ccatgccctc cgttaagggt tgttggtttt actggtagac 1100 agatgttttg tggattgaaa attattttat ggaattgcta cagaggagtg cttttcttct 1160 caattgttag aagaatttat gttaaacttt aaggtaaggg tgtaaaaaca tttttgagat 1220 aaggttttta tttatgttta ttattgttag agtgagttgc aatgtgggaa gaaatgacat 1280 tgaaattcca gtttttgaat cctgtttcta tttataagtg aaatttgtga tctcctatca 1340 acctttcatg ttttaccctg ttaaaatgga catacatgga accactactg atgagggaca 1400 gttgtatgtt tgcatcatat atgccagaaa accttcctct gcttcctcct tttgacttat 1460 ttggtatgtt gtatatatta cataaaataa cttttcaaat atagtttaat aacacttaga 1520 agtgtttact tacctggaaa ataattgcta tgccgtacat tcagagtgcc ccctcccctg 1580 caaggccttg ccatgattaa caagtaactt gttagtctta cagataattc atgcattaac 1640 agtttaagat ttagaccatg gtaatagtag ttcttattct ctaaggttat atcatatgta 1700 atttaaaagt atttttaaga caagtttcct gtatacctct gaactgtttt gattttgagt 1760 tcatcatgat agatctgctg tttccttata aaaggcattt gttgtgtgag ttaatgcaaa 1820 gtagccaagt ccagctatat agcagcttca gaaacatacc tgaccaaaaa attcccagta 1880 aCCaggCatg atCaatttat agtggtCgtt taCatCtaat aattatCagg aCttttttCa 1940 ggagtgggtt ataaaaacat tcaagttggt ctgacagtat tttgttaagg atatttgttt 2000 gtatgtttat tcagtatact tacataaaaa ttatttcgcc atcagccaaa actcagtaat 2060 catgacagct gtctgttgtt ttatgaagtt tatttctcaa gaaaatggga ataaatttgg 2120 gatttgttca gcttttttac taaagatgcc taaagccaca ggttttattg ectaacttaa 2180 gccatgactt ttagatatga gatgacggga agcaggacga aatatcggcg tgtggctgga 2240 gccttcccac tggaggctga aagtggcttg tggtattata atgttcagat ttcaagagga 2300 aggtgcaggt acacatgagt tagagagctg gtgagacagt tgggaactct ttgtgcttgt 2360 gatctactgg actttttttt tgcaggaagt gcattctctg gtccttccct attttctgtt 2420 CtggatgtCa gtgCagtgCa CtgCtaCtgt tttatCCaCt tggCCaCaga CtttttCtaa 2~~O
CagCtgCgta ttatttCtat ataCtaattg CattggCagC attgtgtCtt tgaCCttgta X540 taCtagCttg aCatagtgCt gtCtCtgatt tCtaggCtag ttaCttgaga tatgaatttt ~6~~
ccatagaata tgcactgata caacattacc attcttctat ggaaagaaaa cttttgatga 2660 tgaaacaata aagattttaa atatctaaat tgttttcaca catgt 2705 <210> 2 <211> 131 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Gly Ile Lys Ala Leu Ile Ser Leu Ser Phe Gly Gly Ala Ile Gly Leu Met Phe Leu Met Leu Gly Cys Ala Leu Pro Ile Tyr Asn Lys Tyr Trp Pro Leu Phe Val Leu Phe Phe Tyr Ile Leu Ser Pro Ile Pro Tyr Cys Ile Ala Arg Arg Leu Val Asp Asp Thr Asp Ala Met Ser Asn Ala Cys Lys Glu Leu Ala Ile Phe Leu Thr Thr Gly Ile Val Val Ser Ala Phe Gly Leu Pro Ile Val Phe Ala Arg Ala His Leu Ile Glu Trp Gly Ala Cys Ala Leu Val Leu Thr Gly Asn Thr Val Ile Phe Ala Thr Ile Leu Gly Phe Phe Leu Val Phe Gly Ser Asn Asp Asp Phe Ser Trp Gln Gln Trp <210> 3 <211> 131 <212> PRT
<213> Mus musculus <220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(131) <223> Séquence en acides aminés de 1'endospanine de souris <400> 3 Met Ala Gly Ile Lys Ala Leu Ile Ser Leu Ser Phe Gly Gly Ala Ile Gly Leu Met Phe Leu Met Leu Gly Cys Ala Leu Pro Ile Tyr Asn Gln Tyr Trp Pro Leu Phe Val Leu Phe Phe Tyr Ile Leu Ser Pro Ile Pro 35 a0 Q5 Tyr Cys Ile t'~la Arg t~rg Leu Val Asp Asp Thr Asp Ala Met Ser Asn Ala Cys Lys Glu Leu Ala Ile Phe Leu Thr Thr Gly Ile Val Val Ser Ala Phe Gly Leu Pro Val Val Phe Ala Arg Ala Hïs Leu Ile Glu Trp Gly Ala Cys Ala Leu Val Leu Thr Gly Asn Thr Val Ile Phe Ala Thr Ile Leu Gly Phe Phe Leu Val Phe Gly Ser Asn Asp Asp Phe Ser Trp Gln Gln Trp <210> 4 <211> 1114 <212> DNA
<213> Homo sapiens <220>
<2ê1> DNA
<222> (1)..(1114) <223> ADNc de OB-RGRP humain <220>
<221> CDS
<222> (71)..(466) <223> Cadre de lecture codant la OB-RGRP humaïne <400> 4 gtctggcttg ggcaggctgc ccgggccgtg gcaggaagcc ggaagcagcc gcggccccag 60 ttcgggagac atg gcg ggc gtt aaa gct ctc gtg gca tta tcc ttc agt 109 Met Ala Gly Val Lys Ala Leu Val Ala Leu Ser Phe Ser ggg gct att gga ctg act ttt ctt atg ctg gga tgt gcc tta gag gat 157 Gly Ala Ile Gly Leu Thr Phe Leu Met Leu Gly Cys Ala Leu Glu Asp 15 , 20 25 tat ggc gtt tac tgg ccc tta ttc gtc ctg att ttc cac gcc atc tcc 205 Tyr Gly Val Tyr Trp Pro Leu Phe Val Leu Ile Phe His Ala Ile Ser ccc atc ccc cat ttc att gcc aaa aga gtc acc tat gac tca gat gca 253 Pro I1e Pro His Phe Ile A1a Lys Arg Val Thr Tyr Asp Ser Asp A1a acc agt agt gcc tgt cgg gaa ctg gca tat ttc ttc act act gga att 301 Thr Ser Ser Ala Cys Arg Glu Leu Ala Tyr Phe Phe Thr Thr Gly Ile gtt gtt tct gcc ttt gga ttt cct gtt att ctt gct cgt gtg gct gtg 349 Val Val Ser Ala Phe Gly Phe Pro Val Ile Leu Ala Arg Val Ala Val atc aaa tgg gga gcc tgc ggc ctt gtg ttg gca ggc aat gca gtc att 397 Ile Lys Trp Gly Ala Cys Gly Leu Val Leu Ala Gly Asn Ala Val Ile ttc ctt aca att caa ggg ttt ttc ctt ata. ttt gga aga gga gat gat 445 Phe Leu Thr Ile Gln Gly Phe Phe Leu Ile Phe Gly Arg Gly Asp Asp ttt agc tgg gag cag tgg tag Cactttattc tgattacagt gcattgaatt 496 Phe Ser Trp Glu Gln Trp tcttagaact catactatct gtatacatgt gcacatgcgg cattttacta tgaaatttaa 556 tatgctgggt tttttaatac ctttatatat catgttcact ttaagaaaga cttcataagt 616 aggagatgag ttttattctc agcaaataga cctgtcaaat ttagattatg ttactcaaat 676 tatgttactt gtttggctgt tcatgtagtc acggtgctct cagaaaatat attaacgcag 736 tcttgtaggc agctgccacc ttatgcagtg catcgaaacc ttttgcttgg ggatgtgctt 796 ggagaggcag ataacgctga agcaggcctc tcatgaccca ggaaggccgg ggtggatccc 856 tctttgtgtt gtagtccatg ctattaaaag tgtggcccac agaccaagag cctcaacatt 916 tcctagagcc ttattagaaa tgcagaatct gaagccccac tctggaccca ggacattttg 976 atgagatcca aaggagttgt atgcacatga aagtttgaga agcatcatca tagagaagta 1036 aacatcacac ccaacttcct tatctttcca gtggctaaac cacttaacct ctctgggtgt 1096 tacctgctca tttgttta 1114 <210> 5 <211> 131 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 5 Met Ala Gly Val Lys Ala Leu Val Ala Leu Ser Phe Ser Gly Ala Ile Gly Leu Thr Phe Leu Met Leu Gly Cys Ala Leu Glu Asp Tyr Gly Val Tyr Trp Pro Leu Phe Val Leu Ile Phe His Ala Ile Ser Pro Ile Pro His Phe Ile Ala Lys Arg Val Thr Tyr Asp Ser Asp Ala Thr Ser Ser Ala Cys Arg Glu Leu Ala Tyr Phe Phe Thr Thr Gly Ile Val Val Ser Ala Phe Gly Phe Pro Val Ile Leu Ala Arg Val Ala Val Ile Lys Trp Gly Ala Cys Gly Leu Val Leu Ala Gly Asn Ala Val Ile Phe Leu Thr Ile Gln Gly Phe Phe Leu Ile Phe Gly Arg Gly Asp Asp Phe Ser Trp Glu Gln Trp <210> 6 <211> 131 <212> PRT
<213> Mus musculus <220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(131) <2ê3> Sdquence en acides aminds de la ~B-RGRP de souris <400> 6 Met Ala Gly Val Lys Ala Leu Val Ala Leu Ser Phe Ser Gly Ala Ile Gly Leu Thr Phe Leu Met Leu Gly Cys Ala Leu Glu Asp Tyr Gly Val Tyr Trp Pro Leu Phe Val Leu Ile Phe Tyr Val Ile Ser Pro Ile Pro Tyr Phe Ile Ala Lys Arg Val Thr Tyr Asp Ser Asp Ala Thr Ser Ser Ala Cys Arg Glu Leu Ala Tyr Phe Phe Thr Thr Gly Ile Val Val Ser Ala Phe Gly Leu Pro Val Val Leu Ala Arg Val Asp Val Ile Lys Trp Gly Ala Cys Gly Leu Val Leu Ala Gly Asn Ala Val Ile Phe Leu Thr Ile Gln Gly Phe Phe Leu Val Phe Gly Arg Gly Asp Asp Phe Ser Trp Glu Gln Trp <210> 7 <211> 9 <212> PRT
<213> unidentified <220>
<221> PEPTIDE
<2ê2> (1)..(9) <223> Marqueur peptidique HA
<4,pO> 7 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro t'~sp Tyr Ala <21O> 8 <211> 10 <21ê> PRT
<213> unidentified <220>

<221> PEPTIDE
<222> (1)..(10) <223> Marqueur peptidique c-myc <400> 8 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu <210>
<211> 11 <212> PRT
<213> unidentified <220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(11) <223> Marqueur peptidique i7SV-G
<400>
Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arcs Leu Gly Lys <210> 10 <211> 6 <212> PRT
<213> unidentified <ê20>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(6) <223> Marqueur peptidique His6 <400 10 His His His His His His <ê10> 11 <211> 8 <212> PRT
<ê13> unidentified <220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(8) <223> Marqueur peptidique FLAG
<400> 11 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys <210> 12 <211> 26 <212> DNA
<213> unidentified <220>
<221> DNA
<222> (1)..(26) <223> Amorce sens pour PCR en temps réel de LEPR~TL1 <400> 12 f:aaataCtJ~ CCCCtCtttC~ ttCatt ~E
<210> 13 <211> 27 <212> DNA
<213> unidentified <220>
<221> DNA
<222> (1)..(27) <223> Amorce antisens pour PCR en temps réel de LEPROTL1 <400> 13 tcagtaattt cttttcacca ctgctgc 27 <210> 14 <211> 20 <212> DNA
<213> unidentified <220>
<221> DNA
<222> (1)..(20) <223> àamorce sens pour PCR en temps réel de OB-RGRP
<400> 14 agcagccgcg gccccagttc 20 <210> 15 <211> é1 <212> DNA
<213> unidentified <220>
<221> DNA
<222> (1)..(21) <223> Amorce antisens pour PCR en temps réel de OB-RGRP
<400> 15 aaggccgcag gctccccatt t 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA
<213> unidentified <220>
<221> DNA
<222> (1)..(21) <223> Amorce sens pour PCR en temps réel de bêta-actine <400> 16 cacactgtgc ccatctacga g 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA
<213> unidentified <220>
<221> DNA
<222> (1)..(21) <223> Amorce antisens pour PCR en temps réel de bêta-actine <400> 17 cgtggtggtg aagctgtagc c 21 <210> 18 <211> 19 <212> DNA
<213> unidentified <220>
<221> DNA
<222> (1)..(19) <223> Amorce sens pour PCR en temps réel de GAPDH
<400> 18 gtgaaggtcg gagtcaacg 19 <210> 19 <211> 21 <212> Dï~IA
<213> unidentified <220>
<221> DNt~
<222> (1)..(21) <223> Amorce antisens pour PCR en temps réel de GAPDH
<400> 19 catgggtgga atcatattgg a 21

Claims

1) Méthode d'identification de composés actifs sur la perte ou la prise de poids ou le diabète cher un sujet humain ou animal, caractérisé en ce que l'on mesure l'effet dudit composé sur (a) l'expression de l'un au moins des gènes LEPROTL1 et OB-RGRP ou partie de ceux-ci, et/ou (b) le transport intracellulaire jusqu'à la membrane cellulaire, et/ou (c) la présence au niveau de la membrane cellulaire, et/ou (d) l'internalisation depuis la membrane, des protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou partie de ceux-ci.

2) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend (i) la mise en contact d'un composé à
tester avec des cellules exprimant l'un au moins des gènes LEPROTL1 et OB-RGRP ou partie de ceux-ci, puis (ii) la mesure de l'effet dudit composé sur la quantité de protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou fragments de ceux-ci présente au niveau de la membrane desdites cellules et/ou leur internalisation.

3) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'endospanine et/ou OB-RGRP ou partie de celles-ci codées par l'un au moins desdits gènes ou fragments de ceux-ci sont marqués.

4) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est mise en oeuvre in vitro sur un modèle de cellules en culture ou in vivo dans un modèle animal.

5) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre la mesure de l'expression et/ou du transport avantageusement jusqu'à la surface de la membrane des cellules d'OB-R, ou encore dans le cas d'un modèle animal, la mesure de la leptine circulante.

6) Méthode selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5, caractérisée le modèle cellulaire ou animal est du type soit exprimant les gènes LEPROTL1 et/ou OB-RGRP ou fragments de ceux-ci de façon endogène soit génétiquement modifié pour exprimer lesdits gènes LEPROTL1 et/ou OB-RGRP
ou fragments de ceux-ci sous la forme de protéines recombinantes.

7) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les gènes LEPROTL1 et/ou OB-RGRP ou fragments de ceux-ci sont des gènes humains, ou de toutes autres espèces dès lors qu'ils présentent avantageusement au moins 80% d'homologie avec les gènes humains.

8) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les gènes LEPROTL1 et/ou OB-RGRP ou fragments de ceux-ci sont modifiés dès lors qu'ils codent pour des protéines qui peuvent être transportées jusqu'à la membrane de la cellule et avantageusement être ensuite internalisée.

9) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les gènes LEPROTL1 et/ou OB-RGRP ou fragments de ceux-ci sont sous une forme modifiée de façon à produire des protéines marquées.

10) Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que le marquage consiste en un marqueur peptidique.

11) Méthode selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisée en ce que les gènes LEPROTL1 et/ou OB-RGRP ou fragments de ceux-ci sont modifiés et en ce qu'ils codent pour au moins deux des quatre domaines transmembranaires desdites protéines et un marqueur peptidique sous la forme de protéines de fusion.

12) Méthode selon l'une quelconque des revendications et 11, caractérisée en ce que le marqueur peptidique est inséré dans l'endospanine au niveau de l'une des deux boucles extracellulaires.

13) Méthode selon l'une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisée en ce que le marqueur peptidique est inséré , au niveau de son l'extrémité N ou C terminal de l'endospanine tronquée par une délétion et en ce que ladite délétion positionne l'extrémité terminale et le marqueur en position lumenale/extracellulaire.

14) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'effet du composé à tester est mesuré à l'aide d'un anticorps dirigé contre l'endospanine et OB-RGRP, une partie ou un marqueur de celles-ci.

15) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que l'effet du composé à tester est réalisé par comparaison des mesures sur des cellules avec et sans la mise en contact avec ledit composé.

16) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que l'effet du composé à tester est mesuré après ou pendant un temps déterminé de mise en contact des cellules avec ledit composé.

17) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'effet du composé à
tester sur le trafic intracellulaire de l'endospanine et/ou OB-RGRP est aussi mesuré à l'aide d'un anticorps dirigé
contre une quelconque protéine membranaire de surface, une partie ou un marqueur de celles-ci.