CN104088019B - 一种基于双分子荧光互补技术的肽适配子文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于双分子荧光互补技术的肽适配子文库构建方法。本发明构建的肽适配子文库容量大、肽适配子构象固定，因此，本发明极具应用价值。本发明有益效果（1）有效合成了以细菌硫氧还蛋白TrxA蛋白支架构成的TrxA-MCS-TrxA；（2）通过载体构建的方式，将TrxA-MCS-TrxA框架插入至双分子荧光互补载体pBiFc-VC155中，形成pBiFc-VC155-TrxA-MCS-TrxA；（3）设计合成了具有可变阅读框的多肽表达核苷酸序列；（4）利用载体构建的方式，将可变阅读框的多肽表达核苷酸序列插入至pBiFc-VC155-TrxA-MCS-TrxA，转化细菌后，抽提质粒进行测序确认获得表达文库。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及到一种基于双分子荧光互补技术的肽适配子文库构建方法。
背景技术
双分子荧光互补技术是一种直观、快速判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的技术，该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达。如果荧光蛋白活性恢复，则表明两目标蛋白发生了相互作用，其后发展出的多色荧光互补技术不仅能检测到同时多种蛋白质复合体的形成，还能对不同蛋白间产生相互作用的强弱进行比较，目前该技术已用于转录因子，不同蛋白间产生相互作用强弱的比较以及蛋白质泛素化等方面的研究工作。
适配体技术是指利用筛选的适配子对靶标进行定位、检测和功能生物学研究的技术。适配子包含DNA适配子、RNA适配子和肽适配子三大类。它们能特异地结合包含离子、DNA、RNA、蛋白、糖分子等在内的靶物质，甚至是完整的细菌和细胞。与抗体相比，适配子具有长的半衰期、无毒且可以通过无免疫原性的靶分子筛选获得的特性，而且它们也可以很容易地通过化学合成或表达系统产生。现在，筛选DNA或RNA适配子主要是通过指数富集的配基系统进化技术(Selex)完成，而经典的肽适配子的筛选主要利用酵母双杂交技术从随机肽表达文库中筛选获得。为了稳定源自于随机表达文库的肽适配子的构象，通常是将一系列编码肽适配子的可变阅读框架插入至一个支架蛋白框架（通常是细菌的硫氧还蛋白）以形成融合蛋白，借此，融合的肽适配子能形成特定的蛋白构象以利于适配子和靶分子之间的相互结合。
肽适配子是指从随机表达文库中筛选针对蛋白质靶标的短肽，这些从高容量的文库中筛选获取的短肽能特异与靶标结合，从而影响靶标的功能，可应用于靶标及其复合物功能的干扰研究。
发明内容
本发明的目的是提供一个利用双分子荧光互补技术快速从高容量的随机表达肽适配子文库中筛选鉴定针对靶标的特异肽适配子方法。
本发明提供了一个高容量的随机肽适配子表达文库，该文库通过双分子荧光互补技术筛选靶标的肽适配子。
一种基于双分子荧光互补技术的肽适配子文库构建方法，包括以下步骤：
1）根据实验设计，合成包含TrxA-MCS-TrxA的核苷酸序列；
2）应用设计引物，以合成的TrxA-MCS-TrxA为模板，对合成序列进行高保真PCR扩增；
3）利用酶切连接方法将TrxA-MCS-TrxA转移入载体pBiFc-VC155双荧光互补表达表达载体，获得载体pBiFc-VC155-TrxA-MCS-TrxA；
4）设计11个氨基酸的随机对应核苷酸序列，并通过酶切连接方法，插入pBiFc-VC155-TrxA-MCS-TrxA载体的多克隆位点中；转化细菌后，抽提质粒进行测序确认获得肽适配子文库pBiFc-VC155-TrxA-11aa-TrxA。
所述的文库质粒pBiFc-VC155-TrxA-11aa-TrxA包含随机的11个氨基酸及其多种组合排列，且随机的氨基酸被固定于细菌硫氧还蛋白TrxA的支架中，具有稳定的构象，且该表达片段和VENUS蛋白C155片段融合表达。
将连接获取的载体转化感受态细胞，并涂布于氨苄青霉素抗性LB平板。
对平板上的克隆进行摇菌，并提取质粒，通过酶切和菌液PCR对克隆进行鉴定。将阳性克隆送生物技术服务公司进行测序和分析。
所述的方法构建获得的肽适配子文库。
该文库能够表达11个随机氨基酸，且这些随机氨基酸通过TrxA蛋白支架形成稳定的构象，所述出发载体为pBiFc-VC155。
该文库用于蛋白分子靶标的筛选，设计将另外一个靶标X和双分子荧光互补载体pBiFc-VN173进行融合表达，并获得pBiFc-VN173-X载体。
将文库质粒和pBiFc-VN173-X质粒分别用去内毒素质粒抽提试剂盒进行抽提后测浓度，并将pBiFc-VN173-X和单个肽适配子表达质粒共转染HEK293T细胞，24-48小时后观察荧光的出现以确定获得的特异结合肽适配子。
具体方案为：
设计并合成了具有32个随机核苷酸和1个固定核苷酸（对应于11个氨基酸）的核苷酸片段，并携带相应的酶切位点。
设计引物对包含随机核苷酸的DNA片段进行高保真PCR扩增，并通过酶切和载体构建方式将其定向插入于pBiFc-VC155-TrxA-MCS-TrxA载体的多克隆位点MCS中。
将另一靶标蛋白X的表达阅读框插入至双分子荧光互补载体pBiFc-VN173中，与VENUS蛋白的1-172氨基酸残基进行融合表达，获得pBiFc-VN173-X载体。
对文库获得的载体用菌液PCR进行鉴定，并抽提质粒后送测序公司测序。同时抽提pBiFc-VN173-X载体测序。
用去内毒素的质粒抽提试剂盒对文库质粒和pBiFc-VN173-X进行抽提、鉴定，分别将文库质粒与pBiFc-VN173-X形成组合，并使用pDsRED2-C1为内参检测转染效率，将这三个质粒共转入HEK293T细胞，通过观察荧光的出现以确定它们之间的相互作用。
本发明的有益效果：
（1）设计了能插入于细菌硫氧还蛋白支架蛋白TrxA中多克隆位点的寡核苷酸，该寡核苷酸对应于编码11个氨基酸残基；
（2）通过载体构建的方式，构建了pBiFc-VC155-TrxA-11aa-TrxA的表达载体，TrxA-11aa-TrxA框架与VENUS蛋白C155融合表达，并将载体转化细菌感受态受体细胞中，形成高容量的肽适配子表达文库；
（3）构建了pBiFc-VN173-X表达载体，X蛋白与VENUS蛋白的1-172氨基酸残基进行融合表达；
（4）在测序结果正确的基础上，利用去内毒素质粒抽提试剂盒将文库质粒pBiFc-VC155-TrxA-11aa-TrxA和pBiFc-VN173-X进行提取，将它们和内参质粒pDsRED2-C1共转染HEK293T细胞，初步结果表明其中有些文库载体能特异与X蛋白特异结合，从而在荧光显微镜下可以观察到荧光的出现，表明该表达文库构建正确，基于双分子荧光互补技术的筛选策略可快速筛选特异靶标的肽适配子。
附图说明
图1为文库载体构建和鉴定的琼脂糖凝胶电泳图。图1-a中泳道1为DNAMarker；泳道2为TrxA-MCS-TrxA高保真PCR产物电泳；泳道3为pBiFc-VC155-TrxA-MCS-TrxA载体酶切产物电泳。图1-b中泳道1为DNAMarker；泳道2为随机寡核苷酸（包含相应的随机肽适配子阅读框架）高保真PCR产物电泳。图1-c中泳道1为DNAMarker；其余泳道为菌液PCR产物电泳。
图2为载体示意图。A为靶蛋白X，与VENUS蛋白1-172氨基酸残基融合表达；B为TrxA-11a-TrxA,与VENUS蛋白的C155融合表达。
图3为双分子荧光互补鉴定与X蛋白特异结合的肽适配子示意图。其中1为P15+X；2为P18+X；3为P32+X；4为P42+X；5我P46+X；6为P55+X；7为P64+X。
具体实施方式
实施例1
基于双分子荧光互补技术的随机肽适配子表达文库构建包括以下步骤
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂销售店获取。以下实施例中的定量实验，均设置为独立的三次重复实验，结果取平均值。
步骤1）TrxA-MCS-TrxA设计和合成：根据实验需要，我们合成了一段核苷酸序列，以形成S-S键固定的肽适配子表达骨架。合成的序列信息如下（粗体序列为多克隆插入位点）：5’ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCAGTGTGCTGGGCCCAGCCGGCCAGATCTGAGCTCGCGGCCGCGATATCGCTAGCTCGAGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTG-3’。
步骤2）TrxA-MCS-TrxA高保真克隆：以TrxA-MCS-TrxA为模板，正向引物：5’-ACGCGTCGACCATGAGCGATAAAATTATTCAC-3’（末端为SalI酶切位点,SEQIDNO.2）,反向引物:5’-GGGGTACCCAGGTTAGCGTCGAGGAA-3’（末端为KpnI酶切位点,SEQIDNO.3）。PCR反应条件如表1，PCR产物跑电泳，电泳条带如图1a泳道1所示。
表1反应体系
表2反应条件
步骤3）通过载体的酶切和连接，构建了pBiFc-VC155-TrxA-MCS-TrxA表达载体，并利用SalI和KpnI对抽提质粒进行酶切鉴定，酶切产物电泳条带如图1a泳道2所示。
步骤4）表达随机肽适配子的寡核苷酸设计和合成：设计合成具有可变阅读框的肽适配子表达寡核苷酸序列5’-CTGCAGAACCAGTGTGCTGGN32GATATCGCTAGCTCGAGC-3’(SEQIDNO.4),粗体区域为11个随机氨基酸残基序列对应核苷酸。
步骤5）表达随机肽适配子的寡核苷酸克隆：以步骤4）中设计的寡核苷酸为模板，正向引物：5’-CTGCAGAACCAGTGTGCT-3’（末端为BstXI部分酶切位点，SEQIDNO.5），反向引物:5’-GCTCGAGCTAGCGATATC-3’（末端为EcoRV酶切位点，SEQIDNO.6）。高保真PCR反应条件如表3,PCR产物跑电泳，电泳条带如图1b泳道2所示。
表3反应体系
表4
步骤6）通过载体酶切和连接，构建了pBiFc-VC155-TrxA-11aa-TrxA表达载体。
步骤7）以pBiFc-VC155-TrxA-11aa-TrxA转化菌为模板进行菌液PCR鉴定正确克隆，正向引物：5’-TGCGGTCCAGTGTGCTGG-3’(SEQIDNO.7)，反向引物:5’-ACCTCGAGCTAGCGATATC-3’(SEQIDNO.8)。PCR产物跑电泳，电泳条带如图1c泳道2-12所示。
表5反应体系
表6
实施例2
文库筛选的初步应用和效果验证包括以下步骤
步骤1）使用去内毒素质粒提取试剂盒抽提测序正确的pBiFc-VC155-TrxA-11aa-TrxA文库质粒、pBiFc-VN173-X和pDsRED2-C1，将200ngpBiFc-VC155-TrxA-11aa-TrxA，200ngpBiFc-VN173-X和50ngpDsRED2-C1共转染于12孔板的HEK293T细胞中。步骤2）将转染的HEK293T细胞放置于细胞培养箱中培养24小时后，在荧光显微镜下可以观察到荧光的出现。初步结果表明其中有些文库载体能特异与X蛋白特异结合，从而表明该表达文库构建正确，基于双分子荧光互补技术的筛选策略可快速筛选特异靶标的肽适配子。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCELISTING
<110>中国人民解放军南京军区福州总医院
<120>一种基于双分子荧光互补技术的肽适配子文库构建方法
<130>8
<160>8
<170>PatentInversion3.3
<210>1
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<212>DNA
<213>TrxA-MCS-TrxA
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ccggccagatctgagctcgcggccgcgatatcgctagctcgaggtccgtgcaaaatgatc180
gccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactg240
aacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctg300
ctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcag360
ttgaaagagttcctcgacgctaacctg387
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<212>DNA
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<400>8
acctcgagctagcgatatc19
Claims (6)
1.一种基于双分子荧光互补技术的肽适配子文库构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）根据实验设计，合成TrxA-MCS-TrxA的核苷酸序列；TrxA-MCS-TrxA核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
2）应用设计引物，以合成的TrxA-MCS-TrxA为模板，对合成序列进行高保真PCR扩增；
3）利用酶切连接方法将TrxA-MCS-TrxA转移入载体pBiFc-VC155双荧光互补表达载体，获得载体pBiFc-VC155-TrxA-MCS-TrxA；
4)设计11个氨基酸的随机对应核苷酸序列，并通过酶切连接方法，插入pBiFc-VC155-TrxA-MCS-TrxA载体的多克隆位点中；转化细菌后，抽提质粒进行测序确认获得肽适配子文库；
所述的载体包含随机的11个氨基酸及其多种组合排列，且随机的氨基酸被固定于细菌硫氧还蛋白TrxA的支架中，具有稳定的构象，且所述载体表达片段和VENUS蛋白C155片段融合表达。
2.根据权利要求1所述的一种基于双分子荧光互补技术的肽适配子文库构建方法，其特征在于：将连接获取的载体转化感受态细胞，并涂布于氨苄青霉素抗性LB平板。
3.根据权利要求2所述的一种基于双分子荧光互补技术的肽适配子文库构建方法，其特征在于：对平板上的克隆进行摇菌，并提取质粒，通过酶切和菌液PCR对克隆进行鉴定。
4.根据权利要求3所述的一种基于双分子荧光互补技术的肽适配子文库构建方法，其特征在于：将阳性克隆送生物技术服务公司进行测序和分析。
5.一种如权利要求1所述的方法构建获得的肽适配子文库。
6.根据权利要求5所述的肽适配子文库，其特征在于：该文库能够表达11个随机氨基酸，且这些随机氨基酸通过TrxA蛋白支架形成稳定的构象，出发载体为pBiFc-VC155。
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