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CN104144915B - 含氮芳香族杂环化合物 - Google Patents

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CN104144915B CN201380011423.7A CN201380011423A CN104144915B CN 104144915 B CN104144915 B CN 104144915B CN 201380011423 A CN201380011423 A CN 201380011423A CN 104144915 B CN104144915 B CN 104144915B
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Abstract

本发明提供作为膀胱癌的预防和/或治疗剂有用的化合物。本发明的发明者等人对具有FGFR抑制作用的化合物进行研究，确认本发明的含氮芳香族杂环化合物具有FGFR1、2和/或3抑制作用，特别是突变FGFR3抑制作用，从而完成本发明。本发明的含氮芳香族杂环化合物可作为FGFR1、2和/或3相关的各种癌(例如，肺癌或激素疗法抗性的乳癌、胃癌、三重阴性乳癌、子宫内膜癌、膀胱癌及成胶质细胞瘤等)的治疗剂，特别是作为突变FGFR3阳性的膀胱癌的预防和/或治疗剂使用。

Description

含氮芳香族杂环化合物
技术领域
本发明涉及可用作医药组合物、特别是突变FGFR3阳性膀胱癌治疗用医药组合物的有效成分的化合物。
纤维母细胞增殖因子(FGF)与其受体即纤维母细胞增殖因子受体(FGFR)的信号路径，为发育的进展中由早期胚胎形成至各种器官形成过程中具有最重要功能的信号路径之一。FGF配体中存在18种基因，FGFR中存在4种(FGFR1～4)基因，在各种形态的细胞中表达，且与细胞增殖、分化、生存相关。近年来，各种癌的发病中，FGF信号的重要性已被报导，FGF或FGFR特异性的药剂的开发正在进行(Nature Reviews Cancer 2010；10，116-129、J.Med.Chem.2011；54，7066-7083、AACR 2011，No.1643AstraZeneca)。
关于FGFR1，在肺癌(特别是扁平上皮癌)及激素疗法抗性的乳癌中，FGFR1基因的扩增被报导，且还报导这些细胞株中显示依存于FGFR1的细胞增殖(Sci.Transl.Med.2010；2(62)：62ra93、BreastCancer Res.2007；9(2)：R23、Cancer Res.2010，70(5)，2085-2094)。
关于FGFR2，报导有胃癌及三重阴性乳癌中的基因扩增、子宫内膜癌中的活性化突变(Laboratory Investigation 1998，78(9)；1143-1153、Virchows Arch，1997，431；383-389、J.Cancer Res.Clin.Oncol.，1993，119，265-272、AACR2011，No.1643AstraZeneca、Oncogene 2010；29，2013-2023)，在这些癌细胞中也已经确认依存于FGFR2的增殖。
另外，FGFR3在膀胱癌中约50％的病例显示活性化基因突变。膀胱癌被大致分为非浸润性、浸润性及转移性3种。非浸润性膀胱癌的5年存活率高达70％以上，但复发频率高、且一部分会朝向浸润 性发展，另一方面，浸润性或转移性膀胱癌5年存活率低至50％以下，分别成为问题。作为FGFR3突变的非浸润性膀胱癌的现行疗法，有经尿道的膀胱肿瘤切除术(TUR-BT)及术后BCG疗法或化学疗法剂的膀胱内注入，但复发预防效果依然不充分，血尿、膀胱剌激症状等副作用会成为问题。另一方面，浸润或转移性膀胱癌虽然主要进行膀胱全摘除及化学疗法剂的全身给药，但在有效性或副作用上有问题。作为膀胱癌的特征，已知一部分癌细胞会由膀胱组织剥落至尿中，作为膀胱癌的诊断，进行尿细胞诊察。最近，报导了可使用尿中的沉淀物来检测FGFR3突变(Biochem.Biophys.Res.Commun.2007Nov 3；362(4)：865-71)。通过此FGFR3突变的有无，可选择FGFR3突变阳性膀胱癌患者，期望制出FGFR3选择性的抑制剂。
另外，已报导FGFR基因和TACC(Transforming Acidic Coiled-coil)基因的融合基因(FGFR3-TACC3及FGFR1-TACC1)在一部分的成胶质细胞瘤患者的肿瘤有表达(Science，2012Sep7；337(6099)：1231-5)。根据该报告，由将FGFR3-TACC3及FGFR1-TACC1在astrocyte中强制表达时的转换，显示了这些融合基因具有癌化能力，FGFR3-TACC3局部存在于分裂期的纺锤体极，且诱导依存于激酶活性的染色体非整倍性。另外，对FGFR3-TACC3表达细胞进行FGFR抑制剂处置的话，染色体非整倍体性被抑制，且抑制此细胞的增殖。因此，暗示了FGFR抑制剂对具有FGFR-TACC融合基因的成胶质细胞瘤患者的治疗有效的可能性。
另外，已报导于人类膀胱癌细胞株RT112、RT4、LUCC2中会表达FGFR3-TACC3融合基因、同样地人类膀胱癌细胞株SW780中会表达FGFR3-BAIAP2L1融合基因(Hum Mol Genet.，2013Feb 15，22(4)，795-803)。根据该报告，将这些融合基因导入NIH3T3细胞的结果，确认了锚定非依赖性的增殖亢进作用。另外，表达这些FGFR3融合基因的上述膀胱癌细胞株的增殖会被FGFR抑制剂所抑制，因此，本融合基因的存在检测可能对通过FGFR抑制剂治疗有效的患者的选择有用。
下述式(A)的化合物被报导显示出各种激酶抑制，作为癌、及心 肌梗塞等血管障碍的治疗剂有用(专利文献1)。该文献的表2中公开了数个化合物的关于Yes、VEGFR、EphB4、PDGFRβ及FGFR1的激酶抑制试验结果，且公开了FGFR1抑制活性的IC50值大于1000nM，相比于其它激酶的活性抑制弱。另外，该文献中并无后述本申请发明的式(I)化合物的具体公开。
[化学式1]
(式中，A分别为CH、N等；B分别为CH等；A1为O、CR2等；R0为H等；A2为NR、O等；L1为键、O等；L2为键、C1-C6烷基等；R1为3～6元杂环等；而且，Re、Rf为H、C1-C6烷基、羟基烷基等。其它符号参照该公报)。
下述式(B)的化合物被报导显示出Abl抑制作用，对各种癌有用(专利文献2)。但是，该文献中并无关于FGFR抑制作用的具体记载。另外，后述本申请发明的式(I)化合物，在其基团(R1)P方面，与式(B)化合物的构造不同。
[化学式2]
(式中，G为CH等、A为3-羟基苯基等、Y为乙烯基或亚乙基。其它符号参照该公报)。
下述式(C)的化合物被报导用于治疗癌、血管障碍等，对于由Src、VEGFR2、Yes、Fyn、Lck、Abl、PDGFR、EGFR及RET构成的各种激酶具有抑制作用(专利文献3)。但是，该文献中并无对FGFR的抑制作用的公开。而且，该文献中并无后述本申请发明的式(I)化合物的具体公开。
[化学式3]
(式中，G1表示可具有取代基的芳基、可具有取代基的杂芳基等；L1表示O、SO、SO2、可被取代的烷基等；L2表示可被取代的烷基、杂环等；A1表示键、O、C(Ra)2等；A2表示NRa、O等。其它符号参照该公报)。
下述式(D)被报导具有TIE-2和/或VEGFR-2激酶抑制作用，对包含癌的血管新生相关的疾病治疗有用(专利文献4)。但是，该文献中并无关于FGFR抑制的具体记载。另外，后述本发明的式(I)化合物在其基团L1不具有氨基的这点、及包含X及Y的环的2个连结键位于对位的这点上，与式(D)的化合物的构造不同。
[化学式4]
(式中，W为N或CR，R为H等。其它符号参照该公报)。
下述式(E)的化合物被报导显示出多个受体蛋白质酪氨酸激酶活性，特别是FGFR活性的抑制作用，可使用于与这些酶的异常或与过度活性相关的各种疾病的处置(专利文献5)。但是，后述本发明的式(I)化合物在其基团L1上没有N原子取代这点、以及包含X及Y的环的2个连结键位于对位的这点上，与式(E)的化合物的构造不同。
[化学式5]
(式中，X、Y和Z中的2个为N、第3个为CH或N。其它符号参照该公报)。
下述式(F)被报导对各种激酶显示出抑制作用，对发炎或自体免疫疾病有用(专利文献6)。另一方面，后述本发明的式(I)化合物在其基团L1并非酰胺基这点、以及包含X及Y的环的2个连结键位于对位这点上，与式(F)的化合物的构造不同。
[化学式6]
(式中，A1、A2、A3及A4分别为CR4、CR5、CR6及CR7或N；L为-C(O)NR7-、-NR7C(O)-等。其它符号参照该公报)。
下述式(G)及式(H)的化合物被报导显示出FGFR抑制作用，可使用于各种癌的治疗(专利文献7及专利文献8)。
[化学式7]
(式(G)中，B环根据情况而表示可含有由O、S和N中选择的至少1个杂原子的5或6元芳香族基团。其它符号参照该公报)。
下述式(J)化合物被报导显示出葡萄糖激酶活性化作用，可用于糖尿病相关的疾病的治疗(专利文献9)，其构造上的特征在于吡啶的2号位置上有氨基取代。
[化学式8]
(式中符号参照该公报)。
另外，具有下述构造的化合物分别作为CAS注册编号1371065-79-0、1317903-92-6在数据库上已知。
[化学式9]
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专利文献
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发明所要解决的问题
本发明提供可用作医药组合物、特别是突变FGFR3阳性的膀胱癌治疗用医药组合物的有效成分的化合物。
用于解决问题的手段
本发明的发明者等人针对具有FGFR抑制作用的化合物进行了深入研究，结果发现本发明的含氮芳香族杂环化合物具有FGFR1、2及3抑制作用，特别是良好的突变FGFR3抑制作用，从而完成了本发明。
即，本发明涉及式(I)的化合物或其盐、以及含有式(I)的化合物或其盐和制药学上容许的赋形剂的医药组合物。
[化学式10]
(式中，X和Y相同或不同，为CH或N，但X和Y不同时为N，
L1为-低级亚烷基-、-低级亚烷基-O-、-O-低级亚烷基-或-低级亚炔基-；
Z为N或CH；
R1相同或不同，为可被卤素取代的低级烷基、-O-(可被卤素取代的低级烷基)、卤素、氰基或-N(低级烷基)2；
P为2至4的整数；
环W为可被取代的芳香族碳环、可被取代的芳香族杂环、或可被取代的非芳香族杂环；
Q为-L2-R2或R3；
L2为可被取代的芳香族杂环或可被取代的非芳香族杂环，
R2为可被低级烷基取代的非芳香族杂环基、可被取代的环烷基、可被选自-OH及-O-低级烷基构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基、-C(O)-R0、-C(O)-可被取代的环烷基、-NH-R0、-N(低级烷基)-R0、-L3-可被取代的非芳香族杂环基或H；
R0为可被-OH取代的低级烷基；
R3为
(1)可被选自由以下基团构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基：-C(O)OH、-OH、-O-R0、可被1个或2个R0取代的氨基、可被1个或2个R0取代的氨基甲酰基、可被取代的芳香族杂环基、可被取代的非芳香族杂环基以及-C(O)-可被取代的非芳香族杂环基，
(2)-O-(可被选自由以下基团构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基：-C(O)OH、-OH、-O-R0、可被1个或2个R0取代的氨基甲酰基、可被取代的非芳香族杂环基以及-C(O)-可被取代的非芳香族杂环基)，
(3)-NH-(可被选自由以下基团构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基：-OH、可被低级烷基取代的非芳香族杂环基、以及可被1个或2个R0取代的氨基甲酰基)，
(4)-N(低级烷基)-(可被选自由以下基团构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基：-OH、可被低级烷基取代的非芳香族杂环基、以及可被1个或2个R0取代的氨基甲酰基)，
(5)-C(O)OH，
(6)-C(O)-可被取代的非芳香族杂环基，
(7)-O-(可被低级烷基取代的非芳香族杂环基)，或
(8)可被1个或2个R0取代的氨基甲酰基；以及
L3为键、-NH-、-N(低级烷基)-或低级亚烷基。)
需要说明的是，若无特别说明，则本说明书中的某化学式中的记号在其它化学式中也被使用时，相同记号表示相同意思。
另外，本发明涉及含有式(I)化合物或其盐与制药学上容许的赋形剂的与FGFR1、2和/或3相关的各种癌(例如与FGFR1相关的肺癌或激素疗法抗性的乳癌、与FGFR2相关的胃癌、三重阴性乳癌或子宫内膜癌、及与FGFR3相关的膀胱癌及成胶质细胞瘤)的治疗用医药组合物。需要说明的是，该医药组合物包含与FGFR1、2和/或3相关的各种癌的治疗剂。作为某一方式，为含有式(I)的化合物或其盐以及制药学上容许的赋形剂的与FGFR3相关的膀胱癌的治疗用医药组合物。作为另一方式，为含有式(I)的化合物或其盐与制药学上容许的赋形剂的突变FGFR3阳性膀胱癌的治疗用医药组合物。需要说明的是，本说明书中，“突变”包含点突变、融合突变、缺失突变、插入突变，作为某一方式，为包含点突变及融合突变的概念，作为另一方式，为点突变，作为又一方式，为融合变异。
另外，本发明也涉及用于制造与FGFR1、2和/或3相关的各种癌的治疗用医药组合物的式(I)化合物或其盐的应用；用于治疗与FGFR1、2和/或3相关的各种癌的式(I)化合物或其盐的应用；以及用于治疗与FGFR1、2和/或3相关的各种癌的式(I)化合物或其盐；以及包括将式(I)的化合物或其盐的有效量施用至对象的与FGFR1、2和/或3相关的各种癌的治疗方法。进而，本发明还涉及用于制造突变FGFR3阳性膀胱癌的治疗用医药组合物的式(I)化合物或其盐的应用；用于治疗突变FGFR3阳性膀胱癌的式(I)化合物或其盐的应用；用于治疗突变FGFR3阳性膀胱癌的式(I)化合物或其盐；以及包括将式(I)化合物或其盐的有效量施用至对象的突变FGFR3阳性膀胱癌的治疗方法。需要说明的是，上述“对象”是指需要该治疗的人类或其它动物，作为某一方式，为需要该治疗的人类。
发明效果
式(I)的化合物或其盐具有FGFR1、2和/或3抑制作用，特别是突变FGFR3抑制作用，可作为与FGFR1、2和/或3相关的各种癌(例如肺癌或激素疗法抗性的乳癌、胃癌、三重阴性乳癌、子宫内膜癌、膀胱癌及成胶质细胞瘤等)的治疗剂，特别是作为突变FGFR3阳性膀胱癌的治疗剂来使用。
以下，详细说明本发明。
本说明书中，“低级烷基”是指直链或分枝状的碳数为1至8(以下简称为C1-8)的烷基，例如甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基、异丁基、sec-丁基、tert-丁基、n-戊基、n-己基、n-庚基、n-辛基等。作为另一方式，为C1-4烷基，作为又一方式，为甲基，作为又再另一方式，为乙基。
“低级亚烷基”为直链或分枝状的C1-8的亚烷基，例如亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、七亚甲基、八亚甲基、亚丙基、甲基亚甲基、乙基亚乙基、1,2-二甲基亚乙基、1,1,2,2-四甲基亚乙基等。作为另一方式，为C1-4亚烷基，作为又一方式，为亚甲基，作为又再另一方式，为亚乙基。
“低级亚炔基”为直链或分枝状的C2-6的亚炔基，例如亚乙炔基、亚丙炔基、亚丁炔基、亚戊炔基、亚己炔基、1,3-亚丁二炔基、1,3-亚戊二炔基等。作为另一方式，为C2-4亚炔基，作为又一方式，为亚乙炔基。
“环烷基”为C3-10的饱和烃环基，也可以有交联。例如为环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、金刚烷基等。作为另一方式，为C3-8环烷基，作为又一方式，为C3-6环烷基，作为又再另一方式，为环丙基。
“芳香族碳环”为C6-14的单环～三环式芳香族烃环。例如为苯、萘、蒽，作为另一方式，为苯。
“芳香族杂环”为具有1至4个选自氮、氧及硫构成的组中的杂原子的环元数5至10的芳香族杂环，例如吡啶、吡咯、吡嗪、嘧 啶、哒嗪、咪唑、吡唑、噻唑、噁唑、异噁唑、噻吩、异噻唑、呋喃、噁二唑、噻二唑、吲哚、异吲哚、吲唑、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并咪唑、苯并噁唑、苯并噻唑、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹噁啉、噻吩并吡啶、噻吩并嘧啶、噻吩并吡嗪等。作为另一方式，为吡啶、吡咯、吡嗪、嘧啶、哒嗪、咪唑、吡唑、噻唑、噁唑、噻吩、呋喃、噁二唑、吲唑。作为又一方式，为吡啶、嘧啶、咪唑、吡唑、噻唑、吲唑，作为又一方式，为吡啶、咪唑、吡唑，作为又一方式，为吡啶，作为又一方式，为吡唑，作为又再另一方式，为咪唑。
“芳香族杂环基”是指上述“芳香族杂环”的1价基，例如吡啶基、吡咯基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、噁唑基、噻吩基、呋喃基、1,2,4-噁二唑基等，作为另一方式，为具有1至2个氮原子的环元数5至6的芳香族杂环基，作为又一方式，为吡啶基。
“非芳香族杂环”是指具有1至4个选自氮、氧及硫构成的组中的相同或不同的杂原子的环元数3至10、作为其一方式为环元数4至8的非芳香族杂环，该非芳香族杂环可与苯环或噻吩环缩合、可由低级亚烷基交联、可与另一个非芳香族杂环形成螺环、也可在环的一部分上有不饱和键，另外，作为环构成原子的硫原子或氮原子也可被氧化。例如氮丙啶、氧杂环丁烷、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、氮杂环庚烷、二氮杂环庚烷、氮杂环辛烷、哌嗪、4-氧化哌嗪、高哌嗪(homopiperazine)、吗啉、高吗啉(oxazepane)、硫代吗啉、1,1-二氧化硫代吗啉、1,1-二氧化四氢硫代吡喃、1,1-二氧化四氢噻唑、硫杂氮杂环庚烷(thiazepane)、1-氮杂双环[2.2.2]辛烷、7-氧杂双环[2.2.1]庚烷、2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷、3-氮杂双环[3.2.1]辛烷、8-氮杂双环[3.2.1]辛烷、9-氮杂双环[3.3.1]壬烷、3,9-二氮杂双环[3.3.1]壬烷、3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷、2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷、2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷、2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬烷、四氢吡喃、四氢呋喃、二噁烷、二氧杂环戊烷、四氢噻吩、四氢硫代吡喃、四氢噻吩并吡啶、四氢苯并氮杂卓、四氢苯并二氮杂卓、二氢苯并呋喃、二氢苯并噻吩、二氢苯并吡喃、二氢苯并二噁烷、苯并二噁烷、二氢吡喃、二氢吡咯、二氢 吡啶、四氢吡啶、四氢吡嗪等。作为另一方式，为具有1至2个选自氮、氧及硫构成的组中的相同或不同的杂原子的环元数5至7的非芳香族杂环，作为又一方式，具有至少1个氮原子，且进一步可具有1个选自氮、氧及硫构成的组中的杂原子的含氮5至7元非芳香族杂环，作为又一方式，为6元含氮非芳香族杂环，例如哌嗪、哌啶、吗啉、硫代吗啉、1,1-二氧化硫代吗啉等。作为又一方式，为氧杂环丁烷、哌啶、哌嗪、吗啉、硫代吗啉、4-氧化哌嗪、1,1-二氧化硫代吗啉、四氢吡喃、四氢呋喃、四氢噻吩、四氢吡啶、1-氮杂双环[2.2.2]辛烷、8-氮杂双环[3.2.1]辛烷、3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷、2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷、2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷、2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬烷，作为又一方式，为吗啉、哌啶、哌嗪、4-氧化哌嗪、3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷、2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷，作为又一方式，为哌啶，作为又再另一方式，为哌嗪。
“非芳香族杂环基”为非芳香族杂环的1价基，且为具有1至4个选自氮、氧及硫所构成的组中的相同或不同的杂原子的环元数3至10的非芳香族杂环基，可由低级亚烷基交联、在环的一部分可具有不饱和键、也可与另一个非芳香族杂环形成螺环。另外，作为环构成原子的硫原子或氮原子也可被氧化。例如，氮丙啶基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、氮杂环庚烷基、二氮杂环庚烷基、氮杂环辛烷基、哌嗪基、高哌嗪基、吗啉基、高吗啉基(oxazepanyl)、硫代吗啉基、1,1-二氧化硫代吗啉基、硫杂氮杂环庚烷基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、二噁烷基、二氧杂环戊烷基、四氢噻吩基、四氢硫代吡喃基、7-氧杂双环[2.2.1]庚基、2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚基、3-氮杂双环[3.2.1]辛基、8-氮杂双环[3.2.1]辛基、9-氮杂双环[3.3.1]壬基、3,9-二氮杂双环[3.3.1]壬基、二氢吡喃基、二氢吡咯基、二氢吡啶基、四氢吡啶基、四氢吡唑基、9-二氮杂螺[5.5]十一碳-3-基、1,9-二氮杂螺[5.5]十一碳-9-基、2,8-二氮杂螺[4.5]癸-8-基、1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基等。作为另一方式，为具有1至2个选自氮、氧及硫构成的组中的相同或不同的杂原子的环元数5至7的非芳香族杂环基，作为又一方式，为至少具有1个氮原子的环元数5 至7的非芳香族杂环基，作为又一方式，为6元含氮非芳香族杂环基，例如哌嗪基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、1,1-二氧化硫代吗啉基等。作为又一方式，为氧杂环丁烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、4-氧化哌嗪基、1,1-二氧化硫代吗啉基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡啶基、1-氮杂双环[2.2.2]辛基、8-氮杂双环[3.2.1]辛基、3,9-二氮杂螺[5.5]十一碳-3-基、2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-基、2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基，作为又一方式，为哌啶基、哌嗪基，作为又一方式，为哌啶基，作为又再另一方式，为哌嗪基。
“卤素”为-F、-Cl、-Br及-I。作为另一方式，为-F，作为又一方式，为-C1。
式(I)中的L1为-低级亚烷基-O-时的式(I)的化合物或其盐是指式(II)的化合物或其盐。
[化学式11]
(式中，L4表示低级亚烷基。以下相同。)
另外，(R1)p中，2个至4个R1可分别相同也可分别不同。
本说明书中，“可被取代的”是指没有取代、或具有1～5个取代基。需要说明的是，有多个取代基时，这些取代基可以相同、也可以不同。另外，例如，“可被1个或2个R0取代的氨基甲酰基”中的氮上的2个R0可分别为相同的低级烷基、也可为各自不同的低级烷基。另外，R0可以各自被-OH取代、可以一方被取代、也可以两者均无取代。
本说明书中，作为式(I)的W中的“可被取代的芳香族碳环”、“可被取代的芳香族杂环”及“可被取代的非芳香族杂环”中的取代基，例如为下述D1组中所示的基团。
D1组为由以下基团构成的组：
(1)可被选自-OH基和低级烷基中的1个以上的取代基取代的芳香族杂环基，
(2)可被选自-OH基和低级烷基中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基，
(3)卤素，
(4)-O-低级烷基、-S-低级烷基、-OH和-SH，
(5)-CN和-NO2，
(6)-CO2H和-CO2-低级烷基，以及
(7)可被选自上述(1)～(6)记载的基团构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基或-O-低级烷基。
作为D1组的另一方式，可列举
(1)可被-OH基取代的芳香族杂环基，
(2)卤素，
(3)-OH，
(4)-CN，
(5)-CO2H，以及
(6)可被选自上述(1)～(5)记载的取代基构成的组中的1个以上的取代基取代的低级烷基或-O-低级烷基。
另外，作为D1组的另一方式，可列举
(1)可被卤素取代的低级烷基，
(2)可被芳香族杂环基取代的-O-低级烷基，其中该芳香族杂环基可被-OH基取代，
(3)卤素，以及
(4)-CN。
另外，作为D1组的另一方式，可列举可被卤素取代的低级烷基、-O-(可被选自由以下基团构成的组中的1个以上取代基取代的低级烷基：可被氧代取代的非芳香族杂环基、可被-OH取代的芳香族杂环基、以及卤素)、卤素、氰基、氧代。
作为式(I)的L2中的“可被取代的芳香族杂环”、“可被取代的非芳香族杂环”、R2中的“可被取代的环烷基”、“可被取代的非 芳香族杂环基”、以及、R3中的“可被取代的芳香族杂环基”、“可被取代的非芳香族杂环基”中可容许的取代基，可列举例如选自D2组中的取代基。
D2组为由以下基团构成的组：
(1)卤素，
(2)-OH及-SH，
(3)-CN，以及
(4)可被选自上述(1)～(3)记载的取代基构成的组中的1个以上的取代基取代的低级烷基。
作为D2组的另一方式，可列举
(1)可被-OH取代的低级烷基，以及
(2)-OH。
式(I)的化合物或其盐的其一方式如下所示。
(1)X为N、Y为CH的化合物或其盐。作为另一方式，X为CH、Y为N的化合物或其盐。作为又一方式，X为CH、Y为CH的化合物或其盐。
(2)L1为低级亚烷基或-低级亚烷基-O-的化合物或其盐。L1为-低级亚烷基-的化合物或其盐。作为又一方式，L1为-低级亚烷基-O-的化合物或其盐。作为又一方式，L1为亚乙基或-亚甲基-O-的化合物或其盐。作为又一方式，L1为亚乙基的化合物或其盐。作为又一方式，L1为-亚甲基-O-的化合物或其盐。作为又再另一方式，L1为亚乙炔基的化合物或其盐。
(3)Z为CH的化合物或其盐。作为另一方式，Z为N的化合物或其盐。
(4-1)p为2或4的化合物或其盐。作为另一方式，p为2的化合物或其盐。作为又一方式，p为4的化合物或其盐。
(4-2)R1相同或彼此不同，为-O-低级烷基或卤素的化合物或其盐。作为另一方式，R1相同或彼此不同，为-O-低级烷基的化合物或其盐。作为又一方式，R1相同或彼此不同，为卤素的化合物或其盐。作为又一方式，R1相同或彼此不同，为-O-甲基或F的化合物或其盐。作为又一方式，R1相同或彼此不同，为-O-甲基或C1的化合物或其盐。作为又再另一方式，R1全部为F的化合物或其盐。
(5)式(I)中的被p个R1取代的具有Z作为环构成原子的6元芳香环为2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基或2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基的化合物或其盐。作为另一方式，式(I)中的被P个R1取代的具有Z作为环构成原子的6元芳香环为2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基的化合物或其盐。作为另一方式，式(I)中的被P个R1取代的具有Z作为环构成原子的6元芳香环为2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基的化合物或其盐。
(6)环W为可被选自D1组中的1个以上的取代基取代的芳香族碳环或可被选自D1组中的1个以上的取代基取代的芳香族杂环的化合物或其盐。作为另一方式，环W为被选自D1组中的1个以上的取代基取代的苯环或者为分别可被选自D1组中的1个以上的取代基取代的吡唑、吡啶、嘧啶、噻唑、吲唑或咪唑的化合物或其盐。作为又一方式，环W为可被选自D1组中的1个以上的取代基取代的苯环或可被选自D1组中的1个以上的取代基取代的吡唑的化合物或其盐。作为又一方式，环W为可被选自D1组中的1个以上的取代基取代的苯环的化合物或其盐。作为又一方式，环W为可被选自低级烷基、-O-低级烷基以及卤素构成的组中的1个以上取代基取代的苯环的化合物或其盐。作为又一方式，环W为可被选自甲基、-O-甲基以及卤素构成的组中的1个取代基取代的苯环的化合物或其盐。作为又一方式，环W为可被-O-甲基取代的苯环的化合物或其盐。作为又一方式，环W为可被选自D1组中的1个以上的取代基取代的吡唑的化合物或其盐。作为又一方式，环W为可被低级烷基取代的吡唑的化合物或其盐。作为又一方式，环W为可被甲基取代的吡唑的化合物或其盐。作为又一方式，环W为甲基取代的吡唑的化合物或其盐。作为又一方式，环W为吡唑的化合物或其盐。
(7)Q为-L2-R2的化合物或其盐。作为另一方式，Q为R3的化合物或其盐。
(8)L2为可被选自D2组中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环的化合物或其盐。作为另一方式，L2为可被选自D2组中的1个 以上的取代基取代的含氮非芳香族杂环的化合物或其盐。作为又一方式，L2为可被选自D2组中的1个以上的取代基分别取代的哌嗪、4-氧化哌嗪、哌啶、吗啉、氮杂环丁烷、3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷、2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷、2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷、2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬烷、8-氮杂双环[3.2.1]辛烷或1-氮杂双环[2.2.2]辛烷的化合物或其盐。作为又一方式，L2为可被1个以上的甲基取代的哌嗪、可被1个以上的甲基取代的哌啶或3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷的化合物或其盐。作为又再另一方式，L2为哌啶或4-甲基哌嗪的化合物或其盐。
(9)R2为可被选自-OH以及-O-低级烷基构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基、-NH-(可被-OH取代的低级烷基)、可被选自D2组中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基、-低级亚烷基-(可被选自D2组中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基)或H的化合物或其盐。作为另一方式，R2为可被选自-OH以及-O-低级烷基构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基、-NH-(可被-OH取代的低级烷基)、可被低级烷基(该低级烷基可被-OH取代)取代的非芳香族杂环基或H的化合物或其盐。作为又一方式，R2为可被甲基取代的哌嗪、可被甲基取代的哌啶、2-羟乙基氨基或H的化合物或其盐。作为又一方式，R2为4-甲基哌嗪、2-羟乙基氨基或H的化合物或其盐。作为又一方式，R2为4-甲基哌嗪的化合物或其盐。作为又一方式，R2为2-羟乙基氨基的化合物或其盐。作为又一方式，R2为H的化合物或其盐。
(10)R3为可被选自以下基团构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基：-C(O)OH、可被1个或2个R0取代的氨基甲酰基、-OH、可被选自D2组中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基以及-C(O)-(可被选自D2组中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基)；或-O-(可被选自以下基团构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基：-C(O)OH、可被1个或2个R0取代的氨基甲酰基、-OH、可被选自D2组中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基以及-C(O)-(可被选自D2组中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基))的化合物或其盐。作为另一方式，R3为被选自：-C(O)OH、可被 1个或2个R0取代的氨基甲酰基、-OH、可被选自D2组中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基以及-C(O)-(可被选自D2组中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基)构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基的化合物或其盐。作为又一方式，R3为被选自：-OH、可以被选自-OH以及低级烷基中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基以及-C(O)-(可被选自-OH以及低级烷基构成的组中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基)构成的组中的1个以上的取代基取代的低级烷基的化合物或其盐。作为又一方式，R3为被选自：-OH、可被低级烷基取代的非芳香族杂环基以及-C(O)-(可被-OH取代的非芳香族杂环基)构成的组中的1个以上的取代基取代的低级烷基的化合物或其盐。作为又一方式，R3为被选自：-OH、可被甲基取代的哌嗪基以及-C(O)-(可被-OH取代的氮杂环丁烷基)构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基的化合物或其盐。进一步作为另一方式，R3为2-羟基乙基、2,3-二羟基丙基或4-甲基哌嗪-1-基甲基的化合物或其盐。作为又一方式，R3为4-甲基哌嗪-1-基甲基的化合物或其盐。作为又一方式，R3为可被1个以上的-OH取代的低级烷基的化合物或其盐。作为又再另一方式，R3为2-羟基乙基或2,3-二羟基丙基的化合物或其盐。
(11)上述(1)至(10)记载的方式中不矛盾的任意二种以上的组合的化合物或其盐。
本发明中，包含如上述(11)记载的、上述(1)至(10)记载的方式中任意二种以上的组合的化合物或其盐，其具体例子也可以列举以下方式。
(12)X为N、Y为CH、且L1为低级亚烷基或-低级亚烷基-O-的化合物或其盐。
(13)如(12)记载的化合物或其盐，其中Z为CH、R1相同或彼此不同，为-O-低级烷基或卤素，p为2或4，且环W为可被取代的芳香族碳环或可被取代的芳香族杂环。
(14)如(13)记载的化合物或其盐，其中L1为亚乙基或-亚甲基-O-、p为4、且环W为可被取代的苯环或可被取代的吡唑。
(15)如(12)～(14)中任意一项记载的化合物或其盐，其中Q为-L2-R2，L2为可被取代的非芳香族杂环，R2为可被选自-OH以及-O-低级烷基构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基、-NH-(可被-OH取代的低级烷基)、可被取代的非芳香族杂环基、-低级亚烷基-(可被取代的非芳香族杂环基)或H。
(16)如(15)记载的化合物或其盐，其中p为4，L2为可被1个以上的甲基取代的哌嗪、可被1个以上的甲基取代的哌啶或3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷，R2为可被甲基取代的哌嗪、可被甲基取代的哌啶、2-羟基乙基氨基或H。
(17)如(16)记载的化合物或其盐，其中R1相同或彼此不同，为-O-甲基或F；L1为-亚甲基-O-；环W为可被-O-甲基取代的苯环；L2为哌啶或4-甲基哌嗪；R2为4-甲基哌嗪、2-羟基乙基氨基或H。
(18)如(12)～(14)中任意一项记载的化合物或其盐，其中环W为可被取代的吡唑；Q为R3；R3为被选自：-C(O)OH、可被1个或2个R0取代的氨基甲酰基、-OH、可被取代的非芳香族杂环基以及-C(O)-(可被取代的非芳香族杂环基)构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基。
(19)如(18)记载的化合物或其盐，其中p为4；R3为被选自：-OH、可被低级烷基取代的非芳香族杂环基以及-C(O)-(可被-OH取代的非芳香族杂环基)构成的组中的1个以上的取代基取代的低级烷基。
(20)如(19)记载的化合物或其盐，其中R1相同或彼此不同，为-O-甲基或F；L1为-亚甲基-O-；环W为可被甲基取代的吡唑；R3为2-羟基乙基、2,3-二羟基丙基或4-甲基哌嗪-1-基甲基。
另外，作为式(I)的化合物或其盐的另一方式，可列举以下化合物或其盐：其中
X和Y相同或彼此不同，为CH或N，但X和Y不同时为N，
L1为-低级亚烷基-、-低级亚烷基-O-、-O-低级亚烷基-或低级亚炔基，
Z为N或CH，
R1相同或彼此不同，为可被卤素取代的低级烷基、-O-(可被卤 素取代的低级烷基)、卤素、氰基或-N(低级烷基)2，
P为2至4的整数，
环W为可被取代的芳香族碳环、可被取代的芳香族杂环、或可被取代的非芳香族杂环，
Q为-L2-R2或R3，
L2为可被取代的芳香族杂环或可被取代的非芳香族杂环，
R2为可被选自-OH以及-O-低级烷基构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基、-C(O)-可被取代的环烷基、-NH-(可被-OH取代的低级烷基)、-L3-可被取代的非芳香族杂环基或H，
R3为可被选自：-C(O)OH、-OH、-NH-低级烷基、-N(低级烷基)2、-C(O)-NH-低级烷基、-C(O)-N(低级烷基)2、可被取代的芳香族杂环基、可被取代的非芳香族杂环基以及-C(O)-可被取代的非芳香族杂环基构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基；-O-(可被选自-OH、-C(O)-NH-低级烷基以及-C(O)-N(低级烷基)2构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基)；-NH-(可被选自-OH、-C(O)-NH-低级烷基以及-C(O)-N(低级烷基)2构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基)；-N(低级烷基)-(可被选自-OH、-C(O)-NH-低级烷基以及-C(O)-N(低级烷基)2构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基)；-C(O)OH或-C(O)-可被取代的非芳香族杂环基，以及
L3为键或低级亚烷基。
作为包含于式(I)的化合物或其盐的具体化合物例子，可列举以下的化合物。
5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-[3-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺、
(2S)-3-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]丙烷-1,2-二醇、
5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-{3-氟-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[3-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[1-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{4-[(3R,5S)-3,5-二甲基哌嗪-1-基]-3-甲氧基苯基}嘧啶-2-胺、
N-[4-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一碳-3-基)-3-甲氧基苯基]-5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-胺、
2-[4-({5-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙醇、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{1-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-2-胺、
2-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]-1-(3-羟基氮杂环丁烷-1-基)乙酮、
(2R)-3-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]丙烷-1,2-二醇、
2-({1-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)苯基]哌啶-4-基}氨基)乙醇、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{1-甲基-5-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-1H-吡唑-3-基}嘧啶-2-胺、以及、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺、以及它们的盐。
作为包含于式(I)的化合物或其盐的具体化合物的例子的另一方式，可列举以下化合物。
5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-[3-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺、
(2S)-3-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]丙烷-1,2-二醇、
5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-{3-氟-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[3-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[1-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{4-[(3R,5S)-3,5-二甲基哌嗪-1-基]-3-甲氧基苯基}嘧啶-2-胺、
N-[4-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一碳-3-基)-3-甲氧基苯基]-5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-胺、
2-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙醇、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{1-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-2-胺、
2-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]-1-(3-羟基氮杂环丁烷-1-基)乙酮、以及、
(2R)-3-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]丙烷-1,2-二醇、以及它们的盐。
作为包含于式(I)的化合物或其盐的具体的化合物例子的又一方式，可列举以下化合物。
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
2-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙醇、
(2R)-3-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]丙烷-1,2-二醇、
2-({1-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)苯基]哌啶-4-基}氨基)乙醇、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{1-甲基-5-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-1H-吡唑-3-基}嘧啶-2-胺、以及
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺、以及它们的盐。
作为包含于式(I)化合物或其盐的具体的化合物例子的又一方式，可列举以下化合物。
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
2-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙醇、以及、
(2R)-3-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]丙烷-1,2-二醇、以及它们的盐。
作为包含于式(I)化合物或其盐的具体的化合物例子的又一方式，可列举以下化合物。
2-({1-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)苯基]哌啶-4-基}氨基)乙醇、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{1-甲基-5-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-1H-吡唑-3-基}嘧啶-2-胺、以及、
5-[(2,6-二氟3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺、以及它们的盐。
式(I)的化合物中，根据取代基的种类不同，可存在互变异构体或几何异构体。本说明书中，有时仅记载式(I)化合物的异构体的一种形态，但本发明也包含其以外的异构体，也包含异构体分离后的物质、或它们的混合物。
另外，式(I)的化合物中有时具有不对称碳原子或轴不对称性，也可存在基于它们的光学异构体。本发明还包含式(I)化合物的光学异构体分离后的物质、或它们的混合物。
进而，本发明还包含以式(I)所示化合物在制药学上容许的前体药。制药学上容许的前体药是指具有可通过加溶剂分解而在生理学条件下转换为氨基、羟基、羧基等基团的化合物。作为形成前体药的基团，可列举例如Prog.Med.,5,2157-2161(1985)、或“医药品的开发”(广川书店、1990年)第7卷分子设计163-198中记载的基团。
另外，式(I)的化合物的盐是指式(I)化合物在制药学上容许的盐，根据取代基种类不同，有时形成酸加成盐或与碱的盐。具体而言，可列举与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等的无机酸，或与甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、苦杏仁酸、酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、二甲苯酰基酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、p-甲苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸等有机酸的酸加成盐；与钠、钾、镁、钙、铝等的无机碱，与甲胺、乙胺、乙醇胺、赖氨酸、鸟氨酸等的有机碱的盐；与乙酰基亮氨酸等各种氨基酸及氨基酸衍生物的盐或铵盐等。
进而，本发明还包含式(I)化合物及其盐的各种水合物或溶剂合物、以及结晶态物质。另外，本发明还包含由各种放射性或非放射性同位体标记的化合物。
(制造方法)
式(I)的化合物及其盐可利用基于其基本构造或取代基的种类的 特征，并采用各种公知的合成法来制造。此时，根据其官能团种类不同，在由原料至中间体的阶段将该官能团预先替换为适当的保护基(可容易转化为该官能团的基团)，有时在制造技术上会有效果。作为这样的保护基，可列举例如ウッツ(P.G.M.Wuts)和グリーン(T.W.Greene)著、“Greene's Protective Groups in Organic Synthesis(第4版、2006年)”所记载的保护基等，只要根据这些反应条件适当选择来使用即可。在这样的方法中，导入该保护基进行反应后，可通过根据需要去除保护基，得到所期望的化合物。
另外，式(I)的化合物的前体药与上述保护基同样，可通过在由原料至中间体的阶段导入特定的基团，或使用所得的式(I)化合物进一步进行反应而制造。反应可通过应用通常的酯化、酰胺化、脱水等本领域人员公知的方法来进行。
以下，说明式(I)的化合物的代表制造法。各制法也可参照该说明所附的参考文献来进行。需要说明的是，本发明的制造方法不受以下所示例子限定。
(第一制法)
[化学式12]
(式中，L5表示卤素、甲基亚磺酰基或甲基磺酰基。以下相同。)
本发明化合物(I)可通过化合物(1a)与化合物(2a)的耦合反应而得到。
本反应中，使用当量或一方过剩量的化合物(1a)和化合物(2a)，将这些的混合物在对反应惰性的溶剂中、或无溶剂下，在指定催化剂的存在下，于由室温至加热回流下，通常搅拌0.1小时～5天。本反 应优选为在惰性气体气氛下进行。作为此处所用的溶剂的例子，无特殊限定，可列举苯、甲苯、二甲苯等的芳香烃类；二乙醚、四氢呋喃、二噁烷、二甲氧基乙烷等的醚类；二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯仿等卤化烃类；N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜、乙酸乙酯、乙腈、tert-丁醇及它们的混合物。作为规定的催化剂可列举乙酸钯、三(二亚苄基丙酮)二钯等。另外，使用钯催化剂时，作为其配体，也可使用三苯基膦、1,1’-联萘-2,2’-二基双(二苯基膦)、2-(二环己基膦基)-2’,4’,6'-三异丙基-1,1’-联苯、4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基氧杂蒽。另外，在三乙胺、N,N-二异丙基乙胺或N-甲基吗啉等有机碱；或在tert-丁氧基钠、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、或氢氧化钾等的无机碱存在下进行反应，在使反应顺利进行的观点上有时有利。通过微波照射加热反应混合物，在使反应顺利进行的观点上有时是有利的。
[文献]
S.R.Sandler和W.Karo著，“Organic Functional Group Preparations”，第2版，第1卷，Academic Press Inc.，1991年
日本化学会编，“第5版实验化学讲座(第14卷)”，丸善，2005年
(第二制法)
[化学式13]
(式中，L6表示低级亚炔基。以下相同。)
(第一工序)
本工序为通过化合物(1b)与末端炔衍生物的薗头耦合反应而得到本发明化合物(1-1)的工序。
本工序中，使用当量或一方过剩量的化合物(1b)与末端炔衍生物，将它们的混合物在对反应为惰性的溶剂中，在碱、钯催化剂以及碘化铜存在下，在由室温至加热回流下，通常搅拌0.1小时～5天。本反应优选为在惰性气体气氛下进行。作为此处所用的溶剂的例子，并无特殊限定，可列举苯、甲苯、二甲苯等的芳香烃类；二乙醚、四氢呋喃、二噁烷、二甲氧基乙烷等的醚类；二氯甲烷、1,2-二氯乙烷或氯仿等卤化烃类；甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇等的醇类；N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、及它们的混合溶剂。碱优选为三乙胺、N,N-二异丙基乙胺或N-甲基吗啉等有机碱；或碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、或氢氧化钾等无机碱。钯催化剂优选为四(三苯基膦)钯、二氯双(三苯基膦)钯、氯化钯-1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁等。另外，通过微波照射加热反应混合物，在使反应顺利进行的观点上有时是有利的。
[文献]
A.d.Meijere和F.Diederich编，“Metal-Catalyzed Cross-CouplingReactions”，第1版，VCH Publishers Inc.，1997年
日本化学会编“实验化学讲座(第5版)”13卷(2005年)(丸善)
(第二工序)
本工序为将本发明化合物(I-1)的炔部分通过氢化或二酰亚胺还原而还原为亚烷基，从而得到本发明化合物(1-2)的工序。
本工序中，使用当量或一方过剩量的本发明化合物(I-1)与钯碳，将它们的混合物在对反应为惰性的溶剂中，在氢气氛下、在由室温至加热回流下，通常搅拌0.1小时～5天。作为此处所用的溶剂的例子，并无特殊限定，可列举二乙醚、四氢呋喃、二噁烷、二甲氧基乙烷等的醚类；甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇等的醇类；及它们的混合溶剂。
在氢化反应以外，使用当量或一方过剩量的本发明化合物(I-1)与规定的二酰亚胺，将它们的混合物在对反应为惰性的溶剂中，在由室温至加热回流下，通常搅拌0.1小时～5天。作为此处所用的溶剂 的例子，与上述相同。另外，作为规定的二酰亚胺可列举例如4-甲基苯磺酰基酰肼。
式(I)的化合物中的环W上的取代基可通过以式(I)化合物作为原料，使用后述实施例记载的反应、本领域人员所周知的反应、或这些变型方法，容易地转换为其它官能团。可任意组合例如还原、卤化、去保护、水解、酰胺化、氨基化、氧化、还原性氨基化、酰化、O-烷基化、N-烷基化、还原性烷基化、环氧化等本领域人员通常可采用的工序来进行。
(原料化合物的制造)
上述制造法中的原料化合物可使用例如下述的方法、后述制造例所记载的方法、公知方法、或这些的变型方法来制造。
(原料合成1)
[化学式14]
(式中，R4表示-OH或-低级亚烷基-OH；L7表示卤素、-OH、-低级亚烷基-OH、-低级亚烷基-OMs、-低级亚烷基-OTs、-低级亚烷基-OTf、或-低级亚烷基-卤素；L8表示-低级亚烷基-O-或-O-低级亚烷基-。以下相同。)
本制法是制造第一制法的原料化合物(1a)中的L1为-O-低级亚烷基或-低级亚烷基-O-的化合物(3c)的方法。
L7为卤素、-低级亚烷基-OMs、-低级亚烷基-OTs、-低级亚烷基-OTf、或-低级亚烷基-卤素的化合物(3a)的情况下，使用当量或一方过剩量的该化合物(3a)与化合物(3b)，将它们的混合物在对反应为惰性的溶剂中，在碱的存在下、在由室温至加热回流下，通常搅拌0.1小时～5天。作为此处所用的溶剂的例子，并无特殊限定，可列举N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜等。另外，碱优选为碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、或氢氧化钾等无机碱。
L7为-OH或-低级亚烷基-OH的化合物(3a)的情况下，使用当量 或一方过剩量的该化合物(3a)与化合物(3b)，将它们的混合物在对反应为惰性的溶剂中，在规定的膦试剂和缩合剂存在下，在由室温至加热回流下，通常搅拌0.1小时～5天。作为此处所用的溶剂的例子，并无特殊限定，可列举二乙基醚、四氢呋喃、二噁烷、二甲氧基乙烷等的醚类。作为规定的膦试剂，可列举三丁基膦、三苯基膦等。作为规定的缩合剂，可列举偶氮二羧酸二乙酯、1,1’-(偶氮二羰基)二哌啶等。另外，使用(氰基亚甲基)三甲基膦烷以取代规定的膦和规定的缩合剂时，在使反应顺利进行的观点上有时是有利的。
(原料合成2)
[化学式15]
(式中，L9表示卤素。以下相同。)
本制法为制造第一制法的原料化合物(1a)中的L1为低级亚烷基的化合物(4d)的方法。
(第一工序)
本工序是通过化合物(4a)与末端炔衍生物的薗头耦合反应而得到化合物(4b)的工序。
反应条件与第二制法的第一工序相同。
(第二工序)
本工序是通过使化合物(4b)的炔部分氢化而还原为低级亚烷基，从而得到化合物(4c)的工序。
反应条件与第二制法的第二工序相同。
(第三工序)
本工序是将化合物(4c)的氨基转换为卤素，从而得到化合物(4d) 的工序。
本工序中，使用当量或一方过剩量的化合物(4c)与氯化铜(II)以及亚硝酸n-戊酯，将它们的混合物在对反应为惰性的溶剂中，在由冰冷至加热回流下，通常搅拌0.1小时～5天。作为此处所用的溶剂的例子，并无特殊限定，可列举二氯甲烷、1,2-二氯乙烷或氯仿等的卤化烃类。
(原料合成3)
[化学式16]
本制法为制造第二制法的原料化合物(1b)中X为N的化合物(5c)的方法。
本反应为通过化合物(5a)与化合物(5b)的IPSO取代反应，得到化合物(5C)的反应。
使用当量或一方过剩量的化合物(5a)与化合物(5b)，将它们的混合物在对反应为惰性的溶剂中，在氢气氛下、在由冰冷至加热回流下，通常搅拌0.1小时～5天。作为此处所用的溶剂的例子，并无特殊限定，可列举甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇等的醇类；N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、及它们的混合溶剂。另外，使用甲磺酸、乙酸、三氟乙酸、氯化氢、硫酸等的酸时，在使反应顺利进行的观点上有时是有利的。
式(I)化合物的药理活性通过以下试验来确认。
试验例1FGFR1、2和3酶分析
酶分析使用人类重组FGFR1、FGFR2、FGFR3(Carnabio公司、目录编号08-133，08-134，08-135)，关于反应，FGFR1和FGFR2在室温、FGFR3在30℃下实施。测定方法如以下显示其概略。
将化合物以二甲基亚砜(DMSO)溶液稀释(10倍公比、4点)，用反应缓冲液(100mMHEPES(pH7.5)、0.003％Brij-35、0.004％ Tween20、0.5mM DTT、10mM MgCl2)稀释使得DMSO浓度成为2％。在384孔板中，在化合物溶液4μL中添加用反应缓冲液稀释的FGFR1酶(2或3ng/μL)、FGFR2酶(2ng/μL)、或FGFR3酶(6ng/μL)2μL，20分钟后添加基质-ATP溶液(100mMHEPES(pH 7.5)、0.003％Brij-35、0.004％Tween 20、0.5mM DTT、10mM MgCl2、3.75μMsubstrate-FL-peptide 22+500μM(FGFR1)ATP、188μM(FGFR2)ATP或250μM(FGFR3)ATP)4μL，反应30分钟。反应停止后，用LabChip EZ Reader测定。以所得的抑制率为基准，由非线形回归算出IC50值。将数个化合物的结果示于表1。表中的Ex表示后述实施例化合物编号。
[表1]
试验例2突变FGFR3强制表达细胞(FGFR3_S249C/NIH3T3)的增殖分析
将FGFR3_S249C/NIH3T3细胞各添加3000细胞/孔/90μL于96孔球形板(U底)，第二天添加化合物溶液(10μL)(DMSO的最终浓度0.1％)。化合物溶液这样制备：由最高浓度10mM，通过DMSO以3倍公比(9点并且仅DMSO)阶段稀释，并以培养介质(DMEM、10％FBS)稀释100倍。化合物添加5天后，通过Promega(G7573)CellTiter-Glo(注册商标)Lumine scentCell Viability Assay评价化合物的增殖抑制。需要说明的是，对添加DMSO的孔进行控制，将计数0设为100％抑制，由非线形回归算出IC50值。将数个化合物的结果示于表2。
[表2]
试验例3UM-UC-14(FGFR3_S249C阳性细胞、膀胱癌)抗肿瘤试验
在裸鼠(CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj(nu/nu)、雄、4-5周龄)右腹的皮下移植3×106个细胞/0.1mL(PBS+Matrigel、1:1)的UM-UC-14细胞，在肿瘤大小成为约250mm3时，开始药剂施用(Day 1)。1日施用1次或2次，每2～3天用游标卡尺测定肿瘤直径并测定体重，最终以第11天的肿瘤体积mm3(短径mm×短径mm×长径mm/2)来判定抗肿瘤效果(n＝3-5)。需要说明的是，向控制组施用0.5％MC(甲基纤维素)。表中的％抑制例如在100％抑制时表示将控制组的肿瘤成长抑制 为Day 1的肿瘤体积，％退缩是指比Day 1的肿瘤体积更退缩几％。需要说明的是，Day 1的肿瘤体积表示药物刚要施用前的肿瘤体积。将经口施用lmg/kg/day时(其中，实施例95的化合物为3mg/kg/day)的数个化合物结果如表3所示。
[表3]
根据上述试验，确认了包含于本发明式(I)的多个实施例化合物具有FGFR1、2和/或3抑制作用。另外，包含于式(I)的多个实施例化合物抑制使突变FGFR3强制表达的细胞的增殖，进而，在负荷有突变FGFR3阳性膀胱癌的动物模型中，确认了膀胱癌的成长的抑制或膀胱癌本身的退缩。由以上可知式(I)的化合物或其盐可作为FGFR1、2和/或3相关的各种癌、特别是突变FGFR3阳性膀胱癌的治疗剂来使用。
试验例4FGFR3-TACC3_v1的分离
对于肺癌临床样品(美国Asterand公司)200样品，使用逆转录酶(SuperScriptIII、LifeTechnologies公司)和随机引物(Random Primers、LifeTechnologies公司)，根据试剂盒的实验流程进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列编号1所示的FGFR3_TACC3_RT_F以及序列 编号2所示的FGFR3_TACC3_RT_R的引物，以上述所得的cDNA为模板，使用DNA聚合酶(TaKaRa Ex Taq；TakaraBio株式会社)进行PCR(98℃10秒、55℃15秒、68℃1分30秒、30循环)。之后，以10倍稀释的上述PCR产物为模板，使用序列编号3所示的FGFR3_TACC3_nested_F以及序列编号4所示的FGFR3_TACC3_nested_R的引物，使用同样的DNA聚合酶进行PCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃1分、30循环)。PCR反应后、电泳后，可知仅样品Lg344样品得到约500base的PCR产物。
之后，将PCR产物通过双脱氧定序法来决定序列(BigDye Terminator v3.1CycleSequencing Kit；Life；Technologies)。其结果，可知约500base的PCR产物为登录于NCBI的FGFR3(NM_001163213.1)的编码序列(以下CDS)的外显子18的3’末端与TACC3(NM_006342.1)的CDS的外显子11的5’末端融合的序列。
对于来自扁平上皮肺癌患者肺癌组织的RNA(美国Asterand公司)Lg344样品RNA，使用逆转录酶(SuperScriptⅢ、LifeTechnologies公司)及寡(dT)引物(寡(dT)20引物、LifeTechnologies公司)，根据试剂盒的实验流程进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列编号5所示的FGFR3-TACC3_cloning_F以及序列编号6所示的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，以上述所得的cDNA为模板，使用DNA聚合酶(KOD-plus-Ver.2；东洋纺绩株式会社)进行PCR(98℃15秒、60℃15秒、68℃3分30秒、25循环)。之后，以10倍稀释的上述PCR产物为模板，使用序列编号7所示的FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F以及序列编号8所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物，使用相同的DNA聚合酶进行PCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃3分30秒、25循环)。PCR反应后，电泳后，可知得到约2.9kbase的PCR产物。将PCR产物克隆至克隆载体(TOPO XL PCR Cloning Kit；LifeTechnologies株式会社)。插入序列通过双脱氧定序法来决定序列(BigDye Terminator v3.1CycleSequencing Kit；LifeTechnologies)。结果可知，约2.9kbase的 PCR产物中存在登录于NCBI的FGFR3(NM_001163213.1)的CDS的5'末端至外显子18的3'末端与TACC3(NM_006342.1)CDS的外显子11的5'末端至CDS的3'末端融合的转录产物(FGFR3-TACC3_v1)(序列编号9)。以序列编号9编码的多肽(FGFR3-TACC3_v1融合多肽)如序列编号10所示。
试验例5FGFR3-TACC3_v2的分离
对于膀胱癌(美国Asterand公司)59样品，使用逆转录酶(SuperScript III、LifeTechnologies公司)及随机引物(RandomPrimers、LifeTechnologies公司)，根据试剂盒的实验流程进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列编号1所示的FGFR3_TACC3_RT_F以及序列编号2所示的FGFR3_TACC3_RT_R的引物，以上述所得的cDNA为模板，使用DNA聚合酶(TaKaRa Ex Taq；TakaraBio株式会社)进行PCR(98℃10秒、55℃15秒、68℃1分30秒、30循环)。之后，以10倍稀释的上述PCR产物为模板，使用序列编号3所示的FGFR3_TACC3_nested_F以及序列编号4所示的FGFR3_TACC3_nested_R的引物，使用相同的DNA聚合酶进行PCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃1分、30循环)。PCR反应后，电泳后，可知以样品Bd106样品得到约600base的PCR产物。
之后，通过双脱氧定序法对PCR产物定序(BigDye Terminator v3.1CycleSequencing Kit；LifeTechnologies)。其结果可知，约600base的PCR产物为登录于NCBI的FGFR3(NM_001163213.1)的CDS的外显子18的3’末端与TACC3(NM_006342.1)的CDS的外显子10的5’末端融合的序列。对于来自膀胱癌患者膀胱癌组织的RNA(美国Asterand公司)Bd106样品RNA，使用逆转录酶(SuperScriptIII、LifeTechnologies公司)及寡(dT)引物(寡(dT)20引物、LifeTechnologies公司)，根据试剂盒的实验流程进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列编号5所示的FGFR3-TACC3_cloning_F以及序列编号6所示的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，以上述所得的cDNA为模板，使用DNA聚合酶(KOD-plus-Ver.2；东洋纺绩股份有 限公司)进行PCR(98℃15秒、60℃15秒、68℃3分30秒、25循环)。之后，以10倍稀释的上述PCR产物为模板，使用序列编号7所示的FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F以及序列编号8所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物，使用相同的DNA聚合酶进行PCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃3分30秒、25循环)。PCR反应后，电泳后，可知得到约3.0kbase的PCR产物。将PCR产物克隆于克隆载体(TOPO XL PCR Cloning Kit；LifeTechnologies株式会社)。插入序列通过双脱氧定序法来决定序列(BigDyeTerminator v3.1Cycle Sequencing Kit；LifeTechnologies)。其结果可知，约3.0kbase的PCR产物中，存在有登录于NCBI的FGFR3(NM_001163213.1)的CDS的5'末端至外显子18的3'末端与TACC3(NM_006342.1)的CDS的外显子10的5’末端至CDS的3’末端融合的转录产物(FGFR3-TACC3_v2)(序列编号11)。由序列编号11编码的多肽(FGFR3-TACC3_v2融合多肽)如序列编号12所示。
试验例6FGFR3-TACC3_v3的分离
对于膀胱癌(美国Asterand公司)59样品，使用逆转录酶(SuperScriptIII、LifeTechnologies公司)及随机引物(RandomPrimers、LifeTechnologies公司)，根据试剂盒的实验流程进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列编号1所示的FGFR3_TACC3_RT_F以及序列编号2所示的FGFR3_TACC3_RT_R的引物，以上述所得的cDNA为模板，使用DNA聚合酶(TaKaRa Ex Taq；TakaraBio株式会社)进行PCR(98℃10秒、55℃15秒、68℃1分30秒、30循环)。之后，以10倍稀释的上述PCR产物为模板，使用序列编号3所示的FGFR3_TACC3_nested_F以及序列编号4所示的FGFR3_TACC3_nested_R的引物，使用相同的DNA聚合酶进行PCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃1分、30循环)。PCR反应后，电泳后，得知样品Bd021样品得到约650base的PCR产物。
之后，通过双脱氧定序法决定PCR产物的序列(BigDye Terminator v3.1CycleSequencing Kit；LifeTechnologies)。其结果可 知，约650base的PCR产物为登录于NCBI的FGFR3(NM_001163213.1)的CDS的外显子19的中间序列与TACC3(NM_006342.1)的内含子10-11的一部分融合，且进一步与TACC3的CDS的外显子11的5’末端融合的序列。
对于来自膀胱癌患者膀胱癌组织的RNA(美国Asterand公司)Bd021样品RNA，使用逆转录酶(SuperScriptIII、Life'Technologies公司)及寡(dT)引物(寡(dT)20引物、LifeTechnologies公司)，根据试剂盒的实验流程进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列编号5所示的FGFR3-TACC3_cloning_F以及序列编号6所示的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，以上述所得的cDNA为模板，使用DNA聚合酶(KOD-plus-Ver.2；东洋纺绩股份有限公司)进行PCR(98℃15秒、60℃15秒、68℃3分30秒、25循环)。之后，以10倍稀释的上述PCR产物为模板，使用序列编号7所示的FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F以及序列编号8所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物，使用相同的DNA聚合酶进行PCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃3分30秒、25循环)。PCR反应后，电泳后，得知得到约3.0kbase的PCR产物。将PCR产物克隆至克隆载体(TOPO XL PCR Cloning Kit；LifeTechnologies株式会社)。插入序列通过双脱氧定序法定序(BigDye Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit；LifeTechnologies)。其结果可知，约3.0kbase的PCR产物中，存在有登录于NCBI的FGFR3(NM_001163213.1)的CDS的5'末端至外显子19的中间序列与TACC3(NM_006342.1)的内含子10-11的一部分融合，且进而与TACC3的CDS的外显子11的5’末端至CDS的3’末端融合的转录产物(FGFR3-TACC3_v3)(序列编号13)。由序列编号13编码的多肽(FGFR3-TACC3_v3融合多肽)如序列编号14所示。
试验例7由来自膀胱癌患者的细胞株RT-112分离FGFR3-TACC3_v1
对于由来自膀胱癌患者的细胞株RT-112(从Leibniz-Institut DSMZ-DeutscheSammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH购入)纯化的RNA，使用逆转录酶(SuperScriptIII、LifeTechnologies公司)及寡(dT)引物(寡(dT)20引物、LifeTechnologies公司)，根据试剂盒的实验流程进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列编号5所示的FGFR3-TACC3_cloning_F以及序列编号6所示的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，以上述所得的cDNA为模板，使用DNA聚合酶(KOD-plus-Ver.2；东洋纺绩股份有限公司)进行PCR(98℃15秒、60℃15秒、68℃3分30秒、25循环)。之后，以10倍稀释的上述PCR产物为模板，使用序列编号7所示的FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F以及序列编号8所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物，使用相同的DNA聚合酶进行PCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃3分30秒、25循环)。PCR反应后，进行电泳，结果得到约2.9kbase的PCR产物。将PCR产物克隆于克隆载体(TOPO XL PCR Cloning Kit；LifeTechnologies株式会社)，通过双脱氧定序法(BigDye Terminator v3.1CycleSequencing Kit；LifeTechnologies)对插入序列定序，其结果可知，与登录于NCBI的FGFR3(NM_001163213.1)的CDS的N末端至外显子18的3’末端与TACC3(NM_006342.1)的CDS外显子11的5'末端至CDS的C末端融合的转录产物(FGFR3-TACC3_v1)(序列编号9)相同。
试验例8由来自膀胱癌患者的细胞株RT4分离FGFR3-TACC3_v4
对于由来自膀胱癌患者的细胞株RT4(从ECACC(European Collectionof CellCultures)购入)纯化的RNA，使用逆转录酶(SuperScriptIII、LifeTechnologies公司)及寡(dT)引物(寡(dT)20引物、LifeTechnologies公司)，根据试剂盒的实验流程进行逆转录反应，合成cDNA。接着，使用序列编号5所示的FGFR3-TACC3_cloning_F以及序列编号6所示的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，以上述所得的cDNA为模板，使用DNA聚合酶(KOD-plus-Ver.2；东洋纺绩株式会社)进行PCR(98℃15秒、60℃15秒、68℃5分30秒、30循环)。之后，以10倍稀释的上述PCR产物为模板，使用序列编号7所示的FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F以及序列编号8所示的 FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物，使用相同的DNA聚合酶进行PCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃5分、30循环)。PCR反应后，进行电泳，结果得到约4.5kbase的PCR产物。将PCR产物克隆于克隆载体(TOPO XL PCR Cloning Kit；LifeTechnologies株式会社)，通过双脱氧定序法(BigDye Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit；LifeTechnologies)对插入序列定序，其结果可知，存在有登录于NCBI的FGFR3(NM_001163213.1)的CDS的5’末端至外显子18的3'末端与FGFR3的内含子18-19序列的一部分融合，且进一步由TACC3(NM_006342.1)的外显子4的中途开始融合，与TACC3的CDS的3'末端为止融合的转录产物(FGFR3-TACC3_v4)。经确认的序列中，第882号的碱基序列由T替换为C(SNPs登录编号；rs2234909)、第2484号的碱基序列由C替换为T、第2663号的碱基序列由G替换为A(序列编号15)。由序列编号15编码的多肽(FGFR3-TACC3_v4融合多肽)如序列编号16所示。
试验例9FGFR3-TACC3_v1、FGFR3-TACC3_v2、FGFR3-TACC3_v3和FGFR3-TACC3_v4的逆转录病毒液的制作
为了将FGFR3-TACC3_v1、FGFR3-TACC3_v2、FGFR3-TACC3_v3以及FGFR3-TACC3_v4的ORF全长作为蛋白质来表达，由试验例4、试验例5、试验例6以及试验例8中制作的克隆载体，以限制酶BamHI进行37℃、3小时的酶反应并纯化限制酶处理后的DNA片段，进而，以EcoRI进行37℃、3小时的酶反应并纯化限制酶处理后的DNA片段。将含有此ORF的DNA片段克隆到存在于表达载体(pMXs-puro；Cosmobio公司)的多克隆位点的BamHI及EcoRI位点上，并构筑表达质粒(FGFR3-TACC3_v1/pMXs-puro、FGFR3-TACC3_v2/pMXs-puro、FGFR3-TACC3_v3/pMXs-puro以及FGFR3-TACC3_v4/pMXs-puro)。
使用转染试剂(FUGENE(注册商标)HD、Roche公司)对各9μg的FGFR3-TACC3_v1/pMXs-puro、FGFR3-TACC3_v2/pMXs-puro、FGFR3-TACC3_v3/pMXs-puro以及FGFR3-TACC3_v4/pMXs-puro，实施向Platinum-E细胞的转染。转染24小时后，更换为包含10％牛 血清(NichireiBioscience公司)的D-MEM培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium培养基；Invitrogen公司)，进一步采取24小时后的培养基上清液，制作逆转录病毒溶液。
试验例10FGFR3-TACC3_v1、FGFR3-TACC3_v2、FGFR3-TACC3_v3以及FGFR3-TACC3_v4的锚定非依赖性的增殖亢进作用的研究
试验例9中，在使用FGFR3-TACC3_v1/pMXs-puro、FGFR3-TACC3_v2/pMXs-puro、FGFR3-TACC3_v3/pMXs-puro以及FGFR3-TACC3_v4/pMXs-puro制作的病毒溶液中以4μg/mL的浓度添加聚凝胺(Polybrene；Sigma公司)后，添加至NIH3T3细胞使其感染。添加6小时后更换为包含10％牛血清(NichireiBioscience公司)的D-MEM培养基，感染1天后更换为包含10％牛血清(NichireiBioscience公司)以及lμg/mL的嘌呤霉素(Sigma公司)的D-MEM培养基(Invitrogen公司)，在5％CO2存在下、37℃下持续4周培养，取得稳定表达FGFR3-TACC3_v1、FGFR3-TACC3_v2、FGFR3-TACC3_v3以及FGFR3-TACC3_v4的NIH3T3细胞。(分别命名为FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞以及FGFR3-TACC3_v4表达/NIH3T3细胞)。
为了研究FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞以及FGFR3-TACC3_V4表达/NIH3T3细胞的锚定非依赖性的增殖亢进能力，在96孔球形板(Sumiloncelltightspheroid96U；住友Bakelite)中分别将FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v4表达/NIH3T3细胞以及经空载体pMXs-puro感染的NIH3T3细胞(Mock/NIH3T3细胞)，用包含10％牛血清(NichireiBioscience公司)的D-MEM培养基(Invitrogen公司)进行播种，使得每1孔为1×103个。在5％CO2存在下、在37℃培养后，以细胞数测定试剂(CELLTITER-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay；Promega公司)根据手册的方法来测定第二天(Dayl)及4天后(Day4)的细胞数。使用发光测定装置进行检测。关于Mock/NIH3T3细胞，由Dayl至Day4，细胞数的计数不增加，相对于此，FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞由Dayl至Day4确认到约3.1倍的细胞数计数的增加、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞由Dayl至Day4确认了约2.8倍的细胞数计数的增加、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞由Dayl至Day4确认到约2.3倍的细胞数计数的增加、FGFR3-TACC3_v4表达/NIH3T3细胞由Dayl至Day4确认到约2.5倍的细胞数计数的增加。
从以上可以发现，FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞以及FGFR3-TACC3_v4表达/NIH3T3细胞显示出锚定非依赖性的细胞增殖。
试验例11化合物对FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v4表达/NIH3T3细胞、来自膀胱癌患者的细胞株RT-112及来自膀胱癌患者的细胞株RT4的锚定非依赖性的细胞增殖抑制作用
锚定非依赖性的细胞增殖的测定(集落法等)已知为研究化合物抗癌作用(药理效果)的系统(临床肿瘤学第二版、癌与化学疗法社)。作为代替集落法的测定细胞非粘合性增殖的方法，有使用如上所述的球形板的方法。
在96孔球形板(Sumiloncelltightspheroid96U；住友Bakelite)中，将FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v4表达/NIH3T3细胞用包含10％胎牛血清的D-MEM培养基进行播种，使得每1孔为1×103个。同样将来自膀胱癌患者的细胞株RT-112用包含10％胎牛血清以及2mM L-glutamine的RPMI1640培养基进行播种，使得每1孔为1×103个；将来自膀胱癌患者的细胞株RT4用包含10％胎牛血清的RPMI1640培养基进行播 种，使得每1孔为1×103个。另外，作为正控制用，制备仅添加培养基的孔。在5％CO2存在下、37℃培养一晚后，以最终浓度100nM、10nM及1nM添加被测化合物。作为负控制，将化合物的溶剂即DMSO以成为与化合物添加时同浓度(0.1％)的方式添加。之后，在5％CO2存在下、37℃培养4天，添加细胞数测定试剂(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay；Promega公司)，搅拌20分钟后，使用发光测定装置来测定。分别以正控制、负控制的值为100％抑制值、0％抑制值，算出各化合物的增殖抑制％。其结果如表4所示，发现了数个本发明化合物抑制FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v4表达/NIH3T3细胞、来自膀胱癌患者的细胞株RT-112以及来自膀胱癌患者的细胞株RT4的锚定非依赖性的增殖亢进作用。
根据以上结果，可知表达FGFR3-TACC3_v1、FGFR3-TACC3_v2、FGFR3-TACC3_v3以及FGFR3-TACC3_v4的癌细胞或肿瘤的增殖可通过本发明化合物来抑制。
[表4]
试验例12化合物对FGFR3-TACC3融合多肽的体外激酶活性的抑制作用
(1)FLAG标签融合表达质粒
(FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)、
FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)以及
FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+))的构筑
为了取得FLAG标签融合于5’末端的FGFR3-TACC3融合聚核苷酸，使用试验例4、试验例5、以及试验例6中克隆的载体作为模板，实施于5'末端加成FLAG标签的PCR。使用序列编号17所示的FGFR3_N_FLAG_BamHI以及序列编号8所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物以及DNA聚合酶(KOD-plus-Ver.2；东洋纺绩株式会社)进行PCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃3分30秒、12循环)。将PCR产物克隆于克隆载体(TOPO XL PCR Cloning Kit；LifeTechnologies株式会社)。插入序列通过双脱氧定序法定序(BigDye Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit；LifeTechnologies)。其结果，确认了PCR产物为在序列编号9、序列编号11及序列编号13记载的序列当中，编码第一个甲硫氨酸的3个碱基(ATG)被删除且起始密码子与编码FLAG标签的核酸序列(序列编号24)被加成于5’末端的核酸序列。将通过这些所编码的多肽分别称为FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽，将这些总称为FGFR3-TACC3(N-FLAG)融合多肽。另外，为了构筑将加成这些的FLAG序列的FGFR3-TACC3_vl(N-FLAG)、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)以及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)的ORF全长作为蛋白质来表达的表达载体，利用上述克隆载体并以限制酶BamHI进行37℃、3小时的酶反应并且纯化限制酶处理过的DNA片段，进一步用EcoRI进行37℃、3小时的酶反应并且纯化限制酶处理过的DNA片段。将含有此ORF的DNA片段克隆到存在于表达载体(pcDNA3.1/Zeo(+)；LifeTechnologies株式会社)的多克隆位点的BamHI及EcoRI位点上，并构筑表达质粒(FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)以及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+))。
(2)FGFR3-TACC3(N-FLAG)融合多肽的获得
在转染实施的前一天，使用包含10％胎牛血清的D-MEM培养基，培养10张经胶原蛋白涂覆的15cm培养盘，每1张0.5×107个HEK293细胞。在转染当天，分别将FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)以及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)(试验例12)在每1张培养盘使用27μg，使用转染试剂(FUGENE(注册商标)HD、Roche公司)81μL，对HEK293细胞实施转染。转染24小时后，去除培养基， 用PBS洗涤3次，添加1mL的PBS，以细胞刮具(康宁公司)剥下细胞后，回收于聚丙烯制的管。以1200rpm离心5分钟后，去除上清液，添加150μL的细胞溶解液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、l％Np-40、1mMEDTA、蛋白酶抑制剂cocktailcomplete)，于冰上培养30分钟，使细胞溶解。将存在于离心后所得的上清液中的FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽以及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽分别使用M2抗体亲和凝胶(ANTI-FLAG M2Affinity Gel；SIGMA-ALDRICH公司)根据产品信息记载的方法来纯化。洗涤及溶出分别使用洗涤液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、l％Np-40、1mMEDTA、蛋白酶抑制剂cocktailcomplete)、溶出液(20mM Tris-HCl(pH7.4)、10mM MgCl2、l0mM MnCl2、0.5mg/mL FLAG peptide)，而得到l00μL的溶出液。对于溶出液进行使用了抗FGFR3抗体(CellSignaling公司)及抗FLAGM2抗体(SIGMA-ALDRICH公司)的免疫印迹法以及银染色，确认了得到FGFR3-TACC3_vl(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽。
(3)FGFR3-TACC3(N-FLAG)融合多肽的体外激酶活性的检测
使用激酶活性检测试剂盒(HTRF KinEASE-TK；Cisbio公司)来研究上述经纯化的FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽以及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽对肽基质的磷氧化活性。使用康宁公司384孔、Low-volume Blackplate，以上述溶出液的1倍稀释溶液、3倍稀释溶液或10倍稀释溶液各1μL作为酶源，在试剂盒所附的5x Kinase buffer中分别添加DTT及Mg使最终浓度成为1mM及5mM，作为反应溶液。以试剂盒所附的TK Substrate作为基质且最终浓度成为2.0μM的方式、ATP未添加及添加使得ATP最终浓度成为100μM，最终容量为5.0μL，各自于室温反应1小时。反应后，根据试剂盒推荐的方法，制备Sa-XL665及TK Antibody-Eu(K)溶液，分别添加2.5μL，在室温反应1小时后，检测HTRF的计数(即肽基 质的磷氧化)。其结果可知，相对于ATP未添加，ATP添加时，HTRF的计数在添加包含上述FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽或FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽的各溶出液1倍稀释溶液lμL时，分别增加约38倍、约40倍以及约38倍；添加上述溶出液3倍稀释溶液lμL时，分别增加约27倍、34倍、31倍；添加上述溶出液10倍稀释溶液lμL时，分别增加5倍、18倍、11倍。
如上，通过使用激酶活性检测试剂盒，可检测各融合多肽的体外激酶活性。
(4)化合物对FGFR3-TACC3(N-FLAG)融合多肽的体外激酶活性的抑制作用
使用上述激酶活性检测试剂盒及同样的384孔板，研究被测化合物对FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽的体外激酶活性的抑制作用。以各化合物最终浓度成为100nM、10nM及1nM的方式添加，作为控制组，添加DMSO成为0.1％，对于FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽，添加上述溶出液2倍稀释溶液1μL、对于FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽，添加上述溶出液3倍稀释溶液lμL、及对于FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽，添加上述溶出液3倍稀释溶液lμL，然后，添加试剂盒所附的TKSubstrate作为基质，使最终浓度成为2.0μM，在室温反应15分钟。接着，添加ATP使最终浓度成为100μM，或不添加，以最终容量为5.0μL在室温反应60分钟。其它分别添加与上述(3)的方法同样方式制备的Sa-XL665及TK Antibody-Eu(K)溶液2.5μL，在室温反应1小时后，检测HTRF的计数。将化合物不存在下(与化合物添加时同浓度添加DMSO 0.1％)的ATP未添加及添加时的磷氧化计数分别作为100％抑制、0％抑制，用以下算式算出化合物所致的FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽激酶活性的抑制％。
[化合物所致的激酶活性抑制(％)]＝(1-[化合物添加ATP添加时的磷氧化计数-化合物未添加ATP未添加时的磷氧化计数]/[化合物未添加ATP添加时的磷氧化计数-化合物未添加ATP未添加时的磷氧化计数])×100
其结果，如表5所示，发现了数个本发明的化合物会抑制纯化的FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽对肽基质的磷氧化活性。
[表5]
试验例13由来自膀胱癌患者的细胞株SW780的FGFR3-BAIAP2L1的分离
对由来自膀胱癌患者的细胞株SW780(由ATCC购入)所纯化的RNA，使用逆转录酶(SuperScriptIII、LifeTechnologies公司)及寡(dT)引物(寡(dT)20引物、LifeTechnologies公司)，根据试剂盒的实验流程进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列编号18所示的FGFR3-BAIAP2Ll_cloning_F以及序列编号19所示的FGFR3-BAIAP2L1_cloning_R的引物，以上述所得的cDNA为模板，使用DNA聚合酶(KOD-plus-Ver.2；东洋纺绩株式会社)进行PCR(98℃15秒、60℃15秒、68℃5分、30循环)。之后，以10倍稀释的上述PCR产物为模板，使用序列编号20所示的FGFR3_BAIAP2Ll_cloning_BamHI_F以及序列编号21所示的FGFR3_BAIAP2Ll_cloning_NotI_R的引物，使用相同的DNA聚合酶进行PCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃4分、30循环)。PCR反应后、进行电泳，结果得到约3.8kbase的PCR产物。将PCR产物克隆于克隆载体(TOPO XL PCR Cloning Kit；LifeTechnologies株式会社)，将插入序列以双脱氧定序法(BigDye Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit；LifeTechnologies)定序，结果可知为登录于NCBI的FGFR3(NM_001163213.1)的CDS的5’末端至外显子18的3'末端与BAIAP2L1(NM_018842.4)的CDS的外显子2的5'末端至CDS的3'末端融合的转录产物(FGFR3-BAIAP2L1)。确认的序列中，第3558号的碱基序列由G替换为A(SNPs登录编号；rs1045916)、第3723号的碱基序列由C替换为T、第3747号的碱基序列由G替换为A(序列编号22)。由序列编号22所编码的多肽如序列编号23所示。
试验例14FGFR3-BAIAP2L1的逆转录病毒液的制作
为了构筑将FGFR3-BAIAP2L1的ORF全长作为蛋白质表达的表达质粒，利用上述克隆载体并用限制酶BamHI进行37℃、3小时的酶反应，并纯化限制酶处理后的DNA片段，进一步用NotI进行37℃、3小时的酶反应，并纯化限制酶处理后的DNA片段。将含有该ORF的DNA片段克隆到存在于表达载体(pMXs-puro；Cosmobio公司)的多克隆位点的BamHI及NotI位点上，构筑表达质粒(FGFR3-BAIAP2Ll/pMXs-puro)。使用所制作的FGFR3-BAIAP 2Ll/pMXs-puro，根据试验例9的方法制作逆转录病毒溶液。
试验例15FGFR3-BAIAP2L1的锚定非依赖性的增殖亢进作用的研究
使用于试验例14中使用FGFR3-BAIAP2Ll/pMXs-puro所制作的病毒溶液，根据试验例10的方法，取得稳定表达FGFR3-BAIAP2L1的NIH3T3细胞(命名为FGFR3-BAIAP2L1表达/NIH3T3细胞)。
为了研究FGFR3-BAIAP2L1表达/NIH3T3细胞的锚定非依赖性的增殖亢进能力，以与试验例10同样的方法进行了研究。Mock/NIH3T3细胞由Dayl至Day4细胞数的计数并无增加，与之相对，FGFR3-BAIAP2L1表达/NIH3T3细胞确认了由Dayl至Day4有约2.5倍的细胞数计数的增加。如上可知，FGFR3-BAIAP2L1表达/NIH3T3细胞显示出锚定非依赖性的细胞增殖。
试验例16对FGFR3-BAIAP2L1表达/NIH3T3细胞的锚定非依赖性的细胞增殖抑制作用
在96孔球形板(Sumiloncelltightspheroid96U；住友Bakelite)中用含有10％胎牛血清的D-MEM培养基播种FGFR3-BAIAP2L1表达/NIH3T3细胞，使得每1孔为l×103个。另外，制备仅添加培养基的孔作为正控制用。在5％CO2存在下、37℃培养一晚后，以最终浓度100nM、10nM及1nM添加被测化合物。作为负控制，添加化合物的溶剂即DMSO使成为与化合物添加时同浓度(0.1％)。之后，在5％CO2存在下、37℃培养4天，添加细胞数测定试剂(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay；Promega公司)，搅拌20分钟后，使用发光测定装置测定。以正控制、负控制的值分别为100％抑制值、0％抑制值，算出各化合物的增殖抑制％。其结果如表6所示，发现了多个本发明化合物会抑制FGFR3-BAIAP2L1表达/NIH3T3细胞的锚定非依赖性的增殖亢进作用。
根据以上结果，表明表达FGFR3-BAIAP2L1的癌细胞或肿瘤的增殖可被本发明化合物抑制。
[表6]
含有式(I)的化合物或其盐的1种或2种以上作为有效成分的医药组合物可使用本技术领域通常所使用的赋形剂(即药剂用赋形剂或药剂用载体等)通过通常所使用的方法来制备。
给药时，可为利用锭剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂等的经口给药；或利用关节内、静脉内、肌肉内等的注射剂、栓剂、点眼剂、眼软膏、经皮用液体制剂、软膏剂、经皮用贴附剂、经黏膜液体制剂、经黏膜贴附剂、吸入剂、膀胱内注入剂等的非经口给药的任意方式。
作为用于经口给药的固体组合物，可使用锭剂、散剂、颗粒剂等。在这样的固体组合物中，将1种或2种以上的有效成分与至少1种的惰性赋形剂混合。根据一般方法，组合物可含有惰性的添加剂，例如润滑剂或崩解剂、稳定化剂、溶解辅助剂。锭剂或丸剂也可根据需要以糖衣或胃溶性或肠溶性物质的薄膜来包覆。
用于经口给药的液体组合物含有药剂学上容许的乳浊剂、溶液剂、悬浊剂、糖浆剂或酏剂等，且含有一般所用的惰性稀释剂，例如纯水或乙醇。该液体组合物除惰性稀释剂以外，也可含有如可溶化剂、湿润剂、悬浊剂之类的辅助剂、甘味剂、风味剂、芳香剂、防腐剂。
用于非经口给药的注射剂含有无菌的水性或非水性溶液剂、悬浊剂或乳浊剂。作为水性的溶剂，包含例如注射用蒸馏水或生理食盐水。作为非水性的溶剂，有例如乙醇之类的醇类。这样的组合物还可以进一步含有等渗剂、防腐剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定化剂、或溶解辅助剂。它们(例如)通过细菌保留过滤器来过滤、通过杀菌剂的配合或照射而无菌化。另外，它们也可以制造无菌固体组合物，且于使用前溶解或悬浊于无菌水或无菌的注射用溶剂来使用。
外用剂包含软膏剂、硬膏剂、霜剂、胶状剂、糊剂、喷雾剂、洗剂、点眼剂、眼软膏等。含有一般所用的软膏基剂、洗剂基剂、水性、或非水性的液体制剂、悬浊剂、乳剂等。
吸入剂或经鼻剂等的经黏膜剂可使用固体、液体、或半固体状，可根据以往公知的方法来制造。也可以适当添加例如公知的赋形剂、或进一步适当添加pH调整剂、防腐剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂或增黏剂等。给药可使用用于适当的吸入或吹送的装置。例如，可使用计量给药吸入装置等的公知装置或喷雾器，将化合物单独地或作为配方后的混合物的粉末来给药、或者可以将化合物与可药用的载体组合后作为溶液或悬浮液来给药。干燥粉末吸入器等可为单次或多次给药用吸入器，可利用干燥粉末或含有粉末的胶囊。或可为加压气溶胶喷雾等的方式，其使用适当的抛射剂，例如氯氟烷烃或二氧化碳等的适合的气体。
通常口服给药时，1天的给药量按体重约为0.001～100mg/kg，优选为0.1～30mg/kg，更优选为0.1～10mg/kg，并将该给药量1次服用或分2次～4次服用。静脉内给药时，1天的给药量按体重约为0.0001～10mg/kg是适当的，并将该给药量每日一次或分为多次给药。而且，使用经粘膜剂时，按体重约为0.001～100mg/kg，每日一次或分多次给药。应考虑症状、年龄、性别等，根据每个患者的情况， 来适当地决定给药量。
虽然根据给药路径、剂形、给药部位、赋形剂或添加剂的种类而不同，但本发明的医药组合物含有0.01～100重量％、作为某方式含有0.01～50重量％的有效成分即1种或其以上的式(I)化合物或其盐。
式(I)的化合物可以与认为上述式(I)所示化合物对其有效的那些疾病的各种治疗剂或预防剂并用。在并用时，可以同时给药，或者分别连续给药、或按所希望的时间间隔给药。同时给药时的制剂可以是配合剂，也可以分别制成制剂。
实施例
以下，基于实施例，进一步详细说明式(I)化合物的制造法。需要说明的是，本发明不受下述实施例记载的化合物限定。另外，原料化合物的制法如制造例所示。进而，式(I)化合物的制造法不限定于以下所示的具体实施例的制造法，式(I)化合物也可以通过这些的制造法的组合、或本领域人员所易知的方法来制造。
1；54，7066-7083、AACR 2011，No.1643AstraZeneca)。
关于FGFR1，在肺癌(特别是扁平上皮癌)及激素疗法抗性的乳癌中，FGFR1基因的扩增被报导，且还报导这些细胞株中显示依存于FGFR1的细胞增殖(Sci.Transl.Med.2010；2(62)：62ra93、BreastCancer Res.2007；9(2)：R23、Cancer Res.2010，70(5)，2085-2094)。
关于FGFR2，报导有胃癌及三重阴性乳癌中的基因扩增、子宫内膜癌中的活性化突变(Laboratory Investigation 1998，78(9)；1143-1153、Virchows Arch，1997，431；383-389、J.Cancer Res.Clin.Oncol.，1993，119，265-272、AACR2011，No.1643AstraZeneca、Oncogene 2010；29，2013-2023)，在这些癌细胞中也已经确认依存于FGFR2的增殖。
另外，FGFR3在膀胱癌中约50％的病例显示活性化基因突变。膀胱癌被大致分为非浸润性、浸润性及转移性3种。非浸润性膀胱癌的5年存活率高达70％以上，但复发频率高、且一部分会朝向浸润 性发展，另一方面，浸润性或转移性膀胱癌5年存活率低至50％以下，分别成为问题。作为FGFR3突变的非浸润性膀胱癌的现行疗法，有经尿道的膀胱肿瘤切除术(TUR-BT)及术后BCG疗法或化学疗法剂的膀胱内注入，但复发预防效果依然不充分，血尿、膀胱剌激症状等副作用会成为问题。另一方面，浸润或转移性膀胱癌虽然主要进行膀胱全摘除及化学疗法剂的全身给药，但在有效性或副作用上有问题。作为膀胱癌的特征，已知一部分癌细胞会由膀胱组织剥落至尿中，作为膀胱癌的诊断，进行尿细胞诊察。最近，报导了可使用尿中的沉淀物来检测FGFR3突变(Biochem.Biophys.Res.Commun.2007Nov 3；362(4)：865-71)。通过此FGFR3突变的有无，可选择FGFR3突变阳性膀胱癌患者，期望制出FGFR3选择性的抑制剂。
另外，已报导FGFR基因和TACC(Transforming Acidic Coiled-coil)基因的融合基因(FGFR3-TACC3及FGFR1-TACC1)在一部分的成胶质细胞瘤患者的肿瘤有表达(Science，2012Sep7；337(6099)：1231-5)。根据该报告，由将FGFR3-TACC3及FGFR1-TACC1在astrocyte中强制表达时的转换，显示了这些融合基因具有癌化能力，FGFR3-TACC3局部存在于分裂期的纺锤体极，且诱导依存于激酶活性的染色体非整倍性。另外，对FGFR3-TACC3表达细胞进行FGFR抑制剂处置的话，染色体非整倍体性被抑制，且抑制此细胞的增殖。因此，暗示了FGFR抑制剂对具有FGFR-TACC融合基因的成胶质细胞瘤患者的治疗有效的可能性。
另外，已报导于人类膀胱癌细胞株RT112、RT4、LUCC2中会表达FGFR3-TACC3融合基因、同样地人类膀胱癌细胞株SW780中会表达FGFR3-BAIAP2L1融合基因(Hum Mol Genet.，2013Feb 15，22(4)，795-803)。根据该报告，将这些融合基因导入NIH3T3细胞的结果，确认了锚定非依赖性的增殖亢进作用。另外，表达这些FGFR3融合基因的上述膀胱癌细胞株的增殖会被FGFR抑制剂所抑制，因此，本融合基因的存在检测可能对通过FGFR抑制剂治疗有效的患者的选择有用。
下述式(A)的化合物被报导显示出各种激酶抑制，作为癌、及心 肌梗塞等血管障碍的治疗剂有用(专利文献1)。该文献的表2中公开了数个化合物的关于Yes、VEGFR、EphB4、PDGFRβ及FGFR1的激酶抑制试验结果，且公开了FGFR1抑制活性的IC50值大于1000nM，相比于其它激酶的活性抑制弱。另外，该文献中并无后述本申请发明的式(I)化合物的具体公开。
[化学式1]
(式中，A分别为CH、N等；B分别为CH等；A1为O、CR2等；R0为H等；A2为NR、O等；L1为键、O等；L2为键、C1-C6烷基等；R1为3～6元杂环等；而且，Re、Rf为H、C1-C6烷基、羟基烷基等。其它符号参照该公报)。
下述式(B)的化合物被报导显示出Abl抑制作用，对各种癌有用(专利文献2)。但是，该文献中并无关于FGFR抑制作用的具体记载。另外，后述本申请发明的式(I)化合物，在其基团(R1)P方面，与式(B)化合物的构造不同。
[化学式2]
(式中，G为CH等、A为3-羟基苯基等、Y为乙烯基或亚乙基。其它符号参照该公报)。
下述式(C)的化合物被报导用于治疗癌、血管障碍等，对于由Src、VEGFR2、Yes、Fyn、Lck、Abl、PDGFR、EGFR及RET构成的各种激酶具有抑制作用(专利文献3)。但是，该文献中并无对FGFR的抑制作用的公开。而且，该文献中并无后述本申请发明的式(I)化合物的具体公开。
[化学式3]
(式中，G1表示可具有取代基的芳基、可具有取代基的杂芳基等；L1表示O、SO、SO2、可被取代的烷基等；L2表示可被取代的烷基、杂环等；A1表示键、O、C(Ra)2等；A2表示NRa、O等。其它符号参照该公报)。
下述式(D)被报导具有TIE-2和/或VEGFR-2激酶抑制作用，对包含癌的血管新生相关的疾病治疗有用(专利文献4)。但是，该文献中并无关于FGFR抑制的具体记载。另外，后述本发明的式(I)化合物在其基团L1不具有氨基的这点、及包含X及Y的环的2个连结键位于对位的这点上，与式(D)的化合物的构造不同。
[化学式4]
(式中，W为N或CR，R为H等。其它符号参照该公报)。
下述式(E)的化合物被报导显示出多个受体蛋白质酪氨酸激酶活性，特别是FGFR活性的抑制作用，可使用于与这些酶的异常或与过度活性相关的各种疾病的处置(专利文献5)。但是，后述本发明的式(I)化合物在其基团L1上没有N原子取代这点、以及包含X及Y的环的2个连结键位于对位的这点上，与式(E)的化合物的构造不同。
[化学式5]
(式中，X、Y和Z中的2个为N、第3个为CH或N。其它符号参照该公报)。
下述式(F)被报导对各种激酶显示出抑制作用，对发炎或自体免疫疾病有用(专利文献6)。另一方面，后述本发明的式(I)化合物在其基团L1并非酰胺基这点、以及包含X及Y的环的2个连结键位于对位这点上，与式(F)的化合物的构造不同。
[化学式6]
(式中，A1、A2、A3及A4分别为CR4、CR5、CR6及CR7或N；L为-C(O)NR7-、-NR7C(O)-等。其它符号参照该公报)。
下述式(G)及式(H)的化合物被报导显示出FGFR抑制作用，可使用于各种癌的治疗(专利文献7及专利文献8)。
[化学式7]
(式(G)中，B环根据情况而表示可含有由O、S和N中选择的至少1个杂原子的5或6元芳香族基团。其它符号参照该公报)。
下述式(J)化合物被报导显示出葡萄糖激酶活性化作用，可用于糖尿病相关的疾病的治疗(专利文献9)，其构造上的特征在于吡啶的2号位置上有氨基取代。
[化学式8]
(式中符号参照该公报)。
另外，具有下述构造的化合物分别作为CAS注册编号1371065-79-0、1317903-92-6在数据库上已知。
[化学式9]
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第WO2006/101977号小册子
专利文献2：国际公开第WO2007/056075号小册子
专利文献3：国际公开第WO2008/008234号小册子
专利文献4：国际公开第WO2003/066601号小册子
专利文献5：国际公开第WO2007/071752号小册子
专利文献6：国际公开第WO2007/022380号小册子
专利文献7：国际公开第WO2008/075068号小册子
专利文献8：国际公开第WO2009/153592号小册子
专利文献9：国际公开第WO2009/046784号小册子
发明内容
发明所要解决的问题
本发明提供可用作医药组合物、特别是突变FGFR3阳性的膀胱癌治疗用医药组合物的有效成分的化合物。
用于解决问题的手段
本发明的发明者等人针对具有FGFR抑制作用的化合物进行了深入研究，结果发现本发明的含氮芳香族杂环化合物具有FGFR1、2及3抑制作用，特别是良好的突变FGFR3抑制作用，从而完成了本发明。
即，本发明涉及式(I)的化合物或其盐、以及含有式(I)的化合物或其盐和制药学上容许的赋形剂的医药组合物。
[化学式10]
(式中，X和Y相同或不同，为CH或N，但X和Y不同时为N，
L1为-低级亚烷基-、-低级亚烷基-O-、-O-低级亚烷基-或-低级亚炔基-；
Z为N或CH；
R1相同或不同，为可被卤素取代的低级烷基、-O-(可被卤素取代的低级烷基)、卤素、氰基或-N(低级烷基)2；
P为2至4的整数；
环W为可被取代的芳香族碳环、可被取代的芳香族杂环、或可被取代的非芳香族杂环；
Q为-L2-R2或R3；
L2为可被取代的芳香族杂环或可被取代的非芳香族杂环，
R2为可被低级烷基取代的非芳香族杂环基、可被取代的环烷基、可被选自-OH及-O-低级烷基构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基、-C(O)-R0、-C(O)-可被取代的环烷基、-NH-R0、-N(低级烷基)-R0、-L3-可被取代的非芳香族杂环基或H；
R0为可被-OH取代的低级烷基；
R3为
(1)可被选自由以下基团构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基：-C(O)OH、-OH、-O-R0、可被1个或2个R0取代的氨基、可被1个或2个R0取代的氨基甲酰基、可被取代的芳香族杂环基、可被取代的非芳香族杂环基以及-C(O)-可被取代的非芳香族杂环基，
(2)-O-(可被选自由以下基团构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基：-C(O)OH、-OH、-O-R0、可被1个或2个R0取代的氨基甲酰基、可被取代的非芳香族杂环基以及-C(O)-可被取代的非芳香族杂环基)，
(3)-NH-(可被选自由以下基团构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基：-OH、可被低级烷基取代的非芳香族杂环基、以及可被1个或2个R0取代的氨基甲酰基)，
(4)-N(低级烷基)-(可被选自由以下基团构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基：-OH、可被低级烷基取代的非芳香族杂环基、以及可被1个或2个R0取代的氨基甲酰基)，
(5)-C(O)OH，
(6)-C(O)-可被取代的非芳香族杂环基，
(7)-O-(可被低级烷基取代的非芳香族杂环基)，或
(8)可被1个或2个R0取代的氨基甲酰基；以及
L3为键、-NH-、-N(低级烷基)-或低级亚烷基。)
需要说明的是，若无特别说明，则本说明书中的某化学式中的记号在其它化学式中也被使用时，相同记号表示相同意思。
另外，本发明涉及含有式(I)化合物或其盐与制药学上容许的赋形剂的与FGFR1、2和/或3相关的各种癌(例如与FGFR1相关的肺癌或激素疗法抗性的乳癌、与FGFR2相关的胃癌、三重阴性乳癌或子宫内膜癌、及与FGFR3相关的膀胱癌及成胶质细胞瘤)的治疗用医药组合物。需要说明的是，该医药组合物包含与FGFR1、2和/或3相关的各种癌的治疗剂。作为某一方式，为含有式(I)的化合物或其盐以及制药学上容许的赋形剂的与FGFR3相关的膀胱癌的治疗用医药组合物。作为另一方式，为含有式(I)的化合物或其盐与制药学上容许的赋形剂的突变FGFR3阳性膀胱癌的治疗用医药组合物。需要说明的是，本说明书中，“突变”包含点突变、融合突变、缺失突变、插入突变，作为某一方式，为包含点突变及融合突变的概念，作为另一方式，为点突变，作为又一方式，为融合变异。
另外，本发明也涉及用于制造与FGFR1、2和/或3相关的各种癌的治疗用医药组合物的式(I)化合物或其盐的应用；用于治疗与FGFR1、2和/或3相关的各种癌的式(I)化合物或其盐的应用；以及用于治疗与FGFR1、2和/或3相关的各种癌的式(I)化合物或其盐；以及包括将式(I)的化合物或其盐的有效量施用至对象的与FGFR1、2和/或3相关的各种癌的治疗方法。进而，本发明还涉及用于制造突变FGFR3阳性膀胱癌的治疗用医药组合物的式(I)化合物或其盐的应用；用于治疗突变FGFR3阳性膀胱癌的式(I)化合物或其盐的应用；用于治疗突变FGFR3阳性膀胱癌的式(I)化合物或其盐；以及包括将式(I)化合物或其盐的有效量施用至对象的突变FGFR3阳性膀胱癌的治疗方法。需要说明的是，上述“对象”是指需要该治疗的人类或其它动物，作为某一方式，为需要该治疗的人类。
发明效果
式(I)的化合物或其盐具有FGFR1、2和/或3抑制作用，特别是突变FGFR3抑制作用，可作为与FGFR1、2和/或3相关的各种癌(例如肺癌或激素疗法抗性的乳癌、胃癌、三重阴性乳癌、子宫内膜癌、膀胱癌及成胶质细胞瘤等)的治疗剂，特别是作为突变FGFR3阳性膀胱癌的治疗剂来使用。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
本说明书中，“低级烷基”是指直链或分枝状的碳数为1至8(以下简称为C1-8)的烷基，例如甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基、异丁基、sec-丁基、tert-丁基、n-戊基、n-己基、n-庚基、n-辛基等。作为另一方式，为C1-4烷基，作为又一方式，为甲基，作为又再另一方式，为乙基。
“低级亚烷基”为直链或分枝状的C1-8的亚烷基，例如亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、七亚甲基、八亚甲基、亚丙基、甲基亚甲基、乙基亚乙基、1,2-二甲基亚乙基、1,1,2,2-四甲基亚乙基等。作为另一方式，为C1-4亚烷基，作为又一方式，为亚甲基，作为又再另一方式，为亚乙基。
“低级亚炔基”为直链或分枝状的C2-6的亚炔基，例如亚乙炔基、亚丙炔基、亚丁炔基、亚戊炔基、亚己炔基、1,3-亚丁二炔基、1,3-亚戊二炔基等。作为另一方式，为C2-4亚炔基，作为又一方式，为亚乙炔基。
“环烷基”为C3-10的饱和烃环基，也可以有交联。例如为环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、金刚烷基等。作为另一方式，为C3-8环烷基，作为又一方式，为C3-6环烷基，作为又再另一方式，为环丙基。
“芳香族碳环”为C6-14的单环～三环式芳香族烃环。例如为苯、萘、蒽，作为另一方式，为苯。
“芳香族杂环”为具有1至4个选自氮、氧及硫构成的组中的杂原子的环元数5至10的芳香族杂环，例如吡啶、吡咯、吡嗪、嘧 啶、哒嗪、咪唑、吡唑、噻唑、噁唑、异噁唑、噻吩、异噻唑、呋喃、噁二唑、噻二唑、吲哚、异吲哚、吲唑、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并咪唑、苯并噁唑、苯并噻唑、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹噁啉、噻吩并吡啶、噻吩并嘧啶、噻吩并吡嗪等。作为另一方式，为吡啶、吡咯、吡嗪、嘧啶、哒嗪、咪唑、吡唑、噻唑、噁唑、噻吩、呋喃、噁二唑、吲唑。作为又一方式，为吡啶、嘧啶、咪唑、吡唑、噻唑、吲唑，作为又一方式，为吡啶、咪唑、吡唑，作为又一方式，为吡啶，作为又一方式，为吡唑，作为又再另一方式，为咪唑。
“芳香族杂环基”是指上述“芳香族杂环”的1价基，例如吡啶基、吡咯基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、噁唑基、噻吩基、呋喃基、1,2,4-噁二唑基等，作为另一方式，为具有1至2个氮原子的环元数5至6的芳香族杂环基，作为又一方式，为吡啶基。
“非芳香族杂环”是指具有1至4个选自氮、氧及硫构成的组中的相同或不同的杂原子的环元数3至10、作为其一方式为环元数4至8的非芳香族杂环，该非芳香族杂环可与苯环或噻吩环缩合、可由低级亚烷基交联、可与另一个非芳香族杂环形成螺环、也可在环的一部分上有不饱和键，另外，作为环构成原子的硫原子或氮原子也可被氧化。例如氮丙啶、氧杂环丁烷、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、氮杂环庚烷、二氮杂环庚烷、氮杂环辛烷、哌嗪、4-氧化哌嗪、高哌嗪(homopiperazine)、吗啉、高吗啉(oxazepane)、硫代吗啉、1,1-二氧化硫代吗啉、1,1-二氧化四氢硫代吡喃、1,1-二氧化四氢噻唑、硫杂氮杂环庚烷(thiazepane)、1-氮杂双环[2.2.2]辛烷、7-氧杂双环[2.2.1]庚烷、2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷、3-氮杂双环[3.2.1]辛烷、8-氮杂双环[3.2.1]辛烷、9-氮杂双环[3.3.1]壬烷、3,9-二氮杂双环[3.3.1]壬烷、3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷、2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷、2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷、2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬烷、四氢吡喃、四氢呋喃、二噁烷、二氧杂环戊烷、四氢噻吩、四氢硫代吡喃、四氢噻吩并吡啶、四氢苯并氮杂卓、四氢苯并二氮杂卓、二氢苯并呋喃、二氢苯并噻吩、二氢苯并吡喃、二氢苯并二噁烷、苯并二噁烷、二氢吡喃、二氢吡咯、二氢 吡啶、四氢吡啶、四氢吡嗪等。作为另一方式，为具有1至2个选自氮、氧及硫构成的组中的相同或不同的杂原子的环元数5至7的非芳香族杂环，作为又一方式，具有至少1个氮原子，且进一步可具有1个选自氮、氧及硫构成的组中的杂原子的含氮5至7元非芳香族杂环，作为又一方式，为6元含氮非芳香族杂环，例如哌嗪、哌啶、吗啉、硫代吗啉、1,1-二氧化硫代吗啉等。作为又一方式，为氧杂环丁烷、哌啶、哌嗪、吗啉、硫代吗啉、4-氧化哌嗪、1,1-二氧化硫代吗啉、四氢吡喃、四氢呋喃、四氢噻吩、四氢吡啶、1-氮杂双环[2.2.2]辛烷、8-氮杂双环[3.2.1]辛烷、3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷、2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷、2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷、2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬烷，作为又一方式，为吗啉、哌啶、哌嗪、4-氧化哌嗪、3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷、2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷，作为又一方式，为哌啶，作为又再另一方式，为哌嗪。
“非芳香族杂环基”为非芳香族杂环的1价基，且为具有1至4个选自氮、氧及硫所构成的组中的相同或不同的杂原子的环元数3至10的非芳香族杂环基，可由低级亚烷基交联、在环的一部分可具有不饱和键、也可与另一个非芳香族杂环形成螺环。另外，作为环构成原子的硫原子或氮原子也可被氧化。例如，氮丙啶基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、氮杂环庚烷基、二氮杂环庚烷基、氮杂环辛烷基、哌嗪基、高哌嗪基、吗啉基、高吗啉基(oxazepanyl)、硫代吗啉基、1,1-二氧化硫代吗啉基、硫杂氮杂环庚烷基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、二噁烷基、二氧杂环戊烷基、四氢噻吩基、四氢硫代吡喃基、7-氧杂双环[2.2.1]庚基、2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚基、3-氮杂双环[3.2.1]辛基、8-氮杂双环[3.2.1]辛基、9-氮杂双环[3.3.1]壬基、3,9-二氮杂双环[3.3.1]壬基、二氢吡喃基、二氢吡咯基、二氢吡啶基、四氢吡啶基、四氢吡唑基、9-二氮杂螺[5.5]十一碳-3-基、1,9-二氮杂螺[5.5]十一碳-9-基、2,8-二氮杂螺[4.5]癸-8-基、1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基等。作为另一方式，为具有1至2个选自氮、氧及硫构成的组中的相同或不同的杂原子的环元数5至7的非芳香族杂环基，作为又一方式，为至少具有1个氮原子的环元数5 至7的非芳香族杂环基，作为又一方式，为6元含氮非芳香族杂环基，例如哌嗪基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、1,1-二氧化硫代吗啉基等。作为又一方式，为氧杂环丁烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、4-氧化哌嗪基、1,1-二氧化硫代吗啉基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡啶基、1-氮杂双环[2.2.2]辛基、8-氮杂双环[3.2.1]辛基、3,9-二氮杂螺[5.5]十一碳-3-基、2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-基、2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基，作为又一方式，为哌啶基、哌嗪基，作为又一方式，为哌啶基，作为又再另一方式，为哌嗪基。
“卤素”为-F、-Cl、-Br及-I。作为另一方式，为-F，作为又一方式，为-C1。
式(I)中的L1为-低级亚烷基-O-时的式(I)的化合物或其盐是指式(II)的化合物或其盐。
[化学式11]
(式中，L4表示低级亚烷基。以下相同。)
另外，(R1)p中，2个至4个R1可分别相同也可分别不同。
本说明书中，“可被取代的”是指没有取代、或具有1～5个取代基。需要说明的是，有多个取代基时，这些取代基可以相同、也可以不同。另外，例如，“可被1个或2个R0取代的氨基甲酰基”中的氮上的2个R0可分别为相同的低级烷基、也可为各自不同的低级烷基。另外，R0可以各自被-OH取代、可以一方被取代、也可以两者均无取代。
本说明书中，作为式(I)的W中的“可被取代的芳香族碳环”、“可被取代的芳香族杂环”及“可被取代的非芳香族杂环”中的取代基，例如为下述D1组中所示的基团。
D1组为由以下基团构成的组：
(1)可被选自-OH基和低级烷基中的1个以上的取代基取代的芳香族杂环基，
(2)可被选自-OH基和低级烷基中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基，
(3)卤素，
(4)-O-低级烷基、-S-低级烷基、-OH和-SH，
(5)-CN和-NO2，
(6)-CO2H和-CO2-低级烷基，以及
(7)可被选自上述(1)～(6)记载的基团构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基或-O-低级烷基。
作为D1组的另一方式，可列举
(1)可被-OH基取代的芳香族杂环基，
(2)卤素，
(3)-OH，
(4)-CN，
(5)-CO2H，以及
(6)可被选自上述(1)～(5)记载的取代基构成的组中的1个以上的取代基取代的低级烷基或-O-低级烷基。
另外，作为D1组的另一方式，可列举
(1)可被卤素取代的低级烷基，
(2)可被芳香族杂环基取代的-O-低级烷基，其中该芳香族杂环基可被-OH基取代，
(3)卤素，以及
(4)-CN。
另外，作为D1组的另一方式，可列举可被卤素取代的低级烷基、-O-(可被选自由以下基团构成的组中的1个以上取代基取代的低级烷基：可被氧代取代的非芳香族杂环基、可被-OH取代的芳香族杂环基、以及卤素)、卤素、氰基、氧代。
作为式(I)的L2中的“可被取代的芳香族杂环”、“可被取代的非芳香族杂环”、R2中的“可被取代的环烷基”、“可被取代的非 芳香族杂环基”、以及、R3中的“可被取代的芳香族杂环基”、“可被取代的非芳香族杂环基”中可容许的取代基，可列举例如选自D2组中的取代基。
D2组为由以下基团构成的组：
(1)卤素，
(2)-OH及-SH，
(3)-CN，以及
(4)可被选自上述(1)～(3)记载的取代基构成的组中的1个以上的取代基取代的低级烷基。
作为D2组的另一方式，可列举
(1)可被-OH取代的低级烷基，以及
(2)-OH。
式(I)的化合物或其盐的其一方式如下所示。
(1)X为N、Y为CH的化合物或其盐。作为另一方式，X为CH、Y为N的化合物或其盐。作为又一方式，X为CH、Y为CH的化合物或其盐。
(2)L1为低级亚烷基或-低级亚烷基-O-的化合物或其盐。L1为-低级亚烷基-的化合物或其盐。作为又一方式，L1为-低级亚烷基-O-的化合物或其盐。作为又一方式，L1为亚乙基或-亚甲基-O-的化合物或其盐。作为又一方式，L1为亚乙基的化合物或其盐。作为又一方式，L1为-亚甲基-O-的化合物或其盐。作为又再另一方式，L1为亚乙炔基的化合物或其盐。
(3)Z为CH的化合物或其盐。作为另一方式，Z为N的化合物或其盐。
(4-1)p为2或4的化合物或其盐。作为另一方式，p为2的化合物或其盐。作为又一方式，p为4的化合物或其盐。
(4-2)R1相同或彼此不同，为-O-低级烷基或卤素的化合物或其盐。作为另一方式，R1相同或彼此不同，为-O-低级烷基的化合物或其盐。作为又一方式，R1相同或彼此不同，为卤素的化合物或其盐。作为又一方式，R1相同或彼此不同，为-O-甲基或F的化合物或其盐。作为又一方式，R1相同或彼此不同，为-O-甲基或C1的化合物或其盐。作为又再另一方式，R1全部为F的化合物或其盐。
(5)式(I)中的被p个R1取代的具有Z作为环构成原子的6元芳香环为2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基或2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基的化合物或其盐。作为另一方式，式(I)中的被P个R1取代的具有Z作为环构成原子的6元芳香环为2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基的化合物或其盐。作为另一方式，式(I)中的被P个R1取代的具有Z作为环构成原子的6元芳香环为2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基的化合物或其盐。
(6)环W为可被选自D1组中的1个以上的取代基取代的芳香族碳环或可被选自D1组中的1个以上的取代基取代的芳香族杂环的化合物或其盐。作为另一方式，环W为被选自D1组中的1个以上的取代基取代的苯环或者为分别可被选自D1组中的1个以上的取代基取代的吡唑、吡啶、嘧啶、噻唑、吲唑或咪唑的化合物或其盐。作为又一方式，环W为可被选自D1组中的1个以上的取代基取代的苯环或可被选自D1组中的1个以上的取代基取代的吡唑的化合物或其盐。作为又一方式，环W为可被选自D1组中的1个以上的取代基取代的苯环的化合物或其盐。作为又一方式，环W为可被选自低级烷基、-O-低级烷基以及卤素构成的组中的1个以上取代基取代的苯环的化合物或其盐。作为又一方式，环W为可被选自甲基、-O-甲基以及卤素构成的组中的1个取代基取代的苯环的化合物或其盐。作为又一方式，环W为可被-O-甲基取代的苯环的化合物或其盐。作为又一方式，环W为可被选自D1组中的1个以上的取代基取代的吡唑的化合物或其盐。作为又一方式，环W为可被低级烷基取代的吡唑的化合物或其盐。作为又一方式，环W为可被甲基取代的吡唑的化合物或其盐。作为又一方式，环W为甲基取代的吡唑的化合物或其盐。作为又一方式，环W为吡唑的化合物或其盐。
(7)Q为-L2-R2的化合物或其盐。作为另一方式，Q为R3的化合物或其盐。
(8)L2为可被选自D2组中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环的化合物或其盐。作为另一方式，L2为可被选自D2组中的1个 以上的取代基取代的含氮非芳香族杂环的化合物或其盐。作为又一方式，L2为可被选自D2组中的1个以上的取代基分别取代的哌嗪、4-氧化哌嗪、哌啶、吗啉、氮杂环丁烷、3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷、2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷、2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷、2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬烷、8-氮杂双环[3.2.1]辛烷或1-氮杂双环[2.2.2]辛烷的化合物或其盐。作为又一方式，L2为可被1个以上的甲基取代的哌嗪、可被1个以上的甲基取代的哌啶或3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷的化合物或其盐。作为又再另一方式，L2为哌啶或4-甲基哌嗪的化合物或其盐。
(9)R2为可被选自-OH以及-O-低级烷基构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基、-NH-(可被-OH取代的低级烷基)、可被选自D2组中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基、-低级亚烷基-(可被选自D2组中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基)或H的化合物或其盐。作为另一方式，R2为可被选自-OH以及-O-低级烷基构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基、-NH-(可被-OH取代的低级烷基)、可被低级烷基(该低级烷基可被-OH取代)取代的非芳香族杂环基或H的化合物或其盐。作为又一方式，R2为可被甲基取代的哌嗪、可被甲基取代的哌啶、2-羟乙基氨基或H的化合物或其盐。作为又一方式，R2为4-甲基哌嗪、2-羟乙基氨基或H的化合物或其盐。作为又一方式，R2为4-甲基哌嗪的化合物或其盐。作为又一方式，R2为2-羟乙基氨基的化合物或其盐。作为又一方式，R2为H的化合物或其盐。
(10)R3为可被选自以下基团构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基：-C(O)OH、可被1个或2个R0取代的氨基甲酰基、-OH、可被选自D2组中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基以及-C(O)-(可被选自D2组中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基)；或-O-(可被选自以下基团构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基：-C(O)OH、可被1个或2个R0取代的氨基甲酰基、-OH、可被选自D2组中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基以及-C(O)-(可被选自D2组中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基))的化合物或其盐。作为另一方式，R3为被选自：-C(O)OH、可被 1个或2个R0取代的氨基甲酰基、-OH、可被选自D2组中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基以及-C(O)-(可被选自D2组中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基)构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基的化合物或其盐。作为又一方式，R3为被选自：-OH、可以被选自-OH以及低级烷基中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基以及-C(O)-(可被选自-OH以及低级烷基构成的组中的1个以上的取代基取代的非芳香族杂环基)构成的组中的1个以上的取代基取代的低级烷基的化合物或其盐。作为又一方式，R3为被选自：-OH、可被低级烷基取代的非芳香族杂环基以及-C(O)-(可被-OH取代的非芳香族杂环基)构成的组中的1个以上的取代基取代的低级烷基的化合物或其盐。作为又一方式，R3为被选自：-OH、可被甲基取代的哌嗪基以及-C(O)-(可被-OH取代的氮杂环丁烷基)构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基的化合物或其盐。进一步作为另一方式，R3为2-羟基乙基、2,3-二羟基丙基或4-甲基哌嗪-1-基甲基的化合物或其盐。作为又一方式，R3为4-甲基哌嗪-1-基甲基的化合物或其盐。作为又一方式，R3为可被1个以上的-OH取代的低级烷基的化合物或其盐。作为又再另一方式，R3为2-羟基乙基或2,3-二羟基丙基的化合物或其盐。
(11)上述(1)至(10)记载的方式中不矛盾的任意二种以上的组合的化合物或其盐。
本发明中，包含如上述(11)记载的、上述(1)至(10)记载的方式中任意二种以上的组合的化合物或其盐，其具体例子也可以列举以下方式。
(12)X为N、Y为CH、且L1为低级亚烷基或-低级亚烷基-O-的化合物或其盐。
(13)如(12)记载的化合物或其盐，其中Z为CH、R1相同或彼此不同，为-O-低级烷基或卤素，p为2或4，且环W为可被取代的芳香族碳环或可被取代的芳香族杂环。
(14)如(13)记载的化合物或其盐，其中L1为亚乙基或-亚甲基-O-、p为4、且环W为可被取代的苯环或可被取代的吡唑。
(15)如(12)～(14)中任意一项记载的化合物或其盐，其中Q为-L2-R2，L2为可被取代的非芳香族杂环，R2为可被选自-OH以及-O-低级烷基构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基、-NH-(可被-OH取代的低级烷基)、可被取代的非芳香族杂环基、-低级亚烷基-(可被取代的非芳香族杂环基)或H。
(16)如(15)记载的化合物或其盐，其中p为4，L2为可被1个以上的甲基取代的哌嗪、可被1个以上的甲基取代的哌啶或3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷，R2为可被甲基取代的哌嗪、可被甲基取代的哌啶、2-羟基乙基氨基或H。
(17)如(16)记载的化合物或其盐，其中R1相同或彼此不同，为-O-甲基或F；L1为-亚甲基-O-；环W为可被-O-甲基取代的苯环；L2为哌啶或4-甲基哌嗪；R2为4-甲基哌嗪、2-羟基乙基氨基或H。
(18)如(12)～(14)中任意一项记载的化合物或其盐，其中环W为可被取代的吡唑；Q为R3；R3为被选自：-C(O)OH、可被1个或2个R0取代的氨基甲酰基、-OH、可被取代的非芳香族杂环基以及-C(O)-(可被取代的非芳香族杂环基)构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基。
(19)如(18)记载的化合物或其盐，其中p为4；R3为被选自：-OH、可被低级烷基取代的非芳香族杂环基以及-C(O)-(可被-OH取代的非芳香族杂环基)构成的组中的1个以上的取代基取代的低级烷基。
(20)如(19)记载的化合物或其盐，其中R1相同或彼此不同，为-O-甲基或F；L1为-亚甲基-O-；环W为可被甲基取代的吡唑；R3为2-羟基乙基、2,3-二羟基丙基或4-甲基哌嗪-1-基甲基。
另外，作为式(I)的化合物或其盐的另一方式，可列举以下化合物或其盐：其中
X和Y相同或彼此不同，为CH或N，但X和Y不同时为N，
L1为-低级亚烷基-、-低级亚烷基-O-、-O-低级亚烷基-或低级亚炔基，
Z为N或CH，
R1相同或彼此不同，为可被卤素取代的低级烷基、-O-(可被卤 素取代的低级烷基)、卤素、氰基或-N(低级烷基)2，
P为2至4的整数，
环W为可被取代的芳香族碳环、可被取代的芳香族杂环、或可被取代的非芳香族杂环，
Q为-L2-R2或R3，
L2为可被取代的芳香族杂环或可被取代的非芳香族杂环，
R2为可被选自-OH以及-O-低级烷基构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基、-C(O)-可被取代的环烷基、-NH-(可被-OH取代的低级烷基)、-L3-可被取代的非芳香族杂环基或H，
R3为可被选自：-C(O)OH、-OH、-NH-低级烷基、-N(低级烷基)2、-C(O)-NH-低级烷基、-C(O)-N(低级烷基)2、可被取代的芳香族杂环基、可被取代的非芳香族杂环基以及-C(O)-可被取代的非芳香族杂环基构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基；-O-(可被选自-OH、-C(O)-NH-低级烷基以及-C(O)-N(低级烷基)2构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基)；-NH-(可被选自-OH、-C(O)-NH-低级烷基以及-C(O)-N(低级烷基)2构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基)；-N(低级烷基)-(可被选自-OH、-C(O)-NH-低级烷基以及-C(O)-N(低级烷基)2构成的组中的1个以上的基团取代的低级烷基)；-C(O)OH或-C(O)-可被取代的非芳香族杂环基，以及
L3为键或低级亚烷基。
作为包含于式(I)的化合物或其盐的具体化合物例子，可列举以下的化合物。
5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-[3-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺、
(2S)-3-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]丙烷-1,2-二醇、
5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-{3-氟-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[3-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[1-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{4-[(3R,5S)-3,5-二甲基哌嗪-1-基]-3-甲氧基苯基}嘧啶-2-胺、
N-[4-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一碳-3-基)-3-甲氧基苯基]-5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-胺、
2-[4-({5-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙醇、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{1-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-2-胺、
2-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]-1-(3-羟基氮杂环丁烷-1-基)乙酮、
(2R)-3-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]丙烷-1,2-二醇、
2-({1-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)苯基]哌啶-4-基}氨基)乙醇、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{1-甲基-5-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-1H-吡唑-3-基}嘧啶-2-胺、以及、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺、以及它们的盐。
作为包含于式(I)的化合物或其盐的具体化合物的例子的另一方式，可列举以下化合物。
5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-[3-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺、
(2S)-3-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]丙烷-1,2-二醇、
5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-{3-氟-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[3-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[1-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{4-[(3R,5S)-3,5-二甲基哌嗪-1-基]-3-甲氧基苯基}嘧啶-2-胺、
N-[4-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一碳-3-基)-3-甲氧基苯基]-5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-胺、
2-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙醇、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{1-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-2-胺、
2-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]-1-(3-羟基氮杂环丁烷-1-基)乙酮、以及、
(2R)-3-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]丙烷-1,2-二醇、以及它们的盐。
作为包含于式(I)的化合物或其盐的具体的化合物例子的又一方式，可列举以下化合物。
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
2-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙醇、
(2R)-3-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]丙烷-1,2-二醇、
2-({1-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)苯基]哌啶-4-基}氨基)乙醇、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{1-甲基-5-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-1H-吡唑-3-基}嘧啶-2-胺、以及
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺、以及它们的盐。
作为包含于式(I)化合物或其盐的具体的化合物例子的又一方式，可列举以下化合物。
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
2-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙醇、以及、
(2R)-3-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]丙烷-1,2-二醇、以及它们的盐。
作为包含于式(I)化合物或其盐的具体的化合物例子的又一方式，可列举以下化合物。
2-({1-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)苯基]哌啶-4-基}氨基)乙醇、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{1-甲基-5-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-1H-吡唑-3-基}嘧啶-2-胺、以及、
5-[(2,6-二氟3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺、以及它们的盐。
式(I)的化合物中，根据取代基的种类不同，可存在互变异构体或几何异构体。本说明书中，有时仅记载式(I)化合物的异构体的一种形态，但本发明也包含其以外的异构体，也包含异构体分离后的物质、或它们的混合物。
另外，式(I)的化合物中有时具有不对称碳原子或轴不对称性，也可存在基于它们的光学异构体。本发明还包含式(I)化合物的光学异构体分离后的物质、或它们的混合物。
进而，本发明还包含以式(I)所示化合物在制药学上容许的前体药。制药学上容许的前体药是指具有可通过加溶剂分解而在生理学条件下转换为氨基、羟基、羧基等基团的化合物。作为形成前体药的基团，可列举例如Prog.Med.,5,2157-2161(1985)、或“医药品的开发”(广川书店、1990年)第7卷分子设计163-198中记载的基团。
另外，式(I)的化合物的盐是指式(I)化合物在制药学上容许的盐，根据取代基种类不同，有时形成酸加成盐或与碱的盐。具体而言，可列举与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等的无机酸，或与甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、苦杏仁酸、酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、二甲苯酰基酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、p-甲苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸等有机酸的酸加成盐；与钠、钾、镁、钙、铝等的无机碱，与甲胺、乙胺、乙醇胺、赖氨酸、鸟氨酸等的有机碱的盐；与乙酰基亮氨酸等各种氨基酸及氨基酸衍生物的盐或铵盐等。
进而，本发明还包含式(I)化合物及其盐的各种水合物或溶剂合物、以及结晶态物质。另外，本发明还包含由各种放射性或非放射性同位体标记的化合物。
(制造方法)
式(I)的化合物及其盐可利用基于其基本构造或取代基的种类的 特征，并采用各种公知的合成法来制造。此时，根据其官能团种类不同，在由原料至中间体的阶段将该官能团预先替换为适当的保护基(可容易转化为该官能团的基团)，有时在制造技术上会有效果。作为这样的保护基，可列举例如ウッツ(P.G.M.Wuts)和グリーン(T.W.Greene)著、“Greene's Protective Groups in Organic Synthesis(第4版、2006年)”所记载的保护基等，只要根据这些反应条件适当选择来使用即可。在这样的方法中，导入该保护基进行反应后，可通过根据需要去除保护基，得到所期望的化合物。
另外，式(I)的化合物的前体药与上述保护基同样，可通过在由原料至中间体的阶段导入特定的基团，或使用所得的式(I)化合物进一步进行反应而制造。反应可通过应用通常的酯化、酰胺化、脱水等本领域人员公知的方法来进行。
以下，说明式(I)的化合物的代表制造法。各制法也可参照该说明所附的参考文献来进行。需要说明的是，本发明的制造方法不受以下所示例子限定。
(第一制法)
[化学式12]
(式中，L5表示卤素、甲基亚磺酰基或甲基磺酰基。以下相同。)
本发明化合物(I)可通过化合物(1a)与化合物(2a)的耦合反应而得到。
本反应中，使用当量或一方过剩量的化合物(1a)和化合物(2a)，将这些的混合物在对反应惰性的溶剂中、或无溶剂下，在指定催化剂的存在下，于由室温至加热回流下，通常搅拌0.1小时～5天。本反 应优选为在惰性气体气氛下进行。作为此处所用的溶剂的例子，无特殊限定，可列举苯、甲苯、二甲苯等的芳香烃类；二乙醚、四氢呋喃、二噁烷、二甲氧基乙烷等的醚类；二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯仿等卤化烃类；N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜、乙酸乙酯、乙腈、tert-丁醇及它们的混合物。作为规定的催化剂可列举乙酸钯、三(二亚苄基丙酮)二钯等。另外，使用钯催化剂时，作为其配体，也可使用三苯基膦、1,1’-联萘-2,2’-二基双(二苯基膦)、2-(二环己基膦基)-2’,4’,6'-三异丙基-1,1’-联苯、4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基氧杂蒽。另外，在三乙胺、N,N-二异丙基乙胺或N-甲基吗啉等有机碱；或在tert-丁氧基钠、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、或氢氧化钾等的无机碱存在下进行反应，在使反应顺利进行的观点上有时有利。通过微波照射加热反应混合物，在使反应顺利进行的观点上有时是有利的。
[文献]
S.R.Sandler和W.Karo著，“Organic Functional Group Preparations”，第2版，第1卷，Academic Press Inc.，1991年
日本化学会编，“第5版实验化学讲座(第14卷)”，丸善，2005年
(第二制法)
[化学式13]
(式中，L6表示低级亚炔基。以下相同。)
(第一工序)
本工序为通过化合物(1b)与末端炔衍生物的薗头耦合反应而得到本发明化合物(1-1)的工序。
本工序中，使用当量或一方过剩量的化合物(1b)与末端炔衍生物，将它们的混合物在对反应为惰性的溶剂中，在碱、钯催化剂以及碘化铜存在下，在由室温至加热回流下，通常搅拌0.1小时～5天。本反应优选为在惰性气体气氛下进行。作为此处所用的溶剂的例子，并无特殊限定，可列举苯、甲苯、二甲苯等的芳香烃类；二乙醚、四氢呋喃、二噁烷、二甲氧基乙烷等的醚类；二氯甲烷、1,2-二氯乙烷或氯仿等卤化烃类；甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇等的醇类；N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、及它们的混合溶剂。碱优选为三乙胺、N,N-二异丙基乙胺或N-甲基吗啉等有机碱；或碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、或氢氧化钾等无机碱。钯催化剂优选为四(三苯基膦)钯、二氯双(三苯基膦)钯、氯化钯-1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁等。另外，通过微波照射加热反应混合物，在使反应顺利进行的观点上有时是有利的。
[文献]
A.d.Meijere和F.Diederich编，“Metal-Catalyzed Cross-CouplingReactions”，第1版，VCH Publishers Inc.，1997年
日本化学会编“实验化学讲座(第5版)”13卷(2005年)(丸善)
(第二工序)
本工序为将本发明化合物(I-1)的炔部分通过氢化或二酰亚胺还原而还原为亚烷基，从而得到本发明化合物(1-2)的工序。
本工序中，使用当量或一方过剩量的本发明化合物(I-1)与钯碳，将它们的混合物在对反应为惰性的溶剂中，在氢气氛下、在由室温至加热回流下，通常搅拌0.1小时～5天。作为此处所用的溶剂的例子，并无特殊限定，可列举二乙醚、四氢呋喃、二噁烷、二甲氧基乙烷等的醚类；甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇等的醇类；及它们的混合溶剂。
在氢化反应以外，使用当量或一方过剩量的本发明化合物(I-1)与规定的二酰亚胺，将它们的混合物在对反应为惰性的溶剂中，在由室温至加热回流下，通常搅拌0.1小时～5天。作为此处所用的溶剂 的例子，与上述相同。另外，作为规定的二酰亚胺可列举例如4-甲基苯磺酰基酰肼。
式(I)的化合物中的环W上的取代基可通过以式(I)化合物作为原料，使用后述实施例记载的反应、本领域人员所周知的反应、或这些变型方法，容易地转换为其它官能团。可任意组合例如还原、卤化、去保护、水解、酰胺化、氨基化、氧化、还原性氨基化、酰化、O-烷基化、N-烷基化、还原性烷基化、环氧化等本领域人员通常可采用的工序来进行。
(原料化合物的制造)
上述制造法中的原料化合物可使用例如下述的方法、后述制造例所记载的方法、公知方法、或这些的变型方法来制造。
(原料合成1)
[化学式14]
(式中，R4表示-OH或-低级亚烷基-OH；L7表示卤素、-OH、-低级亚烷基-OH、-低级亚烷基-OMs、-低级亚烷基-OTs、-低级亚烷基-OTf、或-低级亚烷基-卤素；L8表示-低级亚烷基-O-或-O-低级亚烷基-。以下相同。)
本制法是制造第一制法的原料化合物(1a)中的L1为-O-低级亚烷基或-低级亚烷基-O-的化合物(3c)的方法。
L7为卤素、-低级亚烷基-OMs、-低级亚烷基-OTs、-低级亚烷基-OTf、或-低级亚烷基-卤素的化合物(3a)的情况下，使用当量或一方过剩量的该化合物(3a)与化合物(3b)，将它们的混合物在对反应为惰性的溶剂中，在碱的存在下、在由室温至加热回流下，通常搅拌0.1小时～5天。作为此处所用的溶剂的例子，并无特殊限定，可列举N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜等。另外，碱优选为碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、或氢氧化钾等无机碱。
L7为-OH或-低级亚烷基-OH的化合物(3a)的情况下，使用当量 或一方过剩量的该化合物(3a)与化合物(3b)，将它们的混合物在对反应为惰性的溶剂中，在规定的膦试剂和缩合剂存在下，在由室温至加热回流下，通常搅拌0.1小时～5天。作为此处所用的溶剂的例子，并无特殊限定，可列举二乙基醚、四氢呋喃、二噁烷、二甲氧基乙烷等的醚类。作为规定的膦试剂，可列举三丁基膦、三苯基膦等。作为规定的缩合剂，可列举偶氮二羧酸二乙酯、1,1’-(偶氮二羰基)二哌啶等。另外，使用(氰基亚甲基)三甲基膦烷以取代规定的膦和规定的缩合剂时，在使反应顺利进行的观点上有时是有利的。
(原料合成2)
[化学式15]
(式中，L9表示卤素。以下相同。)
本制法为制造第一制法的原料化合物(1a)中的L1为低级亚烷基的化合物(4d)的方法。
(第一工序)
本工序是通过化合物(4a)与末端炔衍生物的薗头耦合反应而得到化合物(4b)的工序。
反应条件与第二制法的第一工序相同。
(第二工序)
本工序是通过使化合物(4b)的炔部分氢化而还原为低级亚烷基，从而得到化合物(4c)的工序。
反应条件与第二制法的第二工序相同。
(第三工序)
本工序是将化合物(4c)的氨基转换为卤素，从而得到化合物(4d) 的工序。
本工序中，使用当量或一方过剩量的化合物(4c)与氯化铜(II)以及亚硝酸n-戊酯，将它们的混合物在对反应为惰性的溶剂中，在由冰冷至加热回流下，通常搅拌0.1小时～5天。作为此处所用的溶剂的例子，并无特殊限定，可列举二氯甲烷、1,2-二氯乙烷或氯仿等的卤化烃类。
(原料合成3)
[化学式16]
本制法为制造第二制法的原料化合物(1b)中X为N的化合物(5c)的方法。
本反应为通过化合物(5a)与化合物(5b)的IPSO取代反应，得到化合物(5C)的反应。
使用当量或一方过剩量的化合物(5a)与化合物(5b)，将它们的混合物在对反应为惰性的溶剂中，在氢气氛下、在由冰冷至加热回流下，通常搅拌0.1小时～5天。作为此处所用的溶剂的例子，并无特殊限定，可列举甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇等的醇类；N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、及它们的混合溶剂。另外，使用甲磺酸、乙酸、三氟乙酸、氯化氢、硫酸等的酸时，在使反应顺利进行的观点上有时是有利的。
式(I)化合物的药理活性通过以下试验来确认。
试验例1FGFR1、2和3酶分析
酶分析使用人类重组FGFR1、FGFR2、FGFR3(Carnabio公司、目录编号08-133，08-134，08-135)，关于反应，FGFR1和FGFR2在室温、FGFR3在30℃下实施。测定方法如以下显示其概略。
将化合物以二甲基亚砜(DMSO)溶液稀释(10倍公比、4点)，用反应缓冲液(100mMHEPES(pH7.5)、0.003％Brij-35、0.004％ Tween20、0.5mM DTT、10mM MgCl2)稀释使得DMSO浓度成为2％。在384孔板中，在化合物溶液4μL中添加用反应缓冲液稀释的FGFR1酶(2或3ng/μL)、FGFR2酶(2ng/μL)、或FGFR3酶(6ng/μL)2μL，20分钟后添加基质-ATP溶液(100mMHEPES(pH 7.5)、0.003％Brij-35、0.004％Tween 20、0.5mM DTT、10mM MgCl2、3.75μMsubstrate-FL-peptide 22+500μM(FGFR1)ATP、188μM(FGFR2)ATP或250μM(FGFR3)ATP)4μL，反应30分钟。反应停止后，用LabChip EZ Reader测定。以所得的抑制率为基准，由非线形回归算出IC50值。将数个化合物的结果示于表1。表中的Ex表示后述实施例化合物编号。
[表1]
试验例2突变FGFR3强制表达细胞(FGFR3_S249C/NIH3T3)的增殖分析
将FGFR3_S249C/NIH3T3细胞各添加3000细胞/孔/90μL于96孔球形板(U底)，第二天添加化合物溶液(10μL)(DMSO实施例213
在5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{6-[(2-苯基-1,3-二噁烷-5-基)氧基]吡啶-3-基}嘧啶-2-胺(335mg)与乙酸(10mL)的混合物中添加水(2mL)，在60℃搅拌16小时。将溶剂减压浓缩，在残渣中添加饱和碳酸氢钠水溶液后，以氯仿萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化后，以乙酸乙酯固化，得到2-{[5-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)吡啶-2-基]氧基}丙烷-1,3-二醇(92mg)。
[表2]
试验例3UM-UC-14(FGFR3_S249C阳性细胞、膀胱癌)抗肿瘤试验
在裸鼠(CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj(nu/nu)、雄、4-5周龄)右腹的皮下移植3×106个细胞/0.1mL(PBS+Matrigel、1:1)的UM-UC-14细胞，在肿瘤大小成为约250mm3时，开始药剂施用(Day 1)。1日施用1次或2次，每2～3天用游标卡尺测定肿瘤直径并测定体重，最终以第11天的肿瘤体积mm3(短径mm×短径mm×长径mm/2)来判定抗肿瘤效果(n＝3-5)。需要说明的是，向控制组施用0.5％MC(甲基纤维素)。表中的％抑制例如在100％抑制时表示将控制组的肿瘤成长抑制 为Day 1的肿瘤体积，％退缩是指比Day 1的肿瘤体积更退缩几％。需要说明的是，Day 1的肿瘤体积表示药物刚要施用前的肿瘤体积。将经口施用lmg/kg/day时(其中，实施例95的化合物为3mg/kg/day)的数个化合物结果如表3所示。
[表3]
根据上述试验，确认了包含于本发明式(I)的多个实施例化合物具有FGFR1、2和/或3抑制作用。另外，包含于式(I)的多个实施例化合物抑制使突变FGFR3强制表达的细胞的增殖，进而，在负荷有突变FGFR3阳性膀胱癌的动物模型中，确认了膀胱癌的成长的抑制或膀胱癌本身的退缩。由以上可知式(I)的化合物或其盐可作为FGFR1、2和/或3相关的各种癌、特别是突变FGFR3阳性膀胱癌的治疗剂来使用。
试验例4FGFR3-TACC3_v1的分离
对于肺癌临床样品(美国Asterand公司)200样品，使用逆转录酶(SuperScriptIII、LifeTechnologies公司)和随机引物(Random Primers、LifeTechnologies公司)，根据试剂盒的实验流程进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列编号1所示的FGFR3_TACC3_RT_F以及序列 编号2所示的FGFR3_TACC3_RT_R的引物，以上述所得的cDNA为模板，使用DNA聚合酶(TaKaRa Ex Taq；TakaraBio株式会社)进行PCR(98℃10秒、55℃15秒、68℃1分30秒、30循环)。之后，以10倍稀释的上述PCR产物为模板，使用序列编号3所示的FGFR3_TACC3_nested_F以及序列编号4所示的FGFR3_TACC3_nested_R的引物，使用同样的DNA聚合酶进行PCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃1分、30循环)。PCR反应后、电泳后，可知仅样品Lg344样品得到约500base的PCR产物。
之后，将PCR产物通过双脱氧定序法来决定序列(BigDye Terminator v3.1CycleSequencing Kit；Life；Technologies)。其结果，可知约500base的PCR产物为登录于NCBI的FGFR3(NM_001163213.1)的编码序列(以下CDS)的外显子18的3’末端与TACC3(NM_006342.1)的CDS的外显子11的5’末端融合的序列。
对于来自扁平上皮肺癌患者肺癌组织的RNA(美国Asterand公司)Lg344样品RNA，使用逆转录酶(SuperScriptⅢ、LifeTechnologies公司)及寡(dT)引物(寡(dT)20引物、LifeTechnologies公司)，根据试剂盒的实验流程进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列编号5所示的FGFR3-TACC3_cloning_F以及序列编号6所示的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，以上述所得的cDNA为模板，使用DNA聚合酶(KOD-plus-Ver.2；东洋纺绩株式会社)进行PCR(98℃15秒、60℃15秒、68℃3分30秒、25循环)。之后，以10倍稀释的上述PCR产物为模板，使用序列编号7所示的FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F以及序列编号8所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物，使用相同的DNA聚合酶进行PCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃3分30秒、25循环)。PCR反应后，电泳后，可知得到约2.9kbase的PCR产物。将PCR产物克隆至克隆载体(TOPO XL PCR Cloning Kit；LifeTechnologies株式会社)。插入序列通过双脱氧定序法来决定序列(BigDye Terminator v3.1CycleSequencing Kit；LifeTechnologies)。结果可知，约2.9kbase的 PCR产物中存在登录于NCBI的FGFR3(NM_001163213.1)的CDS的5'末端至外显子18的3'末端与TACC3(NM_006342.1)CDS的外显子11的5'末端至CDS的3'末端融合的转录产物(FGFR3-TACC3_v1)(序列编号9)。以序列编号9编码的多肽(FGFR3-TACC3_v1融合多肽)如序列编号10所示。
试验例5FGFR3-TACC3_v2的分离
对于膀胱癌(美国Asterand公司)59样品，使用逆转录酶(SuperScript III、LifeTechnologies公司)及随机引物(RandomPrimers、LifeTechnologies公司)，根据试剂盒的实验流程进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列编号1所示的FGFR3_TACC3_RT_F以及序列编号2所示的FGFR3_TACC3_RT_R的引物，以上述所得的cDNA为模板，使用DNA聚合酶(TaKaRa Ex Taq；TakaraBio株式会社)进行PCR(98℃10秒、55℃15秒、68℃1分30秒、30循环)。之后，以10倍稀释的上述PCR产物为模板，使用序列编号3所示的FGFR3_TACC3_nested_F以及序列编号4所示的FGFR3_TACC3_nested_R的引物，使用相同的DNA聚合酶进行PCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃1分、30循环)。PCR反应后，电泳后，可知以样品Bd106样品得到约600base的PCR产物。
之后，通过双脱氧定序法对PCR产物定序(BigDye Terminator v3.1CycleSequencing Kit；LifeTechnologies)。其结果可知，约600base的PCR产物为登录于NCBI的FGFR3(NM_001163213.1)的CDS的外显子18的3’末端与TACC3(NM_006342.1)的CDS的外显子10的5’末端融合的序列。对于来自膀胱癌患者膀胱癌组织的RNA(美国Asterand公司)Bd106样品RNA，使用逆转录酶(SuperScriptIII、LifeTechnologies公司)及寡(dT)引物(寡(dT)20引物、LifeTechnologies公司)，根据试剂盒的实验流程进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列编号5所示的FGFR3-TACC3_cloning_F以及序列编号6所示的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，以上述所得的cDNA为模板，使用DNA聚合酶(KOD-plus-Ver.2；东洋纺绩股份有 限公司)进行PCR(98℃15秒、60℃15秒、68℃3分30秒、25循环)。之后，以10倍稀释的上述PCR产物为模板，使用序列编号7所示的FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F以及序列编号8所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物，使用相同的DNA聚合酶进行PCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃3分30秒、25循环)。PCR反应后，电泳后，可知得到约3.0kbase的PCR产物。将PCR产物克隆于克隆载体(TOPO XL PCR Cloning Kit；LifeTechnologies株式会社)。插入序列通过双脱氧定序法来决定序列(BigDyeTerminator v3.1Cycle Sequencing Kit；LifeTechnologies)。其结果可知，约3.0kbase的PCR产物中，存在有登录于NCBI的FGFR3(NM_001163213.1)的CDS的5'末端至外显子18的3'末端与TACC3(NM_006342.1)的CDS的外显子10的5’末端至CDS的3’末端融合的转录产物(FGFR3-TACC3_v2)(序列编号11)。由序列编号11编码的多肽(FGFR3-TACC3_v2融合多肽)如序列编号12所示。
试验例6FGFR3-TACC3_v3的分离
对于膀胱癌(美国Asterand公司)59样品，使用逆转录酶(SuperScriptIII、LifeTechnologies公司)及随机引物(RandomPrimers、LifeTechnologies公司)，根据试剂盒的实验流程进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列编号1所示的FGFR3_TACC3_RT_F以及序列编号2所示的FGFR3_TACC3_RT_R的引物，以上述所得的cDNA为模板，使用DNA聚合酶(TaKaRa Ex Taq；TakaraBio株式会社)进行PCR(98℃10秒、55℃15秒、68℃1分30秒、30循环)。之后，以10倍稀释的上述PCR产物为模板，使用序列编号3所示的FGFR3_TACC3_nested_F以及序列编号4所示的FGFR3_TACC3_nested_R的引物，使用相同的DNA聚合酶进行PCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃1分、30循环)。PCR反应后，电泳后，得知样品Bd021样品得到约650base的PCR产物。
之后，通过双脱氧定序法决定PCR产物的序列(BigDye Terminator v3.1CycleSequencing Kit；LifeTechnologies)。其结果可 知，约650base的PCR产物为登录于NCBI的FGFR3(NM_001163213.1)的CDS的外显子19的中间序列与TACC3(NM_006342.1)的内含子10-11的一部分融合，且进一步与TACC3的CDS的外显子11的5’末端融合的序列。
对于来自膀胱癌患者膀胱癌组织的RNA(美国Asterand公司)Bd021样品RNA，使用逆转录酶(SuperScriptIII、Life'Technologies公司)及寡(dT)引物(寡(dT)20引物、LifeTechnologies公司)，根据试剂盒的实验流程进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列编号5所示的FGFR3-TACC3_cloning_F以及序列编号6所示的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，以上述所得的cDNA为模板，使用DNA聚合酶(KOD-plus-Ver.2；东洋纺绩股份有限公司)进行PCR(98℃15秒、60℃15秒、68℃3分30秒、25循环)。之后，以10倍稀释的上述PCR产物为模板，使用序列编号7所示的FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F以及序列编号8所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物，使用相同的DNA聚合酶进行PCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃3分30秒、25循环)。PCR反应后，电泳后，得知得到约3.0kbase的PCR产物。将PCR产物克隆至克隆载体(TOPO XL PCR Cloning Kit；LifeTechnologies株式会社)。插入序列通过双脱氧定序法定序(BigDye Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit；LifeTechnologies)。其结果可知，约3.0kbase的PCR产物中，存在有登录于NCBI的FGFR3(NM_001163213.1)的CDS的5'末端至外显子19的中间序列与TACC3(NM_006342.1)的内含子10-11的一部分融合，且进而与TACC3的CDS的外显子11的5’末端至CDS的3’末端融合的转录产物(FGFR3-TACC3_v3)(序列编号13)。由序列编号13编码的多肽(FGFR3-TACC3_v3融合多肽)如序列编号14所示。
试验例7由来自膀胱癌患者的细胞株RT-112分离FGFR3-TACC3_v1
对于由来自膀胱癌患者的细胞株RT-112(从Leibniz-Institut DSMZ-DeutscheSammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH购入)纯化的RNA，使用逆转录酶(SuperScriptIII、LifeTechnologies公司)及寡(dT)引物(寡(dT)20引物、LifeTechnologies公司)，根据试剂盒的实验流程进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列编号5所示的FGFR3-TACC3_cloning_F以及序列编号6所示的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，以上述所得的cDNA为模板，使用DNA聚合酶(KOD-plus-Ver.2；东洋纺绩股份有限公司)进行PCR(98℃15秒、60℃15秒、68℃3分30秒、25循环)。之后，以10倍稀释的上述PCR产物为模板，使用序列编号7所示的FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F以及序列编号8所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物，使用相同的DNA聚合酶进行PCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃3分30秒、25循环)。PCR反应后，进行电泳，结果得到约2.9kbase的PCR产物。将PCR产物克隆于克隆载体(TOPO XL PCR Cloning Kit；LifeTechnologies株式会社)，通过双脱氧定序法(BigDye Terminator v3.1CycleSequencing Kit；LifeTechnologies)对插入序列定序，其结果可知，与登录于NCBI的FGFR3(NM_001163213.1)的CDS的N末端至外显子18的3’末端与TACC3(NM_006342.1)的CDS外显子11的5'末端至CDS的C末端融合的转录产物(FGFR3-TACC3_v1)(序列编号9)相同。
试验例8由来自膀胱癌患者的细胞株RT4分离FGFR3-TACC3_v4
对于由来自膀胱癌患者的细胞株RT4(从ECACC(European Collectionof CellCultures)购入)纯化的RNA，使用逆转录酶(SuperScriptIII、LifeTechnologies公司)及寡(dT)引物(寡(dT)20引物、LifeTechnologies公司)，根据试剂盒的实验流程进行逆转录反应，合成cDNA。接着，使用序列编号5所示的FGFR3-TACC3_cloning_F以及序列编号6所示的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，以上述所得的cDNA为模板，使用DNA聚合酶(KOD-plus-Ver.2；东洋纺绩株式会社)进行PCR(98℃15秒、60℃15秒、68℃5分30秒、30循环)。之后，以10倍稀释的上述PCR产物为模板，使用序列编号7所示的FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F以及序列编号8所示的 FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物，使用相同的DNA聚合酶进行PCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃5分、30循环)。PCR反应后，进行电泳，结果得到约4.5kbase的PCR产物。将PCR产物克隆于克隆载体(TOPO XL PCR Cloning Kit；LifeTechnologies株式会社)，通过双脱氧定序法(BigDye Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit；LifeTechnologies)对插入序列定序，其结果可知，存在有登录于NCBI的FGFR3(NM_001163213.1)的CDS的5’末端至外显子18的3'末端与FGFR3的内含子18-19序列的一部分融合，且进一步由TACC3(NM_006342.1)的外显子4的中途开始融合，与TACC3的CDS的3'末端为止融合的转录产物(FGFR3-TACC3_v4)。经确认的序列中，第882号的碱基序列由T替换为C(SNPs登录编号；rs2234909)、第2484号的碱基序列由C替换为T、第2663号的碱基序列由G替换为A(序列编号15)。由序列编号15编码的多肽(FGFR3-TACC3_v4融合多肽)如序列编号16所示。
试验例9FGFR3-TACC3_v1、FGFR3-TACC3_v2、FGFR3-TACC3_v3和FGFR3-TACC3_v4的逆转录病毒液的制作
为了将FGFR3-TACC3_v1、FGFR3-TACC3_v2、FGFR3-TACC3_v3以及FGFR3-TACC3_v4的ORF全长作为蛋白质来表达，由试验例4、试验例5、试验例6以及试验例8中制作的克隆载体，以限制酶BamHI进行37℃、3小时的酶反应并纯化限制酶处理后的DNA片段，进而，以EcoRI进行37℃、3小时的酶反应并纯化限制酶处理后的DNA片段。将含有此ORF的DNA片段克隆到存在于表达载体(pMXs-puro；Cosmobio公司)的多克隆位点的BamHI及EcoRI位点上，并构筑表达质粒(FGFR3-TACC3_v1/pMXs-puro、FGFR3-TACC3_v2/pMXs-puro、FGFR3-TACC3_v3/pMXs-puro以及FGFR3-TACC3_v4/pMXs-puro)。
使用转染试剂(FUGENE(注册商标)HD、Roche公司)对各9μg的FGFR3-TACC3_v1/pMXs-puro、FGFR3-TACC3_v2/pMXs-puro、FGFR3-TACC3_v3/pMXs-puro以及FGFR3-TACC3_v4/pMXs-puro，实施向Platinum-E细胞的转染。转染24小时后，更换为包含10％牛 血清(NichireiBioscience公司)的D-MEM培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium培养基；Invitrogen公司)，进一步采取24小时后的培养基上清液，制作逆转录病毒溶液。
试验例10FGFR3-TACC3_v1、FGFR3-TACC3_v2、FGFR3-TACC3_v3以及FGFR3-TACC3_v4的锚定非依赖性的增殖亢进作用的研究
试验例9中，在使用FGFR3-TACC3_v1/pMXs-puro、FGFR3-TACC3_v2/pMXs-puro、FGFR3-TACC3_v3/pMXs-puro以及FGFR3-TACC3_v4/pMXs-puro制作的病毒溶液中以4μg/mL的浓度添加聚凝胺(Polybrene；Sigma公司)后，添加至NIH3T3细胞使其感染。添加6小时后更换为包含10％牛血清(NichireiBioscience公司)的D-MEM培养基，感染1天后更换为包含10％牛血清(NichireiBioscience公司)以及lμg/mL的嘌呤霉素(Sigma公司)的D-MEM培养基(Invitrogen公司)，在5％CO2存在下、37℃下持续4周培养，取得稳定表达FGFR3-TACC3_v1、FGFR3-TACC3_v2、FGFR3-TACC3_v3以及FGFR3-TACC3_v4的NIH3T3细胞。(分别命名为FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞以及FGFR3-TACC3_v4表达/NIH3T3细胞)。
为了研究FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞以及FGFR3-TACC3_V4表达/NIH3T3细胞的锚定非依赖性的增殖亢进能力，在96孔球形板(Sumiloncelltightspheroid96U；住友Bakelite)中分别将FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v4表达/NIH3T3细胞以及经空载体pMXs-puro感染的NIH3T3细胞(Mock/NIH3T3细胞)，用包含10％牛血清(NichireiBioscience公司)的D-MEM培养基(Invitrogen公司)进行播种，使得每1孔为1×103个。在5％CO2存在下、在37℃培养后，以细胞数测定试剂(CELLTITER-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay；Promega公司)根据手册的方法来测定第二天(Dayl)及4天后(Day4)的细胞数。使用发光测定装置进行检测。关于Mock/NIH3T3细胞，由Dayl至Day4，细胞数的计数不增加，相对于此，FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞由Dayl至Day4确认到约3.1倍的细胞数计数的增加、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞由Dayl至Day4确认了约2.8倍的细胞数计数的增加、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞由Dayl至Day4确认到约2.3倍的细胞数计数的增加、FGFR3-TACC3_v4表达/NIH3T3细胞由Dayl至Day4确认到约2.5倍的细胞数计数的增加。
从以上可以发现，FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞以及FGFR3-TACC3_v4表达/NIH3T3细胞显示出锚定非依赖性的细胞增殖。
试验例11化合物对FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v4表达/NIH3T3细胞、来自膀胱癌患者的细胞株RT-112及来自膀胱癌患者的细胞株RT4的锚定非依赖性的细胞增殖抑制作用
锚定非依赖性的细胞增殖的测定(集落法等)已知为研究化合物抗癌作用(药理效果)的系统(临床肿瘤学第二版、癌与化学疗法社)。作为代替集落法的测定细胞非粘合性增殖的方法，有使用如上所述的球形板的方法。
在96孔球形板(Sumiloncelltightspheroid96U；住友Bakelite)中，将FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v4表达/NIH3T3细胞用包含10％胎牛血清的D-MEM培养基进行播种，使得每1孔为1×103个。同样将来自膀胱癌患者的细胞株RT-112用包含10％胎牛血清以及2mM L-glutamine的RPMI1640培养基进行播种，使得每1孔为1×103个；将来自膀胱癌患者的细胞株RT4用包含10％胎牛血清的RPMI1640培养基进行播 种，使得每1孔为1×103个。另外，作为正控制用，制备仅添加培养基的孔。在5％CO2存在下、37℃培养一晚后，以最终浓度100nM、10nM及1nM添加被测化合物。作为负控制，将化合物的溶剂即DMSO以成为与化合物添加时同浓度(0.1％)的方式添加。之后，在5％CO2存在下、37℃培养4天，添加细胞数测定试剂(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay；Promega公司)，搅拌20分钟后，使用发光测定装置来测定。分别以正控制、负控制的值为100％抑制值、0％抑制值，算出各化合物的增殖抑制％。其结果如表4所示，发现了数个本发明化合物抑制FGFR3-TACC3_v1表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v2表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v3表达/NIH3T3细胞、FGFR3-TACC3_v4表达/NIH3T3细胞、来自膀胱癌患者的细胞株RT-112以及来自膀胱癌患者的细胞株RT4的锚定非依赖性的增殖亢进作用。
根据以上结果，可知表达FGFR3-TACC3_v1、FGFR3-TACC3_v2、FGFR3-TACC3_v3以及FGFR3-TACC3_v4的癌细胞或肿瘤的增殖可通过本发明化合物来抑制。
[表4]
试验例12化合物对FGFR3-TACC3融合多肽的体外激酶活性的抑制作用
(1)FLAG标签融合表达质粒
(FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)、
FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)以及
FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+))的构筑
为了取得FLAG标签融合于5’末端的FGFR3-TACC3融合聚核苷酸，使用试验例4、试验例5、以及试验例6中克隆的载体作为模板，实施于5'末端加成FLAG标签的PCR。使用序列编号17所示的FGFR3_N_FLAG_BamHI以及序列编号8所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物以及DNA聚合酶(KOD-plus-Ver.2；东洋纺绩株式会社)进行PCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃3分30秒、12循环)。将PCR产物克隆于克隆载体(TOPO XL PCR Cloning Kit；LifeTechnologies株式会社)。插入序列通过双脱氧定序法定序(BigDye Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit；LifeTechnologies)。其结果，确认了PCR产物为在序列编号9、序列编号11及序列编号13记载的序列当中，编码第一个甲硫氨酸的3个碱基(ATG)被删除且起始密码子与编码FLAG标签的核酸序列(序列编号24)被加成于5’末端的核酸序列。将通过这些所编码的多肽分别称为FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽，将这些总称为FGFR3-TACC3(N-FLAG)融合多肽。另外，为了构筑将加成这些的FLAG序列的FGFR3-TACC3_vl(N-FLAG)、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)以及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)的ORF全长作为蛋白质来表达的表达载体，利用上述克隆载体并以限制酶BamHI进行37℃、3小时的酶反应并且纯化限制酶处理过的DNA片段，进一步用EcoRI进行37℃、3小时的酶反应并且纯化限制酶处理过的DNA片段。将含有此ORF的DNA片段克隆到存在于表达载体(pcDNA3.1/Zeo(+)；LifeTechnologies株式会社)的多克隆位点的BamHI及EcoRI位点上，并构筑表达质粒(FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)以及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+))。
(2)FGFR3-TACC3(N-FLAG)融合多肽的获得
在转染实施的前一天，使用包含10％胎牛血清的D-MEM培养基，培养10张经胶原蛋白涂覆的15cm培养盘，每1张0.5×107个HEK293细胞。在转染当天，分别将FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)以及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+)(试验例12)在每1张培养盘使用27μg，使用转染试剂(FUGENE(注册商标)HD、Roche公司)81μL，对HEK293细胞实施转染。转染24小时后，去除培养基， 用PBS洗涤3次，添加1mL的PBS，以细胞刮具(康宁公司)剥下细胞后，回收于聚丙烯制的管。以1200rpm离心5分钟后，去除上清液，添加150μL的细胞溶解液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、l％Np-40、1mMEDTA、蛋白酶抑制剂cocktailcomplete)，于冰上培养30分钟，使细胞溶解。将存在于离心后所得的上清液中的FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽以及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽分别使用M2抗体亲和凝胶(ANTI-FLAG M2Affinity Gel；SIGMA-ALDRICH公司)根据产品信息记载的方法来纯化。洗涤及溶出分别使用洗涤液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、l％Np-40、1mMEDTA、蛋白酶抑制剂cocktailcomplete)、溶出液(20mM Tris-HCl(pH7.4)、10mM MgCl2、l0mM MnCl2、0.5mg/mL FLAG peptide)，而得到l00μL的溶出液。对于溶出液进行使用了抗FGFR3抗体(CellSignaling公司)及抗FLAGM2抗体(SIGMA-ALDRICH公司)的免疫印迹法以及银染色，确认了得到FGFR3-TACC3_vl(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽。
(3)FGFR3-TACC3(N-FLAG)融合多肽的体外激酶活性的检测
使用激酶活性检测试剂盒(HTRF KinEASE-TK；Cisbio公司)来研究上述经纯化的FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽以及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽对肽基质的磷氧化活性。使用康宁公司384孔、Low-volume Blackplate，以上述溶出液的1倍稀释溶液、3倍稀释溶液或10倍稀释溶液各1μL作为酶源，在试剂盒所附的5x Kinase buffer中分别添加DTT及Mg使最终浓度成为1mM及5mM，作为反应溶液。以试剂盒所附的TK Substrate作为基质且最终浓度成为2.0μM的方式、ATP未添加及添加使得ATP最终浓度成为100μM，最终容量为5.0μL，各自于室温反应1小时。反应后，根据试剂盒推荐的方法，制备Sa-XL665及TK Antibody-Eu(K)溶液，分别添加2.5μL，在室温反应1小时后，检测HTRF的计数(即肽基 质的磷氧化)。其结果可知，相对于ATP未添加，ATP添加时，HTRF的计数在添加包含上述FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽或FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽的各溶出液1倍稀释溶液lμL时，分别增加约38倍、约40倍以及约38倍；添加上述溶出液3倍稀释溶液lμL时，分别增加约27倍、34倍、31倍；添加上述溶出液10倍稀释溶液lμL时，分别增加5倍、18倍、11倍。
如上，通过使用激酶活性检测试剂盒，可检测各融合多肽的体外激酶活性。
(4)化合物对FGFR3-TACC3(N-FLAG)融合多肽的体外激酶活性的抑制作用
使用上述激酶活性检测试剂盒及同样的384孔板，研究被测化合物对FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽的体外激酶活性的抑制作用。以各化合物最终浓度成为100nM、10nM及1nM的方式添加，作为控制组，添加DMSO成为0.1％，对于FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽，添加上述溶出液2倍稀释溶液1μL、对于FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽，添加上述溶出液3倍稀释溶液lμL、及对于FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽，添加上述溶出液3倍稀释溶液lμL，然后，添加试剂盒所附的TKSubstrate作为基质，使最终浓度成为2.0μM，在室温反应15分钟。接着，添加ATP使最终浓度成为100μM，或不添加，以最终容量为5.0μL在室温反应60分钟。其它分别添加与上述(3)的方法同样方式制备的Sa-XL665及TK Antibody-Eu(K)溶液2.5μL，在室温反应1小时后，检测HTRF的计数。将化合物不存在下(与化合物添加时同浓度添加DMSO 0.1％)的ATP未添加及添加时的磷氧化计数分别作为100％抑制、0％抑制，用以下算式算出化合物所致的FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽激酶活性的抑制％。
[化合物所致的激酶活性抑制(％)]＝(1-[化合物添加ATP添加时的磷氧化计数-化合物未添加ATP未添加时的磷氧化计数]/[化合物未添加ATP添加时的磷氧化计数-化合物未添加ATP未添加时的磷氧化计数])×100
其结果，如表5所示，发现了数个本发明的化合物会抑制纯化的FGFR3-TACC3_v1(N-FLAG)融合多肽、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)融合多肽及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)融合多肽对肽基质的磷氧化活性。
[表5]
试验例13由来自膀胱癌患者的细胞株SW780的FGFR3-BAIAP2L1的分离
对由来自膀胱癌患者的细胞株SW780(由ATCC购入)所纯化的RNA，使用逆转录酶(SuperScriptIII、LifeTechnologies公司)及寡(dT)引物(寡(dT)20引物、LifeTechnologies公司)，根据试剂盒的实验流程进行逆转录反应，合成cDNA。
接着，使用序列编号18所示的FGFR3-BAIAP2Ll_cloning_F以及序列编号19所示的FGFR3-BAIAP2L1_cloning_R的引物，以上述所得的cDNA为模板，使用DNA聚合酶(KOD-plus-Ver.2；东洋纺绩株式会社)进行PCR(98℃15秒、60℃15秒、68℃5分、30循环)。之后，以10倍稀释的上述PCR产物为模板，使用序列编号20所示的FGFR3_BAIAP2Ll_cloning_BamHI_F以及序列编号21所示的FGFR3_BAIAP2Ll_cloning_NotI_R的引物，使用相同的DNA聚合酶进行PCR(98℃15秒、55℃15秒、68℃4分、30循环)。PCR反应后、进行电泳，结果得到约3.8kbase的PCR产物。将PCR产物克隆于克隆载体(TOPO XL PCR Cloning Kit；LifeTechnologies株式会社)，将插入序列以双脱氧定序法(BigDye Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit；LifeTechnologies)定序，结果可知为登录于NCBI的FGFR3(NM_001163213.1)的CDS的5’末端至外显子18的3'末端与BAIAP2L1(NM_018842.4)的CDS的外显子2的5'末端至CDS的3'末端融合的转录产物(FGFR3-BAIAP2L1)。确认的序列中，第3558号的碱基序列由G替换为A(SNPs登录编号；rs1045916)、第3723号的碱基序列由C替换为T、第3747号的碱基序列由G替换为A(序列编号22)。由序列编号22所编码的多肽如序列编号23所示。
试验例14FGFR3-BAIAP2L1的逆转录病毒液的制作
为了构筑将FGFR3-BAIAP2L1的ORF全长作为蛋白质表达的表达质粒，利用上述克隆载体并用限制酶BamHI进行37℃、3小时的酶反应，并纯化限制酶处理后的DNA片段，进一步用NotI进行37℃、3小时的酶反应，并纯化限制酶处理后的DNA片段。将含有该ORF的DNA片段克隆到存在于表达载体(pMXs-puro；Cosmobio公司)的多克隆位点的BamHI及NotI位点上，构筑表达质粒(FGFR3-BAIAP2Ll/pMXs-puro)。使用所制作的FGFR3-BAIAP 2Ll/pMXs-puro，根据试验例9的方法制作逆转录病毒溶液。
试验例15FGFR3-BAIAP2L1的锚定非依赖性的增殖亢进作用的研究
使用于试验例14中使用FGFR3-BAIAP2Ll/pMXs-puro所制作的病毒溶液，根据试验例10的方法，取得稳定表达FGFR3-BAIAP2L1的NIH3T3细胞(命名为FGFR3-BAIAP2L1表达/NIH3T3细胞)。
为了研究FGFR3-BAIAP2L1表达/NIH3T3细胞的锚定非依赖性的增殖亢进能力，以与试验例10同样的方法进行了研究。Mock/NIH3T3细胞由Dayl至Day4细胞数的计数并无增加，与之相对，FGFR3-BAIAP2L1表达/NIH3T3细胞确认了由Dayl至Day4有约2.5倍的细胞数计数的增加。如上可知，FGFR3-BAIAP2L1表达/NIH3T3细胞显示出锚定非依赖性的细胞增殖。
试验例16对FGFR3-BAIAP2L1表达/NIH3T3细胞的锚定非依赖性的细胞增殖抑制作用
在96孔球形板(Sumiloncelltightspheroid96U；住友Bakelite)中用含有10％胎牛血清的D-MEM培养基播种FGFR3-BAIAP2L1表达/NIH3T3细胞，使得每1孔为l×103个。另外，制备仅添加培养基的孔作为正控制用。在5％CO2存在下、37℃培养一晚后，以最终浓度100nM、10nM及1nM添加被测化合物。作为负控制，添加化合物的溶剂即DMSO使成为与化合物添加时同浓度(0.1％)。之后，在5％CO2存在下、37℃培养4天，添加细胞数测定试剂(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay；Promega公司)，搅拌20分钟后，使用发光测定装置测定。以正控制、负控制的值分别为100％抑制值、0％抑制值，算出各化合物的增殖抑制％。其结果如表6所示，发现了多个本发明化合物会抑制FGFR3-BAIAP2L1表达/NIH3T3细胞的锚定非依赖性的增殖亢进作用。
根据以上结果，表明表达FGFR3-BAIAP2L1的癌细胞或肿瘤的增殖可被本发明化合物抑制。
[表6]
含有式(I)的化合物或其盐的1种或2种以上作为有效成分的医药组合物可使用本技术领域通常所使用的赋形剂(即药剂用赋形剂或药剂用载体等)通过通常所使用的方法来制备。
给药时，可为利用锭剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂等的经口给药；或利用关节内、静脉内、肌肉内等的注射剂、栓剂、点眼剂、眼软膏、经皮用液体制剂、软膏剂、经皮用贴附剂、经黏膜液体制剂、经黏膜贴附剂、吸入剂、膀胱内注入剂等的非经口给药的任意方式。
作为用于经口给药的固体组合物，可使用锭剂、散剂、颗粒剂等。在这样的固体组合物中，将1种或2种以上的有效成分与至少1种的惰性赋形剂混合。根据一般方法，组合物可含有惰性的添加剂，例如润滑剂或崩解剂、稳定化剂、溶解辅助剂。锭剂或丸剂也可根据需要以糖衣或胃溶性或肠溶性物质的薄膜来包覆。
用于经口给药的液体组合物含有药剂学上容许的乳浊剂、溶液剂、悬浊剂、糖浆剂或酏剂等，且含有一般所用的惰性稀释剂，例如纯水或乙醇。该液体组合物除惰性稀释剂以外，也可含有如可溶化剂、湿润剂、悬浊剂之类的辅助剂、甘味剂、风味剂、芳香剂、防腐剂。
用于非经口给药的注射剂含有无菌的水性或非水性溶液剂、悬浊剂或乳浊剂。作为水性的溶剂，包含例如注射用蒸馏水或生理食盐水。作为非水性的溶剂，有例如乙醇之类的醇类。这样的组合物还可以进一步含有等渗剂、防腐剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定化剂、或溶解辅助剂。它们(例如)通过细菌保留过滤器来过滤、通过杀菌剂的配合或照射而无菌化。另外，它们也可以制造无菌固体组合物，且于使用前溶解或悬浊于无菌水或无菌的注射用溶剂来使用。
外用剂包含软膏剂、硬膏剂、霜剂、胶状剂、糊剂、喷雾剂、洗剂、点眼剂、眼软膏等。含有一般所用的软膏基剂、洗剂基剂、水性、或非水性的液体制剂、悬浊剂、乳剂等。
吸入剂或经鼻剂等的经黏膜剂可使用固体、液体、或半固体状，可根据以往公知的方法来制造。也可以适当添加例如公知的赋形剂、或进一步适当添加pH调整剂、防腐剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂或增黏剂等。给药可使用用于适当的吸入或吹送的装置。例如，可使用计量给药吸入装置等的公知装置或喷雾器，将化合物单独地或作为配方后的混合物的粉末来给药、或者可以将化合物与可药用的载体组合后作为溶液或悬浮液来给药。干燥粉末吸入器等可为单次或多次给药用吸入器，可利用干燥粉末或含有粉末的胶囊。或可为加压气溶胶喷雾等的方式，其使用适当的抛射剂，例如氯氟烷烃或二氧化碳等的适合的气体。
通常口服给药时，1天的给药量按体重约为0.001～100mg/kg，优选为0.1～30mg/kg，更优选为0.1～10mg/kg，并将该给药量1次服用或分2次～4次服用。静脉内给药时，1天的给药量按体重约为0.0001～10mg/kg是适当的，并将该给药量每日一次或分为多次给药。而且，使用经粘膜剂时，按体重约为0.001～100mg/kg，每日一次或分多次给药。应考虑症状、年龄、性别等，根据每个患者的情况， 来适当地决定给药量。
虽然根据给药路径、剂形、给药部位、赋形剂或添加剂的种类而不同，但本发明的医药组合物含有0.01～100重量％、作为某方式含有0.01～50重量％的有效成分即1种或其以上的式(I)化合物或其盐。
式(I)的化合物可以与认为上述式(I)所示化合物对其有效的那些疾病的各种治疗剂或预防剂并用。在并用时，可以同时给药，或者分别连续给药、或按所希望的时间间隔给药。同时给药时的制剂可以是配合剂，也可以分别制成制剂。
实施例
以下，基于实施例，进一步详细说明式(I)化合物的制造法。需要说明的是，本发明不受下述实施例记载的化合物限定。另外，原料化合物的制法如制造例所示。进而，式(I)化合物的制造法不限定于以下所示的具体实施例的制造法，式(I)化合物也可以通过这些的制造法的组合、或本领域人员所易知的方法来制造。
PEx：制造例编号、Ex：实施例编号、PSyn：以同样的方法制造的制造例编号、Syn：以同样的方法制造的实施例编号、Str：化学结构式(Me：甲基、Et：乙基、ipr：异丙基、tBu：tert-丁基、Boc：tert-丁氧基羰基、Bn：苄基、THP：四氢吡喃基)、DAT：物理化学的数据、ESI+：质量分析中的m/z值(离子化法ESI、无特别指明时为(M+H)+)、ESI-：m/z值(离子化法ESI、无特别指明时为(M-H)-)、EI：质量分析中的m/z值(离子化法EI、无特别指明时为(M)+)、APCI/ESI+：质量分析中的m/z值(离子化法APCI与ESI的同时测定、无特别指明时为(M+H)+)、NMR1：二甲亚砜-d6中的1H-NMR的δ(ppm)、NMR2：CDC13中的1H-NMR的δ(ppm)、NMR3：CD3OD中的1H-NMR的δ(ppm)、制造例及实施例中的“M”：表示mol/L。另外，结构式中的HCl表示盐酸盐，HCl前的数字表示摩尔比。例如2HCl是指二盐酸盐。另外，制造例表及实施例表中附有“*”的化合物表示其化合物为光学活性体)。
制造例1
氩气氛下，在3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯胺(300mg)和乙醇(6mL)的混合物中添加甲磺酸(128μL)，在室温搅拌30分钟后，添加5-溴-2氯嘧啶(229mg)，在100℃搅拌4小时。追加5-溴-2-氯嘧啶(95mg)，在100℃搅拌12小时。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以氯仿萃取。将有机层以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩后，将所得的残渣以硅胶柱层析(乙酸乙酯/甲醇)纯化，得到5-溴-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺(352mg)。
制造例2
在3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯胺(253mg)和异丙醇(6mL)的混合物中添加甲磺酸(162μL)，在室温搅拌30分钟后，添加2-氯-5-碘嘧啶(200mg)，在90℃搅拌12小时，进一步在微波照射下、在130℃搅拌2小时。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以氯仿萃取。将有机层以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩后，将所得到的残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化，得到5-碘-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺(282mg)。
制造例3
在氩气氛下，将1-乙炔基-3,5-二甲氧基苯(3g)和乙腈(30mL)的混合物用冰冷却，添加磺酰氯(3.15mL)，在室温搅拌4小时。进一步添加磺酰氯(449μL)，在室温搅拌12小时。将反应混合物减压浓缩后，在残渣中添加乙酸乙酯与饱和碳酸氢钠水，在室温搅拌30分钟。滤取所产生的固体，以乙酸乙酯洗涤后，减压干燥，得到2,4-二氯-3-乙炔基-1,5-二甲氧基苯(1.99g)。
制造例4
将1-乙炔基-3,5-二甲氧基苯(4g)和乙腈(80mL)的混合物用冰冷却，添加N-氟-N'-(氯甲基)三乙二胺双(四氟硼酸)(19.4g)，慢慢地升温同时在室温搅拌12小时。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤后，以无水硫酸钠 干燥，并过滤。将滤液减压浓缩后，将所得到的残渣以硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷)、接着以硅胶柱层析(氯仿/己烷)纯化，得到3-乙炔基-2,4-二氟-1,5-二甲氧基苯(798mg、后述制造例编号PEx.4-1)及1-乙炔基-2-氟-3,5-二甲氧基苯(375mg、后述制造例编号PEx.4-2)。
制造例5
在氩气氛下，将1-乙炔基-2-氟-3,5-二甲氧基苯(800mg)和乙腈(8mL)的混合物用冰冷却，添加磺酰氯(378μL)，在室温搅拌12小时。在反应混合物中添加乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣以乙酸乙酯/二异丙醚固化，得到2-氯-3-乙炔基-4-氟-1,5-二甲氧基苯(787mg)。
制造例6
在氩气氛下，在室温下，向2,6-二氟-3-甲氧基苯甲醛(500mg)、碳酸钾(803mg)及甲醇(10mL)的混合物中添加(1-重氮基-2-氧代丙基)膦酸二甲酯(523μL)，搅拌5小时。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣以硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到2-乙炔基-1,3-二氟-4-甲氧基苯(452mg)。
制造例7
在氩气氛下，在2-氨基-5-碘嘧啶(lg)、3-乙炔基-2,4-二氟-1,5-二甲氧基苯(897mg)、四三苯基膦钯(261mg)、碘化铜(43mg)及N,N-二甲基甲酰胺(20mL)的混合物中添加N,N-二异丙基乙胺(1.55mL)，在80℃搅拌1小时。将反应混合物减压浓缩，在残渣中添加氯仿及水后，以硅藻土过滤去除不溶物。将滤液以氯仿萃取后，将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化，得到5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]嘧啶-2-胺(1.07g)。
制造例8
在氩气氛下，在5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]嘧啶-2-胺(400mg)、甲醇(4mL)及四氢呋喃(4mL)的混合物中添加10％钯- 碳(73mg)。在氢气氛下，在60℃搅拌8小时后，以硅藻土过滤去除不溶物。将滤液减压浓缩，得到5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]嘧啶-2-胺(402mg)。
制造例9
在氩气氛下，在5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]嘧啶-2-胺(100mg)和乙腈(2mL)的混合物中添加氯化铜(II)(68mg)及亚硝酸n-戊酯(69μL)，在60℃搅拌4小时。在反应混合物中添加乙酸乙酯，滤除不溶物。将滤液减压浓缩后，将残渣以硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到2-氯-5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]嘧啶(20mg)。
制造例10
将(2-氯嘧啶-5-基)甲醇(120mg)、3,5-二甲氧基酚(186mg)、三丁基膦(297μL)及四氢呋喃(2.4mL)的混合物用冰冷却，添加1,1’-(偶氮二羰基)二哌啶(305mg)后，在室温搅拌12小时。将不溶物滤除，将滤液减压浓缩。将残渣以硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到2-氯-5-[(3,5-二甲氧基苯氧基)甲基]嘧啶(119mg)。
制造例13
将2-氯-5-羟基嘧啶(278mg)和碳酸钾(453mg)及N,N-二甲基甲酰胺(3mL)的混合物用冰冷却，添加3,5-二甲氧基苄基溴化物(541mg)后，在室温搅拌7小时。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥后，过滤。将残渣以硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到2-氯-5-[(3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶(360mg)。
制造例14
在2-氯-5-[(3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶(4.17g)和N,N-二甲基甲酰胺(40mL)的混合物中添加N-氯琥珀酰亚胺(4.05g)，在室温搅拌2小时、在60℃搅拌2小时。在反应混合物中加水，滤取所产生的固体，用水洗涤后，减压干燥。将固体悬浊于乙酸乙酯(40mL)后，加热至80℃。滤取固体后，减压干燥，得到2-氯-5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶(3.99g)。
制造例15
将2-氯-5-羟基嘧啶(487mg)和1-(3,5-二甲氧基苯基)乙醇(680mg)、三丁基膦(1.37mL)及四氢呋喃(14mL)的混合物用冰冷却，添加1,1’-(偶氮二羰基)二哌啶(1.4g)后，在室温搅拌12小时、在50℃搅拌3小时。将不溶物滤除，将滤液减压浓缩。将残渣以硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到2-氯-5-[1-(3,5-二甲氧基苯基)乙氧基]嘧啶(415mg)。
制造例16
将3,5-二甲氧基安息香酸甲酯(1g)和乙腈(20mL)的混合物用冰冷却，添加N-氟-N’-(氯甲基)三乙二胺双(四氟硼酸盐)(4.09g)，在室温搅拌整夜。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤后，添加无水硫酸钠及碱性二氧化硅凝胶，搅拌30分钟后，过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣以硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷)纯化，分别得到2,6-二氟-3,5-二甲氧基安息香酸甲酯(292mg：制造例16-1)及2-氟-3,5-二甲氧基安息香酸甲酯(232mg：制造例16-2)。
制造例17
将2,6-二氟-3,5-二甲氧基安息香酸甲酯(10g)和四氢呋喃(50mL)的混合物用冰冷却，添加氢化硼锂(3.0M四氢呋喃溶液，43mL)后，在室温搅拌65小时。将反应混合物再度用冰冷却，进一步添加氢化硼锂(3.0M四氢呋喃溶液，14mL)，在室温搅拌22小时。将反应混合物用冰冷却，慢慢添加至冰水(300mL)中。进一步慢慢添加浓盐酸(25mL)，在室温搅拌1小时。以甲苯/乙酸乙酯(1：1)萃取，将有机层以饱和碳酸氢钠水溶液及饱和食盐水洗涤后，以无水硫酸钠干燥，过滤。将滤液减压浓缩，得到(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)甲醇(8.67g)。
制造例18
将(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)甲醇(1.71g)、三乙胺(2.57mL)及四氢呋喃(34mL)的混合物用冰冷却，添加甲磺酰氯(716μL)后，搅拌1小时。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和 食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，得到甲磺酸2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基酯(2.32g)。
制造例19
在2-氯-5-羟基嘧啶(4.38g)、碳酸钾(9.27g)及N,N-二甲基甲酰胺(79mL)的混合物中添加甲磺酸2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基酯(7.89g)后，在60℃搅拌1小时。在反应混合物中加水，滤取所产生的固体，用水洗涤后，减压干燥，得到2-氯-5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶(8.53g)。
制造例20
将2,3,5,6-四氟吡啶(1.5g)和甲醇(15mL)的混合物用冰冷却，添加甲醇钠(4.03g)后，在室温搅拌2小时、在50℃搅拌整夜。在反应混合物中加水，以二乙基醚萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，得到3,5-二氟-2,6-二甲氧基吡啶(l.47g)。
制造例21
将二异丙基胺(745μL)和四氢呋喃(5mL)的混合物冷却至-78℃，添加n-丁基锂(1.6M己烷溶液，3.02mL)后，在0℃搅拌30分钟。将反应混合物冷却至-78℃，滴入3,5-二氟-2,6-二甲氧基吡啶(770mg)和四氢呋喃(5mL)的混合物，搅拌1小时。添加N,N-二甲基甲酰胺(440μL)后，升温至室温，搅拌1小时。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将残渣以硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到3,5-二氟-2,6-二甲氧基异烟醛(406mg)。
制造例22
将3,5-二氟-2,6-二甲氧基异烟醛(400mg)和甲醇(4mL)的混合物用冰冷却，添加硼氢化钠(82mg)，搅拌1小时。在反应混合物中添加1M盐酸，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液浓缩，得到(3,5-二氟-2,6-二甲氧基吡啶-4-基)甲醇(403mg)。
制造例23
在氩气氛下，在2-氯-5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶(235mg)、4-(4-氨基-3-甲氧基苯基)哌啶-1-羧酸tert-丁基酯(306mg)、1,1’-联萘-2,2'-二基双(二苯基膦)(138mg)、碳酸铯(660mg)及二噁烷(10mL)的混合物中，在室温添加乙酸钯(30mg)，在100℃搅拌3小时。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到4-[4-({5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-3-甲氧基苯基]哌啶-1-羧酸tert-丁基酯(298mg)。
制造例24
在2-氟-5-硝基甲苯(500mg)、碳酸钾(2.0g)及N,N-二甲基甲酰胺(15mL)的混合物中添加4-哌啶-4-基硫代吗啉1,1-二氧化双三氟乙酸盐(2.16g)，在80℃搅拌20小时。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化，得到4-[1-(2-甲基-4-硝基苯基)哌啶-4-基]硫代吗啉1,1-二氧化物(870mg)。
制造例25
在氩气氛下，在4-[1-(2-甲基-4-硝基苯基)哌啶-4-基]硫代吗啉1,1-二氧化物(1.5g)和乙酸(30mL)的混合物中添加10％钯-碳(452mg)。在氢气氛下搅拌13小时后，以硅藻土过滤去除不溶物。将滤液减压浓缩后，在残渣中添加饱和碳酸氢钠水溶液。滤取析出的固体，用水洗涤后，减压干燥，得到4-[4-(1,1-二氧化硫代吗啉-4-基)哌啶-1-基]-3-甲基苯胺(1.26g)。
制造例26
在1-氯-2-(二氟甲氧基)-4-硝基苯(920mg)、碳酸钾(l.7g)及N,N-二甲基甲酰胺(10mL)的混合物中添加1-甲基-4-哌啶-4-基哌嗪(1.13g)，在100℃搅拌整夜。将反应混合物减压浓缩，在残渣中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇/浓氨水)纯化，得到1-{1-[2-(二氟甲氧基)-4-硝基苯基]哌啶-4-基}-4-甲基哌嗪 (1.38g)。
制造例27
在氩气氛下，在1-{1-[2-(二氟甲氧基)-4-硝基苯基]哌啶-4-基}-4-甲基哌嗪(1.38g)和乙醇(54mL)的混合物中添加10％钯-碳(397mg)。在氢气氛下搅拌1小时后，以硅藻土过滤去除不溶物。将滤液减压浓缩，得到3-(二氟甲氧基)-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯胺(1.25g)。
制造例28
将哌嗪-1-羧酸苄基酯(10g)、2,2,6,6-四甲基哌啶-4-酮(7.05g)及二氯甲烷(100mL)的混合物用冰冷却，添加三乙酰氧基硼氢化钠(11.5g)后，在室温搅拌整夜。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以氯仿萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以碱性硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到4-(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)哌嗪-1-羧酸苄基酯(7.18g)。
制造例29
在氩气氛下，在4-(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)哌嗪-1-羧酸苄基酯(7.18g)与乙醇(60mL)的混合物中，添加10％钯-碳(2.0g)。在氢气氛下搅拌7小时后，以硅藻土过滤去除不溶物。将滤液减压浓缩，得到1-(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)哌嗪(4.35g)。
制造例30
在氩气氛下，向2-氯-5-[(2,3,5,6-四氟苄基)氧基]嘧啶(202mg)、9-(4-氨基-2-甲氧基苯基)-3,9-二氮杂螺[5,5]十一烷-3-羧酸tert-丁基酯(311mg)、2-(二环己基膦基)-2’,4’,6’-三异丙基-1,1’-联苯(30mg)、碳酸钾(134mg)及tert-丁醇(10mL)的混合物中，于室温添加三(二亚苄基丙酮)二钯(19mg)，以100℃搅拌4小时。将不溶物滤除，以乙酸乙酯洗涤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到4-[4-({5-[(2,3,5,6-四氟苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-2-甲氧基苯基]-3,9-二氮杂螺[5,5]十一烷-3-羧酸tert-丁基酯(259mg)。
制造例31
在N-[3-(1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4,5]癸-8-基)苯基]-5-[(2,3,5,6-四 氟苄基)氧基]嘧啶-2-胺(596mg)、乙酸(9mL)及水(9mL)的混合物中添加浓盐酸(0.5mL)，在80℃搅拌7小时。将反应混合物用冰冷却，添加1M氢氧化钠水溶液(155mL)及饱和碳酸氢钠水溶液后，滤取生成的固体。添加氯仿，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，得到1-[3-({5-[(2,3,5,6-四氟苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)苯基]哌啶-4-酮(512mg)。
制造例32
将2-[3-({5-[(2,3,5,6-四氟苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙醇(116mg)、三乙胺(84μL)及四氢呋喃(4mL)的混合物用冰冷却，添加甲磺酰氯(47μL)后，搅拌3小时。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，得到甲磺酸2-[3-({5-[(2,3,5,6-四氟苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙基酯(l29mg)。
制造例33
将4-(4-硝基-1H-吡唑-1-基)哌啶(250mg)、1-甲基哌啶-4-酮(220μL)及二氯甲烷(5mL)的混合物用冰冷却，添加三乙酰氧基硼氢化钠(810mg)后，在室温搅拌4小时。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以氯仿萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇/浓氨水)纯化，得到1’-甲基-4-(4-硝基-1H-吡唑-1-基)-1,4’-联哌啶(342mg)。
制造例34
在1-(2-氯-4-硝基苯基)-4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪(3.7g)、氯化铵(352mg)、乙醇(94mL)、四氢呋喃(47mL)及水(47mL)的混合物中添加铁粉(3.06g)，在70℃搅拌4小时。将不溶物滤除后，将滤液减压浓缩。在残渣中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以乙酸乙酯萃取。将有机层以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，得到3-氯-4-[4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪-1-基]苯胺(1.03g)。
制造例35
在(3R,5S)-1-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3,5-二甲基哌嗪(3.0g)、N,N- 二异丙基乙胺(2.32mL)、二碳酸二-tert-丁基酯(2.71g)及二噁烷(20mL)的混合物中添加4-二甲基氨基吡啶(69mg)，以80℃搅拌整夜。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到(2R,6S)-4-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-2,6-二甲基哌嗪-1-羧酸tert-丁基酯(1.73g)。
制造例36
在2-(2-溴乙氧基)-1-氯-4-硝基苯(3.0g)、碳酸铯(5.23g)、N-甲基吡咯烷酮(30mL)的混合物中添加1H-吡唑(874mg)，在60℃搅拌6小时。在反应混合物中加水，滤取生成的固体。将固体用水洗涤，减压干燥，得到1-[2-(2-氯-5-硝基苯氧基)乙基]-1H-吡唑(2.57g)。
制造例37
在1-[2-(2-氯-5-硝基苯氧基)乙基]-1H-吡唑(l-3g)、碳酸铯(l.0g)、N-甲基吡咯烷酮(8mL)的混合物中添加顺-2,6-二甲基哌嗪(832mg)，在130℃搅拌整夜。在反应混合物中加水，滤取生成的固体。将固体用水洗涤，减压干燥，得到(3R,5S)-3,5-二甲基-l-{4-硝基-2-[2-(1H-吡唑-1-基)乙氧基]苯基}哌嗪(1.15g)。
制造例38
将2-氯-5-[(3,5-二甲氧基苄基)氧基]吡啶(500mg)和乙腈(10mL)的混合物用冰冷却，添加磺酰氯(297μL)，在室温搅拌3天。将反应混合物减压浓缩后，在残渣中添加饱和碳酸氢钠水溶液。滤取所产生的固体，用水洗涤后，减压干燥，得到2-氯-5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]吡啶(596mg)。
制造例39
在5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-2-胺(3.6g)和甲醇(20mL)的混合物中添加4M氯化氢/二噁烷溶液(40mL)，在室温搅拌6小时。将反应混合物减压浓缩后，在残渣中添加饱和碳酸氢钠水溶液。滤取所产生的固体，以二乙基醚洗涤后，减压干燥，得到5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-(1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺(2.9g)。
制造例40
在5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-(1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺(4.0g)、碳酸钾(4.6g)及N,N-二甲基甲酰胺(80mL)的混合物中添加溴乙酸乙酯(2.4mL)，在80℃搅拌3小时。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩后，将所得到的残渣以硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙酸乙酯(4.2g)。
制造例41
在5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-(1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺(50mg)、碳酸钾(57mg)及N,N-二甲基甲酰胺(1mL)的混合物中添加[(4R)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基]甲基4-甲基苯磺酸酯(98μL)，在60℃搅拌1小时、以110℃搅拌4天。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层用饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩后，将所得到的残渣以硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-(1-{[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基]甲基}-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺(45mg)。
制造例111
在4-硝基-1H-吡唑(500mg)、(3-内)-3-[(甲基磺酰基)氧基]-8-氮杂双环[3,2,1]辛烷-8-羧酸tert-丁基酯(1.35g)及N-甲基吡咯烷酮(6mL)的混合物中添加碳酸铯(2.16g)，在100℃搅拌6小时。在反应混合物中加水，滤取所产生的固体，用水洗涤后，减压干燥，得到(3-外)-3-(4-硝基-1H-吡唑-1-基)-8-氮杂双环[3,2,1]辛烷-8-羧酸tert-丁基酯(1.07g)。
制造例118
将4-硝基-1H-吡唑(3g)、奎宁-3-醇(4.05g)、三苯基膦(9.05g)及四氢呋喃(60mL)的混合物用冰冷却，添加偶氮二羧酸二异丙酯(6.84mL)后，在室温搅拌整夜。将反应混合物减压浓缩后，在残渣中添加1M盐酸(50mL)。将水层用乙酸乙酯洗涤后，添加1M氢氧 化钠水溶液溶液(60mL)，成为碱性。以氯仿萃取，将有机层以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣以碱性硅胶柱层析(乙酸乙酯)纯化，得到3-(4-硝基-1H-吡唑-1-基)奎宁(5.15g)。
制造例133
将(4-氨基-2-甲氧基苯基)[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基]氨基甲酸tert-丁基酯(1.21g)和四氢呋喃(24mL)的混合物用冰冷却，添加氢化锂铝(629mg)后，加热回流下搅拌1小时。在反应混合物中依次添加水(0.63mL)、1M氢氧化钠水溶液(0.63mL)及水(1.89mL)，通过硅藻土过滤来滤除不溶物后，将滤液以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣以碱性硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化，得到2-甲氧基-N1-甲基-N1-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基]苯-1,4-二胺(922mg)。
制造例138
在2-氯-5-硝基嘧啶(798mg)、碳酸钾(1.04g)及N,N-二甲基甲酰胺(16mL)的混合物中添加1-甲基-4-(哌啶-4-基)哌嗪(1.1g)，在室温搅拌3小时。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化，得到2-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]-5-硝基嘧啶(542mg)。
制造例143
在4-(2-氨基-1,3-噻唑-5-基)哌啶-1-羧酸tert-丁基酯(1.13g)和乙酸乙酯(8mL)的混合物中添加4M氯化氢/乙酸乙酯溶液(8mL)，在室温搅拌3小时。将溶剂减压浓缩，得到5-(哌啶-4-基)-1,3-噻唑-2-胺盐酸盐(877mg)。
制造例144
在5-(哌啶-4-基)-1,3-噻唑-2-胺盐酸盐(519mg)、二氯甲烷(5mL)及甲醇(5mL)的混合物中，依次添加1H-苯并三唑-1-基甲醇(423mg)、乙酸钠(388mg)及三乙酰氧基硼氢化钠(1.0g)，在室温搅拌2小时。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液及碱性二氧化硅凝胶后，将溶剂减压浓缩。将残渣以碱性硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化，得到5-(1- 甲基哌啶-4-基)-1,3-噻唑-2-胺(411mg)。
制造例145
将5-硝基吡啶-2(1H)-酮(700mg)、(R)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-甲醇(661mg)、三苯基膦(1.97g)及四氢呋喃(20mL)的混合物用冰冷却，添加偶氮二羧酸二异丙酯(1.49mL)后，在室温搅拌5小时。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣以硅胶柱层析(己烷/乙酸乙酯)纯化，得到(R)-2-[(2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲氧基]-5-硝基吡啶(541mg)。
制造例152
在(S)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-甲醇(661mg)和N,N-二甲基甲酰胺(23mL)的混合物中添加氢化钠(218mg)，在室温搅拌10分钟。在反应混合物中添加2-氯-5-硝基吡啶(793mg)，在室温搅拌2小时。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣以硅胶柱层析(己烷/乙酸乙酯)纯化，得到(S)-2-[(2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲氧基]-5-硝基吡啶(810mg)。
制造例162
在甲磺酸2-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙酯(320mg)和N-甲基吡咯烷酮(6mL)的混合物中添加哌嗪-1-羧酸tert-丁基酯(1.31g)，在80℃搅拌整夜，进一步在120℃搅拌整夜。在反应混合物中添加水和饱和碳酸氢钠水溶液，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化后，以乙酸乙酯/二异丙醚固化，得到4-{2-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙基}哌嗪-1-羧酸tert-丁基酯(202mg)。
制造例175
将5-甲基-1H-吡唑-3-胺(522mg)和N,N-二甲基甲酰胺(10mL)的混合物用冰冷却，添加氢化钠(473mg)后，搅拌30分钟。在反应混 合物中添加2-(2-溴乙氧基)四氢-2H-吡喃(893μL)，在室温搅拌12小时。在反应混合物中添加饱和氯化铵水溶液，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣以硅胶柱层析(己烷/乙酸乙酯)纯化，得到5-甲基-1-[2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙基]-1H-吡唑-3-胺(427mg：制造例175-1)及3-甲基-1-[2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙基]-1H-吡唑-5-胺(199mg：制造例175-2)。
制造例176
在5-[2-(苄基氧基)乙基]-3-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-1-甲基-1H-吡唑(640mg)和乙醇(9.7mL)的混合物中，依次添加羟胺(1.37mL)及p-甲苯磺酸一水合物(1.95g)，在95℃搅拌整夜。将反应混合物减压浓缩后，在残渣中加水，以氯仿萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化，得到5-[2-(苄基氧基)乙基]-1-甲基-1H-吡唑-3-胺(470mg)。
制造例183
在(1-甲基-3-硝基-1H-吡唑-5-基)甲醇(398mg)、3,4-二氢-2H-吡喃(459μL)及乙酸乙酯(8mL)的混合物中，添加p-甲苯磺酸一水合物(96mg)，在室温搅拌1.5小时。进一步添加3,4-二氢-2H-吡喃(459μL)及p-甲苯磺酸一水合物(96mg)，在室温搅拌1.5小时。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣以硅胶柱层析(己烷/乙酸乙酯)纯化，得到1-甲基-3-硝基-5-[(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)甲基]-1H-吡唑(487mg)。
制造例186
将4-硝基-1H-吡唑(300mg)、2-苯基-1,3-二噁烷-5-醇(717mg)、三苯基膦(1.11g)以及四氢呋喃(4.5mL)的混合物用冰冷却，添加偶氮二羧酸二异丙酯(842μL)后，在室温搅拌12小时。将反应混合物减压浓缩后，将残渣以硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到4-硝基-1-(2-苯基-1，3-二噁烷-5-基)-1H-吡唑(121mg)。
制造例189
在5-硝基吡啶-2-甲醛(761mg)、2-(哌嗪-1-基)乙醇(1.23mL)、乙酸(570μL)及二氯甲烷(20mL)的混合物中添加三乙酰氧基硼氢化钠(2.23g)，在室温搅拌16小时。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以氯仿/2-丙醇萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化，得到2-{4-[(5-硝基吡啶-2-基)甲基]哌嗪-l-基}乙醇(726mg)。
制造例191
在甲基5-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-羧酸酯(871mg)、乙醇(8.7mL)及四氢呋喃(8.7mL)的混合物中，添加1M氢氧化钠水溶液(3.45mL)，在60℃搅拌2小时。在反应混合物中添加1M盐酸，滤取所产生的固体，用水洗涤后，减压干燥，得到5-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-羧酸(846mg)。
制造例193
将5-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-羧酸(300mg)和二噁烷(8.5mL)的混合物用冰冷却，添加1,1’-羰基二咪唑(99mg)后，在室温搅拌2小时、在60℃搅拌2小时。进一步添加1,1’-羰基二咪唑(99mg)，在60℃搅拌2小时。进一步添加1,1’-羰基二咪唑(297mg)，在室温搅拌1小时。将反应混合物用冰冷却，添加硼氢化钠(230mg)后，在室温搅拌12小时。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(己烷/乙酸乙酯)纯化，得到[5-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-基]甲醇(126mg)。
制造例201
在1-甲基-3-硝基-1H-吡唑-5-甲醛(850mg)和四氢呋喃(50mL)的 混合物中添加(三苯基正膦亚基)乙酸甲酯(3.66g)，在60℃搅拌3小时。将反应混合物减压浓缩后，在残渣中加水，以氯仿萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣以氯仿洗涤，滤取固体。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化后，与先前得到的固体合并，得到(E)-3-(1-甲基-3-硝基-1H-吡唑-5-基)丙烯酸甲酯(1.15g)。
制造例202
在氩气氛下，在(E)-3-(1-甲基-3-硝基-1H-吡唑-5-基)丙烯酸甲酯(1.15g)和乙醇(50mL)的混合物中添加10％钯-碳(580mg)。在氢气氛下，在1大气压搅拌12小时、在2.7大气压搅拌4小时后，以硅藻土过滤去除不溶物。将滤液减压浓缩，得到3-(3-氨基-1-甲基-1H-吡唑-5-基)丙酸甲酯(955mg)。
制造例204
在2-[(tert-丁氧基羰基)氨基]-1,3-噻唑-5-羧酸(500mg)、N-[3-(二乙基氨基)丙基]-N'-乙基碳二酰亚胺盐酸盐(589mg)、1H-苯并三唑-1-醇(415mg)及N,N-二甲基甲酰胺(10mL)的混合物中添加1-甲基哌嗪(451μL)，在室温搅拌3天。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化，得到{5-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1,3-噻唑-2-基}氨基甲酸tert-丁基酯(560mg)。
制造例205
将4-氨基吡啶-2(1H)-酮(400mg)和N-甲基吡咯烷酮(15mL)的混合物用冰冷却，添加氢化钠(218mg)后，在室温搅拌30分钟。在反应混合物中依次添加p-甲苯磺酸(S)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基甲酯(1.14g)及碘化钠(109mg)，在室温搅拌4小时。在反应混合物中添加氢化钠(218mg)后，在80℃搅拌整夜。在反应混合物中添加饱和氯化铵水溶液后，添加食盐使其饱和，以甲醇/氯仿萃取。将有机层以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以碱性硅胶柱层析(乙酸乙酯/甲醇)纯化，得到(R)-4-氨基-1-[(2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基]吡啶-2(1H)-酮(136mg)。
制造例209
将[5-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-基]甲醇(126mg)、三乙胺(147μL)、二氯甲烷(6mL)及四氢呋喃(6mL)的混合物用冰冷却，添加甲磺酰氯(82μL)后，在室温搅拌3小时。在反应混合物中添加N,N-二甲基甲酰胺(6mL)，在室温搅拌12小时。在反应混合物中加水，以氯仿萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，得到N-[3-(氯甲基)-1H-吡唑-5-基]-5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-胺(109mg)。
制造例210
在{5-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1,3-噻唑-2-基}氨基甲酸tert-丁基酯(560mg)和乙酸乙酯(8mL)的混合物中，添加4M氯化氢/乙酸乙酯溶液(8mL)，在室温搅拌3小时。将反应混合物减压浓缩后，将残渣以碱性硅胶柱层析(甲醇/氯仿)纯化，得到(2-氨基-1,3-噻唑-5-基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮(357mg)。
制造例211
在(5-硝基-1H-吡唑-3-基)甲醇(1.86g)、3，4-二氢-2H-吡喃(4.7mL)及乙腈(28mL)的混合物中添加三氟乙酸(40μL)，在70℃搅拌3小时。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(己烷/乙酸乙酯)纯化，得到5-硝基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-3-[(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)甲基]-1H-吡唑(3.98g)。
制造例214
将[5-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-3-基]甲醇(200mg)和1,2-二氯乙烷(12mL)的混合物用冰冷却，添加二氧化锰(442mg)，在室温搅拌30分钟后，在90℃搅拌2小时。将不溶物滤除后，将滤液减压浓缩，得到5-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-3-甲醛(142mg)。
制造例229
将2-氯-6-氟-3,5-二甲氧基安息香酸甲酯(682mg)和四氢呋喃(25mL)的混合物用冰冷却，添加氢化铝锂(104mg)后，在室温搅拌3小时。在反应混合物中，在用冰冷却下，添加二乙醚进行稀释后，添加饱和硫酸钠水溶液。将不溶物滤除，将滤液减压浓缩。将残渣以硅胶柱层析(己烷/乙酸乙酯)纯化，得到(2-氯-6-氟-3,5-二甲氧基苯基)甲醇(363mg)。
制造例232
在氩气氛下，在2-溴-5-硝基苯甲醚(3.15g)和3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛-2-烯-8-羧酸tert-丁基酯(5.00g)和二噁烷(40mL)的混合物中，依次添加[1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]钯二氯化物二氯甲烷络合物(554mg)、碳酸钾(2.81g)，在80℃搅拌21小时。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣以硅胶柱层析(己烷/乙酸乙酯)纯化，得到3-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛-2-烯-8-羧酸tert-丁基酯(2.78g)。
制造例252
将4,4-双(乙酰氧基甲基)-1,4’-联哌啶-1’-羧酸tert-丁基酯(712mg)和二氯甲烷(6mL)的混合物用冰冷却，添加三氟乙酸(3mL)后，在室温搅拌3小时。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以二氯甲烷萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，得到1,4’-联哌啶-4,4-二基双(亚甲基)二乙酸酯(529mg)。
制造例255
将4,4-双(羟基甲基)哌啶-1-羧酸tert-丁基酯(1.01g)、三乙胺(861μL)及二氯甲烷(10mL)的混合物用冰冷却，添加乙酸酐(950μL)后，搅拌2小时。在反应混合物中加水，以二氯甲烷萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣以硅胶柱层析(己烷/乙酸乙酯)纯化，得到4,4-双(乙酰氧基甲基)哌啶-1-羧酸tert-丁基酯(1.38g)。
制造例295
2-[3-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基]乙醇(630mg)、苄基溴化物(376μL)及四氢呋喃(8mL)的混合物用冰冷却后，添加氢化钠(173mg)，在室温搅拌6小时。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到5-[2-(苄基氧基)乙基]-3-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-1-甲基-1H-吡唑(640mg)。
制造例296
将3-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-1-甲基-1H-吡唑(2g)和四氢呋喃(60mL)的混合物冷却至-78℃后，添加n-丁基锂(1.6M己烷溶液，8.56mL)，搅拌2小时。在反应混合物中添加环氧乙烷(1.1M四氢呋喃溶液，15.6mL)及三氟化硼四氢呋喃络合物(1.51mL)，搅拌30分钟后，升温至室温，搅拌6小时。在反应混合物中添加饱和氯化铵水溶液，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到2-[3-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基]乙醇(630mg)。
以与上述所示制造例的制造方法同样的方式，制造后述表7～表62所示化合物。另外，各制造例化合物的制造法、构造及物理化学数据如表7～表62所示。
实施例1
在氩气氛下，在5-溴-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺(104mg)、1-乙炔基-3,5-二甲氧基苯(37mg)、四三苯基膦钯(13mg)、碘化铜(4mg)及N,N-二甲基甲酰胺(2mL)的混合物中，添加三乙胺(157μL)，在120℃搅拌30分钟。进一步添加1-乙炔基-3,5-二甲氧基苯(146mg)和N,N-二甲基甲酰胺(1mL)的混合物，在120℃搅拌2小时后，将反应混合物以乙酸乙酯稀释，以硅藻土过滤去除不溶物。将滤液减压浓缩后，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)、接着以碱性硅胶柱层析(乙酸乙酯/甲醇)纯化后，以乙酸乙酯固化，得到5-[(3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基 哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺(23mg)。
实施例2
在氩气氛下，在5-[(3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺(72mg)、甲醇(2mL)及四氢呋喃(2mL)的混合物中添加10％钯-碳(25mg)。在氢气氛下(3个大气压)搅拌4小时后，以硅藻土过滤去除不溶物。将滤液减压浓缩后，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化后，用二乙醚固化，得到5-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺(17mg)。
实施例3
在氩气氛下，在5-碘-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺(100mg)、2,4-二氯-3-乙炔基-1,5-二甲氧基苯(55mg)、四三苯基膦钯(23mg)、碘化铜(2mg)及N,N-二甲基甲酰胺(2mL)的混合物中添加N,N-二异丙基乙基胺(67μL)，在100℃搅拌4小时。将反应混合物以乙酸乙酯稀释，以硅藻土过滤去除不溶物。在滤液中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)、接着以碱性硅胶柱层析(乙酸乙酯/甲醇)纯化后，用乙酸乙酯固化，得到5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺(56mg)。
实施例4
在5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺(92mg)和乙酸乙酯(6mL)的混合物中添加4M氯化氢/乙酸乙酯溶液(1mL)，在室温搅拌4小时。滤取固体，减压干燥，得到5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺3盐酸盐(101mg)。
实施例5
将5-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺(131mg)和乙腈(1.3mL)的混合物用 冰冷却，添加磺酰氯(41μL)，在室温搅拌12小时。将反应混合物减压浓缩后，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化后，以二异丙醚洗涤，得到N-{2-氯-5-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}-5-[2-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)乙基]嘧啶-2-胺(29mg)。
实施例6
在氩气氛下，将5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪-1-基]苯基}嘧啶-2-胺(164mg)、4-甲基苯磺酰基酰肼(2.63g)及1,2-二甲氧基乙烷(3mL)的混合物在110℃搅拌，添加乙酸钠(1.16g)及水(1mL)的混合物。2小时后，添加4-甲基苯磺酰基酰肼(1.32g)后，进一步添加乙酸钠(581mg)和水(1mL)的混合物，在110℃搅拌2小时。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以氯仿萃取。将有机层以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以碱性硅胶柱层析(乙酸乙酯/甲醇/浓氨水)纯化后，以乙酸乙酯/二异丙醚固化，得到5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪-1-基]苯基}嘧啶-2-胺(114mg)。
实施例7
将5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]-N-[3-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺(100mg)、四氢呋喃(5mL)及甲醇(5mL)的混合物，使用H-Cube(注册商标)(10％钯-碳、0.5mL/min、50℃、1个大气压)进行反应。将反应混合物减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化后，以乙酸乙酯/二异丙醚固化，得到5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-[3-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺(29mg)。
实施例8
在乙基[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙酸酯(292mg)、四氢呋喃(6mL)及乙醇(6mL)的混合物中，在室温添加1M氢氧化钠水溶液溶液(1.3mL)，搅拌5小时。使用1M盐酸使反应混合物成为中性，滤取生成的固体。用水洗涤后，减压干燥，得到[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶 -2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙酸(267mg)。
实施例9
在氩气氛下，在2-氯-5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]嘧啶(56mg)、1-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-胺(48mg)、1,1’-联萘-2,2’-二基双(二苯基膦)(33mg)、碳酸铯(174mg)及二噁烷(2.2mL)的混合物中，在室温添加乙酸钯(8mg)，在100℃搅拌4小时。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化后，以乙酸乙酯/二异丙醚固化，得到5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-[1-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-2-胺(43mg)。
实施例10
在1-(溴甲基)-2,6-二氟苯(14mg)、2-氯-5-羟基嘧啶(9.1mg)及N,N-二甲基甲酰胺(1mL)的混合物中添加碳酸钾(16mg)，在室温搅拌整夜。在反应混合物中加水，以氯仿萃取，将有机层减压浓缩。在残渣中添加3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯胺(30mg)、碳酸铯(65mg)、乙酸钯-X-Phos(Pd:P＝1:2)ChemDose(注册商标)片剂及tert-丁醇(0.5mL)的混合物，在氮气氛下，以120℃搅拌整夜。在反应混合物中加水，以氯仿萃取，将有机层减压浓缩。将残渣以HPLC(0.1％甲酸水溶液/甲醇)纯化，得到5-[(2,6-二氟苄基)氧基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺(17mg)。
实施例11
在5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-(1-{[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基]甲基}-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺(45mg)及四氢呋喃(2mL)的混合物中添加1M盐酸(1mL)，以50℃搅拌3小时。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以氯仿萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化后，以乙酸乙酯固化，得到(2S)-3-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨 基)-1H-吡唑-1-基]丙烷-1,2-二醇(27mg)。
实施例12
将4-[4-({5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-3-甲氧基苯基]哌啶-1-羧酸tert-丁基酯(298mg)和氯仿(6mL)的混合物用冰冷却，添加三氟乙酸(1mL)后，在室温搅拌4小时。将反应混合物用冰冷却，添加1M氢氧化钠水溶液(10mL)及饱和碳酸氢钠水溶液，成为碱性，以氯仿萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，得到粗生成物(273mg)。进一步将粗生成物(60mg)以硅胶柱层析(氯仿/甲醇/浓氨水)纯化后，以乙酸乙酯/二异丙醚固化，得到5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[2-甲氧基-4-(哌啶-4-基)苯基]嘧啶-2-胺(23mg)。
实施例13
在5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[2-甲氧基-4-(哌啶-4-基)苯基]嘧啶-2-胺(63mg)、二氯甲烷(2mL)及甲醇(1mL)的混合物中添加1H-苯并三唑-1-基甲醇(20mg)，在室温搅拌1小时后，添加三乙酰氧基硼氢化钠(51mg)，在室温搅拌2小时。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以氯仿萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇/浓氨水)纯化后，以乙酸乙酯/二异丙醚固化，得到5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[2-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基]嘧啶-2-胺(28mg)。
实施例14
在5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-2-胺(200mg)、乙醇(3mL)及N,N-二甲基甲酰胺(3mL)的混合物中添加2,2-二甲基环氧乙烷(112μL)，在室温搅拌整夜。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以碱性硅胶柱层析(乙酸乙酯)纯化后，以乙酸乙酯固化，得到1-{4-[4-({5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]哌啶-1-基}-2-甲基丙烷-2-醇(93mg)。
实施例15
将5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-2-胺(150mg)、三乙胺(131μL)及二氯甲烷(4mL)的混合物用冰冷却，添加环丙烷羰基氯化物(29μL)后，在室温搅拌整夜。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以氯仿萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以乙酸乙酯固化，得到环丙基{4-[4-({5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H吡唑-1-基]哌啶-l-基}甲酮(159mg)。
实施例16
在5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-2-胺(150mg)、碳酸钾(130mg)及N,N-二甲基甲酰胺(4mL)的混合物中，添加2-溴乙基甲基醚(32μL)后，在室温搅拌整夜、以60℃搅拌3小时。进一步添加2-溴乙基甲基酸(12μL)，以60℃搅拌4小时。在反应混合物中添加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以碱性硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷)纯化后，以乙酸乙酯固化，得到5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{1-[1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-2-胺(41mg)。
实施例17
在1-甲基-5-({5-[(2,3,5,6-四氟苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-3-羧酸乙基酯(663mg)、乙醇(6.6mL)及四氢呋喃(6.6mL)的混合物中添加1M氢氧化钠水溶液(3.2mL)，在室温搅拌4小时。在反应混合物中添加1M盐酸(3.2mL)，滤取所产生的固体，用水洗涤后，减压干燥，得到1-甲基-5-({5-[(2,3,5,6-四氟苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-3-羧酸(464mg)。
实施例18
在1-甲基-5-({5-[(2,3,56-四氟苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-3-羧酸(100mg)、1-甲基哌嗪(83μL)、1H-苯并三唑-1-醇(68mg)及N,N-二甲基甲酰胺(2mL)的混合物中，添加N-[3-(二乙基氨基)丙基]-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(97mg)，在室温搅拌整夜。在反应混合 物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇/浓氨水)纯化，得到(4-甲基哌嗪-1-基)[1-甲基-5-({5-[(2,3,5,6-四氟苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-3-基]甲酮(79mg)。
实施例19
将4-[4-({5-[(2,3,5,6-四氟苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-2-甲氧基苯基]-3,9-二氮杂螺[5,5]十一烷-3-羧酸tert-丁基酯(232mg)和二氯甲烷(3mL)的混合物用冰冷却，添加三氟乙酸(0.5mL)后，在室温搅拌1小时。将反应混合物减压浓缩后，在残渣中添加乙酸乙酯、饱和碳酸氢钠水溶液，滤取生成的固体。以乙酸乙酯洗涤后，减压干燥，得到N-[4-(3,9-二氮杂螺[5,5]十一烷-3-基)-3-甲氧基苯基]-5-[(2,3,5,6-四氟苄基)氧基]嘧啶-2-胺(167mg)。
实施例20
在甲磺酸2-[3-({5-[(2,3,5,6-四氟苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙基酯(160mg)和N-甲基吡咯烷酮(6mL)的混合物中，添加1-甲基哌嗪(382μL)，在80℃搅拌2小时。在反应混合物中添加水及饱和碳酸氢钠水溶液，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇/浓氨水)纯化后，以乙酸乙酯/二异丙醚固化，得到N-{1-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基]-1H-吡唑-3-基}-5-[(2,3,5,6-四氟苄基)氧基]嘧啶-2-胺(64mg)。
实施例21
将N-[3-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]-5-[(2,3,5,6-四氟苄基)氧基]嘧啶-2-胺(100mg)和氯仿(4mL)的混合物用冰冷却，添加m-氯代过苯甲酸(43mg)，于4～10℃搅拌3小时、室温搅拌2小时。在反应混合物中添加硫代硫酸钠水溶液，在室温搅拌1小时后、以氯仿萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以碱性硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化后，以乙酸乙酯/二异丙醚固化，得到N-[3-甲氧基-4-(4-甲基-4-氧化哌嗪-1-基)苯 基]-5-[(2,3,5,6-四氟苄基)氧基]嘧啶-2-胺(16mg)。
实施例22
在氩气氛下，在2-氯-5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]吡啶(100mg)、3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯胺(87mg)、2-(二环己基膦基)-2’,4’,6’-三异丙基-1,1’-联苯(27mg)、tert-丁醇钠(41mg)及N-甲基吡咯烷酮(3mL)的混合物中，添加乙酸钯(6.4mg)，在微波照射下、在160℃搅拌2小时。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以碱性硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化，得到5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}吡啶-2-胺(27mg)。
实施例23
将5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-(1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺(200mg)、碳酸铯(215mg)、(2S)-2-甲基环氧乙烷(128mg)及N-甲基吡咯烷酮(4mL)的混合物，在微波照射下，在130℃搅拌30分钟。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥后过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷)纯化后，以乙酸乙酯/二异丙醚洗涤，得到(2S)-1-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]丙烷-2-醇(171mg)。
实施例24
在[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙酸(50mg)、氯化铵(25mg)、三乙胺(66μL)、1H-苯并三唑-1-醇(32mg)及N,N-二甲基甲酰胺(1mL)的混合物中，添加N-[3-(二乙基氨基)丙基]-N’-乙基碳二酰亚胺盐酸盐(45mg)，在室温搅拌12小时。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层减压浓缩，将残渣以二异丙醚固化，得到2-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙酰胺(48mg)。
实施例64
在5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[2-甲氧基-4-(哌啶-4- 基)苯基]嘧啶-2-胺(62mg)、丙酮(118μL)及二氯甲烷(3mL)的混合物中，添加三乙酰氧基硼氢化钠(5l mg)，在室温搅拌整夜。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以氯仿萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇/浓氨水)纯化后，以乙酸乙酯/二异丙醚固化，得到5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[4-(1-异丙基哌啶-4-基)-2-甲氧基苯基]嘧啶-2-胺(14mg)。
实施例106
在5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{4-(哌嗪-1-基)-3-[2-(1H-吡唑-1-基)乙氧基]苯基}嘧啶-2-胺(229mg)、甲醛溶液(37％，164μL)、乙酸(231μL)及二氯甲烷(6mL)的混合物中添加三乙酰氧基硼氢化钠(257mg)，在室温搅拌整夜。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以氯仿萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以碱性硅胶柱层析(乙酸乙酯/甲醇)纯化后，以乙酸乙酯/二异丙醚固化，得到5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{4-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-[2-(1H-吡唑-1-基)乙氧基]苯基}嘧啶-2-胺(72mg)。
实施例120
在1-[3-({5-[(2,3,5,6-四氟苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)苯基]哌啶-4-酮(209mg)、1-甲基哌嗪(103μL)及二氯甲烷(4mL)的混合物中，添加三乙酰氧基硼氢化钠(298mg)，在室温搅拌整夜。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以氯仿萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇/浓氨水)纯化后，以乙酸乙酯/二异丙醚固化，得到N-{3-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}-5-[(2,3,5,6-四氟苄基)氧基]嘧啶-2-胺(98mg)。
实施例161
在5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[4-(哌啶-4-基)苯基]嘧啶-2-胺(52mg)、乙醇酸(26mg)、1H-苯并三唑-1-醇(31mg)及N,N-二甲基甲酰胺(1mL)的混合物中添加N-[3-(二乙基氨基)丙基]-N’-乙 基碳二酰亚胺盐酸盐(44mg)，在室温搅拌2天。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化后，以乙酸乙酯/二异丙醚固化，得到1-{4-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)苯基]哌啶-l-基}-2-羟基乙酮(10mg)。
实施例162
在5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺(123mg)与乙醇(3mL)的混合物中，添加富马酸(26mg)后，加热回流。在反应混合物中加水，在室温搅拌整夜后、滤取生成的固体。以乙醇洗涤后，减压干燥，得到5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺半富马酸盐(82mg)。
实施例166
在4-[4-({5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]哌啶-1-羧酸tert-丁基酯(276mg)和乙酸乙酯(2mL)的混合物中，添加4M氯化氢/乙酸乙酯溶液(2mL)，在室温搅拌3小时。将反应混合物减压浓缩后，在残渣中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以碱性硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化后，以乙酸乙酯/二异丙醚固化，得到5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-[1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-2-胺(119mg)。
实施例190
在{2-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙基}氨基甲酸tert-丁基酯(101mg)与乙酸乙酯(2mL)的混合物中，添加4M氯化氢/乙酸乙酯溶液(2mL)，在室温搅拌3小时。滤取生成的固体后，减压干燥，得到N-[1-(2-氨基乙基)-1H-吡唑-4-基]-5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-胺3盐酸盐(100mg)。
实施例212
在5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{1-[3-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)丙基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-2-胺(1.6g)、四氢呋喃(6.9mL)及水(3.4mL)的混合物中，添加乙酸(13.8mL)，在70℃搅拌2天。将反应混合物减压浓缩后，在残渣中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以氯仿萃取。将有机层以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣溶解于甲醇(30mL)。添加碳酸钾(656mg)，在60℃搅拌5小时。在反应混合物中加水，以氯仿萃取。将有机层以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，得到3-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]丙烷-1-醇(510mg)。
实施例213
在5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧代]-N-{6-[(2-苯基-1,3-二噁烷-5-基)氧代]吡啶-3-基}嘧啶-2-胺(335mg)与乙酸(10mL)的混合物中添加水(2mL)，在60℃搅拌16小时。将溶剂减压浓缩，在残渣中添加饱和碳酸氢钠水溶液后，以氯仿萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化后，以乙酸乙酯固化，得到2-{[5-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧代]嘧啶-2-基}氨基)吡啶-2-基]氧代}丙烷-1,3-二醇(92mg)。
实施例214
在5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{6-[2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙氧基]吡啶-3-基}嘧啶-2-胺(1.49g)与甲醇(5mL)的混合物中，添加4M氯化氢/二噁烷溶液(5mL)，在室温搅拌2小时。将反应混合物减压浓缩后，在残渣中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以氯仿萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以乙酸乙酯固化后，滤取固体，得到2-{[5-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)吡啶-2-基]氧基}乙醇(452mg)。进一步将滤液用硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化，得到生成物(701mg)。
实施例217
在1-[5-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基) 吡啶-2-基]哌啶-4-酮(256mg)、2-氨基乙醇(131μL)、乙酸(200μL)及二氯甲烷(9.3mL)的混合物中添加三乙酰氧基硼氢化钠(243mg)，在室温搅拌整夜。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以氯仿/2-丙醇萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以碱性硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化后，以乙酸乙酯固化，得到2-({1-[5-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)吡啶-2-基]哌啶-4-基}氨基)乙醇(137mg)。
实施例239
将N-{5-[2-(苄基氧基)乙基]-1-甲基-1H-吡唑-3-基}-5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-胺(283mg)和二氯甲烷(47mL)的混合物冷却至-78℃，添加三溴化硼(1.0M二氯甲烷溶液、830μL)后，在-78℃搅拌1小时、在0℃搅拌1小时。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以氯仿萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化，得到2-[3-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基]乙醇(38mg)。
实施例246
将5-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1-甲基-1H-吡唑-3-羧酸(320mg)和二噁烷(6mL)的混合物用冰冷却，添加1,1’-羰基二咪唑(616mg)后，在室温搅拌2小时。在反应混合物中添加硼氢化钠(287mg)，在室温搅拌12小时。在反应混合物中添加水与氯仿，将不溶物以硅藻土过滤去除后，以氯仿萃取滤液。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(己烷/乙酸乙酯)纯化，得到[5-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1-甲基-1H-吡唑-3-基]甲醇(125mg)。
实施例253
在5-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1-(2-羟基乙基)吡啶-2(1H)-酮(90mg)、三乙胺(50μL)及二氯甲烷(3mL)的混合物中添加甲磺酰氯(20μL)，在室温搅拌1小时。在反应 混合物中添加1-甲基哌嗪(50μL)及N,N-二甲基甲酰胺(3mL)后，以50℃搅拌20小时。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以碱性硅胶柱层析(乙酸乙酯/氯仿)纯化后，以二乙醚固化，得到5-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基]吡啶-2(1H)-酮(28mg)。
实施例254
在氩气氛下，在2-氯-5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶(270mg)、1-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-咪唑-4-胺(231mg)、1,1’-联萘-2,2'-二基双(二苯基膦)(80mg)、碳酸铯(556mg)及二噁烷(5.4mL)的混合物中，添加乙酸钯(19mg)，在微波照射下、在150℃下搅拌30分钟。在反应混合物中加水，以氯仿萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化后，以乙醇/二乙醚固化，得到5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[1-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-咪唑-4-基]嘧啶-2-胺(241mg)。
实施例278
在氩气氛下、在2-氯-5-[(2-氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶(200mg)、2-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)乙醇(170mg)、4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基氧杂蒽(39mg)、碳酸铯(655mg)及二噁烷(4mL)的混合物中，添加三(二亚苄基丙酮)二钯(31mg)，在80℃搅拌整夜。在反应混合物中加水，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以碱性硅胶柱层析(乙酸乙酯/甲醇)纯化后，以乙醇固化，得到2-[4-({5-[(2-氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙醇(58mg)。
实施例282
在5-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-3-甲醛(100mg)、吗啉(67μL)及N,N-二甲基甲酰胺(2mL)的混合物中，添加三乙酰氧基硼氢化钠(243mg)，在室温搅拌12小时。在反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，以氯仿萃取。将有机 层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以碱性硅胶柱层析(氯仿/甲醇)及硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化后，以乙醇/二异丙醚固化，得到5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[3-(吗啉-4-基甲基)-1H-吡唑-5-基]嘧啶-2-胺(42mg)。
实施例286
在氩气氛下，在2-氯-5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶(159mg)、3-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)苯胺(100mg)及tert-丁醇(5mL)的混合物中，添加三(二亚苄基丙酮)二钯(13mg)、2-(二环己基膦基)-2’,4’,6’-三异丙基-1,1’-联苯(20mg)及碳酸钾(88mg)，在100℃搅拌8小时。将不溶物滤除，以乙酸乙酯洗涤后，将滤液减压浓缩。将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化，得到5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[3-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基]嘧啶-2-胺(35mg)。
实施例302
在甲磺酸2-{4-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)苯基]哌嗪-l-基}乙基酯(100mg)和甲醇(3mL)的混合物中，添加甲醇钠(25％甲醇溶液、3mL)，在微波照射下、在90℃搅拌15分钟。将反应混合物减压浓缩，在残渣中加水后，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化，得到5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{4-[4-(2-甲氧基乙基)哌嗪-1-基]苯基}嘧啶-2-胺(46mg)。
实施例315
在{1’-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-2-甲氧基苯基]-1,4’-联哌啶-4,4-二基}双(亚甲基)二乙酸酯(46mg)与甲醇(3mL)的混合物中，添加甲醇钠(25％甲醇溶液、0.2mL)，在室温搅拌14小时。将反应混合物减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化，得到{1’-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-2-甲氧基苯基]-1,4'-联哌啶-4,4-二基}二甲醇(34mg)。
实施例336
将4-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨 基)-2-氟苯基]丁酸乙酯(150mg)和四氢呋喃(3mL)的混合物用冰冷却，添加氢化铝锂(11mg)后，在室温搅拌3小时。在用冰冷却下，在反应混合物中添加二乙醚而稀释后，添加饱和硫酸钠水溶液。将不溶物滤除，将滤液减压浓缩。将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化，得到4-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-2-氟苯基]丁烷-1-醇(70mg)。
实施例349
将4-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-2-氟苯基]丁酸乙酯(150mg)和四氢呋喃(3mL)的混合物用冰冷却，添加甲基镁溴化物(1.0M四氢呋喃溶液，1.2mL)后，搅拌3小时。在反应混合物中添加饱和氯化铵水溶液后，以乙酸乙酯萃取。将有机层以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥后，过滤。将滤液减压浓缩，将残渣以硅胶柱层析(氯仿/甲醇)纯化，得到5-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-2-氟苯氧基]-2-甲基戊烷-2-醇(104mg)。
实施例356
在氮气氛下，在2-(4-氨基苯氧基)-2-甲基丙酸(14.6mg)、碳酸铯(49mg)、2-氯-5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶(15.8mg)及tert-丁醇(0.5mL)的混合物中，添加乙酸钯(II)-2-(二环己基膦基)-2’,4’,6’-三异丙基-l,1’-联苯(Pd:P 1:2)ChemDose(注册商标)片剂，在120℃搅拌整夜。在反应混合物中加水，以氯仿(2mL)萃取后，将溶剂减压浓缩。将所得的残渣以HPLC(0.1％甲酸水溶液/甲醇)纯化，得到2-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)苯氧基]-2-甲基丙酸(0.7mg)。
实施例375
在氮气氛下，在4-氨基-1-(1-tert-丁氧基羰基-氮杂环丁烷-3-基)-1H-吡唑(17.9mg)、碳酸铯(49mg)、2-氯-5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶(15.8mg)、tert-丁醇(0.34mL)及N,N-二甲基甲酰胺(0.16mL)的混合物中，添加乙酸钯(II)-2-(二环己基膦基)-2’,4',6'-三异丙基-1,1’-联苯(Pd:P 1:2)ChemDose(注册商标)片剂，在120℃搅拌整 夜。在反应混合物中加水，以氯仿(2mL)萃取后，将溶剂减压浓缩。在所得的残渣中添加乙醇(1mL)及4M氯化氢/乙酸乙酯溶液(0.5mL)，在室温搅拌整夜，将溶剂减压浓缩。将所得的残渣以HPLC(0.1％甲酸水溶液/甲醇)纯化，得到N-[1-(氮杂环丁烷-3-基)-1H-吡唑-4-基]-5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-胺(1.7mg)。
以与上述所示实施例的制造方法同样的方式，制造后述表63～表137所示化合物。另外，各实施例化合物的构造如表63～表137所示、各实施例化合物的制造法及物理化学数据如表138～表156所示。
[表7]
[表8]
[表9]
[表10]
[表11]
[表12]
[表13]
[表14]
[表15]
[表16]
[表17]
[表18]
[表19]
[表20]
[表21]
[表22]
[表23]
[表24]
[表25]
[表26]
[表27]
[表28]
[表29]
[表30]
[表31]
[表32]
[表33]
[表34]
[表35]
[表36]
[表37]
[表38]
[表39]
[表40]
[表41]
[表42]
[表43]
[表44]
[表45]
[表46]
[表47]
[表48]
[表49]
[表50]
[表51]
[表52]
[表53]
[表54]
[表55]
[表56]
[表57]
[表58]
[表59]
[表60]
[表61]
[表62]
[表63]
[表64]
[表65]
[表66]
[表67]
[表68]
[表69]
[表70]
[表71]
[表72]
[表73]
[表74]
[表75]
[表76]
[表77]
[表78]
[表79]
[表80]
[表81]
[表82]
[表83]
[表84]
[表85]
[表86]
[表87]
[表88]
[表89]
[表90]
[表91]
[表92]
[表93]
[表94]
[表95]
[表96]
[表97]
[表98]
[表99]
[表100]
[表101]
[表102]
[表103]
[表104]
[表105]
[表106]
[表107]
[表108]
[表109]
[表110]
[表111]
[表112]
[表113]
[表114]
[表115]
[表116]
[表117]
[表118]
[表119]
[表120]
[表121]
[表122]
[表123]
[表124]
[表125]
[表126]
[表127]
[表128]
[表129]
[表130]
[表131]
[表132]
[表133]
[表134]
[表135]
[表136]
[表137]
[表138]
[表139]
[表140]
[表141]
[表142]
[表143]
[表144]
[表145]
[表146]
[表147]
[表148]
Ex Syn DAT
123 9 ESI+：555
124 9 ESI+：531
125 20 ESI+：466
126 20 ESI+：453
127 9 APCI/ESI+：384
128 20 ESI+：453
129 9 ESI+：599
130 9 ESI+：603
131 120 ESI+：599
132 120 ESI+：613
133 120 ESI+：572
134 12 ESI+：505
135 9 ESI+：499
136 12 ESI+：423
137 12 ESI+：447
138 9 ESI+：573
139 9 ESI+：470
140 9 ESI+：505
141 120 ESI+：597
142 12 ESI+：458
143 12 ESI+：476
144 166+4 ESI+：514
145 12 ESI+：486
146 12 ESI+：457
147 13+4 ESI+：611
148 9+4 ESI+：583
149 9+4 ESI+：543
150 9+4 ESI+：557
151 13 ESI+：471
152 64 ESI+：554
153 9 ESI+：567
[表149]
Ex Syn DAT
154 9 ESI+：474
155 9 ESI+：487
157 15 ESI+：499
158 16 ESI+：501
159 64 ESI+：541
160 17 ESI+：422
161 161 ESI+：515
162 120+162 ESI+：555
165 9 ESI+：487
166 166 ESI+：445
167 18 ESI+：504
168 12+162 ESI+：473
169 18 ESI+：465
170 13+162 ESI+：487
171 9 ESI+：557
172 18 ESI+：491
173 20 ESI+：477
174 20 ESI+：504
175 23 ESI+：436
176 9 ESI+：461
177 9 ESI+：556
178 9 ESI+：488
[表150]
Ex Syn DAT
179 9 APCI/ESI+：487
180 18 ESI+：465
181 18 ESI+：509
182 9 ESI+：483
183 9 ESI+：570
184 23 ESI+：422
185 9 ESI+：556
186 17 ESI+：448
187 166 ESI+：458
188 16 ESI+：422
189 16 ESI+：378
190 190 APCI/ESI+：407
191 64 ESI+：555
192 106 ESI+：502
193 19 ESI+：571
194 12 ESI+：475
195 9 ESI+：586
196 18 ESI+：491
197 18 ESI+：491
198 18 ESI+：505
[表151]
Ex Syn DAT
199 18 ESI+：504
200 18 ESI+：518
201 11 ESI+：465
202 13 ESI+：489
203 20 ESI+：5014
204 20 ESI+：435
205 11 ESI+：465
206 20+4 ESI+：463
207 12+4 ESI+：476
208 9 ESI+：461
209 20 ESI+：504
210 20+162 ESI+：518
211 9 ESI+：448
212 212 ESI+：422
213 213 ESI+：465
214 214 ESI+：435
215 12 ESI+：461
216 120 ESI+：531
217 217 ESI+：517
218 17 ESI+：436
219 17 ESI+：450
220 17 ESI+：436
221 17 ESI+：450
222 18 ESI+：491
223 18 ESI+：505
224 18 ESI+：491
225 18 ESI+：505
226 13 ESI+：475
[表152]
[表153]
Ex Syn DAT
257 246 ESI+：436
258 24 ESI+：449
259 11 ESI+：465
260 11 ESI+：465
261 18 ESI+：505
262 18 ESI+：532
263 20 ESI+：476
264 254 ESI+：507
265 254 ESI+：507
266 18 ESI+：491
267 18 ESI+：463
268 18 ESI+：504
269 24 ESI+：407
270 214 APCI/ESI+：394
271 20 ESI+：504
272 20 ESI+：477
273 20 ESI+：461
274 20 ESI+：504
275 20 ESI+：504
276 20 ESI+：520
277 20 ESI+：477
278 278 ESI+：390
279 20 ESI+：490
280 282 ESI+：447
281 282+4 ESI+：490
282 282 ESI+：463
283 282 ESI+：490
284 282 ESI+：506
285 214 ESI+：490
286 286 ESI+：533
[表154]
[表155]
[表156]
Ex Syn DAT
350 18 ESI+：576
351 286 ESI+：473
352 286 ESI+：422
353 12 ESI+：531
354 64 ESI+：545
355 286 ESI+：597
356 356 ESI+：476
357 356 ESI+：446
358 356 ESI+：446
359 356 ESI+：460
360 356 ESI+：473
361 356 ESI+：486
362 356 ESI+：432
363 356 ESI+：418
364 356 ESI+：432
365 356 ESI+：418
366 356 ESI+：466
367 356 ESI+：478
368 356 ESI+：460
369 356 ESI+：466
370 356 ESI+：378
371 356 ESI+：444
372 356 ESI+：473
373 375 ESI+：459
374 375 ESI+：433
375 375 ESI+：419
376 356 ESI+：458
377 356 ESI+：447
378 356 ESI+：471
379 356 ESI+：490
380 356 ESI+：417
381 375 ESI+：403
382 356 ESI+：459
383 356 ESI+：501
384 356 ESI+：519
385 356 ESI+：477
386 356 ESI+：459
387 356 ESI+：476
388 286 ESI+：517
产业上的可利用性
本发明的式(I)化合物或其盐具有FGFR1、2和/或3抑制作用、特别是突变FGFR3抑制作用，可以作为FGFR1、2和/或3所相关的各种癌(例如肺癌或激素疗法抗性的乳癌、胃癌、三重阴性乳癌、子宫内膜癌及膀胱癌等)的治疗剂，特别是作为突变FGFR3阳性膀胱癌的治疗剂使用。
序列表独立文本
以下序列表的数字标题<223>中，记载有“Artificial Sequence”的说明。具体而言，序列表的序列编号7、8、17、20及21所示的各碱基序列是人工合成的引物序列。序列表的序列编号24所表示的碱基序列是人工合成的FLAG标签的序列。

Claims (10)

1.由以下所构成的组中选择的化合物或其盐：
5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-[3-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺、
(2S)-3-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]丙烷-1,2-二醇、
5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[2-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)乙基]-N-{3-氟-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[3-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[1-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{4-[(3R,5S)-3,5-二甲基哌嗪-1-基]-3-甲氧基苯基}嘧啶-2-胺、
N-[4-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一碳-3-基)-3-甲氧基苯基]-5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-胺、
2-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙醇、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{1-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基]-1H-吡唑-4-基}嘧啶-2-胺、
2-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]-1-(3-羟基氮杂环丁烷-1-基)乙酮、
(2R)-3-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]丙烷-1,2-二醇、
2-({1-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)苯基]哌啶-4-基}氨基)乙醇、
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{1-甲基-5-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-1H-吡唑-3-基}嘧啶-2-胺、以及
5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺。
2.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其中所述化合物为5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2-胺。
3.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其中所述化合物为2-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙醇。
4.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其中所述化合物为(2R)-3-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]丙烷-1,2-二醇。
5.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其中所述化合物为2-({1-[4-({5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]嘧啶-2-基}氨基)苯基]哌啶-4-基}氨基)乙醇。
6.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其中所述化合物为5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-{1-甲基-5-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-1H-吡唑-3-基}嘧啶-2-胺。
7.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其中所述化合物为5-[(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苄基)氧基]-N-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]嘧啶-2-胺。
8.一种医药组合物，其含有权利要求1-7中任意一项所述的化合物或其盐、以及制药学上容许的赋形剂。
9.根据权利要求8所述的医药组合物，其为突变FGFR3阳性癌的治疗用医药组合物。
10.权利要求1-7中任意一项所述的化合物或其盐在用于制造突变FGFR3阳性癌的治疗用医药组合物中的应用。
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