CN104212711A - 电子传感器及基于电子传感器的基因探测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测领域，公开了一种电子传感器及基于电子传感器的基因探测方法。在发明中，电子传感器包含ISFET，该ISFET的源极和漏极之间的纳米线沟道上刻蚀形成第一凹槽，该第一凹槽的底部或开有纳米孔，或放置化学分子，或开设纳米孔，并在纳米孔处放置化学分子，使得DNA分子不再是畅通无阻地从化学分子或纳米孔的一侧高速无控地滑到另一侧，只有在待测单链DNA和探测碱基配对成功后，才能通过化学分子往前挪动一个碱基，可以准确检测出探测碱基与待测单链DNA中的碱基配对过程，从而使基因探测结果更准确，精度更高，灵敏度更高。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种电子传感器及基于电子传感器的基因探测方法。
背景技术
随着科学技术的发展，脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，缩写为DNA）测序已成为全世界生物医药研究实验室的常规研究项目。带来这种现象的原因可能是由于测序技术的飞速发展，导致拥有测序设备的成本下降，也可能是由于进行测序所需要的生物化学品和其他必需品成本下降。基于所谓的第一代测序技术进行整体人类基因组测序的成本在2001年至2007年的下降率符合微电子学的摩尔定律。由图可知，下一代大规模并行测序技术在2005年进入应用阶段，导致成本下降率超过了摩尔定律几个数量级，但下降率自2012年以来基本持平。新一轮的技术革命在当时设定的目标是实现仅花费1000美元完成对整个人类基因组进行测序。然而，为了使基因组测序走出科研实验室，并渗透到医疗保健部门，对每个基因组的测序成本应该远远低于1000美元，因此，进一步发展测序技术是绝对必要的。
到目前为止，市售的测序技术几乎完全都是基于光学的荧光/化学标记法的。笨重的机器和冗长的操作时间，以及高昂的成本，是这一技术的主要缺点。由离子激流（Ion Torrent）公司于2010年12月进行商业化的半导体测序技术呈现出革命性的进步。半导体测序技术完全是基于硅微加工技术和微电子的，且无需标记和光学仪器。如图1所示是Ion Torrent系统的离子敏感场效应晶体管（ISFET）示意图（111为衬底，104为参考电极）。图中，磁珠101上承载了大量的（数量大于104至106）相同的单链DNA102，该磁珠放置在充满电解质的ISFET凹槽107内。该凹槽连接至以预设的顺序供给四种核苷酸（也称为“碱基”）的流体池，四种碱基分别是：腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T），不一定按A、C、G、T的顺序，但基本上每流中每一种类型出现一次。图中，未画出流体池，但画出了碱基进入ISFET凹槽107的方向103。当流体中的探测碱基与单链DNA上的待测碱基出现配对（即A-T或C-G结合，形成双链）时，将在流体中释放大量的氢离子。这将导致ISFET凹槽内电解质的酸碱（pH）值瞬间变化，并且更重要的是导致ISFET的堆叠栅极的上表面的氢离子浓度瞬间变化。而表面氢离子浓度变化将导致ISFET表面电势的变化，从而引起ISFET源极105和漏极106之间的沟道电流的变化。为了最大限度检测到这个变化，可以在堆叠栅极的表面涂覆对质子化/去质子化（或pH值改变）尤其敏感的金属或金属氧化物108。
Ion Torrent技术的最大优点在于它的成本极其低廉。经过几十年的飞速发展和巨大的投资，目前的半导体工厂的微芯片加工在费用和复杂性上都极具竞争力。片上芯片集成了Ion Torrent传感器阵列与各种电子电路，进行校准，噪声处理，数据管理等，使得这一新兴技术进一步降低了整体成本。
然而，Ion Torrent公司的芯片（到目前为止所有产品）存在一个缺陷，就是在测序中，通常会产生比光学方法更高的误码率。具体地说，Ion Torrent测序技术存在的两大主要缺陷是：
（一）单链DNA上出现大量重复碱基时，无法确定其重复长度的精确数字。例如，GGGGG（重复长度为5）与GGGGGG（重复长度为6），当出现类似重复时，预期可能产生更强的电信号，因为在单个流体中释放了更多的氢离子，导致了更大的pH值变化。但这种变化却难以确定是由于长重复序列引起的，还是由于使用了大量的相同单链DNA拷贝引起的。
（二）Ion Torrent技术的读取长度（即单链DNA的总碱基数）通常低于400个碱基对，比其他测序方法短。当对存在较多重复或有许多结构变异的DNA进行测序时，较长的读取长度是有利的。比如说，较长的测序读取长度对从头基因组的组装特别有益。
这些缺陷主要是由于平面ISFET相当差的灵敏度导致的，其根源在于平面ISFET的沟道上的锥截体微凹槽结构（如图1所示），因为其占支配地位的侧壁区域不是有效的检测区。因此，这样的设计应当可以进行改进，从而获得更好的灵敏度。此外，在每一颗磁珠上使用了大量的相同DNA的拷贝，使得释放的氢离子难以协调一致地改变表面电势，从而引起非线性问题，并难以区分长重复。凭直觉来说，用少量的DNA拷贝，甚至只使用一个，进行测序，是非常有利的，因为它不仅解决了非线性问题，也避免了因DNA扩增的聚合酶链反应（PCR）等引起的误测。事实上，可以去除费时的PCR步骤。
半导体测序技术被称为“2.5代”，而单个分子测序被认为是第三代。最有代表性的也许是使用纳米孔，包括基于石墨烯薄片的纳米孔，进行电子计数并确定碱基，从而进行直接测序，无需DNA扩增，荧光/化学标记或光学仪器。该装置的结构和工作原理很简单，如图2A和2B所示。当单链DNA电泳通过纳米孔时，特别是碱基通过纳米孔时，上、下电解液储液池之间的离子电流减小。可以通过记录这些离子电流变化，得到已通过的碱基数，并通过参考已知的碱基间距离，获取单链DNA的长度。
然而，使用纳米孔迄今为止主要用于测量DNA长度，可测长度达数千个碱基，而不是确定序列的顺序，因为由四种不同的碱基所产生的离子阻断电流的差别非常小。而且，离子电流本身非常低，在10-11至10-10安培（A）数量级，对其进行准确探测也非常困难。此外，纳米孔的形状和大小，DNA碱基相对于纳米孔的位置和方向，以及电解液储液池中的离子性质和离子强度，这些参数对其探测结果的影响也非常大。在碱基之间电子结构的细微差别用横向电子隧穿电流（如图2B所示，图中，201为隧道探针tunneling probe，202为背栅back gate）来度量也绝非易事。
发明内容
本发明的目的在于提供一种电子传感器及基于电子传感器的基因探测方法，使基因探测结果更准确，精度更高，灵敏度更高。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种电子传感器，包含离子敏感场效应晶体管ISFET，所述ISFET的源极和漏极之间的纳米线沟道上刻蚀形成一个第一凹槽；
所述第一凹槽的底部具有以下结构之一或组合：
所述第一凹槽的底部开有纳米孔、所述第一凹槽的底部放置有化学分子；
其中，所述化学分子用于控制基因的移动。
本发明还提供了一种基于上述电子传感器的基因探测方法，包含以下步骤：
将所述第一凹槽连接上电解质储液池；
在所述上电解质储液池中插入参考电极；
向所述上电解质储液池内投放待测单链DNA；
所述待测单链DNA在所述参考电极的偏置电压作用下，移动到所述第一凹槽底部；
向所述上电解质储液池供给探测碱基；其中，以预设的顺序供应四种碱基，每次向所述上电解质储液池供给一种碱基；并且，每次更换碱基之前，从所述上电解质储液池、所述第一凹槽中将前一种碱基冲洗出去；
探测碱基与所述单链DNA中的碱基配对成功后，所述待测单链DNA移动一个碱基；
检测所述纳米孔的离子电流被阻出现的电流峰或谷，测定所述待测单链DNA的长度或碱基数；其中，在所述碱基通过所述纳米孔时，所述纳米孔的离子电流被阻；
或者，在碱基配对过程中，向所述纳米碗内释放氢离子，检测所述ISFET的源极和漏极之间的电流变化。
与现有技术相比，本发明中ISFET的源极和漏极之间的纳米线沟道上刻蚀形成一个第一凹槽，该第一凹槽的底部或开有纳米孔，或放置化学分子，或开设纳米孔，并在纳米孔处放置化学分子，使得DNA分子不再是畅通无阻地从化学分子或纳米孔的一侧高速无控地滑到另一侧，只有在待测单链DNA和探测碱基配对成功后，才能通过化学分子往前挪动一个碱基，可以准确检测出探测碱基与待测单链DNA中的碱基配对过程，从而使基因探测结果更准确，精度更高，灵敏度更高。
另外，所述第一凹槽可以为纳米碗，在纳米碗底部放置有化学分子。
另外，所述第一凹槽可以为纳米碗，所述纳米碗的底部开有纳米孔，所述ISFET的衬底以所述纳米孔为中心开有第二凹槽。
另外，所述第一凹槽可以为纳米碗，所述纳米碗的底部开有纳米孔，所述ISFET的衬底以所述纳米孔为中心开有第二凹槽，并且所述纳米孔所在位置放置有化学分子；其中，所述化学分子只允许基因的双链部分从所述纳米孔一边向另一边移动。
另外，所述纳米碗的底部在所述纳米孔周围形成尖角knife-edge，以便更准确地检测纳米孔的横向电子隧穿电流
另外，所述纳米碗的高度和直径小于200纳米；或者，所述纳米碗的容积小于10-17升。纳米碗具有足够小的体积可以进一步使基因探测结果更准确，精度更高，灵敏度更高。
另外，所述纳米孔的直径小于10纳米，与基因的尺寸匹配，以便进行有效地探测。
另外，所述纳米碗的底部在所述纳米孔周围的厚度小于5纳米。
另外，所述纳米碗的内侧壁上涂覆离子敏感膜。所述离子敏感膜材料可以为金属或金属氧化物，这些离子敏感膜材料对氢离子比较敏感且吸附作用比较强，吸附浓度较高，灵敏度好，这样就使测量结果更加及时有效。
另外，所述离子敏感膜上可以结合有机离子基团。通过有机离子可以激活表面，使本实施方式的电子传感器对氢离子更敏感。
另外，所述化学分子为Phi29DNAP。
另外，所述第一凹槽可以为漏斗形；所述漏斗形底部开有纳米孔；并且所述第一凹槽底部在所述纳米孔周围形成尖角knife-edge。
另外，所述尖角所在位置放置有化学分子；其中，所述化学分子只允许基因的双链部分从所述纳米孔一边向另一边移动。
另外，在检测所述ISFET的源极和漏极之间的电流变化时，记录在电流发生变化时所供应的碱基类型。
另外，在检测出所述纳米孔的离子电流被阻出现的电流峰或谷时，记录在电流发生变化时所供应的碱基类型。
另外，在检测所述ISFET的源极和漏极之间的电流变化的步骤之后，还包含以下步骤：
根据碱基配对原则，将记录的碱基类型按顺序找出其互补碱基，得到所述待测单链DNA的碱基顺序；
其中，所述碱基配对原则为：腺嘌呤A与胸腺嘧啶T配对，鸟嘌呤G与胞嘧啶C配对。
另外，在得到所述待测单链DNA的碱基顺序的步骤之后，还包含以下步骤：
参考已知的碱基间距离，根据所述待测单链DNA的碱基顺序，获取所述待测单链DNA的长度。
另外，在检测所述ISFET的源极和漏极之间的电流变化的步骤中，还包含以下子步骤：
记录电流发生变化的次数；
待基因探测完毕之后，将所记录的电流发生变化的总次数作为所述待测单链DNA的碱基数。
另外，在向所述上电解质储液池内投放待测单链DNA的步骤中，每次仅投放一个待测单链DNA；
在向所述上电解质储液池供给碱基的步骤中，每次向所述上电解液储液池供给一个探测碱基。
通过每次供应一个探测碱基对单个单链DNA进行测序，其测序结果更准确。并且，由于每次只供应一个探测碱基，如果检测到的ISFET的源极和漏极之间的电流变化，那么，其结果只可能是供应的探测碱基与单链DNA中的碱基配对成功；而且通过Phi29DNAP的控制，即使出现单链DNA中的碱基重复，每次也只能与双链部分之后的一个碱基配对，因此，对长重复碱基，也可以准确地检测出来。
另外，在向所述上电解质储液池内投放待测单链DNA的步骤中，投放若干相同待测单链DNA的拷贝；
在向所述上电解质储液池供给碱基的步骤之前，判断所述相同待测单链DNA的拷贝是否均移动到所述第一凹槽的底部，若否，等待，直到所述相同待测单链DNA的拷贝均移动到所述第一凹槽的底部之后，再向所述上电解质储液池供给碱基；
在向所述上电解质储液池供给碱基的步骤中，每次向所述上电解质储液池供给若干探测碱基；其中，所述供给的碱基数大于或等于所述相同待测单链DNA的拷贝数。
通过多个探测碱基与多个相同待测单链DNA的拷贝中的碱基配对，可以使ISFET的源极和漏极之间的电流变化增大，或ISFET的源极和漏极之间的电流变化持续的时间增长，从而可以进一步使基因测序结果更准确。
附图说明
图1是现有技术中Ion Torrent系统的ISFET示意图；
图2A是现有技术中基于石墨烯薄片的纳米孔直接基因测序的结构示意图；
图2B是现有技术中基于石墨烯薄片的纳米孔直接基因测序的工作原理示意图；
图3是根据本发明第一实施方式中的电子传感器示意图；
图4是根据本发明第一实施方式中的电子传感器进行基因探测的系统示意图；
图5A是根据本发明第二实施方式中的电子传感器剖面示意图；
图5B是根据本发明第二实施方式中的电子传感器俯视图；
图6是根据本发明第二实施方式中的电子传感器进行基因长度和碱基数探测的系统示意图；
图7是根据本发明第二实施方式中的电子传感器进行基因测序的系统示意图；
图8是根据本发明第三实施方式中的电子传感器的一种结构示意图；
图9是根据本发明第三实施方式中的电子传感器的另一种结构示意图；
图10是根据本发明第三实施方式中的电子传感器进行基因测序的系统示意图；
图11是根据本发明第四实施方式中的基因探测方法所采用的基因探测系统示意图；
图12是是根据本发明第四实施方式中的基因探测方法的流程图；
图13是根据本发明第五实施方式中的基因探测方法所采用的基因探测系统示意图；
图14是是根据本发明第五实施方式中的基因探测方法的流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。
本发明的第一实施方式涉及一种电子传感器，如图3所示，该电子传感器包含离子敏感场效应晶体管（ISFET），其源极302和漏极303之间的纳米线沟道304上刻蚀形成一个第一凹槽，该第一凹槽的底部具有以下结构之一或组合：第一凹槽的底部开有纳米孔、第一凹槽的底部放置有化学分子；其中，化学分子用于控制基因的移动。也就是说，该第一凹槽的底部或开有纳米孔，或放置化学分子，或开设纳米孔，并在纳米孔处放置化学分子，使得DNA分子不再是畅通无阻地从化学分子或纳米孔的一侧高速无控地滑到另一侧，只有在待测单链DNA和探测碱基配对成功后，才能通过化学分子往前挪动一个碱基，可以准确检测出探测碱基与待测单链DNA中的碱基配对过程，从而使基因探测结果更准确，精度更高，灵敏度更高。
在本实施方式中，第一凹槽可以为纳米碗，该纳米碗的底部开有纳米孔306，ISFET的衬底301以纳米孔306为中心开有凹槽。
纳米碗的体积做得足够小，可以相对增加电解质内离子的浓度。比如，纳米碗的高度和直径小于200纳米，或者，纳米碗的容积小于10-17升。具体地说，人的正常血液pH值是7.4，对应于相当低的质子浓度，约每立方厘米24×1012，即在360nm边长的纳米立方体内只能找到1个质子。以纳米碗的高度和直径小于100纳米，或其容积小于10-18升（attolitre，即106立方纳米）为例来说，在如此小容积的纳米碗内虽然只有一个质子，但其对应的浓度几乎比人的正常血液中质子平均散布情况下增加50倍，相应地，在这样小的容积内产生一个质子将相应地使pH值从1.7变化至5.7，或使电势偏移110毫伏（mV），远远超过典型ISFET的分辨率极限（0.1-1mV）。因此，纳米碗具有足够小的体积可以进一步使基因探测结果更准确，精度更高，灵敏度更高。
本实施方式的电子传感器可称为“3NANO传感器”（简称3NANO），包含三个纳米级概念：纳米线、纳米碗和纳米孔。专门设计的SOI衬底具有SiO2/Si3N4/SiO2堆栈作为绝缘层（如图3中301），为后续制作纳米孔做好准备。表面硅层的厚度可以为200纳米，先制作和使用基于目前的ISFET制备工艺的纳米线ISFET，也可以采用新的电子束光刻（EBL）技术来制作纳米结构。宽50至300纳米的纳米线阵列可用于形成最优的纳米碗，而纳米碗的厚度（即纳米碗的高度）可以很容易地从表面硅层的厚度200nm调整得到。纳米线的掺杂类型和浓度也调整到最佳极性和偏压条件下。通过适当地设置电解液的栅极偏置电压，可以尽量使碱基配对过程中释放的氢离子向感测表面（即离子敏感膜305）移动，而不是向远离纳米碗的方向移动。
从上向下看时，纳米碗轮廓可以是圆形、椭圆形或几种不同的基本形状的组合，可以通过仿真选择出灵敏度最佳、可加工性最优的精确形状。纳米碗的内表面需要设计成镜面，以消除腐蚀损坏。可采用热氧化工艺形成具有最强稳定性的SiO2/silicon界面，其界面形态和热稳定性均较好，灵敏度高，并且噪声控制能力较强。离子敏感膜将被沉积的最上面一层，详见下文。此外，本实施方式的3NANO传感器具有优化的源极/漏极，绝缘层，钝化和金属接触区，以尽量减少外部干扰。
位于纳米碗底部的纳米孔可以通过在几纳米厚的氮化硅膜上，采用电子束光刻（EBL）方式自顶向下方法形成直径达到20纳米的纳米孔，也可以采用硬掩膜和共形薄膜沉积（例如原子层沉积ALD）组合起来形成直径小于10纳米的纳米孔。纳米孔的孔径大小可以通过ALD进一步减少，但纳米孔周围的有效膜厚度也是需要控制的，也就是说，纳米碗的底部在纳米孔边缘的厚度小于5纳米。因此，可根据需要控制ALD的次数，使纳米孔的孔径和纳米孔周围的膜厚度均调整到合适的取值。
纳米碗的内侧壁上可涂覆离子敏感膜。刻蚀在纳米线晶体管沟道内的纳米碗可注入电解质，这样的设计使得几乎整个纳米碗的内侧，除了纳米孔之外，包括竖直侧壁，均是感测表面。当然，也可以只在竖立侧壁上涂覆离子敏感膜，能达到一样的感测效果。应用本实施方式的电子传感器进行基因探测时，由于纳米碗的内侧壁上涂覆离子敏感膜，所以整个纳米碗的内侧壁均可用于检测氢离子浓度，使探测碱基与待测单链DNA中的碱基配对过程能够被准确地检测出来，从而使基因探测结果更准确，精度更高，灵敏度更高。
本实施例中的离子敏感膜的材料可以为金属或金属氧化物，目前较常见的金属有金、铂、钯等，较常见的金属氧化物有二氧化铪（HfO2）、二氧化钛（TiO2）、氧化铝（Al2O3）或五氧化钽（Ta2O5）等，这些离子敏感膜材料对氢离子比较敏感且吸附作用比较强，吸附浓度较高，灵敏度好，这样就使测量结果更加及时有效。该离子敏感膜可以通过热氧化、化学气相沉积或原子层沉积的方式把上述材料制成薄膜，这些方式相对来说都比较简单易行，对成膜设备要求也不高，能降低整个器件的制备成本。
此外，值得一提的是，离子敏感膜上还可以结合有机离子基团，比如氢氧根OH-离子、氢硫酸氢根SH-离子。这些有机离子可以激活表面，使本实施方式的电子传感器对氢离子更敏感。
此外，值得说明的是，在本实施方式中，半导体衬底可以是P型或N型，若半导体衬底是P型，则通过掺杂形成的就是N型的源极和漏极；若半导体衬底是N型，则通过掺杂形成的就是P型的源极和漏极。在图3中，用的是P型半导体衬底，通过掺杂形成N型的源极和漏极，并在源极和漏极形成了P型重掺杂（图中P+区域）。因为电子的迁移率远大于空穴的迁移率，因此用电子为多数载流子的N型掺杂做源极和漏极的话，通过电流能力要强得多；另外，从控制角度而言，N型ISFET可以用正电压开启，使用起来比较方便。
采用本实施方式的电子传感器进行基因探测的系统，其结构如图4所示，纳米孔所在位置放置有化学分子401，纳米碗连接上电解质储液池402，第二凹槽连接下电解质储液池403。
目前已经出现了一些技术，通过测量电子流通过集成了纳米孔的纳米线FET，采用与移位相关联的碱基计数改进可靠性。在该技术中，最关键的是如何通过纳米孔控制DNA移位的速率。利用光或命名为“Phi29的DNA聚合酶”（简称为Phi29DNAP）可以控制速率被证明是可行的。Phi29DNAP也被用在其它测序中，最出名的是在零模光波导（ZMW）技术中，成功地使用这种神奇的酶，控制在单个碱基水平的单链DNA运动，每一个成功的碱基配对导致单链DNA的一个碱基移动。也就是说，在纳米孔入口处加Phi29DNAP或类似的化学分子等，Phi29DNAP的存在使得DNA分子不再是畅通无阻地从纳米孔的一侧（图中纳米孔上方，上电解质储液池402一侧）高速无控地滑到另一侧（图中纳米孔下方，下电解质储液池403一侧）。在合理条件下，Phi29DNAP只让DNA的双链部分通过，也就是说，只有在待测单链DNA和流入的探测碱基A、G、C、T碱基配对成功后，DNA才能通过Phi29DNAP往下方挪动一个碱基。
应用上述原理，在进行基因测序时，向上电解质储液池中投放单链DNA，从流体池向上电解质储液池中供应探测碱基（用五角星标示），方向如图中404所示，探测碱基A、C、G、T与单链DNA中的碱基配对，配对成功后，原来的单链DNA成为双链的，在Phi29DNAP的控制下，向下电解质储液池移动一个碱基。在单链DNA中的每个碱基配对过程中，产生氢离子406，释放到纳米碗中，使纳米碗中电解质的pH值发生瞬时变化。在参考电极405的偏置电压作用下，氢离子向纳米碗的内壁移动（图中407所示方向），使ISFET的源极和漏极之间的沟道电流也随之发生瞬时变化，通过检测ISFET的源极和漏极之间的沟道电流变化，可以准确地获取碱基配对成功的时刻。简言之，用测通过纳米孔的离子电流被阻时（正好某个碱基通过纳米孔时）的变化（出现电流峰或谷）来测定DNA的长度或碱基数；或者，可通过对ISFET电子电流变化和流入探测碱基时序的同步处理，来确定DNA的顺序；也可通过对纳米孔离子电流变化和流入探测碱基时序的同步处理来确定DNA的顺序；后两者也可结合使用，可以提高测序的准确率（cross-check）。
此外，值得注意是，核糖核酸（RNA）由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、尿嘧啶（U），其中，U取代了DNA中的T。与上文中阐述的关于单链DNA探测类似，本实施方式的电子传感器也可用于对RNA进行探测，不同之处在于探测碱基类型为A、G、C、U，在纳米孔入口处放置与Phi29DNAP类似的化学分子，可以控制RNA从纳米孔一侧向另一侧的移动，对RNA进行长度、碱基数、顺序探测的原理与DNA类似，在此不一一赘述。
本发明第二实施方式涉及一种电子传感器，第二实施方式与第一实施方式大致相同，主要不同之处在于：在第一实施方式中，第一凹槽为纳米碗，在第二实施方式中，第一凹槽为漏斗形，漏斗形底部开有纳米孔，并且第一凹槽的底部在纳米孔周围形成尖角（knife-edge），其结构如图5A和5B所示，其中，图5A是本实施方式的ISFET的剖面示意图，图5B是本实施方式的ISFET的俯视图。
具体地说，本实施方式的ISFET将图2A中的Si3N4/SiO2纳米孔替换成了一个只有几纳米厚的尖角纳米孔ISFET，以便更准确地检测纳米孔的横向电子隧穿电流。采用图6所示系统，可以用测通过纳米孔的离子电流被阻时（正好某个碱基通过纳米孔时）的变化（出现电流峰或谷）来测定DNA的长度或碱基数。采用图7所示系统，在尖角所在位置放置有化学分子；该化学分子只允许基因的双链部分从纳米孔一边（图中所示上侧）向另一边（图中所示下侧）移动，可通过对ISFET电子电流变化和流入探测碱基时序的同步处理，来确定DNA的顺序；也可通过对纳米孔离子电流变化和流入探测碱基时序的同步处理来确定DNA的顺序；后两者也可结合使用，可以提高测序的准确率（cross-check）。其基本原理与第一实施方式类似，在此不再一一赘述。
本发明第二实施方式涉及一种电子传感器，第二实施方式与第一实施方式大致相同，主要不同之处在于：在第一实施方式中，第一凹槽为纳米碗，纳米碗底部开有纳米孔；在第二实施方式中，第一凹槽为纳米碗，但纳米碗底部不开纳米孔，直接放置化学分子，其结构如图8所示。具体地说，纳米碗的底部为堆叠结构，依次堆叠有绝缘层801、Si介质层802和离子敏感膜803；化学分子804放置在离子敏感膜上。
或者，第一凹槽为纳米碗，纳米碗底部开纳米孔，在纳米孔坐在位置放置化学分子，其结构如图9所示。图中，301为衬底，304为ISFET的源极302和漏极303之间的纳米沟道，401为化学分子。在本实施方式中，可以在纳米碗整个内壁涂覆离子敏感膜，也可以只在竖直侧壁涂覆离子敏感膜305。
采用本实施方式的电子传感器进行基因探测的系统如图10所示，在参考电极405作用下，投放到上电解质储液池中的待测单链DNA向纳米碗底部移动，向上电解质储液池中注入探测碱基（用五角星表示），探测碱基与待测单链DNA中的碱基配对成功时，向纳米碗中释放氢离子，使纳米碗中电解质的pH值发生瞬时变化。在参考电极的偏置电压作用下，氢离子向纳米碗的内壁移动，使ISFET的源极和漏极之间的沟道电流也随之发生瞬时变化，通过检测ISFET的源极和漏极之间的沟道电流变化，可以准确地获取碱基配对成功的时刻。其基本原理与第一实施方式类似，在此不再一一赘述。
本发明第三实施方式涉及一种基因探测方法，是基于第一实施方式的电子传感器的基因探测方法，具体进行单个单链DNA探测，其具体探测原理如图11所示，探测流程如图12所示。
具体地说，先将纳米碗连接上电解质储液池，凹槽连接下电解质储液池；在上电解质储液池和下电解质储液池的电解质之间加偏置电压，向上电解质储液池内投放待测单链DNA，每次仅投放一个待测单链DNA；该待测单链DNA在偏置电压的作用下，通过纳米孔，向下电解质储液池快速移动，在纳米孔处，被化学分子阻拦。
向上电解质储液池供给探测碱基，每次供给一个探测碱基；其中，以预设的顺序供应四种碱基，每次向上电解质储液池供给一种碱基，并且，每次更换碱基之前，从上电解质储液池、纳米碗、凹槽、下电解质储液池中将前一种碱基冲洗出去。
探测碱基与单链DNA中的碱基配对成功后，待测单链DNA向下电解质储液池移动一个碱基；
检测纳米孔的离子电流被阻出现的电流峰或谷，测定待测单链DNA的长度或碱基数；其中，在碱基通过纳米孔时，纳米孔的离子电流被阻。
在碱基配对过程中，会向纳米碗内释放氢离子，因此，可以检测ISFET的源极和漏极之间的电流变化，并记录在电流发生变化时所供应的碱基类型。或者，在检测出纳米孔的离子电流被阻出现的电流峰或谷时，记录在电流发生变化时所供应的碱基类型。然后，根据碱基配对原则，将记录的碱基类型按顺序找出其互补碱基，得到待测单链DNA的碱基顺序；其中，碱基配对原则为：腺嘌呤A与胸腺嘧啶T配对，鸟嘌呤G与胞嘧啶C配对。
此外，在得到待测单链DNA的碱基顺序之后，参考已知的碱基间距离，根据待测单链DNA的碱基顺序，可以获取待测单链DNA的长度。并且，在检测ISFET的源极和漏极之间的电流变化的过程中，还可以记录电流发生变化的次数；待基因探测完毕之后，将所记录的电流发生变化的总次数作为待测单链DNA的碱基数。
本实施方式通过每次供应一个探测碱基对单个单链DNA进行测序，其测序结果更准确。并且，由于每次只供应一个探测碱基，如果检测到的ISFET的源极和漏极之间的电流变化，那么，其结果只可能是供应的探测碱基与单链DNA中的碱基配对成功；而且通过Phi29DNAP的控制，即使出现单链DNA中的碱基重复，每次也只能与双链部分之后的一个碱基配对，因此，对长重复碱基，也可以准确地检测出来。
本发明第四实施方式涉及一种基因探测方法，是基于第一实施方式的电子传感器的基因探测方法，具体进行多个单链DNA探测，其具体探测原理如图13所示，探测流程如图14所示。
具体地说，先将纳米碗连接上电解质储液池，凹槽连接下电解质储液池，在上电解质储液池和下电解质储液池的电解质之间加偏置电压，向上电解质储液池内投放待测单链DNA，投放若干相同待测单链DNA的拷贝；该待测单链DNA在偏置电压的作用下，通过纳米孔，向下电解质储液池快速移动，在纳米孔处，被化学分子阻拦。
在向上电解质储液池供给碱基之前，判断相同待测单链DNA的拷贝是否均移动到纳米孔，若否，等待，直到相同待测单链DNA的拷贝均移动到纳米孔之后，再向上电解质储液池供给碱基。
向上电解质储液池供给探测碱基时，每次供给若干探测碱基；其中，以预设的顺序供应四种碱基，每次向上电解质储液池供给一种碱基，供给的碱基数大于或等于相同待测单链DNA的拷贝数。并且，每次更换碱基之前，从上电解质储液池、纳米碗、凹槽、下电解质储液池中将前一种碱基冲洗出去。
探测碱基与单链DNA中的碱基配对成功后，待测单链DNA向下电解质储液池移动一个碱基；检测纳米孔的离子电流被阻出现的电流峰或谷，测定待测单链DNA的长度或碱基数；其中，在碱基通过纳米孔时，纳米孔的离子电流被阻。
此外，与第三实施方式类似，也可以对待测单链DNA进行测序等探测，其工作原理类似，为避免重复，在此不再赘述。
在本实施方式中，由于多个探测碱基与多个相同待测单链DNA的拷贝中的碱基配对，因此，存在两种情况：
（1）多个探测碱基同时与单链DNA中的碱基配对，此时若配对成功，其产生的氢离子将比单个单链DNA时产生的氢离子多，那么ISFET的源极和漏极之间的电流变化也会增大，从而便于检测到这个电流变化，可以进一步使基因测序结果更准确。
（2）多个探测碱基不同时与单链DNA中的碱基配对，此时若配对成功，则会在一定时间内，持续产生氢离子，从而使ISFET的源极和漏极之间的电流变化持续的时间也更长，也有利于检测到这个电流变化，可以进一步使基因测序结果更准确。
上面各种方法的步骤划分，只是为了描述清楚，实现时可以合并为一个步骤或者对某些步骤进行拆分，分解为多个步骤，只要包含相同的逻辑关系，都在本专利的保护范围内；对算法中或者流程中添加无关紧要的修改或者引入无关紧要的设计，但不改变其算法和流程的核心设计都在该专利的保护范围内。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
Claims (24)
1.一种电子传感器，包括离子敏感场效应晶体管ISFET，其特征在于，所述ISFET的源极和漏极之间的纳米线沟道上刻蚀形成一个第一凹槽；
所述第一凹槽的底部具有以下结构之一或组合：
所述第一凹槽的底部开有纳米孔、所述第一凹槽的底部放置有化学分子；
其中，所述化学分子用于控制基因的移动。
2.根据权利要求1所述的电子传感器，其特征在于，所述第一凹槽为纳米碗。
3.根据权利要求2所述的电子传感器，其特征在于，所述纳米碗底部放置有所述化学分子。
4.根据权利要求2所述的电子传感器，其特征在于，所述纳米碗的底部开有纳米孔，所述ISFET的衬底以所述纳米孔为中心开有凹槽。
5.根据权利要求4所述的电子传感器，其特征在于，所述纳米孔所在位置放置有化学分子；其中，所述化学分子只允许基因的双链部分从所述纳米孔一边向另一边移动。
6.根据权利要求2所述的电子传感器，其特征在于，所述纳米碗的高度和直径小于200纳米；
或者，所述纳米碗的容积小于10-17升。
7.根据权利要求4所述的电子传感器，其特征在于，所述纳米孔的直径小于10纳米。
8.根据权利要求4所述的电子传感器，其特征在于，所述纳米碗的底部在所述纳米孔边缘的厚度小于5纳米。
9.根据权利要求2所述的电子传感器，其特征在于，所述纳米碗的内侧壁上涂覆离子敏感膜。
10.根据权利要求9所述的电子传感器，其特征在于，所述离子敏感膜的材料为金属或金属氧化物。
11.根据权利要求10所述的电子传感器，其特征在于，所述离子敏感膜上结合有机离子基团。
12.根据权利要求10所述的电子传感器，其特征在于，所述纳米碗的底部为堆叠结构，依次堆叠有绝缘层、Si介质层和离子敏感膜；
所述化学分子放置在所述离子敏感膜上。
13.根据权利要求1所述的电子传感器，其特征在于，所述化学分子为Phi29DNAP。
14.根据权利要求1所述的电子传感器，其特征在于，所述第一凹槽为漏斗形；所述漏斗形底部开有纳米孔；
所述第一凹槽底部在所述纳米孔周围形成尖角knife-edge。
15.根据权利要求14所述的电子传感器，其特征在于，所述尖角所在位置放置有化学分子；其中，所述化学分子只允许基因的双链部分从所述纳米孔一边向另一边移动。
16.根据权利要求1所述的电子传感器，其特征在于，所述纳米孔的材料为以下任意之一：
硅Si、氮化硅SiNx、氧化硅SiO2、金刚石、石墨烯graphene。
17.一种基于如权利要求1至16任一项所述的电子传感器的基因探测方法，其特征在于，包含以下步骤：
将所述第一凹槽连接上电解质储液池；
在所述上电解质储液池中插入参考电极；
向所述上电解质储液池内投放待测单链DNA；
所述待测单链DNA在所述参考电极的偏置电压作用下，移动到所述第一凹槽的底部；
向所述上电解质储液池供给探测碱基；其中，以预设的顺序供应四种碱基，每次向所述上电解质储液池供给一种碱基；并且，每次更换碱基之前，从所述上电解质储液池、所述第一凹槽中将前一种碱基冲洗出去；
探测碱基与所述单链DNA中的碱基配对成功后，所述待测单链DNA移动一个碱基；
检测所述纳米孔的离子电流被阻出现的电流峰或谷，测定所述待测单链DNA的长度或碱基数；其中，在所述碱基通过所述纳米孔时，所述纳米孔的离子电流被阻；
或者，在碱基配对过程中，向所述纳米碗内释放氢离子，检测所述ISFET的源极和漏极之间的电流变化。
18.根据权利要求17所述的基因探测方法，其特征在于，在检测所述ISFET的源极和漏极之间的电流变化时，记录在电流发生变化时所供应的碱基类型。
19.根据权利要求17所述的基因探测方法，其特征在于，在检测出所述纳米孔的离子电流被阻出现的电流峰或谷时，记录在电流发生变化时所供应的碱基类型。
20.根据权利要求18或19所述的基因探测方法，其特征在于，在检测所述ISFET的源极和漏极之间的电流变化的步骤之后，还包含以下步骤：
根据碱基配对原则，将记录的碱基类型按顺序找出其互补碱基，得到所述待测单链DNA的碱基顺序；
其中，所述碱基配对原则为：腺嘌呤A与胸腺嘧啶T配对，鸟嘌呤G与胞嘧啶C配对。
21.根据权利要求20所述的基因探测方法，其特征在于，在得到所述待测单链DNA的碱基顺序的步骤之后，还包含以下步骤：
参考已知的碱基间距离，根据所述待测单链DNA的碱基顺序，获取所述待测单链DNA的长度。
22.根据权利要求17所述的基因探测方法，其特征在于，在检测所述ISFET的源极和漏极之间的电流变化的步骤中，还包含以下子步骤：
记录电流发生变化的次数；
待基因探测完毕之后，将所记录的电流发生变化的总次数作为所述待测单链DNA的碱基数。
23.根据权利要求17所述的基因探测方法，其特征在于，在向所述上电解质储液池内投放待测单链DNA的步骤中，每次仅投放一个待测单链DNA；
在向所述上电解质储液池供给碱基的步骤中，每次向所述上电解液储液池供给一个探测碱基。
24.根据权利要求17所述的基因探测方法，其特征在于，在向所述上电解质储液池内投放待测单链DNA的步骤中，投放若干相同待测单链DNA的拷贝；
在向所述上电解质储液池供给碱基的步骤之前，判断所述相同待测单链DNA的拷贝是否均移动到所述第一凹槽的底部，若否，等待，直到所述相同待测单链DNA的拷贝均移动到所述第一凹槽的底部之后，再向所述上电解质储液池供给碱基；
在向所述上电解质储液池供给碱基的步骤中，每次向所述上电解质储液池供给若干探测碱基；其中，所述供给的碱基数大于或等于所述相同待测单链DNA的拷贝数。
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