CN104220601A - 经与碳储存相关的CoA 依赖性碳链延长制备6 碳化学品的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请描述了通过在C6脂族主链底物中形成两个末端官能团(包括羧基、胺或者羟基基团)制备己二酸、己内酰胺、6-氨基己酸、六亚甲基二胺或者1,6-己二醇的生物化学途径。本申请所述的这些途径、代谢工程和培养策略取决于与聚羟基烷酸酯累积细菌的碳储存途径相关的CoA依赖性延长酶或者类似的酶。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年12月16日提交的美国申请61/576,401的优先权。将该申请公开的全部内容通过引用的方式并入本申请。
技术领域
本发明涉及使用一种或者多种分离的酶如β-酮硫解酶、脱氢酶、还原酶、水合酶、单氧化酶、ω-羟化酶和转氨酶或者使用表达一种或者多种所述酶的重组宿主细胞生物合成己二酸、6-氨基己酸、六亚甲基二胺、己内酰胺和1,6-己二醇的方法。
背景技术
尼龙是聚酰胺，其通常通过二胺与二羧酸的缩聚合成。类似地，尼龙可通过内酰胺的缩聚制备。一种无处不在的尼龙是尼龙6,6，其通过六亚甲基二胺(HMD)和己二酸的反应制备。尼龙6通过己内酰胺的开环聚合制备。因此，己二酸、六亚甲基二胺和己内酰胺是尼龙制备中的重要中间体(Anton&Baird,Polyamides Fibers,Encyclopedia of Polymer Science and Technology,2001)。
在产业上，己二酸和己内酰胺经环己烷的空气氧化制备。环己烷的空气氧化在一系列步骤中产生环己酮(K)和环己醇(A)的混合物，其被指定为KA油。KA油的硝酸氧化产生己二酸(Musser,Adipic acid,Ullmann’s Encyclopediaof Industrial Chemistry,2000)。己内酰胺由环己酮经它的肟重排和随后的酸重排制备(Fuchs,Kieczka and Moran,Caprolactam,Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry,2000)。
在产业上，六亚甲基二胺(HMD)通过以下方法制备：将C6结构单元氢氰化成己二腈，然后氢化成HMD(Herzog and Smiley,Hexamethylenediamine,Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry,2012)。
鉴于对石油化学原料的依赖；生物技术提供可选择的经生物催化的途径。生物催化是使用生物催化剂如酶实施有机化合物的生物化学转换。
对于生物催化方法，生物衍生的原料和石油化学原料均为可行的起始原料。
从而，在这样的背景下，很明显，需要用于制备己二酸、己内酰胺、6-氨基己酸、六亚甲基二胺和1,6-己二醇的可持续的方法(下文称为“C6结构单元”)，其中所述方法是基于生物催化剂的(Jang et al.,Biotechnology&Bioengineering,2012,109(10),2437–2459)。
然而，没有野生型原核生物或者真核生物天然地向细胞外环境过度生成或者分泌C6结构单元。不过，己二酸和己内酰胺的代谢已有报道(Ramsay etal.,Appl.Environ.Microbiol.,1986,52(1),152–156；和Kulkarni和Kanekar,Current Microbiology,1998,37,191–194)。
该二羧酸，己二酸，被大量的细菌和酵母作为碳源经β-氧化有效地转化成中心代谢产物。己二酸β-氧化成3-氧代己二酸促进经例如与芳族底物降解相关的邻位裂解途径进一步代谢。已经充分表征了3-氧代己二酰基-CoA被数种细菌和真菌代谢成乙酰基-CoA和琥珀酰基-CoA(Harwood和Parales,Annual Review of Microbiology,1996,50,553–590)。己二酸和6-氨基己酸是己内酰胺代谢中的中间体，最后经3-氧代己二酰基-CoA降解成中心代谢产物。
已经提出了由生物质-糖制备己二酸的潜在的代谢途径：(1)以生物化学的方式经邻位裂解芳烃降解途径从葡萄糖转化成顺式,顺式-粘康酸，然后化学催化成己二酸；(2)经琥珀酰基-CoA和乙酰基-CoA的缩合的可逆的己二酸降解途径和(3)组合β-氧化、脂肪酸合成酶和ω-氧化。然而，没有报道过使用这些策略的信息(Jang et al.,Biotechnology&Bioengineering,2012,109(10),2437–2459)。
最优性原理指出，微生物调节它们的生物化学网络以支持最大生物质生长。除了在宿主生物体中表达异源性途径的需要之外，将碳通量引导至用作碳源而非用作生物质生长组分的C6结构单元与最优性原理矛盾。例如，与天然制造者的生产性能相比，将1-丁醇途径从梭菌属物种转移至其它生产菌株中经常下降一个数量级(Shen et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9),2905–2915)。
在C6脂族主链上形成末端官能团如羧基、胺或者羟基基团之前，六碳的脂族主链前体的有效合成是合成C6结构单元中的重要考虑因素。
发明内容
本申请至少部分地基于以下发现：可构建用于制备六碳的链式脂族主链前体的生物化学途径，在所述六碳的链式脂族主链前体中可形成两个官能团如羧基、胺或者羟基，导致合成以下物质中的一个或者多个：己二酸、6-氨基己酸、六亚甲基二胺、己内酰胺和1,6-己二醇(下文称为“C6结构单元”)。本申请所述的这些途径、代谢工程和培养策略依赖于与聚羟基烷酸酯累积细菌如钩虫贪铜菌的碳储存途径相关的CoA依赖性延长酶或者其类似物。
面对最优性原理，意料不到地发现，可将适当的非天然途径、原料、宿主微生物、对宿主的生物化学网络的弱化策略和培养策略组合起来，从而有效率地制备C6结构单元。
在一些实施方案中，用于转化成C6结构单元的C6脂族主链可由乙酰基-CoA经两个CoA依赖性碳链延长循环使用NADH或者NADPH依赖性酶形成。参见图1和图2。
在一些实施方案中，在产生C6脂族主链的CoA依赖性碳链延长途径中的酶催化不可逆酶促步骤。
在一些实施方案中，所述末端羧基基团可使用酰基-CoA水解酶、醛脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶或者细胞色素P450/ω-羟化酶酶促形成。参见图3和图4。
在一些实施方案中，所述末端胺基团可使用ω-转氨酶或者二胺转氨酶酶促形成。参见图5和图6。
在一些实施方案中，所述末端羟基基团可使用细胞色素P450、单氧化酶或者醇脱氢酶酶促形成。参见图7和图8。
在一个方面，本申请的特征在于生物合成一种或者多种产物的方法，所述产物选自己二酸、6-氨基己酸、六亚甲基二胺、己内酰胺和1,6-己二醇。所述方法包括酶促合成六碳的链式脂族主链(例如，己酰基-CoA)和在一个或者多个步骤中在主链中酶促形成两个选自羧基、胺和羟基基团的末端官能团，从而直接制备产物或者在随后的步骤中制备产物。所述两个末端官能团可相同或者可不同。
己酰基-CoA可由乙酰基-CoA经两个循环的CoA依赖性碳链延长使用NADH或者NADPH依赖性酶酶促合成。己酰基-CoA可通过以下方法形成：通过归类在EC 1.3.1.44、EC 1.3.1.38或者EC 1.3.1.8下的烯酰基-CoA还原酶如ter或者tdter的基因产物转化己-2-烯酰基-CoA。己-2-烯酰基-CoA可通过以下方法形成：通过归类在EC 4.2.1.17下的反式-2-烯酰基-CoA水合酶转化(S)3-羟基己酰基-CoA或者通过归类在EC 4.2.1.119下的反式-2-烯酰基-CoA水合酶转化(R)3-羟基己酰基-CoA。反式-2-烯酰基-CoA水合酶可为crt的基因产物。(S)3-羟基己酰基-CoA可通过以下方法形成：通过归类在EC1.1.1.35下的3-羟基酰基-CoA脱氢酶如由fadB编码的3-羟基酰基-CoA脱氢酶转化3-氧代己酰基-CoA。3-氧代己酰基-CoA可通过以下方法形成：通过归类在EC 2.3.1.16下的乙酰基-CoA C-酰基转移酶如由bktB编码的乙酰基-CoA C-酰基转移酶转化丁酰基-CoA。丁酰基-CoA可通过以下方法形成：通过归类在EC 1.3.1.44、EC 1.3.1.38或者EC 1.3.1.8下的烯酰基-CoA还原酶转化巴豆酰基-CoA。巴豆酰基-CoA可通过以下方法形成：通过归类在EC4.2.1.17下的反式-2-烯酰基-CoA水合酶转化(S)3-羟基丁酰基-CoA。(S)3-羟基丁酰基-CoA可通过以下方法形成：通过归类在EC 1.1.1.157下的3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶如由hbd编码的3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶转化乙酰乙酰基-CoA。乙酰乙酰基-CoA可通过以下方法形成：通过归类在EC 2.3.1.9下的乙酰基-CoA C-酰基转移酶如由atoB或者phaA编码的乙酰基-CoA C-酰基转移酶转化乙酰基-CoA。乙酰乙酰基-CoA可通过以下方法形成：通过归类在EC 2.3.1.194下的乙酰乙酰基-CoA合成酶转化丙二酸单酰基-CoA。丙二酸单酰基-CoA可通过以下方法形成：通过归类在EC 6.4.1.2下的乙酰基-CoA羧化酶转化乙酰基-CoA。反式-2-烯酰基-CoA水合酶可为phaJ的基因产物。
(R)3-羟基己酰基-CoA可通过以下方法形成：通过归类在EC 1.1.1.100下的3-氧代酰基-CoA还原酶如由fabG编码的3-氧代酰基-CoA还原酶转化3-氧代己酰基-CoA。巴豆酰基-CoA可通过以下方法形成：通过归类在EC4.2.1.119下的反式-2-烯酰基-CoA水合酶转化(R)3-羟基丁酰基-CoA。(R)3-羟基丁酰基-CoA可通过以下方法形成：通过归类在EC 1.1.1.36下的乙酰酰基-CoA还原酶如由phaB编码的乙酰酰基-CoA还原酶转化乙酰乙酰基-CoA。
在本申请所述的任何方法中，所述方法可包括通过以下方法产生己酸(hexanoate)：使用酰基-CoA水解酶和醛脱氢酶或者硫酯酶在己酰基CoA中形成第一末端羧基基团。酰基-CoA水解酶或者硫酯酶可由YciA、tesB或者Acot13编码。
己酸可通过以下方法产生：通过归类在EC 1.2.1.4下的醛脱氢酶在己醛中形成第一末端羧基基团。己醛可通过以下方法形成：通过归类在EC1.2.1.57下的丁醛脱氢酶转化己酰基-CoA。
在本申请所述的任何方法中，所述方法可包括使用一种或者多种酶促转化将己酸转化成己二酸、6-氨基己酸、六亚甲基二胺、ε己内酰胺或者1,6己二醇，其中所述酶促转化中的一种引入第二末端官能团。方法可包括使用细胞色素P450/ω-羟化酶如来自家族CYP153如CYP152A6的那些将己酸转化成6-羟基己酸。使用(i)醇脱氢酶如由YMR318C编码的那些、(ii)6-羟基己酸脱氢酶如由ChnD编码的那些，或者(iii)细胞色素P450/ω-羟化酶，可将6-羟基己酸转化成己二酸半醛。
在本申请所述的任何方法中，己二酸可通过以下方法产生：使用(i)归类在EC 1.2.1.3下的醛脱氢酶、(ii)归类在EC 1.2.1.63下的6-氧代己酸脱氢酶如由ChnE编码的那些或者iii)细胞色素P450/ω-羟化酶，在己二酸半醛中形成第二末端官能团。
在本申请所述的任何方法中，6-氨基己酸可通过以下方法产生：使用归类在EC 2.61.18、EC 2.6.1.19或者EC 2.6.1.48下的ω-转氨酶，在己二酸半醛中形成第二末端官能团。
在本申请所述的任何方法中，己内酰胺可由6-氨基己酸使用归类在EC3.5.2.-下的内酰胺酶产生。与己内酰胺有关的酰胺键是首先具有末端羧基基团和末端胺基团然后形成键的结果。使用归类在EC 1.2.99.6下的羧酸还原酶如连同npt的基因产物由car编码的那些，t或者由GriC&GriD编码的那些，可将6-氨基己酸转化成6-氨基己醛。
在本申请所述的任何方法中，六亚甲基二胺可通过以下方法产生：使用归类在EC 2.6.1.29或者EC 2.6.1.82下的二胺转氨酶，在6-氨基己醛中形成第二末端官能团。
在本申请所述的任何方法中，1,6己二醇可通过以下方法产生：使用归类在EC 1.1.1.-(1,2,21,184)下的醇脱氢酶在6-羟基己醛中形成第二末端官能团。
在一些实施方案中，所述生物原料为以下物质，包含以下物质，或者衍生自以下物质：单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素如γ-戊酮酸和糠醛、木质素、甘油三酯如甘油和脂肪酸、农业废物或者城市废物。
在一些实施方案中，所述非生物原料为或者衍生自：天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物(NVR)或者碱洗废物流。
在一些实施方案中，所述宿主微生物为原核生物。例如，所述原核生物可来自埃希氏菌属如大肠杆菌；来自梭状芽胞杆菌属如杨氏梭菌、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)或者克鲁佛梭菌；来自棒状杆菌属如谷氨酸棒状杆菌；来自贪铜菌属如钩虫贪铜菌或者耐金属贪铜菌(Cupriavidusmetallidurans)；来自假单胞菌属如荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌或者食油假单胞菌(Pseudomonas oleavorans)；来自代尔夫特菌属如食酸代尔夫特菌；来自芽孢杆菌属如枯草芽胞杆菌；来自乳杆菌属如德氏乳杆菌；或者来自乳球菌属如乳酸乳球菌。这种原核生物也可为用于构建本申请所述的能够产生C6结构单元的重组宿主细胞的基因来源。
在一些实施方案中，所述宿主微生物为真核生物(例如，真菌如酵母)。例如，真核生物可来自真菌曲霉菌属如黑曲霉菌；来自酵母菌属如酿酒酵母菌；来自毕赤氏酵母属如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；来自耶罗维亚酵母属如解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)；来自伊萨酵母属如东方伊萨酵母；来自德巴利酵母属如汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)；来自Arxula酵母属如Arxula adenoinivorans；或者来自克鲁维酵母菌属如乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis)。这种真核生物也可为用于构建本申请所述的能够产生C6结构单元的重组宿主细胞的基因来源。
在一些实施方案中，所述宿主微生物对高浓度的一种或者多种C6结构单元的耐受性通过在选择性环境中的连续培养而改善。
在一些实施方案中，将所述宿主微生物的生物化学网络弱化或者强化以(1)确保乙酰基-CoA的细胞内可用度，(2)创造NADH或者NADPH不平衡，其仅可经一种或者多种C6结构单元的形成来平衡，(3)防止降解导致和包含C6结构单元的中心代谢产物、中心前体和(4)确保来自细胞的有效外向通量。
在一些实施方案中，非循环培养策略用于实现缺氧的、微需氧的或者需氧的培养条件。
在一些实施方案中，循环培养策略用于在缺氧的和需氧的培养条件之间交替。
在一些实施方案中，所述培养策略包括限制养分，例如限制氮、磷酸盐(phosphate)或者氧。
在一些实施方案中，一种或者多种C6结构单元通过单一类型的微生物(例如，含有一种或者多种外源性核酸的重组宿主)，使用非循环或者循环发酵策略产生。
在一些实施方案中，一种或者多种C6结构单元通过以下方法产生：使用非循环或者循环发酵策略，共同培养超过一种类型的微生物，例如，两种或者更多种不同的重组宿主，每一宿主含有一组特定的外源性核酸。
在一些实施方案中，一种或者多种C6结构单元通过以下方法产生：连续发酵，其中将来自前发酵的肉汤或者离心滤液作为原料、中心代谢产物或者中心前体的来源供料至相继的发酵；最后产生C6结构单元。
本申请的特征还在于重组宿主，其包含至少一种外源性核酸，所述外源性核酸编码例如以下物质中的一种或者多种：甲酸脱氢酶、烯酰基-CoA还原酶、反式-2-烯酰基-CoA水合酶、3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶、乙酰基-CoAC-酰基转移酶、乙酰酰基-CoA还原酶、乙酰基-CoA合成酶、乙酰基-CoA羧化酶、苹果酸酶、吡啶(puridine)核苷酸转氢酶、甘油醛-3P-脱氢酶、酰基-CoA水解酶、醛脱氢酶、硫酯酶、细胞色素P450/ω-羟化酶、醇脱氢酶、6-羟基己酸脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶、二胺转氨酶、丙酰基-CoA合成酶和羧酸还原酶，其中所述宿主包含以下的一种或者多种缺乏，例如，6-磷酸葡萄糖异构酶、乙酸激酶、将丙酮酸降解至乳酸的酶、介导磷酸烯醇丙酮酸降解至琥珀酸的酶、醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、2-酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶、谷氨酸脱氢酶。
除非另外定义，本申请使用的所有技术和科学术语的定义与本发明所述领域的普通技术人员所通常理解的含义相同。下面描述适合的方法和材料，不过与本申请所述的方法和材料相似或者相同的方法和材料也可用于实践本发明。将本申请提及的所有公开、专利申请、专利和其它参考文献的全部内容通过引用的方式并入本申请。在冲突的情况下，以本发明说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例仅为说明性的并且不意图限制本发明。
本发明的一个或者多个实施方案的细节在附图和下面的描述中阐明。根据说明书和附图，并根据权利要求，本发明的其它特征、目的和优点将显而易见。根据专利法的标准实践，词语“包含”在权利要求中可被“基本上由…组成”或者“由…组成”替代。
附图说明
图1是示例性生物化学途径的示意图，其使用NADH依赖性酶导致己酰基-CoA并以乙酰基-CoA作为中心代谢产物。
图2是示例性生物化学途径的示意图，其使用NADPH依赖性酶导致己酰基-CoA并以乙酰基-CoA作为中心代谢产物。
图3是示例性生物化学途径的示意图，其使用己酰基-CoA作为中心代谢产物导致己酸。
图4是示例性生物化学途径的示意图，其使用己酸作为中心前体导致己二酸。
图5是示例性生物化学途径的示意图，其使用己酸作为中心前体导致6-氨基己酸。
图6是示例性生物化学途径的示意图，其使用6-氨基己酸作为中心前体导致六亚甲基二胺。
图7是示例性生物化学途径的示意图，其使用己酸作为中心前体导致6-羟基己酸。
图8是示例性生物化学途径的示意图，其使用6-羟基己酸作为中心前体导致1,6-己二醇。
具体实施方式
总的来说，本申请提供酶、非天然途径、培养策略、原料、宿主微生物和对宿主的生物化学网络的弱化，其从中心代谢产物产生六碳的链式脂族主链，在所述中心代谢产物中可形成两个末端官能团，从而合成己二酸、己内酰胺、6-氨基己酸、六亚甲基二胺或者1,6-己二醇(本申请中称为“C6结构单元”)。本申请使用的术语"中心前体"用于表示导致C6结构单元的合成的途径中的重要代谢产物。术语"中心代谢产物"在本申请中用于表示在所有微生物中产生以支持生长的代谢产物。
因此，本申请所述的宿主微生物可包括可操纵使得可产生一种或多种C6结构单元的内源性途径。在内源性途径中，宿主微生物天然地表达催化在该途径内的反应的所有酶。含有工程化途径的宿主微生物不天然地表达催化在该途径内反应的所有酶，但是已经被工程化以使得在宿主中表达在途径内的所有酶。在工程化途径内，酶可来自单一来源，即，来自一个物种或者属，或者可来自多个来源，即，不同物种或者属。编码本申请所述的酶的核酸已经从各种生物鉴别出并可在公开资料数据库如GenBank或者EMBL中容易地得到。工程化宿主不可天然地表达本申请所述途径的酶，或者可天然地表达本申请所述途径的酶中的一些(例如，一种或者多种，两种或者更多种，三种或者更多种，四种或者更多种，五种或者更多种，或者六种或者更多种)。也可将工程化宿主的内源性基因破坏以防止形成不希望的代谢物，或者防止在途径中的中间体通过作用于这种中间体的其它酶导致的损失。可将工程化宿主称为重组宿主或者重组宿主细胞。因此，如本申请所述，重组宿主可包含核酸，所述核酸编码以下物质中的一种或者多种：β-酮硫解酶、脱氢酶、还原酶、水合酶、单氧化酶、ω-羟化酶或者转氨酶，如下面更详细地描述。
另外，C6结构单元的产生可在体外使用本申请所述的分离的酶，使用宿主微生物的溶胞产物(例如，细胞溶解产物)作为酶源，或者使用来自不同宿主微生物的多种溶胞产物作为酶源进行。
本申请所述的途径的反应可在一种或者多种宿主菌株中进行，所述宿主菌株(a)天然表达一种或者多种相关的酶，(b)被基因工程化以表达一种或者多种相关的酶，或者(c)天然表达一种或者多种相关的酶并被基因工程化以表达一种或者多种相关的酶。可选择地，可将相关的酶从上述类型的宿主细胞中提取出来并以纯化的或者半纯化的形式使用。而且，这种提取物包括可用作相关的酶的来源的溶胞产物(例如细胞裂解物)。在本申请提供的方法中，所有步骤可在宿主细胞中进行，所有步骤可使用提取的酶进行，或者一些步骤可在细胞中进行并且其它步骤可使用提取的酶进行。
4.1产生用于转化成C6结构单元的C6脂族主链的酶
如图1和图2中所示，用于转化成C6结构单元的C6脂族主链可由乙酰基-CoA经两个循环的CoA依赖性碳链延长使用NADH或者NADPH依赖性酶形成。在一些实施方案中，CoA依赖性碳链延长循环包含乙酰基-CoA C-酰基转移酶(其将乙酰基-CoA转化成乙酰乙酰基-CoA和将丁酰基-CoA转化成3-氧代己酰基-CoA)，或者乙酰基-CoA羧化酶(其将乙酰基-CoA转化成丙二酸单酰基-CoA)，以及乙酰乙酰基-CoA合成酶(其将丙二酸单酰基-CoA转化成乙酰乙酰基-CoA)，3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶(其将乙酰乙酰基-CoA转化成3-羟基丁酰基CoA)或者3-氧代酰基-CoA还原酶/3-羟基酰基-CoA脱氢酶(其将3-氧代己酰基-CoA转化成3-羟基己酰基-CoA)，烯酰基-CoA水合酶(其将3-羟基丁酰基-CoA转化成巴豆酰基-CoA和将3-羟基己酰基-CoA转化成己-2-烯酰基-CoA)和反式-2-烯酰基-CoA还原酶(其将巴豆酰基-CoA转化成丁酰基-CoA和将己-2-烯酰基-CoA转化成己酰基-CoA)。
在一些实施方案中，乙酰基-CoA C-酰基转移酶可归类在EC 2.3.1.9下，例如atoB或者phaA的基因产物，或者归类在EC 2.3.1.16下，例如bktB的基因产物。
由atoB或者phaA编码的β-酮硫解酶接受乙酰基-CoA作为底物，从而形成丁酰基-CoA(Haywood et al.,FEMS Microbiology Letters,1988,52,91-96；Slater et al.,Journal of Bacteriology,1998,180(8),1979-1987)。
来自钩虫贪铜菌的由bktB编码的β-酮硫解酶接受乙酰基-CoA和丁酰基-CoA作为底物，从而形成CoA活化的C6脂族主链(Haywood et al.,FEMSMicrobiology Letters,1988,52,91-96；Slater et al.,Journal of Bacteriology,1998,180(8),1979-1987)。
在一些实施方案中，乙酰基-CoA羧化酶可归类在EC 6.4.1.2下。
已经显示，通过乙酰基-CoA羧化酶将乙酰基-CoA转化成丙二酸单酰基-CoA提高脂肪酸合成速率(Davis et al.,The Journal of Biological Chemistry,2000,275(37),28593–28598)。
在一些实施方案中，乙酰乙酰基-CoA合成酶可归类在EC 2.3.1.194下。
已经证实，乙酰乙酰基-CoA合成酶在与多羟基丁酸合成相关的碳链延长中可用作phaA的基因产物的不可逆替代物(irreversiblesubstitute)(Matsumoto et al.,Biosci.Biotechnol.Biochem.,2011,75(2),364–366)。
在一些实施方案中，3-羟基酰基-CoA脱氢酶可归类在EC 1.1.1.35下，例如fadB的基因产物，或者3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶可归类在EC 1.1.1.157下，例如hbd的基因产物，或者乙酰乙酰基-CoA还原酶可归类在EC 1.1.1.36下，例如phaB的基因产物(Liu&Chen,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2007,76(5),1153–1159；Shen et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9),2905–2915；Budde et al.,Journal of Bacteriology,2010,192(20),5319–5328)。
在一些实施方案中，3-氧代酰基-CoA还原酶可归类在EC 1.1.1.100下，例如fabG的基因产物(Budde et al.,Journal of Bacteriology,2010,192(20),5319–5328；Nomura et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2005,71(8),4297–4306)。
在一些实施方案中，烯酰基-CoA水合酶可归类在EC 4.2.1.17下，例如crt的基因产物，或者归类在EC 4.2.1.119下，例如phaJ的基因产物(Shen etal.,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9),2905–2915；Fukui et al.,Journal ofBacteriology,1998,180(3),667–673).
在一些实施方案中，反式-2-烯酰基-CoA还原酶可归类在EC 1.3.1.38、EC 1.3.1.8或者EC 1.3.1.44下，例如ter或者tdter的基因产物(Nishimaki et al.,J.Biochem.,1984,95,1315–1321；Shen et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9),2905–2915)；Bond-Watts et al.,Biochemistry,2012,51,6827-6837)。
4.2在C6结构单元的生物合成中产生末端羧基基团的酶
如图3和图4中所示，末端羧基基团可使用酰基-CoA水解酶、醛脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶或者细胞色素P450/ω-羟化酶酶促形成。
在一些实施方案中，导致C6结构单元的合成的第一末端羧基基团通过归类在EC 3.1.2.-下的酰基-CoA水解酶或者硫酯酶在己酰基-CoA中酶促形成，从而导致己酸的生成。酰基-CoA水解酶或者硫酯酶可为YciA、tesB或者Acot13的基因产物(Cantu et al.,Protein Science,2010,19,1281–1295；Zhuang et al.,Biochemistry,2008,47(9),2789–2796；Naggert et al.,Journal ofBiological Chemistry,1991,266(17),11044–11050)。
在一些实施方案中，导致C6结构单元的合成的第一末端羧基基团通过归类在EC 1.2.1.4下的醛脱氢酶在己醛中酶促形成(Ho&Weiner,Journal ofBacteriology,2005,187(3),1067–1073)，从而导致己酸的生成。
在一些实施方案中，导致己二酸的合成的第二末端羧基基团通过归类在EC 1.2.1.3下的醛脱氢酶在己二酸半醛中酶促形成(Guerrillot&Vandecasteele,Eur.J.Biochem.,1977,81,185–192)。
在一些实施方案中，导致己二酸的合成的第二末端羧基基团通过归类在EC 1.2.1.63下的6-氧代己酸脱氢酶如ChnE的基因产物在己二酸半醛中酶促形成(Iwaki et al.,Appl.Environ.Microbiol.,1999,65(11),5158-5162)。
在一些实施方案中，导致己二酸的合成的第二末端羧基基团通过细胞色素P450在己二酸半醛中酶促形成(Sanders et al.,Journal of Lipid Research,2005,46(5),1001-1008；Sanders et al.,The FASEB Journal,2008,22(6),2064–2071)。
在将羧基基团引入烷烃中ω-氧化的利用已经在酵母热带念珠菌中证实，从而导致己二酸的合成(Okuhara et al.,Agr.Boil.Chem.,1971,35(9),1376–1380)。
4.3在C6结构单元的生物合成中产生末端胺基团的酶
如图5和图6中所示，末端胺基团可使用ω-转氨酶或者二胺转氨酶酶促形成。
在一些实施方案中，通过归类在EC 2.6.1.18下的ω-转氨酶如得自河流弧菌或者青紫色素杆菌的那些，或者归类在EC 2.6.1.19下的ω-转氨酶如得自灰色链霉菌的那些，或者归类在2.6.1.48下的ω-转氨酶如得自Clostridiumviride的那些，导致6-氨基己酸的合成的第一末端胺基团在己二酸半醛中酶促形成。
来自青紫色素杆菌的可逆ω-转氨酶具有已证实的接受6-氨基己酸作为氨基供体的活性，由此在己二酸半醛中形成第一末端胺基团(Kaulmann et al.,Enzyme and Microbial Technology,2007,41,628–637)。
来自灰色链霉菌的可逆4-氨基丁酸:2-氧代戊二酸转氨酶具有已证实的将6-氨基己酸转化成己二酸半醛的活性(Yonaha et al.,Eur.J.Biochem.,1985,146,101-106)。
来自Clostridium viride的可逆5-氨基戊酸转氨酶具有已证实的将6-氨基己酸转化成己二酸半醛的活性(Barker et al.,The Journal of BiologicalChemistry,1987,262(19),8994–9003)。
在一些实施方案中，导致六亚甲基二胺的合成的第二末端胺基团通过归类在EC 2.6.1.29下的二胺转氨酶或者归类在EC 2.6.1.82下的二胺转氨酶如YgjG的基因产物在6-氨基己醛中酶促形成。
ygjG的基因产物接受宽范围的二胺碳链长度底物，例如腐胺、尸胺和精脒(Samsonova et al.,BMC Microbiology,2003,3:2)。
来自大肠杆菌菌株B的二胺转氨酶具有已证实的针对1,5二氨基戊烷和1,7二氨基庚烷的活性，1,6二氨基己烷(HMD)预期是活性的(Kim,The Journalof Chemistry,1963,239(3),783–786)。
4.4在C6结构单元的生物合成中产生末端羟基基团的酶
如图7和图8中所示，末端羟基基团可使用细胞色素P450、单氧化酶或者醇脱氢酶酶促形成。
在一些实施方案中，导致C6结构单元的合成的第一末端羟基基团通过单氧化酶、细胞色素P450或者ω-羟化酶如来自CYP153家族如CYP153A6的那些在己酸中酶促形成(Van Beilen&Funhoff,Current Opinion inBiotechnology,2005,16,308–314；Koch et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2009,75(2),337-344；Nieder和Shapiro,Journal of Bacteriology,1975,122(1),93-98)。
末端ω-羟化酶的底物特异性已经成功地加宽(Koch et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2009,75(2),337-344)。不过，
在一些实施方案中，导致1,6己二醇的合成的第二末端羟基基团通过归类在EC 1.1.1.-(例如，1,2,21，或者184)下的醇脱氢酶在6-羟基己醛中酶促形成。尽管在体外观察到CYP153A6的非末端羟基化，在体内仅1-羟基化发生(Funhoff et al.,Journal of Bacteriology,2006,188(14),5220–5227)。
4.5生物化学途径
4.5.1得到己酰基-CoA的途径，所述己酰基-CoA为导致C6结构单元的中心前体的前体
在一些实施方案中，己酰基-CoA由中心代谢产物乙酰基-CoA通过以下方法合成：通过乙酰乙酰基-CoA硫解酶(EC 2.3.1.9)如atoB或者phaA的基因产物，或者通过乙酰基-CoA羧化酶(EC 6.4.1.2)和乙酰乙酰基-CoA合成酶(EC 2.3.1.194)经丙二酸单酰基-CoA将乙酰基-CoA转化成乙酰乙酰基-CoA；然后通过3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶(EC 1.1.1.157)如hbd的基因产物将乙酰乙酰基-CoA转化成(S)3-羟基丁酰基-CoA；然后通过烯酰基-CoA水合酶(EC4.2.1.17)如crt的基因产物将(S)3-羟基丁酰基-CoA转化成巴豆酰基-CoA；然后通过反式-2-烯酰基-CoA还原酶(EC 1.3.1.44)如ter的基因产物将巴豆酰基-CoA转化成丁酰基-CoA；然后通过乙酰基-CoA C-酰基转移酶(EC 2.3.1.16)如bktB的基因产物将丁酰基-CoA转化成3-氧代-己酰基-CoA；然后通过3-羟基酰基-CoA脱氢酶(EC 1.1.1.35)如fabB的基因产物将3-氧代-己酰基-CoA转化成(S)3-羟基己酰基-CoA；然后通过烯酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.17)如crt的基因产物将(S)3-羟基己酰基-CoA转化成己-2-烯酰基-CoA；然后通过反式-2-烯酰基-CoA还原酶(EC 1.3.1.44)如ter或者tdter的基因产物将己-2-烯酰基-CoA转化成己酰基-CoA。参见图1。
在一些实施方案中，己酰基-CoA由中心代谢产物乙酰基-CoA通过以下方法合成：通过乙酰乙酰基-CoA硫解酶(EC 2.3.1.9)如atoB或者phaA的基因产物，或者通过乙酰基-CoA羧化酶(EC 6.4.1.2)和乙酰乙酰基-CoA合成酶(EC 2.3.1.194)经丙二酸单酰基-CoA将乙酰基-CoA转化成乙酰乙酰基-CoA；然后通过3-乙酰乙酰基-CoA还原酶(EC 1.1.1.36)如phaB的基因产物将乙酰乙酰基-CoA转化成(R)3-羟基丁酰基-CoA；然后通过烯酰基-CoA水合酶(EC4.2.1.119)如phaJ的基因产物将(R)3-羟基丁酰基-CoA转化成巴豆酰基-CoA；然后通过反式-2-烯酰基-CoA还原酶(EC 1.3.1.38)将巴豆酰基-CoA转化成丁酰基-CoA；然后通过乙酰基-CoA C-酰基转移酶(EC 2.3.1.16)如bktB的基因产物将丁酰基-CoA转化成3-氧代-己酰基-CoA；然后通过3-氧代酰基-CoA还原酶(EC 1.1.1.100)如fabG的基因产物将3-氧代-己酰基-CoA转化成(R)3-羟基己酰基-CoA；然后通过烯酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.119)如phaJ的基因产物将(R)3-羟基己酰基-CoA转化成己-2-烯酰基-CoA；然后通过反式-2-烯酰基-CoA还原酶(EC 1.3.1.38)将己-2-烯酰基-CoA转化成己酰基-CoA。参见图2。
4.5.2使用己酰基-CoA作为导致中心前体己酸的前体的途径
在一些实施方案中，己酸由中心代谢产物己酰基-CoA通过以下方法合成：通过酰基-CoA水解酶或者硫酯酶(EC 3.1.2.-)如YciA、tesB或者Acot13的基因产物将己酰基-CoA转化成己酸。
在一些实施方案中，己酸由中心代谢产物己酰基-CoA通过以下方法合成：通过丁醛脱氢酶(EC 1.2.1.57)将己酰基-CoA转化成己醛；然后通过醛脱氢酶(EC 1.2.1.4)将己醛转化成己酸。参见图3。
对于NADH和NADPH作为辅因子，己酰基-CoA转化成己醛已经被证实(Palosaari和Rogers,Journal of Bacteriology,1988,170(7),2971–2976)。
4.5.3.使用己酸作为己二酸的中心前体的途径
在一些实施方案中，己二酸由中心前体己酸通过以下方法合成：通过单氧化酶或者细胞色素P450如来自CYP153家族如CYP153A6的那些将己酸转化成6-羟基己酸；然后通过醇脱氢酶(EC 1.1.1.2)如YMR318C的基因产物将6-羟基己酸转化成己二酸半醛；然后通过6-氧代己酸脱氢酶(EC 1.2.1.63)将己二酸半醛转化成己二酸。参见图4。
由YMR318C编码的醇脱氢酶具有宽的底物特异性，包括C6醇的氧化。
在一些实施方案中，己二酸由中心前体己酸通过以下方法合成：通过单氧化酶或者细胞色素P450如来自CYP153家族如CYP153A6的那些将己酸转化成6-羟基己酸；然后通过6-羟基己酸脱氢酶(EC 1.1.1.258)如ChnD的基因产物将6-羟基己酸转化成己二酸半醛(Iwaki et al.,Appl.Environ.Microbiol.,1999,65(11),5158-5162)；然后通过醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)将己二酸半醛转化成己二酸。参见图4。
在一些实施方案中，己二酸由中心前体己酸通过以下方法合成：通过单氧化酶或者细胞色素P450如来自CYP153家族如CYP153A6的那些将己酸转化成6-羟基己酸；然后通过细胞色素P450将6-羟基己酸转化成己二酸半醛(Sanders et al.,Journal of Lipid Research,2005,46(5),1001-1008；Sanders etal.,The FASEB Journal,2008,22(6),2064–2071)；然后通过细胞色素P450将己二酸半醛转化成己二酸。参见图4。
4.5.4使用己酸作为6-氨基己酸(6-aminohexanoate)和∈-己内酰胺的中心前体的途径
在一些实施方案中，6-氨基己酸由中心前体己酸通过以下方法合成：通过单氧化酶或者细胞色素P450如来自CYP153家族如CYP153A6的那些将己酸转化成6-羟基己酸；然后通过醇脱氢酶(EC 1.1.1.2)或者6-羟基己酸脱氢酶(EC 1.1.1.258)将6-羟基己酸转化成己二酸半醛；然后通过ω-转氨酶(EC2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.48)将己二酸半醛转化成6-氨基己酸。参见图5。
在一些实施方案中，∈-己内酰胺由中心前体己酸通过以下方法合成：通过单氧化酶或者细胞色素P450如来自CYP153家族如CYP153A6的那些将己酸转化成6-羟基己酸；然后通过醇脱氢酶(EC 1.1.1.2)或者6-羟基己酸脱氢酶(EC 1.1.1.258)将6-羟基己酸转化成己二酸半醛；然后通过ω-转氨酶(EC2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.48)将己二酸半醛转化成6-氨基己酸；然后通过水解酶(EC 3.5.2.-)将6-氨基己酸转化成∈-己内酰胺。参见图5。
4.5.5使用6-氨基己酸作为六亚甲基二胺的中心前体的途径
在一些实施方案中，六亚甲基二胺由中心前体6-氨基己酸通过以下方法合成：通过羧酸还原酶(EC 1.2.99.6)，如car的基因产物连同npt的基因产物，或者GriC&GriD的基因产物，将6-氨基己酸转化成6-氨基己醛(Suzukiet al.,J.Antibiot.,2007,60(6),380–387)；然后通过二胺转氨酶(EC 2.6.1.29,EC 2.6.1.82)将6-氨基己醛转化成六亚甲基二胺。参见图6。
由car和增强子npt的基因产物编码的羧酸还原酶具有宽的底物特异性，包括末端二官能C4和C5羧酸(Venkitasubramanian et al.,Enzyme andMicrobial Technology,2008,42,130–137)。
4.5.6使用己酸作为1,6-己二醇的中心前体的途径
在一些实施方案中，6-羟基己酸由中心前体己酸通过以下方法合成：通过单氧化酶或者细胞色素P450如来自CYP153家族如CYP153A6的那些将己酸转化成6-羟基己酸。参见图7。
在一些实施方案中，1,6己二醇由中心前体6-羟基己酸通过以下方法合成：通过羧酸还原酶(EC 1.2.99.6)如car的基因产物连同npt的基因产物将6-羟基己酸转化成6-羟基己醛；然后通过醇脱氢酶(例如，EC 1.1.1.1、EC1.1.1.2、EC 1.1.1.21或者EC 1.1.1.184)将6-羟基己醛转化成1,6己二醇(Liu etal.,Microbiology,2009,155,2078–2085)。
4.6培养策略
在一些实施方案中，一种或者多种C6结构单元在重组宿主中使用缺氧的、需氧的或者微需氧的培养条件生物合成。非循环或者循环培养策略可用于实现希望的培养条件。例如，非循环策略可用于实现缺氧的、需氧的或者微需氧的培养条件。
在一些实施方案中，循环培养策略可用于在缺氧的培养条件和需氧的培养条件之间交替。
在一些实施方案中，所述培养策略经氮、磷酸盐或者氧限制进行养分限制。
在一些实施方案中，一种或者多种C6结构单元通过单一微生物经非循环或者循环发酵策略产生。
在一些实施方案中，一种或者多种C6结构单元通过以下方法产生：经非循环或者循环发酵策略共同培养超过一种微生物。
在一些实施方案中，一种或者多种C6结构单元通过以下方法产生：连续发酵，其中将来自前发酵的肉汤或者离心滤液作为原料供料至相继的发酵；最后产生C6结构单元。
在一些实施方案中，使用例如陶瓷中空纤维膜的细胞保留策略用于在分批补料或者连续补料发酵期间实现和维持高细胞密度。
在一些实施方案中，在C6结构单元的合成中供料至发酵的主要碳源衍生自生物或者非生物原料。
在一些实施方案中，所述生物原料是，包含，或者衍生自以下物质：单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素如γ-戊酮酸和糠醛、木质素、甘油三酯如甘油和脂肪酸、农业废物或者城市废物。
来自生化柴油生产的粗甘油的有效分解代谢已经在数种微生物如大肠杆菌、钩虫贪铜菌、假单胞菌属、恶臭假单胞菌和解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)中被证实(Lee et al.,Appl.Biochem.Biotechnol.,2012,166,1801–1813；Yang et al.,Biotechnology for Biofuels,2012,5:13；Meijnen et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2011,90,885-893)。
木质纤维素衍生的γ-戊酮酸的有效分解代谢已经在经前体丙酰基-CoA合成3-羟基戊酸中在数种有机体如钩虫贪铜菌和恶臭假单胞菌中被证实(Jaremko和Yu,Journal of Biotechnology,2011,155,2011,293–298；Martin和Prather,Journal of Biotechnology,2009,139,61–67)。
木质素衍生的芳族化合物如苯甲酸类似物(benzoate analogues)的有效分解代谢已经在数种微生物如恶臭假单胞菌、钩虫贪铜菌中被证实(Bugg et al.,Current Opinion in Biotechnology,2011,22,394–400；Pérez-Pantoja et al.,FEMS Microbiol.Rev.,2008,32,736–794)。
农业废物如橄榄油厂废水的有效利用已经在数种微生物(包括Yarrowialipolytica)中被证实(Papanikolaou et al.,Bioresour.Technol.,2008,99(7),2419-2428)。
对于数种微生物如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌和德氏乳杆菌和乳酸乳球菌，衍生自纤维素、半纤维素、蔗糖蜜和甜菜糖蜜、木薯、玉米和其它农业来源的可发酵糖如单糖和二糖的有效利用已经被证实(参见，例如，Hermannet al,Journal of Biotechnology,2003,104,155–172；Wee et al.,Food Technol.Biotechnol.,2006,44(2),163–172；Ohashi et al.,Journal of Bioscience andBioengineering,1999,87(5),647-654)。
对于钩虫贪铜菌，衍生自多种农业木质纤维来源的糠醛的有效利用已经被证实(Li et al.,Biodegradation,2011,22,1215–1225)。
在一些实施方案中，所述非生物原料是或者衍生自天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物(NVR)或者碱洗废物流。
对于巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，甲醇的有效分解代谢已经被证实。
对于克氏梭状芽胞杆菌，乙醇的有效分解代谢已经被证实(Seedorf et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2008,105(6)2128-2133)。
对于钩虫贪铜菌，CO2和H2(其可衍生自天然气和其它化学和石油化学来源)的有效分解代谢已经被证实(Prybylski et al.,Energy,Sustainability andSociety,2012,2:11)。
对于大量微生物如Clostridium ljungdahlii和Clostridiumautoethanogenum，合成气的有效分解代谢已经被证实(et al.,Appliedand Environmental Microbiology,2011,77(15),5467–5475)。
对于大量微生物如食酸代尔夫特菌和钩虫贪铜菌，来自环己烷工艺的非挥发性残留物废物流的有效分解代谢已经被证实(Ramsay et al.,Applied andEnvironmental Microbiology,1986,52(1),152–156)。
在一些实施方案中，所述宿主为原核生物。例如，所述原核生物可来自埃希氏菌属如大肠杆菌；来自梭状芽胞杆菌属如杨氏梭菌、自产乙醇梭菌或者克鲁佛梭菌；来自棒状杆菌属如谷氨酸棒状杆菌；来自贪铜菌属如钩虫贪铜菌或者耐金属贪铜菌；来自假单胞菌属如荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌或者食油假单胞菌；来自代尔夫特菌属如食酸代尔夫特菌；来自芽孢杆菌属如枯草芽胞杆菌；来自乳杆菌属如德氏乳杆菌；或者来自乳球菌属如乳酸乳球菌。这种原核生物也可为构建本申请所述的能够产生C6结构单元的重组宿主细胞的基因来源。
在一些实施方案中，所述宿主为真核生物。例如，所述真核生物可来自曲霉菌属如黑曲霉菌；来自酵母菌属如酿酒酵母菌；来自毕赤氏酵母属如巴斯德毕赤酵母；或者来自耶罗维亚酵母属如解脂耶罗维亚酵母；来自伊萨酵母属如东方伊萨酵母；来自德巴利酵母属如汉逊德巴利酵母；来自Arxula属如Arxula adenoinivorans；或者来自克鲁维酵母菌属如乳酸克鲁维酵母菌。这种真核生物也可为构建本申请所述的能够产生C6结构单元的重组宿主细胞的基因来源。
4.7代谢工程
本文件提供方法，所述方法包括对所有上面途径所述的少于所有步骤。这种方法可包括，例如，这些步骤中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或者更多。在这种方法包含少于所有步骤的情况下，第一步骤可为所列步骤中的任何步骤。
而且，本申请所述的重组宿主可包括上面的酶中的任何组合，使得所述步骤中的一个或者多个，例如，这些步骤中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或者更多可在重组宿主内实施。本申请提供所列出的和基因工程化以表达本申请列举的任何酶的一个或者多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个、11个、12个或者更多)重组形式的任何属和种的宿主细胞。因此，例如，宿主细胞可含有外源性核酸，所述外源性核酸编码催化本申请所述途径的任何一个或者多个步骤的酶。
另外，本申请认识到，在酶已经被描述为接受CoA活化的底物的情况下，存在与[acp]结合底物相关的相似的酶活性，其不一定为相同的酶种类。
此外，本申请认识到，在酶已经被描述为接受底物的(R)-对映异构体的情况下，存在与底物的(S)-对映异构体相关的相似的酶活性，其不一定为相同的酶种类。
本申请还认识到，在酶已经显示接受特定辅助因子如NADPH或者辅助底物如乙酰基-CoA的情况下，许多酶在催化特定酶活性中在接受大量不同辅因子或者辅助底物方面是泛宿主性的。此外，本申请认识到，在酶对例如特定辅助因子如NADH具有高特异性的情况下，对辅助因子NADPH具有高特异性的具有相似或者相同活性的酶可为不同的酶种类。
在一些实施方案中，在4.5节中所述的途径中的酶是经非直接或者合理酶设计方法酶工程的结果，目的在于改善活性、改善特异性、降低反馈抑制、降低阻抑、改善酶溶解性、改变立体特异性，或者改变辅助因子特异性。
在一些实施方案中，将在4.5节中所述的途径中的酶经附加型或者染色体整合方法基因给予(即，过表达)至所得的基因修饰的有机体内。
在一些实施方案中，使用基因组级别(genome-scale)的系统生物学技术如通量平衡分析来设计用于将碳通量导至C6结构单元的基因组级别的弱化或者敲除策略。
弱化策略包括但不限于使用转座子、同源重组(双交叉的方法)、诱变、酶抑制剂和RNAi干扰。
在一些实施方案中，使用通量组(fluxomic)、代谢组(metabolomic)和转录组(transcriptomal)数据告知或者支持基因组级别的系统生物学技术，由此在将碳通量导向C6结构单元中设计基因组级别的弱化或者敲除策略。
在一些实施方案中，所述宿主微生物的对高浓度的C6结构单元的耐受性通过在选择性环境中的连续培养来改善。
在一些实施方案中，将所述宿主微生物的生物化学网络弱化或者强化以(1)确保乙酰基-CoA的细胞内可用度，(2)创造NADH或者NADPH不平衡，其仅可经C6结构单元的形成来平衡，(3)防止降解导致和包含C6结构单元的中心代谢产物，中心前体和(4)确保来自细胞的有效率的外向通量。
在需要用于C6结构单元合成的乙酰基-CoA的细胞内可用度的一些实施方案中，产生乙酸的磷酸乙酸转移酶如pta弱化(Shen et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9),2905–2915)。
在需要用于C6结构单元合成的乙酰基-CoA的细胞内可用度的一些实施方案中，在乙酸合成途径中编码乙酸激酶的基因如ack弱化。
在需要用于C6结构单元合成的乙酰基-CoA和NADH的细胞内可用度的一些实施方案中，编码降解丙酮酸至乳酸的基因如ldhA弱化(Shen et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9),2905-2915)。
在需要用于C6结构单元合成的乙酰基-CoA和NADH的细胞内可用度的一些实施方案中，编码降解磷酸烯醇丙酮酸至琥珀酸的基因如frdBC弱化(参见例如，Shen et al.,2011,如上)。
在需要用于C6结构单元合成的乙酰基-CoA和NADH的细胞内可用度的一些实施方案中，编码降解乙酰基-CoA至乙醇的基因如由adhE编码的醇脱氢酶弱化(Shen et al.,2011,如上)。
在一些实施方案中，编码降解丙酮酸至乙醇的基因如丙酮酸脱羧酶弱化。
在一些实施方案中，编码生成异丁醇的基因如2-酮酸脱羧酶弱化。
在需要用于C6结构单元合成的乙酰基-CoA的细胞内可用度的一些实施方案中，乙酰基-CoA合成酶如acs的基因产物在微生物中过表达(Satoh etal.,Journal of Bioscience and Bioengineering,2003,95(4),335–341)。
在一些实施方案中，通过弱化6-磷酸葡萄糖异构酶将碳通量导至磷酸戊糖循环中(EC 5.3.1.9)。
在一些实施方案中，在途径需要用于C6结构单元合成的过量NADH辅助因子的情况下，甲酸脱氢酶基因在所述宿主有机体中过表达(Shen et al.,2011,如上)。
在一些实施方案中，在途径在合成C6结构单元中需要过量NADPH辅助因子的情况下，吡啶核苷酸转氢酶基因如UdhA在所述宿主有机体中过表达(Brigham et al.,Advanced Biofuels and Bioproducts,2012,Chapter 39,1065-1090)。
在一些实施方案中，在途径在合成C6结构单元中需要过量NADPH辅助因子的情况下，甘油醛-3P-脱氢酶基因如GapN在所述宿主有机体中过表达(Brigham et al.,2012,如上)。
在一些实施方案中，在途径在合成C6结构单元中需要过量NADPH辅助因子的情况下，苹果酸酶基因如maeA或者maeB在所述宿主有机体中过表达(Brigham et al.,2012,如上)。
在一些实施方案中，在途径在合成C6结构单元中需要过量NADPH辅助因子的情况下，6-磷酸葡糖脱氢酶基因如zwf在所述宿主有机体中过表达(Lim et al.,Journal of Bioscience和Bioengineering,2002,93(6),543-549)。
在一些实施方案中，在途径在合成C6结构单元中需要过量NADPH辅助因子的情况下，果糖1,6二磷酸酶基因如fbp在所述宿主有机体中过表达(Becker et al.,Journal of Biotechnology,2007,132,99-109)。
在一些实施方案中，在途径在合成C6结构单元中需要过量NADPH辅助因子的情况下，磷酸丙糖异构酶(EC 5.3.1.1)弱化。
在一些实施方案中，在途径在合成C6结构单元中需要过量NADPH辅助因子的情况下，葡萄糖脱氢酶如gdh的基因产物在所述宿主有机体中过表达(Satoh et al.,Journal of Bioscience and Bioengineering,2003,95(4),335–341)。
在一些实施方案中，促进NADPH转化成NADH的酶弱化，例如可经EC 1.4.1.2(NADH特异性)和EC 1.4.1.4(NADPH特异性)中的谷氨酸脱氢酶的相互转化产生的NADH生成循环。
在一些实施方案中，利用NADH和NADPH辅因子的谷氨酸脱氢酶(EC1.4.1.3)弱化。
在一些实施方案中，膜结合细胞色素P450/ω-羟化酶经截短将P450锚定至内质网的N-端区域而增溶(Scheller et al.,The Journal of BiologicalChemistry,1994,269(17),12779 0 12783)。
在使用天然积累聚羟基烷酸酯的宿主的一些实施方案中，聚合物合成酶酶可在所述宿主菌株中弱化。
在需要用于C6结构单元合成的丁酰基-CoA的细胞内可用度的一些实施方案中，丙酰基-CoA合成酶如PrpE-RS的基因产物在微生物中过表达(Rajashekhara&Watanabe,FEBS Letters,2004,556,143–147)。
在一些实施方案中，降解中心代谢产物的β-氧化酶和导致和包含C6结构单元的中心前体弱化。
在一些实施方案中，经辅酶A酯化而活化C6结构单元的酶如CoA-连接酶弱化。
在一些实施方案中，通过对细胞膜的基因工程结构修饰或者提高用于C6结构单元的任何相关的转运蛋白活性，C6结构单元穿越细胞膜到达细胞外介质的外向通量强化或者放大。
本发明将在下面的实施例中进一步描述，这些实施例不限制权利要求中所述的本发明的范围。
实施例
实施例1
用于在酿酒酵母菌中由葡萄糖循环合成己二酸的基因组级别的弱化策略
基因组级别的通量平衡分析使用指定为iMM904的酿酒酵母菌的基因组级别的模型来进行(Mo et al.,BMC Systems Biology,2009,3(37),1-17)。
IMM904模型通过以下方法扩展：包含发表的作品中所概述的用于真核有机体的ω-氧化途径(Sanders et al.,Journal of Lipid Research,2005,46(5),1001–1008)。而且，在iMM904模型的过氧化物酶体中的β-氧化反应被扩展并且包含相关的膜转运反应。在验证扩展的模型期间需要富马酸还原酶的钝化，以使模型通量与实验通量数据协调。
将在图1中所述的NADH特异性酶反应结合至模型中。
允许己酸和己二酸膜转运至细胞外介质以及己酸和己二酸从细胞外介质膜转运。
当过表达甲酸脱氢酶时，在大肠杆菌中产生1-丁醇中NADH的化学计量平衡更加有效率(Shen et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9),2905–2915)。iMM904模型包含甲酸脱氢酶，但是缺乏丙酮酸甲酸裂解酶活性，其包含在酿酒酵母菌模型中。
评估了NAD(H)或者NADP(H)依赖性酶的辅助因子特异性，并且在已公开的文献在特异性方面不明确的情况下，假定了泛宿主性的酶。
使用代谢工程工作台Optflux搜索与用于弱化策略的生物化学网络相关的解空间，所述弱化策略(1)以缺氧的方式由葡萄糖产生己酸，然后(2)以需氧的方式由细胞外己酸产生己二酸，同时共同供料葡萄糖作为碳和能量来源。
优化试验发现四种有利的弱化；即，(1)弱化6-磷酸葡萄糖异构酶，从而将通量导至磷酸戊糖循环中；(2)弱化丙酮酸脱羧酶或者醇脱氢酶，从而防止乙醇产生；(3)弱化2-酮酸脱羧酶，从而防止异丁醇产生和(4)钝化β-氧化，从而防止中心前体、中心代谢产物和己二酸降解。
在这种使用葡萄糖作为碳和能量来源的酿酒酵母突变体中的弱化有利于作为最大化生物质生长手段的经己酸的产生平衡NADH。
甲酸脱氢酶在酿酒酵母突变体中的过表达消除甲酸(formate)和丙酮酸(pyruvate)的副产物形成，从而以0.62的摩尔收率[(mol己酸)/(mol葡萄糖)]产生己酸。
从缺氧培养循环至需氧培养，同时维持葡萄糖供料速率以匹配在缺氧条件下的生长速率，得到0.38的总摩尔收率[(mol己二酸)/(mol总葡萄糖)]。
使用经验证的模型在计算机上进行的生物化学网络弱化确定(In-silicoattenuation of the biochemical network using a validated model determined that)，在缺氧条件和需氧条件之间循环的培养策略从供料的葡萄糖主要产生己二酸。
实施例2
在酿酒酵母菌中使用NADH不平衡以将碳通量导向己二酸的用于从葡萄糖开始的微需氧合成的基因组级别的弱化策略
使用实施例1中所述的iMM904模型评估使用葡萄糖作为碳和能量来源在微需氧的、底物氧化和生长限制培养条件下的己二酸的非循环制备。
通过使用扩展的iMM904模型和代谢工程工作台Optflux，优化试验发现了优化的弱化策略，所述优化的弱化策略包括(1)弱化向细胞外介质的己酸转运；(2)弱化向细胞外介质的乙醇分泌；(3)弱化2-羟基丁酸氧化还原酶(2-hydroxybutyrate oxidoreductase)，从而防止2-羟基丁酸(2-hydroxybutyrate)产生；(4)弱化DL甘油-3-磷酸酶，从而防止甘油产生和(5)弱化苹果酸脱氢酶，从而防止NADH与NADPH的相互转化。
所得的酿酒酵母突变体产生己二酸作为最有利的平衡NADH的手段以最大化生物质生长，从而以0.71的摩尔收率[(mol己二酸)/(mol葡萄糖)]产生己二酸。
使用经验证的模型在计算机上进行的生物化学网络弱化确定，在微需氧条件下的非循环培养策略从供料的葡萄糖主要产生己二酸。
实施例3
在酿酒酵母菌中使用NADPH不平衡以将碳通量导向己二酸的用于从葡萄糖开始的需氧合成的基因组级别的弱化策略
使用实施例1中所述的iMM904模型评价使用葡萄糖作为碳和能量来源在需氧培养和生长限制条件下的己二酸的非循环制备。
图1中所述的NADH特异性酶促反应被图2中所述的相当的NADPH特异性酶促反应替代。
通过使用扩展的iMM904模型和代谢工程工作台Optflux，优化试验发现了优化的弱化策略，所述优化的弱化策略包括(1)弱化磷酸丙糖异构酶/磷酸葡糖异构酶，从而将通量改向至磷酸戊糖循环中；(2)通过弱化NADH依赖性谷氨酸脱氢酶和脯氨酸氧化酶，防止NADPH与NADH的相互转化。
所得的酿酒酵母突变体产生己二酸作为最有利的平衡NADPH的手段以最大化生物质生长，从而以0.4的摩尔收率[(mol己二酸)/(mol葡萄糖)]产生己二酸。
使用经验证的模型在计算机上进行的生物化学网络弱化确定，在需氧条件下的非循环培养策略从供料的葡萄糖主要产生己二酸。
其它实施方案
应理解的是，尽管协同发明的具体描述描述了本发明，但是前面的描述意图说明并且不限制发明的范围，发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点和修饰也在权利要求的范围内。
Claims (89)
1.生物合成选自己二酸、6-氨基己酸、六亚甲基二胺、己内酰胺和1,6-己二醇的一种或者多种产物的方法，所述方法包括酶促合成六碳的链式脂族主链和在一个或者多个步骤中在所述主链中酶促形成两个选自羧基、胺和羟基基团的末端官能团，从而直接产生所述产物或者在后续步骤中产生所述产物。
2.权利要求1的方法，其中所述两个末端官能团是相同的。
3.权利要求1的方法，其中所述两个末端官能团是不同的。
4.权利要求1的方法，其中所述六碳的链式脂族主链为己酰基-CoA。
5.权利要求4的方法，其中所述己酰基-CoA是由乙酰基-CoA经两个CoA依赖性碳链延长循环使用NADH或者NADPH依赖性酶酶促合成的。
6.权利要求4或者5的方法，其中所述己酰基-CoA通过以下方法形成：通过归类在EC 1.3.1.44、EC 1.3.1.38或者EC 1.3.1.8下的烯酰基-CoA还原酶转化己-2-烯酰基-CoA。
7.权利要求6的方法，其中所述烯酰基-CoA还原酶是ter或者tdter的基因产物。
8.权利要求6的方法，其中己-2-烯酰基-CoA通过以下方法形成：通过归类在EC 4.2.1.17下的反式-2-烯酰基-CoA水合酶转化(S)3-羟基己酰基-CoA，或者通过归类在EC 4.2.1.119下的反式-2-烯酰基-CoA水合酶转化(R)3-羟基己酰基-CoA。
9.权利要求8的方法，其中所述反式-2-烯酰基-CoA水合酶是crt的基因产物。
10.权利要求8或者权利要求9的方法，其中(S)3-羟基己酰基-CoA通过以下方法形成：通过归类在EC 1.1.1.35下的3-羟基酰基-CoA脱氢酶转化3-氧代己酰基-CoA。
11.权利要求10的方法，其中所述3-羟基酰基-CoA脱氢酶是通过fadB编码的。
12.权利要求10或者权利要求11的方法，其中3-氧代己酰基-CoA通过以下方法形成：通过归类在EC 2.3.1.16下的乙酰基-CoA C-酰基转移酶转化丁酰基-CoA。
13.权利要求12的方法，其中所述乙酰基-CoA C-酰基转移酶是通过bktB编码的。
14.权利要求12或者权利要求13的方法，其中丁酰基-CoA通过以下方法形成：通过归类在EC 1.3.1.44、EC 1.3.1.38或者EC 1.3.1.8下的烯酰基-CoA还原酶转化巴豆酰基-CoA。
15.权利要求14的方法，其中所述巴豆酰基-CoA通过以下方法形成：通过归类在EC 4.2.1.17下的反式-2-烯酰基-CoA水合酶转化(S)3-羟基丁酰基-CoA。
16.权利要求15的方法，其中(S)3-羟基丁酰基-CoA通过以下方法形成：通过归类在EC 1.1.1.157下的3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶转化乙酰乙酰基-CoA。
17.权利要求16的方法，其中所述3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶是通过hbd编码的。
18.权利要求16或者权利要求17的方法，其中乙酰乙酰基-CoA通过以下方法形成：通过归类在EC 2.3.1.9下的乙酰基-CoA C-酰基转移酶转化乙酰基-CoA。
19.权利要求18的方法，其中所述乙酰基-CoA C-酰基转移酶是通过atoB或者phaA编码的。
20.权利要求18或者权利要求19的方法，其中乙酰乙酰基-CoA通过以下方法形成：通过归类在EC 2.3.1.194下的乙酰乙酰基-CoA合成酶转化丙二酸单酰基-CoA。
21.权利要求20的方法，其中丙二酸单酰基-CoA通过以下方法形成：通过归类在EC 6.4.1.2下的乙酰基-CoA羧化酶转化乙酰基-CoA。
22.权利要求8的方法，其中所述反式-2-烯酰基-CoA水合酶是phaJ的基因产物。
23.权利要求8或者权利要求22的方法，其中(R)3-羟基己酰基-CoA通过以下方法形成：通过归类在EC 1.1.1.100下的3-氧代酰基-CoA还原酶转化3-氧代己酰基-CoA。
24.权利要求23的方法，其中所述3-氧代酰基-CoA还原酶是通过fabG编码的。
25.权利要求14的方法，其中巴豆酰基-CoA通过以下方法形成：通过归类在EC 4.2.1.119下的反式-2-烯酰基-CoA水合酶转化(R)3-羟基丁酰基-CoA。
26.权利要求25的方法，其中(R)3-羟基丁酰基-CoA通过以下方法形成：通过归类在EC 1.1.1.36下的乙酰酰基-CoA还原酶转化乙酰乙酰基-CoA。
27.权利要求26的方法，其中所述乙酰酰基-CoA还原酶是通过phaB编码的。
28.权利要求1-4中的任一项的方法，其包括通过以下方法产生己酸：使用酰基-CoA水解酶和醛脱氢酶或者硫酯酶在己酰基CoA中形成第一末端羧基基团。
29.权利要求28的方法，其中所述酰基-CoA水解酶或者硫酯酶是通过YciA、tesB或者Acot13编码的。
30.权利要求1-4中的任一项的方法，其包括通过以下方法产生己酸：通过归类在EC 1.2.1.4下的醛脱氢酶在己醛中形成第一末端羧基基团。
31.权利要求30的方法，其中己醛通过以下方法形成：通过归类在EC 1.2.1.57下的丁醛脱氢酶转化己酰基-CoA。
32.权利要求29-31中的任一项的方法，其还包括使用一种或者多种酶促转化将己酸转化成己二酸、6-氨基己酸、六亚甲基二胺、ε己内酰胺或者1,6己二醇，其中所述酶促转化中的一种引入第二末端官能团。
33.权利要求32的方法，其包括使用细胞色素P450/ω-羟化酶将己酸转化成6-羟基己酸。
34.权利要求33的方法，其中所述细胞色素P450/ω-羟化酶来自家族CYP153如CYP152A6。
35.权利要求33或者权利要求34的方法，其包括使用(i)醇脱氢酶、(ii)6-羟基己酸脱氢酶或者(iii)细胞色素P450/ω-羟化酶将6-羟基己酸转化成己二酸半醛。
36.权利要求35的方法，其中所述醇脱氢酶是通过YMR318C编码的。
37.权利要求35或者权利要求36的方法，其中所述6-羟基己酸脱氢酶是通过ChnD编码的。
38.权利要求1-3或者32中的任一项的方法，其包括通过以下方法产生己二酸：使用(i)归类在EC 1.2.1.3下的醛脱氢酶、(ii)归类在EC 1.2.1.63下的6-氧代己酸脱氢酶或者(iii)细胞色素P450/ω-羟化酶在己二酸半醛中形成第二末端官能团。
39.权利要求38的方法，其中所述6-氧代己酸脱氢酶是通过ChnE编码的。
40.权利要求32或者33的方法，其包括通过以下方法产生6-氨基己酸：使用归类在EC 2.61.18、EC 2.6.1.19或者EC 2.6.1.48下的ω-转氨酶在己二酸半醛中形成第二末端官能团。
41.权利要求1、32或者40的方法，其包括使用归类在EC 3.5.2.-下的内酰胺酶由6-氨基己酸产生ε-己内酰胺。
42.权利要求41的方法，其包括使用归类在EC 1.2.99.6下的羧酸还原酶将6-氨基己酸转化成6-氨基己醛。
43.权利要求1、32或者42的方法，其包括通过以下方法产生六亚甲基二胺：使用归类在EC 2.6.1.29或者EC 2.6.1.82下的二胺转氨酶在6-氨基己醛中形成第二末端官能团。
44.权利要求42或者43的方法，其中所述羧酸还原酶是连同npt的基因产物通过car编码的。
45.权利要求42或者43的方法，其中所述羧酸还原酶是通过GriC&GriD编码的。
46.权利要求1、33或者34中的任一项的方法，其包括通过以下方法产生1,6己二醇：使用归类在EC 1.1.1.-(1,2,21,184)下的醇脱氢酶在6-羟基己醛中形成第二末端官能团。
47.前述权利要求中的任一项的方法，其中所述方法使用包含所述酶的细胞裂解物实施。
48.前述权利要求中的任一项的方法，其中所述方法在重组宿主中实施。
49.权利要求48的方法，其中所述宿主在缺氧的、需氧的或者微需氧的培养条件下培养。
50.权利要求48的方法，其中所述宿主经受循环培养策略，以使所述宿主在缺氧的培养条件和需氧的培养条件之间交替。
51.权利要求48的方法，其中所述宿主经氮、磷酸盐或者氧的限制在营养限制的条件下培养。
52.权利要求48-51中的任一项的方法，其中所述C6结构单元通过单一微生物菌株经非循环或者循环发酵策略产生。
53.权利要求48-51中的任一项的方法，其中所述C6结构单元通过共同培养两种或者更多种微生物菌株经非循环或者循环发酵策略产生。
54.权利要求48-50中的任一项的方法，其中所述C6结构单元通过连续发酵产生，其中将来自前发酵的肉汤或者离心滤液作为原料、中心代谢产物或者中心前体的来源供料至相继的发酵；最后产生所述C6结构单元。
55.权利要求48-51中的任一项的方法，其中将所述重组宿主细胞保留在陶瓷中空纤维膜中以在发酵期间维持高细胞密度。
56.权利要求49或者50的方法，其中供料至发酵的主要碳源来源于生物或者非生物原料。
57.权利要求56的方法，其中所述生物原料是或者来源于：单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素如γ-戊酮酸和糠醛、木质素、甘油三酯如甘油和脂肪酸、农业废物或者城市废物。
58.权利要求56的方法，其中所述非生物原料是或者来源于：天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物(NVR)或者碱洗废物流。
59.权利要求49的方法，其中所述宿主为原核生物或者真核生物。
60.权利要求59的方法，其中所述宿主为原核生物，所述原核生物来自埃希氏菌属如大肠杆菌；来自梭状芽胞杆菌属如杨氏梭菌、自产乙醇梭菌或者克鲁佛梭菌；来自棒状杆菌属如谷氨酸棒状杆菌；来自贪铜菌属如钩虫贪铜菌或者耐金属贪铜菌；来自假单胞菌属如荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌或者食油假单胞菌；来自代尔夫特菌属如食酸代尔夫特菌；来自芽孢杆菌属如枯草芽胞杆菌；来自乳杆菌属如德氏乳杆菌；或者来自乳球菌属如乳酸乳球菌。
61.权利要求59的方法，其中所述宿主为真核生物，所述真核生物来自曲霉菌属如黑曲霉菌；来自酵母菌属如酿酒酵母菌；来自毕赤氏酵母属如巴斯德毕赤酵母；来自耶罗维亚酵母属如解脂耶罗维亚酵母；来自伊萨酵母属如东方伊萨酵母；来自德巴利酵母属如汉逊德巴利酵母；来自Arxula属如Arxula adenoinivorans；或者来自克鲁维酵母菌属如乳酸克鲁维酵母菌。
62.权利要求59的方法，其中所述宿主对高浓度的C6结构单元的耐受性通过在选择性环境中的连续培养而得到改善。
63.权利要求59的方法，其中所述宿主天然地累积聚羟基烷酸酯，并且其中聚合物合成酶在宿主菌株中弱化。
64.权利要求51的方法，其中通过弱化降解乙酰基-CoA的基因，用于C6结构单元的生物合成的乙酰基-CoA的细胞内浓度在所述宿主中提高。
65.权利要求48的方法，其中产生NADH的不平衡，其仅可经C6结构单元的形成来平衡。
66.权利要求65的方法，其中编码甲酸脱氢酶的基因过表达，编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因过表达，2-羟基丁酸氧化还原酶活性弱化，DL甘油-3-磷酸酶活性弱化，和/或苹果酸脱氢酶活性弱化。
67.权利要求65的方法，其中通过弱化归类在EC 5.3.1.9下的6-磷酸葡萄糖异构酶，将碳通量导入所述宿主中的磷酸戊糖循环中。
68.权利要求64或者65的方法，其中编码乙酸激酶的基因如ack在所述宿主中弱化。
69.权利要求64或者65的方法，其中编码介导丙酮酸降解至乳酸的酶的基因如ldhA在所述宿主中弱化。
70.权利要求64或者65的方法，其中编码介导磷酸烯醇丙酮酸降解至琥珀酸的酶的基因如frdBC在所述宿主中弱化。
71.权利要求64或者65的方法，其中编码介导乙酰基-CoA降解至乙醇的酶如通过adhE编码的醇脱氢酶的基因在所述宿主中弱化。
72.权利要求64或者65的方法，其中编码介导丙酮酸降解至乙醇的酶如丙酮酸脱羧酶的基因在所述宿主中弱化。
73.权利要求64或者65的方法，其中编码介导异丁醇的生成的酶如2-酮酸脱羧酶的基因在所述宿主中弱化。
74.权利要求48的方法，其中通过过表达形成乙酰基-CoA的基因，用于C6结构单元的生物合成的乙酰基-CoA的细胞内浓度在所述宿主中提高。
75.权利要求74的方法，其中乙酰基-CoA合成酶如acs的基因产物在所述宿主中过表达。
76.权利要求48的方法，其中在所述宿主中产生NADPH的不平衡，其仅可经C6结构单元的形成来平衡。
77.权利要求76的方法，其中吡啶核苷酸转氢酶基因如UdhA在所述宿主中过表达。
78.权利要求76的方法，其中甘油醛-3P-脱氢酶基因如GapN在所述宿主中过表达，苹果酸酶基因如maeA或者maeB在所述宿主中过表达，6-磷酸葡糖脱氢酶基因如zwf在所述宿主中过表达，果糖1,6二磷酸酶基因如fbp在所述宿主中过表达，磷酸丙糖异构酶的活性在所述宿主中弱化，和/或苹果酸脱氢酶的活性弱化。
79.权利要求76的方法，其中膜结合细胞色素P450/ω-羟化酶经将所述P450锚定至内质网的N-端区域的截短在所述宿主中增溶。
80.权利要求76的方法，其中葡萄糖脱氢酶如gdh的基因产物在所述宿主中过表达。
81.权利要求76的方法，其中促进NADPH转化至NADH的酶在所述宿主中弱化或者己酸向细胞外介质的转运弱化。
82.权利要求76的方法，其中可经EC 1.4.1.2(NADH特异性的)和EC1.4.1.4(NADPH特异性的)中的谷氨酸脱氢酶的互变产生的NADH生成循环在所述宿主中弱化。
83.权利要求76的方法，其中利用NADH和NADPH作为辅因子的谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.3)在所述宿主中弱化。
84.权利要求48的方法，其中导致己酰基-CoA形成的中心代谢产物的降解在所述宿主中弱化。
85.权利要求84的方法，其中丙酰基-CoA合成酶如PrpE-RS的基因产物在所述宿主中过表达。
86.权利要求84的方法，其中降解中心代谢产物和中心前体的β-氧化酶在所述宿主中弱化，所述中心代谢产物和中心前体导致和包括C6结构单元。
87.权利要求84的方法，其中经辅酶A酯化活化C6结构单元的酶如CoA-连接酶弱化。
88.权利要求48的方法，其中通过对细胞膜的基因工程结构修饰或者提高对C6结构单元的任何相关转运蛋白活性，增强或者放大C6结构单元穿越细胞膜到达细胞外介质的外向通量。
89.重组宿主，其包含至少一种外源性核酸，所述外源性核酸编码以下物质中的一种或者多种：甲酸脱氢酶、烯酰基-CoA还原酶、反式-2-烯酰基-CoA水合酶、3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶、乙酰基-CoA C-酰基转移酶、乙酰酰基-CoA还原酶、乙酰基-CoA合成酶、乙酰基-CoA羧化酶、苹果酸酶、吡啶核苷酸转氢酶、甘油醛-3P-脱氢酶、酰基-CoA水解酶、醛脱氢酶、硫酯酶、细胞色素P450/ω-羟化酶、醇脱氢酶、6-羟基己酸脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶、二胺转氨酶、丙酰基-CoA合成酶和羧酸还原酶，其中所述宿主包含以下的一种或者多种缺乏：6-磷酸葡萄糖异构酶、乙酸激酶、将丙酮酸降解至乳酸的酶、介导磷酸烯醇丙酮酸降解至琥珀酸的酶、醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、2-酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶、谷氨酸脱氢酶。
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