CN104267194B - 人胰高血糖素样肽-1、抗体及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了四种胰高血糖素样肽-1，公开了能够识别上述四种多肽的单克隆，公开了能识别上述四种多肽的多克隆抗体，本发明还公开了一种检测血清、或者血浆GLP-1总含量的ELISA试剂盒，包括有生物活性的GLP-1(7-37)、GLP-1？(7-36)？NH2肽、无生物活性的GLP-1(9-37)和GLP-1？(9-36)？NH2肽、四种肽链BSA融合蛋白、能够识别上述四种GLP-1的单克隆抗体、多克隆抗体和酶标记多克隆抗体。本发明是一种快速、稳定、可靠的诊断、治疗及疗效检测GLP-1缺乏相关性疾病的有效工具。
Description
技术领域：
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种多肽及其单克隆、多克隆抗体和试剂盒。
背景技术：
2010年的统计资料显示中国现有成人糖尿病患者达9240万(发病率10％),更令人担忧的是还有巨大数量的成人糖耐量受损者(Impairedglucosetolerance,IGT)。如何更有效地预防糖尿病，特别是2型糖尿病(type2diabetetsmellitus,T2DM)发生、有效地控制病情发展、减少并发症的发生，已经成为全民族共同关注的焦点之一。
胰岛α细胞分泌胰高血糖素、β细胞分泌胰岛素，两者作用互为相反，在维持机体血糖浓度中起至关重要作用。在胰岛α细胞中,胰高血糖素原基因的主要表达产物是胰高血糖素,而在肠粘膜的L细胞中,胰高血糖素原基因表达的产物经前激素转换酶剪切，其中羧基端的段肽链即为胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)。GLP-1有2种生物活性形式,分别为GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2，GLP-1约80％的循环活性来自GLP-1(7-36)。生物活性GLP-1在体内被二肽酶(DPP-IV)、中性肽链内切酶(NEP)降解成无活性的GLP-1(9-37)和GLP-1(9-36)NH2，半衰期极短仅2min。
研究已证实,GLP-1以葡萄糖浓度依赖性方式促进胰岛β细胞分泌胰岛素,并减少胰岛胰高血糖素分泌从而降低血糖。正常人在进餐后,GLP-1开始分泌,进而促进胰岛素分泌,以减少餐后血糖的波动。但对于T2DM患者,其“肠促胰素效应”受损,主要表现为进餐后GLP-1浓度升高幅度较正常人有所减小,但其促进胰岛素分泌以及降血糖的作用并无明显受损。动物实验和临床研究已经证明GLP-1可通过多种机制明显地改善T2DM动物模型或患者的血糖情况,其中促进胰岛β细胞的再生和修复,增加胰岛β细胞数量的作用尤为显著,这为T2DM的治疗提供了一个非常好的前景。同时GLP-1的这种葡萄糖浓度依赖性降糖特性是其临床应用安全性的基础与保障,从而免除了人们对现有糖尿病治疗药物及方案可能造成患者严重低血糖的担心。此外，动物和临床研究显示，一些治疗措施，如胃转流术治疗非肥胖型糖尿病、胃部分切除术治疗肥胖症以及中医药治疗糖尿病等，均能通过调节循环GLP-1水平来达达到治疗目的，同时通过监测治疗前后外周血中GLP-1水平来指导、调整治疗方案。
近年来，多个制药企业，如美国的礼来公司、默克公司、百时美施贵宝公司，瑞士罗氏制药等均在研制GLP-1相关药物，有的在进行临床试验，有的已经完成了临床试验进入市场，表明GLP-1在不久的将来必定成为IGT、T2DM的常用治疗药物之一。
在GLP-1作为新的治疗方法应用于临床之前，必须完成一个重要的基础工作，那就是要建立快速、准确的测定方法判断患者体内是否真正存在GLP-1分泌不足！准确地监测GLP-1含量变化，对于T2DM的分型诊断、个性化治疗以及不同个体用药剂量等均是必不可少的前提，此外检测方法的建立也是进一步研究GLP-1在IGT、T2DM、代谢综合征等GLP-1缺乏相关性疾病的发病机制及早期预防研究的实验基础。目前在国内定量检测患者血液中总GLP-1含量的ELISA试剂盒尚未见报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种人胰高血糖素样肽-1、抗体及其试剂盒，所述的这种人胰高血糖素样肽-1、抗体及其试剂盒要解决现有技术中没有合适的检测患者血液中总GLP-1含量的ELISA试剂盒的技术问题。
一种人源性GLP-1肽链，氨基酸序列如下：
GLP-1(7-37):HAEGTFTSDVSSTLEGQAAKEFIAWLVKGRG
一种人源性GLP-1肽链，氨基酸序列如下：
GLP-1(7-36):HAEGTFTSDVSSTLEGQAAKEFIAWLVKGR
一种人源性GLP-1肽链，氨基酸序列如下：
GLP-1(9-37):EGTFTSDVSSTLEGQAAKEFIAWLVKGRG
一种人源性GLP-1肽链，氨基酸序列如下：
GLP-1(9-36):EGTFTSDVSSTLEGQAAKEFIAWLVKGR
本发明还提供了一种单克隆抗体，其特征在于：能够识别权利要求1、2、3、或者4所述的多肽。
本发明还提供了一种多克隆抗体，其特征在于：能够识别权利要求1、2、3、或者4所述的多肽，并由HRP标记。
进一步的，所述的单克隆抗体是由保藏号为CCTCCNO：C2014108的杂交瘤细胞株所分泌的。
本发明还提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCCNO：C2014108。
本发明提供了一种试剂盒，含有权利要求1～4所述的多肽、或者权利要求5所述的单克隆抗体、或者权利要求6所述的多克隆抗体。
进一步的，所述的试剂盒用于检测血清、或者血浆中的生物活性和失活的GLP-1总含量。
本发明还提供了一种采用ELISA的方法测定血液或者血浆中GLP-1总含量的方法，包括如下步骤：
1)一个制备反应板的步骤，在所述的制备反应板的步骤中，采用保藏号为CCTCCNO：C2014108的单克隆抗体作为包被抗体，用包被缓冲液作1:1000稀释，加于微孔板中，每孔100ul，置2～5℃冰箱中，20～50小时后取出，用蒸馏水冲洗2～6次，拍干，于微孔板中加入0.5％BSA-PBS，每孔100ul，置30～40℃水浴中1～3小时，取出，用蒸馏水冲洗2～6次，拍干；
2)一个配置标准液的步骤，先配置缓冲液，所述的缓冲液为0.5％BSA-0.05％Tween20-PBS，然后取合成肽抗原GLP-1(9-36)NH2，用缓冲液配，配制成74.5uM的溶液冷冻保存；
3)取上述GLP-1(9-36)融合蛋白(74.5umol/L)用封闭液封闭，每孔100ul，置30～40℃水浴中1～3小时，取出，用蒸馏水冲洗2～6次，拍干；
4)加入HRP-标记兔抗GLP-1抗体，用pH7.2，0.5％BSA-0.05％Tween20-0.15molPBS作1:1500稀释，加于微孔板中，每孔100ul，置2～5℃冰箱中，20～50小时后取出，用蒸馏水冲洗2～6次，拍干；
5)加邻苯二胺底物显色，室温15分钟，用2mol硫酸终止显色；
6)使用主波长492nm，付波长640nm比色；
7)每个96孔酶标板均设0～2980nmol/L标准曲线和空白孔，以吸光度为横坐标，以浓度为纵坐标绘出标准曲线，以各待测样本的吸光度值在标准曲线上查出该样本GLP-1的浓度。
本发明提供的单克隆、多克隆抗体，可用于建立其它的免疫检测方法测定人源性GLP-1总含量，如胶体金快速检测、免疫比浊法等。
本发明的一种杂交瘤细胞株，其分类命名为：杂交瘤细胞株2D11-2，该细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)中，中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武汉大学(武汉市武昌珞珈山)，保藏日期为2014年7月1日，保藏号为CCTCCNO：C2014108。
本发明提供的ELISA试剂盒，测定血清中GLP-1线性范围为1490nmol/L～23.5nmol/L，分析灵敏度为23.5nmol/L。经过初步临床检测分析，健康成人空腹血清总GLP-1参考范围为79.5±39.7nmol/L。IGT和T2DM患者空腹血清总GLP-1含量高于糖耐量正常组，在餐后1小时糖耐量正常组血清总GLP-1水平显著升高，2h恢复至空腹水平。但是在IGT和T2DM患者血清中，餐后1hGLP-1不升反而显著降低，2h接近空腹水平。初步临床检测结果证实本发明不仅提供了辅助IGT和T2DM等早期诊断的血液学指标，而且为GLP-1类生物制剂临床应用提供了必要的监测指标。也为一些治疗糖尿病、肥胖症的其它疗法提供了疗效检测指标。此外除了IGT和T2DM，最近有研究报道代谢综合征、冠心病、阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)均与GLP-1分泌异常有关，本发明提供的各种GLP-1多肽及其抗体、ELISA试剂盒均在相关疾病发病机制、防治研究中起重要作用。
本发明是针对2型糖尿病(T2DM)患者的这种“肠促胰素效应”受损，以及人工合成GLP-1制剂能促进胰岛β细胞再生和修复、有效改善T2DM动物模型或患者的血糖情况，建立血液中GLP-1总含量ELISA检测方法。检测结果发现IGT、T2DM患者空腹GLP-1总体水平较正常人偏高，但餐后GLP-1分泌显著不足。GLP-1总含量ELISA定量检测试剂盒的建立将在IGT、T2DM等GLP-1分泌异常相关性疾病的早期诊断、治疗及疗效监测领域发挥重要作用。
本发明提供的四种人源性GLP-1肽链及其单克隆、多克隆抗体和定量ELISA试剂盒，为临床提供快速、稳定、可靠的GLP-1缺乏相关性疾病的诊断、治疗及疗效检测的有效工具。
附图说明：
图1是GLP-1总含量ELISA检测标准曲线。
图2是正常体检者血清总GLP-1含量分布。
具体实施方式：
实施例1设计和合成人源性生物活性和无活性GLP-1多肽
按照NCBI官方网站上发布的人生物活性、无活性GLP-1氨基酸序列，进行人工生物合成、纯化(图1合成肽链的氨基酸序列)。
实施例2GLP-1多肽及其单克隆及多克隆抗体特征
制备生物合成GLP-1的7-37、7-36、9-37、9-36多肽与BSA融合蛋白。采用GLP-1(9-36)NH2融合蛋白，用加强免疫法免疫家兔制备多克隆抗体，并标记辣根过氧化物酶。采用杂交瘤细胞融合技术，制备GLP-1(9-36)NH2单克隆抗体。
表1鉴定兔抗GLP-1(9-36)NH2融合蛋白多克隆抗体与GLP-1的7-37、7-36、9-37、9-36多肽BSA融合蛋白抗原的反应性(反应滴度)，抗血清经三倍系列稀释后与多肽-BSA抗原蛋白反应，并经二抗-HRP信号放大反应后，在96孔ELISA板上显示出不同中的吸光度(OD)和梯度曲线，以证实所制备的兔抗GLP-1(9-36)NH2多克隆抗体能够识别GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)、GLP-1(9-37)、GLP-1(9-36)抗原肽，并有较高的效价。
以GLP-1(9-36)NH2为抗原制备的单克隆抗体，再采用GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)、GLP-1(9-37)抗原肽分别同时筛选。表2显示所筛选到的单克隆抗体(2D11-2)，与各GLP-1抗原肽融合蛋白反应曲线，表明所筛选到的鼠抗GLP-1(9-36)NH2融合蛋白单克隆抗体同样识别其它GLP-1多肽BSA融合蛋白，效价相近。将该杂交瘤细胞株(2D11-2)进行克隆扩大培养后，送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCCNO：C2014108；
在分析GLP-1多克隆抗体与抗原反应特性实验中，通过棋盘法初步筛选确定GLP-1的四个抗原肽融合蛋白均以250nmol/L浓度、100ul/孔包被ELISA板，室温过夜，反应板封闭后，将不同稀释度抗血清100ul/well加入反应孔内，室温1小时后洗涤三次，再加100ul/well以1:2000稀释HRP偶联的羊抗兔IgG，室温1小时后再洗涤四次，加HRP底物溶液(TMB和过氧化氢)并显色10分钟，读取OD492/640nm值。GLP-1单克隆抗体筛选方法同上，酶标记的显色抗体换成HRP偶联的羊抗鼠IgG。
表1.兔抗GLP-1多克隆抗体与GLP-1抗原肽反应特性
表2.GLP-1单克隆抗体(2D11-2)与GLP-1抗原肽反应特性
从表1、2的结果分析看，所制备的GLP-1(9-36)多克隆抗体和筛选到的单克隆抗体均能识别GLP-1的四个抗原肽，说明单克隆、多克隆抗体所识别的抗原表位为GLP-1(9-36)、(9-37)、(7-36)、(7-37)肽链分子中共有的抗原表位。
实施例3血浆总GLP-1定量ELISA建立
一、反应板制备
1、包被酶标板：保藏号为CCTCCNO：C2014108的单克隆抗体(2D11-2)作为包被抗体，用包被缓冲液(CB)作1:1000稀释，加于微孔板中，每孔100ul。置4℃，48小时。取出，用蒸馏水冲洗5次，拍干。
2、封闭：于微孔板中加入0.5％BSA-PBS，每孔100ul。置37℃，2小时。取出，用蒸馏水冲洗5次，拍干。
二、标准液配制：
1、缓冲液：0.5％BSA-0.05％Tween20-PBS。
2、取合成肽抗原GLP-1(9-36)NH2，用缓冲液配配制成74.5uM冷冻保存。
三、实验步骤：
1、加标准：取上述GLP-1(9-36)融合蛋白(74.5umol/L)用封闭液(作倍比稀释，每孔100ul，37℃，2小时。用蒸馏水洗涤5次，拍干。
2、加入HRP-标记兔抗GLP-1抗体，用pH7.2，0.5％BSA-0.05％Tween20-0.15molPBS作1:1500稀释。加于微孔板中，每孔100ul。置4℃，48小时。取出，用蒸馏水冲洗5次，拍干。
3、加邻苯二胺底物显色，室温15分钟，用2mol硫酸终止显色。
4、使用主波长492nm，付波长640nm比色。
四、实验结果：
表3.连续5天标准液检测结果(吸光度)
实验结果表明，检测范围为1490nmol-23.5nmol/L，分析灵敏度为23.5nmol/L。
实施例4GLP-1ELISA试剂临床初步应用
一、研究对象
收集健康体检者空腹静脉血108例，明确空腹血糖正常、肝肾功能正常、血脂指标均正常，无糖尿病及其它心血管病史，其中男性52例、年龄25～76岁，女性56例，年龄25～75岁。
收集新诊断的IGT、T2DM患者120例，收集糖耐量试验正常人50例，上述对象至少包括空腹、服糖后1h和2h三个时间点样本，累计血样本510个。所有患者均未接受GLP-1或其类似物药物治疗。
采用普通管或促凝管收集血样本，收集血清-20℃冻存，用于血清总GLP-1检测。其它指标血样本按照常规方法收集、检测。
二、血清总GLP-1含量测定
上述所有血清样本按照实施例3所示操作步骤集中进行检验，每个96孔酶标板均设0～2980nmol/L标准曲线和空白孔。
三、血糖、糖化血红蛋白等常规生化项目检测
采用德国罗氏诊断产品公司全自动生化分析仪及其配套试剂，按照临床检验常规检测上述样本血糖、胰岛素(In)、胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、C-反应蛋白(CRP)，应用日本TOSOHG8型糖化血红蛋白分析仪及配套试剂检测糖化血红蛋白(HbA1c)。
四、结果
1.正常人空腹血清总GLP-1含量
按照实施例3方法集中检测，获得健康成人空腹总GLP-1含量79.5±39.7nmol/L，图2显示了108例正常人空腹血清总GLP-1含量的分布情况，从中可以发现糖代谢正常人群中GLP-1的空腹基础值差别较大，含量>100nmol/L占13.89％。
2.IGT、T2DM临床应用分析
所有临床样本检测结果见表4。分析检测的结果，T2DM患者空腹血清总GLP-1含量高于正常组，IGT组偏高、但尚未达到统计学差异。三组对象接受糖耐量测试的同时检测血清总GLP-1含量，发现NGT组在餐后1h血清总GLP-1含量显著升高至2h逐渐回落，而IGT组和T2DM组均呈现餐后1h不升反降的趋势，至餐后2h血清总GLP-1回升不显著，提示IGT组和T2DM组存在GLP-1分泌缺陷。
另外，观察每一列研究对象在进行糖耐量测试中血清总GLP-1含量变化，发现50例NGT空腹、餐后1h、2hGLP-1变化趋势一致。52例IGT患者中有5例、68例T2DM中有3例GLP-1变化趋势与NGT一致，在餐后1小时出现GLP-1水平显著升高，2小时候回落，表明并不是所有IGT、T2DM患者都存在餐后GLP-1分泌不足，患者的糖代谢异常可能存在其它原因。
表4.170例研究对象空腹状态下临床生化指标情况
NGT：糖耐量正常组；IGT：糖耐量异常组；T2DM：2型糖尿病组；FBG：空腹血糖；In：胰岛素；TG：甘油三酯；TC：胆固醇；LDL：低密度脂蛋白；HDL：高密度脂蛋白；HbA1c：糖化血红蛋白；CRP：C反应蛋白。
表5.IGT、T2DM患者餐后血清总GLP-1变化分析
*IGT组或T2DM组与NGT组比较(*p<0.05,**p<0.01)；Δ餐后1h、2h与空腹比较(Δp<0.05，ΔΔp<0.01)。空腹状态下，T2DM组GLP-1水平显著高于NGT组(p＝0.006)，但与IGT组无显著差异。各组内餐后GLP-1水平比较，NGT组餐后1hGLP-1水平显著上升，2h后回落至空腹水平，IGT组餐后1h反而是降低(p＝0.000)，餐后2h仍然低于空腹水平(p＝0.003)。T2DM组餐后1hGLP-1水平显著降低(p＝0.011)，餐后2hGLP-1水平，从数值上看仍然低，但与空腹水平无显著差异(p＝0.056)。
结论：采用本发明建立的血清(血浆)总GLP-1ELISA检测方法，首先建立正常人空腹血清GLP-1参考范围为79.5±39.7nmol/L，并发现正常个体间GLP-1的空腹基础值差异较大。分析IGT、T2DM患者空腹、餐后不同时段血液中总GLP-1含量，发现120例IGT、T2DM患者中112例患者存在餐后GLP-1分泌缺陷。本发明的重要意义在于所公开的血清(血浆)总GLP-1定量ELISA检测方法，能动态定量监测血液中总GLP-1含量变化，对于T2DM的分型诊断、个性化治疗以及其它GLP-1缺乏相关性疾病(代谢综合征、冠心病、老年痴呆等)的发病机制及早期预防研究奠定了实验基础。此外，检测血液中总GLP-1含量，配合生物活性GLP-1检测，可全面了解受试者体内GLP-1分泌、失活的状况，是GLP-1相关基础及临床研究必不可少的工具。
Claims (4)
1.一种单克隆抗体，其特征在于：是由保藏号为CCTCCNO：C2014108的杂交瘤细胞株所分泌的。
2.一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCCNO：C2014108。
3.一种试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述的单克隆抗体。
4.一种采用ELISA的方法测定血液或者血浆中GLP-1总含量的方法，其特征在于包括如下步骤：
1）一个制备反应板的步骤，在所述的制备反应板的步骤中，采用保藏号为CCTCCNO：C2014108的单克隆抗体作为包被抗体，用包被缓冲液作1:1000稀释，加于微孔板中，每孔100ul，置2~5℃冰箱中，20~50小时后取出，用蒸馏水冲洗2~6次，拍干，于微孔板中加入0.5%BSA-PBS，每孔100ul，置30~40℃水浴中1~3小时，取出，用蒸馏水冲洗2~6次，拍干；
2）一个配置标准液的步骤，先配置缓冲液，所述的缓冲液为0.5%BSA-0.05%Tween20-PBS，然后取合成肽抗原GLP-1(9-36)NH2，用缓冲液配，配制成74.5uM的溶液冷冻保存；
3）取上述配制好的74.5uM的溶液，用封闭液稀释，每孔100ul，置30~40℃水浴中1~3小时，取出，用蒸馏水冲洗2~6次，拍干；
4）加入HRP-标记兔抗GLP-1抗体，用pH7.2，0.5%BSA-0.05%Tween20-0.15molPBS作1:1500稀释，加于微孔板中，每孔100ul，置2~5℃冰箱中，20~50小时后取出，用蒸馏水冲洗2~6次，拍干；
5）加邻苯二胺底物显色，室温15分钟，用2mol硫酸终止显色；
6）使用主波长492nm，副波长640nm比色；
7）每个96孔酶标板均设0～2980nmol/L标准曲线和空白孔，以吸光度为横坐标，以浓度为纵坐标绘出标准曲线，以各待测样本的吸光度值在标准曲线上查出该样本GLP-1的浓度。
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