CN104328133B - 葡聚糖酶Cel16A及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了葡聚糖酶Cel16A及其编码基因和应用。本发明从特异腐质霉中分离到葡聚糖酶Cel16A编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.3所示，其所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示；本发明公开了成熟的葡聚糖酶Cel16A，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，其编码的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。本发明还公开了含有所述基因的重组表达载体和重组宿主细胞。本发明葡聚糖酶最适pH为5.5，在pH 4.0‑10.0之间均很稳定，最适温度为55℃；本发明葡聚糖酶Cel16A稳定性好，酶活高，能够高效降解葡聚糖、地衣多糖或昆布多糖，可应用于酿酒、纺织、饲料或能源工业等领域。
Description
技术领域
本发明涉及葡聚糖酶，尤其涉及从特异腐质霉(Humicola insolens)中分离的葡聚糖酶Cel16A，本发明还涉及该酶的编码基因及其应用，属于葡聚糖酶的分离及应用技术领域。
背景技术
纤维素类物质包括纤维素、半纤维素和木质素，是自然界中最丰富的可再生资源。纤维素是由D-吡喃式葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而成的线性大分子聚合物，是植物细胞壁的主要成分。木质素是由苯基丙烷结构单元通过碳-碳键和醚键连接而成的具有三度空间结构的芳香性高聚物，形成纤维支架，具有强化木质纤维的作用。半纤维素由杂聚多糖组成，根据主链组成占多数的糖的种类各有不同，可分为葡聚糖、甘露聚糖和葡甘露聚糖等(Schulze E 1891.Ber Dtsch Chem Ges 24,2277-2287.)。其中β-葡聚糖是植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，富含于单子叶禾本科植物的糊粉层和胚乳细胞中，如大麦和燕麦胚乳细胞壁含有约70～75％的葡聚糖(Philippe S et al.2006.Planta 224(2),449-461.)。
β-葡聚糖酶是内切β-1,3、β-1,4-葡聚糖酶和外切β-1,3、β-1,4葡聚糖酶的总称。它作用于β-葡聚糖的β-1,3和β-1,4糖苷键,使β-葡聚糖分解成还原糖和寡糖。在饲料加工业中，β-葡聚糖酶通过降解β-葡聚糖，使其降解为低分子量片段，失去亲水性和粘性。改变单胃动物肠道内容物的特性，提高内源性消化酶活性，改变肠道微生物环境，利于动物对营养物质的消化和吸收，提高生长性能和饲料的转化率(Mathlouthi N et al.2002.Amin Res 51,395-406.)在食品和饲料工业等方面有广阔的应用前景。在啤酒加工业中，β-葡聚糖酶能高效地将麦芽中的β-葡聚糖水解为葡萄糖和低聚糖，摧毁细胞壁，使细胞内容物大量地释放出来，提高麦芽汁得率，降低醪液粘度从而缩短糖化醪过滤时间，所获麦汁清亮，使制得的啤酒色泽浅，泡沫均匀持久。因此，将β-葡聚糖酶用于啤酒糖化和发酵过程，可节约用粮，降低成本，提高糖化过滤设备的效能，有利于啤酒的质量提高及稳定(宫春波等，2002，广州食品工业科技)。
由于不同工业对β-葡聚糖酶需求的不同，因此，获得新型具有优良特性的β-葡聚糖酶仍具有重大意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种从特异腐质霉(Humicolainsolens)中分离的葡聚糖酶Cel16A，该酶在pH 4～10范围内具有良好的稳定性，并且具有较高的葡聚糖酶活性。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先公开了从特异腐质霉(Humicola insolens)中分离的葡聚糖酶Cel16A的编码基因，其核苷酸序列为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：
(a)、SEQ ID No.1所示的多核苷酸；或
(b)、编码SEQ ID No.2所示氨基酸的多核苷酸；或
(c)、与SEQ ID No.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有葡聚糖酶Cel16A的功能；或
(d)、与SEQ ID No.1所示的多核苷酸至少有70％或以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有葡聚糖酶Cel16A的功能；优选的，其与SEQ ID No.1所示的多核苷酸至少有80％或以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有葡聚糖酶Cel16A的功能；优选的，其与SEQ ID No.1所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有葡聚糖酶Cel16A的功能；优选的，其与SEQ ID No.1所示的多核苷酸至少有95％或以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有葡聚糖酶Cel16A的功能；最优选的，其与SEQ ID No.1所示的多核苷酸至少有98％或以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有葡聚糖酶Cel16A的功能；或
(e)、在SEQ ID No.1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有葡聚糖酶Cel16A的功能。
所述编码基因编码的成熟的葡聚糖酶Cel16A，其氨基酸序列为(a)或(b)所示：
(a)、SEQ ID No.2所示的氨基酸；
(b)、将SEQ ID No.2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有葡聚糖酶Cel16A功能的蛋白变体。
本发明还公开了从特异腐质霉(Humicola insolens)中分离的葡聚糖酶Cel16A的编码基因，其核苷酸序列为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：
(a)、SEQ ID No.3所示的多核苷酸；或
(b)、编码SEQ ID No.4所示氨基酸的多核苷酸；或
(c)、与SEQ ID No.3的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有葡聚糖酶Cel16A的功能；或
(d)、与SEQ ID No.3所示的多核苷酸至少有70％或以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有葡聚糖酶Cel16A的功能；优选的，其与SEQ ID No.3所示的多核苷酸至少有80％或以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有葡聚糖酶Cel16A的功能；优选的，其与SEQ ID No.3所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有葡聚糖酶Cel16A的功能；优选的，其与SEQ ID No.3所示的多核苷酸至少有95％或以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有葡聚糖酶Cel16A的功能；最优选的，其与SEQ ID No.3所示的多核苷酸至少有98％或以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有葡聚糖酶Cel16A的功能；或
(e)、在SEQ ID No.3所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有葡聚糖酶Cel16A的功能。
所述编码基因编码的葡聚糖酶Cel16A，其氨基酸序列为(a)或(b)所示：
(a)、SEQ ID No.4所示的氨基酸；
(b)、将SEQ ID No.4所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有葡聚糖酶Cel16A功能的蛋白变体。
本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备葡聚糖酶Cel16A的氨基酸序列变体或片段，其中用于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。本发明所述的葡聚糖酶Cel16A及其编码基因包括天然存在的序列和变体两种形式。“变体”意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所得到的仍编码SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示的氨基酸的多核苷酸变体，或者是通过重组的方法(例如DNA改组)。
本发明通过PCR方法分离克隆了葡聚糖酶Cel16A的编码基因，DNA全序列分析结果表明，含有信号肽序列的葡聚糖酶基因的cDNA序列全长861bp，编码286个氨基酸和一个终止密码子，其核苷酸序列为SEQ IDNo.3所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示；其N端20个氨基酸为其预测的信号肽序列，其氨基酸序列为SEQ ID No.6所示，信号肽的编码序列为SEQ ID No.5所示。不含有信号肽的成熟的葡聚糖酶Cel16A，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，其编码的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。因此，成熟的葡聚糖酶Cel16A的理论分子量为30.9kDa。
将葡聚糖酶基因的cDNA序列(SEQ ID No.1所示)及推导出的氨基酸序列(SEQ ID No.2所示)在GenBank中进行BLAST比对，结果，该基因与来源于Chaetomium globosum CBS 148.51的hypothetical proteinCHGG_04043氨基酸序列一致性为68％。说明本发明分离的葡聚糖酶Cel16A是一种新的葡聚糖酶。
本发明还公开了含有所述葡聚糖酶Cel16A的编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体优选为pPIC-cel16A。
将本发明的葡聚糖酶Cel16A的编码基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的葡聚糖酶Cel16A的编码基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC-cel16A。
另外，本领域技术人员可以将SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的多核苷酸进行优化以增强在重组宿主细胞或重组菌株中的表达效率。例如，可采用目标宿主细胞的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标宿主细胞中的表达效率。
本发明还公开了含有所述的重组表达载体的重组宿主细胞或重组菌株。
其中，所述重组宿主细胞可为原核细胞或真核细胞；优选的，所述重组宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞中的任意一种，优选为毕赤酵母细胞；
所述重组菌株选自糖酵母属、克鲁维氏酵母属、裂殖糖酵母属或甲基营养型酵母菌株中的任意一种；其中，所述甲基营养型酵母菌株优选为毕赤氏酵母属菌株。
将所述多核苷酸或多肽引入重组宿主细胞的合适方法包括：电转化法、原生质体法、化学转化法等，这些操作方法通常为本领域所了解。
本发明还公开了一种制备所述葡聚糖酶Cel16A的方法，包括以下步骤：
(1)用含有所述葡聚糖酶Cel16A编码基因的重组表达载体转化宿主细胞，获得重组菌株；
(2)培养重组菌株，诱导葡聚糖酶Cel16A表达；
(3)回收并纯化所表达的葡聚糖酶Cel16A。
本发明将不含信号肽序列的葡聚糖酶基因的cDNA序列插入到毕赤酵母表达载体pPIC9上，使之位于α-因子信号肽下游，构建重组表达质粒pPIC-cel16A，并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/cel16A。测得葡聚糖酶Cel16A的表达量为150.6U/mL。SDS-PAGE结果表明，葡聚糖酶Cel16A在毕赤酵母中得到了分泌表达；重组葡聚糖酶Cel16A的比活为693.3U/mg。
葡聚糖酶Cel16A的最适pH和pH稳定性的测定结果表明，本发明葡聚糖酶Cel16A的最适pH为5.5，在pH 4.0-10.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在50％左右。葡聚糖酶Cel16A的最适温度及热稳定性测定结果表明，葡聚糖酶Cel16A最适温度为55℃。葡聚糖酶Cel16A在50℃下温育1h，酶活力仍保留80％左右。葡聚糖酶Cel16A的Km值的测定结果表明，以大麦葡聚糖为底物时的Km值为0.91mg/mL，最大反应速度Vmax为1530.2μmol/min·mg。不同金属离子化学试剂对葡聚糖酶Cel16A酶活的影响测定结果表明，大多数离子和化学试剂在浓度为1mM或者10mM时葡聚糖酶Cel16A的活力没有明显变化。但是Ag+完全阻断其活力；Cu2+在1mM时对葡聚糖酶Cel16A的酶活力影响不明显，而在浓度为10mM时可强烈抑制其活力。
葡聚糖酶Cel16A除可作用于葡聚糖外，对于地衣多糖，昆布多糖也有一定的降解作用。其对地衣多糖的降解能力相对于大麦葡聚糖的为42.6％，其对昆布多糖的降解能力相对于大麦葡聚糖的为16.5％。
本发明葡聚糖酶Cel16A能有效地降解β-葡聚糖，对于地衣多糖，昆布多糖也有一定的降解作用，易于工业化发酵生产。本发明葡聚糖酶Cel16A或其编码基因可广泛应用于酿酒、纺织或能源工业等。例如在啤酒加工业中，本发明葡聚糖酶Cel16A能高效地将麦芽中的β-葡聚糖水解为葡萄糖和低聚糖，摧毁细胞壁，使细胞内容物大量地释放出来，提高麦芽汁得率，降低醪液粘度从而缩短糖化醪过滤时间，所获麦汁清亮，使制得的啤酒色泽浅，泡沫均匀持久。
在饲料加工业中，本发明葡聚糖酶Cel16A通过降解β-葡聚糖，使其降解为低分子量片段，失去亲水性和粘性，改变单胃动物肠道内容物的特性，提高内源性消化酶活性，改变肠道微生物环境，利于动物对营养物质的消化和吸收，提高生长性能和饲料的转化率。
本发明技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：
本发明葡聚糖酶Cel16A的最适pH为5.5，在pH 4.0-10.0之间均很稳定，并且还具有较高的葡聚糖酶活性，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在50％左右。葡聚糖酶Cel16A最适温度为55℃，在50℃下温育1h，酶活力仍保留80％左右。葡聚糖酶Cel16A除可作用于葡聚糖外，对于地衣多糖，昆布多糖也有一定的降解作用。因此，本发明葡聚糖酶Cel16A可广泛应用于酿酒、纺织、饲料或能源工业等。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍)。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。
术语“启动子”意指存在于目的基因编码序列的上游，提供RNA聚合酶和正确转录起始所必需的其它因子的识别位点，启动或指导目的基因转录为mRNA。
术语“可操作的连接”意指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。
术语“转化”意指将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。
术语“表达”意指内源性基因或转基因在细胞中的转录和/或翻译。
术语“比活力(性)”是酶纯度的量度，意指单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示；一般来说，酶的比活力越高，酶越纯。
附图说明
图1为重组毕赤酵母菌株GS115/cel16A发酵湿重及酶活测定；
图2为SDS-PAGE检测纯化的葡聚糖酶Cel16A，其中，M为蛋白Marker；Cel16A为葡聚糖酶Cel16A；
图3为葡聚糖酶Cel16A的最适pH测定结果；
图4为葡聚糖酶Cel16A的pH稳定性测定结果；
图5为葡聚糖酶Cel16A的最适温度测定结果；
图6为葡聚糖酶Cel16A的热稳定性测定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、实验材料和试剂
1.1菌株及载体
特异腐质霉(Humicola insolens Y1CGMCC 4573)从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心分发，其保藏编号为：CGMCC No.4573。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
1.2酶类及其它生化试剂
内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自NEB公司。大麦葡聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。1.3培养基
(1)Humicola insolens产孢培养基为马铃薯培养基：
1000mL 200g土豆煮汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH5.0。
(2)Humicola insolens纤维素酶诱导培养基：
30g/L麦麸、30g/L玉米芯粉、5g/L(NH4)SO4、1g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、0.01g/L FeSO4·7H2O、0.2g/L CaCl2。
(3)大肠杆菌培养基LB：
1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH7.0。
(4)毕赤酵母发酵培养基：
PTM微量盐：0.6％CuSO4，0.008％NaI2，0.3％MnSO4，0.02％Na2MoO4，0.002％H3BO3，0.05％CoCl2，2％ZnCl2，6.5％FeSO4，0.5％硫酸(v/v)。
酵母发酵基础盐培养基(FBSM)：
0.5％KH2PO4，5％NH4H2PO4，1.485％MgSO4，1.82％K2SO4，0.093％CaSO4，0.15％KOH，0.00011％Biotin，0.44％PTM微量盐，2％葡萄糖。
酵母发酵基础盐诱导培养基(FBIM)：
0.5％KH2PO4，5％NH4H2PO4，1.485％MgSO4，1.82％K2SO4，0.093％CaSO4，0.15％KOH，0.00011％Biotin，0.44％PTM微量盐，0.5％甲醇。
Na2HPO4-柠檬酸缓冲液(0.1mol/L pH5.2)：
0.2mol/L磷酸氢二钠536ml，0.1mol/L柠檬酸464ml，混匀后调pH至5.2。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1特异腐质霉(Humicola insolens)葡聚糖酶编码基因cel16A cDNA的克隆
提取特异腐质霉在纤维素酶诱导培养基上生长2d时的菌体的总RNA，将其反转录得到cDNA后，以此为模板，利用特异性引物Cel16AF(5’-GGGGAATTCTGGGACGCCCCCTATTACCATGGCTG-3’)和Cel16AR(5’-GCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCAATAACTGTAGTATTGGGCAACATAG-3’)，经PCR扩增得到去除天然信号肽的葡聚糖酶基因cel16A的cDNA片段，并克隆至pEASY-Blunt载体，测序验证。
DNA全序列分析结果表明，含有信号肽序列的葡聚糖酶基因的cDNA序列全长861bp，编码286个氨基酸和一个终止密码子，其核苷酸序列为SEQ ID No.3所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示；其N端20个氨基酸为其预测的信号肽序列，其氨基酸序列为SEQ ID No.6所示，信号肽的编码序列为SEQ ID No.5所示。不含有信号肽的成熟的葡聚糖酶Cel16A，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，其编码的核苷酸序列为SEQID No.1所示。因此，成熟的葡聚糖酶Cel16A的理论分子量为30.9kDa。
将葡聚糖酶基因的cDNA序列(SEQ ID No.1所示)及推导出的氨基酸序列(SEQ ID No.2所示)在GenBank中进行BLAST比对，结果，该基因与来源于Chaetomium globosum CBS 148.51的hypothetical proteinCHGG_04043氨基酸序列一致性为68％。说明本发明分离的葡聚糖酶Cel16A是一种新的葡聚糖酶。
实施例2葡聚糖酶Cel16A的制备
将不含有信号肽序列的葡聚糖酶基因的cDNA序列(SEQ ID No.1所示)插入到毕赤酵母表达载体pPIC9上，使之位于α-因子信号肽下游，构建重组表达质粒pPIC-cel16A。
将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将实施例1构建的连接有不含有信号肽序列的葡聚糖酶基因的cDNA序列的克隆载体双酶切(EcoR I+Not I)，切出目的片段与表达载体pPIC9连接，获得重组质粒pPIC-cel16A并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/cel16A。
取含有重组质粒的GS115菌株，先经FBSM培养基培养使其快速生长48h后，再经FBIM培养基诱导培养84h后，取上清，测定葡聚糖酶的活力。发酵过程中取样测定菌体湿重及葡聚糖酶的活力，结果见图1。葡聚糖酶Cel16A的表达量为150.6U/mL。发酵上清用0.1μm滤膜过滤杂质，然后用赛托利斯10kD滤膜浓缩，浓缩液直接过Akta的His-Trap柱，收集酶活峰。SDS-PAGE结果表明，葡聚糖酶Cel16A在毕赤酵母中得到了分泌表达(图2)。
采用DNS法进行葡聚糖酶Cel16A的活性分析：在pH6.0，60℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液(实施例2制备的葡聚糖酶Cel16A)，900μL大麦葡聚糖底物(1％)，反应10min，加入1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。实验结果表明，葡聚糖酶Cel16A的比活为693.3U/mg。
实施例3葡聚糖酶Cel16A的性质测定
以实施例2纯化的葡聚糖酶Cel16A为研究对象，对该酶的相关性质进行测定。
1、葡聚糖酶Cel16A的最适pH和pH稳定性的测定
将实施例2纯化的葡聚糖酶Cel16A在不同pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物大麦葡聚糖，在不同pH的0.2mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中55℃下进行葡聚糖酶活力测定。
测定结果(图3)表明，葡聚糖酶Cel16A的最适pH为5.5。葡聚糖酶Cel16A于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH5.5缓冲液体系中55℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图4)表明，葡聚糖酶Cel16A在pH 4.0-10.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在50％左右。
2、葡聚糖酶Cel16A的最适温度及热稳定性测定
葡聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为葡聚糖酶在不同温度(50℃、55℃和60℃)下处理不同时间，再在55℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图5)表明，葡聚糖酶Cel16A最适温度为55℃。酶的热稳定性实验结果表明(图6)，葡聚糖酶Cel16A在50℃下温育1h，酶活力仍保留80％左右。
3、葡聚糖酶Cel16A的Km值的测定
用不同浓度的葡聚糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.5)缓冲液体系中，55℃下测定酶活性，计算出其Km值。
经测定，以大麦葡聚糖为底物时的Km值为0.91mg/mL，最大反应速度Vmax为1530.2μmol/min·mg。
4、不同金属离子化学试剂对葡聚糖酶Cel16A酶活的影响测定
在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1mM或者10mM。在55℃、pH5.5条件下测定酶活性。
结果表明(表1)，大多数离子和化学试剂在浓度为1mM或者10mM时葡聚糖酶Cel16A的活力没有明显变化。但是Ag+完全阻断其活力；Cu2+在1mM时对葡聚糖酶Cel16A的酶活力影响不明显，而在浓度为10mM时可强烈抑制其活力。
表1 不同金属离子化学试剂对葡聚糖酶Cel16A酶活的影响
5、葡聚糖酶Cel16A的底物特异性
葡聚糖酶Cel16A除可降解葡聚糖外，对于地衣多糖，昆布多糖也有一定的降解作用。其对地衣多糖的降解能力相对于大麦葡聚糖的为42.6％，其对昆布多糖的降解能力相对于大麦葡聚糖的为16.5％(表2)。表2 葡聚糖酶Cel16A的底物特异性分析
*未检测到。
Claims (11)
1.从特异腐质霉(Humicola insolens)中分离的葡聚糖酶Cel16A的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列为编码SEQ ID N o.2所示氨基酸的多核苷酸。
2.权利要求1所述编码基因编码的葡聚糖酶Cel16A，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
3.从特异腐质霉(Humicola insolens)中分离的葡聚糖酶Cel16A的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列为编码SEQ ID No.4所示氨基酸的多核苷酸。
4.权利要求3所述编码基因编码的葡聚糖酶Cel16A，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID No.4所示。
5.含有权利要求1或3所述编码基因的重组表达载体。
6.按照权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为pPIC-cel16A。
7.含有权利要求5所述的重组表达载体的重组宿主细胞。
8.按照权利要求7所述的重组宿主细胞，其特征在于：所述重组宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞中的任意一种。
9.一种制备权利要求2或4所述葡聚糖酶Cel16A的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用权利要求5所述的重组表达载体转化宿主细胞，获得重组菌株；
(2)培养重组菌株，诱导葡聚糖酶Cel16A表达；
(3)回收并纯化所表达的葡聚糖酶Cel16A。
10.权利要求1或3所述编码基因在降解葡聚糖、地衣多糖或昆布多糖中的应用。
11.权利要求2或4所述葡聚糖酶Cel16A在降解葡聚糖、地衣多糖或昆布多糖中的应用。
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