CN104371019B - 一种能与glp-1r特异性结合的抗体及其与glp-1的融合蛋白质 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能与GLP‑1R特异性结合的抗体及其与GLP‑1的融合蛋白。这些融合蛋白质可以高效地与人GLP‑1R受体结合并激活受体信号通道，可以被用于糖尿病，超重，肥胖，及其相关病症的治疗。

Description

一种能与GLP-1R特异性结合的抗体及其与GLP-1的融合蛋 白质

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，特别涉及一种能与GLP-1R特异性结合的抗体及其与GLP-1的融合蛋白质。

背景技术

II型糖尿病的典型症状包括以下三个方面：1）外周胰岛素抵抗，主要是骨骼和肌肉对胰岛素的应激度下降，导致对这些组织的葡萄糖输出受到影响（Kahn and Goldfine,J Diabetes Complication（1993）7：92-105；Weyer 等, J Clin Invest.（1999）104:787-794）；2）过度的肝脏葡萄糖生成，肝脏细胞对胰岛素的调节应激降低（Kahn and Goldfine,J Diabetes Complication. （1993）7：92-105；Lam 等, Am J Physiol EndocrinolMetab.（2009）11:375-378）和胰高血糖素的过度分泌（Unger and Orci, Arch InternMed.（1977）137:482-491）；3）胰岛beta细胞失调，在疾病早期，beta细胞的增殖和胰岛素分泌量增加代偿性弥补胰岛素抵抗对血糖的影响（Bonner-Weir, Trends EndocrinolMetab.（2000）11:375-378）, 但随着时间和胰岛素抵抗程度的增加导致beta细胞耗竭，胰岛素分泌随之下降导致了II型糖尿病的真正始发（DeFronzo, Diabetes.（1988）37:667-687; Kahn 等, J Nutr.（2001）131:354S-360S）。

胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是一个包含有30个氨基酸的肽段。它由肠道内L细胞分泌来应激葡萄糖的摄入（Orskov 等, Diabetes （1994）43:535-539; Drucker 等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA（1987）84:3431-3438）。其应激分泌后，GLP-1和胰腺上的GLP-1R（胰高血糖素样肽-1受体）结合激活下游腺苷酸环化酶信号通路来促进胰岛素的合成与分泌。GLP-1分泌还会减少胃排空，以此来减少食物消化后进入循环系统的葡萄糖的量（Wettergren 等, Dig. Dis. Sci.（1993）38：665-673）。在小鼠以及I型和II型糖尿病患者中，GLP-1增加了胰岛素的分泌降低血糖浓度（Nauck 等, Diabetes.（1997）105:187-195;Todd 等, Eur J Clin Invest.（1997）27:533-536）。有研究显示，GLP-1还能够抑制胰腺beta细胞的凋亡，促进其增殖（Perfetti 等, Endocrinology（2000）141:4600-4605；Hui等, Endocrinology（2003）144:1444-1455）。临床已经证实了GLP-1在治疗糖尿病病人上的可行性和效果（Samson and Garber，Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes.（2013）20:87-97），也已经有专利（U.S Pat. No 5,899,883，U.S. Pat. No. 6,989,148）叙述了使用GLP-1及其衍生物来治疗糖尿病的方法。但是GLP-1在体内半衰期较短，治疗效果不佳。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种能与GLP-1R特异性结合的抗体。

本发明的目的之二在于提供一种能与GLP-1R特异性结合的抗体与GLP-1形成的融合蛋白质，它能延长GLP-1的体内半衰期来保留GLP-1分子生物学活性。同时，GLP-1和能与GLP-1R特异性结合的抗体形成的融合蛋白质具有由抗体提供的分子靶向性，而且抗体的免疫源性也低于其他的融合蛋白质伙伴。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种能与GLP-1R特异性结合的抗体，所述抗体包含以下方案之一的氨基酸序列：

a．选自以下序列之一的轻链CDR3序列:

与选自L1-L13的轻链CDR3序列：SEQ ID NO: 46~SEQ ID NO: 53其中之一相差总共不超过三个氨基酸添加、替换和／或缺失的轻链CDR3序列；优选的与选自L1-L13的轻链CDR3序列：SEQ ID NO: 46~SEQ ID NO: 53其中之一相差总共不超过两个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR3序列；更优选的与选自L1-L13的轻链CDR3序列：SEQ ID NO: 46~SEQID NO: 53其中之一相差一个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR3序列。

b．选自以下序列之一的重链CDR3序列：

与选自H1-H13的重链CDR3序列：SEQ ID NO: 20~SEQ ID NO: 27其中之一相差总共不超过四个氨基酸添加、替换和／或缺失的重链CDR3序列；优选的与选自H1-H13的重链CDR3序列：SEQ ID NO: 20~SEQ ID NO: 27其中之一相差总共不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR3序列；进一步的与选自H1-H13的重链CDR3序列：SEQ ID NO: 20~SEQID NO: 27其中之一相差总共不超过二个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR3序列；更进一步的与选自H1-H13的重链CDR3序列：SEQ ID NO: 20~SEQ ID NO: 27其中之一相差一个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR3序列。

c．(a)的轻链CDR3序列和(b)的重链CDR3序列。

作为优选，所述抗体还包含以下方案的一种或几种组合的氨基酸序列：

a．选自以下之一的轻链CDR1序列：

与选自L1-L13的轻链CDR1序列：SEQ ID NO: 28~SEQ ID NO:37其中之一相差不超过三个氨基酸添加、替换和／或缺失的轻链CDR1；优选的与选自L1-L13的轻链CDR1序列：SEQID NO: 28~SEQ ID NO:37其中之一相差总共不超过两个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR1序列；更优选的与选自L1-L13的轻链CDR1序列：SEQ ID NO: 28~SEQ ID NO:37其中之一相差一个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR1序列。

b．选自以下之一的轻链CDR2序列：

与选自L1-L13的轻链CDR2序列：SEQ ID NO: 38~SEQ ID NO: 45其中之一相差不超过两个氨基酸添加、替换和／或缺失的轻链CDR2；优选的与选自L1-L13的轻链CDR2序列：SEQ ID NO: 38~SEQ ID NO: 45其中之一相差一个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR2序列。

c．选自以下之一的重链CDR1序列：

与选自H1-H13的重链CDR1序列：SEQ ID NO: 6~SEQ ID NO: 12其中之一相差不超过两个氨基酸添加、替换和／或缺失的重链CDR1；优选的与选自H1-H13的重链CDR1序列：SEQID NO: 6~SEQ ID NO: 12其中之一相差一个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR2序列。

d．选自以下之一的重链CDR2：

与选自H1-H13的重链CDR2序列：SEQ ID NO: 13~SEQ ID NO: 19其中之一相差不超过三个氨基酸添加、替换和／或缺失的重链序列。优选的与选自H1-H13的重链CDR2序列：SEQ ID NO: 13~SEQ ID NO: 19其中之一相差总共不超过两个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR1序列；更优选的与选自H1-H13的重链CDR2序列：SEQ ID NO: 13~SEQ ID NO: 19其中之一相差一个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR1序列。

一种能与GLP-1R特异性结合的抗体，所述抗体包含以下方案之一：

a．包含以下方案的一种或几种的轻链可变结构域：

i．选自SEQ ID NO: 28~SEQ ID NO: 37其中之一的轻链CDR1序列；

ii．选自SEQ ID NO: 38~SEQ ID NO: 45其中之一的轻链CDR2序列；

iii．选自SEQ ID NO: 46~SEQ ID NO: 53其中之一的轻链CDR3序列；

b．包含以下方案的一种或几种的重链可变结构域：

i．选自SEQ ID NO: 6~SEQ ID NO: 12其中之一的重链CDR1序列；

ii．选自SEQ ID NO: 13~SEQ ID NO: 19其中之一的重链CDR2序列；

iii．选自SEQ ID NO: 20~SEQ ID NO: 27其中之一的重链CDR3序列；

c．(a)的轻链可变结构域序列和(b)的重链可变结构域序列。

一种能与GLP-1R特异性结合的抗体，所述抗体包含以下方案之一的氨基酸序列：

a．选自以下方案之一的轻链可变结构域序列：

i．具有与选自L1-L13的轻链可变结构域序列：SEQ ID NO: 81，SEQ ID NO: 83，SEQ ID NO: 85，SEQ ID NO: 87，SEQ ID NO: 89，SEQ ID NO: 91，SEQ ID NO: 93，SEQ IDNO: 95，SEQ ID NO: 97，SEQ ID NO: 99，SEQ ID NO: 101，SEQ ID NO: 103，SEQ ID NO:105其中之一至少80%相同的序列的氨基酸；

ii．与编码L1-L13的轻链可变结构域序列的多聚核苷酸序列：SEQ ID NO: 80，SEQID NO: 82，SEQ ID NO: 84，SEQ ID NO: 86，SEQ ID NO: 88，SEQ ID NO: 90，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO: 94，SEQ ID NO: 96，SEQ ID NO: 98，SEQ ID NO: 100，SEQ ID NO: 102，SEQ ID NO: 104其中之一至少80%相同的多聚核苷酸序列编码的氨基酸序列；

b．选自以下的重链可变结构域序列：

i．与H1-H13的重链可变结构域序列：SEQ ID NO: 55，SEQ ID NO: 57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO: 61，SEQ ID NO: 63，SEQ ID NO: 65，SEQ ID NO: 67，SEQ ID NO: 69，SEQID NO: 71，SEQ ID NO: 73，SEQ ID NO: 75，SEQ ID NO: 77，SEQ ID NO: 79其中之一至少80%相同的氨基酸序列；

ii．与编码H1-H13的重链可变结构域序列的多聚核苷酸序列：SEQ ID NO: 54，SEQID NO: 56，SEQ ID NO: 58，SEQ ID NO: 60，SEQ ID NO: 62，SEQ ID NO: 64，SEQ ID NO:66，SEQ ID NO: 68，SEQ ID NO: 70，SEQ ID NO: 72，SEQ ID NO: 74，SEQ ID NO: 76，SEQID NO: 78其中之一至少80%相同的多聚核苷酸序列编码的氨基酸序列；

c．(a)的轻链可变结构域序列和(b)的重链可变结构域序列。

作为优选，所述抗体还包含以下方案之一的氨基酸序列：

a．选自L1-L13的轻链可变结构域序列: SEQ ID NO: 81，SEQ ID NO: 83，SEQ IDNO: 85，SEQ ID NO: 87，SEQ ID NO: 89，SEQ ID NO: 91，SEQ ID NO: 93，SEQ ID NO: 95，SEQ ID NO: 97，SEQ ID NO: 99，SEQ ID NO: 101，SEQ ID NO: 103，SEQ ID NO: 105其中之一的轻链可变结构域序列；

b．选自H1-H13重链可变结构域序列: SEQ ID NO: 55，SEQ ID NO: 57，SEQ IDNO: 59，SEQ ID NO: 61，SEQ ID NO: 63，SEQ ID NO: 65，SEQ ID NO: 67，SEQ ID NO: 69，SEQ ID NO: 71，SEQ ID NO: 73，SEQ ID NO: 75，SEQ ID NO: 77，SEQ ID NO: 79其中之一的重链可变结构域序列；

c．a的轻链可变结构域序列和b的重链可变结构域序列。

作为优选，方案c中a的轻链可变结构域序列与b的重链可变结构域序列的组合选自以下之一：L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13。

作为优选，所述抗体还包含以下方案之一的氨基酸序列：

a．SEQ ID NO: 106的轻链恒定区氨基酸序列；

b．SEQ ID NO: 107的轻链恒定区氨基酸序列；

c．SEQ ID NO: 108的重链恒定区氨基酸序列；

d．SEQ ID NO: 109的重链恒定区氨基酸序列；

e．SEQ ID NO: 106的轻链恒定区氨基酸序列和SEQ ID NO: 108的重链恒定区氨基酸序列；

f．SEQ ID NO: 107的轻链恒定区氨基酸序列和SEQ ID NO: 108的重链恒定区氨基酸序列；

g．SEQ ID NO: 106的轻链恒定区氨基酸序列和SEQ ID NO: 109的重链恒定区氨基酸序列；

h．SEQ ID NO: 107的轻链恒定区氨基酸序列和SEQ ID NO: 109的重链恒定区氨基酸序列。

作为优选，所述抗体选自鼠源抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、Fab片段、F(fa’)x片段、结构域抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体。

一种GLP-1融合蛋白质，所述GLP-1融合蛋白质由GLP-1和本发明的抗体融合形成，其中GLP-1包含选自以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO: 1，SEQ ID NO: 2，SEQ ID NO: 3，SEQ ID NO: 4，SEQ ID NO: 5，SEQ ID NO:127。

作为优选，GLP-1通过N’-R1-L-R2-C’、N’-R2-L-R1-C’或者N’-R2-L-R1_r-C’的连接方式与权利要求1或3或4所述抗体的轻链和/或重链相融合；

其中L为肽接头序列，其包含全长的、部分的或者重复的选自LK1~LK3的氨基酸序列：SEQ ID NO: 110，SEQ ID NO: 111，SEQ ID NO: 112其中之一的氨基酸序列；

R1为GLP-1的氨基酸序列；

R1_r为GLP-1的反向氨基酸序列；

R2为权利要求1或3或4所述抗体轻链或者重链的氨基酸序列；

C’代表GLP-1融合蛋白质多肽链的羟基残基端；

N’代表GLP-1融合蛋白质多肽链的氨基残基端。

一种多核苷酸，其编码本发明的GLP-1融合蛋白质。

一种载体，其包含本发明的多核苷酸。

一种宿主细胞，其包含本发明的载体。

一种药用组合物，其包含与药用可接受载体混合的本发明的GLP-1融合蛋白质。

一种包含或基于本发明的抗体或者GLP-1融合蛋白质的药用组合物在制备用于预防或治疗非胰岛素依赖性糖尿病的药物中的用途。

考虑到GLP-1R在使用胰岛素样肽-1调控II型糖尿病人的血糖浓度方法中的所承担的关键作用，并且其显著的治疗特征是其刺激胰岛素分泌而不伴有低血糖相关危险的能力。本发明将GLP-1与能与GLP-1R特异性结合的抗体相融合，延长GLP-1的体内半衰期来保留GLP-1分子生物学活性。同时，GLP-1和能与GLP-1R特异性结合的抗体形成的融合蛋白质具有由抗体提供的分子靶向性，而且抗体的免疫源性也低于其他的融合蛋白质伙伴。

本发明的有益效果是：将GLP-1与能与GLP-1R特异性结合的抗体相融合，延长GLP-1的体内半衰期来保留GLP-1分子生物学活性。同时，GLP-1和能与GLP-1R特异性结合的抗体形成的融合蛋白质具有由抗体提供的分子靶向性，而且抗体的免疫源性也低于其他的融合蛋白质伙伴。

发明详述

本发明针对GLP-1在体内被二肽基肽酶(DPP-IV)迅速清除而有效性不足的缺点用GLP-1R的抗体与其融合来增强其半衰期和生物学活性。所用于融合的抗体，具有不阻碍GLP-1与受体结合的前提下，特异性识别GLP-1R的生物学活性，本身与受体的高亲和力和稳定性能够长效地增加GLP-1在受体周围的局部浓度，从而大大增加其与受体结合的有效时间和效价。同时，与抗体的融合增加了GLP-1被DPP-IV识别或者捕获的空间位阻，减少了其在体内被清除的几率而增加了GLP-1的有效时长。据文献报道，GLP-1R的N端胞外区和其跨膜区部分的咬合状态的释放是GLP-1得以进入与GLP-1R的结合位点，行使其生物活性的关键步骤。而本发明中所述的抗体与 GLP-1R结合很大程度上涉及到受体的N端胞外区，其和受体的结合有助于上述咬合状态的释放，利于GLP-1的进入。所以，GLP-1与针对GLP-1R的抗体融合后增加了自身的半衰期和亲和效价，有更强的生物学活性，是更进一步优越于GLP-1疗法的一个重要创新。更重要的是，本发明所用的部分抗体本身具有在GLP-1存在的情况下，增强GLP-1R的GLP-1激活的生物学特性。因为以上的一些原因，本发明所述的GLP-1融合蛋白质是比GLP-1更有效的GLP-1R激活剂。

融合蛋白质长时期反复施用时的抗原性存在普遍的顾虑。对于GLP-1融合物疗法，这尤其是一个顾虑，因为糖尿病患者一旦经诊断为该疾病，必须一生接受治疗。此外，如果免疫球蛋白的Fc部分保留不需要的效应子功能，Fc融合蛋白质疗法可能是一个顾虑。通过用电脑协助对免疫球蛋白的三维结构的预测以及抗体的序列的优化以及人源化，加上鉴定反复和长期施用后诱导免疫反应风险降低并且不再具有效应子功能的特定GLP-1融合蛋白质，本发明的中讨论的GLP-1部分的氨基酸优选通过富含甘氨酸和丝氨酸的肽接头与抗体的轻链和重链相融合。因为甘氨酸和丝氨酸带有较小的侧链，使肽接头序列具有相当的灵活性，减少了GLP-1和抗体之间相对位置的刚性，使GLP-1可以自由地与GLP-1R相互作用。同时，肽接头的存在隔离了GLP-1和抗体，避免了两者结构域的相互作用。甘氨酸和丝氨酸交替出现避免过度重复向融合蛋白质中引入不必要的免疫源性，但是肽接头无可避免的增加融合蛋白质在体内的免疫原性，优选肽接头长度，平衡结构柔度和免疫源性很重要，所以，本发明提供了3个不同长度的肽接头用于融合。同时，本发明中提供了GLP-1与抗体用肽接头通过不同的连接的方式来形成融合，由此而形成的GLP-1融合蛋白质的形式包括：

1）带有GLP-1与轻链通过N’-R1-L-R2-C’方式连接的融合蛋白质；

2）带有GLP-1与轻链通过N’-R2-L-R1-C’方式连接的融合蛋白质；

3）带有GLP-1与轻链通过N’-R2-L-R1_r-C’方式连接的融合蛋白质；

4）带有GLP-1与重链通过N’-R1-L-R2-C’方式连接的融合蛋白质；

5）同时带有1)和4)的融合蛋白质；

6）同时带有2)和4)的融合蛋白质；

7）同时带有3)和4)的融合蛋白质。

本发明中，编码GLP-1的DNA与所述抗体的全长/可变区/片段轻链或全长/可变区/全长重链DNA通过编码肽接头序列的DNA连接成融合轻链或融合重链DNA，同时在轻链DNA的5’末端还将引入编码信号引导肽的DNA来形成基因，并可以此基因基础连接突变/野生型的GLP-1和抗体序列。本发明通过基因合成的方法得到GLP-1的序列，并通过PCR的方法将其与肽接头序列以及抗体轻链或重链DNA相连接。针对GLP-1R的抗体轻链或重链可变区序列由特定杂交瘤细胞中通过PCR方法调取，并与特定抗体亚型的恒定区DNA相连接组成得到。野生型抗体亚型的恒定区DNA可以通过从特定的文库克隆得到并作为序列优化的基础。在此所述的用于表达融合蛋白质的基因，通过克隆方式放入表达载体中用于融合蛋白质的产生和表达。在表达过程中，轻链和重链表达载体搭配后，用共转染或者转化的方式将带有其基因的DNA引入宿主细胞中，并用优化适应诱导启动子，选择转化子或者扩增编码所希望序列的基因的培养基在适宜的pH，温度中培养。DNA引入方式选用普遍使用的CaPO₄，电穿孔和PEI等方式。

适于表达此处所述载体中核酸的合适宿主细胞包括高等真核细胞，哺乳动物宿主细胞系表达的实例包括了中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)和人胚胎肾脏细胞(HEK293或者悬浮培养的HEK293细胞系)，位于轻链N末端的信号引导肽指导重组融合蛋白质的从哺乳动物宿主细胞系中的分泌。用于表达和克隆的载体上带有能够使载体在宿主细胞中不断复制的选择标记，用于筛选有能力吸收编码融合蛋白质的核酸的细胞并且带有与融合蛋白质编码序列有效连接并指导mRNA合成的启动子。其中一个实例是用带有抗生素抗性以及乙型肝炎病毒和猿病毒启动子(SV40)的载体优选稳定表达融合蛋白质的CHO宿主细胞。

本发明在宿主细胞系表达融合蛋白质后，用亲和层析的方法将其分泌在细胞培养上清中的部分纯化。本发明中的实例包括用蛋白G的亲和层析柱捕获融合有全长抗体的融合蛋白质，然后用低pH将其从层析柱料上洗脱后再收集。温和的洗脱条件有助于防止蛋白的变性。

可以用一种或多种赋形剂配制本发明的融合蛋白质。本发明的融合蛋白质可以与可药用的缓冲液、经调节提供可接受的稳定性的pH、以及可施用(例如胃肠外施用)的pH组合。任选地，可以添加一种或多种可药用的抗微生物剂。间甲酚和苯酚是优选的可药用抗微生物剂。可以添加一种或多种可药用盐溶液以调节离子强度或张力。可以添加一种或多种赋形剂以进一步调节制剂的等渗性。甘油是等渗性调节赋形剂的实例。可药用意味着适于施用于人类或其他动物，因此不含有毒性成分或不希望的污染物，并且不干扰其中活性化合物的活性。

可以以溶液制剂或能够用合适的稀释剂重构的冻干粉配制本发明的融合蛋白质。冻干剂型是其中融合蛋白质稳定的一种剂型，具有或不具有重构产品在预期的使用货架期内保持pH的缓冲能力。包含在此讨论的融合蛋白质的溶液在冻干前优选是等渗的，使之重构后能够形成等渗溶液。

本发明的融合蛋白质的可药用盐溶液形式在本发明范围内。常用于形成酸加成盐的酸为无机酸，例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等，以及有机酸，例如对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯基一磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸等。优选的酸加成盐是与无机酸，例如盐酸和氢溴酸形成的盐。

碱加成盐包括从无机碱，例如铵、碱或碱土金属氢氧化物衍生的那些盐、碳酸盐、碳酸氢盐等。在制备本发明的盐溶液中有用的这类碱因此包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾等。

本发明的融合蛋白质具有生物学活性。生物学活性指该融合蛋白质在体内结合并激活GLP-1R并引起细胞应激反应。反应包括但是不限于提高胰岛素的分泌、胰高血糖素分泌的抑制，抑制食欲、体重减轻、诱导过饱、抑制凋亡、诱导胰腺beta细胞增殖及胰腺beta细胞分化。对有代表性的一些GLP-1融合蛋白质测试体外和体内活性。首先，步骤4（图1）提供了该融合蛋白质和GLP-1R相互作用的荧光检测数据。然后，步骤5提供了基于该融合蛋白质与人GLP-1R相互作用后将其活化的体外活性测定。在实验中使用过表达人类GLP-1R的CHO细胞。在这些细胞中，GLP-1R的活化引起腺苷酸环化酶的活化，该酶的活化又诱导由cAMP应答元件(CRE)驱动的报告基因的表达。步骤12(图2)提供了其中报告基因为萤光素酶的数据。体外的实验数据共同表明融合蛋白质能够结合并活化GLP-1R，并且在体外表现比GLP-1-Gly8(7-37)OH更有效。步骤13（图3）提供对禁食并腹腔注射本发明的融合蛋白质之一后16h的小鼠灌服葡萄糖后血糖的变化数据。步骤13小鼠中产生的数据则显示该融合蛋白质在体内具有活性，并且比天然GLP-1具有更长的半衰期。

可以通过具有普通技能的内科医生已知有效的任意途径施用这些融合蛋白质。外周肠胃外属于其中一种此类方法。医学文献中通常将肠胃外施用理解为通过消毒注射器或一些其他机械装置例如注射泵向机体注射剂型。外周肠胃外可以包括静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用途径。

本发明的融合蛋白质也可以进行经口、直肠、经鼻或下呼吸道途径施用，它们是非肠胃外途径。这些非肠胃外途径中，优选下呼吸道途径和经口途径。

本发明的融合蛋白质可以用于治疗多种疾病和病症。本发明的融合蛋白质首先通过作用于GLP-1R而发挥其生物学作用。因此可以用本发明的GLP-1融合蛋白质治疗会对GLP-1R刺激或对GLP-1化合物施用做有宜应答的疾病和/或病症的受试者。将这些受试者称为“需要GLP-1化合物治疗”或“需要GLP-1R刺激”的受试者。包括非胰岛素依赖性糖尿病、胰岛素依赖性糖尿病、中风(见WO 00／16797)、心肌梗死(见WO 98／08531)、肥胖(见WO 98／19698)、手术后分解代谢改变(见美国专利号6,006,753)、功能性消化不良和肠易激综合征(见WO99／64060)。也包括要求以GLP-1化合物预防性治疗的受试者，例如具有发展为非胰岛素依赖性糖尿病危险的受试者(见WO 00／07617)。糖耐量损伤或空腹葡萄糖损伤的受试者、体重对于受试者身高和体液高出正常体重约25％的受试者、部分胰切除的受试者、父母一方或双方具有非胰岛素疗的GLP-1融合蛋白质的“有效量”是与没有治疗相比引起对血糖浓度的更佳控制，从而导致糖尿病并发症(例如视网膜病、神经病或肾脏疾病)发作延迟的量。预防糖尿病的GLP-1融合蛋白质的“有效量"是与没有治疗相比延缓血糖水平升高的发作的量，所述发作需要以抗低血糖药物例如磺酰脲类、噻唑烷二酮、胰岛素和／或双胍类治疗。有效将患者血糖正常化的融合蛋白质的剂量取决于许多因素，其中包括但不限于受试者性别、体重和年龄、调节血糖无能的严重性、施用途径和生物利用率。融合蛋白质药物代谢动力学图谱、潜能和剂型。剂量可以为0．01至1 mg／kg体重，优选0．05至0．5 mg／kg体重。优选每周一次或二次施用本发明的融合蛋白质。取决于所治疗的疾病，可能有必要更频繁地施用该融合蛋白质，例如每周三次或更多次。

附图说明

图1是流式细胞术(FACS)检测重组表达的GLP-1融合蛋白质 (GLP-1(A8G)-LK-L13H13)与稳定表达人源GLP-1R（hGLP-1R）的中国仓鼠卵巢细胞株(标有*的实线峰 )以及中国仓鼠卵巢细胞株本身(虚线峰)的特异性结合的对比。

图2是通过报告基因方法得到的GLP-1野生型（圆形）和GLP-1(A8G)-LK-L13H13（三角形）对稳定表达hGLP-1R的中国仓鼠卵巢细胞株的激活曲线。

图3是小鼠（ICR）糖耐量实验，检测GLP-1(A8G)-LK-L13H13在5微克/只（方形）和15微克/只（三角形）单次i.p.注射16h后对禁食状态下的小鼠的糖耐量的影响。

图4是小鼠（C57BL）糖耐量实验，检测GLP-1(A8G)-LK-L13H13在15微克/只（三角形）单次i.p注射40h后对禁食状态下的小鼠的糖耐量的影响。

图5是二型糖尿病小鼠（db/db Mice）血糖浓度时间糖曲线，检测GLP-1(A8G)-LK-L13H13在30微克/千克的浓度下（倒三角形）对二型糖尿病小鼠进行单次i.p.注射后的小鼠血糖浓度变化的时间曲线。

图6是二型糖尿病小鼠（db/db Mice）日进食量时间曲线，记录GLP-1(A8G)-LK-L13H13在30微克/千克的浓度下（倒三角形）单次对二型糖尿病小鼠进行i.p.注射前3天到注射后5天这一时间段内小鼠日进食量的变化的时间曲线。图6和图5为平行进行的实验结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

步骤1：免疫用抗原细胞稳定株的构建

接种CHO-DHFR细胞至6孔板中，培养24h后转染含hGLP-1R基因(核苷酸序列见SEQID NO: 113，氨基酸序列见SEQ ID NO: 114)的pYS质粒于6孔板中的细胞，转染前更换培养液，按照Invitrogen公司推荐Lipofectamine 2000 的转染条件进行转染。48h后，再换为含有10 nM MTX的完全培养基，每隔3天换液，待两周左右，出现稳定生长的克隆，消化分散细胞集落，待长至50%愈合度时，逐渐提高MTX的浓度进行加压筛选，直至MTX的浓度为10 μM。构建的稳定细胞株分别进行FACS检测，利用抗hGLP-1R的抗体（Abcam）鉴定加压后的细胞群体，10 μM MTX筛选后的CHO-DHFR-hGLP-1R细胞膜上hGLP-1R 有大量表达，最后经过亚克隆、鉴定获得6株hGLP-1R高表达细胞稳定株。

步骤2：抗体的制备

将在弗氏佐剂中乳化的CHO-DHFR-hGLP-1R全细胞，以2x10⁶细胞/只的剂量皮下注射BALB/c小鼠（6-8周龄）。2周后，使用不完全弗氏佐剂乳化免疫原，加强免疫小鼠，此后每周加强一次。通过剪尾的方式采血，离心分离血清，进行FACS检测血清效价。直至达到适合抗体滴度时，断颈处死小鼠，无菌状态下获取脾脏细胞。收集生长状态处于对数生长期的SP2/0细胞，2000 rpm, 3min 离心，沉淀用无血清培养至重悬，再次离心-重悬，计数。混合脾脏细胞和SP2/0细胞，保证SP2/0 ：脾脏细胞≥1:1，共“洗涤-离心”3次。弹散最后一次离心后的沉淀，逐滴加入1mL预温至37℃的PEG-1350（30s内滴完），上下吹吸1min，缓慢加入30mL预热至37℃的无血清培养基（Invitrogen）以终止PEG的融合作用，1500rpm，5min离心，弹散细胞沉淀，加入添加有HAT（次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸苷；Invitrogen）, 20% FBS(Bioind)的RPMI1640（Invitrogen）作为融合培养基，按每孔20000个脾细胞及5000个饲养层细胞铺于96 孔板中, 每孔100μl。融合后的杂交瘤细胞和饲养层细胞一起在96孔板中进行培养，并进行HAT筛选，以除去非融合的细胞。10天后收取培养板中的杂交瘤细胞上清进行ELISA检测。

步骤3：全细胞ELISA 筛选

将CHO-DHFR-hGLP-1R过表达hGLP-1R的细胞和不表达hGLP-1R的CHO-DHFR-空白细胞分别接种至96孔板，长至90%愈合度。除去细胞培养上清，PBS洗两遍，加入100μl 100%甲醇4℃固定10min。再加入100 μl新鲜配制的0.6% H₂O₂-PBS，室温处理20min，PBS洗涤2遍。经过PBS-1%BSA封闭后，加入杂交瘤细胞上清4℃孵育90 min。多次洗涤后，每孔加入5000倍稀释的GxM-HRP-Fc二抗（Sigma-Aldrich）100μl， 37℃孵育0.5h。洗涤5次后, 每孔加入100μlTMB显色底物，37℃反应15min，2M H₂SO₄终止，读取OD450值。阳性对照为免疫小鼠的血清；阴性对照为细胞培养基上清。选取分泌抗hGLP-1R抗体的杂交瘤株，进行克隆化以获得能稳定分泌针对hGLP-1R的细胞株。最后选取杂交瘤细胞分泌的抗体上清进行FACS验证。

步骤4：阳性杂交瘤细胞上清流式分析鉴定（FACS）

用含10mM EDTA的PBS消化、收集10⁵个CHO-DHFR-hGLP-1R细胞，分别加入1.5ml EP管，离心后弃上清，阴性对照样本用流式上样缓冲液（PBS，2% FBS）重悬。阳性处理组细胞每管加200μl抗体上清，室温孵育；1500rpm离心，弃上清，用流式上样缓冲液洗一次，再离心，重悬，每孔加入1:50稀释的FITC标记的羊抗鼠荧光抗体（BD Pharmingen） 200μl，室温避光孵育30 min；离心，弃上清，再用流式上样缓冲液洗一次，离心，最后用流式上样缓冲液重悬，上机检测。杂交瘤细胞上清和表达有hGLP-1R的CHO-DHFR细胞有特异性结合，灰色峰和虚线峰为阴性对照，杂交瘤细胞上清对应的实线峰（带有*标记）有明显右移（图1）。

步骤5：抗体基因的克隆及亚克隆

收集分泌抗体的杂交瘤细胞，按照QIAGEN的mRNA抽提试剂盒操作规程，提取杂交瘤细胞的mRNA。然后将提取后的mRNA反转录成cDNA，逆转录引物为小鼠轻、重链恒定区的特异性引物，重链逆转录引物为(5’-TTTGGRGGGAAGATGAAGAC -3’) (SEQ ID NO: 115)，轻链逆转录引物为(5’- TTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3’) (SEQ ID NO: 116)和(5’-TTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’) (SEQ ID NO: 117)。RT-PCR的反应条件为：25℃ 5min；50℃60min；70℃ 15min。将反转录的cDNA用0.1mM的TE稀释至500μl，加入到超滤离心管（AmiconUltra-0.5）中，2000g离心10min；弃滤液，再加500μl的0.1mM的TE，，2000g离心10min；弃滤液，将制备管倒置到新的离心管中，2000g离心10min，得到纯化后的cDNA；取10μl的纯化后的cDNA作为模板，加入4 μl的5x 的tailing buffer，4 μl的dATP（1mM）和10U的末端转移酶（Promega）后混匀，37℃孵育5min后65℃ 5min；然后以加上PolyA尾的cDNA为模板，PCR扩增抗体的轻、重链可变区基因。上游引物均为OligodT，重链下游引物为（5’-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3’） (SEQ ID NO: 118)和（5’- TGGACAGGGCTCCATAGTTCC-3’）(SEQ ID NO: 119)，轻链下游引物为（5’- ACTCGTCCTTGGTCAACGTG-3’） (SEQ ID NO:120)。PCR反应条件：95℃ 5min ；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min 40cycles；72℃ 7min；PCR产物连接到PMD 18-T载体后进行测序。测序得到的抗体轻链和重链可变区序列见附录序列表。

基于已测序得到的抗体的DNA序列设计PCR引物，从而将完整轻链、重链信号肽和可变域以及小鼠IgG1恒定区与表达载体pTM5相连。

步骤6：在悬浮HEK293宿主细胞系中瞬时表达抗GLP-1R的抗体

接种悬浮HEK293或者CHO表达细胞系至转瓶中，经过24h 37℃旋转培养后被用于转染。转染过程中使用Polyethylenimine (PEI)作为转染介质，将其与DNA混合后加入到细胞培养中。PEI和DNA的混合优选配比为1:1至5:1。细胞在接受PEI与DNA混合物后继续37℃旋转培养96h以上以表达抗原结合蛋白，其间向细胞培养中加入0.5%的胰蛋白胨作为表达需要的氨基酸源，最后收集细胞上清用于抗原结合蛋白质的纯化分离。

步骤7：抗体人源化及优化

首先，将筛选所得的鼠源抗体轻、重链可变区序列，并使用NCBI的在线抗体可变区序列比对工具Ig Blast，搜索与输入的抗体可变区序列同源的人源的抗体生殖细胞系基因序列（Ig Germline Gene sequence），并将除CDR序列外，同源性最高的人源基因序列做为模板序列进行CDR嫁接，得到人源化抗体可变区序列，并外包合成人源化抗体轻、重链的基因。根据序列设计PCR引物，在合成序列的5’端和3’端引入合适的限制性内切酶位点，并通过PCR扩增后将其与人IgG2或者IgG4恒定区序列拼接后得到完整的重组人源化抗体序列。重组的抗体根据步骤6进行表达，并按照步骤4中的FACS技术验证其针对GLP-1R的亲和力。在保留了针对GLP-1R亲和力的人源化抗体群中，遴选出亲和力表现最优秀的抗体，并通过定点突变，对其可变区序列进行进一步的改造，更进一步提高其针对GLP-1R的亲和力。

步骤8：GLP-1人源化融合蛋白质的基因克隆与亚克隆

优化后的人源化抗体在轻链的N端或者C端与GLP-1及其衍生物序列进行融合组成GLP-1融合蛋白质，两者的序列由肽接头序列(LK)做为桥梁进行连接。信号肽-GLP-1-肽接头的核苷酸序列由金斯瑞生物科技有限公司合成，以合成基因为模板，PCR扩增“信号肽-GLP1-接头”部分的序列，PCR上游引物为(5’-CCACCATGGACTTTGGGCTGAGC-3’) (SEQ ID NO:121)，PCR下游引物为(5’- AGAGCCGGTGGCAGAGCCAG-3’) (SEQ ID NO:122)，PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s 35cycles；72℃ 7min。另以人源化抗体的核苷酸序列为模板，扩增融合蛋白质的抗体部分的序列。

PCR上游引物为(5’-CTGGCTCTGCCACCGGCTCTGCCATCCAGAT

GACCCAGTCTCC-3’) (SEQ ID NO:123)，PCR下游引物为(5’-ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3’) (SEQ ID NO:124)，PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min 35cycles；72℃ 7min。然后通过overlapping PCR将融合蛋白质核酸序列的“信号肽-GLP-1-肽接头”部分与抗体部分连接，引物两端添加Nhe1和Not1的酶切位点，从而将完整的融合蛋白质序列与表达载体pTM5相连。overlapping PCR上游引物为(5’-CCGGCTAGCCACCATGGACTTTGGGCTGAGC-3’) (SEQ ID NO:125)，下游引物为(5’- AGTGCGGCCGCTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3’) (SEQ ID NO: 126)。PCR反应条件：95℃ 5min ；95℃30s，56℃ 30s，72℃ 1min 35cycles；72℃ 7min；PCR产物连接到PTM5载体后进行测序。

步骤9：在悬浮HEK293宿主细胞系中瞬时表达GLP-1融合蛋白质。

接种HEK293悬浮细胞至转瓶中，在转染前换培养基。将包含融合蛋白质轻/重链基因的载体以DNA总量0.5-1.5μg/ml的浓度与1.5-7.5μg/ml的Polyethylenimine (PEI)混合静置15-25分钟后，加入细胞培养中。24小时后，再向细胞培养加入0.5-1%的Trypton N1。培养5-10天后收取的上清中含有分泌表达的GLP-1融合蛋白质。

步骤10：在悬浮CHO宿主细胞系中稳定表达GLP-1融合蛋白质。

接种悬浮CHO细胞至6孔板中，通过步骤1中的转染条件转染融合蛋白质的表达载体。48小时后，加入300mg/ml的hygromycin (重链)和6mg/ml的puromycin (轻链)进行联合筛选。在细胞出现大量凋亡后(死亡率>90%)，逐步降低抗生素浓度恢复剩余细胞的生长，后转为转瓶扩大培养，并随后确认上清中抗体的表达。在随后的培养基中保持减半的抗生素浓度以维持细胞对GLP-1融合蛋白质的稳定表达。

步骤11：GLP-1融合蛋白质从细胞培养上清中的纯化和制备

将细胞培养离心去除其中细胞，其上清经过偶联蛋白G配基的亲和层析柱后，用pH2.5-3.5的洗脱液将表达的GLP-1融合蛋白质从层析柱上洗脱。洗脱管中预置中和缓冲液及时中和洗脱液的低pH值。洗脱后收集的蛋白质溶液对PBS透析。

步骤12：报告基因实验检测GLP-1融合蛋白质在体外激活GLP-1受体的功能（见图2）。

以每孔20000个接种共表达hGLP1R-CRE-Luciferase的CHO-DHFR-细胞至96孔细胞培养板，37℃培养过夜。第二天除去培养基上清，用无血清培养基清洗细胞表面两次，吸去残液，再加入100μl用无血清培养基稀释纯化抗体或GLP-1，37℃孵育4小时。刺激结束后，加入100μl Promega的Bright Glo化学发光底物，最后将细胞裂解物转移至白色96孔板，在Molecular Devices的SpectraMax L酶标仪上读取相对发光强度。

步骤13：小鼠(ICR)禁食状态下葡萄糖耐量实验。

测定小鼠静脉中葡萄糖耐量测定中评价本专利的GLP-1融合蛋白质(优选抗体GLP-1(A8G)-LK-L13H13))的效果。四组中每组包含至少三至五只小鼠。I组接受同体积PBS对照腹腔注射。II组接受15μg/只的单次腹腔注射。III组接受5μg/只的单次腹腔注射。在注射后，小鼠进行6-16 h的禁食处理，禁食完成后去小鼠血液样本测定其基础血糖浓度值。然后接受1.5g/kg浓度的葡萄糖灌胃。在葡萄糖灌胃后15，30，60和90分钟采集其血液样本以测定血糖浓度，见图3。

步骤14：糖耐量实验检测GLP-1融合蛋白质在小鼠（C57BL）体内长效性（40h）。

测定小鼠静脉中葡萄糖耐量测定中评价本专利的GLP-1融合蛋白质(优选抗体GLP-1(A8G)-LK-L13H13))在小鼠体内的长效性。两组中包含至少三至五只小鼠。I组接受同体积PBS对照腹腔注射。II组接受15μg/只浓度的单次腹腔注射。在注射后24 h，小鼠进行16h的禁食处理，禁食完成后取小鼠血液样本测定其基础血糖浓度值。然后接受1.5g/kg浓度的葡萄糖灌胃。在葡萄糖灌胃后15，30，60和90分钟采集其血液样本以测定血糖浓度，见图4。

步骤15：GLP-1融合蛋白质降低二型糖尿病小鼠（db/db Mice）血糖浓度的长效性研究（72 h）。

在不同时间点测定二型糖尿病小鼠血糖浓度以评价本专利的GLP-1融合蛋白质(优选抗体GLP-1(A8G)-LK-L13H13))在二型糖尿病小鼠体内降低其血糖浓度的长效性。两组中每组包含至少六只小鼠。在注射开始前取小鼠血液样本测定其基础血糖浓度值。之后，I组接受同体积PBS对照腹腔注射，II组接受30μg/千克浓度的单次腹腔注射。在注射后1，4，6，24，48，72小时分别采集其血液样本以测定两组小鼠血糖浓度，见图5。

步骤16：GLP-1融合蛋白质减少二型糖尿病小鼠（db/db Mice）日进食量的长效性研究（120h）。

在对二型糖尿病小鼠日进食量改变的测定中评价本专利的GLP-1融合蛋白质(优选抗体GLP-1(A8G)-LK-L13H13))在降低二型糖尿病小鼠进食水平方面的长效性。该步骤和步骤15在同一批小鼠上同步进行。两组中每组包含至少六只小鼠。在步骤15的注射前3天起至注射后5天（120小时），每日早晨同一时间点称量每组小鼠日进食量，见图6。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州鸿运华宁生物医药工程有限公司

<120> 一种能与GLP-1R特异性结合的抗体及其与GLP-1的融合蛋白质

<130> 2014

<160> 127

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 31

<212> PRT

<213> 人

<400> 1

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 2

<211> 31

<212> PRT

<213> 人

<400> 2

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 3

<211> 22

<212> PRT

<213> 人

<400> 3

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe

20

<210> 4

<211> 23

<212> PRT

<213> 人

<400> 4

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile

20

<210> 5

<211> 24

<212> PRT

<213> 人

<400> 5

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala

20

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 6

Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr Gly Val Asn

1 5 10

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 7

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn Gly Met Ala

1 5 10

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 8

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Met Ala

1 5 10

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 9

Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Tyr Ala Met Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 10

Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Tyr Ala Met His

1 5 10

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 11

Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe Gly Met Gly Val Gly

1 5 10

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 12

Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr Gly Met His

1 5 10

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 13

Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 14

Phe Ile Ser Asn Leu Ser Tyr Arg Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Thr

1 5 10 15

Gly

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 15

Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Arg Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Thr

1 5 10 15

Gly

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 16

Val Ile Ser Ile Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 17

Val Ile Asn Ile Tyr Tyr Gly Asn Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 18

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 18

His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 19

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 19

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 20

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 20

Gly Leu Pro Gly Asp Tyr

1 5

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 21

Gly Thr Met Ala Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 22

Gly Thr Thr Ala Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 23

Gly Ile Thr Thr Ala Ala Phe Asp Tyr

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 24

Gly Ile Thr Met Ala Ala Phe Asp Tyr

1 5

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 25

Gly Val Thr Phe Tyr Ala Met Asp His

1 5

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 26

Lys Gly Asn Phe Ala Trp Phe Thr Tyr

1 5

<210> 27

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 27

Gly Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val

1 5 10 15

<210> 28

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 28

Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp

1 5 10 15

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 29

Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His

1 5 10

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 30

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr

1 5 10

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 31

Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5

<210> 32

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 32

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 33

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 33

Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His

1 5 10

<210> 34

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 34

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asp Arg Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 35

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 35

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 36

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 36

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 37

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 37

Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Leu Leu Ala

1 5 10

<210> 38

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 38

Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 39

Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 40

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 40

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 41

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 41

Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser

1 5

<210> 42

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 42

Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 43

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 43

Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 44

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 44

Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 45

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 45

Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 46

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 46

Phe Gln Ser Asn Tyr Leu Pro Phe Thr

1 5

<210> 47

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

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Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

1 5

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<212> PRT

<213> 小鼠

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Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

1 5

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<212> PRT

<213> 小鼠

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Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr Thr

1 5

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<212> PRT

<213> 小鼠

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Gln Asn Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr

1 5

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<212> PRT

<213> 小鼠

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Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr

1 5

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<212> PRT

<213> 小鼠

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Gln Gln His Tyr Tyr Thr Pro Tyr Thr

1 5

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<212> PRT

<213> 小鼠

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Gln Gln Ala His Arg Phe Pro Pro Thr

1 5

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<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 54

caggtgcaac tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60

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aaaatgaaca gtctgcaaag tgatgacaca gccaggtact actgtgccag aggactaccg 300

ggggactact ggggtcgagg aacctcagtc accgtctcct ca 342

<210> 55

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<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 55

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr

20 25 30

Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

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Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala

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Arg Gly Leu Pro Gly Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Ser Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 56

<211> 360

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 56

gaggtgaagc tggtggagtc tgggggcggc atagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc 60

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<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 57

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ile Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

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Ala Phe Ile Ser Asn Leu Ser Tyr Arg Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Met Ala Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

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<210> 58

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<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 58

gaggtgaagg tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactacggaa tggcgtgggt tcgacaggct 120

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<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 59

Glu Val Lys Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

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Ala Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Arg Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

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100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

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<210> 60

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<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 60

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<212> PRT

<213> 小鼠

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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Val

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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Tyr

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Ala Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile

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Gly Val Ile Ser Ile Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

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Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

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Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

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<212> DNA

<213> 小鼠

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<212> PRT

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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Val

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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Tyr

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Ala Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile

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Gly Val Ile Ser Ile Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

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Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

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<212> DNA

<213> 小鼠

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<212> PRT

<213> 小鼠

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Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ile Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn

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Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

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Ala Phe Ile Ser Asn Leu Ser Tyr Arg Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

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65 70 75 80

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Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

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<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 66

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<212> PRT

<213> 小鼠

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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Met Val Arg Pro Gly Val

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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Tyr

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Gly Val Ile Asn Ile Tyr Tyr Gly Asn Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

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Ser Val Thr Val Ser Ser

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<210> 68

<211> 354

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 68

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<212> PRT

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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Val

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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Tyr

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Gly Val Ile Ser Ile Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

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<212> DNA

<213> 小鼠

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<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 71

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe

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Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

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Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

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Cys Ala Arg Lys Gly Asn Phe Ala Trp Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 72

<211> 354

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 72

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<212> PRT

<213> 小鼠

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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Val

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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Tyr

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Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile

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Gly Val Ile Ser Ile Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

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65 70 75 80

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100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 74

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<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 74

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<212> PRT

<213> 小鼠

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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr

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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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65 70 75 80

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Ala Arg Gly Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu

100 105 110

Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

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<210> 76

<211> 357

<212> DNA

<213> 人

<400> 76

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<212> PRT

<213> 人

<400> 77

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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe

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Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

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Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala

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Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

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Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

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Cys Ala Arg Lys Gly Asn Phe Ala Trp Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 78

<211> 375

<212> DNA

<213> 人

<400> 78

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

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<212> PRT

<213> 人

<400> 79

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 80

<211> 336

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 80

gatgttgttc tgacccaaac tccactctct ctgcctgtca atattggaga tcaagcctct 60

atctcttgca agtctactaa gagtcttctg aatagtgatg gattcactta tttggactgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccacag ctcctaatat atttggtttc taatcgattt 180

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<210> 81

<211> 112

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 81

Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Asn Ile Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser

85 90 95

Asn Tyr Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 82

<211> 318

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 82

caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60

atgacttgca gggccagctc aagtgttact tacatacact ggtaccagca gaagccagga 120

tcctccccca aaccctggat ttatggcaca tccaatctgg cttctggagt ccctgttcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctctttc tctctcacaa tcaccagagt ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cacccacgtt cggtactggg 300

accaagctgg agctgaaa 318

<210> 83

<211> 106

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 83

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

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Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Phe Ser Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu

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Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

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Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 84

<211> 318

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 84

caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60

atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccagca gaagccagga 120

tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg actagtaacc cacccacgtt cggtgctggg 300

tccaagctgg agctgaga 318

<210> 85

<211> 106

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 85

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Ser Lys Leu Glu Leu Arg

100 105

<210> 86

<211> 324

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 86

gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gtgcaagtca gggcattagc aattatttaa actggtatca gcagaaaccg 120

gatggaactg ttaaactcct gatctattac acatcaagtt tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagcaa cctggaacct 240

gaagatgttg ccacttacta ttgtcagcag tatagtaagc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataag acgg 324

<210> 87

<211> 108

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 87

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg Arg

100 105

<210> 88

<211> 339

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 88

gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgagtgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60

atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttggcc 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctacggggc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaactgattt cactcttacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga tcatagttat 300

ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaa 339

<210> 89

<211> 113

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 89

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 90

<211> 318

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 90

caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60

atgacttgca gggccagctc aagtgttact tacatacact ggtaccagca gaagccagga 120

tcctccccca aaccctggat ttatggcaca tccaatctgg cttctggagt ccctgttcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctctttc tctctcacaa tcaccagagt ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cacccacgtt cggtactggg 300

accaagctgg agctgaaa 318

<210> 91

<211> 106

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 91

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Phe Ser Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 92

<211> 339

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 92

gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca cttctggaga gtcagtatcc 60

atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg gatcgtaatg gcaacactta tttatattgg 120

ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 180

tcaggagtcc cagacaggtt cagtggaagt gggtcgggaa gtgctttcac actgagaatc 240

agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatccg 300

tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgg 339

<210> 93

<211> 113

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 93

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Ser Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asp Arg

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ala Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 94

<211> 339

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 94

gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggagc gtcagtatcc 60

atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta tttgtattgg 120

ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcac ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 180

tcgggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 240

agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatccg 300

tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgg 339

<210> 95

<211> 113

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 95

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Ala Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro His Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 96

<211> 339

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 96

gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctggctatgt cagtaggaca gaaggtcact 60

atgagctgca agtccagtca gagcctttta aatagtagca atcaaaagaa ctatttggcc 120

tggtaccagc agaaaccagg acagtctcct aaacttctga tatactttgc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactcttacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gattacttct gtcagcaaca ttattacact 300

ccttacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaa 339

<210> 97

<211> 113

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 97

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln

85 90 95

His Tyr Tyr Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 98

<211> 339

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 98

gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60

atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 120

ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcggatgtc caaccttgcc 180

tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 240

agtagagtgg aggctgagga tgtgggtatt tattactgta tgcaacatct agaatatccg 300

tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgg 339

<210> 99

<211> 113

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 99

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln His

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 100

<211> 324

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 100

gccatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60

atcacttgcc gggcgagtca aaatattaac aacttattag cctggttcca gcagaaacca 120

gggaaatctc ctaagaccct gatctatact gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240

gaagatatgg gaatttatta ttgtcaacag gctcatagat tccctccgac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcag acgt 324

<210> 101

<211> 108

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 101

Ala Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Leu

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala His Arg Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg Arg

100 105

<210> 102

<211> 339

<212> DNA

<213> 人

<400> 102

gacatcgtga tgacccagag ccccgatagc ctggccgtgt ctctgggcga gcgggccacc 60

atcaactgca agagcagcca gagcctgctg aacagcagca accagaagaa ctacctggcc 120

tggtatcagc agaagcccgg ccagcccccc aagctgctga tctacttcgc cagcaccaga 180

gaaagcggcg tgcccgacag attttctggc agcggcagcg gcaccgactt taccctgaca 240

atcagctctc tgcaggccga ggacgtggcc gtgtacttct gccagcagca ctactacacc 300

ccctacacct tcggcggagg caccaaggtg gagatcaag 339

<210> 103

<211> 113

<212> PRT

<213> 人

<400> 103

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln

85 90 95

His Tyr Tyr Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 104

<211> 324

<212> DNA

<213> 人

<400> 104

gccatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgctt ctataggaga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca aaatattaac aacttattag cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ccaaactcct gatctatact gcatccagtt tgcaaagtga ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtgggtc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caatttactg ttgccaacag gctcatagat tccctccgac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcag acgt 324

<210> 105

<211> 108

<212> PRT

<213> 人

<400> 105

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Leu

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Glu Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Cys Cys Gln Gln Ala His Arg Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg Arg

100 105

<210> 106

<211> 106

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 106

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

1 5 10 15

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

35 40 45

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

65 70 75 80

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

85 90 95

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 107

<211> 105

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 107

Gly Gln Pro Lys Ser Thr Pro Thr Leu Thr Val Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Lys Glu Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asn

20 25 30

Phe Ser Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asn Gly Thr Pro

35 40 45

Ile Thr Gln Gly Val Asp Thr Ser Asn Pro Thr Lys Glu Gly Asn Lys

50 55 60

Phe Met Ala Ser Ser Phe Leu His Leu Thr Ser Asp Gln Trp Arg Ser

65 70 75 80

His Asn Ser Phe Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly Asp Thr Val Glu

85 90 95

Lys Ser Leu Ser Pro Ala Glu Cys Leu

100 105

<210> 108

<211> 325

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 108

Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

245 250 255

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

260 265 270

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

275 280 285

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

290 295 300

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

305 310 315 320

Ser Pro Gly Lys Gly

325

<210> 109

<211> 326

<212> PRT

<213> 人

<400> 109

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 110

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 111

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 111

Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ala Ser Ser Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Ala Thr Gly Ser

20

<210> 112

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 112

Lys Asp Ile Asp Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro

1 5 10

<210> 113

<211> 3123

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 113

atcagtctcc gcacgcggtt ccgcaggtgg cagcgatggc ccagtcctga actccccgcc 60

atggccggcg cccccggccc gctgcgcctt gcgctgctgc tgctcgggat ggtgggcagg 120

gccggccccc gcccccaggg tgccactgtg tccctctggg agacggtgca gaaatggcga 180

gaataccgac gccagtgcca gcgctccctg actgaggatc cacctcctgc cacagacttg 240

ttctgcaacc ggaccttcga tgaatacgcc tgctggccag atggggagcc aggctcgttc 300

gtgaatgtca gctgcccctg gtacctgccc tgggccagca gtgtgccgca gggccacgtg 360

taccggttct gcacagctga aggcctctgg ctgcagaagg acaactccag cctgccctgg 420

agggacttgt cggagtgcga ggagtccaag cgaggggaaa gaagctcccc ggaggagcag 480

ctcctgttcc tctacatcat ctacacggtg ggctacgcac tctccttctc tgctctggtt 540

atcgcctctg cgatcctcct cggcttcaga cacctgcact gcaccaggaa ctacatccac 600

ctgaacctgt ttgcatcctt catcctgcga gcattgtccg tcttcatcaa ggacgcagcc 660

ctgaagtgga tgtatagcac agccgcccag cagcaccagt gggatgggct cctctcctac 720

caggactctc tgagctgccg cctggtgttt ctgctcatgc agtactgtgt ggcggccaat 780

tactactggc tcttggtgga gggcgtgtac ctgtacacac tgctggcctt ctcggtctta 840

tctgagcaat ggatcttcag gctctacgtg agcataggct ggggtgttcc cctgctgttt 900

gttgtcccct ggggcattgt caagtacctc tatgaggacg agggctgctg gaccaggaac 960

tccaacatga actactggct cattatccgg ctgcccattc tctttgccat tggggtgaac 1020

ttcctcatct ttgttcgggt catctgcatc gtggtatcca aactgaaggc caatctcatg 1080

tgcaagacag acatcaaatg cagacttgcc aagtccacgc tgacactcat ccccctgctg 1140

gggactcatg aggtcatctt tgcctttgtg atggacgagc acgcccgggg gaccctgcgc 1200

ttcatcaagc tgtttacaga gctctccttc acctccttcc aggggctgat ggtggccata 1260

ttatactgct ttgtcaacaa tgaggtccag ctggaatttc ggaagagctg ggagcgctgg 1320

cggcttgagc acttgcacat ccagagggac agcagcatga agcccctcaa gtgtcccacc 1380

agcagcctga gcagtggagc cacggcgggc agcagcatgt acacagccac ttgccaggcc 1440

tcctgcagct gagactccag cgcctgccct ccctggggtc cttgctgcag gccgggtggc 1500

caatccaggt gggagagaca ctcccaggga caagggaagg aagggacaca cacacacaca 1560

cacacacaca cacacacaca cacatacatc ctgctttccc tccccaaacc catcagacag 1620

gtaaatgggc agtgcctcct gggaccatgg acacattttc tcctaggaga agcagcctcc 1680

taatttgatc acagtggcga gaggagagga aaaacgatcg ctgtgaaaat gaggaggatt 1740

gcttcttgtg aaaccacagg cccttggggt tcccccagac agagccgcaa atcaacccca 1800

gactcaaact caaggtcaac ggcttattag tgaaactggg gcttgcaaga ggaggtggtt 1860

ctgaaagtgg ctcttctaac ctcagccaaa cacagagcgg gagtgacggg agcctcctct 1920

gcttgcatca cttggggtca ccaccctccc ctgtcttctc tcaaagggaa gctgtttgtg 1980

tgtctgggtt gcttatttcc ctcatcttgc cccctcatct cactgcccag tttctttttg 2040

aggggctttg tttgggccac tgccagcagc tgtttctgga aatggctgta ggtggtgttg 2100

agaaagaatg agcattgaga cggtgctcgc ttctcctcca ggtatttgag ttgttttggt 2160

gcctgcctct gccatgccca gagaatcagg gcaggcttgc caccggggaa cccagccctg 2220

gggtatgagc tgccaagtct attttaaaga cgctcaagaa tcctctgggg ttcatctagg 2280

gacacgttag gaatgtccag actgtgggtg tagattacct gccacttcca ggagcccaga 2340

gggccaagag agacattgcc tccacctctc cttggaaata ctttatctgt gaccacacgc 2400

tgtctcttga gaatttggat acactctcta gctttagggg accatgaaga gactctctta 2460

gggaaaccaa tagtccccat cagcaccatg gaggcaggct ccccctgcct ttgaaattcc 2520

cccacttggg agcttgtata tacttcactc acttttcttt attgctgtga atagtctgtg 2580

tgcacaatgg gcaattctga cttctcccat ctagtggaaa tgagcgaaat catggttgta 2640

gtgatgttgt ttgggagagt gcagtagtaa ttgatttgac ccactcacac ttggagctaa 2700

ttaaggtttg ccctgcctgc agcctccccc acaaataatg aacagcagaa agactggacg 2760

gggaaaccta tcaatcctgc ccccagccat ggtgaggaag ccccaagcca tggtgacaca 2820

cagcagcact gcagatagcc agacacatgg ctatcctaga gaggctggca aggagttcgt 2880

ggctgcaaaa gaagtttctg gagcaagaga gagctcgctc ttgggagtca ggacctccgg 2940

ggagagcaga gggttccgac ggattccttt atgagtcagt ctctctctcc cttttaaatg 3000

gtgggaaccc tccccaaaac ctttccccag acacattctc ctgtgcccct cagagaggca 3060

tgtgatgtgc aaggaaaata ataggatata aaacacatca agtagaaaat ttcttatact 3120

tca 3123

<210> 114

<211> 463

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 114

Met Ala Gly Ala Pro Gly Pro Leu Arg Leu Ala Val Leu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Met Val Gly Arg Ala Gly Pro Arg Pro Gln Gly Ala Thr Val Ser Leu

20 25 30

Trp Glu Thr Val Gln Lys Trp Arg Glu Tyr Arg Arg Gln Cys Gln Arg

35 40 45

Ser Leu Thr Glu Asp Pro Pro Pro Ala Thr Asp Leu Phe Cys Asn Arg

50 55 60

Thr Phe Asp Glu Tyr Ala Cys Trp Pro Asp Gly Glu Pro Gly Ser Phe

65 70 75 80

Val Asn Val Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp Ala Ser Ser Val Pro

85 90 95

Gln Gly His Val Tyr Arg Phe Cys Thr Ala Glu Gly Leu Trp Leu Gln

100 105 110

Lys Asp Asn Ser Ser Leu Pro Trp Arg Asp Leu Ser Glu Cys Glu Glu

115 120 125

Ser Lys Arg Gly Glu Arg Ser Ser Arg Glu Glu Gln Leu Leu Phe Leu

130 135 140

Tyr Ile Ile Tyr Thr Val Gly Tyr Ala Leu Ser Phe Ser Ala Leu Val

145 150 155 160

Ile Ala Ser Ala Ile Leu Leu Gly Phe Arg His Leu His Cys Thr Arg

165 170 175

Asn Tyr Ile His Leu Asn Leu Phe Ala Ser Phe Ile Leu Arg Ala Leu

180 185 190

Ser Val Phe Ile Lys Asp Ala Ala Leu Lys Trp Met Tyr Ser Thr Ala

195 200 205

Ala Gln Gln His Gln Trp Asp Gly Leu Leu Ser Tyr Gln Asp Ser Leu

210 215 220

Ser Cys Arg Leu Val Phe Leu Leu Met Gln Tyr Cys Val Ala Ala Asn

225 230 235 240

Tyr Tyr Trp Leu Leu Val Glu Gly Val Tyr Leu Tyr Thr Leu Leu Ala

245 250 255

Phe Ser Val Phe Ser Glu Gln Trp Ile Phe Arg Leu Tyr Val Ser Ile

260 265 270

Gly Trp Gly Val Pro Leu Leu Phe Val Val Pro Trp Gly Ile Val Lys

275 280 285

Tyr Leu Tyr Glu Asp Glu Gly Cys Trp Thr Arg Asn Ser Asn Met Asn

290 295 300

Tyr Trp Leu Ile Ile Arg Leu Pro Ile Leu Phe Ala Ile Gly Val Asn

305 310 315 320

Phe Leu Ile Phe Val Arg Val Ile Cys Ile Val Val Ser Lys Leu Lys

325 330 335

Ala Asn Leu Met Cys Lys Thr Asp Ile Lys Cys Arg Leu Ala Lys Ser

340 345 350

Thr Leu Thr Leu Ile Pro Leu Leu Gly Thr His Glu Val Ile Phe Ala

355 360 365

Phe Val Met Asp Glu His Ala Arg Gly Thr Leu Arg Phe Ile Lys Leu

370 375 380

Phe Thr Glu Leu Ser Phe Thr Ser Phe Gln Gly Leu Met Val Ala Ile

385 390 395 400

Leu Tyr Cys Phe Val Asn Asn Glu Val Gln Leu Glu Phe Arg Lys Ser

405 410 415

Trp Glu Arg Trp Arg Leu Glu His Leu His Ile Gln Arg Asp Ser Ser

420 425 430

Met Lys Pro Leu Lys Cys Pro Thr Ser Ser Leu Ser Ser Gly Ala Thr

435 440 445

Ala Gly Ser Ser Met Tyr Thr Ala Thr Cys Gln Ala Ser Cys Ser

450 455 460

<210> 115

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 115

tttggrggga agatgaagac 20

<210> 116

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 116

ttaacactct cccctgttga a 21

<210> 117

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 117

ttaacactca ttcctgttga a 21

<210> 118

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 118

tggacaggga tccagagttc c 21

<210> 119

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 119

tggacagggc tccatagttc c 21

<210> 120

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 120

actcgtcctt ggtcaacgtg 20

<210> 121

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 121

ccaccatgga ctttgggctg agc 23

<210> 122

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 122

agagccggtg gcagagccag 20

<210> 123

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 123

ctggctctgc caccggctct gccatccaga tgacccagtc tcc 43

<210> 124

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 124

acactctccc ctgttgaagc tc 22

<210> 125

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 125

ccggctagcc accatggact ttgggctgag c 31

<210> 126

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 126

agtgcggccg ctcaacactc tcccctgttg aagctc 36

<210> 127

<211> 39

<212> PRT

<213> Heloderma suspectum（吉拉毒蜥）

<400> 127

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

Claims (25)

1.与GLP-1R特异性结合的抗体，其包含：

重链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:12；

重链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:19；

重链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:27；

轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:37；

轻链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:45；和

轻链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:53。

2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列:SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:105；和重链可变结构域序列:SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:79。

3.根据权利要求1所述的抗体,其包含：轻链可变结构域序列:SEQ ID NO:101；和重链可变结构域序列:SEQ ID NO:75。

4.根据权利要求1所述的抗体,其包含：轻链可变结构域序列:SEQ ID NO:105；和重链可变结构域序列:SEQ ID NO:79。

5.根据权利要求1所述的抗体,其包含：轻链可变结构域序列，其由多聚核苷酸序列:SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:104编码；和重链可变结构域序列，其由多聚核苷酸序列:SEQID NO:74或SEQ ID NO:78编码。

6.根据权利要求1所述的抗体,其包含：轻链可变结构域序列，其由多聚核苷酸序列SEQID NO:100；和重链可变结构域序列，其由多聚核苷酸序列SEQ ID NO:74编码。

7.根据权利要求1所述的抗体,其包含：轻链可变结构域序列，其由多聚核苷酸序列SEQID NO:104编码；和重链可变结构域序列，其由多聚核苷酸序列SEQ ID NO:78编码。

8.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述抗体还包含以下方案之一的氨基酸序列：

a.SEQ ID NO:106的轻链恒定区氨基酸序列；

b.SEQ ID NO:107的轻链恒定区氨基酸序列；

c.SEQ ID NO:108的重链恒定区氨基酸序列；

d.SEQ ID NO:109的重链恒定区氨基酸序列；

e.SEQ ID NO:106的轻链恒定区氨基酸序列和SEQ ID NO:108的重链区氨基酸恒定序列；

f.SEQ ID NO:107的轻链恒定区氨基酸序列和SEQ ID NO:108的重链恒定区氨基酸序列；

g.SEQ ID NO:106的轻链恒定区氨基酸序列和SEQ ID NO:109的重链恒定区氨基酸序列；

h.SEQ ID NO:107的轻链恒定区氨基酸序列和SEQ ID NO:109的重链恒定区氨基酸序列。

9.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述抗体是鼠源抗体或人源化抗体。

10.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述抗体是人源化抗体。

11.一种GLP-1融合蛋白质，其包含GLP-1和权利要求1-10任一项所述抗体，其中GLP-1包含选自以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:127。

12.根据权利要求11所述的GLP-1融合蛋白质，其中GLP-1包含氨基酸序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5。

13.根据权利要求11所述的GLP-1融合蛋白质，其中GLP-1包含氨基酸序列SEQ ID NO:5。

14.根据权利要求11所述的GLP-1融合蛋白质，其中GLP-1通过肽接头与所述抗体的轻链融合。

15.根据权利要求14所述的GLP-1融合蛋白质，其中肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:112。

16.根据权利要求11所述的GLP-1融合蛋白质，其特征在于：GLP-1通过N’-R1-L-R2-C’、N’-R2-L-R1-C’或者N’-R2-L-R1_r-C’的连接方式与所述抗体的轻链或/和重链相融合；

其中L为肽接头序列，其包含选自LK1～LK3的氨基酸序列：SEQ ID NO:110，SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:112其中之一的氨基酸序列；

R1为GLP-1的氨基酸序列；

R1_r为GLP-1的反向氨基酸序列；

R2为抗体轻链或者重链的氨基酸序列；

C’代表GLP-1融合蛋白质多肽链的羰基残基端；且

N’代表GLP-1融合蛋白质多肽链的氨基残基端。

17.根据权利要求11所述的GLP-1融合蛋白质，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列:SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:105；和重链可变结构域序列:SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:79。

18.根据权利要求11所述的GLP-1融合蛋白质，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列SEQ ID NO:101；和重链可变结构域序列SEQ ID NO:75。

19.根据权利要求11所述的GLP-1融合蛋白质，其中所述抗体包含：轻链可变结构域序列SEQ ID NO:105；和重链可变结构域序列或SEQ ID NO:79。

20.一种多核苷酸，其特征在于：其编码权利要求11的GLP-1融合蛋白质。

21.一种载体，其特征在于：其包含权利要求20的多核苷酸。

22.一种宿主细胞，其特征在于：其包含权利要求21的载体。

23.一种药用组合物，其特征在于：其包含与药用可接受载体混合的权利要求11的GLP-1融合蛋白质。

24.一种权利要求11的GLP-1融合蛋白质在制备用于预防或治疗非胰岛素依赖性糖尿病的药物中的用途。

25.一种权利要求11的GLP-1融合蛋白质在制备用于治疗肥胖的药物中的用途。