CN104450609B - 一种分离和培养脐带间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，更具体而言属于干细胞领域。本发明提供了一种分离UC‑MSCs的方法。所述方法包括步骤：1）将脐带组织碎块与胰酶和胶原酶混合后孵育；2）然后加入透明质酸酶后孵育。

Description

一种分离和培养脐带间充质干细胞的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体而言属于干细胞领域。

背景技术

干细胞是一类能够自我更新和具有多向分化潜能的细胞，在组织工程和细胞治疗中，具有广泛的应用前景。干细胞可分为两大类：胚胎干细胞和成体干细胞。

胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)是一类高度未分化的细胞，具有全能性。但由于ESCs来源困难，且容易产生安全问题和伦理问题，极大的限制了ESCs的研究和应用。

成体干细胞(Adult Stem Cells)是一类存在于已经分化组织中的多潜能细胞，这类细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞。间充质干细胞(MesenchymalStem Cells，MSCs)是成体干细胞中的一种，来源于中胚层。目前，MSCs的研究以骨髓来源的间充质干细胞(Bone Marrow MesenchymalStem Cells,BMSCs)为主。大量的研究表明，BMSCs可以向成骨、软骨、脂肪、神经等多种组织细胞分化，在细胞治疗中，具有广泛的临床应用前景。但人体骨髓中的BMSCs含量极其稀少，并随着年龄的增加，骨髓中的BMSCs的数量、增殖和分化能力均有显著的下降，而且BMSCs的取材操作会给受试者造成伤害。这使得MSCs的研究和应用，尤其是临床应用，受到极大的限制。

近年的研究发现，脐带中的沃顿胶体富含脐带间充质干细胞(Umbilical CordMesenchymalStem Cells,UC-MSCs)，且大量研究表明，UC-MSCs具有与BMSCs相似的干细胞特性——良好的自我更新和多向分化能力，免疫原性低等特点。脐带作为分娩后的废弃物，取材方便，不会对受试者产生影响，且没有伦理限制。因此，脐带来源的MSCs引起了人们的广泛关注。

目前，用于分离UC-MSCs的酶消化法中，存在着许多缺陷。例如，有方法直接使用胶原酶或者使用胰酶和胶原酶分离UC-MSCs(如专利公开文本CN102321575A、CN102517251A和CN102533643A公开的方法)。沃顿胶体经过IV型胶原酶或者II型胶原酶和胰酶消化后，透明质酸无法被有效水解而残留，导致消化液过于黏稠，需用大量PBS缓冲液进行稀释或增加离心力和离心时间，很大程度上会造成大量UC-MSCs损失或损伤。也有方法(如专利公开文本CN102191229A公开的方法)将中性蛋白酶、胶原酶和透明质酸酶混合进行长时间的共消化，虽然可以充分水解沃顿胶体中的透明质酸，降低了消化液的黏性，但共消化期间胶原酶、中性蛋白酶会对暴露的UC-MSCs造成伤害，最终难以获得大量活性好的UC-MSCs。另外，在一些方法(如专利公开文本CN102321575A、CN102660501A公开的方法)中，使用过多的脐带组织进行UC-MSCs分离，导致其中许多组织都无法被充分消化而残留，需要使用滤网进一步过滤，这不仅增加了实验操作，而且组织块消化需要使用大量的消化酶，增加了UC-MSCs分离成本。

现有技术需要解决部分或全部上述分离UC-MSCs的问题。

发明内容

本发明的方法中，先使用胰酶和IV型胶原酶的混合消化液对沃顿胶体的组织结构进行水解，再使用透明质酸酶对消化液中的透明质酸进行高效水解。这样采用酶序消化的方法不仅可以解决沃顿胶体经过胶原酶、胰酶消化后，UC-MSCs难收集的问题，还可以解决沃顿胶体经过透明质酸酶、胶原酶和胰酶的长时间共消化后，UC-MSCs细胞活性不佳的问题。而且，在本发明的方法中，组织块消化充分，增加了UC-MSCs的获得量，可以减少脐带组织的使用量，减少酶的使用量，降低UC-MSCs分离成本。

在第一方面，本发明提供了一种分离UC-MSCs的方法，具体包括如下步骤：

1)将脐带组织碎块与胰酶和IV型胶原酶混合后孵育；

2)然后加入透明质酸酶后孵育。

在第二方面，本发明提供了一种分离和培养UC-MSCs的方法，具体包括如下步骤：

1)将脐带组织碎块与胰酶和IV型胶原酶混合后孵育；

2)然后加入透明质酸酶后孵育；

3)回收细胞并将其培养，获得UC-MSCs。

在一个实施方案中，制备本发明第一和第二方面的方法的步骤1)中的脐带组织碎块通过如下方式制备：剔除脐带的动脉和静脉，用等渗缓冲液冲洗(例如用PBS缓冲液冲洗)，在钝性分离或不分离沃顿胶体后制成组织碎块。

在一个实施方案中，本发明的方法的步骤1)中的胰酶和IV型胶原酶混合在低糖DMEM溶液中。优选地，胰酶和IV型胶原酶的浓度分别是0.05％和200U/ml。在优选的方案中，组织碎块与低糖DMEM溶液的体积比是1:3。

在一个实施方案中，本发明的方法的步骤1)中孵育在37℃下进行。在优选的方案中，孵育时间是3-5小时。

在一个实施方案中，本发明的方法的步骤2)中加入的透明质酸酶至浓度25μg/ml。

在一个实施方案中，本发明的方法的步骤2)中孵育在37℃下进行。在优选的方案中，孵育时间是5-10分钟。

在一个实施方案中，本发明的方法的步骤3)回收细胞通过离心进行，并优选用含有FBS的低糖DMEM培养基洗涤沉淀。

在一个实施方案中，本发明的方法的步骤3)培养用含有FBS的低糖DMEM培养基悬浮细胞铺板进行。

在一个实施方案中，本发明的方法的步骤3)中培养在37℃、5％CO₂的培养箱中进行。

本发明对现有的UC-MSCs的酶分离方法进行优化，避免以下问题：

1)沃顿胶体经过胰酶、胶原酶消化过后，其中的结构蛋白可被有效水解，而透明质酸因无法有效水解被残留下来，导致消化液的黏稠度过大，细胞不易被离心收集。

2)透明质酸酶联合胰酶、胶原酶对组织块进行长时间消化，消化期间胶原酶、胰酶会对暴露的细胞造成伤害，最终难以获得大量活性好的细胞。

3)使用过多组织块分离UC-MSCs，造成组织块消化不充分，消化液需要过滤。这不仅增加后续工作量，还浪费消化酶，增加UC-MSCs的分离成本。

附图说明

图1、MSCs成脂分化诱导结果。P3代UC-MSCs，使用GIBCO的STEMPRO AdipogenesisDifferentiation Kit诱导培养21天，油红O染色结果，胞质中可见明显脂滴(如箭头所示)。

图2、MSCs细胞成骨分化诱导结果。P3代UC-MSCs，使用GIBCO的STEMPROOsteogenesis Differentiation Kit诱导培养21天，茜素红S染色结果，确定钙分泌及沉积情况，钙沉积如箭头所示。

图3、MSCs细胞表面抗原检测结果。P3代UC-MSCs，使用流式细胞仪分别对其表面抗原CD73、CD90、CD105、CD34以及CD45的检测结果(M1为阳性面积)。

具体实施方式

在第一方面，本发明提供了一种分离UC-MSCs的方法，具体包括如下步骤：

1)将脐带组织碎块与胰酶和IV型胶原酶混合后孵育；

2)然后加入透明质酸酶后孵育。

在第二方面，本发明提供了一种分离和培养UC-MSCs的方法，具体包括如下步骤：

1)将脐带组织碎块与胰酶和IV型胶原酶混合后孵育；

2)然后加入透明质酸酶后孵育；

3)回收细胞并将其培养，获得UC-MSCs。

在一个实施方案中，本发明的方法的步骤1)中的胰酶和IV型胶原酶混合在低糖DMEM溶液中。使用低糖DMEM作为酶液的稀释液有两个优点：1、低糖DMEM在消化过程中，可为细胞提供基础营养，保证细胞的存活率；2、稳定细胞在分离时和培养时的渗透压，避免变化过剧。

优选地，胰酶和IV型胶原酶的浓度分别是0.05％和200U/ml。

在优选的方案中，组织碎块与低糖DMEM溶液的体积比是1:3。

在一个实施方案中，本发明的方法的步骤3)回收细胞通过离心进行，并优选用含有FBS的低糖DMEM培养基洗涤沉淀。

在一个实施方案中，本发明的方法的步骤3)培养用含有FBS的低糖DMEM培养基悬浮细胞铺板进行。

在一个实施方案中，本发明的方法的步骤3)中培养在37℃、5％CO₂的培养箱中进行，对所获得的UC-MSCs细胞进行纯化，扩繁。

在一个具体实施方案中，本发明提供了一种低损伤高效的MSCs的分离方法，具体包括如下步骤：

1)在无菌情况下，剔除脐带的动脉和静脉，用PBS缓冲液冲洗后，钝性分离或不分离沃顿胶体，制成组织碎块；

2)步骤1获得的组织块，按1:3的体积比与含有胰酶和IV型胶原酶的低糖DMEM混合液混合，在恒温水浴锅中37℃水浴消化3-5小时，得到混合物1；

3)在步骤2获得的混合物1中，加入透明质酸酶37℃水浴消化5-10分钟，得到混合物2；

4)将步骤3获得的混合物2，500g离心5分钟，获得沉淀1；

5)将步骤4获得的沉淀1，用含有FBS的培养基洗涤1次，500g离心5分钟，获得沉淀2；

6)将步骤5获得的沉淀2，用含有10％FBS+2ng/ml bFGF+2mM/mlGln的低糖DMEM培养基重悬细胞沉淀，铺板培养，最终获得UC-MSCs。

沃顿胶体中含有丰富的UC-MSCs，组织块越多，相同的时间内所得到的UC-MSCs细胞也越多。但组织量的增加，相应的消化酶的使用量也要增加，从而增加了UC-MSCs分离的成本费用。本方法中，UC-MSCs分离培养只用2ml脐带组织(约3cm长)，结合酶序消化的方法，先使用3倍体积的胰酶和IV型胶原酶混合消化液消化3-5小时，对其组织结构进行破坏，再使用低浓度的透明质酸酶快速水解消化液中的透明质酸，高效释放被透明质酸包裹着的UC-MSCs。

组织块被胰酶和IV型胶原酶消化3-5小时之后，组织结构通常可以被充分破坏，不需要再对消化液进行过滤，这不仅减少了组织量，减少实验操作，还减少了消化酶的使用量，节省UC-MSCs分离的成本。另外，胰酶和胶原酶对组织块进行初步的消化，胶体中的UC-MSCs被透明质酸包裹着，胰酶和IV型胶原酶都无法对透明质酸进行有效水解，因此，短时间内UC-MSCs受到胰酶和IV型胶原酶的影响较小。当组织结构被胰酶和IV型胶原酶充分水解后，再使用低浓度的透明质酸酶进行短时间消化，有效水解消化液中的透明质酸，充分释放UC-MSCs，并降低UC-MSCs收集难度，保证了UC-MSCs的获得量和细胞的活性。

定义：

PBS：磷酸盐缓冲溶液(Phosphate Buffered Solution)

FBS：胎牛血清(Fetal Bovine Serum)

Gln：谷氨酰胺(Glutamine)

bFGF：碱性成纤维生长因子(basic Fibroblast Growth Factor)

实施例

1)在无菌条件下，剪取足月健康新生儿脐带，储存于含200U/ml青霉素/链霉素(碧云天，ST488)的PBS缓冲液中，4℃保存。保存时间最长不超过一周。

2)在超净工作台中，剪取3cm左右的脐带，用PBS缓冲液洗涤，并挤出血管中残余的血块。

3)用剪刀纵行剪开脐带基膜，剔除脐带中的2条动脉和1条静脉。

4)用PBS缓冲液洗涤3遍，尽可能的把组织上的血迹洗涤干净。

5)钝性分离除脐带基膜以外的沃顿胶体，收集胶体并剪碎为约1mm³大小的组织块。

6)组织块与含有0.05％胰酶(GIBCO，15090-046)和200U/ml IV型胶原酶(INVITROGEN，17104-019)的低糖DMEM(GIBCO,c11885500bt)混合液，按1:3的体积比例混合，在恒温水浴锅中37℃水浴消化3-5小时，再加入终浓度为25μg/ml的透明质酸酶共消化5-10分钟。

7)500g离心5分钟，弃上清。加2ml含有10％FBS的低糖DMEM培养基洗涤沉淀1次。500g离心5分钟，弃上清。

8)加入2ml含有10％FBS(Hyclone，sh30084.03)+2mM/ml Gln(Sigma,G3126)+2ng/ml bFGF(INVITROGEN,13256-029)的低糖DMEM培养基重悬细胞沉淀，培养于35mm的培养皿中。第3天全量换液，以后每2天换一次液，待细胞汇合达到80-90％时，用0.05％的胰酶(INVITROGEN,25300062)消化，按1:3比例传代培养。

9)根据本发明的方法与专利公开文本CN102321575A和CN102191229A报道的方法，对比它们之间UC-MSCs的分离效果。采用等量的组织块，根据各自方法的消化，最后得到细胞悬液，统计各方法的细胞得率，数据如下表所示：

表1、采用不同的酶消化方法对1ml沃顿胶体组织消化后，所得到的UC-MSCs数量。

注：﹡为与发明方法组所得的细胞数相比，具有显著性差异(Student’s T-test，P<0.05)。

10)根据本发明的方法分离得到的细胞，经传代培养扩繁后，第3代MSCs分别做脂肪分化、成骨分化实验和流式检测。脂肪分化和成骨分化实验结果，如图1和图2所示，可见明显的脂滴形成和钙沉积。MSCs流式检测中，发明人检测了UC-MSCs主要的5个表面抗原(CD34、CD45、CD73、CD90和CD105)，结果如图3所示。图中CD73、CD90、CD105、CD34以及CD45的阳性率分别为98.10％、99.97％、98.20％、3.48％、2.74％，说明UC-MSCs经过培养后，细胞纯度较好。

Claims (9)

1.一种分离UC-MSCs的方法，具体包括如下步骤：

1)将脐带组织碎块与胰酶和IV型胶原酶混合后孵育；

2)然后加入透明质酸酶后孵育；

并且所述方法不包括过滤的步骤；

其中胰酶和IV型胶原酶的浓度分别是0.05％和200U/ml。

2.一种分离和培养UC-MSCs的方法，具体包括如下步骤：

1)将脐带组织碎块与胰酶和IV型胶原酶混合后孵育；

2)然后加入透明质酸酶后孵育；

3)回收细胞并将其培养，获得UC-MSCs；

并且所述方法不包括过滤的步骤；

其中胰酶和IV型胶原酶的浓度分别是0.05％和200U/ml。

3.权利要求1或2的方法，其中用于制备步骤1)中脐带组织碎块通过如下方式获得：剔除脐带的动脉和静脉，在钝性分离或不分离沃顿胶体后制成组织碎块。

4.权利要求1或2的方法，其中步骤1)中的胰酶和IV型胶原酶混合在低糖DMEM溶液中。

5.权利要求4的方法，其中组织碎块和低糖DMEM溶液的体积比是1:3。

6.权利要求1或2的方法，其中步骤1)中孵育在37℃下进行，孵育时间是3-5小时。

7.权利要求1或2的方法，其中步骤2)中加入透明质酸酶至浓度25μg/ml。

8.权利要求1或2的方法，其中步骤2)中孵育在37℃下进行，孵育时间是5-10分钟。

9.权利要求2的方法，其中步骤3)培养用低糖DMEM培养基溶液悬浮细胞进行铺板。