CN104789473B - 一种用于微藻冻存的非渗透保护剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于微藻冻存的非渗透保护剂—红藻糖苷，以及它作为微藻玻璃态冻存时的应用；所述红藻糖苷是与一种渗透保护剂二甲基亚砜共同协同使用，在微藻处于对数生长期时加入。本发明采用的红藻糖苷来源于红藻，资源丰富，且具有抗渗透压、抗氧化、保护生物大分子等多种作用，与微藻的相容性好。能很好的提高微藻，特别是红藻在冻存后的存活率、生长状况。

Description

一种用于微藻冻存的非渗透保护剂

技术领域

本发明属于微藻藻种保存技术领域，特别是涉及一种用于微藻冻存的非渗透保护剂。

背景技术

由于藻类具有丰富的、多样性的基因资源以及它们在生物技术上的潜力与日俱增,藻类种质保存的研究近年来日益受到重视。保种方法有继代培养法、固定化保存、超低温保存法。这些方法在实际应用中存在诸多弊端，如继代培养在长时间培养、多次接种下，易导致藻种污染或者遗传漂变，生命力减退等失去良种的价值。固定化培养程序较复杂，需要细心操作，而且大多数微藻在培养后期常会从胶珠中溢出，有的胶珠还会融解，导致保种失败。超低温冻存法可以将存活率提高到30％以上，但同样存在一些缺陷。如常用的两步冷冻法，需要复杂的预冷冻程序，费用较高，耗时长且不可避免冻融过程中晶体的形成，对保存材料造成损伤。而玻璃化冻存法不仅可以克服前几种保存技术中费时、费力、易污染等弊病，而且经过玻璃化冻存的藻种相当于进行了一次优胜劣汰的复壮作用，复苏后存活下来的藻细胞一般会比未冻存的长得更好、更高产和抗冻性更强。但目前还没有有效的用于微藻冻存的非渗透保护剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于微藻冻存的非渗透保护剂，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供红藻糖苷在制备微藻冻存保护剂中的应用，其中红藻糖苷的化学结构式如下：

本发明另外还提供一种用于微藻冻存的保护剂，是包含有红藻糖苷和渗透性保护剂。

本发明的渗透性保护剂的使用液，是用盐度为25～30‰的海水进行稀释，稀释后红藻糖苷的浓度选择为5-15％，DMSO的浓度优选为10％。

本发明的冻存剂的使用方法是：将收集的藻类细胞用新鲜培养基悬浮，然后将保护剂加入，保护剂的加入量至红藻糖苷的浓度为5-15％，DMSO的浓度为10％；混匀后室温平衡30min。4℃放置30min后置于-80℃过夜，投入液氮保存。

本发明克服传统的海洋微藻种质的保存方法繁琐，细胞的污染和变异几率大；而开发的海洋微藻冻存剂中，没有来源于藻类的、相容性好的非渗透保护剂的问题。提供一种来自于红藻的，能够对冻存细胞起到形成玻璃态，起到很好的保护作用。

附图说明

图1：红藻糖苷作为非渗透冻存剂对微藻细胞存活率的影响；

图2：红藻糖苷作为非渗透冻存剂对微藻生长曲线的影响；

图3：红藻糖苷作为非渗透冻存剂对微藻光能转化效率的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。本发明不仅局限于此。

实施例1：

取100g红藻粉和400-600ml纯度为65-75％的乙醇，于65-75％的水浴中搅拌提取5-7小时，搅拌速度100-200转，取出，过滤得到的溶液旋转蒸发浓缩去乙醇，剩下的溶液以等量的乙酸乙酯萃取三次，每次10-30min。得到的水溶液分别上阴阳离子交换树脂，先经过阴离子交换树脂，流出的溶液再经过阳离子交换树脂，流出的溶液以5-10％NaOH中和，得到的溶液冷冻干燥后，以70-80℃热乙醇溶解，溶出部分旋转蒸发干燥得到红藻糖苷。

红藻糖苷以LC-MS方法进行检测，液相色谱和质谱条件：

(1)所用仪器：TSQ Quantum Access液相色谱-三重四极杆质谱联用分析系统；

(2)液相条件：固定相为Waters XBridgeTM Amide柱(100mm×3.0mm,3.5μm)；流动相为体积比为90：10的乙腈-0.1％乙酸铵水溶液等度洗脱；进样量10μL，柱温40℃；

(3)质谱条件：采用电喷雾电离源负离子电离模式，喷雾电压2.5KV，鞘气流量25L/min，辅助气流量5L/min，离子传输毛细管温度350℃，扫描采用选择反应监测SRM模式，母离子为[M-H]-离子m/z277，子离子m/z119和89，碰撞能量分别为20eV和21eV，采集时间均为0.2s，碰撞气采用氩气，碰撞气压力1.5mTorr。

制作标准曲线，分别称取1.0μg、5.0μg、10.0μg、50.0μg和100.0μg红藻糖苷标准品，用1mL体积比为1：1的乙腈/水溶液配置，得到红藻糖苷浓度分别为0.92μg/mL、4.6μg/mL、9.2μg/mL、45.9μg/mL和91.9μg/mL的标准溶液，然后在上述的色谱和质谱条件下测定，记录峰面积，绘制峰面积-浓度标准曲线，即得到所述的标准曲线。

计算含量：

样品中红藻糖苷含量X＝C*V*n/m，式中：

X—样品中红藻糖苷的含量，单位μg/mg；

C—由标准曲线测得的待测液中红藻糖苷浓度，单位为μg/mL；

V—待测液体积，单位为mL；

n—待测液稀释倍数

m—样品质量，单位为mg。

实施例2

将红藻糖苷和DMSO分别加入到盐度为25～30‰的海水中，其中DMSO的终浓度是10％，而红藻糖苷的终浓度分别为5、10和15％(g/ml)，0.22μm滤膜过滤灭菌后4℃保存。

选择颗石藻、紫球藻和小球藻为冻存实验微藻，以含5、10和15％红藻糖苷和10％的DMSO的海水溶液作为冻存液。对数生长期离心(5000r/min，10min)收集藻细胞，用新鲜培养基再悬浮至5×10⁷/ml左右。将750μl藻液和750μl冻存母液加入1.8ml冻存管，移液枪吹打混匀后室温平衡30min。4℃放置30min后置于-80℃过夜，直接投入液氮保存。

48h后，取出冻存管，以40℃水中快速解冻后，离心弃去上清，新鲜培养基洗涤2次后用1.5ml新鲜海水重新悬浮。并对保存的藻种的理化性质进行检测：

保护剂对海洋微藻存活率的影响

使用FDA标记活的藻细胞，流式细胞仪检测冻存藻株的存活率。

红藻糖苷作为冷冻保护剂对3种藻株都有不同程度的保护作用，存活率较单独DMSO处理有明显增加，并且效果随浓度增大而增强。其中红藻糖苷对紫球藻(红藻)的保护作用较好，15％红藻糖苷协同10％DMSO，可使细胞存活率高达84.44％，比单独DMSO保护作用增高了20％之多(图1)。

对冻存微藻生长曲线的影响

复养后，藻细胞每天测定OD值，计算其密度，绘制生长曲线。

凡冻存过的藻株再接种培养后细胞密度均达不到未冻存藻株的细胞密度水平，但添加了红藻糖苷后，细胞密度均比只有DMSO作为保护剂的情况下有所增加。特别是对紫球藻的保护，红藻糖苷和DMSO协同保护后，细胞密度基本可以达到未冻存对照组的细胞密度水平(3.8×10⁶/mL)，证明红藻糖苷对紫球藻生长曲线有更好的影响(图2)。

红藻糖苷对冻存微藻的光能转化效率的影响

复养后，在对数生长期时，暗处理20min后用叶绿素荧光仪测定PSⅡ最大光能转化效率(Fv/Fm)。

Fv/Fm即PSⅡ的最大光能转化效率，反映细胞的光合作用效率。实验结果显示，冻存过的藻株Fv/Fm显著降低，加入红藻糖苷协同DMSO保护后，其值会有明显升高(增幅可达10％之高)，并具有显著性差异(图3)。

对其它微藻类细胞的保存结果也证明本发明的非渗透保护剂具有良好的保存效果。

Claims (6)

1.一种红藻糖苷的用途，其特征在于，是红藻糖苷在制备微藻冻存保护剂中的应用，所述的红藻糖苷，其制备方法如下：取红藻粉和纯度为65-75％的乙醇，于65-75％的水浴中搅拌提取5-7小时，搅拌速度100-200转，取出，过滤得到的溶液旋转蒸发浓缩去乙醇，剩下的溶液以等量的乙酸乙酯萃取；得到的水溶液分别上阴阳离子交换树脂，先经过阴离子交换树脂，流出的溶液再经过阳离子交换树脂，流出的溶液以5-10％NaOH中和，得到的溶液冷冻干燥后，以70-80℃热乙醇溶解，溶出部分旋转蒸发干燥得到红藻糖苷。

2.一种用于微藻冻存的保护剂，其特征在于，所述的保护剂包含有红藻糖苷和渗透性保护剂；所述的渗透性保护剂为DMSO。

3.一种微藻冻存的保护剂，其特征在于，所述的保护剂是将权利要求2所述的保护剂用盐度为25～30‰的海水进行稀释，稀释后红藻糖苷的浓度为5-15％，DMSO的浓度为10％。

4.一种藻类细胞的保存方法，其特征在于，是用权利要求3所述的保护剂进行保存。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，是将收集的藻类细胞用培养基悬浮，然后将权利要求3所述的保护剂加入，混匀后室温平衡30min；4℃放置30min后置于-80℃过夜，投入液氮保存。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的藻类为颗石藻、紫球藻或小球藻。