CN105087468B - 一种高效诱导干细胞向胰岛β样细胞分化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效诱导干细胞向胰岛β样细胞分化的方法。该方法包括：首先在诱使细胞团聚的前提下，应用MET激动剂处理该细胞团，达到高效诱导干细胞向胰岛β样细胞分化的方法。该方法有助于提高干细胞向胰岛素分泌性细胞分化的效率和活力，进而治疗因β细胞受损，胰岛素分泌绝对量减少而导致的高血糖症。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种诱使干细胞团聚后，使用MET激动剂处理该细胞团，达到高效诱导干细胞向胰岛β样细胞分化的方法。
背景技术
I型糖尿病是由于分泌胰岛素的β细胞因中毒或自体免疫攻击等情况下收到损伤，导致的胰岛素分泌不足而引起的。糖尿病人都承受着肥胖，高血糖，肢体运动失调，肾损伤和眼睛病变的痛苦。多年来，为根除糖尿病，人们一直寻找基于组织和细胞的再生替代治疗方法。其中，干细胞治疗近年来备受瞩目。人们认为，将干细胞诱导成为胰岛素分泌性细胞，并进行移植是干细胞治疗糖尿病的可靠途径。目前已经有很多方法诱导干细胞向胰岛β样细胞分化。但是绝大部分方法都面临了分化效率低，分化后细胞活性差的问题。这些问题阻碍了干细胞治疗糖尿病的应用。
干细胞在体外培养分化所面临的主要问题是，体外环境不能像体内环境一样提供干细胞正常生长所需要的全部必要条件。干细胞在体内的分化也是通过与其所在位置的信号分子相互作用以后，才能够正确的进行分化程序。干细胞的体内环境由各种细胞因子，糖蛋白、脂蛋白等多种细胞外基质成分，以及各种激素等调节分子构成。显然体外环境难以完全模拟体内干细胞生存环境。这导致了干细胞提早衰亡，分化效率低和分化之后细胞活力不佳等现象。干细胞团聚结构是干细胞集中并形成的三维立体结构，它给干细胞提供了一个相对自然的支持环境，并造成了局部低氧的环境。研究证明，在这种结构下，干细胞表达了更高的干细胞标记物比如Met，具有更大的分化潜力。研究表明，Met能够调控干细胞的生长，自我更新和分化。Met在肝细胞分化过程中是必须的。Met基因敲除的β细胞对地塞米松的刺激极为敏感，同时阻碍了β细胞对葡萄糖刺激的响应。我们的研究证明，激活MET通路，有利于促使间充质干细胞向胰岛细胞分化。但是，细胞团聚后无疑提供了更加天然的分化环境，对于使用MET激动剂，有效刺激干细胞团向胰岛β样细胞分化，目前并无报道。
基于以上原理，本发明通过诱使干细胞团聚，应用MET激动剂处理该细胞团，达到高效诱导干细胞向胰岛β样细胞分化。
发明内容
发明目的：本发明的一种高效诱导干细胞向胰岛β样细胞分化的方法通过诱使干细胞团聚后，使用MET激动剂激活MET/HGF信号通路，能够高效诱导干细胞向胰岛β样细胞，并能提高其活力。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高效诱导干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，该方法包括以下步骤：步骤a：通过诱使细胞团聚；
步骤b：应用MET激动剂激活处理细胞团，高效诱导干细胞向胰岛β样细胞分化。
其中，上述干细胞为胚胎干细胞，脂肪间充质 干细胞，脐带血间充质干细胞或脐带间充质干细胞中的一种或几种。
其中，上述步骤a诱使细胞团聚采取的方法，是指在明胶包被的培养板上进行悬浮培养，从而使细胞团聚。
其中，上述的MET激动剂是指各种可以激活MET蛋白的分子，包括HGF，活性肽，化学分子或基因工程蛋白质分子中的一种或几种。
一种高效诱导干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，具体步骤如下：
1）脐带血间充质干细胞培养于2%明胶包被的培养板，在含有20%胎牛血清的DMEM悬浮培养7天后，细胞球平均直径达100微米时即开始诱导；
2）细胞用PBS清洗两次，使用培养基I培养24小时；
3）24小时后，PBS清洗细胞，并更换为培养基II，继续培养48小时；
4）48小时后，PBS清洗细胞，并更换为培养基III，继续培养48小时；
5）48小时后，PBS清洗细胞，并更换为培养基IV，继续培养24小时；
6）经ELISA免疫定量测定；
7）对7周龄小鼠腹腔注射160 mg/kg链脲霉素来诱导产生糖尿病；
8）血糖浓度达到16.7 mmol/L时, 每只小鼠腹腔肝内注射2.5×106胰岛β样细胞之后每两周检测血糖浓度。
所述培养基I的成分为：DMEM/F12、1mM丁酸钠和50ng/mL 激活素A。
所述培养基II的成分为：DMEM/F12、0.1-0.2% 胎牛血清和50ng/mL Activin A。
所述培养基III的成分为：DMEM/F12、50ng/mL KGF/FGF、10ng/mL RA、10ng/mL HGF和1%胎牛血清。
所述培养基IV的成分为：DMEM/F12、10ng/mL HGF、1% B27和2%胎牛血清。
有益效果：相对于现有技术，本发明具有以下优点：本发明通过诱使干细胞团聚后，使用MET激动剂处理干细胞团，能够高效诱导干细胞向胰岛β样细胞，并能提高其活力，实现了本发明。
附图说明
图1 经ELISA定量测定，分化成功后细胞内（A, B）和细胞外（C, D）外胰岛素和C-肽（C-peptide）的含量显著增加；
图2应用分化成功的胰岛β样细胞可以使高血糖小鼠模型的高血糖症得到缓解。
具体实施方式
实施例1
一种高效诱导干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，该方法包括以下步骤：
1、脐带血间充质干细胞培养于2%明胶包被的培养板，在含有20%胎牛血清（Ultrapure agarose，Invitrogen，Carlsbad，CA）的DMEM（Life Technologies，Gaithersburg，MD，USA）悬浮培养7天后，细胞球平均直径达100微米时即开始诱导。
2、细胞用PBS清洗两次，使用培养基I培养24小时，培养基I的成分为：DMEM/F12(Life Technologies)，1mM丁酸钠(Sigma，St. Louis，MO，USA)，50ng/mL Activin A(Sigma)。
3、24小时后，PBS清洗细胞，并更换为培养基II，继续培养48小时，培养基II的成分为：DMEM/F12，0.1-0.2% 胎牛血清，50ng/mL Activin A。
4、48小时后，PBS清洗细胞，并更换为培养基III，继续培养48小时，培养基III的成分为：DMEM/F12，50ng/mL KGF/FGF(Life Technologies)，10ng/mL RA(LifeTechnologies)，10ng/mL HGF，1%胎牛血清。
5、48小时后，PBS清洗细胞，并更换为培养基IV，继续培养24小时，培养基IV的成分为：DMEM/F12，10ng/mL HGF(Life Technologies)，1% B27(Life Technologies)，2%胎牛血清。
6、经ELISA免疫定量测定（Ultrasensitive ELISA kits；Merocodia， Uppsala，Sweden)），分化成功后细胞内和细胞外的外胰岛素和C-肽的含量显著增加（图1）。
7、对7周龄小鼠腹腔注射160 mg/kg链脲霉素(STZ，Sigma，St-Louis，MO，USA) 来诱导产生糖尿病。
8、血糖浓度达到16.7 mmol/L时，每只小鼠腹腔肝内注射2.5×106胰岛β样细胞后每两周检测血糖浓度。
9、应用分化成功的胰岛β样细胞可以使高血糖小鼠模型的高血糖症得到缓解（图2）。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种高效诱导干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤a：通过诱使细胞团聚；所述步骤a诱使细胞团聚采取的方法，是指在明胶包被的培养板上进行悬浮培养，从而使细胞团聚；
步骤b：应用MET激动剂激活处理细胞团，高效诱导干细胞向胰岛β样细胞分化，
所述干细胞为脂肪间充质 干细胞，脐带血间充质干细胞或脐带间充质干细胞中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的一种高效诱导干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征在于，所述的MET激动剂是指各种可以激活MET蛋白的分子，包括HGF，活性肽，化学分子或基因工程蛋白质分子中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种高效诱导干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征在于，具体步骤如下：
1）脐带血间充质干细胞培养于2%明胶包被的培养板，在含有20%胎牛血清的DMEM悬浮培养7天后，细胞球平均直径达100微米时即开始诱导；
2）细胞用PBS清洗两次，使用培养基I培养24小时；
3）24小时后，PBS清洗细胞，并更换为培养基II，继续培养48小时；
4）48小时后，PBS清洗细胞，并更换为培养基III，继续培养48小时；
5）48小时后，PBS清洗细胞，并更换为培养基IV，继续培养24小时；
6）经ELISA免疫定量测定；
7）对7周龄小鼠腹腔注射160 mg/kg链脲霉素来诱导产生糖尿病；
8）血糖浓度达到16.7 mmol/L时, 每只小鼠腹腔肝内注射2.5×106胰岛β样细胞之后每两周检测血糖浓度。
4.根据权利要求3所述的一种高效诱导干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征在于，所述培养基I的成分为：DMEM/F12、1mM丁酸钠和50ng/mL 激活素A。
5.根据权利要求3所述的一种高效诱导干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征在于，所述培养基II的成分为：DMEM/F12、0.1-0.2% 胎牛血清和50ng/mL Activin A。
6.根据权利要求3所述的一种高效诱导干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征在于，所述培养基III的成分为：DMEM/F12、50ng/mL KGF/FGF、10ng/mL RA、10ng/mL HGF和1%胎牛血清。
7.根据权利要求3所述的一种高效诱导干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征在于，所述培养基IV的成分为：DMEM/F12、10ng/mL HGF、1% B27和2%胎牛血清。
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