CN105087824B

CN105087824B - 出血热相关病原体鉴别基因芯片的制备和用途

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Publication number: CN105087824B
Application number: CN201510096044.3A
Authority: CN
Inventors: 张严峻; 颜浩; 王升启; 刘琪琦; 陈苏红; 刘志红; 孙晓彦
Original assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS; Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS; Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2015-03-04
Filing date: 2015-03-04
Publication date: 2019-10-25
Anticipated expiration: 2035-03-04
Also published as: CN105087824A

Abstract

本发明涉及一种出血热相关病原体鉴别基因芯片，其制备方法包括制备特异性引物，制备病原体特异性寡核苷酸探针，制备寡核苷酸芯片，建立RT‑PCR体系，建立杂交体系及信号检测方法。利用本发明制备的基因芯片可同时甄别16种出血热相关病原微生物，包括扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒、鸠宁病毒、马秋波病毒、裂谷热病毒、克里米亚‑刚果出血热病毒、疟原虫、汉坦病毒、发热伴血小板减少综合征病毒、登革病毒、黄热病毒、基孔肯雅病毒、A型流感病毒、B型流感病毒，具有快速、准确、高通量、高灵敏度的特点，可为出血热病原的诊断、卫生监督及传染病防控提供一种新的技术手段。

Description

出血热相关病原体鉴别基因芯片的制备和用途

技术领域

本发明涉及十六种出血热相关病原体核酸检测基因芯片的制备和用途，属基因芯片检测技术领域。

背景技术

病毒性出血热(Viral Hemorrhagic Fever，VHF)是一组由不同类型病毒引起，以发热、出血为主要临床症状的一组自然疫源性疾病。出血热病毒主要分布在丝状病毒科(Filoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)和黄病毒科(Flaviviridae)。可引发出血热的病毒种类繁多，其中在全球范围内影响较大的包括：丝状病毒科埃博拉病毒、马尔堡病毒、沙粒病毒科拉沙病毒、鸠宁病毒、马秋波病毒、布尼亚病毒科裂谷热病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、汉坦病毒、发热伴血小板减少综合征病毒、黄病毒科登革病毒、黄热病毒、披膜病毒科基孔肯雅病毒等。该类疾病发病初期的临床表现并不特异，类似流感、疟疾，常可发展到皮下、体腔和内脏出血，随之而来的是休克、昏迷和神经功能障碍等，病死率高，危害严重。

出血热病毒宿主和媒介类型广泛，传播方式多种多样，随着经济全球化的进展，各地区商贸往来和人员交流更加快捷频繁，宿主和媒介分布的地理界线被打破，从而导致疫情流行范围的扩大和突然暴发，也增加了发生输入性疫情的可能。2014年西非暴发的埃博拉出血热是由埃博拉病毒引起的急性出血性传染病，自2014年3月报告出现首批病例到12月24日共有19497人疑似或确认感染，导致7588人死亡，是1976年首次发现埃博拉病毒以来发生的最大且最复杂的埃博拉疫情，本次疫情出现的病例和死亡数字超过了所有其它疫情的总和。WHO已将埃博拉病毒列为对人类危害最严重的病毒之一，其平均病死率约为50％，在以往疫情中出现的病死率从25％到90％不等，目前发现有五个亚型，其中扎伊尔型和苏丹型病死率最高，分别可达88.8％和53.2％。2014年中国广东暴发登革热，至12月1日广东累计报告登革热病例45053例。据估计，全球每年实际感染登革病毒的病例高达3.9亿，其中超过2万人因严重感染而死亡。不仅既往发现的病毒疫情不时暴发，引起新发传染病的新病毒也不断被发现。2010年我国发现具有重要公共卫生意义的新型布尼亚病毒——发热伴血小板减少综合征病毒(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus，SFTSV)，该病毒感染人体引起的发热伴血小板减少综合征，是一种以发热伴白细胞、血小板减少和多脏器功能损伤为主要临床表现的新发传染病，死亡率高达30％。目前已在山东、湖北、浙江、江苏等多个省市发现SFTSV感染病例，2011-2013年，美国密苏里州、日本、韩国也相继报道发现有经蜱虫叮咬传播的类似SFTSV病毒感染病例，SFTSV感染已逐渐成为全球性的重要公共卫生问题。

由于病毒性出血热病死率高，传播途径广，极易造成社会恐慌，美国疾病预防控制中心将出血热病毒列为一类生物武器，因此病毒性出血热的防控和治疗手段显得尤为重要。但目前已商业化的出血热疫苗只有肾综合征出血热疫苗和黄热病疫苗，另外尚有阿根廷出血热疫苗和裂谷热疫苗处于临床试验阶段；在药物治疗方面，尚无针对病毒性出血热的特效药物。“诊”、“防”、“治”三个环节构成了完整的疾病预防控制链，其中“诊”不仅是其中不可缺少的关键一环，而且也是有效防治的前提。在病毒性出血热的高发和临床治疗手段的缺乏情况下，准确有效的诊断病原体显得尤为重要。

由于多数感染者早期缺乏特异的临床表现，且不同的病毒性出血热之间或者病毒性出血热与其他疾病(例如疟疾、流感等)之间都存在相似的临床症状，必须依赖实验室诊断方法加以确认。目前常用的出血热病原体实验室检测方法主要包括病毒分离、聚合酶链反应法(PCR)、酶联免疫吸附法(ELISA)、间接免疫荧光法(IFA)、电镜技术(EM)和免疫组化技术。上述方法都有各自的优缺点，有的方法操作复杂，耗时费力；有的方法特异性和/或敏感性较低；有的方法样本用量过多；且上述方法均存在检测通量不足，检测范围有限的问题。

基因芯片(Gene chip)又称为DNA芯片(DNA chip)、DNA微阵列(DNA microarray)，是生物芯片的一种，也是生物芯片技术中发展最成熟、最先进入应用和实现商品化的技术。基因芯片技术是指直接将DNA探针或者在固相支持物(如玻片、硅片、尼龙膜等)上原位合成寡核苷酸固定于支持物表面，然后与待分析的标记样品杂交，标记的样品通过于基因芯片上已知碱基序列的DNA片段互补杂交，从而得到样品的遗传信息，确定样品的核酸序列，或对基因表达量及其特性进行分析。基因芯片技术因其具有快速、准确、高通量、高效率、低成本等特点被广泛应用于表达谱分析、单核苷酸多态性分析、疾病诊断、病原微生物检测等方面。

本研究结合出血热诊断的实际需要，选取了十三种出血热相关病毒，并加入可引起相似症状的疟原虫及流感病毒，旨在研制出血热相关病原体鉴别基因芯片。基于化学发光检测方法，同时检测十六种出血热相关病原体，包括扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒、鸠宁病毒、马秋波病毒、裂谷热病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、疟原虫、汉坦病毒、发热伴血小板减少综合征病毒、登革病毒、黄热病毒、基孔肯雅病毒、A型流感病毒、B型流感病毒。该芯片法特异性高，敏感性强，适合于多种致发热病症病原体的快速鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因芯片，该芯片可同时检测十六种出血热相关病原体，包括扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒、鸠宁病毒、马秋波病毒、裂谷热病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、疟原虫、汉坦病毒、发热伴血小板减少综合征病毒、登革病毒、黄热病毒、基孔肯雅病毒、A型流感病毒、B型流感病毒，具有快速、准确、高通量、高灵敏度的特点，可为出血热病原的诊断、卫生监督及传染病防控提供一种新的技术手段。

本发明所述的基因芯片其制备方法包括如下步骤：

1.制备特异性引物

经过比对各病原体基因组，选择特异、保守片段作为检测靶基因，在保证各病原体靶基因特异性扩增的前提下兼顾其灵敏度，故将病原体特异性引物进行多重分管组合，经优化最终确定了3管多重TR-PCR体系。优选的29条特异性引物及其对应的扩增靶病原种类和分管组合情况如表1所示，各下游引物5’端标记生物素。

表1出血热相关病原体引物及其对应的扩增靶病原种类和分管组合情况

2.制备特异性探针

本着型间保守、属间特异的原则，根据16种相关病原体靶基因序列间的比对，在上下游引物范围内的序列相对特异区进行特异性探针的设计。每种靶病原对应一条特异性寡核苷酸探针，优选的特异性探针序列如表2所示，每条探针的3’端加入12个碱基T并在3’末端以氨基修饰。

表2特异性探针序列及对应的靶病原

3.制备基因芯片

一个优选的实施方案，步骤2中各个寡核苷酸探针在点样时，用芯片点样液(6×SSC，5％甘油，0.1％SDS)稀释至终浓度50μM。用市售的基因芯片点样仪以接触式点样方式将探针点到空白的醛基化修饰玻片上(阵列如表3所示)，各探针的点样量均为3nl，其中质控探针为20T序列，5’端生物素标记、3’端氨基修饰，用来监测醛基片片基质量。点制过程保持一定湿度，寡核苷酸芯片制备完毕后，芯片应至少在室温干燥放置24小时，使探针与载体充分交联。

表3寡核苷酸探针阵列

质控

ZEBO-P

SEBO-P

MAR-P

LF-P

JUN-P

MAC-P

RVF-P

CCHFV-P

ZEBO-P

SEBO-P

MAR-P

LF-P

JUN-P

MAC-P

RVF-P

CCHFV-P

ZEBO-P

SEBO-P

MAR-P

LF-P

JUN-P

MAC-P

RVF-P

CCHFV-P

MAL-P

HV-MP

SFTSV-P

DEN-P

YFV-P

CHIKV-P

FluA-P

FluB-P

MAL-P

HV-MP

SFTSV-P

DEN-P

YFV-P

CHIKV-P

FluA-P

FluB-P

MAL-P

HV-MP

SFTSV-P

DEN-P

YFV-P

CHIKV-P

FluA-P

FluB-P

空白对照

4.建立RT-PCR体系

本发明基因芯片中RT-PCR体系的特征为不对称多重RT-PCR反应体系。合适的RT-PCR体系可以进一步提高芯片的检测灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对比例、酶的用量等因素进行了优化。优选的RT-PCR体系及扩增条件，如表4所示：

表4-1不对称多重RT-PCR体系配方

表4-2优选的RT-PCR扩增条件

5.建立芯片杂交体系

合适的杂交体系对芯片的特异性及灵敏度改善也有很大的促进作用。通过优化得到了同时可以保证特异性和灵敏度的预洗液及杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。基因芯片杂交前分别置于预洗液(0.2％SDS)与去离子水中清洗20s，RT-PCR产物在95℃变性5min后立即置于冰水浴中。将RT-PCR产物与杂交液等体积混合，优选的杂交液各组分为8×SSC，10％甲酰胺，1.2％SDS，10×Denhardt’s。优选的杂交条件为45℃水浴杂交1小时。优选的洗涤条件为分别在洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤20s。

6.建立信号检测方法

将标记液(Streptavidin-HRP)用稀释液(1×PBS+0.1％BSA)以1∶1000稀释，于每个杂交区加入15μl，芯片置于37℃孵育30min。取出后用PBST洗液(1×PBS+0.05％Tween-20)清洗20s，晾干。将化学发光HRP底物A液和B液(Millipore公司)等体积混匀，每个杂交区加入20μl并迅速展开铺匀，立即置于化学发光成像仪中扫描。记录结果，根据信号强度对结果进行判定。

以上制备的出血热相关病原体鉴别基因芯片包括寡核苷酸芯片、RT-PCR体系、杂交液、洗液A、洗液B、洗液C、Streptavidin-HRP、稀释液、PBST洗液、化学发光HRP底物A液和B液。

本发明建立了一种基于化学发光技术平台的基因芯片，可以对16种出血热相关病原体进行区分，包括扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒、鸠宁病毒、马秋波病毒、裂谷热病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、疟原虫、汉坦病毒、发热伴血小板减少综合征病毒、登革病毒、黄热病毒、基孔肯雅病毒、A型流感病毒、B型流感病毒。该基因芯片和相应的制备方法，具有较强的实用性，通过一次实验操作实现多个病种的检测，在缩短检测周期的同时提高检测效率。与常规培养方法比较，具有快速、准确、灵敏的优势，与免疫学方法和其他核酸检测方法相比，具有高通量、高特异性的优点，可为出血热病原的诊断、卫生监督及传染病防控提供一种新的技术手段。

附图说明

图1：基因芯片外观示意图，每张芯片上有10个相同的分布有探针点阵的杂交反应区。

图2：出血热相关病原体鉴别基因芯片探针点阵布局图，其中1a至8a为质控点；1b至1d为扎伊尔型埃博拉病毒探针；2b至2d为苏丹型埃博拉病毒探针；3b至3d为马尔堡病毒探针；4b至4d为拉沙病毒探针；5b至5d为鸠宁病毒探针；6b至6d为马秋波病毒探针；7b至7d为裂谷热病毒探针；8b至8d为克里米亚-刚果出血热病毒探针；1e至1g为疟原虫探针；2e至2g为汉坦病毒探针；3e至3g为发热伴血小板减少综合征病毒探针；4e至4g为登革病毒探针；5e至5g为黄热病毒探针；6e至6g为基孔肯雅病毒探针；7e至7g为A型流感病毒探针；8e至8g为B型流感病毒探针；1h至8h为空白对照。

图3：出血热相关病原体鉴别基因芯片特异性评价结果图，A为埃博拉病毒扎伊尔型；B为埃博拉病毒苏丹型；C为马尔堡病毒；D为拉沙病毒；E为鸠宁病毒；F为马秋波病毒；G为裂谷热病毒；H为克里米亚-刚果出血热病毒；I为恶性疟原虫；J为间日虐原虫；K为汉坦病毒；L为发热伴血小板减少综合征病毒；M为登革病毒；N为黄热病毒；O为基孔肯雅病毒；P为流感病毒A型；Q为流感病毒B型；R为阴性对照。

图4：出血热相关病原体鉴别基因芯片灵敏度芯片检测结果图，以埃博拉病毒、疟原虫和发热伴血小板减少综合征病毒为例。其中图中A1～A5代表埃博拉病毒扎伊尔型灵敏度评价结果；B1～B5代表埃博拉病毒苏丹型灵敏度评价结果；C1～C5代表疟原虫灵敏度评价结果；D1～D5代表发热伴血小板减少综合征病毒灵敏度评价结果。1～5依次表示10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10¹copies/μl和阴性对照。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1：出血热相关病原体鉴别基因芯片的研制

一、特异性引物的设计和筛选

登陆NCBI网站，在GenBank检索相关病毒属病毒的全基因组序列进行比对分析，疟原虫属下载了4种疟原虫的18s rRNA基因进行比对分析。使用VectorNTIAdvance10(invitrogen)软件包中的AlignX程序按照默认的参数设置对各病原体基因序列进行全局比对。根据比对结果在基因序列的保守区设计特异性引物，经筛选最终确定29条特异性引物(如表1所示)，将下游引物进行生物素标记，作为芯片使用的引物。

二、参考品的构建

除部分出血热相关病原体获得了核酸样本，其余病原体(均为病毒)均未获得合适样本，为满足实验需求，本研究采用重叠延伸的方法人工构建无核酸样本的病原体基因组序列。按照Thermo TranscriptAid T7High Yield Transcription Kit说明书的步骤对构建好的病毒质粒进行体外转录，制备体外转录RNA并定量，作为特异性和灵敏度参考品。

三、特异性探针的设计和筛选

本着型间保守、属间特异的原则，根据AlignX程序的比对结果，在病原体靶基因的保守区设计一系列不同长度(18～45nt)特异性寡核苷酸探针。每条探针的3’端加入12个碱基T作为连接臂，并在3’末端T以氨基修饰，以便探针与芯片载体偶联。使用16种病原体核酸为模板的RT-PCR产物与备选探针分别杂交，考察各探针特异性，最终筛选确定16条特异性探针(如表2所示)。

四、基因芯片的制备

将装有探针(干粉)的离心管置于离心机上以12000转/min离心5min，加入去离子水溶解至浓度为100μM，点样时取10μl与芯片点样液(6×SSC，5％甘油，0.1％SDS)等体积混合使探针终浓度为50μM。用市售的基因芯片点样仪以接触式点样方式将探针点到空白的醛基化修饰玻片上(芯片外观示意图见附图1，阵列如表3与附图2所示)，其中质控探针为20T序列，空白对照为点样液。点制过程保持一定湿度，制备完毕后，芯片应至少在室温干燥放置24小时，使探针与载体充分交联。

五、病原体核酸的提取

使用Qiagen公司的QIAamp MinElute Virus Spin Kit或Mokogene公司的全血DNA/RNA快速提取试剂盒进行病原体核酸的提取，操作按说明书要求进行。

六、RT-PCR扩增

本发明采用三组不对称多重RT-PCR体系进行靶基因扩增，条件优化后采用Takara公司的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂，反应体系及扩增条件见表4。

七、芯片杂交

将扩增产物置于95℃变性5min，立即置于冰水浴中静置5min，基因芯片杂交前分别置于预洗液(0.2％SDS)与去离子水中清洗20s，晾干备用。将杂交液(8×SSC，10％甲酰胺，1.2％SDS，10×Denhardt’s)于45℃中加热完全溶解，三组扩增产物各取2μl与6μl杂交液混匀后加到芯片杂交反应区并展开铺匀，芯片置于杂交盒中于45℃杂交1小时。杂交反应结束后，取出芯片，将其依次在洗液A(1×SSC，0.2％SDS)、洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中洗涤20s，晾干后准备显色。

八、信号检测方法的建立

将标记液(Streptavidin-HRP)用稀释液(1×PBS+0.1％BSA)以1∶1000稀释，于每个杂交区加入15μl，芯片置于37℃孵育30min。取出后用PBST洗液(1×PBS+0.05％Tween-20)清洗20s，晾干。将化学发光HRP底物A液和B液(Millipore公司)等体积混匀，每个杂交反应区加入20μl并迅速展开铺匀，立即置于化学发光成像仪中扫描。记录结果，根据信号强度对结果进行判定。

实施例2：出血热相关病原体鉴别基因芯片特异性评价

特异性是诊断方法最重要的考核指标，本发明使用优化好的体系和条件，检测了16种出血热相关病原体核酸，芯片检测结果见附图3。结果表明，利用本发明可以将16种出血热相关病原体正确区分，具有良好的特异性。

实施例3：出血热相关病原体鉴别基因芯片灵敏度评价

使用灵敏度参考品对芯片的检测灵敏度进行评价，结果发现芯片对每种病原体均能够检测到至少10³copies/体系的RNA或DNA。以埃博拉病毒、疟原虫和发热伴血小板减少综合征病毒为例，选择10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10¹copies/μl的病原体核酸及阴性对照进行芯片检测，结果见附图4。结果表明，芯片对每种病原体均能够检测到至少10³copies/体系的病原体核酸，芯片的检测灵敏度为10²～10³copies/体系。

除上述实施例外，本发明还有其他实施方式，凡是采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均在本发明要求的保护范围内。

Claims

1.一种出血热相关病原体鉴别基因芯片，可用于检测16种出血热相关病原微生物：扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒、鸠宁病毒、马秋波病毒、裂谷热病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、疟原虫、汉坦病毒、发热伴血小板减少综合征病毒、登革病毒、黄热病毒、基孔肯雅病毒、A型流感病毒、B型流感病毒，其特征是包含检测出血热相关病原体的16条特异性寡核苷酸探针、1条质控探针、29条特异性引物和载体，各探针以点阵形式固定在载体上；

其中所述特异性寡核苷酸探针来自下述序列：

所述基因芯片包含一种同时扩增多种出血热相关病原体核酸的引物组合，包括29条特异性引物，分三管体系进行扩增；

其中所述的引物序列来自下述序列：

2.根据权利要求1所述的基因芯片，质控探针序列为20T，5’端生物素标记，3’端氨基修饰。

3.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于阵列中同时包括16种出血热相关病原微生物特异性检测探针，其探针阵列如下所示；

质控质控质控质控质控质控质控质控 ZEBO-P SEBO-P MAR-P LF-P JUN-P MAC-P RVF-P CCHFV-P ZEBO-P SEBO-P MAR-P LF-P JUN-P MAC-P RVF-P CCHFV-P ZEBO-P SEBO-P MAR-P LF-P JUN-P MAC-P RVF-P CCHFV-P MAL-P HV-MP SFTSV-P DEN-P YFV-P CHIKV-P FluA-P FluB-P MAL-P HV-MP SFTSV-P DEN-P YFV-P CHIKV-P FluA-P FluB-P MAL-P HV-MP SFTSV-P DEN-P YFV-P CHIKV-P FluA-P FluB-P 空白对照空白对照空白对照空白对照空白对照空白对照空白对照空白对照

。

4.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述的载体可为经醛基化或氨基化修饰的玻璃片、硅片、聚苯乙稀基片或尼龙基片。

5.根据权利要求3所述的基因芯片，其制备方法包括以下步骤：

步骤一：制备所述29条特异性引物，下游引物5’端标记生物素，分别放入3管RT-PCR体系中；

步骤二：制备所述16条特异性寡核苷酸探针，每条探针的3’端加入12个碱基T并在3’末端以氨基修饰；

步骤三：将步骤二中的各个寡核苷酸探针及质控探针用芯片点样液稀释至终浓度50μM，采用接触式点样方式将探针按照权利要求3所述的探针阵列点到载体上，点制过程保持一定湿度，所有探针的点样量均为3nl，点制完成后芯片应至少在室温干燥放置24小时，使探针与载体充分交联；

步骤四：如下制备RT-PCR体系：

RT-PCR体系配方

步骤五：制备芯片预洗液，其组分为0.2％SDS；制备杂交液，其组分为8×SSC，10％甲酰胺，1.2％SDS，10×Denhardt’s；制备洗液A，其组分为1×SSC，0.2％SDS；制备洗液B，其组分为0.2×SSC；制备洗液C，其组分为0.1×SSC；

步骤六：制备检测试剂，包括标记液、稀释液、PBST洗液、化学发光HRP底物A液和B液。

6.根据权利要求5所述的基因芯片，其特征在于，芯片点样液为：6×SSC，5％甘油，0.1％SDS；标记液为Streptavidin-HRP；稀释液为：1×PBS+0.1％BSA；PBST洗液为：1×PBS+0.05％Tween-20。