CN105209483B - 与肝细胞生长因子结合的设计锚蛋白重复蛋白 - Google Patents
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Abstract
本申请描述了对HGF具有结合特异性的新型设计锚蛋白重复蛋白，以及编码该HGF结合蛋白的核酸，包含该蛋白的药物组合物，以及该蛋白用于治疗疾病的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种对肝细胞生长因子(HGF)具有结合特异性的设计锚蛋白重复蛋白，以及编码该HGF结合蛋白的核酸，包含该蛋白的药物组合物，以及该蛋白用于治疗疾病的用途。
背景技术
MET原癌基因编码受体酪氨酸激酶(MET或c-Met的)，也称为肝细胞生长因子受体(HGFR；人HGFR具有UniProtKB/SWISS-PROT编号P08581)，其对于胚胎发育和伤口愈合必不可少。肝细胞生长因子(HGF，也称为分散因子；人类HGF具有UniProtKB/SWISS-PROT编号P14210)是c-Met的唯一已知配位体。该受体通常由上皮来源细胞表达，而HGF的表达仅限于间质来源的细胞。当受到HGF刺激时，c-Met诱发多种生物反应，它们共同引发被称为浸润性生长的程序。癌症中的异常c-Met激活与不良预后具有相关性，其中异常活性的c-Met触发肿瘤生长，肿瘤细胞存活，血管生成和转移。在许多类型的人恶性肿瘤中，c-Met失控，导致肾癌，肝癌，胃癌，乳房癌，脑癌，它同时也是抵抗其他靶向疗法的主要因素(Bottaro,D.P.,Rubin,J.S.,Faletto,D.L.,Chan,A.M.,Kmiecik,T.E.,Vande Woude,G.F.and Aaronson,S.A.,Science 251(4995),802-804,1991；Comoglio,P.M,Giordano,S.and Trusolino,L.,Nat.Rev.Drug Discov.7(6),504-516,2008)。
HGF被分泌为单个无活性单链前体多肽(sc-HGF，有时也称为前-HGF)，并由丝氨酸蛋白酶剪切为69kDa的α链和34kDa的β链。活性HGF是由所述α链和β链组成的二硫键连接的异二聚体。HGF与凝血因子具有高度同源性，因为其α链包含了纤溶酶原状的“环形结构域(Kringle)”结构基序，并且所述β链包含丝氨酸蛋白酶的同源结构域，但缺乏酶活性(Naldini,L.,Weidner,K.M.,Vigna,E.,Gaudino,G.,Bardelli,A.,Ponzetto,C.,Narsimhan,R.P.,Hartmann,G.,Zarnegar,R.,Michalopoulos,G.K.,et al.,EMBO J.10,2867-2878,1991)。
HGF通过与其受体结合，介导若干细胞反应，包括各种细胞类型的分散，细管和腔的形成，上皮间质转变，血管生成，肝再生，伤口愈合和胚胎发育。HGF/c-Met的信号传导通路也已知在各种疾病中，包括许多人实体瘤中，参与肿瘤发展，侵袭和转移。在人类癌症中，HGF对c-Met的旁分泌和自分泌的激活，这些分子在肿瘤中的表达，以及HGF流通浓度升高的循环，均与预后不良相关联，并增加肿瘤转移的风险(Comoglio et al.,2008,loc.cit.)。
由于HGF在癌症和其他疾病的进程中的活跃作用，阻断HGF活性的药剂可以有利于消除其影响。各种抗HGF(aHGF)的单克隆抗体(mAb)正在临床开发中，包括AMG102(即rilotumumab，一种来自安进(Amgen)公司的人源化抗人HGF IgG2)，来自先灵/乐骋(Schering/Aveo)的AV 299，和来自千年(Millennium)公司的TAK-701。
除抗体外，还有可用于特异性结合靶分子，由此充当拮抗剂的新型结合蛋白或结合域(e.g.Binz,H.K.,Amstutz,P.and Plückthun,A.,Nat.Biotechnol.23,1257-1268,2005)。此类不具有Fc的新型结合蛋白或结合域是基于设计重复蛋白或设计重复域(WO2002/020565；Binz,H.K.,Amstutz,P.,Kohl,A.,Stumpp,M.T.,Briand,C.,Forrer,P.,Grütter,M.G.,and Plückthun,A.,Nat.Biotechnol.22,575-582,2004；Stumpp,M.T.,Binz,H.K and Amstutz,P.,Drug Discov.Today 13,695-701,2008)。WO 2002/020565描述了如何构建重复蛋白的大型文库及其常见应用。然而，WO 2002/020565既没有公开具有HGF结合特异性的重复域的筛选，也没有公开特异性结合HGF的重复域的具体重复模块或重复序列基序。此外，WO 2002/020565没有暗示具有HGF结合特异性的重复域可以用来调节HGF介导的信号传导通路，从而成功地治疗疾病。这些设计重复域利用重复蛋白的模块化性质，并且可以具有N端和C端加帽模块，以防止设计重复域通过屏蔽结构域的疏水核心而聚集(Forrer,P.,Stumpp,M.T.,Binz,H.K.and Plückthun,A.,FEBS letters 539,2-6,2003)。
本发明解决的技术问题在于，鉴定具有HGF结合特异性的新型结合蛋白，例如锚蛋白重复蛋白或结构域，用于调节HGF介导的信号传导通路，以改进对某些癌症，血管疾病，血管发生相关疾病和其他病理学病症的治疗。本发明通过提供权利要求中所表述的实施方式来解决该技术问题。
发明内容
本发明涉及一种重组结合蛋白，包括至少一个锚蛋白重复域，其中所述锚蛋白重复域与PBS(磷酸盐缓冲液)中的HGF结合的Kd低于10-7M。
更具体而言，本发明涉及一种重组结合蛋白，其包括至少一个锚蛋白重复域，所述锚蛋白重复域与选自SEQ ID NOs:33至61的锚蛋白重复域竞争与HGF的结合。
本发明还涉及一种重组结合蛋白，其包括至少一个锚蛋白重复域，所述锚蛋白重复域对HGF具有结合特异性，且包括锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块具有选自SEQ IDNO:12至25的氨基酸序列以及如下序列：在该序列中，SEQ ID NO:12至25中的最多9个氨基酸被任意氨基酸替代。
特别地，本发明涉及一种重组结合蛋白，其包括至少一个锚蛋白重复域，所述锚蛋白重复域包含至少一个与选自SEQ ID NOs:33至61的任一锚蛋白重复域具有至少90％氨基酸序列一致性的氨基酸序列，其中所述锚蛋白重复域的位置1上的G和/或位置2上的S可选缺失；且所述锚蛋白重复域的倒数第二个位置上的L和/或最后一个位置上的N可选地替代为A。
特别地，本发明涉及一种HGF结合重组蛋白，其包含序列SEQ ID NO:1至25和33至62中任一种肽。
本发明还涉及编码本发明所述的结合蛋白的核酸，且包含一种或多种上述结合蛋白或核酸分子的药物组合物。
本发明还涉及一种使用本发明的结合蛋白治疗病理症状的方法。
附图说明
图1.选定DARPin的表面等离子体共振分析。
DARPin结合HGF的表面等离子体共振(SPR)分析(以DARPin#51为例)。各种浓度(1.6，3.1，6.3，12.5和25nM)的DARPin被添加到固定有人HGF的流动池中120秒，接着用缓冲液流洗。所得到的迹线在全局拟合后得到DARPin#51与人类HGF的相互作用的Kd值为51PM。RU，共振单位；s，时间(秒)。请参阅下面对DARPin#51的定义。
RU,Resonance Units；s,time in seconds；D1,DARPin#51；D2,DARPin#57；D3,DARPin#33.See below for the definition of DARPin#51,DARPin#57and DARPin#43.
图2.竞争表面等离子体共振分析。
对DARPin结合人HGF的SPR分析(以DARPin#51，DARPin#57和DARPin#43为例)。取100nM的DARPin#51(即D1)添加到固定有人HGF的流动池中120秒，接着注入第二种DARPin100nm(DARPin#57或DARPin#33；即分别为D2或D3)60秒。因此，D1和D3竞争结合HGF而D1和D2不竞争结合HGF。
RU，共振单位；s，时间(秒)；D1，DARPin#51；D2，DARPin#57；D3，DARPin#33。请参阅下面对DARPin#51，DARPin#57和DARPin#43的定义。
图3.抑制HGF刺激的c-Met磷酸化
如图所示为，各种浓度的具有对人HGF(以DARPin#42和#48为例)特异性的DARPin，在A549细胞中对HGF刺激的c-Met磷酸化的抑制作用，以及对应的拟合抑制曲线(以DARPin#42和#48为例)。测得DARPin#42和#48的IC50值分别为0.32和0.1nM。
OD，450-620nm下的光密度；C，DARPin浓度(nM)；D1，DARPin#48；D2，DARPin#42；MA，最大激活；MI，最小激活。X轴所示为对数标度。请参阅下面对DARPin#52和DARPin#48的定义。
图4.对U87细胞增殖的抑制。
如图所示为各种浓度的对HGF具有特异性抑制的DARPins对U87恶性胶质瘤细胞增殖的抑制和对应的拟合抑制曲线(以DARPin#51和#43为例)。测得的DARPin#51和#43的IC50值分别为72和116nM。
OD，450-620nm下的光密度；C，DARPin浓度(nM)；D1 DARPin#51；D2，DARPin#43。X轴所示为在对数标度。请参阅下面对DARPin#51和DARPin#43的定义。
图5.c-Met竞争实验。
如图所示为一个不同的单一实验中，各种浓度的人HGF特异性DARPin对HGF与c-Met结合的抑制和相应的拟合抑制曲线。DARPin#43和#51的IC50计算值分别为约1.36和0.62nM。OD，450-620nm下的光密度；C，DARPin浓度(nM)；D1，DARPin#51；D2，DARPin#43。X轴所示为对数标度。请参阅下面对DARPin#51和43的定义。
图6.抗HGF DARPin vs.载体在U87肿瘤异种移植模型中的效力。
将U87-MG肿瘤细胞皮下注射到裸鼠中。长有肿瘤动的物随机分为4组，并用不同浓度的聚乙二醇(PEG)化DARPin处理(每周静脉注射三次，动物总共给药七次)。PEG化DARPin的生成如实施例6所述。
T，肿瘤体积(mm3)；d，时间(天)；V，载体(即PBS)；D 1，PEG化的DARPin#62，每次注射的剂量为0.11mg/kg；D2，PEG化DARPin#62每次注射的剂量为1.1mg/kg；D3，PEG化DARPin#62每次注射的剂量为11mg/kg。
图7.SEQ ID NOs：12至28的多序列比对。SEQ ID NOS：12至28根据残基位置对齐进行多重序列比对。所述锚蛋白重复残基位置编号表示在顶部。残基位置2，5，7-13和16-33对应于通常含有骨架残基的位置。残基位置1，3，4，6，14和15对应于其中可能包含目标相互作用残基的位置。
具体实施方式
本发明所述的重组结合蛋白或结构域具有哺乳类HGF特异性。优选地，本发明所述重组结合蛋白对小鼠、大鼠、犬、兔、猴或人源的HGF具有特异性。更优选地，本发明所述重组结合蛋白对人源的HGF具有特异性。
术语“蛋白”指的是多肽，其中所述多肽至少部分具有确定的三维结构，或能够通过在其多肽链之内和/或之间形成二级，三级或四级结构来取得确定的三维结构。如果一个蛋白包含两种或更多种多肽，其个体多肽链可以非共价或共价连接，例如两个多肽之间形成二硫键。蛋白的部分，若能够单独具有，或能够通过形成二级或三级结构取得，确定的三维结构，则将其称为“蛋白结构域”。所述蛋白或蛋白结构域是本领域技术人员所熟知的。
如在重组蛋白、重组蛋白结构域、重组结合蛋白等中所用的术语“重组”，指的是，所述多肽通过使用相关领域技术人员所熟知的重组DNA技术产生。例如，编码多肽的重组DNA分子(例如，通过基因合成产生)可以被克隆到细菌表达质粒(如pQE30，Qiagen)，酵母表达质粒或哺乳动物表达质粒中。例如，当所述构建重组细菌表达质粒插入到合适的细菌(如大肠杆菌)中时，所述细菌可产生由该重组DNA编码的多肽。相应产生的多肽被称为重组多肽。
在本发明的上下文中，术语“多肽”涉及一种由一条或多条由多个(即两个或更多个)通过肽键连接的氨基酸组成的链组成。优选地，多肽由通过肽键连接的八个以上氨基酸组成。
术语“多肽标记”指的是连接到多肽/蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列用于所述多肽/蛋白的纯化、检测或靶定，或其中所述氨基酸序列增强所述多肽/蛋白的物理化学行为，或其中所述氨基酸序列具有效应子功能。结合蛋白的各多肽标记、部分和/或结构域可直接或通过多肽接头彼此连接。这些多肽标记都是本领域熟知的，并且完全是本领域技术人员可获得的。多肽标记的例子包括小多肽序列，例如，组氨酸(His)(例如，所述SEQID NO：9的His标记)，原癌基因(myc)和FLAG，或链球菌(Strep)标记或部分，如酶(例如内切酶样碱性磷酸酶)，其允许对所述多肽/蛋白或部分进行检测，可用于靶向(如免疫球蛋白或其片段)和/或作为效应分子。
术语“多肽接头”是指一种氨基酸序列，其能够连接，例如，两个蛋白结构域，多肽标记和蛋白结构域，蛋白结构域和非多肽部分(如聚乙二醇)或两个序列标记。所述附加域、标记、非多肽部分和接头是相关领域技术人员已知的。在专利申请WO 2002/020565的说明书中提供了示例列表。此类接头的具体例子包括可变长度的甘氨酸-丝氨酸接头及脯氨酸-苏氨酸-接头；优选地，所述接头的长度在2至24个氨基酸之间；更优选地，所述接头的长度在2至16个氨基酸之间。甘氨酸-丝氨酸接头的例子如SEQ ID NO：10所示，脯氨酸-苏氨酸-接头的例子如SEQ ID NO：11所示。优选地，SEQ ID NO：11所示的脯氨酸-苏氨酸-接头之前和/或之后连接有GS。
术语“聚合物部分”指的是蛋白聚合物部分或非蛋白聚合物部分。“蛋白聚合物部分”优选是不形成稳定三级结构的多肽。蛋白聚合物部分的例子包括
(Amunix的注册商标；WO 2007/10351)多肽，或如WO 2008/155134所述的包含脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸残基的多肽。所述蛋白聚合物部分可以过使用标准DNA克隆技术产生基因融合多肽，随后通过标准的表达和纯化，从而共价连接于例如本发明的结合域。“非蛋白聚合物部分”是不由多肽构建的聚合物部分。非蛋白聚合物部分的例子包括羟乙基淀粉(HES)，聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇，或聚氧化烯。术语“聚乙二醇化”(PEG化)是指PEG部分共价连接至，例如，本发明的多肽。本发明的聚合物部分的分子量可以广泛地变化。优选地，所述聚合物部分由多肽接头连接至结合域。
在一个具体实施例中，PEG部分或任何其它非蛋白聚合物可以，例如，通过马来酰亚胺接头连接到半胱氨酸硫醇，其中该半胱氨酸经由肽接头与本文所述的结合域的N端或C端结合。
术语“结合蛋白”是指包含一个或多个结合域、一种或多种生物活性化合物和一种或多种聚合物部分的蛋白，下文将进一步解释。优选地，所述结合蛋白包含最多四个结合域。更优选地，所述结合蛋白包含最多两个结合域。最优选地，所述结合蛋白只包含一个结合域。此外，任何所述结合蛋白均可以包括不是结合域的附加蛋白结构域、多聚化结构部分、多肽标记、多肽接头和/或一个或多个Cys残基。多聚化部分的示例包括配对提供功能性免疫球蛋白Fc结构域的免疫球蛋白重链恒定区，以及亮氨酸拉链或多肽，其包括在两个所述多肽之间形成分子间二硫键的游离硫醇。Cys残基可用于将其它部分连接到多肽上，例如，通过使用本领域技术人员所熟知的马来酰亚胺化学。优选地，所述结合蛋白是重组结合蛋白。同样优选地，结合蛋白的结合域具有不同的靶向特异性。
术语“生物活性化合物”指的是，当用于患有所述疾病的哺乳动物时，能够进行疾病调节的化合物。生物活性化合物可以具有拮抗性质或激动性质，并且可以是蛋白质生物活性化合物或非蛋白质生物活性化合物。所述蛋白的生物活性化合物可以，例如，通过使用标准DNA克隆技术产生基因融合多肽，随后通过标准的表达和纯化，从而共价连接于例如本发明的结合域。可以通过化学方法，例如通过马来酰亚胺接头连接到半胱氨酸硫醇，其中该半胱氨酸经由肽接头与本文所述的结合域的N端或C端结合，将所述非蛋白质生物活性化合物共价连接于例如本发明的结合域，如本文所述。蛋白质生物活性化合物的示例包括，具有不同靶向特异性(例如通过结合来中和生长因子)的结构域，细胞因子(如白介素)，生长因子(如生长激素)，抗体及其片段，激素(例如，GLP-1)，毒素(如绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素A)和任何可能的蛋白质药物。非蛋白的生物活性化合物的示例是，毒素(例如DM1从免疫原)，靶向GPCR的小分子，抗生素及任何可能的非蛋白质药物。
术语“结合域”是指作为表现出与蛋白骨架相同的“折叠”(三维结构)且具有定义如下的预定性质的蛋白结构域。所述结合域可以通过推导获得，或最常见的，通过本领域已知的组合蛋白工程技术和技能获得(Binz et al.,2005,loc.cit.)。例如，可以通过如下方法来获得具有预定性质的结合域，包括以下步骤：(a)提供如下所述第表现出与蛋白骨架相同的折叠的蛋白域的多样性集合；以及(b)从所述多样性集合中筛选和/或选择，以获得至少一种具有所述预定性质的蛋白结构域。可以根据所使用的筛选和/或选择系统，通过几种方法提供蛋白结构域的多样性集合，并且可以包括利用本领域技术人员公知的方法，例如噬菌体展示或核糖体展示方法。优选地，所述结合域是重组结合域。
术语“蛋白骨架”是指具有高度耐受氨基酸插入、替代或缺失的暴露表面区域的蛋白。可以用来产生本发明的结合域的蛋白骨架例子包括抗体或其片段，如单链Fv或Fab片段，来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A，来自大菜粉蝶(Pierisbrassicae)的胆汁三烯结合蛋白或其它脂质运载蛋白，锚蛋白重复蛋白蛋白或其它重复蛋白，以及人纤连蛋白。蛋白骨架是本领域技术人员已知的(Binz et al.,2005,loc.cit.；Binz et al.,2004,loc.cit.)。
术语“靶(Target)”指的是个体分子，例如核酸分子、多肽或蛋白、碳水化合物，或任何其它天然分子，包括所述个体分子的任意部分，或两个或更多此类分子的复合物。所述靶可以是全细胞或组织样品，或它可以是任何非天然分子或部分。优选地，靶是天然或非天然多肽或含有化学修饰的多肽，例如通过天然或非天然的磷酸化、乙酰化或甲基化修饰。在本发明的具体应用中，所述靶是HGF。
术语“预定性质”指的是一种性质，例如结合靶、阻断靶、活化靶介导的反应、酶活性，和相关的其他特性。根据期望性质类型，普通技术人员将能够确定筛选和/或选择具有期望性质的结合域的形式和必要的步骤。优选地，所述预定性质为与靶结合。
下文中重复蛋白的定义基于专利申请WO 2002/020565中的定义。专利申请WO2002/020565中还含有对重复蛋白特征、技术和应用程序的一般描述。
术语“重复蛋白”是指包含一个或多个重复域的蛋白。优选地，每个所述重复蛋白包含最多四个重复域。更优选地，每个所述重复蛋白包含最多两个重复域。最优选的是，每个重复蛋白的仅包括一个重复域。此外，所述重复蛋白可以包含另外的非重复蛋白结构域、多肽标记和/或多肽接头。
术语“重复域”是指包含两个或更多个连续的重复单元(模块)为结构单元的蛋白结构域，其中，所述结构单元具有相同的折叠，并紧密堆叠以构成具有共同疏水核心的超螺旋结构。优选地，重复域还包含N端和/或C端加帽单元(或模块)。更优选地，所述N端和/或C端加帽单元(或模块)为加帽重复序列。
术语“设计重复蛋白”和“设计重复域”指的是分别指根据如专利申请WO 2002/020565中所述的发明方法所得的重复蛋白或重复域。设计重复蛋白和设计重复域是合成蛋白，并非天然蛋白。它们分别是通过相应设计的核酸表达得到的人造蛋白或结构域。优选地，该表达在真核或原核细胞中进行，如细菌细胞，或通过使用无细胞体外表达系统来完成。因此，设计锚蛋白重复蛋白(即DARPin)对应于本发明中的包括至少一个锚蛋白重复域的重组结合蛋白。
术语“结构单元”是指多肽的局部有序部分，由沿多肽链彼此靠近的两个或更多二级结构片段之间的三维相互作用形成。所述结构单元呈现结构基序。术语“结构基序”指的是存在于至少一个结构单元中的二级结构元件的三维结构。结构基序是本领域技术人员所公知的。结构单元不能单独获得确定的三维结构；然而，它们的连续结构，例如在重复域中作为重复模块，可使得超螺旋结构中相邻单元相互稳定。
术语“重复单元”是指包含一个或多个天然重复蛋白的重复序列基序的氨基酸序列，其中所述“重复单元”存在多个拷贝，且对限定所述蛋白的折叠的所有所述基序具有共同的确定折叠拓扑形态。所述重复单元对应于重复蛋白的“重复结构单元(重复序列)”如Forrer et al.,2003,loc.cit.所述，或者对应于重复蛋白的“连续同源结构单元(重复序列)”，如Binz et al,2004,loc.cit.所述。所述重复单元包含骨架残基和相互作用残基。所述重复单元的示例包括犰狳重复单元，富含亮氨酸的重复单元，锚蛋白重复单元，三十四肽(tetratricopeptide)重复单元，HEAT重复单元，和富含亮氨酸的变体的重复单元。含有两个或更多所述重复单元的天然蛋白被称为“天然重复蛋白”。当相互比较时，重复蛋白的各重复单元的氨基酸序列可具有显著数量的突变，取代，添加和/或缺失，同时仍基本上保留重复单元的通用模式(或基序)。
因此，术语“锚蛋白重复单元”指的是重复单元，例如根据Forrer et al.,2003,loc.cit.所述的锚蛋白重复序列。锚蛋白重复序列是本领域技术人员所公知的。术语“锚蛋白重复序列结构域”指的是包含两个或更多个连续的锚蛋白重复单元(模块)作为结构单元，且优选地包含N端和/或C端加帽单元(或模块)的重复域。
术语“骨架残基”涉及对折叠拓扑形态有贡献的重复单元的氨基酸残基或重复模块的对应氨基酸残基，即其对所述重复单元(或模块)的折叠或与相邻单元(或模块)的相互作用有贡献。所述贡献可以是与重复单元(或模块)中其它残基的相互作用，或对多肽骨架构象如α螺旋或β折叠的影响，或形成线性多肽或环的氨基酸段。
术语“靶相互作用残基”指的是对与靶物质的相互作用有贡献的重复单元的氨基酸残基或重复模块的对应氨基酸残基。所述贡献可以是与靶物质的直接互动，或对其他直接相互作用残基的影响，如通过稳定重复单元(或模块)的多肽的构象，以允许或提高直接相互作用残基与所述靶的相互作用。所述骨架和靶相互作用残基可以通过物理化学方法(如X射线晶体学，NMR和/或CD光谱分析)获得的结构数据，或通过与结构生物学和/或生物信息学技术人员已知的相关结构信息进行比较，来分析识别。
优选地，用于推导重复序列基序的重复单元是同源重复单元，其中重复单元包括相同的结构基序，且其中所述重复单元中70％以上的骨架残基彼此同源。优选地，所述重复单元中超过80％的骨架残基是同源的。最优选地，所述重复单元中超过90％的骨架残基是同源的。用于确定多肽之间的同源百分比的计算机程序，如Fasta，Blast或Gap，是本领域技术人员所熟知的。更优选地，用于推导重复序列基序的重复单元是从确定的靶上选择的重复域的同源重复单元。
术语“重复序列基序”是指从一个或多个重复单元或重复模块推导出的氨基酸序列。优选地，所述重复单元或重复模块是由对同一种靶具有结合特异性的重复域。所述重复序列基序包括骨架残基位置和靶相互作用残基位置。所述骨架残基位置对应于重复单元(或模块)骨架残基的位置。通常情况下，锚蛋白重复序列的第2，5，7-13和16-33位置上包含骨架残基。锚蛋白重复序列的位置编号如图7所示。雷斯蒂，所述靶相互作用残基位置对应于重复单元(或模块)靶相互作用残基的位置。通常情况下，锚蛋白重复序列的位置1，3，4，6，14，和15上可能包含靶相互作用残基。重复序列基序包括固定位置和随机位置。术语“固定位置”指的是重复序列基序中设定为特定氨基酸的氨基酸位置。多数情况下，所述固定位置对应于具有特定靶特异性的骨架残基和/或靶相互作用残基的位置。术语“随机位置”是指重复序列基序中可允许两个或以上氨基酸存在的氨基酸位置，例如，通常可以允许二十种天然氨基酸中的任意一种，或者可以允许二十种天然氨基酸中的大多数氨基酸，如除半胱氨酸以外，或除甘氨酸、半胱氨酸和脯氨酸之外的氨基酸。大多数情况下，所述随机位置对应于靶相互作用残基的位置。但是，骨架残基的一些位置也可以被随机化。
术语“折叠拓扑”指的是所述重复单元或重复模块的三级结构。折叠拓扑由形成至少部分α螺旋或β折叠的氨基酸段，或形成线性多肽或环形结构的氨基酸段，或α螺旋，β折叠和/或线性多肽/环形结构的任意组合所决定。例如，锚蛋白重复序列单元/模块包括β转角，后面两个反平行α螺旋和连接下一个重复单元/模块的转角的环形结构。
术语“连续的”是指一种结构，其中所述重复单元或重复单元串联排列。在设计重复蛋白中，有至少2个，通常为约2至6个，特别是至少约6个，经常20个或更多的重复单元(或模块)。在多数情况下，重复域的重复单元(或模块)呈现高度序列一致性(对应位置的氨基酸残基相同)或高度序列相似性(氨基酸残基不同，但物理化学性质相似)，且部分氨基酸残基可能是高度保守的关键残基。但是，只要重复单元(或模块)还维持共同折叠拓扑形态，就有可能因为重复域的不同重复单元(或模块)之间的氨基酸插入和/或缺失，导致高度的序列变异性。
通过物理化学方法，如X射线晶体学、核磁共振或CD光谱法直接测定重复蛋白的折叠拓扑形态的方法，是本领域技术人员所公知的。用于识别和确定重复单元或重复序列基序或用于识别包括所述重复单元或基序的相关蛋白家族的方法，例如同源性检索(BLAST等)，是生物信息学领域中的成熟技术，并且是本领域技术人员所公知的。初始重复序列基序的精炼步骤可包括重复过程。
术语“重复模块”指的是设计重复域的重复氨基酸序列，其最初来源于天然重复蛋白的重复单元。重复域中所包含的每个重复模块来自天然重复蛋白家族或亚家族的一个或多个重复单元，例如，犰狳重复蛋白或锚蛋白重复蛋白家族。更优选地，重复域中所包含的每个重复模块包括根据对同一种靶(例如HGF)进行筛选所得的同源重复单元所推导出的重复序列基序，如实施例1中所述。
因此，术语“锚蛋白重复模块”指的是最初来源于天然锚蛋白重复蛋白重复单元的重复模块。锚蛋白重复蛋白是本领域技术人员所公知的。
“重复单元”可以包括存在于相应重复模块(“固定位置”)的所有拷贝中的氨基酸残基位置，以及具有不同或“随机化”的氨基酸残基(“随机位置”)位置。
术语“加帽模块”指的是融合到重复域N或C端重复模块的多肽，其中所述加帽模块与所述重复模块形成紧密三级相互作用(即三级结构的相互作用)，从而提供帽，所述帽从不与所述连续重复模块接触的一侧遮蔽所述重复模块的疏水核心，使其不与溶剂接触。所述N和/或C端加帽模块可以是，或可以源自，与重复单元相邻的天然重复蛋白中存在的加帽单元或其他结构单元。术语“加帽单元”是指一种天然折叠多肽，其中所述多肽限定了一种N端或C端融合到重复单元上的特定结构单元，其中，所述多肽形式与所述重复单元形成紧密三级相互作用，从而提供帽，所述帽从不与所述连续重复模块接触的一侧遮蔽所述重复单元的疏水核心，使其不与溶剂接触。优选地，加帽模块或加帽单位是加帽重复序列。术语“加帽重复”指的是具有与所述相邻重复单元(或模块)相似或相同的折叠和/或与所述相邻重复单元(或模块)具有序列相似性的加帽模块或加帽单元。加帽模块和加帽重复序列可参见WO 2002/020565，WO 2012/069655和Interlandi et al.,2008(loc.cit.)中的描述。N端锚蛋白加帽模块(即N端加帽重复序列)的示例包括SEQ ID NO：1至3，锚蛋白C端加帽模块的示例(即C端加帽重复序列)包括SEQ ID NO：4至8。
例如，SEQ ID NO：33的N端锚蛋白加帽模块由位置1至32的氨基酸编码，SEQ IDNO：33的C端加帽模块由位置132到159的氨基酸编码。
本发明的重组结合蛋白包含至少一个锚蛋白重复域，其中所述锚蛋白重复序列结构域具有对哺乳类HGF的结合特异性。
术语“具有靶结合特异性”，“特异性结合靶”或“靶向特异性”等，指的是PBS中的结合蛋白或结合域与靶结合的解离常数低于与无关蛋白(例如大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP))结合的解离常数。优选地，在PBS中与靶的解离常数比MBP的相应解离常数至少低10倍，更优选至少低102倍，更优选至少低103倍，或级最优选至少低104倍。
包括具有HGF结合特异性的锚蛋白重复序列结构域的重组结合蛋白示于实施例中。
具体地，本发明涉及如本文所定义的，包括至少一个锚蛋白重复域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复域特异性结合HGF(肝细胞生长因子)。
所述特异性结合是指本发明所述锚蛋白重复域对HGF的选择性亲和力。所有与HGF结合的锚蛋白重复域或其表位，被看作是与该物质特异性结合。因而，结合HGF的所有锚蛋白重复域都具有与后者的结合特异性。
优选地，所述锚蛋白重复域在PBS中结合HGF的解离常数(Kd)低于10-7M；更优选地，低于10-8M，10-9M或10-10M，或最优选为低于10-11M。
用于确定的蛋白-蛋白相互作用的解离常数的方法，如表面等离子体共振(SPR)为基础的技术(如SPR平衡或动力学分析)或等温滴定量热法(ITC)，是本领域技术人员所熟知的。在不同条件(例如，盐浓度，pH值)下测得的特定蛋白-蛋白相互作用的Kd值测量值可能变化。因此，Kd值的测量优选地使用蛋白标准溶液和标准缓冲液，例如PBS。
实施例2所示为抑制HGF与c-Met结合的所述锚蛋白重复序列的IC50值的可能确定方法，及包含在PBS中与HGF结合Kd值低于10-7M的锚蛋白重复域的重组结合蛋白。
优选的是，包括具有人HGF结合特异性的锚蛋白重复域的重组结合蛋白。
更优选的是包括含有70至300个氨基酸的锚蛋白重复域的重组结合蛋白，尤其是90-200个氨基酸。
本发明的结合域是锚蛋白重复域或设计锚蛋白重复域，优选地，如WO2002/020565所述。具有HGF结合特异性的锚蛋白重复序列结构域的示例如实施例所述。
在又一实施例中，本发明涉及包括至少一个哺乳动物HGF结合特异性锚蛋白重复域，其中所述锚蛋白重复域抑制HGF与c-Met在PBS中的结合，IC50值低于10-7M。优选地，所述锚蛋白重复域抑制HGF与c-Met在PBS中结合的IC50值低于10-8M，更优选地低于10-9M，10-10MM，或最优选低于10-11M。
半数最大抑制浓度(IC50)是对化合物(如本发明的结合域)抑制生物、生化或生物物理功能的有效性的一种测度。用于测定蛋白质-蛋白相互作用的抑制IC50的方法，如竞争ELISA，是本领域技术人员所熟知的。在不同条件(例如盐浓度，pH值)下测得的蛋白-蛋白相互作用特定抑制剂的IC50测量值可能变化。因此，IC50值的测量优选为使用蛋白标准溶液和标准缓冲液，例如PBS。
实施例5所示为所述锚蛋白重复序列抑制HGF与c-Met结合的IC50值的可能测定方法，可确定和重组结合蛋白，及包含在PBS中与HGF结合Kd值低于10-7M的锚蛋白重复域的重组结合蛋白。
在又一实施例中，本发明涉及包括至少一个HGF结合特异性锚蛋白重复域的重组结合蛋白，其抑制HGF刺激下A549细胞中的c-Met磷酸化(ATCC，产品号：CCL-185)。将A549细胞饥饿24小时，并在具有HGF特异性的锚蛋白重复域的滴定下以HGF刺激。本发明化合物抑制HGF刺激A549细胞中cMet磷酸化的能力是使用本领域技术人员公知的标准测量的。实施例4所示为所述锚蛋白重复域或蛋白抑制c-Met磷酸化的IC50测定方法，以及包含对HGF刺激A549细胞中的c-Met磷酸化的抑制IC50值低于10-7M的锚蛋白重复域的重组结合蛋白。
优选地，所述重复域对HGF刺激A549细胞中的c-Met磷酸化的抑制IC50值低于10- 8M，更优选低于10-9M，10-10M，或最优选低于10-11M。
在又一实施例中，本发明涉及包括至少一个具有HGF结合特异性的锚蛋白重复域的的重组结合蛋白，其抑制HGF刺激的U87细胞增殖(ATCC，产品号：HTB-14)的IC50值低于10-6M。优选地，所述重复域抑制HGF刺激的U87细胞增殖的IC50值低于10-7M，更优选低于10-8M，10-9M，10-10M，或最优选低于10-11M。
U87细胞可响应HGF而生长，因此可用于测量本发明化合物的功能抑制能力。在培养基中培养U87细胞，并接种于含有1％FBS的DMEM(实验培养基)中。细胞培养24小时后，加入HGF，并以抗HGF DARPin滴定。本发明的化合物抑制HGF的能力是通过用本领域技术人员公知的标准测量方法来测定U87细胞的增殖能力，从而加以评估。实施例4所示为所述锚蛋白重复蛋白抑制U87细胞增殖的IC50值的测定方法，以及包含抑制U87细胞增殖的IC50值低于10-6M的锚蛋白重复域的重组结合蛋白。
本发明涉及包含至少一个具有HGF结合特异性锚蛋白重复域的重组结合蛋白，其中，所述结合蛋白和/或锚蛋白重复域在PBS中的热诱导去折叠的中点变性温度(T m)高于40℃，并且在多至10g/L的浓度下，在37℃下进行1天的PBS培养后，形成小于5％(w/w)的不溶性聚集物，。
术语“PBS”是指含有137mM NaCl，10mM磷酸和2.7mM KCl且pH值7.4的磷酸盐缓冲水溶液。
优选地，所述重组结合蛋白和/或结合域在pH 7.4的PBS中热诱导去折叠的中点变性温度(Tm)高于45℃，更优选高于50℃，更优选高于55℃，和最优选高于60℃。本发明的结合蛋白或结合域在生理条件下具有确定的二级和三级结构。所述多肽的热诱导去折叠使其损失三级和二级结构，其可以随后进行，例如，圆二色性(CD)测量。结合蛋白或结合域经热诱导去折叠时的中点变性温度，对应着所述蛋白或结构域在生理缓冲液中经历温度从10℃缓慢增加至约100℃的热变性时的合作过渡中点温度。热诱导去折叠的中点变性温度测定是本领域技术人员所熟知的。结合蛋白或结合域在热诱导去折叠中的所述中点变性温度指示了所述多肽的热稳定性。
同样优选的是，重组结合蛋白和/或锚蛋白重复域在浓度多至20g/L，优选多至为40g/L，更优选为多至60g/L，更优选为多至80g/L，且最优选多至100g/L时，在37℃下的PBS中培养5天以上，优选超过10天，更优选超过20天，更优选超过40天，最优选超过100天后，形成的不溶性聚集物小于5％(w/w)。可利用在形成不溶性聚集物时大量增加的可见沉淀现象，凝胶过滤或动态光散射，检测不溶性聚集物的形成。不溶性聚集物可通过10000xg离心10分钟来从蛋白样本中除去。优选地，重组结合蛋白和/或锚蛋白重复域在上述培养条件下于37℃的PBS中培养后，形成的不溶性聚集物少于2％，更优选小于1％，0.5％，0.2％，0.1％，或最优选小于0.05％(w/w)。不溶性聚集物的比例可以通过从可溶性蛋白中分离不溶性聚集物，然后用标准量化方法测定其中可溶性和不溶性组分中的蛋白量来确定。
同样优选的是，在含100mM二硫苏糖醇(DTT)的PBS中37℃培养1或10小时后，仍未失去其原有三维结构的重组结合蛋白和/或锚蛋白重复域。
在一个具体实施例中，本发明涉及包括具有HGF结合特异性和上述指明或优选的中点变性温度及非聚集性质的锚蛋白重复域的重组结合蛋白。
在又一实施例中，本发明涉及包括至少一个哺乳动物HGF结合特异性锚蛋白重复域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复域与选自SEQ ID NOs:33至61的锚蛋白重复域(优选为SEQ ID NOs:33、37、41、42、43、48、51、52、57、58、59、60和61，更有选为37、42、43、51、52和60，更优选36、43、51和60，尤其是51和60)竞争结合哺乳动物HGF。
同样优选地，所述锚蛋白重复域与选自DARPins#33至61的结合蛋白竞争结合哺乳动物HGF。优选地，所述锚蛋白重复域与选自DARPins#24、45和50的结合蛋白竞争结合哺乳动物HGF。更优选地，所述锚蛋白重复序列结构域与具有结合蛋白DARPin的#24或50竞争结合哺乳动物HGF。
术语“竞争结合”表示本发明的两个不同的结合域虽然能单独地结合相同靶，但不能同时与该相同靶结合。因此，所述两个结合域竞争结合所述靶。优选地，所述两个竞争结合域结合到所述靶上的重叠或相同结合表位。用于确定两个结合域是否竞争结合靶的方法，如竞争酶联免疫吸附测定(ELISA)或竞争SPR测定(例如，使用来自BioRad公司的Proteon仪)，是本领域众所周知的。所述竞争SPR测量的一个例子如实施例2中所示。
在又一实施例中，本发明涉及包括至少一个哺乳动物HGF结合特异性锚蛋白重复域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复域包括与选自SEQ ID NOs:33至61的锚蛋白重复域具有至少70％氨基酸序列，其中所述锚蛋白重复域的位置1上的G和/或2上的S可选缺失，且所述锚蛋白重复域的倒数第二个位置上的L和/或倒数第一个位置上的N可选地由A替代。
优选地，本发明的重组结合蛋白中的所述锚蛋白重复域包括与选自下列的锚蛋白重复域具有至少70％氨基酸序列：SEQ ID NOs:33，37，41，42，43，48，51，52，57，58，59，60和61；更优选地，37，42，43，51，52和60；更优选地，37，43，51和60，特别是SEQ ID NO：51和60。
优选地，本发明的重组结合蛋白中的所述锚蛋白重复域包含与选自SEQ ID NOs:33至61的锚蛋白重复域的N端帽模块和C端帽模块之间的1个、2个或3个锚蛋白重复模块具有至少70％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
优选地，所述锚蛋白重复序列结构域或所述1个，2个或3个重复模块包含具有至少70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
优选地，SEQ ID NO：33至61的重复域中有多至30，29，28，27，26，25，24，23，22，21，20，19，18，17，16，15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1个氨基酸由另一种氨基酸取代。
优选地，当SEQ ID NO：1至8，SEQ ID NO：12至25的重复模块或SEQ ID NO：33至61的重复域中的加帽模块的氨基酸被替代时，这些氨基酸选自A，D，E，F，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W和Y；更优选选自A，D，E，H，I，K，L，Q，R，S，T，V和Y。同样优选地，氨基酸被同源氨基酸替代；即，氨基酸被具有相似生物物理性质侧链的氨基酸替代。例如，带负电荷的氨基酸D可以被带负电荷的氨基酸E替代，或疏水性氨基酸如L可被A、I或V取代。用另一个氨基酸替代多肽中的一个氨基酸的技术是本领域技术人员所熟知的。
在又一实施例中，本发明涉及的包含至少一个具有哺乳动物HGF结合特异性锚蛋白重复域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复序列结构域选自SEQ ID NO：33至61，其中所述锚蛋白重复域位置1上的G和/或位置2上的S可选缺失；且所述锚蛋白重复域的倒数第二个位置上的L和/或最后一个位置上的N可选地替代为A。
优选地，所述锚蛋白重复序列结构域选自SEQ ID NO：33，37，41，42，43，48，51，52，57，58，59，60和61；更优选地，37，42，43，51，52和60；更优选地，37，43，51和60，特别是SEQID NO：51和60。
在又一实施例中，本发明涉及包括至少一个哺乳动物HGF结合特异性锚蛋白重复域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复域包含具有选自SEQ ID NO：12至25中的氨基酸序列的锚蛋白重复模块；以及如下序列：在该序列中，SEQ ID NO:12至25中的最多9个氨基酸被任意氨基酸替代。
优选地，所述重组结合蛋白包含至少一个具有选自SEQ ID NO：12至25的氨基酸序列的锚蛋白重复模块；以及如下序列：在该序列中，SEQ ID NO:12至25中的最多9个氨基酸被任意氨基酸替代；其中，被替代的所述9个氨基酸中的6个，优选5个，更优选4个，更优选3个，更优选2个，最优选1个，位于所述SEQ ID NO:12至25的位置1、3、4、6、14和/或15处。
优选地，所述锚蛋白重复域的锚蛋白重复模块选自SEQ ID NO：12，15，19，21和24；更优选地，19和21。
更优选地，所述锚蛋白重复域的锚蛋白重复模块选自SEQ ID NO：12，13，14，15，18，19，20，21，和22；更优选地，12，15，18，19，20，21和24；更优选地，18，19，20和21。
优选地，SEQ ID NO：12至25的重复模块中至多8个氨基酸，更优选至多7个氨基酸，更优选至多6个氨基酸，更优选至多5个氨基酸，更优选至多4个氨基酸，更优选至多3个氨基酸，更优选至多2个氨基酸，且最优选1个氨基酸，被另一种氨基酸替代。
在又一实施例中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其中具有HGF结合特异性的锚蛋白重复域所包含的重复模块具有：
KDRYGDTPLHLAADIGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQ ID NO：18)锚蛋白重复序列，以及如下序列：在该序列中，SEQ ID NO：18中的最多9个氨基酸被任意氨基酸取代，其中
位置1的K由Q，H，N，I，T，Y，V，F，D，R，L或S可选替代；优选由Q，H，N，I，T，Y，V或F可选替代；还优选由Q，H，I，T，Y，V可选替代：最优选由Q或H可选替代；
位置3的R由A，T，K，H，N，Y，F，S或D可选替代；最优选由A，T，K，H或N可选替代；最优选由A可选替代；
位置4的Y被F，W，R，L，S或T可选替代；优选被F或W可选替代；
位置6的D被L，A，N，E，S或T可选替代；最优选被L或A可选替代；
位置14的D被S，N，M，T，F可选替代；优选被S或N可选替代；
位置15的I被Y，A，N，T，R，V，K，D，L，S可选替代；最优选被Y，A，N，T，R或V可选替代；最优选被Y或A可选替代；和
位置19的E被K可选替代。
在又一实施例中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其中具有HGF结合特异性的锚蛋白重复域所包含的重复模块具有：
KDRYGDTPLHLAADIGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQ ID NO：18)锚蛋白重复序列，以及如下序列：在该序列中，SEQ ID NO：18中的最多9个氨基酸被任意氨基酸，其中
位置1的K由Q，H，I，V可选替代；
位置3的R由A，T或N；优选是A可选替代；
位置4的Y被F或W可选替代；
位置6的D被N可选替代；
位置14的D被S可选替代；
位置15的I被Y或A可选替代；和
位置19的E被K可选替代。
在又一实施例中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其中具有HGF结合特异性的锚蛋白重复域所包含的重复模块具有：
EDYFGNTPLHLAASYGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQ ID NO:19)锚蛋白重复序列，以及如下序列：在该序列中，SEQ ID NO：19中的最多9个氨基酸被任意氨基酸取代，其中
位置1的E由D，H，N，F，A，L，Q可选替代；优选为D，H，N可选替代；最优选为D或H可选替代；
位置3的Y由W，S，H，V，F，A或D可选替代；优选为W，S，H，V，A或F可选替代；最优选为W或S可选替代；
位置4的F被Y，A或W可选替代；最优选由Y或A可选替代；
位置6的N被D，H，I或M可选替代；最优选由D或H可选替代；最优选由D可选替代；
位置14的S被N或H可选替代；和
位置15的Y由M，W，L，T，V，S，A，I或N可选替代；最优选由M，W，L，T，A或V可选替代；还优选由M，A或W可选替代；最优选由A可选替代。
在又一实施例中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其中具有HGF结合特异性的锚蛋白重复域所包含的重复模块具有：
EDYFGNTPLHLAASYGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQ ID NO:19)锚蛋白重复序列，以及如下序列：在该序列中，SEQ ID NO：19中的最多9个氨基酸被任意氨基酸替代，其中
位置1的E由D，F，A或L可选替代；最优选被D或A可选替代；
位置3的Y由W，S或V可选替代；
位置4的F被Y可选替代；
位置6的N被D可选替代；
位置15的Y被M，L，S，或A可选替代；最优选被M，A或L可选替代；最优选被A或L可选替代。
优选的是一种重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复域包括所述SEQ ID NO：18锚蛋白重复模块和所述SEQ ID NO：19锚蛋白重复模块。优选地，所述锚蛋白重复域中，所述SEQID NO：19锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ ID NO：18锚蛋白重复模块之后。例如，DARPin的#51的锚蛋白重复域中，所述SEQ ID NO：19锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ ID NO：18锚蛋白重复模块之后。
在又一实施例中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其中具有HGF结合特异性的锚蛋白重复域所包含的重复模块具有：
KDDYGNTPLHLAANTGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQ ID NO:20)锚蛋白重复序列，以及如下序列：在该序列中，SEQ ID NO：20中的最多9个氨基酸被任意氨基酸替代，其中
位置1的K由M，I，D，L，Q，V，R，T或H可选替代；最优选被M，I或D可选替代；最优选由I或D可选替代；
位置3的R由H，Y，T，W或F可选替代；优选被H或Y可选替代；
位置4的Y被S，N，A，G，F或R可选替代；最优选被S，N，A或G可选替代；最优选被S可选替代；
位置6的N被S，T，L或Y可选替代；最优选被S可选替代；
位置14的D被L替代，F，M或I可选替代；最优选被L或I可选替代；
位置15的T被S，W，V，E，F或A可选替代；最优选被S可选替代；
位置17的H被R可选替代；和
位置19的E被K可选替代。
在又一实施例中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其中具有HGF结合特异性的锚蛋白重复域所包含的重复模块具有：
KDDYGNTPLHLAANTGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQ ID NO:20)锚蛋白重复序列，以及如下序列：在该序列中，SEQ ID NO：20中的最多9个氨基酸被任意氨基酸替代，其中
位置1的K由M，D，L，Q或V可选替代；
位置3的R由Y或T可选替代；
位置4的Y被A或N可选替代；
位置15的T被S可选替代；
位置17的H被R可选替代；和
位置19的E被K可选替代。
同样优选的是一种重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复域包括所述SEQ ID NO：19锚蛋白重复模块和所述SEQ ID NO：20锚蛋白重复模块。优选地，所述锚蛋白重复域中，所述SEQ ID NO：20锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ ID NO：19锚蛋白重复模块之后。例如，DARPin的#51的锚蛋白重复域中，所述SEQ ID NO：20锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ IDNO：19锚蛋白重复模块之后。
同样优选的是一种重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复域包括所述SEQ ID NO：18锚蛋白重复模块，所述SEQ ID NO：19锚蛋白重复模块和所述SEQ ID NO：20锚蛋白重复模块。优选地，所述锚蛋白重复域中，所述SEQ ID NO：19锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ IDNO：18锚蛋白重复模块之后，且所述SEQ ID NO：20锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ ID NO：19锚蛋白重复模块之后。例如，DARPin的#51的锚蛋白重复域中，所述SEQ ID NO：19锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ ID NO：18锚蛋白重复模块之后，而所述SEQ ID NO：20锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ ID NO：19锚蛋白重复模块之后。
在又一实施例中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其中具有HGF结合特异性的锚蛋白重复域所包含的重复模块具有：
HDYSGFTPLHLAAYYGHLEIVEVLLKHGADVNA(SEQ ID NO:12)锚蛋白重复序列，以及如下序列：在该序列中，SEQ ID NO：12中的最多9个氨基酸被任意氨基酸替代，其中
位置1的H由T，S，N，Q，I，K，F，Y或V可选替代；最优选被T，S，N，Q或I可选替代；最优选被T或S可选替代；
位置3的Y由R，N，D，M，W，E，A，Q或L可选替代；最优选由R，N或D可选替代；最优选由R或N可选替代；
位置4的S被N，T或W可选替代；最优选被N或T可选替代；
位置6的F被I可选替代；
位置14的Y被F可选替代；
位置15的Y被W或H可选替代；和
位置20的I被V或L可选替代。
在又一实施例中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其中具有HGF结合特异性的锚蛋白重复域所包含的重复模块具有：
FDDWGHTPLHLAARYGHLEIVEVLLKYGADVNA(SEQ ID NO:13)C端加帽模块，以及如下序列：在该序列中，SEQ ID NO：13中的最多9个氨基酸被任意氨基酸替代，其中
位置1的F由T，H，L，D，Y，K或E可选替代；优选被T，H，L或D可选替代；最优选被T或H可选替代；
位置3的D由R，K，A，N，Y，S，L，T或F可选替代；优选由R，K，A或N可选替代；最优选由A，R或K可选替代；
位置4的W被F，Y或R可选替代；最优选被F可选替代；
位置6的H被L替代，I，M，N或K可选替代；最优选被L或I可选替代；
位置14的R被H，Y，S，F，A，N或I可选替代；优选被H，Y或S可选替代；最优选被H可选替代；和
位置15的Y被F，L，T，K或R可选替代；优选被F，L或T可选替代；最优选由F可选替代。
优选的是一种重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复域包括所述SEQ ID NO：12锚蛋白重复模块和所述SEQ ID NO：13锚蛋白重复模块。优选地，所述锚蛋白重复域中，所述SEQID NO：13锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ ID NO：12锚蛋白重复模块之后。例如，DARPin的#13的锚蛋白重复域中，所述SEQ ID NO：13锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ ID NO：12锚蛋白重复模块之后。
在又一实施例中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其中具有HGF结合特异性的锚蛋白重复域所包含的重复模块具有：
KYEDGLTPLHLAAFYGHLEIVEVLLRHGADVNA(SEQ ID NO:15)C端加帽模块，以及如下序列：在该序列中，SEQ ID NO：15中的最多9个氨基酸被任意氨基酸替代，其中
位置13的A由V可选替代；和
位置26的R由K可选替代。
在又一实施例中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其中具有HGF结合特异性的锚蛋白重复域所包含的重复模块具有：
TDAWGHTPLHLAAYLGHLEIVEVLLKYGADVNA(SEQ ID NO:16)C端加帽模块，以及如下序列：在该序列中，SEQ ID NO：16中的最多9个氨基酸被任意氨基酸替代，其中
位置8的P由T可选替代；
位置12的A由T可选替代；
位置14的Y由S，H或A可选替代；优选被S或H可选替代；
位置15的L由Y，N或S可选替代；最优选是由Y或N可选替代；和
位置33的A由T可选替代。
优选的是一种重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复域包括所述SEQ ID NO：15锚蛋白重复模块和所述SEQ ID NO：16锚蛋白重复模块。优选地，所述锚蛋白重复域中，所述SEQID NO：16锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ ID NO：15锚蛋白重复模块之后。例如，DARPin的#41的锚蛋白重复域中，所述SEQ ID NO：16锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ ID NO：15锚蛋白重复模块之后。
在又一实施例中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其中具有HGF结合特异性的锚蛋白重复域所包含的重复模块具有：
HDTWGLTPLHLAAFHGHQEIVEVLLKHGADVNA(SEQ ID NO:21)锚蛋白重复序列，以及如下序列：在该序列中，SEQ ID NO：21中的最多9个氨基酸被任意氨基酸替代。
在又一实施例中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其中具有HGF结合特异性的锚蛋白重复域所包含的重复模块具有：
QDFYGKTPLHLAALRGHLEIVEVLLKYGADVNA(SEQ ID NO:22)锚蛋白重复序列，以及如下序列：在该序列中，SEQ ID NO：22中的最多9个氨基酸被任意氨基酸替代。
优选的是一种重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复域包括所述SEQ ID NO：21锚蛋白重复模块和所述SEQ ID NO：22锚蛋白重复模块。优选地，所述锚蛋白重复域中，所述SEQID NO：22锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ ID NO：21锚蛋白重复模块之后。例如，DARPin的#60的锚蛋白重复域中，所述SEQ ID NO：22锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ ID NO：21锚蛋白重复模块之后。
在又一实施例中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其中具有HGF结合特异性的锚蛋白重复域所包含的重复模块具有：
HDYLGLTPLHLAASDGHLEIVEVLLKHGADVNA(SEQ ID NO:23)锚蛋白重复序列，以及如下序列：在该序列中，SEQ ID NO：23中的最多9个氨基酸被任意氨基酸替代，其中
位置1的H由N，L，K，R，F，Q或D可选替代；优选由N，L或K可选替代；最优选由N可选替代；
位置3的Y由F，Q，T，R，N，S或D可选替代；最优选被F，Q或T可选替代；最优选被F或Q可选替代；
位置4的L被V，T，Q，Y，D或F可选替代；优选被V或T可选替代；
位置6的L被D可选替代；
位置14的S被A，N或F可选替代；优选被A或N可选替代；和
位置15的D被I，T，S，R，A，Y或M可选替代；优选被I，T，S或R可选替代；最优选被I或T可选替代。
在又一实施例中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其中具有HGF结合特异性的锚蛋白重复域所包含的重复模块具有：
YDYNGLTPLHLAANNGHLEIVEVLLKYGADVNA(SEQ ID NO:24)锚蛋白重复序列，以及如下序列：在该序列中，SEQ ID NO：24中的最多9个氨基酸被任意氨基酸替代，其中
位置1的Y由S，I，T，Q，E，M，K，D或V可选替代；优选被S，I或T可选替代；最优选被S或I可选替代；
位置3的Y由A，F，V，M，W，T，R或Q可选替代；最优选由A，F，V或M可选替代；最优选由A或V可选替代；
位置4的N被Y，F，T或W可选替代；最优选被Y可选替代；
位置6的L被F，H，Y，N或W可选替代；优选被F，H，Y或N可选替代；最优选被F或H可选替代；
位置10的H被Y可选替代；
位置12的A被T或V可选替代；
位置14的N被S可选替代；
位置15的N被V，M或T可选替代；最优选被V可选替代；和
位置20的I被V或L可选替代。
在又一实施例中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其中具有HGF结合特异性的锚蛋白重复域所包含的重复模块具有：
FDVAGYTPLHLAAYFGHLEIVEVLLKYGADVNA(SEQ ID NO:25)锚蛋白重复序列，以及如下序列：在该序列中，SEQ ID NO：25中的最多9个氨基酸被任意氨基酸替代，其中
位置1的F由I，M，T，D，Y，Q，E，H，A或S可选替代；最优选由I，M，T，D，Y或Q可选替代；最优选被I，T，D或Y可选替代；最优选由I或Y可选替代；
位置3的V由I，H，S，A，D或W可选替代；最优选被I，H或S可选替代；最优选由I或S可选替代；
位置4的A被F，Y，V，M，N，L，T，H或I可选替代；优选被F，Y，V或M可选替代；最优选被F或Y可选替代；
位置6的Y被F，H，T，W，M，N，Q或S可选替代；优选被F，H，T或W可选替代；最优选被F或T可选替代；
位置14的Y被H，M，L，N，I，R，W或T可选替代；优选被H，L，N，I，R或T可选替代；最优选由H或L可选替代；和
位置15的F被Y，H，M，T，V，L，N或I可选替代；最优选被Y，H，T或V可选替代；最优选被T或V.
优选的是一种重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复域包括所述SEQ ID NO：23锚蛋白重复模块和所述SEQ ID NO：24锚蛋白重复模块。优选地，所述锚蛋白重复域中，所述SEQID NO：24锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ ID NO：23锚蛋白重复模块之后。例如，DARPin的#57的锚蛋白重复域中，所述SEQ ID NO：24锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ ID NO：23锚蛋白重复模块之后。
同样优选的是一种重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复域包括所述SEQ ID NO：24锚蛋白重复模块和所述SEQ ID NO：25锚蛋白重复模块。优选地，所述锚蛋白重复域中，所述SEQ ID NO：25锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ ID NO：24锚蛋白重复模块之后。例如，DARPin的#57的锚蛋白重复域中，所述SEQ ID NO：24锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ IDNO：23锚蛋白重复模块之后。
同样优选的是一种重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复域包括所述SEQ ID NO：23锚蛋白重复模块，所述SEQ ID NO：24锚蛋白重复模块和所述SEQ ID NO：25锚蛋白重复模块。优选地，所述锚蛋白重复域中，所述SEQ ID NO：24锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ IDNO：23锚蛋白重复模块之后，且所述SEQ ID NO：25锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ ID NO：24锚蛋白重复模块之后。例如，DARPin的#57的锚蛋白重复域中，所述SEQ ID NO：24锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ ID NO：23锚蛋白重复模块之后，而所述SEQ ID NO：24锚蛋白重复模块直接跟随在SEQ ID NO：24锚蛋白重复模块之后。
进一步优选地，一种N端或C端锚蛋白加帽模块，分别包括N端或C端锚蛋白加帽重复序列，其中所述加帽重复序列中的一个或更多氨基酸残基被与对应锚蛋白加帽单元或锚蛋白重复单元比对时的对应位置氨基酸残基替代。
氨基酸替代可以是20种常见天然氨基酸中的任一种，优选为选自A，D，E，F，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W和Y中的氨基酸；更优选为选自A，D，E，H，I，K，L，Q，R，S，T，V和Y。同样优选地，氨基酸替代是由同源氨基酸替代；即，一个氨基酸被替换为具有相似生物物理性质侧链的氨基酸。例如，带负电荷的氨基酸D可以被带负电荷的氨基酸E替代，或疏水性氨基酸如L可被A，I或V替换。用一个同源氨基酸替换令一个氨基酸是本领域技术人员所熟知的技术。
同样优选的是一种C端锚蛋白加帽模块，其在基于SEQ ID NO：28至48的上述C端加帽模块的位置27和28上包含氨基酸A。
同样优选的是一种C端加帽模块，其在基于SEQ ID NO：4至8的上述C端加帽模块的位置27和28上包含氨基酸A。
在SEQ ID NO：1至3的位置1上的氨基酸G和/或的位置2上的S，可以从N端锚蛋白加帽模块上移除，而不对性能造成任何明显影响。这两种氨基酸作为接头将锚蛋白重复域连接到其他氨基酸和蛋白。本发明还包括含有N端锚蛋白加帽模块的所述锚蛋白重复域，其中位置1上的氨基酸G和/或的位置2上的S被移除。应当理解，本申请所述的锚蛋白重复域中的氨基酸位置(例如“位置33”)被相应地调整，由此产生了一些移位，例如，如果一个氨基酸缺失，则“位置33”将成为“位置32”，或如果两个氨基酸缺失，则“位置33”将成为“位置31”。
本发明的锚蛋白重复域的锚蛋白加帽模块，可通过本领域技术人员公知的锚蛋白结合技术，例如氨基酸序列比对，诱导突变和基因合成，来替代为加帽模块。例如，SEQ IDNO：33的C端加帽重复序列可替换为SEQ ID NO：8的C端加帽重复序列，其中采用以下方法：(i)通过与SEQ ID NO：8的序列比对，确定SEQ ID NO：33的C端加帽重复序列(即序列位置132至159)，(ⅱ)将确定的SEQ ID NO：33C端加帽重复序列替换为SEQ ID NO:8的序列，(iii)生成编码重复域的基因，其中所述重复域编码用于替代的C端加帽模块，(ⅳ)在大肠杆菌的细胞质中表达该经修饰的重复域，及(v)通过标准方法纯化经修饰的重复域。作为又一个例子，SEQ ID NO：33的N端加帽重复序列可替换为SEQ ID NO：2的N端加帽重复序列，其中采用以下方法：(i)通过与SEQ ID NO：2的序列比对，确定SEQ ID NO：33的N端加帽重复序列(即序列位置1至32)，(ⅱ)将确定的SEQ ID NO：33N端加帽重复序列替换为SEQ ID NO:2的序列，(iii)生成编码重复域的基因，其中所述重复域编码用于替代的N端加帽模块，(ⅳ)在大肠杆菌的细胞质中表达该经修饰的重复域，及(v)通过标准方法纯化经修饰的重复域。
此外，可以通过基因合成方法，组装N端锚蛋白加帽模块(如SEQ ID NO：2的N端加帽重复序列)，随后是一个或多个重复模块(例如包含来自从SEQ ID NO：33的位置33到131的氨基酸残基的锚蛋白重复序列的三个锚蛋白重复模块)和C端加帽模块(如SEQ ID NO:8的C端加帽模块)，来构建本发明的锚蛋白重复域。可以在大肠杆菌中如本文所述地表达经遗传组装的重复域基因。
进一步优选的是缺失氨基酸C，M或N的氨基酸序列的重组结合蛋白，重复域，重复模块，N端加帽模块或C端加帽模块。
进一步优选的是缺失氨基酸D，E或N且其后为G的重组结合蛋白，重复域，重复模块，N端加帽模块或C端加帽模块。
进一步优选的是包含任何所述N端或C端加帽模块的重组结合蛋白或重复域。
在包括本发明所述的锚蛋白重复域的重组结合蛋白的又一个优选实施例中，所述重复域的N端加帽模块的一个或多个氨基酸残基替代为N端加帽单元比对对应位置上的氨基酸残基。优选地，最多30％氨基酸残基被替代，更优选地，最多20％，并且更优选地，最多10％氨基酸残基被替代。最优选地，所述N端加帽单元是一种天然N端加帽单元。
在包括本发明所述的锚蛋白重复域的重组结合蛋白的又一个优选实施例中，所述重复域的C端加帽模块的一个或多个氨基酸残基替代为C端加帽单元比对对应位置上的氨基酸残基。优选地，最多30％氨基酸残基被替代，更优选地，最多20％，并且更优选地，最多10％氨基酸残基被替代。最优选地，所述C端加帽单元是一种天然C端加帽单元。
在又一特定实施例中，多至30，29，28，27，26，25，24，23，22，21，20，19，18，17，16，15，14，13，13，12，11，10，9,8，7,6，5,4，3,2或1％的所述氨基酸残基被替代为不存在于重复单元，N端加帽单元或C端加帽单元相应位置上的氨基酸。
术语“共有序列”是指一种氨基酸序列，其中所述共有序列由多个重复单元的结构和/或序列的对齐比对而获得。使用两种或更多经结构和/或序列比对的重复单元，并允许比对中存在缺口，则能够确定各位置上最频繁出现的氨基酸残基。共有序列是包含最常在各位置上出现的氨基酸的序列。当单一位置上超常存在两个或以上氨基酸时，共有序列可以包括所述氨基酸的子集。所述两个或更多重复单元可从单一重复蛋白或两个或更多重复蛋白中包含的重复单元中获得。
共有序列和其测定方法是本领域技术人员所熟知的。
“共有氨基酸残基”是共有序列的特定位置上的氨基酸。如果所述两个或以上重复单元中两个或更多(例如三个，四个或五个)氨基酸残基具有相似的存在几率，则所述共有氨基酸可以是最常见的氨基酸之一或所述两个或更多氨基酸残基的组合。
进一步优选的是非天然的加帽模块，重复模块，结合蛋白或结合域。
术语“非天然”是指合成的或非天然，更具体地，该术语指由人工制得。术语“非天然结合蛋白”或“非天然结合域”是指所述结合蛋白或所述结合域是合成(即通过氨基酸化学合成得到)或重组得到的，而并非天然存在。“非天然结合蛋白”或“非天然结合域”是分别由相应的设计核酸的表达得到的人造蛋白或结构域。优选地，该表达在真核或细菌细胞，或者使用无细胞的体外表达系统进行。此外，该术语意味着所述结合蛋白或所述结合域的序列在序列数据库如GenBank，EMBL-银行或SWISS-PROT中不作为非人工序列条目存在。这些数据库和其他类似的序列数据库是本领域技术人员所熟知的。
在一个具体实施例中，本发明涉及包含特异性结合HGF的锚蛋白重复序列结构域且还包括特异性结合血管内皮细胞生长因子A(VEGF-A)的重组结合蛋白。本申请中提供了具有HGF特异性的锚蛋白重复域的示例，具有VEGF-A特异性的锚蛋白重复序列结构域的示例则描述于WO 2010/060748或WO2011/135067中。同样优选地，所述重组结合蛋白还包含一个或多个，优选为一个或两个，具有人血清白蛋白特异性的锚蛋白重复域。具有人血清白蛋白特异性的锚蛋白重复域的示例记载于WO 2012/069654中。通过本领域技术人员公知的技术方法，借由遗传手段，可以用多肽接头(例如SEQ ID NO:10或11)链接对血清白蛋白，VEGF-A或HGF具有特异性的任何所述重复域。
另一个优选的实施例中为一种重组结合蛋白，包含具有HGF结合特异性且含有一个，两个，三个或更多可参与HGF结合的内部重复模块的锚蛋白重复域。优选地，所述锚蛋白重复序列结构域包含N端加帽模块，二至四个内部重复模块的，和C端加帽模块。优选地，所述加帽模块为加帽重复序列。同样优选地，所述加帽模块可参与结合HGF。
进一步优选的是包括两个或更多个具有HGF结合特异性的所述锚蛋白重复域的重组结合蛋白。优选地，所述结合蛋白包含2或3个所述重复域。所述两个或更多个重复域具有相同或不同氨基酸序列。
另一个优选实施例为一种包括根据本发明所述锚蛋白重复域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复域的重复模块的一个或多个氨基酸残基替换为重复单元比对时的相应位置上的氨基酸残基。优选地，至多30％氨基酸残基被替代，更优选地，至多20％，并且更优选地，至多10％的氨基酸残基被替代。最优选地，所述重复单元是一种天然重复单元。
在又一具体实施例中，最多30％，更优选至多20％，更优选至多10％的氨基酸残基被替代为不存在于重复单元相应位置上的氨基酸。
在又一实施例中，任何本文所述重组HGF结合蛋白或结构域可以被共价结合到一个或多个其他部分，包括，例如，与其他靶结合以创建双特异性结合剂的部分，生物活性化合物，标记部分(如荧光标记(如荧光素)或放射性示踪剂)，便于蛋白纯化的部分(例如，小肽标记，如His-或Strep-标记)，为提高疗效提供效应器功能的部分(例如，用于提供抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用的抗体Fc部分，毒蛋白部分(例如铜绿假单胞菌外毒素A(ETA)或小分子毒性剂如美登素或DNA烷化剂)，或用于改进药物动力学的部分。药物动力学的改善可以根据感观治疗需要来评估。通常需要提高生物可用性和/或提高剂量给药之间的时间，这可能通过增加给药后血清中的可用蛋白维持时间来达成。在一些例子中，需要提高蛋白血清浓度的时间持续性(例如，降低给药后短时间内的浓度与下一次给药前短时间内的浓度之间的差异)。倾向于减缓蛋白的血液清除率的部分包括羟乙基淀粉(HES)，聚乙二醇(PEG)，糖(例如唾液酸)，耐受性良好的蛋白部分(例如Fc片段或血清白蛋白)，和对大量血清蛋白具有特异性和清河性的结合域或肽，例如抗体Fc片段或血清白蛋白。所述对血清蛋白具有亲和性的结合域的例子记载于WO 2012/069654中。本发明的重组结合蛋白可以附着到令哺乳类(例如小鼠，大鼠，或人)多肽清除速率降低到比未修饰多肽低三倍以上的部分上。
在又一实施例中，本发明涉及编码所述特定重组结合蛋白、特定锚蛋白重复域、特定锚蛋白重复模块和特定加帽模块的核酸分子。另外，还构思了包含所述核酸分子的载体。
此外，还构思了一种药物组合物，其包含一种或多种上述重组结合蛋白、尤其是包含编码特定结合蛋白的重复域或核酸分子，以及可选地包含药学上可接受的载体和/或稀释剂。所述药学上可接受的载体和/或稀释剂是本领域技术人员已知的，并在下面更详细地解释。甚至进一步，还构思了一种诊断组合物，其含有一种或多种上述重组结合蛋白，尤其是包含重复域的结合蛋白。
一种药物组合物包括如上所述的重组结合蛋白和药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，例如Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.[1980]中所述。本领域技术人员公知的合适的载体、赋形剂或稳定剂是盐水，林格氏溶液，葡萄糖溶液，Hank溶液，固定油，油酸乙酯，5％右旋糖盐水，增强等渗性和化学稳定性的物质，缓冲剂和防腐剂。其它合适的载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个人有害的抗体的任何载体，例如蛋白，多糖，聚乳酸，聚乙醇酸，聚合氨基酸和氨基酸共聚物。药物组合物还可以是组合制剂，其包含其他活性剂，例如抗癌药或抗血管生成剂。
要用于体内施用的制剂必须是净化的或无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。
该药物组合物可以由本领域技术人员知识范围内的任何合适方法来给药。
此外，上述任何药物组合物均构思为用于治疗疾病。
本发明进一步提供了治疗方法。该方法包括使用治疗有效剂量的本发明重组结合蛋白向有需要的患者给药。
此外，还构思了一种治疗哺乳动物包括人病理症状的方法，其包括包括使用治疗有效剂量的上述药物组合物向有需要的患者给药。
所述病理状况的示例包括动脉粥样硬化，再狭窄，肺动脉高压，炎性关节疾病，眼和视网膜疾病，以及纤维化疾病，包括肺纤维化，肝硬化和其他肝病，硬皮病，肾小球硬化和心脏纤维化。此外，抗HGF疗法对肿瘤病理状况例如固体瘤和血液瘤有用。例如，神经胶质瘤，肉瘤，成骨性肉瘤，多发性骨髓瘤，白血病，淋巴瘤和上皮癌症，包括骨转移。
本发明所述的重组结合蛋白或锚蛋白重复域可通过几种方法获得和/或改进，例如噬菌体表面展示(WO 1990/002809，WO 2007/006665)或细菌细胞表面展示(WO 1993/010214)，核糖体展示(WO 1998/048008)，质粒展示(WO 1993/008278)，或通过使用共价RNA重复蛋白杂交构建体(WO 2000/032823)，或细胞内表达和选择/筛选，例如通过蛋白互补法(WO 1998/341120)筛选。所述方法是本领域技术人员所熟知的。
用于本发明的重组结合蛋白或锚蛋白重复域的选择/筛选的锚蛋白重复蛋白文库，可以根据本领域技术人员已知的技术(WO 2002/020565,Binz,H.K.,et al.,J.Mol.Biol.,332,489-503,2003,和Binz et al.,2004,loc.cit)来获得。将所述文库用于筛选具有HGF特异性的锚蛋白重复域的用途如实施例1所示。此外，本发明的锚蛋白重复域可以用本发明所述锚蛋白重复模块和适当加帽模块或加帽重复序列(Forrer,P.,et al.,FEBS letters 539,2-6,2003)，使用标准重组DNA技术(例如WO 2002/020565，,Binz etal.,2003,loc.cit.和Binz et al.,2004,loc.cit)来组装。
本发明并不限于实施例中描述的特定实施例。可按下文所述概要使用和加工其它原料。
实施例
下面公开的所有初始原料和试剂均是本领域技术人员已知的，且可从市售获得，或可利用公知技术制备。
实验材料
化学药品购自Sigma-Aldrich公司(美国)。寡核苷酸购自Microsynth(瑞士)。除非另有说明，否则DNA聚合酶，限制性内切酶和缓冲液均购自New England Biolabs公司(美国)或Fermentas公司(立陶宛)。克隆和蛋白生产菌株是大肠杆菌XL1-blue(Stratagene，美国)或BL21(Novagen公司，美国)。重组人HGF购自Peprotech公司(美国，产品号100-39)，且重组小鼠HGF购自RND Systems(美国；产品号2207-HG/CF)。生物素化HGF是通过使用标准生物素化试剂和方法(Pierce,USA)，将生物素部分与蛋白化学连接获得的。
细胞系购自/ATCC(France/USA；Cat.No:A549-CCL-185,U87MG–HTB-14)。细胞培养基购自Invitrogen/Lubio(瑞士)。胎牛血清购自Promocell(德国；C-37350)。用于检测细胞增殖的测定试剂，细胞增殖ELISA，BrdU(比色)(Cat.No.1164722900)购自Roche，瑞士。用于检测P-c-Met的测定试剂购自RnDSystems RnDSystems(Human Phospho-HGF R/c-METDuoSet IC；Cat No.DYC2480-5；Sample Diluent Concentrate 2；DXC002)。用于细胞分析的人HGF购自Peprotech公司(Cat No.100-39)并用含有10％FBS细胞培养液重建。
分子生物学
除非另有说明，否则实验方法是按照已记载的实验方案(Sambrook J.,FritschE.F.and Maniatis T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory 1989,New York)进行。
设计锚蛋白重复蛋白文库
用于生成设计锚蛋白重复蛋白文库的方法已被记载(WO 2002/020565；Binz etal.2003,loc.cit.；Binz et al.2004,loc.cit.)。通过所述方法，可以构建具有随机锚蛋白重复模块和/或随机加帽模块锚蛋白的重复蛋白文库。例如，相应地，所述文库的构建，可以基于固定的N端加帽模块(例如SEQ ID NO：2的N端加帽模块)或如SEQ ID NO：29所示的随机N端加帽模块，基于SEQ ID NO：26，27或28的序列基序中的一个或多个随机重复单元，和固定的C端加帽模块(例如SEQ ID NO：8的C端加帽模块)或SEQ ID NO：30的随机C端加帽模块如。优选地，此类文库的构建为，重复或加帽模块随机位置上不含氨基酸C，G，M，N(在G残基之前)或P。此外，基于SEQ ID NO26，27或28的序列基序的随机重复单元，可进一步在位置10和/或17随机化；基于SEQ ID NO：29的序列基序的随机N端加帽模块，可进一步在位置7和/或9随机化；以及，基于SEQ ID NO：30的序列基序的随机化C端加帽模块，可进一步在位置10，11和/或17上随机化。
此外，所述库中的所述随机化模块可以包括在随机氨基酸位置插入的附加多肽环。所述多肽环插入的示例包括抗体的补体决定区(CDR)环文库或从头合成的肽文库。例如，所述环的插入可以使用人核糖核酸酶L的N端锚蛋白重复域结构(田中Tanaka,N.,Nakanishi,M,Kusakabe,Y,Goto,Y.,Kitade,Y,Nakamura,K.T.,EMBO J.23(30),3929-3938,2004)为指导。类似于所述在靠近两个锚蛋白重复序列边界的β-转角中插入有10个氨基酸的锚蛋白重复域，锚蛋白重复蛋白文库可含有插入锚蛋白重复域的一个或多个β-转角的可变长度(例如，1至20个氨基酸)随机环(固定和随机化位置)。
锚蛋白重复序列蛋白文库的任何所述N端加帽模块优选具备RELLKA或RILKAA基序，而非RILLAA基序(例如存在于SEQ ID NO：29的位置21至26)，且锚蛋白重复序列蛋白文库的任何所述C端加帽模块优选具备KAA或KLA基序而非KLN基序(例如，SEQ ID NO：30的最后三个氨基酸)。
所述锚蛋白重复蛋白文库的设计可在与靶相互作用的已知锚蛋白重复域结构的指导下进行。所述结构的例子的蛋白数据库(Protein Data Bank，PDB)唯一查询码或识别码(PDB-ID)是1WDY，3V31，3V30，3V2X，3V2O，3UXG，3TWQ-3TWX，1N11，1S70和2ZGD。
设计锚蛋白重复蛋白文库的例子，如N2C和N3C设计锚蛋白重复蛋白文库，已被记载(WO 2002/020565；Binz et al.2003,loc.cit.；Binz et al.2004,loc.cit.)。N2C和N3C中的数字描述了N端和C端加帽模块之间的随机重复模块数目。
用于定义重复单元和模块内的的位置的命名法是基于Binz et al.2004,loc.cit.，改进之处在于所述锚蛋白重复模块和锚蛋白重复单元的边界存在一个氨基酸位置的移位。例如，Binz et al.2004(loc.cit.)的锚蛋白重复模块的位置1对应与本公开的锚蛋白重复模块的位置2，因此，Binz et al.2004(loc.cit.)的锚蛋白重复模块位置33对应于本公开的下一个锚蛋白重复模块的位置1。
所有的DNA序列均通过测序证实，所有所述蛋白的分子量计算值通过质谱分析进行验证。
实施例1：对包含HGF结合特异性锚蛋白重复域的选择
利用核糖体展示技术(Hanes,J.and Plückthun,A.,PNAS 94,4937-42,1997)，从如Binz et al.2004(loc.cit.)所述的DARPins文库中选择了许多设计HGF结合特异性锚蛋白重复蛋白(DARPins)。使用粗提取物ELISA评估所选定的克隆对特异性目标(HGF)和非特异性目标(MBP，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白)目标的结合，结果表明成功选定了数百种HGF结合蛋白。例如，SEQ ID NO：33至61的锚蛋白重复域构成了包含HGF结合特异性锚蛋白重复域的选定结合蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO：12至25中提供了源自所述HGF结合特异性锚蛋白重复域的个体锚蛋白重复模块。
通过核糖体展示技术筛选HGF特异性锚蛋白重复蛋白
通过核糖体展示技术(Hanes and Plückthun,loc.cit.)，使用人和/或鼠HGF作为靶蛋白，并使用上述的设计锚蛋白重复蛋白文库以及已建立的实验方案(Zahnd,C.,Amstutz,P.and Plückthun,A.,Nat.Methods 4,69-79,2007)，对HGF特异性锚蛋白重复蛋白进行筛选。每次筛选周期后，根据结合蛋白的富集调整以适应产率，令反转录(RT)-PCR循环次数从45到25持续降低。头四次筛选循环使用了标准核糖体展示筛选，使用了逐渐降低的目标浓度和逐渐增加的洗涤严格度来增加从第1轮到第4轮的选择压(Binz et al.2004,loc.cit.)。为了富集高亲和性抗HGF DARPins，令标准核糖体展示筛选(上述)第4轮的产出物进行1轮或2轮选择严格性提高的解离速率筛选(Zahnd,2007,loc.cit.)。每次解离速率筛选后，进行最后一轮标准选择循环，以放大并回收解离速率筛选所选出的结合蛋白。为了提高选定的结合蛋白对人和鼠HGF的交叉反应性，在完成对人HGF的解离速率筛选后，再追加进行一轮对鼠HGF的筛选循环。
通过粗提取物受体竞争性ELISA展示选定克隆与HGF的特异性结合
使用DARPins表达细胞的标准方法大肠杆菌粗提物，通过受体竞争酶联免疫吸附测定(ELISA)，对各个选定HGF结合特异性DARPins进行鉴定。将通过核糖体展示技术选定的DARPins克隆入pQE30(Qiagen)表达载体中，转化入大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene)中，然后在含1.2ml生长培养基(含有1％葡萄糖和50微克/ml氨苄青霉素的TB)的96深孔板(每孔各含有单一克隆)中37℃生长过夜。在新的96深孔板中，向0.9mL含有50微克/ml氨苄青霉素的新鲜LB培养基中接种50微升过夜培养物。在37℃下培养60-90分钟后，用IPTG(0.5mM终浓度)诱导表达，并继续进行3至4小时。收获细胞，再悬浮在50微升B-PERII(皮尔斯)中，并在室温下摇动培养15分钟。然后，加入950微升的PBS溶液，并通过离心除去细胞碎片。每个裂解克隆的提取物的1：50PBSTC稀释液(补充有0.1％吐温
和0.25％(w/v)酪蛋白，pH 7.4的PBS)，和1nM生物素化人或小鼠HGF一起添加到蛋白G涂覆的含有人或小鼠的c-Met-Fc融合体的Maxisorp板中，并在室温下培养10分钟。然后，用PBS-T充分洗涤(补充有0.1％吐温
pH7.4的PBS)，使用标准ELISA程序和链霉素-HRP偶联物(11089153001，Roche)培育该板，并通过POD底物(Roche)检测结合。在405nm处进行显色测定。通过所述细胞粗提物ELISA对数百种克隆的筛选，发现超过一百种不同的DARPins具有HGF特异性。选定的HGF结合特异性锚蛋白重复域氨基酸序列的例子提供于SEQ ID NO：33至61中。
将所述HGF结合特异性锚蛋白重复域和无HGF结合特异性的阴性对照DARPins(例如DARPins#28和29)克隆到基于pQE(QIAgen,Germany)、可提供N端标记以便于简单蛋白纯化(如下所述)的表达载体中。例如，构建了编码如下DARPins的表达载体：
DARPin#33(N端融合有组氨酸标记(SEQ ID NO:9)的SEQ ID NO:33)；
DARPin#34(N端融合有组氨酸标记(SEQ ID NO:9)的SEQ ID NO:34)；
DARPin#35(N端融合有组氨酸标记(SEQ ID NO:9)的SEQ ID NO:35)；
DARPin#36(N端融合有组氨酸标记(SEQ ID NO:9)的SEQ ID NO:36)；
DARPin#37(N端融合有组氨酸标记(SEQ ID NO:9)的SEQ ID NO:37)；
DARPin#38(N端融合有组氨酸标记(SEQ ID NO:9)的SEQ ID NO:38)；
DARPin#39(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:39)；
DARPin#40(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:40)；
DARPin#41(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:41)；
DARPin#42(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:42)；
DARPin#43(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:43)；
DARPin#44(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:44)；
DARPin#45(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:45)；
DARPin#46(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:46)；
DARPin#47(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:47)；
DARPin#48(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:48)；
DARPin#49(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:49)；
DARPin#50(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:50)；
DARPin#51(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:51)；
DARPin#52(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:52)；
DARPin#53(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:53)；
DARPin#54(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:54)；
DARPin#55(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:55)；
DARPin#56(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:56)；
DARPin#57(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:57)；
DARPin#58(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:58)；
DARPin#59(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:59)；
DARPin#60(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:60)；
DARPin#61(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:61)；和
DARPin#62(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO:62)。
DARPins的高水平可溶性表达
在大肠杆菌BL21或XL1-Blue细胞中表达上述在细胞粗提物ELISA中表现出HGF结合特异性的选定克隆，并利用其组氨酸标记以标准实验方法进行纯化，以进行进一步分析。取25ml静止过夜培养物(TB，1％葡萄糖，100mg/l氨苄青霉素；37℃)接种至500ml培养物(相同培养基)中。600nm下的吸光度为1.0，用0.5mM IPTG诱导培养物并于37℃下培养4-5小时。将培养物离心，所得沉淀重新悬浮于40ml TBS500(50mM Tris–HCl，500mM NaCl，pH 8)并超声处理。裂解物再次离心，并取甘油(10％(v/v)终浓度)和咪唑(20mM终浓度)加入到所得上清液中。使用Ni氮基三乙酸柱(2.5ml柱体积)，根据厂商说明(QIAgen,Germany)进行蛋白纯化。可选地，通过阴离子交换层析及后续的尺寸排阻层析，依照病领域技术人员已知的标准树脂和实验方法，来纯化缺乏6xHis标记的DARPins或选定重复域。从1L大肠杆菌培养物中，可以纯化得到多至200mg HGF结合特异性的高可溶性DARPins，纯度>95％(从SDS-15％PAGE估计)。使用所述纯化的DARPins进行进一步表征分析。
实施例2：DARPins的与特异性表面等离子体共振分析，结合对肝细胞生长因子表
征
人HGF分子直接固定在流动池，并与各种所选DARPins的相互作用进行了分析。
通过表面等离子体共振(SPR)分析进行Kd测定
使用ProteOn仪(BioRad)，并根据本领域技术人员已知的标准程序测定SPR。运行缓冲液是PBS，pH值7.4，含有0.005％吐温
将人HGF共价固定在GLC芯片(BioRad)上至约5000共振单位(RU)水平。然后，为了测定DARPin和HGF的相互作用，注入200微升含浓度为25，12.5，6.26，3.13和1.67nM(基于速率测量)的DARPins系列稀释液的运行缓冲液(含有0.005％吐温的PBS)，接着通过100微升/分钟(不基于速率测量)恒定流速的运行缓冲液25分钟。从注射DARPin后获得的RU痕迹中减去区间信号(即共振单位(RU))和基准喷射(即仅注射运行缓冲液)(双基准)。从DARPin与HGF相互作用的结合速率和解离速率测量得到的SPR痕迹，可以得到相应的结合速率和解离速率。举例而言，图1所示为所得DARPin的#51SPR痕迹。用本领域技术人员已知的标准方法，可以从结合速率和解离速率估计值计算解离常数(Kd值)。选定DARPins的Kd值测定为处于10pM至20nM之间。作为举例，表1总结了一些选定DARPin的Kd值。
表1：DARPin与人HGF相互作用的Kd值
竞争SPR分析
为了鉴定本发明的结合蛋白是否与锚蛋白重复域竞争结合HGF，通过将第一种DARPin与人HGF结合至饱和，随后注入第二种DARPin，来进行竞争SPR分析。若注入第二个DARPin时，没有观察到信号增加，则认为第一种和第二种DARPin之间竞争结合HGF；若观察到信号增加，则认为第一种和第二种DARPin之间没有竞争结合HGF。图2中提供了两种竞争结合HGF的DARPins和两种未竞争结合HGF的DARPins的示例分析。
实施例3：肝细胞生长因子的抑制诱导的c-Met磷酸化通过DARPins具有HGF结合特
异性
取A549细胞以每孔50000细胞接种于含完全培养基(DMEM；10％FBS)的96孔板中。24小时后，培养基更换为无血清培养基。将细胞再培养24小时，并在存在和不存在DARPin的前提下用1nm人HGF进行刺激。HGF和DARPin在室温下预培养至少30分钟，然后加入到细胞中。在细胞培养条件下刺激细胞10分钟。通过除去细胞上清液(轻弹)并加入细胞裂解液(RIPA；样品稀释浓缩液2；RnDSystems)令刺激终止。根据厂商说明，使用Human Phospho-HGF R/c-MET DuoSet IC试剂盒(RnD体系)对细胞裂解物中的磷酸化c-Met进行测定。使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software Inc.,CA,USA)分析数据。通过将无刺激对照下所得的OD值设定为100％抑制，并将无抑制剂对照下所得的OD值设定为0％抑制，对磷酸化抑制百分比进行了计算。对于抑制试验，将数据拟合到log(抑制剂)vs.响应/变量斜率。
实施例的结果总结在表3中。从上述以本领域技术人员已知的标准程序获得的滴定曲线，计算IC50值。抑制百分比的计算如上所述。图3中提供了DARPin#51和#43的示例滴定曲线。
表3：DARPin对HGF刺激的c-Met磷酸化的抑制潜力
实施例4：HGF结合特异性DARPins对U87细胞增殖的抑制作用
将U87细胞在37℃、5％CO 2下培养在含有10％FBS(Promocell-细胞因子-低)的DMEM。每周两次按1:3比例分开细胞。在含有1％FBS的100微升DMEM中以每96孔2500个细胞接种，培养过夜。第二天，加入DARPins(10ul，10×最终浓度)再培养5天。第4天，添加每孔10微升BrdU标记溶液(10微升，1：1000稀释)。第5天，根据厂商说明进行测试分析。DARPins滴定的范围在1'000至2nM。用GraphPad Prism软件对实验进行分析。从所得滴定曲线的非线性拟合计算IC50。
实施例的结果总结在表4中。基于以本领域技术人员已知的标准程序获得的上述滴定曲线，计算IC50值。图5中提供了DARPin#51和#43的示例滴定曲线。
表4：DARPins结合HGF对U87增殖的抑制
实施例5：通过受体竞争测定对HGF结合特异性DARPins进行表征
以受体竞争ELISA测定抗HGF DARPins的抑制人HGF结合其受体
的效力。c-Met(Fc嵌合体；RnD体系，USA,358-MT-100/CF)被预先涂覆在微板上。DARPins和HGF在PBSTC中预混合，然后在室温下培养0.5小时。然后所述预培养混合物转移到c-Met预涂孔中，任何未被DARPins阻断的HGF都会被所述固定受体结合。洗去任何未结合物质后，将HGF特异性的多克隆抗体(RnD systems,USA,AF-294-NA)加入到孔中。洗去任何未结合的物质后，将与具有HGF特异性的多克隆抗体结合的辣根过氧化物酶标记抗体(Novus Biologicals,USA,NB7357)加入到各孔中。洗涤除去任何未结合的抗体-酶试剂后，将底物溶液(Roche,Switzerland,11484281001)加入到孔中，显色与HGF结合量成正比。终止显色，并在405nm处测定颜色强度。在该测定中，所测试的DARPins显示出高HGF抑制效力。实施例结果总结在表5中。图5中提供了一组DARPins的示例滴定曲线。根据如上所述得到的滴定曲线，使用本领域技术人员已知标准方法，计算IC50值。
表5：DARPin对HGF与其受体c-Met相互作用的抑制
实施例6：HGF结合特异性DARPins对U87肿瘤生长的抑制作用
取107的U87-MG细胞皮下注射到瑞士裸鼠的右胁腹。25天后，当肿瘤平均大小达到126±51mm3时，将小鼠随机分配到处理组，每组8只小鼠，开始进行处理。小鼠静脉注射0.1ml载体溶液/PBS或各种DARPins PBS溶液(剂量为0.11mg/kg,1.1mg/kg和11mg/kg)，每次给药之间间隔3天(Q3Dx7)。每周两次监测体重和肿瘤体积。处理开始21天后，实验结束。作为例子，图6所示为的肿瘤体积对PEG化DARPin#62处理时间(处理开始后的天数)的作图。用于该肿瘤生长抑制实验中的DARPins包含N端组氨酸标记(SEQ ID NO：9)、本发明所述的HGF结合特异性锚蛋白重复域、GS-连接肽(SEQ ID NO：10)和C端Cys残基。该DARPins的蛋白部分通过利用其组氨酸标记以标准方法纯化，并使用标准马来酰亚胺化学结合到40kDa聚乙二醇上。其他延长本发明锚蛋白重复域的终末半衰期的公知方法(比PEG化等，见上文)，也可以用在所述肿瘤模型上以测试所述结构域的体内效力。
Claims (10)
1.一种重组蛋白，包含锚蛋白重复域，其中所述锚蛋白重复域与人肝细胞生长因子特异性结合，其中所述锚蛋白重复域由选自SEQ ID NO:33、37、38、41至43、48、51、56至61的任一氨基酸序列组成，其中所述锚蛋白重复域的位置1上的G和/或位置2上的S可选缺失；且所述锚蛋白重复域的倒数第二个位置上的L和/或最后一个位置上的N可选地替代为A。
2.一种重组蛋白，包括锚蛋白重复域，其中所述锚蛋白重复域与肝细胞生长因子在磷酸盐缓冲液中结合，且其中所述锚蛋白重复域由SEQ ID NO:51的氨基酸序列组成，其中所述锚蛋白重复域的位置1上的G和/或位置2上的S可选缺失；且所述锚蛋白重复域的倒数第二个位置上的L和/或最后一个位置上的N可选地替代为A。
3.权利要求1或2所述的重组蛋白，其中所述锚蛋白重复域与肝细胞生长因子在磷酸盐缓冲液中以低于10-7M的解离常数(KD)结合。
4.权利要求1或2所述的重组蛋白，其中所述锚蛋白重复域抑制肝细胞生长因子与c-Met在磷酸盐缓冲液中以低于10-7M的IC50值的结合。
5.权利要求3所述的重组蛋白，其中所述锚蛋白重复域抑制肝细胞生长因子与c-Met在磷酸盐缓冲液中以低于10-7M的IC50值的结合。
6.一种核酸，其编码根据权利要求1-5中任一项所述的重组蛋白。
7.一种药物组合物，包含根据权利要求1-5中任一项所述的重组蛋白或根据权利要求6所述的核酸，且可选地包括药学可接受的载体。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的重组蛋白在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗以表达c-Met为特征的病理状况。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述病理状况是以表达c-Met为特征的癌症。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述癌症为神经胶质瘤。
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