CN105255927B

CN105255927B - 一种kiaa1217-ret融合基因

Info

Publication number: CN105255927B
Application number: CN201510640466.2A
Authority: CN
Inventors: 张筱骅; 王瓯晨; 陈恩东; 张玮; 周毅力; 曾瑞超; 金浪平; 蔡业丰; 董思洋; 张祥建; 王青煊; 扬帆; 刘叶欢; 薛丽君; 潘传孟
Original assignee: First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2018-07-27
Anticipated expiration: 2035-09-30
Also published as: CN105255927A

Abstract

本发明公开了一种KIAA1217‑RET融合基因，该KIAA1217‑RET融合基因由KIAA1217基因的第1‑11号外显子和RET基因的第8‑19号外显子相融合组成，其核苷酸序列如附图1所示。该融合基因的公开有助于进一步探究甲状腺癌中所未发现驱动基因改变，优化甲状腺乳头状癌患者的临床病理分类和诊治策略。

Description

一种KIAA1217-RET融合基因

技术领域

本发明属于基因技术领域，具体是指一种KIAA1217-RET融合基因。

背景技术

甲状腺癌的发病率在近30年里已增长了三倍以上，其不同组织类型和基因表达谱也已随着时间有所改变。在所有的甲状腺癌中，除髓样癌外，都是起源于组成甲状腺单细胞上皮层的滤泡细胞。甲状腺乳头状癌(Papillary Thyroid Carcinoma，PTC)是甲状腺恶性肿瘤中最常见的病理类型，因其有乳头的组织学结构而得名，大约占到所有甲状腺恶性肿瘤中的80％。PTC往往是可治愈的，其5年生存率约为95％。然而一些PTC会去分化变为侵袭性、致命性的甲状腺癌。目前的主要治疗方案有外科手术、甲状腺抗TSH激素的内分泌治疗和放射性碘治疗(利用甲状腺滤泡细胞对碘有高亲和力的原理)。

RET/RAS/BRAF/MAPK信号通路上的基因变化，现已证实在乳头状癌的发病机制上起着非常关键作用。所有乳头状癌中约有70％的基因改变发生在这条通路上，而且RET/RAS/BRAF基因变化很少存在交叉重叠，提示该通路中一个效应分子的激活即足以产生细胞的恶性转化。这条通路中最普遍的基因变化是BRAF基因的V600E突变，其发生率约占到乳头状癌的40％。也有报道称发现存在由BRAF染色体重排引起的甲状腺乳头状癌如AKAP9-BRAF融合。这种重排现象很少出现在散发性的乳头状癌中，而更多见于由辐射引起的甲状腺恶性肿瘤中。在甲状腺乳头状癌中约有10％存在RAS基因(N-RAS，H-RAS，K-RAS)的点突变，且大多数发生在滤泡亚型的乳头状癌中。染色体重排相关的RET原癌基因激活是在PTC中另一个比较常见的基因改变。

RET原癌基因位于10染色体的1区1带2亚带(即10q11.2)，其编码生成跨细胞膜的酪氨酸激酶受体蛋白。该蛋白由三个结构域组成：配体结合域(包括四个钙粘蛋白样重复结构和一个富含半胱氨酸结构)、疏水跨膜域和包含酪氨酸激酶结构的胞内域。其配体属于胶质细胞源性的嗜中性因子家族，包括有neurturin(NRTN)、persephin(PSPN)和artemin(ARTN)，和配体结合后导致酪氨酸激酶受体的二聚体化，自体磷酸化胞内域中关键部位的酪氨酸激酶，激活相关下游信号通路。

在甲状腺组织中，RET原癌基因高表达于滤泡旁细胞(即C细胞)，其点突变可导致甲状腺髓样癌的发生发展。在甲状腺滤泡细胞中，RET原癌基因可因染色体重排而被激活，导致一些不相关基因的5’端和RET基因的3’端发生融合，产生RET/PTC重排。最早被鉴定发现的三种RET/PTC重排也是最为多见的乳头状癌重排致癌类型。其中，RET/PTC1和RET/PTC3分别由H4基因(亦称D10S170或CCDC6)和NCOA4基因(亦称RFG或ELE1)与RET基因发生融合形成。RET/PTC1和RET/PTC3均由同条染色体的同臂转位形成，即发生融合的上下游两个基因都位于第10号染色体。不同的是，RET/PTC2是第10号和第17号染色体发生易位，导致PRKAR1A和RET形成融合。近些年来，一系列新类型的RET/PTC融合被报道发现于PTC病例中，其中绝大多数是由染色体间易位而形成。

虽然已发现一些与PTC相关的基因改变，但仍有一部分的甲状腺癌发生机制未明。因此，还需要进一步对其进行研究。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种新的RET融合即KIAA1217-RET，该融合基因有助于进一步探究甲状腺癌中未知的驱动基因改变，优化甲状腺乳头状癌患者的临床病理分类和诊治策略。

为实现上述目的，本发明的技术方案是该KIAA1217-RET融合基因由KIAA1217基因的第1-11号外显子和RET基因的第8-19号外显子相融合组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步设置是KIAA1217-RET融合基因所表达的KIAA1217-RET融合蛋白定位于细胞核中，使MAPK通路的激活作用减弱。KIAA1217-RET融合基因所表达的KIAA1217-RET融合蛋白通过卷曲螺旋结构形成自身二聚体，激活KIAA1217-RET融合蛋白中RET蛋白的激酶域活性。

进一步设置是一种多肽，其特征在于：其由所述的KIAA1217-RET融合基因编码获得。

本发明的优点是：

KIAA1217-RET编码蛋白的氨基酸序列发现其定位于细胞核，并用RET抗体的免疫荧光实验验证其弥散地定位于肿瘤细胞的核膜周围。用免疫印迹实验检测RET蛋白激活MAPK信号通路的能力。由于弥散地定位于细胞核，导致在胞质中RET蛋白激活MAPK信号通路的能力减弱。融合基因激活酪氨酸激酶通过融合上游基因高活性的启动子促进嵌合基因的表达，并利用二聚体功能域介导配体非依赖性的二聚体化和激酶活性的激活。运用COILS和Paircoil2软件发现KIAA1217-RET融合蛋白存在卷曲螺旋结构(CC结构)，激活KIAA1217-RET融合蛋白中RET蛋白的激酶域活性。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。

附图说明

图1本发明的KIAA1217-RET融合基因的转录组测序基因序列融合图，图1的中间竖线为融合基因的连接点位置；

图2 R56T的完整性(RIN)鉴定图；

图3 R56N的完整性(RIN)鉴定图；

图4 R56T的碱基组成情况图；

图5 R56T的碱基质量值分布情况图；

图6 R56T的比对统计结果图；

图7 R56N的比对统计结果图；

图8 R56T的测序随机性评估图；

图9 R56N的测序随机性评估图；

图10 R56T的基因覆盖度统计图；

图11 R56N的基因覆盖度统计图；

图12 20个病人(包括癌与癌旁组织)转录组测序的融合基因Circos图；

图13 R56T转录组测序的融合基因Circos图(其中KIAA1217-RET融合用红框标注)；

图14 KIAA1217的基因坐标图

图15 RET的基因坐标图；

图16 KIAA1217-RET融合基因的分子生物学结构图；

图17 选择KIAA1217-RET融合基因最佳引物的预实验图；

图18 KIAA1217-RET融合基因的正向Sanger测序图；

图19 KIAA1217-RET融合基因的反向Sanger测序图；

图20 KIAA1217-RET融合基因的Western Blot图；

图21 NNCN算法预测融合蛋白定位的结果图；

图22 k-NN算法预测融合蛋白定位的结果图；

图23 带绿色荧光标记的KIAA1217-RET融合蛋白定位图；

图24 R56肿瘤和正常标本的MAPK通路水平Western Blot图

图25 R56标本中Cyclin D1、MMP1和MMP9的RNA表达水平图；

图26 运用COILS(左)和Paircoil2(右)软件对新融合蛋白是否存在卷曲螺旋结构的预测图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

(一)、KIAA1217-RET融合基因的获得和筛选

1甲状腺乳头状癌组织标本来源

1.1标本入组标准样品均来自本院肿瘤外科诊断为甲状腺乳头状癌的患者手术切除标本，且所有20例患者术前均未接受过其它医学干预治疗(如放化疗)。标本收集之前，已获医院伦理委员会批准，并在术前和患者及其家属签署知情同意书。肿瘤分期参考美国癌症联合委员会(AJCC)的甲状腺乳头状癌分类标准。每一个肿瘤组织标本都有相对应的正常组织标本，即癌旁正常组织(如肿瘤为单侧病灶，则癌旁正常组织来自对侧未受累的腺叶组织)。每一个肿瘤标本都配有一张与其FFPE石蜡块所匹配的HE染色切片。

1.2甲状腺乳头状癌的确诊肿瘤和其对应正常组织的新鲜标本包埋于最佳切割温度(OCT)复合物中，然后做成组织切片用于病理学诊断。高年资病理学家评估标本的HE切片，并证实肿瘤标本在组织病理学上符合甲状腺乳头状癌的诊断和配对的正常组织中未含有肿瘤细胞。其中对符合肿瘤标本的要求是肿瘤细胞平均丰度要大于60％，且坏死组织成分少于20％。如果滤泡亚型结构达99％，则归为甲状腺滤泡亚型乳头状癌。如果具有高细胞特征的细胞比例大于50％，即定义为甲状腺高细胞亚型乳头状癌。

1.3临床资料收集20例甲状腺乳头状癌患者的临床资料都来自本院肿瘤外科的电子病历系统。获取的临床病理学和人口学资料如下：诊断时的年龄、获取组织标本的时间、性别、民族、是否有恶性肿瘤病史、肿瘤位置、肿瘤大小、AJCC甲状腺乳头状癌分类(T原发肿瘤大小，N局部淋巴结受累情况，M远处转移情况)、临床分期、肿瘤是否为多灶性、肿瘤组织学亚型和是否有辐射放射史。

2实验试剂和仪器耗材

2.1实验试剂

2.2仪器耗材

实验方法

1 RNA-Seq高通量测序检测入组甲状腺乳头状癌患者的融合基因表达水平差异

1.1组织总RNA的提取及完整性(RIN)鉴定

(1)首先确保用于提取RNA的组织块重量不大于50mg；

(2)将合适大小的组织块放入1.5ml EP管中，并加入700ul QIAzol裂解液，用组织研磨器使其充分裂解和混匀；

(3)将匀浆液室温放置于工作台上5min；

(4)向匀浆液中加入140ul氯仿，盖上EP管的帽子，剧烈振动15s；

(5)将匀浆液室温置于工作台上2-3min；

(6)12000x g、4℃低温高速离心15min；

(7)将离心后的上清液移至新的EP管中，并加入约525ul无水乙醇，充分吹打将其混匀；

(8)取700ul混合液移至2ml的RNeasy Mini离心柱中，≥8000x g室温离心15s，弃离心液；

(9)将混合液中剩余液体一并移至2ml的RNeasy Mini离心柱中，重复第8步；

(10)向RNeasy Mini离心柱中加入700ul RWT，≥8000x g室温离心15s，弃离心液；

(11)向RNeasy Mini离心柱中添加500ul RPE，≥8000x g室温离心15s，弃离心液；

(12)再次向RNeasy Mini离心柱中加入500ul RPE，≥8000x g室温离心2min，弃离心液；

(13)将RNeasy Mini离心柱转移至新的2ml收集管中，全速离心1min；

(14)将RNeasy Mini离心柱移至新的1.5m EP管中，加入40ul经去RNA酶处理的核酸水，≥8000x g离心1min，以便洗脱提取的RNA；

(15)用Agilent 2100对提取的RNA进行质控：主要指标包括RNA浓度、RIN值和28S/18S的比值。

1.2 RNA-Seq高通量测序

收集提取的RNA送至华大基因(广州)公司做二代NGS测序，简要步骤如下。从提取的总RNA中，用带有Oligo(dT)的磁珠分离具有polyA结构的mRNA。用专门的裂解液将mRNA打断成短的小片段。以这些小片段做为模版，利用随机六聚体引物逆转录合成cDNA的第一条链。再分别用缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA聚合酶I等试剂合成cDNA的第二条链。用QIAQuick PCR extraction kit试剂盒纯化打断的小片段，并用EB缓冲液补齐其粘性末端和加上polyA尾。随后给这些小片段连接上测序接头。根据琼脂糖凝胶电泳的结果，选取合适的小片段做PCR扩增。最后，将建立好的cDNA文库放入Illumina公司的HiSeq2000高通量测序仪中进行测序，产生2x90成对的reads数据。

1.3生物信息学分析

去除原始reads中的测序接头数据和低质量reads后，运用Tophat(v2.0.8)软件将符合质控的reads与人类基因组序列(hg19)进行比对，软件参数采用默认形式。利用Cufflinks(v2.0.2)软件对基因表达丰度进行评估，其丰度单位为RPKM即每百万个reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数。检测融合基因采用Soapfuse(v1.2.4)软件。

2 RT-PCR实验验证测序的甲状腺乳头状癌患者组织标本中融合基因的表达水平

2.1融合基因引物设计和合成融合基因的特异性引物

设计原则如下：

融合基因的特异性引物合成：由立菲生物技术(上海)有限公司合成

表1 KIAA1217-RET融合基因的特异性引物序列

2.2总RNA逆转录

(1)RNA的变性：将提取的RNA加入200ul的EP管中，放入PCR仪中，设置为70℃10min，待时间到后，把EP管置于冰上冷却；

(2)配置反应液，采用日本TOYOBO公司的ReverTra qPCR RT Kit试剂盒，具体反应体系如下表2；

表2 RNA逆转录反应体系(总体积20ul)反应成

(3)PCR程序设置：先16℃5min，再42℃30min，最后98℃5min。

2.3 PCR扩增

(1)配置反应液，使用天跟公司的2xTaq PCR MasterMix Kit试剂盒，具体反应体系如下表3；

表3 PCR反应体系(总体积50ul)

(2)PCR程序设置：先94℃3min，再30个循环的94℃30sec、57℃30sec和72℃1min，最后72℃5min。

2.4 PCR产物琼脂糖凝胶电泳跑胶

(1)制胶：根据每次跑胶样品数的不同配制不同大小的琼脂糖凝胶，用0.5X TAE电泳缓冲液溶解琼脂糖，使其浓度达到2％。将混合液放入微波炉中加热，让混合液充分溶解，待液体温度降至50-60℃时再滴加GoldView(100ml凝胶加5ul)并混匀。最后将混匀液倒入事先准备好的制胶模具中，待温度降至室温制成琼脂糖凝胶块。

(2)实验步骤：将5ul的DNA marker和PCR产物分别加入琼脂糖凝胶块的孔隙中，将琼脂糖凝胶放入盛有0.5X TAE电泳缓冲液的电泳槽中，调节电泳仪至恒压120V，电泳20min，最后把凝胶放入凝胶成像分析仪中进行紫外线曝光和拍照。

2.5测序

将电泳跑胶中符合目的大小条带的样品取30-40ul分装，一并送至立菲生物技术(上海)有限公司做一代Sanger测序。测序数据用Chromas(v2.4.1)软件进行分析和整理。

2.6免疫印迹实验检测融合蛋白

(1)组织蛋白提取：将合适大小的组织块放入1.5ml EP管中，并加入500ul RIPA裂解液(强)，用组织研磨器使其充分裂解和混匀。将匀浆液12000rpm离心3min，取上清液移至新的1.5ml EP管中。

(2)组织蛋白浓度测定：配置测定浓度的体系是50ul(5ul样品+45ul双蒸水)，即将5ul待测样品加至事先用双蒸水清洗干净的比色皿中，再加45ul双蒸水并充分吹打。空白对照则用5ul的RIPA代替样品。用蛋白核酸测定仪检测各个样品的浓度，每测完一次用双蒸水清洗比色皿3次。

(3)Western Blot实验步骤：1)预先用洗洁精浸泡玻璃板过夜，再用蒸馏水冲洗、晾干并组装搭建后查漏；

2)将待上样的样品置于99℃的加热器中升温变性5min，一般每管上样量的蛋白质量为40ug；

3)配胶方案详见表4和5。用1ml枪头将分离胶混匀液沿U型凹槽加入玻璃板中，注意避免气泡，并用双蒸水封胶。水平静置于工作台上灯光照射30min，根据配胶管中剩余混匀液的凝固情况，倒去封胶用的双蒸水，重新双蒸水清洗3次，再滤纸吸干。用1ml枪头将浓缩胶混匀液沿U型凹槽加入玻璃板中，注意避免气泡。灌胶后将梳子缓慢插入胶中，光凝30min；

4)待浓缩胶凝固后，缓慢拔出梳子，根据需要加入合适量的样品和Marker。首先在浓缩胶中电泳80V 40min，待Marker进入分离胶后调节电压至140V，当Marker的最小条带跑至分离胶的最下缘时结束电泳跑胶；

5)根据目的蛋白分子量将电泳后的凝胶切成合适大小，并按凝胶尺寸剪出对应大小的0.2mm硝酸纤维膜。把白板、海绵垫、滤纸、膜、胶、滤纸、海绵垫、黑板组成的“三明治”结构放入电转槽中，冰敷电转300mA 90min；

6)电转结束后，取出纤维膜用5％脱脂奶粉室温摇床封闭3h，之后PBST浸洗10min*3次；

7)在纤维膜上湿敷兔抗人RET一抗(CST，1：1000)1ml，并放置湿盒中4℃过夜，之后PBST浸洗10min*3次；

8)在纤维膜上湿敷山羊抗兔二抗(CST，1：5000)1ml，并放置湿盒中室温2h，之后PBST浸洗10min*3次；

9)暗室曝光或Odyssey扫描仪曝光。

3融合蛋白的生物学功能研究

3.1生物信息学预测融合蛋白的细胞器水平定位

运用PSORT II软件对融合形成的新蛋白的细胞器定位进行预测，分别采用NNCN算法(Reinhardt’s method for Cytplasmic/Nuclear discrimination)和k-NN算法(k-nearest neighbor algorithm)一同预测定位，评估两种算法的一致性，帮助指导下一步实验方案的设计和实施。

3.2免疫荧光实验验证软件预测定位的准确性

(1)取R56的新鲜标本做冰冻切片，用粘附性载玻片贴片；

(2)用甲醇室温固定切片5min后，再用PBS浸洗3次；

(3)用0.3％Triton室温通透切片15min后，再用PBS浸洗3次；

(4)用山羊血清液室温封闭切片15min后，将载玻片轻轻甩干；

(5)在切片上湿敷兔抗人RET一抗(CST，1：200)100ul，并放置湿盒中4℃过夜；

(6)取出切片室温置于工作台上10min后，再用PBS摇床浸洗切片5次，每次1min；

(7)在切片上湿敷山羊抗兔荧光二抗(Alexa 488，1：500)100ul，并置于工作台上室温避光30min；

(8)用PBS摇床浸洗切片5次，每次1min，注意避光；

(9)用DAPI(碧云天)室温复染切片4min后，再用PBS浸洗3次，同样注意避光；

(10)将载玻片轻轻甩干后，用抗淬灭封片剂(碧云天)封片；

(11)用荧光显微镜观察切片组织染色情况并拍照。

3.3免疫印迹实验检测融合蛋白MAPK信号通路的磷酸化水平

7)在纤维膜上湿敷兔抗人ERK和p-ERK一抗(CST，1：1000)1ml，并放置湿盒中4℃过夜，之后PBST浸洗10min*3次；

9)暗室曝光或Odyssey扫描仪曝光。

表4 12％分离胶制备体系

表5 4％浓缩胶制备体系

3.4 RealTime检测表型相关分子的表达水平

(1)表型相关分子的引物设计和合成表型相关分子和内参的特异性引物设计原则如下：

表型相关分子和内参的特异性引物合成：由立菲生物技术(上海)有限公司合成

表6表型相关分子和内参的特异性引物序列

(2)总RNA逆转录

反应体系和实验步骤同2.2融合基因的总RNA逆转录。

(3)Real-time qPCR扩增

1)配置反应液，采用日本TOYOBO公司的 qPCR Master Mixkit，具体反应体系如下表7；

表7 PCR反应体系(总体积20ul)

2)PCR程序设置：先95℃2min，再40个循环的95℃15sec、60℃1min，最后72℃5min，同时勾选熔解曲线程序选项。

(4)结果分析

运用相对定量法进行统计分析，分别记录各自样品目的基因和B-Actin内参基因的Ct值，两者的差值△Ct，再比较肿瘤组织和对应癌旁组织的目的基因的相对表达水平差异。

3.5融合蛋白构象预测和机制探讨

分别采用COILS和Paircoil2软件对融合形成的新蛋白是否存在卷曲螺旋结构域进行预测，评估两种软件的一致性，帮助进一步解释融合蛋白发挥生物学效应的机制。其中COILS软件在扫描肽链可能的coil区域时的窗口长度是14、21和28，而Paircoil2软件的窗口长度是28，且其检验可能存在卷曲螺旋结构域的P值设定在0.025。

(二)、数据检验和分析

1测序入组患者的临床病理学和人口学资料

此次入组患者诊断时的平均年龄是35.5岁，其中20％患者年龄不小于45岁。入组资料中有35％男性和65％女性。相关患者的肿瘤临床分期包括三个期，分别是85％Ⅰ期，5％Ⅲ期和10％Ⅳ期。肿瘤最大径的平均长度为22.4mm，范围从8mm到45mm。入组病人中有15％患者在诊断时即为双侧甲状腺乳头状癌，所有患者均无既往恶性肿瘤病史。绝大多数患者无已知的颈部或全身放射史和辐射史，5％是不清楚是否有过放射史。20例患者的临床病理学和人口学资料详见表1。

表1所有患者的临床病理学和人口学资料临床病理

2 RNA-Seq高通量测序检测入组甲状腺乳头状癌患者的融合基因表达水平差异

2.1组织总RNA的完整性(RIN)鉴定

用Agilent 2100对提取的RNA进行质控：主要指标包括浓度、RIN和28S/18S的比值。所选的20对RNA样品均符合RNA-Seq测序的要求。如存在KIAA1217-RET融合的R56T标本，其送检测序样品浓度为384ng/uL，体积31uL，总量11.9ug，RIN＝7.4，28S/18S＝2.1(图2)。对应的R56N则浓度为304ng/uL，体积28uL，总量8.51ug，RIN＝6.7，28S/18S＝1.8(图3)。

2.2 RNA-Seq高通量测序质量评估

质控分析：分别从reads的碱基组成情况、碱基质量值分布情况、与参考基因(组)比对情况、测序随机性情况和各个样品的基因覆盖度情况等五个方面对RNA-Seq的测序质量进行评估。例如R56T标本，其肿瘤组织的样品碱基组成均衡(图4)，各个碱基约占25％；碱基质量值绝大多数大于Q20(图5)。其肿瘤和癌旁组织的参考基因(组)比对情况详见图6和7，其各自reads较均匀地从5’端分布到3’端即测序随机性较好(图8和9)，其各自含90％～100％覆盖度的比例较高(图10和11)。

2.3生物信息学分析

测序质控过滤后，运用Tophat(v2.0.8)软件将符合要求的reads和人类基因组序列(hg19)进行比对，软件参数采用默认形式。利用Cufflinks(v2.0.2)软件对基因表达丰度进行检测，其丰度单位为RPKM。检测融合基因采用Soapfuse(v1.2.4)软件。每个病人的肿瘤和正常标本中均存在一定数量的融合基因(图12)。其中发现在20对测序样品中发现一个样品存在从未报道过的RET融合序列reads(图1)，即R56T的KIAA1217-RET融合(图13)。新的RET融合的上下游基因在染色体上原来的基因坐标如下图所示(图14和15)。新的RET融合mRNA由KIAA1217的第1-11号外显子和RET的第8-19号外显子组成，具体结构详见图16。

3 RT-PCR验证测序的甲状腺乳头状癌患者组织标本中融合基因的表达水平和免疫印迹验证融合蛋白的存在

针对KIAA1217-RET融合基因的连接点序列，运用Primer Premier 5软件根据引物设计的相关原则合成了四对引物。通过预实验发现第2对引物的特异性最好，凝胶电泳跑胶的条带最清晰(图17)，故选定第2对引物(即FP：AGAAGTTGTGCGAGTTGGA，RP：AGTTCCTGGTGATCCCTTT)作为进一步扩大样本量验证KIAA1217-RET融合基因发生频率的实验引物。同时将第2对引物PCR的产物送立菲生物技术(上海)有限公司做Sanger测序，以一代测序结果作为验证存在KIAA1217-RET融合基因序列的金标准，图18和19分别为KIAA1217-RET融合基因序列的正向测序和反向测序图。免疫印迹实验用兔抗人RET一抗(其针对的抗原表位在RET蛋白的C端)去检测融合蛋白，其结果如图20所示。即该融合基因的确能翻译出融合蛋白，蛋白分子量也符合预测大小(150kDa)，而且仅发生在对应的R56肿瘤组织标本中。

4融合蛋白的生物学功能研究

4.1生物信息学预测融合蛋白的细胞器水平定位

运用PSORT II软件对融合形成的新蛋白的细胞器定位进行预测，分别采用NNCN算法(94.1％的可能性在细胞核，图21)和k-NN(69.6％的可能性在细胞核，图22)算法一同预测定位，发现两种算法的一致性较好，都预测其融合蛋白有较大可能定位于细胞核中，帮助指导下一步实验方案的设计和实施。

4.2运用免疫组织荧光技术验证融合蛋白的细胞器定位

发现DAPI染色的细胞核周围的确存在有带绿色荧光标记的RET新融合蛋白(图23，箭头所示位置)，其绿色荧光标记部位不同于原本RET蛋白定位的胞膜胞质位置。

4.3免疫印迹检测融合蛋白相关的MAPK信号通路的磷酸化水平根据软件预测和免疫组织荧光技术验证，KIAA1217-RET融合蛋白定位从原来RET蛋白的胞膜胞质转移至细胞核，即R56T标本中无BRAF突变蛋白和定位于胞膜胞质的RET蛋白，相应的经典MAPK通路活性应该随之而减弱。基于这个设想设计实验，运用Western Blot技术检测MAPK通路上关键分子ERK磷酸化活性的高低来评估MAPK通路活性的强弱。如图24所示，R56T的p-ERK水平明显低于R56N，验证了之前的设计即R56T标本的MAPK通路活性减弱。

4.4 Real-time qPCR检测表型相关分子的表达水平

运用Real-time qPCR技术对表型相关marker分子的表达水平进行检测：增殖方面(Ki-67、PCNA、AKT)、周期方面(Cyclin Ds、CDK4/6、p27)、凋亡方面(p53、caspase-3、BCL-2)和转移方面(MMPs)。结果发现R56T的Cyclin D1、MMP1和MMP9的RNA表达水平较R56N显著升高，如图25所示。

4.5融合蛋白构象预测和机制探讨

分别采用COILS和Paircoil2软件对融合形成的新蛋白是否存在卷曲螺旋结构域进行预测，评估两种软件的一致性，帮助进一步解释融合蛋白发挥生物学效应的机制。其中COILS软件预测存在卷曲螺旋结构域的氨基酸在第648-685AA，Paircoil2软件则为第646-677AA，两款软件预测一致性较好(图26)。即KIAA1217-RET融合蛋白易通过卷曲螺旋结构形成自身二聚体，从而激活KIAA1217-RET融合蛋白中RET蛋白的激酶域活性。

SEQUENCE LISTING

<110> 温州医科大学

<120> 一种KIAA1217-RET融合基因

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5158

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> MISC_FEATURE

<223> 多核苷酸

<400> 1

agagcctcgg tggtttgcag cagtggaacc aggcaggccc agttgtgggt aggagaggcc 60

gtcacctgtt gaggcctccc ccccacaccc ccgcatcgcc ctgccctggc agagcccagc 120

ccccagtccc cggagagcgc gcctgaggac ggacggacgg acggacggac agacctaggg 180

acggagggcc aggggcaggg gagatccaag aggccccgcg ctggaatgca gttttctcgg 240

gcgagggaga ctttgcaccg gagtggaaaa tagtttgggg tggggtttcg caccgtcccc 300

tcctccccag ccccgggccc cctcccaggc gctttctggg agcttttaga actgcgctct 360

gaagtttcca gagagcgagg agcttttgcg gcaggcagag acaatggaag aaaatgaaag 420

ccagaaatgt gagccgtgcc ttccttactc agcagacaga agacagatgc aggaacaagg 480

caaaggcaat ctgcatgtaa catcaccaga agatgcagaa tgccgcagaa ccaaggaacg 540

cctttctaat ggaaacagtc gtggttcagt ttccaagtct tcccgcaata tcccaaggag 600

acacacccta ggggggcccc gaagttccaa ggaaatactg ggaatgcaaa catctgagat 660

ggatcggaag agagaagcgt tcctagaaca tctgaagcag aagtaccccc accacgcctc 720

tgcaatcatg ggtcaccaag agaggctgag agaccagaca aggagcccca aactgtctca 780

cagtcctcaa ccacccagtc tgggtgaccc ggtcgagcat ttatcagaga cgtccgctga 840

ttctttggaa gccatgtctg agggggatgc tccaacccct ttttccagag gcagccggac 900

tcgtgcgagc cttcctgtgg tgaggtcaac caaccagacg aaagaaagat ctctgggggt 960

tctctatctc cagtatggag atgaaaccaa gcagctcagg atgccgaatg aaatcacaag 1020

tgcagacaca atccgtgctc tcttcgtaag tgcctttcca cagcagctca ccatgaaaat 1080

gctggaatcg cccagtgtcg ccatttacat caaagatgaa agcagaaatg tctattatga 1140

attaaatgat gtaaggaaca ttcaagacag atcactcctc aaagtgtaca acaaggatcc 1200

tgcacatgcg tttaatcaca caccaaaaac tatgaatgga gacatgagga tgcagagaga 1260

acttgtttat gcaagaggag atggccctgg ggcccctcgc cccggatcta ctgctcatcc 1320

accccatgcg attccaaatt ccccaccgtc tactccagtg ccccattcca tgcccccctc 1380

cccgtccaga attccttatg ggggcacccg ctccatggtt gttcctggca atgccaccat 1440

ccccagggac agaatctcca gcctgccagt ctccagaccc atctctccaa gcccaagcgc 1500

cattttagaa agaagagatg tcaagcctga tgaagacatg agtggcaaaa acattgcaat 1560

gtacagaaat gagggtttct atgctgatcc ttacctttat cacgagggac ggatgagcat 1620

agcctcatcc catggtggac acccactgga tgtccccgac cacatcattg catatcaccg 1680

caccgccatc cggtcagcga gtgcttattg taacccctca atgcaagcgg aaatgcatat 1740

ggaacaatca ctgtacagac agaaatcaag gaaatatccg gatagccatt tgcctacact 1800

gggctccaaa acaccccctg cctctcctca cagagtcagt gacctgagga tgatagacat 1860

gcacgctcac tataatgccc acggcccccc tcacaccatg cagccagacc gggcctctcc 1920

gagccgccag gcctttaaaa aggagccagg caccttggtg tatatagaaa agccacggag 1980

cgctgcagga ttatccagcc ttgtagacct cggccctcct ctaatggaga agcaagtttt 2040

tgcctacagc acggcgacaa tacccaaaga cagagagacc agagagagga tgcaagccat 2100

ggagaaacag attgccagtt taactggcct tgttcagtct gcgcttttta aagggcccat 2160

tacaagttat agcaaagatg cgtctagcga gaaaatgatg aaaaccacag ccaacaggaa 2220

ccacacagat agtgcaggaa cgccccatgt gtctggtggg aagatgctca gtgctctgga 2280

gtccacggtg cctcccagcc agcctccacc tgtgggcacc tcagccatcc acatgagcct 2340

gcttgagatg aggcggagcg tggcggaact caggctccag ctccagcaga tgcggcagct 2400

ccagctgcag aaccaggagt tgctgagggc aatgatgaag aaggccgagc tggaaatcag 2460

tggcaaagtg atggaaacaa tgaagagact ggaggatccc gtgcagcgac agcgcgtcct 2520

agtggagcaa gagagacaaa aatatcttca tgaggaagag aagatcgtca agaagttgtg 2580

cgagttggaa gactttgttg aagacttgaa gaaggactcc acggcagcca gccgattggt 2640

tactctgaaa gacgtggaag acggggcttt cctcctgcgt caagtgggag aggctgtagc 2700

taccctgaaa gatgtggccg aggaggcggg ctgccccctg tcctgtgcag tcagcaagag 2760

acggctggag tgtgaggagt gtggcggcct gggctcccca acaggcaggt gtgagtggag 2820

gcaaggagat ggcaaaggga tcaccaggaa cttctccacc tgctctccca gcaccaagac 2880

ctgccccgac ggccactgcg atgttgtgga gacccaagac atcaacattt gccctcagga 2940

ctgcctccgg ggcagcattg ttgggggaca cgagcctggg gagccccggg ggattaaagc 3000

tggctatggc acctgcaact gcttccctga ggaggagaag tgcttctgcg agcccgaaga 3060

catccaggat ccactgtgcg acgagctgtg ccgcacggtg atcgcagccg ctgtcctctt 3120

ctccttcatc gtctcggtgc tgctgtctgc cttctgcatc cactgctacc acaagtttgc 3180

ccacaagcca cccatctcct cagctgagat gaccttccgg aggcccgccc aggccttccc 3240

ggtcagctac tcctcttccg gtgcccgccg gccctcgctg gactccatgg agaaccaggt 3300

ctccgtggat gccttcaaga tcctggagga tccaaagtgg gaattccctc ggaagaactt 3360

ggttcttgga aaaactctag gagaaggcga atttggaaaa gtggtcaagg caacggcctt 3420

ccatctgaaa ggcagagcag ggtacaccac ggtggccgtg aagatgctga aagagaacgc 3480

ctccccgagt gagctgcgag acctgctgtc agagttcaac gtcctgaagc aggtcaacca 3540

cccacatgtc atcaaattgt atggggcctg cagccaggat ggcccgctcc tcctcatcgt 3600

ggagtacgcc aaatacggct ccctgcgggg cttcctccgc gagagccgca aagtggggcc 3660

tggctacctg ggcagtggag gcagccgcaa ctccagctcc ctggaccacc cggatgagcg 3720

ggccctcacc atgggcgacc tcatctcatt tgcctggcag atctcacagg ggatgcagta 3780

tctggccgag atgaagctcg ttcatcggga cttggcagcc agaaacatcc tggtagctga 3840

ggggcggaag atgaagattt cggatttcgg cttgtcccga gatgtttatg aagaggattc 3900

ctacgtgaag aggagccagg gtcggattcc agttaaatgg atggcaattg aatccctttt 3960

tgatcatatc tacaccacgc aaagtgatgt atggtctttt ggtgtcctgc tgtgggagat 4020

cgtgacccta gggggaaacc cctatcctgg gattcctcct gagcggctct tcaaccttct 4080

gaagaccggc caccggatgg agaggccaga caactgcagc gaggagatgt accgcctgat 4140

gctgcaatgc tggaagcagg agccggacaa aaggccggtg tttgcggaca tcagcaaaga 4200

cctggagaag atgatggtta agaggagaga ctacttggac cttgcggcgt ccactccatc 4260

tgactccctg atttatgacg acggcctctc agaggaggag acaccgctgg tggactgtaa 4320

taatgccccc ctccctcgag ccctcccttc cacatggatt gaaaacaaac tctatggtag 4380

aatttcccat gcatttacta gattctagca ccgctgtccc ctttgcacta tccttcctct 4440

ctgtgatgct ttttaaaaat gtttctggtc tgaacaaaac caaagtctgc tctgaacctt 4500

tttatttgta aatgtctgac tttgcatcca gtttacattt aggcattatt gcaactatgt 4560

ttttctaaaa ggatgtgaaa ataagtgtaa ttaccacatt gcccagcaac ttaggatggt 4620

agaggaaaaa acagatcagg gcggaactct caggggagac caagaacagg ttgaataagg 4680

cgcttctggg gtgggaatca agtcatagta cttctacttt aactaagtgg ataaatatac 4740

aaatctgggg aggtattcag ttgagaaagg agccaccagc accactcagc ctgcactggg 4800

agcacagcca ggttccccca gacccctcct gggcaggcag gtgcctctca gaggccaccc 4860

ggcactggcg agcagccact ggccaagcct cagccccagt cccagccaca tgtcctccat 4920

caggggtagc gaggttgcag gagctggctg gccctgggag gacgcacccc cactgctgtt 4980

ttcacatcct ttcccttacc caccttcagg acggttgtca cttatgaagt cagtgctaaa 5040

gctggagcag ttgctttttg aaagaacatg gtctgtggtg ctgtggtctt acaatggaca 5100

gtaaatatgg ttcttgccaa aactccttct tttgtctttg attaaatact agaaattt 5158

<210> 2

<211> 1334

<212> PRT

<213> 人工

<221> MISC_FEATURE

<223> 多肽

<400> 2

Met Glu Glu Asn Glu Ser Gln Lys Cys Glu Pro Cys Leu Pro Tyr Ser

1 5 10 15

Ala Asp Arg Arg Gln Met Gln Glu Gln Gly Lys Gly Asn Leu His Val

20 25 30

Thr Ser Pro Glu Asp Ala Glu Cys Arg Arg Thr Lys Glu Arg Leu Ser

35 40 45

Asn Gly Asn Ser Arg Gly Ser Val Ser Lys Ser Ser Arg Asn Ile Pro

50 55 60

Arg Arg His Thr Leu Gly Gly Pro Arg Ser Ser Lys Glu Ile Leu Gly

65 70 75 80

Met Gln Thr Ser Glu Met Asp Arg Lys Arg Glu Ala Phe Leu Glu His

85 90 95

Leu Lys Gln Lys Tyr Pro His His Ala Ser Ala Ile Met Gly His Gln

100 105 110

Glu Arg Leu Arg Asp Gln Thr Arg Ser Pro Lys Leu Ser His Ser Pro

115 120 125

Gln Pro Pro Ser Leu Gly Asp Pro Val Glu His Leu Ser Glu Thr Ser

130 135 140

Ala Asp Ser Leu Glu Ala Met Ser Glu Gly Asp Ala Pro Thr Pro Phe

145 150 155 160

Ser Arg Gly Ser Arg Thr Arg Ala Ser Leu Pro Val Val Arg Ser Thr

165 170 175

Asn Gln Thr Lys Glu Arg Ser Leu Gly Val Leu Tyr Leu Gln Tyr Gly

180 185 190

Asp Glu Thr Lys Gln Leu Arg Met Pro Asn Glu Ile Thr Ser Ala Asp

195 200 205

Thr Ile Arg Ala Leu Phe Val Ser Ala Phe Pro Gln Gln Leu Thr Met

210 215 220

Lys Met Leu Glu Ser Pro Ser Val Ala Ile Tyr Ile Lys Asp Glu Ser

225 230 235 240

Arg Asn Val Tyr Tyr Glu Leu Asn Asp Val Arg Asn Ile Gln Asp Arg

245 250 255

Ser Leu Leu Lys Val Tyr Asn Lys Asp Pro Ala His Ala Phe Asn His

260 265 270

Thr Pro Lys Thr Met Asn Gly Asp Met Arg Met Gln Arg Glu Leu Val

275 280 285

Tyr Ala Arg Gly Asp Gly Pro Gly Ala Pro Arg Pro Gly Ser Thr Ala

290 295 300

His Pro Pro His Ala Ile Pro Asn Ser Pro Pro Ser Thr Pro Val Pro

305 310 315 320

His Ser Met Pro Pro Ser Pro Ser Arg Ile Pro Tyr Gly Gly Thr Arg

325 330 335

Ser Met Val Val Pro Gly Asn Ala Thr Ile Pro Arg Asp Arg Ile Ser

340 345 350

Ser Leu Pro Val Ser Arg Pro Ile Ser Pro Ser Pro Ser Ala Ile Leu

355 360 365

Glu Arg Arg Asp Val Lys Pro Asp Glu Asp Met Ser Gly Lys Asn Ile

370 375 380

Ala Met Tyr Arg Asn Glu Gly Phe Tyr Ala Asp Pro Tyr Leu Tyr His

385 390 395 400

Glu Gly Arg Met Ser Ile Ala Ser Ser His Gly Gly His Pro Leu Asp

405 410 415

Val Pro Asp His Ile Ile Ala Tyr His Arg Thr Ala Ile Arg Ser Ala

420 425 430

Ser Ala Tyr Cys Asn Pro Ser Met Gln Ala Glu Met His Met Glu Gln

435 440 445

Ser Leu Tyr Arg Gln Lys Ser Arg Lys Tyr Pro Asp Ser His Leu Pro

450 455 460

Thr Leu Gly Ser Lys Thr Pro Pro Ala Ser Pro His Arg Val Ser Asp

465 470 475 480

Leu Arg Met Ile Asp Met His Ala His Tyr Asn Ala His Gly Pro Pro

485 490 495

His Thr Met Gln Pro Asp Arg Ala Ser Pro Ser Arg Gln Ala Phe Lys

500 505 510

Lys Glu Pro Gly Thr Leu Val Tyr Ile Glu Lys Pro Arg Ser Ala Ala

515 520 525

Gly Leu Ser Ser Leu Val Asp Leu Gly Pro Pro Leu Met Glu Lys Gln

530 535 540

Val Phe Ala Tyr Ser Thr Ala Thr Ile Pro Lys Asp Arg Glu Thr Arg

545 550 555 560

Glu Arg Met Gln Ala Met Glu Lys Gln Ile Ala Ser Leu Thr Gly Leu

565 570 575

Val Gln Ser Ala Leu Phe Lys Gly Pro Ile Thr Ser Tyr Ser Lys Asp

580 585 590

Ala Ser Ser Glu Lys Met Met Lys Thr Thr Ala Asn Arg Asn His Thr

595 600 605

Asp Ser Ala Gly Thr Pro His Val Ser Gly Gly Lys Met Leu Ser Ala

610 615 620

Leu Glu Ser Thr Val Pro Pro Ser Gln Pro Pro Pro Val Gly Thr Ser

625 630 635 640

Ala Ile His Met Ser Leu Leu Glu Met Arg Arg Ser Val Ala Glu Leu

645 650 655

Arg Leu Gln Leu Gln Gln Met Arg Gln Leu Gln Leu Gln Asn Gln Glu

660 665 670

Leu Leu Arg Ala Met Met Lys Lys Ala Glu Leu Glu Ile Ser Gly Lys

675 680 685

Val Met Glu Thr Met Lys Arg Leu Glu Asp Pro Val Gln Arg Gln Arg

690 695 700

Val Leu Val Glu Gln Glu Arg Gln Lys Tyr Leu His Glu Glu Glu Lys

705 710 715 720

Ile Val Lys Lys Leu Cys Glu Leu Glu Asp Phe Val Glu Asp Leu Lys

725 730 735

Lys Asp Ser Thr Ala Ala Ser Arg Leu Val Thr Leu Lys Asp Val Glu

740 745 750

Asp Gly Ala Phe Leu Leu Arg Gln Val Gly Glu Ala Val Ala Thr Leu

755 760 765

Lys Asp Val Ala Glu Glu Ala Gly Cys Pro Leu Ser Cys Ala Val Ser

770 775 780

Lys Arg Arg Leu Glu Cys Glu Glu Cys Gly Gly Leu Gly Ser Pro Thr

785 790 795 800

Gly Arg Cys Glu Trp Arg Gln Gly Asp Gly Lys Gly Ile Thr Arg Asn

805 810 815

Phe Ser Thr Cys Ser Pro Ser Thr Lys Thr Cys Pro Asp Gly His Cys

820 825 830

Asp Val Val Glu Thr Gln Asp Ile Asn Ile Cys Pro Gln Asp Cys Leu

835 840 845

Arg Gly Ser Ile Val Gly Gly His Glu Pro Gly Glu Pro Arg Gly Ile

850 855 860

Lys Ala Gly Tyr Gly Thr Cys Asn Cys Phe Pro Glu Glu Glu Lys Cys

865 870 875 880

Phe Cys Glu Pro Glu Asp Ile Gln Asp Pro Leu Cys Asp Glu Leu Cys

885 890 895

Arg Thr Val Ile Ala Ala Ala Val Leu Phe Ser Phe Ile Val Ser Val

900 905 910

Leu Leu Ser Ala Phe Cys Ile His Cys Tyr His Lys Phe Ala His Lys

915 920 925

Pro Pro Ile Ser Ser Ala Glu Met Thr Phe Arg Arg Pro Ala Gln Ala

930 935 940

Phe Pro Val Ser Tyr Ser Ser Ser Gly Ala Arg Arg Pro Ser Leu Asp

945 950 955 960

Ser Met Glu Asn Gln Val Ser Val Asp Ala Phe Lys Ile Leu Glu Asp

965 970 975

Pro Lys Trp Glu Phe Pro Arg Lys Asn Leu Val Leu Gly Lys Thr Leu

980 985 990

Gly Glu Gly Glu Phe Gly Lys Val Val Lys Ala Thr Ala Phe His Leu

995 1000 1005

Lys Gly Arg Ala Gly Tyr Thr Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys

1010 1015 1020

Glu Asn Ala Ser Pro Ser Glu Leu Arg Asp Leu Leu Ser Glu Phe

1025 1030 1035

Asn Val Leu Lys Gln Val Asn His Pro His Val Ile Lys Leu Tyr

1040 1045 1050

Gly Ala Cys Ser Gln Asp Gly Pro Leu Leu Leu Ile Val Glu Tyr

1055 1060 1065

Ala Lys Tyr Gly Ser Leu Arg Gly Phe Leu Arg Glu Ser Arg Lys

1070 1075 1080

Val Gly Pro Gly Tyr Leu Gly Ser Gly Gly Ser Arg Asn Ser Ser

1085 1090 1095

Ser Leu Asp His Pro Asp Glu Arg Ala Leu Thr Met Gly Asp Leu

1100 1105 1110

Ile Ser Phe Ala Trp Gln Ile Ser Gln Gly Met Gln Tyr Leu Ala

1115 1120 1125

Glu Met Lys Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu

1130 1135 1140

Val Ala Glu Gly Arg Lys Met Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser

1145 1150 1155

Arg Asp Val Tyr Glu Glu Asp Ser Tyr Val Lys Arg Ser Gln Gly

1160 1165 1170

Arg Ile Pro Val Lys Trp Met Ala Ile Glu Ser Leu Phe Asp His

1175 1180 1185

Ile Tyr Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu

1190 1195 1200

Trp Glu Ile Val Thr Leu Gly Gly Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Pro

1205 1210 1215

Pro Glu Arg Leu Phe Asn Leu Leu Lys Thr Gly His Arg Met Glu

1220 1225 1230

Arg Pro Asp Asn Cys Ser Glu Glu Met Tyr Arg Leu Met Leu Gln

1235 1240 1245

Cys Trp Lys Gln Glu Pro Asp Lys Arg Pro Val Phe Ala Asp Ile

1250 1255 1260

Ser Lys Asp Leu Glu Lys Met Met Val Lys Arg Arg Asp Tyr Leu

1265 1270 1275

Asp Leu Ala Ala Ser Thr Pro Ser Asp Ser Leu Ile Tyr Asp Asp

1280 1285 1290

Gly Leu Ser Glu Glu Glu Thr Pro Leu Val Asp Cys Asn Asn Ala

1295 1300 1305

Pro Leu Pro Arg Ala Leu Pro Ser Thr Trp Ile Glu Asn Lys Leu

1310 1315 1320

Tyr Gly Arg Ile Ser His Ala Phe Thr Arg Phe

1325 1330

Claims

1.一种KIAA1217-RET融合基因，其特征在于：该KIAA1217-RET融合基因由KIAA1217基因的第1-11号外显子和RET基因的第8-19号外显子相融合组成，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

2.一种多肽，其特征在于：其由权利要求1所述的KIAA1217-RET融合基因编码产生。