CN105456280A

CN105456280A - 靶向于肌动蛋白结合蛋白Transgelin-2的化合物及其新用途

Info

Publication number: CN105456280A
Application number: CN201410437886.6A
Authority: CN
Inventors: 杨永清; 朱维良; 尹磊淼; 王文倩; 陈照强; 徐志建; 王宇; 徐玉东; 李波
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS; Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS; Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2014-08-29
Filing date: 2014-08-29
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2034-08-29
Also published as: CN105456280B

Abstract

本发明涉及药物研发领域，具体公开了一种靶向于肌动蛋白结合蛋白Transgelin-2的化合物及其新用途。本发明经试验首次揭示了，式（Ⅰ）所示的化合物能够有效地靶向于肌动蛋白结合蛋白Transgelin-2，且具有明显的舒张气道平滑肌细胞的功能，可用于制备舒张气道平滑肌药物，也可用于制备气道平滑肌舒张剂，具有广阔的应用前景。

Description

靶向于肌动蛋白结合蛋白Transgelin-2的化合物及其新用途

技术领域

本发明涉及药物研发领域，具体公开了一种靶向于肌动蛋白结合蛋白Transgelin-2的化合物及其新用途。

背景技术

气道平滑肌收缩力亢进是哮喘病的病理学基础之一，且哮喘患者气道平滑肌反复而持续的收缩痉挛可以导致平滑肌细胞增生和肥大，并可导致气道壁增厚的器质性病变。临床上应用最广的β2肾上腺素能受体激动剂作为控制哮喘急性发作的药物，也通过舒张气道平滑肌细胞起到缓解症状的作用。

肌动蛋白结合蛋白2(Transgelin-2)于1998年首次被发现，其基因定位于染色体1q21-q25，蛋白表达定位在细胞膜、肌动蛋白微丝、胞浆等部位，含1个钙调蛋白同源结构域(calponinhomologdomain)，可以和细胞骨架蛋白等结合。我们研究发现可以将Transgelin-2作为气道平滑肌细胞的受体靶蛋白，筛选出能够舒张气道平滑肌、降低哮喘模型大鼠的气道阻力、改善肺顺应性，和/或治疗气道重塑的药物。

根据由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)规定的名称为：

N-[(4-{[(1Z)-8-methoxy-4,4-dimethyl-4,5-dihydro-1H-[1,2]dithiolo[3,4-c]quinolin-1-ylidene]amino}phenyl)sulfonyl]acetamide的化合物(CID1896138)，国际上尚未有发现其活性的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供结构如式(Ⅰ)所示的化合物(CID1896138)作为有效成分在制备气道平滑肌舒张剂或制备舒张气道平滑肌药物中的新用途。

具体的，结构如式(Ⅰ)所示的化合物(CID1896138)，分子式为C21H21N3O4S3，分子量为475.61，黄色粉末，微溶于水。由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)规定的名称为：

N-[(4-{[(1Z)-8-methoxy-4,4-dimethyl-4,5-dihydro-1H-[1,2]dithiolo[3,4-c]quinolin-1-ylidene]amino}phenyl)sulfonyl]acetamide。

所述化合物(CID1896138)的中文名称为：N-[(4-{[(1Z)-8-甲氧基-4,4-二甲基-4,5-二氢-1H-[1,2]二硫基[3,4-c]喹啉-1-亚基]氨基}苯基)磺酰基]乙酸胺。

本发明的第一方面公开了结构如式(Ⅰ)所示的化合物(CID1896138)作为有效成分在制备气道平滑肌舒张剂中的用途。

较佳的，所述化合物通过靶向于肌动蛋白结合蛋白Transgelin-2起到舒张气道平滑肌的作用。

更佳的，所述用途为结构如式(Ⅰ)所示的化合物(CID1896138)作为唯一有效成分在制备气道平滑肌舒张剂中的用途。

本发明的第二方面公开了结构如式(Ⅰ)所示的化合物(CID1896138)作为有效成分在制备舒张气道平滑肌药物中的用途。

更佳的，所述用途为结构如式(Ⅰ)所示的化合物(CID1896138)作为唯一有效成分在制备舒张气道平滑肌药物中的用途。

进一步的，所述舒张气道平滑肌药物为哮喘治疗药物。

所述化合物(CID1896138)可以直接购买获得。

本发明经实验证实，式(Ⅰ)所示的化合物(CID1896138)能够有效地靶向于肌动蛋白结合蛋白Transgelin-2，且具有明显的舒张气道平滑肌细胞的功能，具有较好的临床应用前景。

本发明第三方面公开了一种舒张气道平滑肌的药物组合物，包含化合物(CID1896138)。

较佳的，所述化合物(CID1896138)为该药物组合物的唯一有效成分。

更进一步的，所述舒张气道平滑肌的药物组合物为哮喘治疗药物。

本发明第四方面公开了一种舒张气道平滑肌的药物制剂，含有安全有效量的化合物(CID1896138)，余量为药学上可接受的载体。

药学上可接受的载体为各种药学上常用的辅料和/或赋形剂，包括(但不限于)糖类(如乳糖、葡萄糖和蔗糖)，淀粉(如玉米淀粉和土豆淀粉)，纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素)，黄蓍胶粉末，麦芽，明胶，滑石，固体润滑剂(如硬脂酸和硬脂酸镁)，硫酸钙，植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油，多元醇(如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇)，海藻酸，乳化剂(如Tween、聚氧乙烯蓖麻油)，润湿剂(如月桂基硫酸钠)，着色剂，调味剂，压片剂、稳定剂，抗氧化剂，防腐剂，无热原水，等渗盐溶液和磷酸盐缓冲液等；该载体可根据需要提高配方的稳定性、活性及生物有效性等。

较优的，所述化合物(CID1896138)占所述药物制剂总质量的0.0004％～99％。

本发明的药物制剂可以按照药剂学上的通用方法制成任何常规的制剂形式。

较优的，本发明所述药物制剂为针剂或喷雾剂。

更优的，所述针剂中药学上可接受的载体选自磷酸盐缓冲溶液或生理盐水。

最优的，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.2～7.4。

进一步的，所述舒张气道平滑肌药物制剂为治疗哮喘的药物制剂。

本发明的有益效果为：

本发明经试验首次揭示了化合物(CID1896138)能够有效地靶向于肌动蛋白结合蛋白Transgelin-2，且具有明显的舒张气道平滑肌细胞的功能，可用于制备舒张气道平滑肌药物，也可用于制备气道平滑肌舒张剂，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：MT2蛋白与Transgelin2蛋白结合曲线

图2：化合物(CID1896138)与Transgelin2蛋白结合曲线

图3：化合物(CID1896138)量效关系曲线

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。

本发明实施例用到的化合物(CID1896138)，可以在SPECS数据库(http://www.specs.net)中搜寻到并直接购买(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi？cid＝1896138)。为方便描述，下述化合物(CID1896138)还可采用TSG12来表示。

实施例1生物分子相互作用分析实验证明化合物(CID1896138)和Transgelin2有效结合1.实验材料

Biacore3000生物分子相互作用分析系统、配套芯片、配套HBS-EP缓冲液、DMSO、超声波脱泡机、小型高速离心机

2.实验流程

1.1仪器准备

开机，更换为HBS-EP缓冲液，插入芯片，使用含HBS-EP缓冲液高速冲洗管路、进样泵、微流控制系统(IFC)。并使用70％甘油进行标准化，使所有通道信号相同。

1.2芯片表面预处理

Transgelin2蛋白PI为8.98866，浓度为1.5mg/mL，分子量为23694.9。

根据Transgelin2的基本信息选择PH＝5.71、10mM醋酸钠溶液对蛋白进行250倍稀释，选用CM5芯片进行氨基偶联。正式偶联时先用EDC/NHS注射对芯片表面进行酯化，用醋酸钠溶液稀释的Transgelin2蛋白和芯片表面的葡聚糖进行氨基偶联，再用乙醇胺封闭芯片上多余的有活性的羧基，偶联成功后再用缓冲液冲洗5次，并使基线走平。

1.3上机检测

先用MT2蛋白上机验证芯片状态良好，平衡解离常数(KD)值为446nM，如图1所示。

Biacore实验TSG12和transgelin2有效结合分组设计：

A.缓冲液阴性对照组

B.MT2蛋白阳性对照组

C.TSG12浓度梯度组(0nM、250nM、500nM、1000nM、25μM、50μM、100μM、)

按照分组设计配置溶液并超声除泡，将HBS-EP缓冲液更换为添加1‰DMSO的HBS-EP缓冲液，冲洗液路后上样检测。

3.实验结果

TSG12和Transgelin2能有效结合，结合曲线如图2所示，平衡解离常数KD值为40.3nM。

实施例2实时无标记细胞分析技术(RTCA)检测化合物(CID1896138)平滑肌细胞抗收缩能力

1.实验材料

1.1.实验对象

大鼠气道平滑肌细胞

1.2.实验仪器

xCELLigence细胞功能分析仪、E-Plate检测板、超净工作台、CO₂培养箱、低速离心机、移液器、细胞计数板、倒置显微镜、混合气瓶(95％O₂，5％CO₂)

2.实验流程

大鼠气道平滑肌细胞传代培养待细胞生长达80％融合后即可进行传代培养，吸去培养液，加D-Hanks液清洗细胞表面3次。弃掉清洗液，加入0.25％胰蛋白酶液，置37℃培养箱3～5min，在倒置显微镜下观察细胞形态，可见细胞成片皱缩变圆呈球状，细胞边缘折光增强。立即加入含胎牛血清的DMEM(高糖)细胞培养液，终止消化，并将细胞从培养瓶表面洗掉，重悬细胞。

2.1E-Plate检测板细胞布板

打开xCELLigence细胞功能分析仪和相关软件，按要求选择选择需要模板并选择布孔方案，按照方案在96孔E-plate检测板对应孔各加入100μL培养液，并上机检测，获得的数据作为基线。

TSG12实时无标记细胞分析技术(RTCA)检测分组：

A.PBS对照组

B.TSG12终浓度0.1μmol

C.TSG12终浓度1μmol

D.TSG12终浓度10μmol

E.TSG12终浓度20μmol

F.TSG12终浓度50μmol

G.TSG12终浓度100μmol

消化大鼠气道平滑肌细胞，用含15％胎牛血清培养液重悬，使细胞悬液密度为每毫升悬液3.3×10⁴个细胞。待基线测定完毕后，每孔加入90μL细胞悬液，约每孔3000个细胞。室温下静置E-plate10min后上机，并放入CO₂培养箱检测过夜，观察细胞增殖数据。

2.2TSG12抗气道平滑肌收缩效应检测

24h后观察细胞增殖数据，待细胞增殖一倍后均一化，每孔加入10μL不同浓度TSG12溶液上清(每孔终浓度分别为0.1μmol，1μmol，10μmol，20μmol，50μmol，100μmol)，每分钟检测一次，共检测30min。

30min后，每孔加入1mM的乙酰胆碱(Ach)4μL，每5s检测一次，共检测30min，观察TSG12抗Ach收缩大鼠气道平滑肌细胞的作用。

3.实验结果

TSG126个测试点中有5个优于PBS(0.1μmol，1μmol，10μmol，50μmol，100μmol)，量效关系曲线拟合计算得EC50＝10.2μmol，拟合曲线见图3。

实时无标记细胞分析技术实验结果说明TSG12能降低Ach刺激的大鼠气道平滑肌细胞收缩的作用，明显舒张气道平滑肌细胞。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.结构如式(Ⅰ)所示的化合物作为有效成分在制备气道平滑肌舒张剂中的用途

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述化合物通过靶向于肌动蛋白结合蛋白Transgelin-2起到舒张气道平滑肌的作用。

3.结构如式(Ⅰ)所示的化合物作为有效成分在制备舒张气道平滑肌药物中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述化合物通过靶向于肌动蛋白结合蛋白Transgelin-2起到舒张气道平滑肌的作用。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述舒张气道平滑肌药物为哮喘治疗药物。

6.一种舒张气道平滑肌的药物组合物，至少包含结构式如式(Ⅰ)所示的化合物。

7.一种舒张气道平滑肌的药物制剂，含有安全有效量的结构式如式(Ⅰ)所示的化合物，余量为药学上可接受的载体。

8.根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为针剂或喷雾剂。

9.根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述针剂中药学上可接受的载体选自磷酸缓冲溶液或生理盐水。

10.权利要求7-9任一权利要求所述的药物制剂，其特征在于，所述舒张气道平滑肌药物制剂为治疗哮喘的药物制剂。