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CN105541994B - 一种血小板生成素或其变体或衍生物的纯化方法 - Google Patents

一种血小板生成素或其变体或衍生物的纯化方法 Download PDF

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CN105541994B CN201510869984.1A CN201510869984A CN105541994B CN 105541994 B CN105541994 B CN 105541994B CN 201510869984 A CN201510869984 A CN 201510869984A CN 105541994 B CN105541994 B CN 105541994B
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Abstract

本发明属生物制药领域，涉及一种血小板生成素或其变体或衍生物的纯化方法，其包括至少一个应用阴离子交换的柱层析步骤，具体包括下列步骤：(1)将部分纯化后或未纯化的血小板生成素或其变体或衍生物与含有季胺基或二乙氨乙基基团的阴离子交换层析填料的层析柱结合；(2)先用含有NaCl、低pH和低电导率的尿素溶液冲洗层析柱来洗脱杂蛋白；(3)再用高pH和高电导率的缓冲溶液冲洗层析柱，由此将血小板生成素从层析柱上分离下来。阴离子交换层析经含有NaCl、低pH和低电导率的尿素溶液洗脱后，杂蛋白明显减少，可有效提高中间体纯度，后续步骤综合收率提高明显。采用本发明的纯化方法纯化的血小板生成素，具有较高的纯度、活性及稳定性。

Description

一种血小板生成素或其变体或衍生物的纯化方法
技术领域
本发明涉及生物制药领域，尤其涉及糖基化蛋白的纯化，特别涉及用低pH和低电导率的尿素溶液洗脱制备糖基化蛋白，例如血小板生成素或其变体或衍生物的方法。
背景技术
血小板生成素(thrombopoietin，TPO)是主要由肝脏和由骨髓调节血小板生成的肾脏产生的糖蛋白激素。它刺激巨核细胞的产生和分化，使骨髓细胞分裂为大量的血小板，从而升高血小板数目。
TPO分子由332个氨基酸组成。TPO分子内有两对二硫键，6个N-键糖基化位点，N连接糖基化出现在176、185、213、234、319、327位的天冬酰胺残基。TPO的变体包括TPO1-163，TPO1-232，TPO1-151，N端缺失1-6个氨基酸的TPO，TPO的衍生物包括聚乙醇化的TPO等。参见中国专利申请No.95190305.5、公开号CN1131438A，在此一并引入本申请，作为申请文件的一部分内容。
真核细胞产生的许多细胞表面蛋白和分泌蛋白，都被一个或更多寡糖基团修饰。这种称为糖基化的修饰能强烈影响蛋白质的理化性质，对蛋白质的稳定性、分泌和亚细胞定位也会起重要作用。正确的糖基化有时是生物活性所必需的。同时药物代谢动力学及药物治疗效果也受到相应的治疗性重组蛋白分子糖基化的影响。因而，哺乳动物细胞、改善细胞的培养条件、定点进行基因序列的突变等，均可使应用于人体治疗的重组蛋白产生不同程度的糖基化，影响重组蛋白药物本身的理化和生物学特性，以及临床效用。
中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)在重组蛋白的表达中，具有较广的应用范围。CHO细胞的糖基化机制与人体细胞的蛋白糖基化机制比较相近，且表达分泌的重组蛋白分子构象正确，直接具有生理活性，错配及聚体出现的可能性较低，细胞表达稳定，后续纯化工艺相对简单，纯度及活性较高。多项试验显示，CHO细胞表达的新型重组人红细胞刺激蛋白为分子量非均一的蛋白分子，同时存在高度糖基化的现象(参考文献1-3)。
由于利用CHO细胞工程细胞表达的血小板生成素糖基化程度并不均一，所以需要后续纯化步骤对糖基化程度不同的异构体进行有效、稳定地分离，以生产质量稳定的产品。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种血小板生成素的纯化方法，该方法具有操作简便、成本低、回收率高、工艺稳定等特点，采用本发明的纯化方法制备的血小板生成素，具有较高的纯度、活性及稳定性。
本发明所述一种血小板生成素或其变体或衍生物的纯化方法，其特征在于，该方法包括至少一个应用阴离子交换的柱层析步骤，其中该阴离子层析柱采用季胺基或二乙氨乙基基团作为配基的填料。
根据本发明，上述柱层析步骤包括低pH和低电导率的尿素溶液洗脱过程，具体步骤为：
(1)、将初步纯化后或未纯化的血小板生成素或其变体或衍生物与阴离子交换层析的层析柱结合；
(2)、使用低pH和低电导率的尿素溶液冲洗层析柱来洗脱杂蛋白；
(3)、用高pH和高电导率的缓冲溶液冲洗层析柱，由此将血小板生成素从层析柱上分离下来。
本发明所述的血小板生成素或其变体或衍生物的纯化方法，其特征在于，该方法包括下列任选3-5个步骤的组合：阳离子交换层析、阴离子交换层析、反相层析、疏水层析、凝胶过滤层析和复合离子交换层析。根据本发明，上述各层析步骤可采用一次、两次或更多次，例如，阴离子交换层析包括阴离子交换层析a，或者阴离子交换层析a与阴离子交换层析b的组合。根据本发明，上述各层析步骤的先后顺序可由本领域技术人员根据经验和需要而任意组合。
根据本发明，阴离子交换层析a采用季胺基或二乙氨乙基作为功能基团的填料，在pH 7.0±0.5(优选pH 7.0±0.2)条件下加样，用pH 4.5±0.5、电导率4.0±1.0mS/cm的尿素溶液洗脱杂蛋白，在pH 7.0±0.5(优选pH7.0±0.2)、电导率16.0±2.0mS/cm条件下洗脱目的蛋白。阴离子交换层析a利用低pH和低电导率的尿素溶液可有效地清洗脱杂蛋白，达到提高纯度的目的。
根据本发明，阳离子交换层析采用磺丙基或羧甲基基团作为配基的填料，疏水层析采用苯基或丁基基团作为配基的填料，反相层析采用丁基基团作为配基的填料，阴离子交换层析a和b各自独立地采用季胺基或二乙氨乙基基团作为配基的填料，凝胶过滤层析采用琼脂糖或葡聚糖作为基质的填料，复合离子交换层析采用同时含有苯基和羧基作为配基的填料。
根据本发明，TPO的变体包括TPO1-163，TPO1-232，TPO1-151，N端缺失1-6个氨基酸的TPO，而TPO的衍生物包括聚乙醇化的TPO等。
在优选方案中，本发明采用含有NaCl(例如，0.04mol/L NaCl)、低pH和低电导率的尿素溶液洗脱杂蛋白，并且采用含有NaCl(例如，0.15mol/L NaCl)、高pH和高电导率的缓冲溶液洗脱目的蛋白。但本领域技术人员容易理解，本发明并不限于NaCl，也可采用LiCl或KCl，只要能提供合适的电导率。
根据本发明，低pH为4.5±0.5，低电导率为4.0±1.0mS/cm；高pH为7.0±0.5，优选7.0±0.2，高电导率为16.0±2.0mS/cm；以及高pH、高电导率的缓冲溶液为含有0.15mol/LNaCl的Tris·HCl缓冲液，其中pH为7.0±0.2、电导率为16.0±2.0mS/cm。但本领域技术人员容易理解，本发明不限于含有NaCl的Tris·HCl缓冲液，也可采用其他常用缓冲液，例如，磷酸盐缓冲液，只要能提供合适的pH和电导率。
根据本发明，血小板生成素为糖基化蛋白，其分子量为70～120kD。
本发明的纯化方法与不含尿素或只含低pH尿素的纯化工艺相比，NaCl在低电导率下与尿素共同作用洗脱杂蛋白可以最大程度地提高中间体纯度，减小后续步骤的纯化压力，显著降低生产成本。
本发明实施例1-5的阴离子交换层析a步骤中使用了加入NaCl的低pH尿素溶液洗脱杂蛋白，NaCl与低pH尿素的共同作用使杂蛋白被充分洗脱，取得了很好的效果。本发明实施例6与实施例1的区别在于阴离子交换层析a步骤中只使用了低pH尿素洗脱杂蛋白，其中未加入NaCl，结果显示最终的样品纯度和总活性收率均不如实施例1理想，尤其是单步目的蛋白纯度相差甚远。
附图说明
为了更清楚地描述本发明的技术方案，下面将结合附图作简要介绍。显而易见，这些附图仅是本申请记载的一些具体实施方式。本发明包括但不限于这些附图。
图1示出实施例1的阳离子交换层析色谱图。
图2示出实施例1的阴离子交换层析a色谱图。
图3示出实施例1的反相层析色谱图。
图4示出实施例1的阴离子交换层析b色谱图。
图5示出实施例1的凝胶过滤层析色谱图。
图6示出实施例2的疏水层析色谱图。
图7示出实施例2的复合离子交换层析色谱图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合实施例对本发明的优选方案进行描述。这些描述只是举例说明本发明的特征和优点，而非限制本发明的保护范围。
实施例1
新型重组人血小板生成素(TPO)工程细胞株，经悬浮培养后收获培养液。本发明中的“培养液”是指，按照本领域常用方法，通过离心、过滤或超滤等手段从细胞及细胞碎片中分离出的含有目的蛋白的培养液。
具体工艺步骤如下：
(1)、阳离子交换层析柱(SP Sepharose FF，5×10cm，200ml)，用0.05mol/L柠檬酸缓冲液(CB，pH 6.0±0.2)平衡10CV(即10倍柱体积)，将收获的培养液上样，上样后用0.05mol/L CB(pH 6.0±0.2)平衡10CV，先用0.05mol/L CB-0.1mol/L NaCl(pH 6.0±0.2)洗脱杂蛋白，再用0.05mol/L CB-0.25mol/L NaCl(pH 6.0±0.2)洗脱目的蛋白(洗脱峰图参见图1)。目的蛋白纯度为39.1％，活性回收率为61.2％。
(2)、阴离子交换层析a柱(Q Sepharose FF，5×10cm，200ml)，用0.02mol/LTris·HCl(pH 7.0±0.2)平衡10CV，将阳离子交换层析活性峰稀释后上样，上样后用0.02mol/L Tris·HCl(pH 7.0±0.2)平衡10CV，接着用6mol/L尿素溶液-0.04mol/L NaCl(pH 4.5±0.5、电导率4.0±1.0mS/cm)洗脱杂蛋白，然后用0.02mol/L Tris·HCl-0.04mol/L NaCl(pH 7.0±0.2、电导率6.0±1.0mS/cm)洗脱尿素，最后用0.02mol/LTris·HCl-0.15mol/L NaCl(pH7.0±0.2、电导率16.0±2.0mS/cm)洗脱目的蛋白(洗脱峰图参见图2)。目的蛋白纯度为81.9％，活性回收率为68.9％。
(3)、反相层析柱(填料为C4，孔径粒径15μm，125ml)，用0.05mol/L Tris·HCl-5％异丙醇(pH 6.5±0.2)平衡10CV，将阴离子交换层析a活性峰上样，上样后用0.05mol/L Tris·HCl-5％异丙醇(pH 6.5±0.2)平衡10CV，先用0.05mol/L Tris·HCl-40％异丙醇(pH 6.5±0.2)洗脱杂蛋白，再用0.05mol/L Tris·HCl-50％异丙醇(pH 6.5±0.2)洗脱目的蛋白(洗脱峰图参见图3)。目的蛋白纯度为93.6％，活性回收率为85.4％。
(4)、阴离子交换层析b柱(Q Sepharose FF，1.6×10cm，20ml)，用0.05mol/LTris·HCl(pH 7.0±0.2)平衡5CV，将反相层析活性峰上样，上样后用0.05mol/L Tris·HCl(pH 7.0±0.2)平衡5CV，接着用0.05mol/L Tris·HCl-0.25mol/L NaCl(pH 7.0±0.2)洗脱目的蛋白(洗脱峰图参见图4)。目的蛋白纯度为96.2％，活性回收率为97.5％。
(5)、凝胶过滤层析柱(Suprose 12，2.6×100cm，530ml)，用0.1mol/L PBS(pH 6.0±0.2、电导率20±5mS/cm)平衡10CV，将阴离子交换层析b活性峰上样，上样后用0.1mol/LPBS(pH 6.0±0.2、电导率20±5mS/cm)平衡，之后收集洗脱目的蛋白(洗脱峰图参见图5)。目的蛋白纯度为99.3％，活性回收率为83.0％。
将培养液按照实施例1进行纯化，最终纯化后的样品纯度为99.3％，总活性回收率为29.1％。
实施例2
新型重组人血小板生成素(TPO)工程细胞株，经悬浮培养后收获培养液。本发明中的“培养液”是指，按照本领域常用方法，通过离心、过滤或超滤等手段从细胞及细胞碎片中分离出的含有目的蛋白的培养液。
具体工艺步骤如下：
(1)、阳离子交换层析柱(SP Sepharose FF，5×10cm，200ml)，用0.05mol/L CB(pH6.0±0.2)平衡10CV，将收获的培养液上样，上样后用0.05mol/L CB(pH 6.0±0.2)平衡10CV，先用0.05mol/L CB-0.1mol/L NaCl(pH 6.0±0.2)洗脱杂蛋白，再用0.05mol/L CB-0.25mol/L NaCl(pH 6.0±0.2)洗脱目的蛋白。
(2)、阴离子交换层析a柱(Q Sepharose FF，5×10cm，200ml)，用0.02mol/LTris·HCl(pH 7.0±0.2)平衡10CV，将阳离子交换层析活性峰稀释后上样，上样后用0.02mol/L Tris·HCl(pH 7.0±0.2)平衡10CV，接着用6mol/L尿素溶液-0.04mol/L NaCl(pH 4.5±0.5、电导率4.0±1.0mS/cm)洗脱杂蛋白，然后用0.02mol/L Tris·HCl-0.04mol/L NaCl(pH 7.0±0.2、电导率6.0±1.0mS/cm)洗脱尿素，最后用0.02mol/LTris·HCl-0.15mol/L NaCl(pH 7.0±0.2、16.0±2.0mS/cm)洗脱目的蛋白。
(3)、疏水层析柱(Phenyl Sepharose FF，5×10cm，200ml)，用1.5mol/L(NH4)2SO4(pH 7.0±0.5)平衡10CV，将阴离子交换层析a活性峰调节电导率后上样，上样后用1.5mol/L(NH4)2SO4(pH 7.0±0.5)平衡10CV，先用0.9mol/L(NH4)2SO4(pH 7.0±0.5)洗脱杂蛋白，再用0.6mol/L(NH4)2SO4(pH7.0±0.5)洗脱目的蛋白(洗脱峰图参见图6)。
(4)、复合离子交换层析柱(Capto MMC，2.6×10cm，53ml)，用0.05mol/L CB-0.15mol/L NaCl(pH 6.0±0.2)平衡10CV，将疏水层析活性峰稀释后上样，上样后用0.05mol/L CB-0.15mol/L NaCl(pH 6.0±0.2)平衡10CV，之后用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)-0.25mol/L NaCl(pH 7.5±0.2)洗脱目的蛋白(洗脱峰图参见图7)。
将培养液按照实施例2进行纯化，最终纯化后的样品纯度为98.7％，总活性回收率为16.2％。
实施例3
新型重组人血小板生成素(TPO)工程细胞株，经悬浮培养后收获培养液。本发明中的“培养液”是指，按照本领域常用方法，通过离心、过滤或超滤等手段从细胞及细胞碎片中分离出的含有目的蛋白的培养液。
具体工艺步骤如下：
(1)、阴离子交换层析a柱(Q Sepharose FF，5×10cm，200ml)，用0.02mol/LTris·HCl(pH 7.0±0.2)平衡10CV，将收获的培养液上样，上样后用0.02mol/L Tris·HCl(pH 7.0±0.2)平衡10CV，接着用6mol/L尿素-0.04mol/L NaCl溶液(pH 4.5±0.5、电导率4.0±1.0mS/cm)洗脱杂蛋白，然后用0.02mol/L Tris·HCl-0.04mol/L NaCl(pH 7.0±0.2、电导率6.0±1.0mS/cm)洗脱尿素，最后用0.02mol/L Tris·HCl-0.15mol/L NaCl(pH7.0±0.2、电导率16.0±2.0mS/cm)洗脱目的蛋白。
(2)、反相层析柱(填料为C4，孔径粒径15μm，125ml)，用0.05mol/L Tris·HCl-5％异丙醇(pH 6.5±0.2)平衡10CV，将阴离子交换层析a活性峰上样，上样后用0.05mol/L Tris·HCl-5％异丙醇(pH 6.5±0.2)平衡10CV，先用0.05mol/L Tris·HCl-40％异丙醇(pH 6.5±0.2)洗脱杂蛋白，再用0.05mol/L Tris·HCl-50％异丙醇(pH 6.5±0.2)洗脱目的蛋白。
(3)、复合离子交换层析柱(Capto MMC，2.6×10cm，53ml)，用0.05mol/L CB-0.15mol/L NaCl(pH 6.0±0.2)平衡10CV，将反相层析活性峰稀释后上样，上样后用0.05mol/L CB-0.15mol/L NaCl(pH 6.0±0.2)平衡10CV，之后用0.05mol/L PBS-0.25mol/L NaCl(pH 7.5±0.2)洗脱目的蛋白。
将培养液按照实施例3进行纯化，最终纯化后的样品纯度为98.4％，总活性回收率为26.9％。
实施例4
新型重组人血小板生成素(TPO)工程细胞株，经悬浮培养后收获培养液。本发明中的“培养液”是指，按照本领域常用方法，通过离心、过滤或超滤等手段从细胞及细胞碎片中分离出的含有目的蛋白的培养液。
具体工艺步骤如下：
(1)、阴离子交换层析a柱(Q Sepharose FF，5×10cm，200ml)，用0.02mol/LTris·HCl(pH 7.0±0.2)平衡10CV，将样品上样，上样后用0.02mol/L Tris·HCl(pH 7.0±0.2)平衡10CV，接着用6mol/L尿素-0.04mol/L NaCl溶液(pH 4.5±0.5、电导率4.0±1.0mS/cm)洗脱杂蛋白，然后用0.02mol/L Tris·HCl-0.04mol/L NaCl(pH 7.0±0.2、电导率6.0±1.0mS/cm)洗脱尿素，最后用0.05mol/L Tris·HCl-0.15mol/L NaCl(pH 7.0±0.2、电导率16.0±2.0mS/cm)洗脱目的蛋白。
(2)、复合离子交换层析柱(Capto MMC，2.6×10cm，53ml)，用0.05mol/L CB-0.15mol/L NaCl(pH 6.0±0.2)平衡10CV，将阴离子交换层析a活性峰稀释后上样，上样后用0.05mol/L CB-0.15mol/L NaCl(pH 6.0±0.2)平衡10CV，然后用0.05mol/L PBS-0.25mol/L NaCl(pH 7.5±0.2)洗脱目的蛋白。
(3)、阴离子交换层析b柱(Q Sepharose FF，1.6×10cm，20ml)，用0.05mol/LTris·HCl(pH 7.0±0.2)平衡5CV，将复合离子交换层析活性峰稀释后上样，上样后用0.05mol/L Tris·HCl(pH 7.0±0.2)平衡5CV，接着用0.05mol/L Tris·HCl-0.25mol/LNaCl(pH 7.0±0.2)洗脱目的蛋白。
(4)、凝胶过滤层析柱(Suprose 12，2.6×100cm，530ml)，用0.1mol/L PBS(pH 6.0±0.2、电导率20±5mS/cm)平衡10CV，将阴离子交换层析b活性峰上样，上样后用0.1mol/LPBS(pH 6.0±0.2、电导率20±5mS/cm)平衡，之后收集洗脱目的蛋白。
将培养液按照实施例4进行纯化，最终纯化后的样品纯度为98.5％，总活性回收率为18.8％。
实施例5
新型重组人血小板生成素(TPO)工程细胞株，经悬浮培养后收获培养液。本发明中的“培养液”是指，按照本领域常用方法，通过离心、过滤或超滤等手段从细胞及细胞碎片中分离出的含有目的蛋白的培养液。
具体工艺步骤如下：
(1)、阴离子交换层析a柱(Q Sepharose FF，5×10cm，200ml)，用0.02mol/LTris·HCl(pH 7.0±0.2)平衡10CV，将样品上样，上样后用0.02mol/L Tris·HCl(pH 7.0±0.2)平衡10CV，接着用6mol/L尿素-0.04mol/L NaCl溶液(pH 4.5±0.5、电导率4.0±1.0mS/cm)洗脱杂蛋白，然后用0.02mol/L Tris·HCl-0.04mol/L NaCl(pH 7.0±0.2、电导率6.0±1.0mS/cm)洗脱尿素，最后用0.02mol/L Tris·HCl-0.15mol/L NaCl(pH 7.0±0.2、电导率16.0±2.0mS/cm)洗脱目的蛋白。
(2)、反相层析柱(填料为C4，孔径粒径15μm，125ml)，用0.05mol/L Tris·HCl-5％异丙醇(pH 6.5±0.2)平衡10CV，将阴离子交换层析a活性峰上样，上样后用0.05mol/L Tris·HCl-5％异丙醇(pH 6.5±0.2)平衡10CV，先用0.05mol/L Tris·HCl-40％异丙醇(pH 6.5±0.2)洗脱杂蛋白，再用0.05mol/L Tris·HCl-50％异丙醇(pH 6.5±0.2)洗脱目的蛋白。
(3)、疏水层析柱(Phenyl Sepharose FF，5×10cm，200ml)，用1.5mol/L(NH4)2SO4(pH 7.0±0.5)平衡10CV，将反相层析活性峰调节电导率后上样，上样后用1.5mol/L(NH4)2SO4(pH 7.0±0.5)平衡10CV，先用0.9mol/L(NH4)2SO4(pH 7.0±0.5)洗脱杂蛋白，再用0.6mol/L(NH4)2SO4(pH 7.0±0.5)洗脱目的蛋白。
将培养液按照实施例5进行纯化，最终纯化后的样品纯度为98.0％，总活性回收率为19.5％。
实施例6
新型重组人血小板生成素(TPO)工程细胞株，经悬浮培养后收获培养液。本发明中的“培养液”是指，按照本领域常用方法，通过离心、过滤或超滤等手段从细胞及细胞碎片中分离出的含有目的蛋白的培养液。
具体工艺步骤如下：
(1)、阳离子交换层析柱(SP Sepharose FF，5×10cm，200ml)，用0.05mol/L CB(pH6.0±0.2)平衡10CV(即10倍柱体积)，将收获的培养液上样，上样后用0.05mol/L CB(pH6.0±0.2)平衡10CV，先用0.05mol/L CB-0.1mol/L NaCl(pH 6.0±0.2)洗脱杂蛋白，再用0.05mol/L CB-0.25mol/L NaCl(pH 6.0±0.2)洗脱目的蛋白。目的蛋白纯度为38.9％，活性回收率61.5％。
(2)、阴离子交换层析a柱(Q Sepharose FF，5×10cm，200ml)，用0.02mol/LTris·HCl(pH 7.0±0.2)平衡10CV，将阳离子交换层析活性峰稀释后上样，上样后用0.02mol/L Tris·HCl(pH 7.0±0.2)平衡10CV，接着用6mol/L尿素溶液(pH 4.5±0.5)洗脱杂蛋白，然后用0.02mol/L Tris·HCl-0.04mol/L NaCl(pH 7.0±0.2、电导率6.0±1.0mS/cm)洗脱尿素，最后用0.02mol/L Tris·HCl-0.15mol/L NaCl(pH 7.0±0.2、电导率16.0±2.0mS/cm)洗脱目的蛋白。目的蛋白纯度为50.2％，活性回收率为82.5％。
(3)、反相层析柱(填料为C4，孔径粒径15μm，125ml)，用0.05mol/L Tris·HCl-5％异丙醇(pH 6.5±0.2)平衡10CV，将阴离子交换层析a活性峰上样，上样后用0.05mol/L Tris·HCl-5％异丙醇(pH 6.5±0.2)平衡10CV，先用0.05mol/L Tris·HCl-40％异丙醇(pH 6.5±0.2)洗脱杂蛋白，再用0.05mol/L Tris·HCl-50％异丙醇(pH 6.5±0.2)洗脱目的蛋白。目的蛋白纯度为82.6％，活性回收率为40.7％。
(4)、阴离子交换层析b柱(Q Sepharose FF，1.6×10cm，20ml)，用0.05mol/LTris·HCl(pH 7.0±0.2)平衡5CV，将反相层析活性峰上样，上样后用0.05mol/L Tris·HCl(pH 7.0±0.2)平衡5CV，接着用0.05mol/L Tris·HCl-0.25mol/L NaCl(pH 7.0±0.2)洗脱目的蛋白。目的蛋白纯度为94.3％，活性回收率为96.9％。
(5)、凝胶过滤层析柱(Suprose 12，2.6×100cm，530ml)，用0.1mol/L PBS(pH 6.0±0.2、电导率20±5mS/cm)平衡10CV，将阴离子交换层析b活性峰上样，上样后用0.1mol/LPBS(pH 6.0±0.2、电导率20±5mS/cm)平衡，之后收集洗脱目的蛋白。目的蛋白纯度为98.1％，活性回收率为84.1％。
将培养液按照实施例6进行纯化，最终纯化后的样品纯度为98.1％，总活性回收率为16.8％。
利用上述实施例1-6中描述的纯化方法纯化后的样品经SDS-PAGE和HPLC检测，纯度均大于98％，外源DNA残留量<100pg/15000IU，CHO细胞蛋白残留量<0.05％，细菌内毒素<2EU/10000U。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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Claims (1)

1.一种血小板生成素的纯化方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)将填料为含羧甲基的琼脂糖的阳离子交换层析柱用pH6.0±0.2的柠檬酸缓冲液平衡，待纯化的血小板生成素上样后用pH6.0±0.2的柠檬酸缓冲液平衡，用pH6.0±0.2的含有0.1mol/L NaCl的柠檬酸缓冲液洗脱杂蛋白，再用pH6.0±0.2的含有0.25mol/L NaCl的柠檬酸缓冲液洗脱目的蛋白；
(2)将填料为含季胺基的琼脂糖的阴离子层析a柱用pH7.0±0.2的Tris·HCl缓冲液平衡，将步骤(1)活性峰上样后用pH7.0±0.2的Tris·HCl缓冲液平衡，接着用pH4.5±0.5、电导率4.0±1.0mS/cm的含有0.04mol/L NaCl的6mol/L尿素溶液洗脱杂蛋白，然后用pH7.0±0.2、电导率6.0±1.0mS/cm的含有0.04mol/L NaCl的Tris·HCl缓冲液洗脱尿素，最后用pH7.0±0.2、电导率16.0±2.0mS/cm的含有0.15mol/L NaCl的Tris·HCl洗脱目的蛋白；
(3)将填料为C4的反相层析柱用pH6.5±0.2的含有5％异丙醇的Tris·HCl缓冲液平衡，将步骤(2)活性峰上样后用pH6.5±0.2的含有5％异丙醇的Tris·HCl缓冲液平衡，先用pH6.5±0.2的含有40％异丙醇的Tris·HCl缓冲液洗脱杂蛋白，再用pH6.5±0.2的含有50％异丙醇的Tris·HCl缓冲液洗脱目的蛋白；
(4)将填料为季胺基的琼脂糖阴离子交换层析b柱用pH7.0±0.2的Tris·HCl缓冲液平衡，将步骤(3)活性峰上样后用pH7.0±0.2的Tris·HCl缓冲液平衡，用pH7.0±0.2的含有0.25mol/L NaCl的Tris·HCl缓冲液洗脱目的蛋白；
(5)凝胶过滤层析柱采用琼脂糖为基架的填料，该凝胶过滤层析柱用pH6.0±0.2、电导率20±5mS/cm的PBS平衡，将步骤(4)活性峰上样后用pH6.0±0.2、电导率20±5mS/cm的PBS平衡，之后收集洗脱目的蛋白。
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