CN105647844A - 一种利用木糖生产乙醇酸的重组菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用木糖生产乙醇酸的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明提供的利用木糖生产乙醇酸的重组菌中过表达木糖脱氢酶基因，木糖酸内酯酶基因，木糖酸脱水酶基因，3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因和乙醇醛脱氢酶基因。同时，本发明还提供了该重组菌的制备方法及利用该重组菌的生产乙醇酸的方法。本发明首次实现了以D-木糖为碳源，经乙醇醛转化形成乙醇酸的生物合成路径。

Description

一种利用木糖生产乙醇酸的重组菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种利用木糖生产乙醇酸的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

有机酸是目前市场需要非常大的一类化合物，每年生产的有机酸约数百万吨，应用于食品、医药、化妆品、化工等众多领域。同时有机酸也是利用代谢改造微生物合成的一类重要的生物基产品。乙醇酸是一种最简单的α-羟基酸，在众多领域中都有重要的使用价值，例如在化妆品行业：乙醇酸可以有效保护皮肤的柔韧性，提高皮肤的抗病性；乙醇酸复合金属离子后能够作为一种去污清洁剂；乙醇酸的单聚体或者与其他有机酸的多聚体可以作为性能良好的塑料，具有广泛的工业应用价值。

目前乙醇酸的化学合成法主要通过高温高压条件下甲醛羧化形成，生物法主要通过转化乙二醇或者乙醛酸形成乙醇酸。化学合成的条件严苛，耗能大，污染严重，而生物法合成由于污染小、原料可再生等优势越来越受到重视。目前微生物法利用的碳源主要是植物衍生的糖类和淀粉，然而木质纤维素原料的应用也是人们普遍重视的、未来生物技术的重要研究方向。木质纤维素的主要组成成分为D-葡萄糖和D-木糖，D-葡萄糖能够被多数微生物代谢形成目标产品，而D-木糖的利用范围相对较小，仅有少数微生物能够代谢，鉴于此原因，代谢工程改造仍然集中于以葡萄糖为底物的生物合成途径的研究。D-木糖作为木质纤维素的重要成分，来源广泛、成本低，以D-木糖作为底物，生物法合成乙醇酸的研究具有重要的科学和应用价值。但是现有技术中尚没有以木糖为底物，利用该途径成功合成乙醇酸的报道。

发明内容

为实现利用生物法以木糖为原料合成乙醇酸，本发明提供了一种利用木糖生产乙醇酸的重组菌，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种利用木糖生产乙醇酸的重组菌，该重组菌过表达木糖脱氢酶基因，木糖酸内酯酶基因，木糖酸脱水酶基因，3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因和乙醇醛脱氢酶基因。

优选地，所述木糖脱氢酶基因，为来源于新月丙杆菌(Caulobactercrescentus)的木糖脱氢酶基因xdh；所述木糖酸内酯酶基因，为来源于新月丙杆菌(Caulobactercrescentus)的木糖酸内酯酶基因xylC；所述木糖酸脱水酶基因，为来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的木糖酸脱水酶基因yjhG；所述3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因，为来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH；所述乙醛酸脱氢酶基因，为来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的乙醇醛脱氢酶基因aldA。

本发明的另一目的是提供一种所述重组菌的构建方法，该方法的步骤如下：

1)克隆获得木糖脱氢酶基因xdh，木糖酸内酯酶基因xylC，木糖酸脱水酶基因yjhG，3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH，乙醇醛脱氢酶基因aldA；

2)将步骤1)所得的木糖脱氢酶基因xdh，木糖酸内酯酶基因xylC和3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH连接到质粒载体，获得重组质粒I；

3)将步骤1)所得的木糖酸脱水酶基因yjhG和乙醇醛脱氢酶基因aldA连接到质粒载体上，获得重组质粒II；

4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到宿主细胞，获得重组菌。

优选地，步骤2)所述质粒载体，为质粒pETDuet-1。

优选地，步骤3)所述质粒载体，为质粒pACYCDuet-1。

优选地，步骤4)所述宿主细胞，为大肠杆菌BL21(DE3)。

所述方法的具体步骤如下：

1)以新月柄杆菌的基因组DNA为模板，设计引物分别克隆木糖脱氢酶基因xdh，木糖酸内酯酶基因xylC；以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，设计引物分别克隆木糖酸脱水酶基因yjhG，3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH和乙醇醛脱氢酶基因aldA；

2)将步骤1)所得的脱氢酶基因xdh，木糖酸内酯酶基因xylC和3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH连接到质粒pETDuet-1上，获得重组质粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC；

3)将步骤1)木糖酸脱水酶基因yjhG和乙醇醛脱氢酶基因aldA连接到质粒pACYCDuet-1上，获得重组质粒pACYCDuet-1-aldA-yjhG；

4)将步骤2)所得的重组质粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC，将步骤3)获得重组质粒pACYCDuet-1-aldA-yjhG同时导入受体细胞E.coliBL21(DE3)，获得重组菌。

优选地，所述方法步骤1)中所述木糖脱氢酶基因xdh的GeneID为7329904；所述木糖酸内酯酶基因xylC的GeneID为7329903；所述木糖酸脱水酶基因yjhG的GeneID为946829；所述3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH的GeneID为948825；所述乙醇醛脱氢酶基因aldA的GeneID为945672。

优选地，所述方法步骤1)中克隆木糖脱氢酶基因xdh所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.2所示；克隆木糖酸内酯酶基因xylC所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3-SEQIDNO.4所示；克隆木糖酸脱水酶基因yjhG所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5-SEQIDNO.6所示；克隆3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.7-SEQIDNO.8所示；克隆乙醇醛脱氢酶基因aldA所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.9-SEQIDNO.10所示。

所述重组菌在发酵生产乙醇酸中的应用在本发明的保护范围之内。

所述应用的步骤如下：

1)活化权利要求1或2所述的重组菌，获得活化重组菌；

2)将步骤1)所得的活化重组菌接种到含有氨苄青霉素和氯霉素的M9液体培养基中进行发酵培养。

优选地，所述应用中步骤2)所述发酵培养，是按1％的接种量接种，在37℃，180rpm的条件下培养至OD₆₀₀达到1.0时，加入100μM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，诱导后置于30℃，180rpm的条件下继续培养48h后终止发酵。

所述重组载体导入宿主菌的方法采用热激转化法。

本发明获得的有益效果是：

本发明以大肠杆菌这种模式菌株为宿主菌，实现了以D-木糖为底物，合成得到乙醇酸，为D-木糖的生物利用以及乙醇酸的微生物合成提供了新的技术方法。

本发明通过在大肠杆菌中过表达新月丙杆菌的木糖脱氢酶基因xdh和木糖酸内酯酶基因xylC；同时过表达大肠杆菌MG1655的木糖酸脱水酶基因yjhG，3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH和乙醇醛脱氢酶基因aldA，首次实现以D-木糖为碳源，经乙醇醛转化形成乙醇酸的生物合成路径。

定义和缩写

在本发明中使用下列的缩写或简称：

木糖脱氢酶基因：xdh

木糖酸内酯酶基因：xylC

木糖酸脱水酶基因：yjhG

3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因：yjhH

乙醇醛脱氢酶基因：aldA

大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)：E.coli

新月丙杆菌(Caulobactercrescentus)：C.crescentus

“热激转化”或“热转化”指分子生物学中转染技术的一种，用来将外来基因整合到宿主基因中并稳定表达，其利用受到热激后，细胞膜出现裂隙，将外来基因导入宿主基因或将外来质粒导入宿主原生质体，又热激转化或热转化等。

“过量表达”或“过表达”指特定的基因在生物体中大量表达，表达量超过正常水平(即，野生型表达水平)，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。

附图说明

图1为利用木糖合成乙醇酸的代谢途径示意图。

图2为重组大肠杆菌发酵产物的高效液相色谱检测；

(图中，A为标准品；B为实验组检测发酵产物；其中箭头所指的色谱峰为乙醇酸)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

所用酶试剂购自MBIFermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。

培养基配方：

1)种子液摇瓶培养基

LB培养基：5g/L酵母粉，10g/LNaCl，10g/L蛋白胨，其余为水，121℃，20min灭菌。

2)发酵生产摇瓶培养基

M9培养基：10g/LD-xylose,14g/LK₂HPO4·3H₂O,5.2g/LKH₂PO₄,1g/LNaCl,1g/LNH₄Cl,0.25g/LMgSO₄·7H₂O,0.2g/Lyeastextract,20g/Lglucose.

在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100mg/L的氨苄青霉素和50mg/L的氯霉素。

实施例1外源基因的克隆

木糖脱氢酶基因：(xdh)(GeneID:7329904)的克隆是以C.crescentus为模板，通过PCR扩增获得，引物序列为：xdh-F5'-GGGAATTCCATATGTCCTCAGCCATCTATCCC-3'，xdh-R5'-CGGGGTACCTCAACGCCAGCCGGCGTCGAT-3'；木糖酸内酯酶基因(xylC)(GeneID:7329903)的克隆是以C.crescentus为模板，通过PCR扩增获得，引物序列为：

xylC-F5'-CCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGGAATTG-3'，xylC-R5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAAACCAGACGAACTTCGTGCTG-3'；木糖酸脱水酶基因(yjhG)(GeneID:946829)克隆是以E.coli为模板，通过PCR扩增获得，引物序列为：yjhG-F5'-GGAATTCCATATGTCTGTTCGCAATATTTTTGC-3'，yjhG-R5'-CCGCTCGAGTCAGTTTTTATTCATAAAATCGCG-3'；3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因(yjhH)(GeneID:948825)克隆是以E.coli为模板，通过PCR扩增获得，引物序列为：yjhH-F5'-CCGCCATGGCATGAAAAAATTCAGCGGCAT-3'，yjhH-R5'-CCGGAATTCTCAGACTGGTAAAATGCCCT-3'；乙醇醛脱氢酶基因(aldA)(GeneID:945672)克隆是以E.coli为模板，通过PCR扩增获得，引物序列为：aldA-F5'-CCGCCATGGGATGTCAGTACCCGTTCAACA-3'，aldA-R5'-CCGGAATTCTTAAGACTGTAAATAAACCA-3'；克隆获得基因利用胶回收试剂盒回收目的片段。

实施例2重组质粒的构建

1.重组质粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC的构建过程

1)实施例1克隆所得的木糖脱氢酶基因xdh与载体pETDuet-1经NdeI、KpnI双酶切后，利用回收试剂盒回收酶切后目的片段xdh和载体pETDuet-1，再进行连接，连接产物转化E.coliDH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pETDuet-1-xdh；

2)实施例1克隆所得xylC基因与重组质粒pETDuet-1-xdh经EcoRI、NotI双酶切后，利用回收试剂盒回收酶切后目的片段xylC和载体pETDuet-1-xdh，再进行连接，连接产物转化E.coliDH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pETDuet-1-xdh-xylC；

3)实施例1克隆所得yjhH基因与重组质粒pETDuet-1-xdh-xylC经EcoRI、NcoI双酶切后，利用回收试剂盒回收酶切后目的片段yjhH和载体pETDuet-1-xdh-xylC，再进行连接，连接产物转化E.coliDH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC；

2.重组质粒pACYCDuet-1-aldA-yjhG

1)实施例1克隆所得的木糖脱氢酶基因yjhG与载体pACYCDuet-1经NdeI、xhoI双酶切后，利用回收试剂盒回收酶切后目的片段yjhG和载体pACYCDuet-1，再进行连接，连接产物转化E.coliDH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pETDuet-1-yjhG；

2)实施例1克隆所得aldA基因与重组质粒pETDuet-1-yjhG经EcoRI、NcoI双酶切后，利用回收试剂盒回收酶切后目的片段aldA和载体pETDuet-1-yjhG，再进行连接，连接产物转化E.coliDH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pACYCDuet-1-aldA-yjhG；

实施例3重组菌株构建

按照TAKARA感受态制备试剂盒的操作步骤制备野生型对照菌株E.coliBL21(DE3)感受态，将重组质粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC和pACYCDuet-1-aldA-yjhG通过热激法转化至宿主菌株E.coliBL21(DE3)感受态细胞，得到重组菌株，编号为ZG-2562。

实施例4重组菌株的摇瓶发酵试验

本实施例共进行三组实验，三组实验的其他条件均相同，不同之处具体如下：

对照组1：野生菌株E.coliBL21(DE3)，以木糖为碳源，进行发酵；

对照组2：重组菌株ZG-2562，以甘油为碳源进行发酵；

实验组：重组菌株ZG-2562，以木糖为碳源进行发酵。具体的发酵过程如下：

(1)将活化后的野生菌株及重组菌株ZG-2562按1:100的比例接种到含有50mL的M9改良液体培养基的250mL摇瓶中(内含100mg/L的氨苄青霉素和50mg/L的氯霉素)，其中对照组2加入10g/L甘油，其余两组加入10g/L木糖。37℃、180rpm条件下振荡培养。OD₆₀₀达到1.0左右时，加入100μM/LIPTG诱导表达，诱导后置于30℃、180rpm继续培养48h至发酵结束。

(2)取1mL发酵液，4℃，12000rpm离心10min，取上清，用高效液相色谱检测发酵产物。

(3)液相色谱(图2)证实实验组得到了产物乙醇酸；在250mL摇瓶发酵水平，工程菌株ZG-2562完全以木糖为碳源，乙醇酸的产量为2.1g/L，转化率为46％。对照组1和对照组2均没有检测到乙醇酸。由此表明，在不含有本发明的乙醇酸合成途径时，野生菌株以木糖为底物无法通过其他途径合成乙醇酸。此外，即使含有本发明的合成途径，无木糖存在时，重组菌株也无法合成乙醇酸。本发明是以木糖为底物合成乙醇酸的一种新型的，高效的代谢途径。

本领域技术人员应该理解，上述各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行；上述过量表达的5种基因共同克隆到大肠杆菌(E.coli)中，各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种利用木糖生产乙醇酸的重组菌，其特征在于，过表达木糖脱氢酶基因，木糖酸内酯酶基因，木糖酸脱水酶基因，3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因和乙醇醛脱氢酶基因。

2.权利要求1所述重组菌，其特征在于，所述木糖脱氢酶基因，为来源于新月丙杆菌(Caulobactercrescentus)的木糖脱氢酶基因xdh；所述木糖酸内酯酶基因，为来源于新月丙杆菌(Caulobactercrescentus)的木糖酸内酯酶基因xylC；所述木糖酸脱水酶基因，为来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的木糖酸脱水酶基因yjhG；所述3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因，为来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH；所述乙醛酸脱氢酶基因，为来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的乙醇醛脱氢酶基因aldA。

3.一种权利要求1或2所述重组菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

1)克隆获得木糖脱氢酶基因xdh，木糖酸内酯酶基因xylC，木糖酸脱水酶基因yjhG，3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH，乙醇醛脱氢酶基因aldA；

2)将步骤1)所得的木糖脱氢酶基因xdh，木糖酸内酯酶基因xylC和3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH连接到质粒载体，获得重组质粒I；

3)将步骤1)所得的木糖酸脱水酶基因yjhG和乙醇醛脱氢酶基因aldA连接到质粒载体上，获得重组质粒II；

4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到宿主细胞，获得重组菌。

4.权利要求3所述构建方法，其特征在于，步骤2)所述质粒载体，为质粒pETDuet-1。

5.权利要求3所述方法，其特征在于，步骤3)所述质粒载体，为质粒pACYCDuet-1。

6.权利要求3所述方法，其特征在于，步骤4)所述宿主细胞，为大肠杆菌BL21(DE3)。

7.权利要求3所述方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)以新月柄杆菌的基因组DNA为模板，设计引物分别克隆木糖脱氢酶基因xdh，木糖酸内酯酶基因xylC；以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，设计引物分别克隆木糖酸脱水酶基因yjhG，3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH和乙醇醛脱氢酶基因aldA；

2)将步骤1)所得的脱氢酶基因xdh，木糖酸内酯酶基因xylC和3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH连接到质粒pETDuet-1上，获得重组质粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC；

3)将步骤1)木糖酸脱水酶基因yjhG和乙醇醛脱氢酶基因aldA连接到质粒pACYCDuet-1上，获得重组质粒pACYCDuet-1-aldA-yjhG；

4)将步骤2)所得的重组质粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC，将步骤3)获得重组质粒pACYCDuet-1-aldA-yjhG同时导入受体细胞E.coliBL21(DE3)，获得重组菌。

8.权利要求1或2所述重组菌在发酵生产乙醇酸中的应用。

9.权利要求8所述应用，其特征在于，步骤如下：

1)活化权利要求1或2所述的重组菌，获得活化重组菌；

2)将步骤1)所得的活化重组菌接种到含有氨苄青霉素和氯霉素的M9液体培养基中进行发酵培养。

10.权利要求9所述应用，其特征在于，步骤2)所述发酵培养，是按1％的接种量接种，在37℃，180rpm的条件下培养至OD₆₀₀达到1.0时，加入100μM异丙基硫代半乳糖苷诱导，诱导后置于30℃，180rpm的条件下继续培养48h后终止发酵。