CN106085969A - 表面展示猪流行性腹泻病毒s蛋白的重组杆状病毒 - Google Patents

Abstract

本发明提供表面展示猪流行性腹泻病毒S蛋白的重组杆状病毒及其制备方法，该病毒以PEDV纤突蛋白S1基因为抗原基因，利用昆虫杆状病毒载体表达系统构建重组病毒，成功表达并展示S1蛋白于病毒表面。以该重组病毒作为PEDV伪病毒疫苗免疫接种小鼠，血清中和试验及淋巴细胞增殖实验分析表明该重组病毒能够激起有效的免疫保护作用。

Description

表面展示猪流行性腹泻病毒S蛋白的重组杆状病毒

技术领域

本发明涉及基因工程疫苗技术领域，具体涉及一种表面展示猪流行性腹泻病毒S蛋白的重组杆状病毒，以及该重组杆状病毒的制备方法。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirus,PEDV)引起的一种以水样腹泻、脱水、呕吐和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的高度接触性肠道传染病。该病于1971年在英国首次暴发，1978年，比利时首次确认病原并报道，此后匈牙利、德国、日本、中国、韩国、越南等多个国家地区相继发生。2013-2014年，在美国、加拿大、古巴、墨西哥中西部和日本也出现PED疫情，死亡率异常高，给各国养猪业造成严重经济损失。

猪流行腹泻是全球性猪流行病，多发于冬季及早春季节，夏季时有发生，各年龄段猪均易感染，但不同年龄易感猪的致死率不同，其中仔猪的感染率较高可达80-100％。该病主要感染途径是消化道，发病猪和带毒猪是主要传染源，康复猪会持续带毒，并不断地排出带有PEDV粪便，污染环境和饲料。一旦感染PEDV，猪肠绒毛上皮细胞便会遭到瓦解，猪空肠和回肠绒毛萎缩，各阶段日龄猪发生肠炎，产生水样腹泻，引起仔猪死亡，并使肥育猪增重降低。

猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒科，冠状病毒属，具有典型的冠状病毒形态。病毒粒子为多型性，倾向球状，外周包裹囊膜，囊膜上覆有放射状纤突，平均直径约为130nm。S蛋白即为伸出PEDV囊膜的20nm球杆形糖蛋白，分子量为180-220kDa，预测有1383个氨基酸组成，富含半胱氨酸，并含有29个潜在N-糖基化位点，与其他冠状病毒S蛋白结构相似。在pH4.0，溶解度达最大，因N-糖基化位点在病毒粒子成熟后不能被细胞蛋白酶切割，降低了病毒的细胞融合力和感染力，是PEDV人工细胞培养困难的原因。根据与其它冠状病毒S蛋白保守序列的相似性，PEDV S蛋白被划分为S1(1-789aa)和S2(790-1383aa)两个结构域。其中S1区位于病毒表面，主要识别受体并与宿主细胞受体结合，介导中和抗体产生。S2区负责病毒囊膜与宿主细胞膜的融合，将病毒遗传物质RNA导入宿主细胞内，从而引起细胞感染。S蛋白也是诱导宿主体液免疫反应的 免疫原蛋白，目前研发的冠状病毒基因工程疫苗，目标抗原基因选择常集中在S基因上。

随着国内外猪流行性腹泻疫情的扩大、蔓延及持续发生，养猪业发展面临极大威胁。目前市场上获批的用于预防及控制猪流行性腹泻的疫苗多为传统PEDV弱毒苗和灭活苗，然而此类疫苗因存在诸多缺陷，制备费时费力、灭活疫苗自身免疫保护力较弱及一旦灭活不完全，存在散毒风险、弱毒苗疫苗出现毒株毒力反强、野毒变异株的出现等，使其无法及时安全有效地预防和控制PED疫情的流行。随着分子生物学技术研究的不断深入及基因工程疫苗的安全、高效、副作用小、表达量高、可工业化生产等优点，研究者开始将PEDV疫苗的研发转向具有潜在优势的基因工程疫苗。

随着全球PED疫情的不断扩大和蔓延，人们相继开展了PEDV乳酸杆菌疫苗、转基因植物疫苗、核酸疫苗等开发研究。然而这些疫苗存在持久性差、表达水平低、稳定性差、易被胃肠道消化、整合宿主染色体、致突变等诸多问题。鉴于此，通过新平台开展PEDV新型疫苗的研发十分必要。

发明内容

本发明以PEDV S1基因作为抗原基因，利用杆状病毒表达载体系统克隆PEDV全长S1基因，成功构建重组杆状病毒，表达并展示S1蛋白于昆虫细胞和杆状病毒囊膜表面。进一步，利用展示S1蛋白的杆状病毒作为病毒活载体疫苗免疫小鼠，分析表明该重组杆状病毒病毒能够激起有效的免疫保护作用。

本发明所采用的技术方案为：

一种表面展示猪流行性腹泻病毒S蛋白的重组杆状病毒，该病毒通过以下步骤构建而成：

(1)根据猪流行性腹泻病毒CV777株(Genbank Accession Number：AF353511)S蛋白氨基酸序列，对S1区21-789位氨基酸的核酸序列进行优化，并人工合成包含该S1基因的DNA序列SP-S1-TMD，如SEQ ID NO.1所示，其中4-60位碱基序列为杆状病毒AcNPV GP64蛋白信号肽编码序列(SP)，61-2367位碱基序列为PEDV S1蛋白编码序列，2368-2577位碱基序列为疱疹病毒G蛋白的跨膜结构域(TMD)编码序列；

(2)将SP-S1-TMD片段插入到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体的多克隆位点，构建重组质粒；

(3)转化DH10Bac感受态细胞，蓝白斑筛选重组克隆；

(4)将重组克隆转染昆虫细胞，培养后得到表面展示猪流行性腹泻病毒S蛋白的重组杆状病毒。

所述步骤(2)中Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体为pFastBac系列载体中的一种。

所述步骤(2)中构建重组质粒包括以下步骤：

(a)以SP-S1-TMD片段片段为模板，设计上游引物和下游引物，然后进行PCR扩增；

(b)对转移载体和PCR片段分别进行双酶切，然后连接，构建重组质粒。

所述步骤(a)中上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示。

所述步骤(a)中PCR扩增的反应体系如下：

所述步骤(a)中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸3min，循环反应30次；最后68℃延伸10min。

所述步骤(b)中双酶切使用的内切酶为BamHI和HindIII。

所述步骤(4)中昆虫细胞为Sf9、Sf21、Tn5、Tn368、High Five细胞中的一种。

本发明进一步提供上述表面展示猪流行性腹泻病毒S蛋白的重组杆状病毒在作为猪流行性腹泻疫苗中的应用。该重组杆状病毒感染昆虫细胞即可大量获得，可直接作为病毒疫苗免疫小鼠，达到免疫目的。

杆状病毒表达载体系统是近年来发展起来的真核表达系统。相对于以大肠杆菌为代表的原核表达系统和酵母、哺乳动物细胞的真核表达系统具有安全，翻译后修饰，表达水平高，克隆容量大等优点。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和显著效果：

(1)本发明利用昆虫杆状病毒表面展示系统成功构建克隆PEDV S1基因的重组杆状病毒，该病毒能够表达并展示S1蛋白于昆虫细胞和杆状病毒囊膜表面，PEDV S1基因前后分别连接杆状病毒AcNPV GP64蛋白信号肽编码序列和疱疹病毒G蛋白的跨膜结构域编码序列，有利于提高目的蛋白表面展示效果；

(2)对PEDV S1基因进行优化，使更有利于翻译，提高蛋白表达量，且真核表达系统的应用使表达蛋白具有糖基化修饰，更接近天然PEDV S1蛋白，有利于提高免疫效果；

(3)本发明重组病毒能够诱导产生较高水平抗PEDV特异性抗体，免疫血清具有一定PEDV中和能力，重组病毒也能够诱导脾淋巴细胞产生细胞免疫，与目前其他正在研究的PEDV基因工程疫苗相比，展示S1蛋白重组杆状病毒疫苗制备，只需感染Sf9细胞即可大量获得，无需纯化，制备工艺简单，成本低廉。

附图说明

图1所示的是本发明实施例1中重组质粒pFastBac-SP-S1-TMD的鉴定图；

图2所示的是本发明实施例1中重组Bacmid-S1的PCR鉴定图；

图3所示的是本发明实施例2中重组S1蛋白的Western Blot鉴定图；

图4所示的是本发明实施例3中Sf9细胞表达的S1间接免疫荧光分析图；

图5所示的是本发明实施例4中重组病毒表面S1蛋白的免疫电镜分析图；

图6所示的是本发明实施例5中PEDV特异性抗体效价测定图；

图7所示的是本发明实施例6中免疫鼠血清中和抗体检测图；

图8所示的是本发明实施例7中脾淋巴细胞增殖检测图，其中NS：无显著差异(P>0.05)；**：差异极显著(P<0.01)。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

载体和细胞培养：

Bac-to-Bac载体系统和Sf9细胞购自Invitrogen公司。PK-15细胞由浙江诺倍威生物技术有限公司提供。Sf9细胞于27℃以无血清培养基SF900 II SFM(Gibco)贴壁培养于T形瓶中，或者以110rpm悬浮培养。PK-15细胞于37℃以含10％小牛血清的DMED培养基培养。

实施例1：重组杆状病毒的构建

根据猪流行性腹泻病毒CV777株(Genbank Accession Number:AF353511)S蛋白氨基酸序列，对S1区21-789位氨基酸的核酸序列进行了优化，委托杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成包含S1基因的DNA：SP-S1-TMD，如SEQ ID NO.1所示。其中，4-60位碱基序列为杆状病毒AcNPV GP64蛋白信号肽编码序列(SP)；61-2367位碱基序列为PEDV S1蛋白编码序列；2368-2577位碱基序列为疱疹病毒G蛋白的跨膜结构域(TMD)编码序列。

根据优化后的核酸序列，利用DNAstar软件设计扩增引物P1(5’-CGCGGATCCATGGTGTCAGCCATCGTG-3’)和P2(5’-CCCAAGCTTTTACTTTCCCAGTCTGTTC-3’)，分别引入BamHI和HindIII酶切位点。PCR反应体系如下：

PCR反应程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸3min，循环反应30次；最后68℃延伸10min。PCR结束后，通过常规DNA克隆技术将SP-S1-TMD片段插入到pFastBacHTB载体BamHI和HindIII位点之间，得到重组质粒：pFastBac-SP-S1-TMD，该重组质粒的鉴定见图1。重组质粒经测序后分析结果与预期序列完全一致。

按照Bac-to-Bac的方法构建重组Bacmid。以pFastBac-SP-S1-TMD转化DH10Bac感受态细胞，涂X-gal/IPTG/Kan/Gen/Tet平板，37℃培养48h，蓝白斑筛选重组克隆。挑取的重组克隆经接种Kan/Gen/Tet/LB液体培养基培养24h后，按照Bacmid的抽提方法制备重组Bacmid DNA，最后利用目的基因特异引物与M13引物进行PCR鉴定，结果(图2)表明重组Bacmid-S1构建成功。

以Bacmid-S1转染六孔板中汇合度达80％的Sf9细胞，具体参照FuGene 6使用说明(Roche)，转染后细胞置入27℃培养箱中继续培养，逐日于荧光显微镜下观察细胞形态和荧光等情况。待细胞病变明显，收集细胞，1000×g离心10min，收集上清即为重组杆状病毒rvAc-S1。

实施例2：S1蛋白的表达与免疫鉴定

实施例1得到的重组病毒样品通过终点稀释法滴定后，按MOI＝1剂量感染六孔板中预铺好的Sf9细胞。感染72h后，1000rpm离心5min，收集管底沉淀下来的Sf9细胞，PBS洗涤细胞两次，取细胞沉淀，制备蛋白样品，进行SDS-PAGE和Western Blotting分析验证S1蛋白是否表达。使用PEDV S1抗血清(自制，1:100稀释)作为一抗，二抗为HRP-羊抗兔IgG抗体(1:10000稀释)，ECL化学发光法检测S1蛋白印迹，检测结果如图3。

S1重组蛋白预期大小约92kD，从图3可见重组病毒rvAc-S1感染的Sf9细胞表达的S1蛋白有2条印迹带，大小范围在120-170kD之间。由于S1蛋白有近20多个糖基化位点，推测不均一的S1蛋白带可能是因为糖基化或者部分降解造成的。

实施例3：荧光观察及亚细胞定位

为进一步确定PEDV S1蛋白在细胞中的表达定位，通过间接免疫荧光观察rvAc-S1感染的Sf9细胞。将Sf9细胞接种于35mm激光共聚焦专用培养皿(Corning)中，细胞汇合度达50％时，接种重组杆状病毒(MOI＝1)感染培养皿中Sf9细胞，感染48h之后进行免疫荧光检测。具体操作如下：4％多聚甲醛室温固定细胞10min；0.2％Triton X-100透化细胞10min；5％BSA(Sigma)室温封闭1h；兔源S1多克隆抗血清(自制，1:50)4℃过夜；Cy3-羊抗兔多克隆抗体(Abcam，1:500)37℃避光孵育1h；DAPI(Sigma)染核3min；以上每各步操作之后用含0.05％Tween-20的PBS(PBST，pH 7.4)洗涤3次，5min/次，激光扫描共聚焦显微镜(C1SI，Nikon)下观察结果并拍照。激光共聚焦结果表明(如图4)，重组病毒rvAc-S1感染的Sf9细胞在细胞膜表面呈现出较强的红色荧光，而细胞质和DAPI染色的细胞核所呈现的红色荧光很弱，阴性对照vAc-WT感染的Sf9细胞未检测到荧光信号，表明S1重组蛋白表达后主要集中锚定在细胞膜表面。

实施例4：S1蛋白在重组病毒表面的展示定位

AcNPV病毒感染宿主细胞后以出芽的方式分泌出去，并包裹上一层细胞膜作为病毒囊膜。重组杆状病毒rvAc-S1从感染的Sf9细胞分泌出去时也会附带包裹上细胞膜，从而将S1蛋白展示于病毒囊膜表面。为确认这一点，我们利用免疫电镜分析病毒表面的S1蛋白，具体操作如下：

铜网吸附病毒液，自然风干后置于封闭液(pH 7.0，50mM PBS，1％BSA，0.02％PEG2000，100mM NaCl，0.1％NaN3)中封闭5min；兔源S1多克隆抗体(1:100)室温孵育2h；10nm金颗粒标记羊抗兔多克隆抗体(Abcam，1:100)室温孵育1h；3％磷钨酸染色5min；以上每各步操作之后用PBS(pH 7.0)洗涤，2min/次，共6次；风干后置于透射电镜(H-7160，Hitachi)样品台观察拍照。

从获取的电镜图片可观察到胶体金颗粒较密集的附着在重组病毒囊膜表面(图5)，而vAc-WT无金颗粒附着。表明随着重组杆状病毒出芽，病毒核衣壳包裹上含有S1蛋白的细胞膜，从而将S1蛋白展示于重组病毒囊膜表面。

实施例5：重组病毒rvAc-S1颗粒的制备与动物免疫试验分析

为了评价以rvAc-S1作为伪病毒的免疫效果，悬浮培养Sf9细胞，接种扩增并制备重组病毒样品。将重组病毒rvAc-S1以MOI＝1剂量感染Sf9细胞进行病毒扩增纯化，感染72h后收集细胞培养上清作为病毒液。病毒纯化的步骤如下：首先，对病毒液高速离心除杂(4℃，10000×g，30min)，然后进一步使用超滤管(100kDa，Millipore)浓缩病毒(4℃，7500×g，30min)，获得的病毒悬液于适量PBS，4℃保存。病毒样品通过终点稀释法滴定。

上述制备的病毒样品免疫接种小鼠通过测定鼠血清效价分析rvAc-S1作为伪病毒的免疫效果。以6-8周龄的BALB/c小鼠作为实验动物，随机分成4组，6只/组，分别皮下免疫PBS、vAc-WT、rvAc-S1、PEDV CV777活毒疫苗，接种体积200μL/只，病毒接种剂量1×10⁷PFU/只，共免疫三次，每次间隔2周。

于首免后14d、28d、35d，每组随机选取3只免疫小鼠，割尾取血采集血清，50倍稀释后作为待检样品。间接ELSA检测PEDV特异性抗体，PEDV病毒作为抗原并用包被液稀释至100μg/mL(BCA法定量)，4℃，100μL/孔过夜包被酶标板；5％BSA/PBS室温封闭2h；逐孔加入连续2倍比稀释的待检血清100μL，每个稀释度3个重复，37℃孵育2h；每孔加入100μL HRP-羊抗小鼠抗体(Abcam，1:10000)，37℃孵育1h；上述每步操作之后，用PBST洗涤4次，3min/次；最后，避光条件下，每孔加入100μL的TMB单组份显色液(Solarbio)，37℃孵育15min，50μL 2MH₂SO₄终止反应，多功能酶标仪读取A₄₉₀值，当待测血清A₄₉₀与阴性对照血清A₄₉₀大于等于2.1的最高血清稀释度即为血清效价。

间接ELSA检测结果表明(如图6)，首免后14d血清中仅PEDV CV777疫苗组免疫血清中检测到PEDV特异性抗体，首免后28d和35d，rvAc-S1组、PEDV CV777疫苗组则检测到特异性抗体，且随着免疫次数增加，血清中特异性抗体逐渐升高。首免35 d重组病毒rvAc-S1组血清抗体平均效价可达1:6000，约为PEDV CV777疫苗组的一半。

实施例6：血清中和试验分析

56℃灭活30min处理首免后35d待检鼠血清，用含2％FBS的DMEM维持液对待检血清进行连续倍比稀释，即1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，取不同稀释度待检血清250μL分别与等体积的PEDV病毒液(200TCID₅₀)混合，37℃孵育1h，取混合液100μL分别接种至96孔板中预铺好的PEDV细胞单层上，每个血清稀释度做4个重复，同时设病毒对照、正常细胞对照，37℃培养4-5d，每日观察细胞病变效应，用Reed-Muench法计算血清中和效价。PBS组不同稀释度血清接种Vero细胞几乎均出现细胞病变，表明这组免疫鼠血清不具PEDV中和能力，rvAc-S1组及PEDV CV777疫苗组血清则能够抑制病毒感染具有一定PEDV病毒中和能力。免疫血清稀释比分别为1:32及1:64时，PEDV病毒抑制率达50％以上(图7)。Reed-Muench法计算rvAc-S1组血清平均中和效价为1:26。

实施例7：淋巴细胞增殖实验分析

分别在首免后28d、35d，于PBS组、vAc-WT组、rvAc-S1、PEDV CV777疫苗组随机各选取3只小鼠颈椎脱臼处死，于安全柜中取出脾脏，用小鼠淋巴细胞分离液(DAKAWE)分离脾淋巴细胞。获得脾淋巴细胞以5×10⁶/mL密度接种96孔板，100μL/孔，将PEDV刺激原及ConA阳性对照加入96孔板，100μL/孔，终浓度为5μg/mL，同时设不加刺激原阴性对照孔(100μLDMEM)，每个处理4个重复，于37℃培养箱孵育42h，加入20μL MTT(5mg/mL)，37℃培养箱继续培养6h，弃去孔中培养基，加入100μL DMSO，于孔板振荡器上震荡5min，将样品于多功能酶标仪测取OD₄₉₀值，计算各组刺激指数：SI＝刺激孔OD₄₉₀值/未刺激孔OD₄₉₀值。MTT法检测分析表明，PBS组、vAc-WT组脾淋巴细胞未发生明显增殖，PEDV CV777疫苗组、rvAc-S1组脾淋巴细胞发生明显增殖(P<0.01)，且疫苗组、重组病毒组首免后35d鼠脾淋巴细胞刺激指数高于首免后28d鼠脾淋巴细胞刺激指数(图8)。这些结果表明PEDV CV777组、rvAc-S1组脾淋巴细胞产生细胞免疫反应。

本发明利用昆虫杆状病毒表面展示系统将PEDV S1蛋白(aa 21-789)融合于杆状病毒GP64信号肽与水泡性口炎病毒G蛋白跨膜结构域TMD之间，构建表面展示S1蛋白的重组杆状病毒作为PEDV伪病毒疫苗应用。免疫荧光标记及病毒感染性分析证实了重组杆状病毒rvAc-S1表面能够高效表达展示S1。通过对重组病毒感染Sf9细胞样品免疫印迹分析表明，Sf9细胞表达的重组S1蛋白呈现为大小分别约120kDa和150kDa两条印迹带，至少比预期92kDa大了30kDa左右。2006年，Qian等通过昆虫杆状病毒 表达展示SARS-CoV S蛋白时，发现表达的S蛋白因糖基化修饰得到比预期143kDa大30kDa左右的特异性条带。该现象与本发明现象一致，故推测S1蛋白在Sf9细胞中也被高度糖基化修饰。

初步动物免疫试验表明，重组病毒能够诱导产生较高水平抗PEDV特异性抗体，免疫血清具有一定PEDV中和能力。重组病毒也能够诱导脾淋巴细胞产生细胞免疫。我们也注意到，与PEDV CV777活毒疫苗相比，重组病毒免疫血清中特异性抗体及中和抗体水平相对较低，可能跟检测方法中使用PEDV全病毒作为抗原有关。

与目前其他正在研究的PEDV基因工程疫苗相比，展示S1蛋白重组杆状病毒疫苗制备，只需感染Sf9细胞即可大量获得，无需纯化，制备工艺简单，成本低廉；并且，杆状病毒具有宿主专一性，不会引起安全问题；杆状病毒自身稳定易储存，自身可作为佐剂，简化免疫程序。

综上，本研究在杆状病毒AcNPV表面展示了PEDV CV777 S1蛋白，以此重组病毒作为伪病毒疫苗免疫小鼠诱导产生了体液免疫及细胞免疫反应。该重组病毒疫苗具有成本低、制备简单、安全、无需免疫佐剂等优点，为PEDV新型高效基因工程疫苗的研发奠定基础。

本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

序列表：

SEQ ID NO.1：

ATGGTGTCAGCCATCGTGTTGTACGTTCTGTTGGCCGCCGCTGCCCATTCAGCTTTTGCTCAGGACGTGACACGCTGCCAGTCTACAACTAACTTCCGCCGCTTCTTTTCAAAATTCAACGTGCAGGCCCCTGCTGTTGTGGTGCTGGGTGGTTACCTGCCTTCAATGAACTCATCTTCATGGTACTGCGGTACAGGAATCGAGACTGCTTCAGGTGTTCATGGAATTTTTCTGTCATATATCGATTCTGGACAGGGTTTCGAGATCGGAATCTCTCAGGAGCCATTTGACCCTTCAGGATACCAGCTGTATCTGCACAAGGCCACAAACGGTAACACAAATGCCATCGCCCGCTTGCGCATCTGCCAGTTCCCAGACAACAAGACTTTGGGTCCTACAGTGAACGACGTTACAACTGGTCGCAACTGCCTGTTCAATAAGGCCATCCCAGCTTACATGCGCGACGGAAAGGACATTGTGGTTGGAATTACATGGGACAACGACCGCGTGACAGTGTTCGCCGACAAGATTTACCACTTTTACCTGAAAAACGACTGGTCACGCGTGGCCACAAGATGTTACAATCGCCGCTCTTGCGCCATGCAGTACGTTTATACTCCAACATACTATATGCTGAATGTGACATCAGCCGGAGAAGACGGTATCTACTACGAGCCATGCACTGCTAACTGTACAGGTTACGCCGCCAACGTGTTTGCTACTGACTCAAATGGTCACATCCCTGAAGGATTTTCATTCAATAATTGGTTCTTGCTGTCAAACGATTCAACACTGCTGCACGGAAAGGTGGTGTCTAACCAGCCATTGCTGGTGAACTGCCTGTTGGCCATCCCTAAGATCTATGGTTTGGGACAGTTCTTCTCATTTAATCATACAATGGATGGAGTTTGCAATGGTGCCGCTGTTGATCGCGCTCCTGAGGCCTTGCGCTTCAACATCAATGACACATCAGTGATTCTGGCCGAGGGTTCTATCGTGTTGCACACAGCCCTGGGTACTAACCTGTCTTTTGTGTGTTCAAACTCATCTGACCCTCACTTGGCTATCTTTGCCATTCCACTGGGAGCCACAGAGGTGCCATACTACTGTTTCCTGAAGGTGGACACATACAACTCTACAGTGTATAAATTTTTGGCCGTGTTGCCACCTACAGTGCGCGAGATCGTGATCACAAAATACGGTGACGTGTACGTGAATGGTTTCGGATACTTGCATCTGGGACTGCTGGATGCCGTTACTATCAATTTTACTGGTCACGGTACTGACGACGACGTTTCTGGATTCTGGACAATCGCCTCTACTAACTTCGTGGATGCCCTGATCGAGGTGCAGGGAACTTCTATCCAACGCATTCTGTATTGCGACGACCCAGTGTCACAGCTGAAGTGCTCACAGGTGGCCTTTGACCTGGATGACGGTTTTTACCCTATTTCTTCTCGCAATTTGCTGTCACACGAGCAACCAATCTCATTTGTTACACTGCCTTCTTTTAACGACCACTCTTTCGTGAACATCACTGTGTCAGCCGCCTTCGGAGGTTTGTCTTCTGCCAACTTGGTGGCCTCAGACACAACAATTAACGGATTCTCATCTTTCTGCGTGGACACA CGCCAATTCACTATTACATTGTTCTACAACGTGACAAACTCATACGGTTACGTGTCTAAATCACAGGACTCAAATTGCCCTTTCACATTGCAGTCTGTGAACGACTACTTGTCATTTTCAAAGTTTTGCGTTTCTACATCATTGCTGGCCGGTGCTTGCACTATTGACCTGTTCGGATATCCTGCCTTCGGTTCAGGTGTGAAGTTGACATCTTTGTATTTCCAGTTCACTAAGGGAGAGCTGATTACTGGTACTCCAAAGCCACTGGAGGGAATTACAGACGTGTCATTTATGACTTTGGATGTTTGCACAAAATACACTATTTACGGTTTCAAGGGTGAAGGAATTATTACACTGACTAACTCATCTATCCTGGCTGGTGTGTACTACACTTCTGACTCTGGACAGCTGCTGGCCTTCAAGAACGTGACATCAGGTGCCGTGTATTCTGTGACTCCTTGCTCATTTTCTGAGCAAGCTGCCTATGTTAACGACGACATCGTGGGAGTGATCTCATCATTGTCTAATTCAACATTCAATAATACTCGCGAATTGCCTGGTTTTTTTTACCATTCAAATGACGGATCAAACTGCACAGAACCAGTGCTGGTGTATTCAAATATCGGTGTTTGCAAGTCAGGTTCTATCGGATACGTGCCATCACAGTATGGACAGGTGAAAATCGCCCCTACTGTGACTGGAAACATCTCTATTCCTACTAATTTCTCAATGTCTATCGGTGACACTGGACTGTCTAAGAACCCAATCGAGTTGGTGGAGGGATGGTTTTCTTCTTGGAAATCATCTATTGCTTCATTTTTTTTCATTATCGGTCTGATTATTGGACTGTTCCTGGTGCTGCGCGTGGGTATTCATCTGTGCATTAAACTGAAGCACACTAAGAAGCGCCAGATCTATACTGATATTGAAATGAACAGACTGGGAAAGTAA

SEQ ID NO.2：

CGCGGATCCATGGTGTCAGCCATCGTG

SEQ ID NO.3：

CCCAAGCTTTTACTTTCCCAGTCTGTTC。

Claims (10)

1.一种表面展示猪流行性腹泻病毒S蛋白的重组杆状病毒，其特征在于：该病毒通过以下步骤构建而成：

(1)根据猪流行性腹泻病毒CV777株S蛋白氨基酸序列，对S1区21-789位氨基酸的核酸序列进行优化，并人工合成包含该S1基因的DNA序列SP-S1-TMD，如SEQ ID NO.1所示；

(2)将SP-S1-TMD片段插入到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体的多克隆位点，构建重组质粒；

(3)转化DH10Bac感受态细胞，蓝白斑筛选重组克隆；

(4)将重组克隆转染昆虫细胞，培养后得到表面展示猪流行性腹泻病毒S蛋白的重组杆状病毒。

2.根据权利要求1所述的表面展示猪流行性腹泻病毒S蛋白的重组杆状病毒，其特征在于：所述步骤(1)中SP-S1-TMD序列从N端到C端依次包括杆状病毒AcNPV GP64蛋白信号肽编码序列、优化的PEDV S1蛋白编码序列、疱疹病毒G蛋白的跨膜结构域编码序列。

3.根据权利要求1所述的表面展示猪流行性腹泻病毒S蛋白的重组杆状病毒，其特征在于：所述步骤(2)中Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体为pFastBac系列载体中的一种。

4.根据权利要求1所述的表面展示猪流行性腹泻病毒S蛋白的重组杆状病毒，其特征在于：所述步骤(2)中构建重组质粒包括以下步骤：

(a)以SP-S1-TMD片段为模板，设计上游引物和下游引物，然后进行PCR扩增；

(b)对转移载体和PCR片段分别进行双酶切，然后连接，构建重组质粒。

5.根据权利要求4所述的表面展示猪流行性腹泻病毒S蛋白的重组杆状病毒，其特征在于：所述步骤(a)中上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示。

6.根据权利要求4所述的表面展示猪流行性腹泻病毒S蛋白的重组杆状病毒，其特征在于：所述步骤(a)中PCR扩增的反应体系如下：

7.根据权利要求4所述的表面展示猪流行性腹泻病毒S蛋白的重组杆状病毒，其特征在于：所述步骤(a)中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸3min，循环反应30次；最后68℃延伸10min。

8.根据权利要求4所述的表面展示猪流行性腹泻病毒S蛋白的重组杆状病毒，其特征在于：所述步骤(b)中双酶切使用的内切酶为BamHI和HindIII。

9.根据权利要求1所述的表面展示猪流行性腹泻病毒S蛋白的重组杆状病毒，其特征在于：所述步骤(4)中昆虫细胞为Sf9、Sf21、Tn5、Tn368、High Five细胞中的一种。

10.权利要求1所述的表面展示猪流行性腹泻病毒S蛋白的重组杆状病毒在作为猪流行性腹泻疫苗中的应用。