CN106222134A - 高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法 - Google Patents
高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106222134A CN106222134A CN201610605996.8A CN201610605996A CN106222134A CN 106222134 A CN106222134 A CN 106222134A CN 201610605996 A CN201610605996 A CN 201610605996A CN 106222134 A CN106222134 A CN 106222134A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stem cell
- cell
- mesenchymal stem
- fat
- fat mesenchymal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 91
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 47
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 35
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims abstract description 29
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 10
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 238000009288 screen filtration Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 21
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 18
- 238000007689 inspection Methods 0.000 claims description 17
- 238000007443 liposuction Methods 0.000 claims description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 15
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 11
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 claims description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 10
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 9
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 229940000351 hemocyte Drugs 0.000 claims description 8
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 7
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 7
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 6
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 6
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 6
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 238000013190 sterility testing Methods 0.000 claims description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- 230000004899 motility Effects 0.000 abstract description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 5
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 abstract description 4
- 208000014674 injury Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 9
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 8
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 7
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 210000001217 buttock Anatomy 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- 238000012549 training Methods 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 230000002293 adipogenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 3
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 3
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 2
- 241000736199 Paeonia Species 0.000 description 2
- 235000006484 Paeonia officinalis Nutrition 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- HVYLDJKDVOOTHV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-iminoethanethiol Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.SCC=N HVYLDJKDVOOTHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 2
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 2
- 230000002138 osteoinductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 1
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 1
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000014429 Insulin-like growth factor Human genes 0.000 description 1
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 1
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004691 chief cell of stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000009189 diving Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000003725 endotheliocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 210000002570 interstitial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000011169 microbiological contamination Methods 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000003668 pericyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000229 preadipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法，为解决现有技术获得细胞活率低问题，包括以下步骤脂肪间充质干细胞的分离：脂肪组织用D.Hanks冲洗，并检测确保无污染，加入数倍体积的I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物，进行37℃、旋转振荡消化数十分钟后停止酶解；离心弃去上清液；并用筛网过滤，得脂肪间充质干细胞悬液；脂肪间充质干细胞的培养：将上述步骤获得的脂肪间充质干细胞悬液接种到培养瓶无血培养基中，进行原代细胞培养，培养期间多次倒置相差显微镜观察，并更换新鲜培养基；细胞培养到80‑90％融合时，用trypLETM消化后扩展接种到新培养瓶中培养，经过数次传代，得到纯化的间充质干细胞。具有消化更充分，细胞得率更高，保护间充质干细胞不受损伤，高活率的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种获取脂肪间充质干细胞方法，特别是涉及一种高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法。
背景技术
脂肪组织在人体中大量存在，容易获取，增殖能力强，失去后对被采集者的影响较小，对受体不存在免疫反应，并且现在主动要求抽脂的人数也越来越多。因此，脂肪间充质干细胞作为一种新的成体干细胞来源有着非常广阔的前景。特别是对于中胚层来源的细胞，ADSC有着与骨髓间充质干细胞有着相近的分化能力，能向脂肪、骨、软骨、神经等细胞分化，并且从脂肪组织中分离培养间质细胞相对于从骨髓组织和密质骨组织中分离培养更易实现，因此其应用前景非常广泛。
越来越多的研究显示，组织工程学在组织缺损修复中具有相当的优势，而在种子细胞的选择上也更加广泛，但哪种细胞最具有优势尚无定论。常用成体干细胞来源包括骨髓组织和脂肪组织等。脂肪组织包含有大量细胞，包括脂肪细胞、脂肪前体细胞、结缔组织细胞、干细胞、血细胞、内皮细胞、平滑肌细胞及周细胞等多种细胞。自Zuk等2001年成功从脂肪组织分离出干细胞并命名为脂肪间充质干细胞，脂肪来源的间充质干细胞得到极大关注，Zuk等人研究发现从抽脂术中获取的脂肪组织中可以分离出一种程序抽吸细胞(processed lipoaspirate(PLA)cells)，该细胞在体外培养表现出稳定的生长特性，而且在特定环境下可以向多种细胞方向分化，具有干细胞的特征。与骨髓来源的间充质干细胞相比，脂肪干细胞储量更加丰富，取材更加方便，痛苦小，干细胞扩增能力更强，而且，最近的研究证明，脂肪干细胞具有多向分化的能力，可以在不同诱导条件下成脂、成骨、成软骨分化，并能分泌血管内皮生长因子、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子等。在先前的研究中，脂肪组织都是来源于抽脂术的大量液化的脂肪组织，表明皮下脂肪组织中存在具有间充质干细胞特征的细胞。
现在对脂肪干细胞研究方面，在人的脂肪干细胞同一供体不同部位来源脂肪干细胞提取、扩增、细胞活性及生物学功能方面的研究未见报道。且培养方法多在用单一酶消化法，细胞得率低，消化时间长，影响细胞活性，且多数为有血清培养法，在临床转化应用脂肪间充质干细胞作为种子细胞在临床中应用，存在很大瓶颈，有许多待解决的问题：如动物源成分残留，细胞培养体系中外源病毒的引入，及细胞数量及活性生物学功能方面都存在诸多争议，没有明确的安全应用规范，这使干细胞在临床应用中受到很大的限制。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法。
为实现上述目的，本发明高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法包括以下步骤：
(1)、脂肪间充质干细胞的分离：将吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗，洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织，同时对脂肪进行涂平板检测，确保实验前脂肪无污染；向冲洗检验后的脂肪组织中加入数倍体积的I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物，进行37℃、旋转振荡消化数十分钟后停止酶解；离心弃去上清液；并用筛网过滤，得脂肪间充质干细胞悬液；
(2)、脂肪间充质干细胞的培养：将上述步骤获得的脂肪间充质干细胞悬液接种到培养瓶无血培养基中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养，培养期间多次倒置相差显微镜观察，并更换新鲜培养基；
细胞培养到80-90％融合时，用trypLETM消化后扩展接种到新培养瓶中培养，经过数次传代，得到纯化的间充质干细胞。本发明将腹部、臀部等不同部位来源的自体脂肪间充质干细胞可以通过本发明独创的培养方法经行体外扩增培养，得到形态均一，呈成纤维样生长的干细胞群，该方法较现有方法不同之处及优点在于：(1)能确保获得高质量的脂肪间充质干细胞。(2)能使样本充分接触酶混合物，消化更充分，细胞得率更高，对细胞损伤小，能最大可能的保护间充质干细胞，不受损伤，使其具有更高活率。
作为优化，在吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗前先对脂肪组织样本进行取样做无菌检测，确保样本培养过程中无污染；用trypLETM消化所用的消化液为无动物源成分消化液。
作为优化，传代次数为1-6代。
作为优化，将细得到纯化的间充质干细胞作为原代传代的细胞转移到细胞库中，冻存到液氮中长期保存。
作为优化，冻存所用的冻存液为无动物源成分商业化冻存保护液。细胞库中的细胞均为经过细菌、真菌和人源传染性病毒检查、支原体、衣原体检查，细胞纯度鉴定、染色体核型检查，细胞生物学功能鉴定及体外动物致瘤性实验验证后均为合格的干细胞。制成的脂肪间充质干细胞培养质量控制实验主要是通过从细胞形态、活力、表型、分化潜能、细菌、真菌、内毒素、支原体衣原体、病毒等相关指标进行检测。
作为优化，洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织的冲洗是置离心管中离心弃去上血水，并将离心管下层的脂肪分散；进行37℃、旋转振荡消化数十分钟是37℃，350转旋转振荡消化30-45分钟；离心弃去上清夜是1500rpm离心10分钟，弃去上清液；用筛网过滤是用200目筛网过滤。
作为优化，加入数倍体积的I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物是加入2倍体积的0.1％I型胶原酶和0.25％trypLETM消化酶溶液混合物。
作为优化，培养期间多次倒置相差显微镜观察是分别在培养的第3、7、10天倒置相差显微镜观察。
作为优化，接种到培养瓶无血培养基中是按2-4×104/cm2的密度接种到培养瓶无血培养基中，消化后扩展接种到新培养瓶中是按分种率1∶4-1∶6接种到新培养瓶中。
作为优化，整个培养方法体系中均为无动物源成分包括脂肪干细胞专用培养基无血清成分，消化用混合酶无动物源成分，消化终止液无血清，冻存保护液无血清。
也就是，本发明高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法包括以下步骤：
(1)脂肪间充质干细胞的分离：无菌条件下打开样本存储装置，对脂肪组织样本进行取样做无菌检测，确保样本培养过程中无污染，将吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗，洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织，同时对脂肪进行涂平板检测，确保实验前脂肪无污染。离心后脂肪组织在下层，去掉上层血水后将离心管下层的脂肪分散，按照相应比例加入2倍体积的0.1％I型胶原酶和0.25％trypLETM消化酶溶液混合物，37℃，350转旋转振荡消化30-45分钟后停止酶解；1500rpm离心10分钟，弃去上清夜；并用200目筛网过滤，得脂肪间充质干细胞悬液。消化所用的消化液为无动物源成分消化液。
(2)脂肪间充质干细胞的培养：将上述步骤(1)获得的细胞按2-4×104/cm2的密度接种到培养瓶无血清培养基中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养，分别在培养的第3、7、10天倒置相差显微镜观察，并更换新鲜培养基；
细胞培养到80-90％融合时，用trypLETM消化，按分种率1∶4--1∶6接种到新培养瓶中培养，经过1-6次传代，间充质干细胞得到纯化，可以将细胞作为原代传代的细胞转移到细胞库中，冻存到液氮中长期保存。冻存所用的冻存液为无动物源成分商业化冻存保护液。所建细胞库中的细胞均为经过细菌、真菌和人源传染性病毒检查、支原体、衣原体检查，细胞纯度鉴定、染色体核型检查，细胞生物学功能鉴定及体外动物致瘤性实验验证后均为合格的干细胞。
本发明提供了一种快捷、高效分离人脂肪间充质干细胞的方法，本发明能够在较短时间得到脂肪充质干细胞，而且对细胞的损伤更小；经试验证明本发明的方法能发明能够利用小量的脂肪组织获得大量的状态良好、保持很好的多向分化能力的脂肪干细胞，并且操作方法简单易行、可重复性强。最大可能的保护间充质干细胞，具有更高活率及活性，经实验证实该方法可以有效的效进行成脂、成骨诱导分化。
本发明所采用的技术方案是：从人脂肪组织中提取培养的脂肪间充质干细胞生长迅速，呈成纤维样生长，为下一步实验奠定了良好的基础。在本发明中，取材来自臀部、腹部不同部位少量吸脂来源脂肪组织20ml，采用混合酶消化法均可以分离出类似细胞，且在短时间得到较多脂肪间充质干细胞，细胞活率在90％以上。通过传代培养和细胞表面标记物分析，得到形态均一，呈成纤维样生长细胞群，具有干细胞特征，并证实其可以在体外能够连续培养并保持遗传性状稳定。
采用上述技术方案后，本发明高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法具有能确保获得高质量的脂肪间充质干细胞，能使样本充分接触酶混合物，消化更充分，细胞得率更高，对细胞损伤小，能最大可能的保护间充质干细胞，不受损伤，使其具有更高活率的优点。
附图说明
图1-4为本发明高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法获得的脂肪间充质干细胞进行流式检测分析的波形图；
图5为本发明高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法获得的脂肪间充质干细胞第五代流式表型分析的波形图；
图6-7为本发明高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法获得的脂肪间充质干细胞培养成的ADSCs细胞：第1代人ADSCs形态40倍放大图和第3代人ADSCs形态100倍放大图；
图8为本发明高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法获得的脂肪间充质干细胞ADSCs成脂诱导14d后油红染色100倍放大图；
图9为本发明高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法获得的脂肪间充质干细胞ADSCs成骨诱导14天后von Kossa染色100倍放大图。
具体实施方式
本发明高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法包括以下步骤：
(1)、脂肪间充质干细胞的分离：将吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗，洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织，同时对脂肪进行涂平板检测，确保实验前脂肪无污染；向冲洗检验后的脂肪组织中加入数倍体积的I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物，进行37℃、旋转振荡消化数十分钟后停止酶解；离心弃去上清液；并用筛网过滤，得脂肪间充质干细胞悬液。
(2)、脂肪间充质干细胞的培养：将上述步骤获得的脂肪间充质干细胞悬液接种到培养瓶无血清培养基中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养，培养期间多次倒置相差显微镜观察，并更换新鲜培养基；
细胞培养到80-90％融合时，用trypLETM消化后扩展接种到新培养瓶中培养，经过数次传代，得到纯化的间充质干细胞。
具体是：在吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗前先对脂肪组织样本进行取样做无菌检测，确保样本培养过程中无污染；用trypLETM消化所用的消化液为无动物源成分消化液。
具体是：传代次数为1-6代。
具体是：将得到纯化的间充质干细胞作为原代传代的细胞转移到细胞库中，冻存到液氮中长期保存。
更具体是：冻存所用的冻存液为无动物源成分商业化冻存保护液。细胞库中的细胞均为经过细菌、真菌和人源传染性病毒检查、支原体、衣原体检查，细胞纯度鉴定、染色体核型检查，细胞生物学功能鉴定及体外动物致瘤性实验验证后均为合格的干细胞。制成的脂肪间充质干细胞培养质量控制实验主要是通过从细胞形态、活力、表型、分化潜能、细菌、真菌、内毒素、支原体衣原体、病毒等相关指标进行检测。
具体是：洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织的冲洗是置离心管中离心弃去上血水，并将离心管下层的脂肪分散；进行37℃、旋转振荡消化数十分钟是37℃，350转旋转振荡消化30-45分钟；离心弃去上清夜是1500rpm离心10分钟，弃去上清液；用筛网过滤是用200目筛网过滤。
具体是：加入数倍体积的I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物是加入2倍体积的0.1％I型胶原酶和0.25％trypLETM消化酶溶液混合物。
具体是：培养期间多次倒置相差显微镜观察是分别在培养的第3、7、10天倒置相差显微镜观察。
具体是：接种到培养瓶无血培养基中是按1.2-4×104/cm2的密度接种到培养瓶无血培养基中，消化后扩展接种到新培养瓶中是按分种率1∶4-1∶6接种到新培养瓶中。
具体是：整个培养方法体系中均为无动物源成分包括脂肪干细胞专用培养基无血清成分，消化用混合酶无动物源成分，消化终止液无血清，冻存保护液无血清。
也就是，本发明高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法包括以下步骤：
(1)脂肪间充质干细胞的分离：无菌条件下打开样本存储装置，对脂肪组织样本进行取样做无菌检测，确保样本培养过程中无污染，将吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗，洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织，同时对脂肪进行涂平板检测，确保实验前脂肪无污染。离心后脂肪组织在下层，去掉上层血水后将离心管下层的脂肪分散，按照相应比例加入2倍体积的0.1％I型胶原酶和0.25％trypLETM消化酶溶液混合物，37℃，350转旋转振荡消化30-45分钟后停止酶解；1500rpm离心10分钟，弃去上清夜；并用200目筛网过滤，得脂肪间充质干细胞悬液。消化所用的消化液为无动物源成分化消化液。
(2)脂肪间充质干细胞的培养：将上述步骤(1)获得的细胞按2-4×104/cm2的密度接种到培养瓶无血清培养基中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养，分别在培养的第3、7、10天倒置相差显微镜观察，并更换新鲜培养基；
细胞培养到80-90％融合时，用trypLETM消化，按分种率1∶4--1∶6接种到新培养瓶中培养，经过1-6次传代，间充质干细胞得到纯化，可以将细胞作为原代传代的细胞转移到细胞库中，冻存到液氮中长期保存。冻存所用的冻存液为无动物源成分商业化冻存保护液。所建细胞库中的细胞均为经过细菌、真菌和人源传染性病毒检查、支原体、衣原体检查，细胞纯度鉴定、染色体核型检查，细胞生物学功能鉴定及体外动物致瘤性实验验证后均为合格的干细胞。
本发明提供了一种快捷、高效分离人脂肪间充质干细胞的方法，本发明能够在较短时间得到脂肪间充质干细胞，而且对细胞的损伤更小；经实验证明本发明的方法能发明能够利用小量的脂肪组织获得大量的状态良好、保持很好的多向分化能力的脂肪干细胞，并且操作方法简单易行、可重复性强。最大可能的保护间充质干细胞，具有更高活率及活性，经实验证实该方法可以有效的效进行成脂、成骨诱导分化。
本发明所采用的技术方案是：从人脂肪组织中提取培养的脂肪间充质干细胞生长迅速，呈成纤维样生长，为下一步实验奠定了良好的基础。在本发明中，取材来自臀部、腹部不同部位少量吸脂来源脂肪组织20ml，采用混合酶消化法均可以分离出类似细胞，且在短时间得到较多脂肪间充质干细胞，细胞活率在90％以上。通过传代培养和细胞表面标记物分析，得到形态均一，呈成纤维样生长细胞群，具有干细胞特征，并证实其可以在体外能够连续培养并保持遗传性状稳定。
下面结合实例作更进一步说明：
实施例1、本发明高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法是人自体脂肪来源间充质干细胞原代的分离、培养、及原代细胞的冻存，步骤如下：
(1)、脂肪组织的提取：在正规医疗美容院，用专用抽脂设备无菌条件下抽取人脂肪20ml，立即装入无菌自封袋中，封口，装入脂肪组织专用保温箱，4度条件下在8-24小时内，送往实验室。
(2)、脂肪间充质干细胞的分离：无菌条件下打开样本存储装置，将吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗，洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织，同时对脂肪进行涂平板检测，确保实验前脂肪无污染。离心后脂肪组织在下层，去掉上层血水后将离心管下层的脂肪分散，按照相应比例加入加入2倍体积的0.1％I型胶原酶和0.25％trypLETM消化酶溶液混合物溶液混合物，37℃消化30-45分钟后停止酶解，1500rpm离心10分钟，弃去上清夜；并用200目筛网过滤，得脂肪间充质干细胞悬液。
(3)、脂肪间充质干细胞的培养：将上述步骤(1)获得的细胞按1.2-3×104/cm2的密度接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养，细胞培养到80-90％融合时，用trypLETM消化，按分种率1∶4--1∶6接种到新培养瓶中培养，经过1-6次传代，间充质干细胞得到纯化，可以将细胞作为原代传代的细胞转移到细胞库，并冻存到液氮中长期保存。
除上述实例1-1外，还并行进行了如下叁个实例：
实施例1-2，本发明高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法与上述实施例1-1的区别仅在于：37℃消化30分钟后停止酶解；按1.2×104/cm2的密度接种到培养瓶无血培养基中；细胞培养到80％融合时，用trypLETM消化，按分种率1∶4接种到新培养瓶中培养。
实施例1-3，本发明高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法与上述实施例1-1的区别仅在于：37℃消化40分钟后停止酶解；按3×104/cm2的密度接种到培养瓶无血培养基中；细胞培养到85％融合时，用trypLETM消化，按分种率1∶5接种到新培养瓶中培养。
实施例1-4，本发明高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法与上述实施例1-1的区别仅在于：37℃消化45分钟后停止酶解；按4×104/cm2的密度接种到培养瓶无血培养基中；细胞培养到90％融合时，用trypLETM消化，按分种率1∶6接种到新培养瓶中培养。
结果：我们成功的从脂肪组织中提取了脂肪间充质干细胞并进行原代培养，镜下观察细胞形态，细胞呈梭形、多角形，原代细胞约10天接近80％融合，传代后细胞纯度提高，形态较原代均一，以平行排列生长为主，或呈漩涡状生长(如图6)，将细胞进行流式检测分析，符合间充质干细胞特征(如图7)，其中CD73、CD90、CD105为阳性。CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR为阴性。如图1-4所示。
本发明方法获得的脂肪间充质干细胞第五代流式表型分析，其中PENegCKTL为阴性抗体：CD CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR，如图5所示。
本发明方法获得的脂肪间充质干细胞培养杨的ADSCs细胞：如图6，第1代人ADSCs形态(×40倍)：如图6，第3代人ADSCs形态(×100倍)。
实施例2.本发明高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法是人脂肪间充质干细胞的扩增和质量控制，步骤包括：
(1)、从上述实例一中制备的原代细胞库中取出含2×106细胞的冻存管，在37℃水浴锅中迅速解冻复苏细胞。
(2)用无血清培养基(脂肪干细胞专用)按1.2-2×104/cm2的密度接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行培养，细胞到80-90％融合时按1∶4传代，经过5次传代。
(3)在第5次传代细胞融合度达90％时用trypLETM消化细胞，计数，用配制好细胞保护液按合适浓度重悬细胞，分装入无菌容器中，密封后，放置在梯度降温专用冻存盒于-80度环境保存24小时，24小时候转移到液氮罐中长期保存。
(4)扩增细胞质量控制：按本研究中心建立的方法(参考《中国药典》2010版及《干细胞制剂质量控制及临床指导原则》)进行细菌、真菌和病毒的病原微生物检查，细胞活力检测、内毒素检测、细胞纯度检查。
结果：获得的细胞无细菌、真菌和病毒的病原微生物污染，细胞纯度检查，细胞活力检测、内毒素检测、支原体、衣原体检测均合格。
实施例3、本发明高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法制得的人脂肪间充质干细胞的多向分化能力鉴定，如下：
(1)、取P5代脂肪间充质干细胞传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，用成脂专用培养基(GIBICO)，每3～4d换一次液；2周后进行油红0染色鉴定。经成脂诱导培养14天后，显微镜下可见有大量脂滴形成，且油红0染色呈阳性，证明我们的脂肪间充质细胞具有向成脂肪方向分化的潜能。如图8所示，ADSCs成脂诱导14d后油红染色(×100倍)显微镜下可见有大量脂滴形成，且油红O染色呈阳性。
(2)、取P5代细胞以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，用成脂专用培养基(GIBICO)，每3～4d换一次液，经成骨诱导培养18天后，细胞基质矿化物逐渐出现，显微镜下可见明显钙化结节，经茜素红染色后呈深红色，证明我们的细胞具有向成骨方向分化的潜能。如图9所示，ADSCs成骨诱导14天后von Kossa染色(×100倍)微镜下可见明显钙化结节，经茜素红染色后呈深红色。
本发明方法是将腹部、臀部等不同部位来源的自体脂肪间充质干细胞可以通过本发明独创的培养方法经行体外扩增培养，得到形态均一，呈成纤维样生长的干细胞群。该方法较现有方法不同之处及优点在于：(1)能确保获得高质量的脂肪间充质干细胞。(2)能使样本充分接触酶混合物，消化更充分，细胞得率更高，对细胞损伤小，能最大可能的保护间充质干细胞，不受损伤，使其具有更高活率。
Claims (10)
1.一种高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、脂肪间充质干细胞的分离：将吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗，洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织，同时对脂肪进行涂平板检测，确保实验前脂肪无污染；向冲洗检验后的脂肪组织中加入数倍体积的I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物，进行37℃、旋转振荡消化数十分钟后停止酶解；离心弃去上清液；并用筛网过滤，得脂肪间充质干细胞悬液；
(2)、脂肪间充质干细胞的培养：将上述步骤获得的脂肪间充质干细胞悬液接种到培养瓶无血培养基中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养，培养期间多次倒置相差显微镜观察，并更换新鲜培养基；
细胞培养到80-90％融合时，用trypLETM消化后扩展接种到新培养瓶中培养，经过数次传代，得到纯化的间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于在吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗前先对脂肪组织样本进行取样做无菌检测，确保样本培养过程中无污染；用trypLETM消化所用的消化液为无动物源成分消化液。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于传代次数为1-6代。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于将得到纯化的间充质干细胞作为原代传代的细胞转移到细胞库中，冻存到液氮中长期保存。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于冻存所用的冻存液为无动物源成分商业化冻存保护液。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织的冲洗是置离心管中离心弃去上血水，并将离心管下层的脂肪分散；进行37℃、旋转振荡消化数十分钟，是37℃，350转旋转振荡消化30-45分钟；离心弃去上清夜是1500rpm离心10分钟，弃去上清液；用筛网过滤是用200目筛网过滤。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于加入数倍体积的I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物是加入2倍体积的0.1％I型胶原酶和0.25％trypLETM消化酶溶液混合物。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于培养期间多次倒置相差显微镜观察是分别在培养的第3、7、10天倒置相差显微镜观察。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于接种到培养瓶无血培养基中是按1.2-4×104/cm2的密度接种到培养瓶无血培养基中，消化后扩展接种到新培养瓶中是按分种率1∶4-1∶6接种到新培养瓶中。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于整个培养方法体系中均为无动物源成分包括脂肪干细胞专用培养基无血清成分，消化用混合酶无动物源成分，消化终止液无血清，冻存保护液无血清。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610605996.8A CN106222134A (zh) | 2016-07-29 | 2016-07-29 | 高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610605996.8A CN106222134A (zh) | 2016-07-29 | 2016-07-29 | 高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106222134A true CN106222134A (zh) | 2016-12-14 |
Family
ID=57533316
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610605996.8A Pending CN106222134A (zh) | 2016-07-29 | 2016-07-29 | 高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106222134A (zh) |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107828726A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-03-23 | 北京焕生汇生物技术研究院 | 一种从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法 |
| CN108004207A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-05-08 | 英科博雅生命科技有限公司 | 从脂肪中获取大量脂肪间充质干细胞的方法 |
| CN109266605A (zh) * | 2018-10-12 | 2019-01-25 | 希瑞干细胞科技有限公司 | 一种眼袋脂肪干细胞分离及体外培养的方法 |
| CN109486753A (zh) * | 2017-09-12 | 2019-03-19 | 深圳华云生物科技发展有限公司 | 一种脂肪干细胞提取方法 |
| CN109554339A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-02 | 中国医学科学院整形外科医院 | 一种从脂肪抽吸物中高效分离脂肪间充质干细胞的方法 |
| CN110177872A (zh) * | 2017-03-03 | 2019-08-27 | 日本乐敦制药株式会社 | 间充质干细胞和药物组合物 |
| CN110846275A (zh) * | 2019-12-12 | 2020-02-28 | 赛瑞诺(北京)生物科技有限公司 | 一种人自体脂肪间充质干细胞的无血清培养方法 |
| CN111440766A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-07-24 | 沈阳农业大学 | 犬原代脂肪间充质干细胞的无血清分离提取方法 |
| CN111454890A (zh) * | 2020-01-23 | 2020-07-28 | 广州医科大学附属第二医院 | 一种小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养方法 |
| CN111944748A (zh) * | 2020-08-14 | 2020-11-17 | 福建医科大学附属协和医院 | 一种用于治疗心肌梗死的高表达il-10的人脂肪间充质干细胞外泌体及其用途 |
| CN111944749A (zh) * | 2020-08-14 | 2020-11-17 | 福建医科大学附属协和医院 | 一种用于治疗心肌梗死的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法 |
| CN115261312A (zh) * | 2022-08-03 | 2022-11-01 | 湖北万海赛康生命科学有限公司 | 一种间充质干细胞的制备方法 |
| CN116121181A (zh) * | 2022-11-23 | 2023-05-16 | 武汉市工科院生命科学技术有限公司 | 一种临床级脂肪间充质干细胞及其制备方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101974486A (zh) * | 2010-11-25 | 2011-02-16 | 王泰华 | 从微量人脂肪组织提取间充质干细胞及规模化培养的方法 |
| CN101984049A (zh) * | 2010-12-09 | 2011-03-09 | 协和干细胞基因工程有限公司 | 从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法 |
| CN103070161A (zh) * | 2013-01-09 | 2013-05-01 | 广州爱菲科生物科技有限公司 | 一种脂肪间充质干细胞冻存液及冻存方法 |
| CN104164403A (zh) * | 2014-07-25 | 2014-11-26 | 大连大学 | 一种提取及培养脂肪干细胞的方法 |
| CN104611292A (zh) * | 2014-11-25 | 2015-05-13 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法 |
| CN105267240A (zh) * | 2014-12-16 | 2016-01-27 | 天津医科大学眼科医院 | 间充质干细胞来源的外泌体的用途 |
-
2016
- 2016-07-29 CN CN201610605996.8A patent/CN106222134A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101974486A (zh) * | 2010-11-25 | 2011-02-16 | 王泰华 | 从微量人脂肪组织提取间充质干细胞及规模化培养的方法 |
| CN101984049A (zh) * | 2010-12-09 | 2011-03-09 | 协和干细胞基因工程有限公司 | 从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法 |
| CN103070161A (zh) * | 2013-01-09 | 2013-05-01 | 广州爱菲科生物科技有限公司 | 一种脂肪间充质干细胞冻存液及冻存方法 |
| CN104164403A (zh) * | 2014-07-25 | 2014-11-26 | 大连大学 | 一种提取及培养脂肪干细胞的方法 |
| CN104611292A (zh) * | 2014-11-25 | 2015-05-13 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法 |
| CN105267240A (zh) * | 2014-12-16 | 2016-01-27 | 天津医科大学眼科医院 | 间充质干细胞来源的外泌体的用途 |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110177872A (zh) * | 2017-03-03 | 2019-08-27 | 日本乐敦制药株式会社 | 间充质干细胞和药物组合物 |
| CN109486753A (zh) * | 2017-09-12 | 2019-03-19 | 深圳华云生物科技发展有限公司 | 一种脂肪干细胞提取方法 |
| CN108004207B (zh) * | 2017-12-15 | 2021-07-13 | 英科博雅生命科技有限公司 | 从脂肪中获取大量脂肪间充质干细胞的方法 |
| CN108004207A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-05-08 | 英科博雅生命科技有限公司 | 从脂肪中获取大量脂肪间充质干细胞的方法 |
| CN107828726A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-03-23 | 北京焕生汇生物技术研究院 | 一种从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法 |
| CN109266605A (zh) * | 2018-10-12 | 2019-01-25 | 希瑞干细胞科技有限公司 | 一种眼袋脂肪干细胞分离及体外培养的方法 |
| CN109554339A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-02 | 中国医学科学院整形外科医院 | 一种从脂肪抽吸物中高效分离脂肪间充质干细胞的方法 |
| CN110846275A (zh) * | 2019-12-12 | 2020-02-28 | 赛瑞诺(北京)生物科技有限公司 | 一种人自体脂肪间充质干细胞的无血清培养方法 |
| CN111454890A (zh) * | 2020-01-23 | 2020-07-28 | 广州医科大学附属第二医院 | 一种小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养方法 |
| CN111440766A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-07-24 | 沈阳农业大学 | 犬原代脂肪间充质干细胞的无血清分离提取方法 |
| CN111944748A (zh) * | 2020-08-14 | 2020-11-17 | 福建医科大学附属协和医院 | 一种用于治疗心肌梗死的高表达il-10的人脂肪间充质干细胞外泌体及其用途 |
| CN111944749A (zh) * | 2020-08-14 | 2020-11-17 | 福建医科大学附属协和医院 | 一种用于治疗心肌梗死的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法 |
| CN115261312A (zh) * | 2022-08-03 | 2022-11-01 | 湖北万海赛康生命科学有限公司 | 一种间充质干细胞的制备方法 |
| CN116121181A (zh) * | 2022-11-23 | 2023-05-16 | 武汉市工科院生命科学技术有限公司 | 一种临床级脂肪间充质干细胞及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106222134A (zh) | 高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法 | |
| CN102002475B (zh) | 人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法 | |
| Zhu et al. | Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates | |
| CN102676451B (zh) | 从胎盘中分离间充质干细胞的方法 | |
| CN107236704B (zh) | 从胎盘分离间充质干细胞的方法和使用的消化酶组合物 | |
| CN102586184B (zh) | 建立胎盘间充质干细胞库的方法 | |
| CN109234229B (zh) | 从胎盘血管分离间充质干细胞的方法和所用消化酶组合物 | |
| CN107217034A (zh) | 一种人脐带间充质干细胞源外泌体及其获取方法和应用 | |
| CN106244532A (zh) | 人源脐带间充质干细胞的制备方法 | |
| CN102965335A (zh) | 用于间充质干细胞培养的试剂盒及其应用 | |
| CN104357387A (zh) | 一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法 | |
| CN103013911A (zh) | 贴壁密度梯度法联合egf培养人脐带间充质干细胞的方法 | |
| CN104450611A (zh) | 一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法 | |
| CN106318906A (zh) | 一种大规模培养人脐带间充质干细胞的方法 | |
| CN102028970A (zh) | 一种用于治疗肝硬化的干细胞制剂 | |
| CN105462919A (zh) | 一种从脐带华通氏胶组织中分离提取hUC-MSC的方法 | |
| CN102154202A (zh) | 储存宫内膜干细胞的方法 | |
| CN111763656A (zh) | 脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法 | |
| CN105132375A (zh) | 一种肝癌干细胞的无血清培养基及其培养方法 | |
| CN104152409A (zh) | 同时分离培养犬骨髓间充质干细胞和多功能造血干细胞的方法 | |
| CN101848718A (zh) | 用于组织再生的细胞组合物 | |
| CN103087982A (zh) | 一种快速分离脂肪间充质干细胞的试剂盒及方法 | |
| CN109628388B (zh) | 用消化酶组合物从胎盘血管分离间充质干细胞 | |
| Savelli et al. | Pooled human serum: A new culture supplement for bioreactor-based cell therapies. Preliminary results | |
| CN104450613A (zh) | 一种利于自体骨髓间充质干细胞在体外培养的细胞培养基 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20170606 Address after: 101111 Beijing branch of Daxing District economic and Technological Development Zone Street No. 88 Yizhuang biomedical park E1-501 Applicant after: Defender Huayi (Beijing) Biotechnology Co. Ltd. Applicant after: Huayue will (Beijing) Medical Technology Co Ltd Address before: 101111 Beijing branch of Daxing District economic and Technological Development Zone Street No. 88 Yizhuang biomedical park E1-501 Applicant before: Defender Huayi (Beijing) Biotechnology Co. Ltd. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20161214 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |