CN106232217A - 创建并收获表面结合的乳液 - Google Patents

Abstract

提供了一种乳液，其包含：(a)含有单一聚合化合物或其预定义的混合物的小滴，和(b)不能混溶的液体，其中：(i)每个小滴包括其含有的化合物的多个分子；并且所述小滴不含所述聚合化合物的单体前体。还提供了用于生成乳液的方法。

Description

创建并收获表面结合的乳液

交叉援引

本申请要求2014年4月15日提交的临时申请流水号61/979,711的权益，将该申请通过提述并入本文用于所有目的。

发明背景

对于一些多重生物和基因组应用，将多种试剂和/或生物样品组合在区室化反应(compartmentalized reactions)中，以便将复杂的测定法与其它反应分开实施，或以高浓度且微小的样品体积实施，是有用的。

发明概述

本文中描述了一种乳液，其包含：(a)多个小滴，所述小滴含有单一聚合化合物或其预定义的混合物，和(b)不能混溶的(immiscible)液体，其中：(i)每个小滴包含其所含有的化合物的多个分子；并且所述多个小滴不含其中含有的聚合化合物的单体前体。

本文中还描述了生成乳液的方法，其包括：(a)获得基底表面上的聚合化合物的阵列，其中聚合化合物经由可切割接头与基底结合，并且其中基底表面上含有聚合化合物的区域相对于基底表面的其余部分而言是亲水的；(b)选择性水化(hydrating)含有聚合化合物的区域以在基底表面上产生离散的多个小滴，其中每个小滴含有单一聚合化合物(asingle polymeric compound)或在基底上彼此相邻的多个聚合化合物的预定义的组合(apre-defined combination of polymeric compounds that are adjacent to onanother on the substrate)；并且(c)通过在水化步骤(b)之前、期间或之后切割可切割接头，从基底表面释放所述聚合化合物。任选地，某些实施方案包括(d)在不能混溶的液体中收集所述小滴，从而产生含有离散小滴的乳液，每个所述小滴在溶液相中含有单一聚合化合物或来自基底上彼此相邻的特征或来自相同特征的聚合化合物组合。

在许多基于通道的常规微流体系统测定法中可以用到大量的合成聚合化合物，从表面释放的小滴具有应用于任何这样的测定法中的潜力。这些测定法包括条码化的多重测序(barcoded multiplex sequencing)、单元型测序、单细胞测序、高通量筛选和基因装配或基因合成。(参考文献:LinasMazutiset al.,“Single-cell analysis and sortingusing droplet-based Microfluidics”Nature Protocols,8,5,870-891(2013).EricBrouzes,et al.“Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening”,PNAS,106,34,14195-14200(2009),Haosheng Chen et al.“Reactions in double emulsions by flow-controlled coalescence of encapsulateddrops”,Royal Society of Chemistry(2011)DOI:10.1039/c1lc20265k,Gaurav J.Shahet al.,”EWOD-driven droplet microfluidic device integrated withoptoelectronictweezers as an automated platform for cellular isolation andanalysis”,Lab Chip,9,1732–1739(2009))。

附图简述

熟练技术人员会理解下文描述的附图仅为了例示目的。附图并不意图以任何方式限制本文中的教导的范围。

图1示意性显示了主题方法的一个实施方案的一些一般原则。

图2示意性显示了在三个顺序的时间点a、b和c上水小滴通过水蒸汽冷凝在DNA特征上的生长。

图3示意性显示了用于创建大小滴的几个简单的特征图案，所述大小滴是由驻留于多个相邻特征上的较小小滴的簇聚并形成的。聚并是通过下述方式发生的：发射多个喷墨(ink-jet)小滴至所述特征上，直至小滴足够扩张以与邻近的小滴接触，由此扩张每个复合小滴。

图4示意性显示了小滴在油性流体中的浸湿(immersion)。一旦水性小滴形成，则使油性流体流到的基底上包围所述特征，并且最终浸湿它们，以在表面上形成被封装的小滴，或乳液。

图5示意性显示了通过侧向剪切力从载玻片的表面移除小滴。

图6示意性显示了用于从基底移除小滴的多重抽吸器。当头部从右至左移过基底时，它交替地抽吸坐落在特征上的流体和浸湿阵列的间隙载体流体。这导致头部内的微通道内交替产生含化学品(例如含DNA或RNA)的水性流体与油(或任何载体流体)所成的小段(plug)。可以将这些通道探入芯片中，芯片将小滴以它们在阵列上的相同次序贮存。或者，芯片可以将它们泵送到公共小室中，其中所有小滴在2D或3D乳液中被随机化。

图7示意性显示了电湿润(electrowetting)实施方案。

图8显示了DNA阵列上的空气中的水性小滴(40％PEG)的图像。图像上重叠的圆圈和线表示在阵列上合成的DNA特征的名义大小和间隔。此图像显示，小滴大小与化学特征大小大致相同。

图9显示了DNA阵列上的油中的水性小滴(40％PEG)的图像。小滴在阵列上封装在Novec-7500Engineering流体(The 3M Company,St.Paul,MN)中。定义

在更为详细描述例示性的实施方案前，列出以下定义以例示并定义描述中使用的术语的意义和范围。

数字范围包括限定范围的数字。除非另外指示，核酸以5’至3’方向左至右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向左至右书写。

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。Singleton,et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY,2D ED.,John Wiley and Sons,New York(1994)，及Hale&Markham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,N.Y.(1991)给技术人员提供本文中使用的许多术语的一般意义。不过，为了清楚和易于参考，下文定义了某些术语。

必须指明，如本文中和所附权利要求书中使用，单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”包括指称复数的情况，除非上下文另有明确要求。例如，术语“一种引物”指一种或多种引物，即单一引物和多种引物。进一步注意到，撰写权利要求书时可以排除任何任选的要素。因此，这种表述可以作为与权利要求要求结合使用的排他术语，如“唯一”，“仅仅”等，或者使用“否定式”限定的在先引用基础。

如本文中使用，术语“聚合化合物的阵列”意图指可寻址区域的二维排列，所述可寻址区域携带与该区域相关的特定的聚合部分(例如，生物聚合物，如寡核苷酸或多肽、碳水化合物、和脂质，以及已经使用单体合成的有机聚合化合物)。在一些实施方案中，阵列是聚合结合剂(polymeric binding agent)的阵列，其中聚合结合剂可以是任何下述者：肽、寡核苷酸、多糖、此类生物聚合结合剂的合成模拟物，等等。阵列的寡核苷酸可以在沿着核酸链上的任何点处共价附着于基底，但是一般附着在一个末端(例如，3’或5’末端)。有时，阵列是多肽(例如蛋白质或其片段)的阵列。

任何给定的基底可以携带1、2、4或更多个布置在基底的前表面上的阵列。取决于用途，任何或所有阵列可以是相同的或彼此不同的，并且每个阵列可以含有多个点或特征。阵列可以在小于20cm²的区域中，例如在小于10cm²、小于5cm²、或小于1cm²的区域中含有至少10个、至少100个、至少1,000个、至少10,000个、至少100,000个或至少10⁶或更多个特征。在一些实施方案中，特征的宽度(对于圆点而言为直径)可以在1μm至1.0cm的范围，但这些尺寸之外的特征也在考虑之中。在一些实施方案中，特征的宽度可以在3.0μm至200μm，例如5.0μm至100μm或10μm至50μm的范围。通常会存在特征间区域(interfeature areas)，此类区域不携带任何聚合化合物。应当理解的是，当存在时，特征间区域可以有多种大小和构型。

每个阵列可以覆盖小于100cm²，例如小于50cm²，小于10cm²或小于1cm²的区域。在一些实施方案中，携带一个或多个阵列的基底一般会成形为矩形或正方形立体(尽管其它形状是可能的)，具有超过4mm且小于10cm，例如超过5mm且小于5cm的长度，和超过4mm且小于10cm，例如超过5mm且小于5cm的宽度。

阵列可以使用液滴沉积来制造，通过脉冲喷射多核苷酸前体单元(如单体)(在原位制作的情况下)，或先前获得的多核苷酸。此类方法详细记载于例如US 6,242,266，US 6,232,072，US 6,180,351，US 6,171,797，US 6,323,043，Caren等在1999年4月30日提交的美国专利申请流水No.09/302,898，以及其中引用的参考文献。这些参考文献通过提及并入本文。其它液滴沉积方法可以用于制造，如本文中先前描述的。还有，代替液滴沉积方法，可以使用光刻阵列制作方法。特别地，在通过光刻法制备阵列时，不需要存在特征间区域。

当阵列具有多个具备不同模块(例如不同多核苷酸序列)的区域，使得某个区域(即，阵列的“特征”、“点”或“区域”)在阵列上的特定的预定位置(即，“地址”)时，阵列是“可寻址的”。各阵列特征通常被，但不需要被，居间空间所分开。

术语“核苷酸”意图包括那些不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基，而且还含有已经修饰的其它杂环碱基的模块。此类修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶、烷基化的核糖或其它杂环。另外，术语“核苷酸”包括这样的模块，它们含有半抗原或荧光标记物，而且不仅可以含有常规的核糖和脱氧核糖，而且也可以含有其它糖。经修饰的核苷或核苷酸还包括糖模块上的修饰，例如一个或多个羟基基团替换为卤素原子或脂肪族基团，或者官能化为酯、胺等。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，描述由核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸构成的任何长度，例如大于约2个碱基、大于约10个碱基、大于约100个碱基、大于约500个碱基、大于1000个碱基，直至约10,000或更多个碱基的聚合物，可以酶促或合成生成(例如，如记载于美国专利No.5,948,902和其中引用的参考文献的PNA)，可以以与两个天然存在的核酸的方式类似的序列特异性方式与天然存在的核酸杂交，例如可以参与Watson-Crick碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶(分别为G、C、A、T和U)。DNA和RNA分别具有脱氧核糖和核糖糖主链，而PNA主链由通过肽键连接的重复N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元构成。在PNA中，多个嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键与主链连接。锁定核酸(LNA)，经常称为难接近的RNA，是一种经修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖模块用额外的桥修饰，所述桥连接2’氧和4’碳。桥“锁定”3’-内(North)构象的核糖，其经常存在于A-形式的双链体中。只要期望，可以混合LNA核苷酸与寡核苷酸中的DNA或RNA残基。术语“非结构化核酸”或“UNA”是含有非天然核苷酸的核酸，所述非天然核苷酸以降低的稳定性彼此结合。例如，非结构化的核酸可以含有G’残基和C’残基，其中这些残基对应于G和C的非天然存在的形式，即类似物，它们以降低的稳定性彼此碱基配对，但是保留分别与天然存在的C和G残基碱基配对的能力。非结构化的核酸记载于US20050233340，其通过提及并入本文用于公开UNA。

如本文中使用，术语“寡核苷酸”意指长度约2至200个核苷酸，直至500个核苷酸的核苷酸单链多聚体。寡核苷酸可以是合成的或可以酶促生成，并且在一些实施方案中，长度为30至150个核苷酸。寡核苷酸可以含有核糖核苷酸单体(即，可以是寡核糖核苷酸)和/或脱氧核糖核苷酸单体。例如，寡核苷酸的长度可以是10至20、21至30、31至40、41至50、51-60、61至70、71至80、80至100、100至150或150至200个核苷酸。

如本文中使用，术语“引物”指这样的寡核苷酸，无论是天然存在的(如在纯化的限制性消化物中)还是合成生成的，其当被置于与核酸链互补的引物延伸产物被诱导合成的条件下，即在存在核苷酸和诱导剂，如DNA聚合酶的情况下并且在合适的温度和pH的条件下时，可发挥合成起始点的作用。引物可以是单链或双链的，并且必须有足够长度以在诱导剂存在下引发期望的延伸产物的合成。引物的确切长度会取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。例如，对于诊断应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25或更多个核苷酸，但它可以含有更少的核苷酸。本文中的引物选择为与特定的靶DNA序列的不同链基本上互补。这意味着引物必须足够互补以与其相应的链杂交。因此，引物序列不需要反映模板的确切序列。例如，引物的5’端可以附着有非互补核苷酸片段，而引物序列的其余部分与链互补。或者，引物中可以散在有非互补的碱基或更长的序列，只要引物序列与链的序列具有足够的互补性以与其杂交，并且从而形成模板用于合成延伸产物即可。

如本文中使用，术语“肽”意图指氨基酸或其类似物的聚合物。

如本文中使用，术语“已经通过组合化学生成的有机分子”意图指这样的有机聚合物，其是使用较小构件块生成的，这些构件块被彼此连接以产生聚合物。根据单体的数目，此类分子可以具有小于1000Da，例如小于500Da的分子量。

可以使用任何合适的方法生成聚合化合物的阵列，所述方法包括将预先生成的聚合化合物沉积到基底的表面上，然后与基底连接的方法，以及还有原位合成方法。

如本文中使用，术语“原位合成聚合化合物”意图指这样的方法，通过该方法，使用单体前体逐一添加到生长中的链，让聚合化合物在基底上原位生长。此类方法包括光刻法方法，以及液滴沉积方法。此类方法的例子记载于例如Cleary et al.(Nature Methods2004 1:241-248)和LeProust et al.(Nucleic Acids Research 2010 38:2522-2540)。

如本文中使用，术语“经由可切割接头与基底结合”意图指这样的安排，其中聚合化合物经由可切割键(cleavable bond)与基底连接。例如，可以使用碱(例如氨或三甲胺)、酸、氟化物或光子等切割可切割键。

如本文中使用，术语“基底表面上含有聚合化合物的区域”意图指含有聚合化合物的特征(features that contain the polymeric compounds)，如上文讨论的。

如本文中使用，术语“基底表面的其余部分”意图指基底表面的不含聚合化合物的区域(即，含有化合物的区域之间的基底表面区域)。

如本文中使用，术语“疏水性”和“亲水性”是相对术语，意图指溶液被吸引到表面或从表面被排斥的程度。可以通过测量溶液在表面上的接触角测量疏水性和亲水性，如记载于Johnson et al.(J.Phys.Chem.1964Contact Angle Hysteresis 68:1744–1750)。接触角是静态疏水性的量度，接触角滞后和滑动角(slide angle)是动态量度。还可参见Roger P.Woodward的题目为Contact Angle Measurements Using the Drop ShapeMethod的文章，其可以在通过在“firsttenangstroms.com/pdfdocs/CAPaper.pdf”前放置“http://www.”形成的网址获得。

如本文中使用，术语“选择性水化”意图指将水性溶液选择性应用于阵列的含有聚合化合物(或彼此紧密相邻的其选择基团)的区域，而非那些区域之间的区域的步骤。此步骤产生在其表面上具有小滴阵列的基底，其中小滴的边缘对应于含有聚合化合物的特征的边界。

如本文中使用，术语“离散(的)小滴”意图指基底的表面上彼此分开的小滴。如下文会描述的，每个离散小滴可以占据单个区域(即，其中每个小滴位于单个聚合化合物之上)或者每个离散小滴可以占据多个区域(其中诸小滴被积极诱导以预定义的方式扩散入(bleed into)彼此中，从而一个小滴可以含有多种聚合物)。

如本文中使用，术语“每个小滴含有单一化合物”意图指含有相同的基本上纯的化合物的多个分子的小滴。

如本文中使用，术语“预定义”意图指在做出前已知的某事物。

如本文中使用，术语“基底上彼此相邻的预定义的聚合化合物组合”意图指基底表面上彼此相邻的聚合化合物组合，其中该组合是预先计划的。例如，并且如下文会更为详细解释的，基底上彼此相邻的预定义的聚合化合物组合可以通过使靶小滴(它们是相邻的小滴)扩散到彼此之中而生成。

如本文中使用，术语“从表面释放聚合化合物”意图指从基底表面切离聚合化合物的步骤。此步骤通过切割将聚合化合物与阵列表面连接的可切割接头来完成。

如本文中使用，术语“在不能混溶的液体中收集小滴”意图指这样的步骤，其中位于基底表面上的小滴被从基底物理分离，在不能混溶的液体中变为小滴，即乳液。

如本文中使用，术语“乳液”意图指通常不能混溶的的两种或更多种液体的混合物，其中一种液体形成另一种液体内分散的小滴。油包水乳液指含有水性小滴和有机(油性或疏水性)连续相的乳液。根据使用的液体，乳液的小滴可以在100nm至100μm，例如1μm至50μm的范围中。

如本文中使用，术语“小滴”意图指乳液的散布在与水不能混溶的连续液体(即不能混溶的液体)中的水性部分。

如本文中使用，术语“不能混溶的液体”意图指乳液的连续部分。

如本文中使用，术语“在溶液相中”意图指处于不与固体基底结合或维系的水性环境中的聚合化合物。这样的聚合化合物可以溶解在所述的水性环境中。

如本文中使用，术语“在基底上彼此相邻”意图指含有聚合化合物的区域，所述聚合化合物彼此紧密相邻(即彼此紧靠，没有中间含有聚合化合物的任何其它区域)。

如本文中使用，术语“混合物”意图指这样的溶液，其中组分彼此散在，并且不在空间上分开。

如本文中使用，术语“水性”意图指溶剂为水的介质。

如本文中使用，术语“化合物的多个分子”意图指含有相同化合物的多个分子的组合物。例如，含有化合物的至少100个分子的溶液含有相同化合物的至少100个分子。更具体地，若小滴含有某种寡核苷酸的至少100个分子，则它含有相同寡核苷酸的至少100个分子。

“多个”含有至少2个成员。在某些情况下，多个可以具有至少10，至少100，至少1,000，至少10,000，至少100,000，至少10⁶，至少10⁷，至少10⁸或至少10⁹或更多个成员。

如本文中使用，术语“聚合化合物的单体前体”意图指聚合化合物的游离的(即未聚合的)化学构建块，从这些化学构建块可以酶促或使用固相化学合成方法合成聚合化合物。聚合化合物的单体前体的身份可能取决于聚合化合物而变化，例如取决于聚合化合物是寡核苷酸、肽还是有机分子，还可能取决于将单体连接在一起的化学。在一些情况下，聚合化合物的单体前体可以是受保护的单体。寡核苷酸的单体前体包括亚磷酰胺(其可以在寡核苷酸的固相合成中使用)和核苷三磷酸(其可以在寡核苷酸的酶促合成中使用)。肽的单体前体包括N-保护的氨基酸。

说明书全文中可能出现其它术语定义。

示例实施方案描述

在描述各个实施方案前，应当理解本公开的教导不限于描述的具体的实施方案，并且因此当然可以变化。还应当理解，本文中使用的术语是仅为了描述具体的实施方案，并且并不意图为限制性的，因为本教导的范围仅会限于所附权利要求书。

本文中使用的部分标题仅为了组织目的，并且不应解释为以任何方式限制描述的主题。虽然本教导结合各个实施方案描述，但是并不意图本教导限于此类实施方案。相反，本教导涵盖各个备选、修改、和等同方案，如本领域技术人员应当领会。

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料也可以在实施或测试本教导中使用，现在描述一些例示性的方法和材料。

任何出版物的引用是为了其在申请日前的公开，并且不应解释为本发明没有资格承认凭借在先发明而早于此类出版物。此外，提供的出版日期可以不同于可以独立确认的实际出版日期。

如在阅读本公开后对于本领域技术人员会显见的，本文中描述并例示的每个单个的实施方案具有离散的组分和特征，其在不偏离本教导的范围或精神的前提下可以容易地与任何其它几个实施方案的特征分开或组合。可以以叙述的事件的次序或者以逻辑上可能的任何其它次序实施任何叙述的方法。

本文提及的所有专利和出版物，包括此类专利和出版物内公开的所有序列通过提及明确并入。

方法

图1中显示了方法的一些特征。参考图1，该方法的一些实施方案包括获得聚合化合物的阵列2。如图所示，聚合化合物A、B和C经由可切割接头与基底4的表面上的区域6、8和10结合，其中区域6含有聚合化合物A的多个分子，区域8含有聚合化合物B的多个分子，并且区域8含有聚合化合物C的多个分子。基底表面上的聚合化合物的存在使那些区域相对于基底表面的其余部分亲水，这使得那些区域能够被选择性水化而在基底表面上产生离散的小滴14、16和18，其中每个小滴含有单一聚合化合物或基底上彼此相邻的聚合化合物的组合。如图所示，在小滴14含有聚合化合物A的多个分子的情况下，小滴16含有聚合化合物B的多个分子，并且小滴18含有聚合化合物C的多个分子。

在小滴已经在基底上形成后，将不能混溶的液体22添加到基底，并且在不能混溶的液体中收集小滴，从而生成乳液24，其含有离散的小滴26、28和30，其中每个小滴在溶液相中含有单一聚合化合物或基底上彼此相邻的聚合化合物的组合。如图所示，在小滴26含有溶液中的聚合化合物A的多个分子的情况下，小滴28含有溶液中的聚合化合物B的多个分子，并且小滴30含有溶液中的聚合化合物C的多个分子。

容易想到的是，该方法还涉及通过在该方法的过程中切割可切割接头而从基底的表面释放聚合化合物。这可以在水化步骤之前、期间或之后完成。例如，在一些实施方案中，可以在水化前从表面释放聚合化合物，例如用氨气。在其它实施方案中，可以在水化期间或之后，但在添加不能混溶的液体前从表面释放聚合化合物，例如通过使用溶解再水化剂(rehydrant)中的试剂或者使用光，这取决于使用的可切割接头。在其它实施方案中，可以在添加不能混溶的液体后从表面释放聚合化合物，例如通过向不能混溶的液体中加入转移到小滴中的试剂。

在一些实施方案中，聚合化合物可以是以合成方式制造的寡核苷酸、肽或有机分子，通过合成组合化学方法生成，其合成是公知的(例如参见例如Cleary et al.,NatureMethods 2004 1:241-248,LeProust et al.,Nucleic Acids Research 2010 38:2522-2540,Panse et al.,Molecular diversity 2004 8:291–9,Lin et al.,Journal ofAllergy and Clinical Immunology 2009 124:315–22,Uttamchandani et al.,MolBiosyst.2006 2:58-68和Ma et al.,Drug Discov Today2006 11:661-8)。在一些实施方案中，所述方法可以包括在基底表面上原位合成聚合化合物。

阵列上的聚合化合物的密度可以为每μm²至少1000个分子，例如，每μm²至少1000个分子，每μm²至少5000个分子，每μm²至少10,000个分子，每μm²至少20,000个分子，每μm²至少50,000个分子，直至每μm²至少100,000个分子或更多。在某些实施方案中，含有聚合化合物的区域应当比周围表面实质性地更为亲水，使得周围表面将一定实用体积的水性流体限制于所述特征(其接触角可以低达20-30度)。在这样的情况下，对于特征间表面而言，水性流体的表面能将会低于润湿的临界表面能。含有聚合化合物的区域和聚合化合物间的区域之间的疏水性差异可以通过控制聚合物的密度、用于合成的单体的类型、聚合物的长度、接头化学，以及通过选择具有合适的表面特征的基底(或者修饰基底使它具有合适的表面特征)来加以控制。在某些情况中，含有聚合化合物的区域和聚合化合物间的区域之间的接触角的差异是至少10度、至少20度、至少30度、至少40度、直至50度或更多。如上文和下文提示的，在某些情况下，基底表面上的聚合化合物的存在使那些区域变得更加亲水。

在一些实施方案中，由聚合化合物占据的区域可以在1μm²至1mm²，例如2μm²至200μm²或5μm²至100μm²的范围中，尽管此范围外的区域也在考虑之中。在任何实施方案中，在基底表面上可以有至少1,000个区域(例如，至少5,000个区域、至少10,000个区域、至少50,000个区域、至少100,000个区域、至少500,000个区域或10⁶或更多个区域)含有聚合化合物。区域彼此分开的距离可以有很大的差异，在一些情况下，它们可以相距至少1μm的距离，例如至少5μm的距离、至少10μm的距离、或至少20μm的距离、直至至少50μm或更多的距离。在一些情况下，如下文更为详细描述的，一些区域设计为彼此非常接近(例如，小于5μm、小于2μm或小于1μm)，使得一旦水化后，各小滴扩散入彼此之中，以提供含有聚合物的预先确定的组合的小滴，其中聚合化合物在阵列上彼此邻近。

选择性水化可以通过任何合适的方法完成。在一些实施方案中，选择性水化可以如下完成：将阵列放置在具有受控湿度的环境中；b)将溶液印刷到含有化合物的区域上；c)使阵列接受冻融循环；或者d)将阵列浸入溶液中，并且从不含化合物的区域排干溶液。

如上文记录，在规程中的某个节点，切割维系聚合化合物的可切割键，从而从支持物的表面释放聚合化合物。有许多可切割接头可以使用，包括例如可以用碱(例如氨、甲胺、乙醇胺、乙二胺或三甲胺)、酸、氟化物或光子切割的可切割接头。碱可切割键(base-cleavage linkage)包括酯特别是琥珀酸酯(通过例如氨或三甲胺可切割)，季铵盐(例如可被二异丙基胺切割)和氨基甲酸乙酯(urethane)(可被氢氧化钠水溶液切割)；酸可切割位点，如苄醇衍生物(可使用三氟乙酸切割)，替考拉宁糖苷配基(teicoplaninaglycone)(可用三氟乙酸，随后用碱切割)，缩醛和硫缩醛(也可用三氟乙酸切割)，硫醚(可用例如HF或甲酚切割)和磺酰基(可用三氟甲磺酸、三氟乙酸、茴香硫醚等切割)；可用亲核体切割的位点，如邻苯二酰胺(可用取代的肼切割)，酯(可用例如三氯化铝切割)，和Weinreb酰胺(可用氢化铝锂切割)；和其它类型的化学可切割位点，包括硫代磷酸酯(可用银或汞离子切割)和二异丙基二烷氧基甲硅烷基(diisopropyldialkoxysilyl)(可用氟离子切割)。其它可切割的键将是本领域技术人员容易想到的或者记载于相关文献和教科书中(例如，Brown(1997)Contemporary Organic Synthesis 4(3)；216-237)。在具体的实施方案中，可以采用光可切割接头(例如，UV可切割接头)。适合于使用的光可切割接头可以包括基于邻硝基苄基的接头、苯酰甲基接头、烷氧基苯偶姻(alkoxybenzoin)接头，铬芳烃复合物接头，NpSSMpact接头和特戊酰基乙二醇(pivaloylglycol)接头，如记载于Guillier et al.(ChemRev.2000Jun 14；100(6):2091-158)。在一些情况下，切割可以释放聚合化合物，并且留下一个或多个疏水性残基，从而增加含有该聚合物的区域的疏水性。在其它情况下，切割可以释放聚合化合物，并且留下一个或多个亲水性残基，从而使含有聚合化合物的区域的疏水性相对不变。

在一些情况下，在选择性水化步骤前完成进行步骤。在这些实施方案中，可以通过将阵列暴露于氨气，从而切割将聚合化合物附着于基底的氨敏感性连接，来进行选择性水化。在其它实施方案中，可以通过将阵列暴露于光，从而切割将聚合化合物附着于基底的光可切割连接，来进行选择性水化。

在其它情况下，释放步骤可以在选择性水化步骤过程中或之后进行。在这些实施方案中，可以通过将含有切割剂的溶液印刷到含有化合物的区域上，从而切割将聚合化合物附着于基底的切割剂敏感性连接，来进行释放步骤。或者，可以通过将阵列暴露于光，其中光切割将聚合化合物附着于基底的光可切割连接，来进行释放步骤。

在备选的实施方案中，可以通过将阵列浸没于含有切割剂(例如铵)的不能混溶的作用剂中，从而切割将聚合化合物附着于基底的切割剂敏感性键，或者备选地，当阵列处于在不能混溶的液体中时将其暴露于光，来进行释放步骤(c)。在这些实施方案中，聚合化合物应当具有这样的设计，使得切割后留下维系于阵列表面的疏水性残基，从而增加阵列表面的疏水性并且让小滴能够容易地释放。

不能混溶的液体可以包含矿物油如Petroleum Special，烷如十七烷，卤化烷如溴代十六烷，碳酸油，全氟碳油，例如3M的NovekTMHFE-7500，烷基芳烃(alkylarene)，卤化烷基芳烃，醚，或具有高于100℃的沸腾温度的酯，举例而言。不能混溶的液体在水中应当是不溶的或微溶的。在某些情况下，乳液可以含有或不含添加的具有等于或小于例如5.0的亲水性-亲脂性平衡(HLB)值的表面活性剂。本领域技术人员可以领会，可以通过使用具有各种HLB值的各种表面活性剂来调节油相的表面活性剂亲和力差异(SAD)，使得可以制备稳定的反相(油包水)乳液。例如，氟化载体油氟表面活性剂(具有氟化尾部的表面活性剂)可急剧降低非氟化化合物的溶解度，对于形成具有长货架期的乳液是有效的。

可以使用任何方便的方法从基底收集小滴。在一些实施方案中，如图1中所示，可以如下完成收集：将不能混溶的液体施加阵列的表面；并且在不能混溶的液体中从基底的表面分离小滴。在某些实施方案中，已用于水化含有聚合化合物的区域的水性流体的接触角大于特征间表面的临界角，不能混溶的流体的接触角小于用于润湿特征间表面的临界角，并且特征内表面比特征间表面更为亲水。接触角的任何差异可以是至少5度、至少10度、至少20度、至少30度、至少40度或至少50度或更多。应当选用不能混溶的液体，使得小滴在其中是稳定的，并且理想地，表面将是足够亲油的，使得载体流体将超出其润湿表面的临界表面能。

在这些实施方案中，可以使用任何合适的方法从基底分离小滴。在一些实施方案中，并且如下文会更加详细描述的，可以如下从基底分离小滴：a)使疏水性的刀刃(blade)移动穿过基底表面，即利用刀刃将小滴温和地刮离基底表面；b)通过施加液体剪切力，例如通过温和地左右晃动阵列，使小滴侧向位移；c)通过离心使小滴位移；d)使小滴扩张，例如使用加热或负压；e)切割寡核苷酸，留下疏水性单体，从而使区域变为更为疏水；f)用具有一定形状的(shaped)声波或超声波或脉冲射击小滴；或者g)使用具有与小滴对齐的通道组的抽吸器从表面抽吸小滴。取决于小滴与不能混溶的液体的相对密度，小滴可能上升或落入基底中。

乳液组合物

还提供了乳液，其包含：含有单一聚合化合物或其预定义的混合物的多个小滴(其中所述预定义的混合物中的聚合化合物在阵列上彼此相邻)，和不能混溶的液体。在这些实施方案中，每个小滴包含多个分子，例如其中含有的化合物的至少100个分子、至少500个分子、至少1,000个分子、至少5,000个分子、至少10,000个分子、至少50,000个分子、至少100,000或至少10⁶个分子。具体地，若某个小滴含有单一聚合物，则该小滴中会有例如相同聚合化合物的至少100个分子。同样地，若某个小滴含有多个聚合物，则小滴中会有例如每个聚合化合物的至少100个分子。另外，所述多个小滴不含聚合化合物的单体前体，这意味着聚合化合物不在小滴中生成，而是在小滴形成之前生成。例如，若小滴含有寡核苷酸，则小滴不含可以被聚合酶用来制备寡核苷酸的核苷酸三磷酸(或任何其它类型的三磷酸前体)。在某些情况中，小滴也不含其它实体，例如其中所含的聚合化合物的合成所需的其它引物、酶(例如聚合酶)、辅因子和试剂。

可以通过任何合适的方法将小滴一次在乳液中保持分离达数月而不发生实质性的小滴聚并。用于稳定水和油乳液的方式记载于多种出版物，包括Shim et al.(J.Am.Chem.Soc.2009 42:15251–15256)。Leunissenet al.(PNAS2007 104:2585–2590)和Holtze et al.(Lab Chip 2008 8:1632-1639)。

取决于如何生成乳液，在某些实施方案中，至少10％的小滴(例如，至少20％的小滴、至少30％的小滴、至少40％的小滴或至少50％或更多的小滴)各自含有单一聚合化合物(即，相同化合物的多个分子)，并且那些小滴中的每个含有不同的单一聚合化合物。

在一些实施方案中，至少10％的小滴(例如，至少20％的小滴、至少30％的小滴、至少40％的小滴或至少50％或更多的小滴)各自含有预定义的聚合化合物混合物(即，其中含有的每种聚合化合物的多个分子)，并且那些小滴中的每一个含有不同的预定义的聚合化合物混合物。

在一些实施方案中，乳液可以包含至少10,000个小滴(至少50,000个小滴、至少100,000个小滴、至少500,000个小滴或至少10⁶或更多个小滴)，每个小滴含有不同的聚合化合物或其预定义的组合。在一些实施方案中，视需要，乳液的体积可以在10μl至10ml或更多，例如50μl至5ml，例如100μl至2ml的范围。

在某些实施方案中，小滴中的聚合化合物可以是单链寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸可以彼此部分互补，并且可以杂交并彼此连接以生成合成子(synthon)。此类乳液在基因合成方法中可以是有用的。在一些实施方案中，单链寡核苷酸可以是引物，例如与靶基因组杂交的引物。此类乳液可以在基因组学方法中有用，例如用于对基因组测序。

下文描述了关于一些实施方案的更多详情。下文使用寡核苷酸阵列来例示上文一般性描述的方法和组合物。不言而喻的是，下文描述的原则可以适用于其它阵列。

本文中提供了一种创建高复杂性乳液的方法，其中将核酸或其它聚合分子的大量独特组合被组合成非常小的独特流体性区室(fluidic compartments)。所得的这种乳液可以用于高通量筛选应用，这些应用中平行地测试或处理许多试剂、细胞、小分子等。该方法也可以适用于基因合成，其中多个较短的DNA寡核苷酸被组合生成较长的DNA构建体，其中每个较长的构建体的组分被分割成个别的区室。可以在单一乳液中从单一载玻片或晶片同时构建许多这样的组合，多达数十万个，包括数以百万计的化合物，其中一个晶片可以切成多个载玻片。

本公开提供了一种新办法来创建有序的(ordered)2维表面结合油包水乳液，并且然后从表面除去构成乳液的小滴，以创建体相或液相乳液，或者以创建被捕获在小通道，如微通道中的筒内的乳液。此办法可以将阵列或基底上合成或沉积的多种试剂在单一小滴中封闭、组合并区室化，形成复杂的乳液，并且通过一种多重化方式，其中每个组合的小滴含有一种或多种试剂。每个小滴可以含有一组独特的组成性化学模块，其具有如此的潜在复杂性，以至于在一些应用中，没有两个含有相同的化学模块组合的小滴。

该方法为大幅扩展独立的多组序列或化学(independent sets of sequences orchemistries)的区室化规模，从用现存的微孔板技术的数百个，扩充到使用微阵列技术的数十万，或甚至数百万个，创造了条件。方法包括产生大量的寡核苷酸(或其它化学)组，将每个组独立封装，以及将某个测定中每个组与独立样品共封装。这样，可以将每个化学组与一大组独立样品中的某个独特样品组合。

将复杂的寡核苷酸文库合成应用于大规模化学过程的主要挑战，是在不使用复杂且昂贵的机器人移液系统的情况下独立地分离和操作大量化学混合物。此问题通过在微滴(microdroplets)内封装化学品组(chemical sets)得到了解决，所述微滴利用两种异类介质间的表面能来分离混合物或样品(以及合适的表面活性剂)。这些介质经过挑选从而具有迥异的亲水或亲油性质，例如油和水。这样的微滴和乳液已经记载于许多文章中，并且用于许多应用，包括数字-PCR和靶向富集以供例如RainDance Technologies、LifeTechnologies和BioRad等公司测序。

对于样品条码化(sample barcoding)应用，可以组合两组小滴，其中一组小滴具有一系列独立的条形码，并且另一组小滴含有独立地区室化的多个样品或全细胞。使用小滴融合领域的技术人员已知的方法，将这两个独立组的小滴以高达每秒几千个小滴的速率一次一个小滴对(one droplet pair at a time)地快速连续组合或“融合”。

用于小滴回收的方法

可以在玻璃基底上合成寡核苷酸阵列。在合成后，基底在特征区内部与特征区外部具有完全不同的疏水性。在几种标准的寡核苷酸生成方法中，在合成特征前通过硅烷化方法使浮法玻璃基底变得疏水。表面的疏水性用接触角来量度，接触角是一致性的表面上的小滴的外表面的切线和其所在表面的平面之间的内角。对于由小水滴组成的测试探针，疏水性越大意味着接触角越大。在一种现今的方法中，空白基底上的水滴的接触角是约110度，是中等疏水的，而碳酸丙烯酯(一种极性非质子溶剂)的接触角是65-90度。在合成后，特征的占地面(footprint)变得更为亲水。包被在寡核苷酸中的表面的接触角比这低得多，在例如9-12度的范围，这说明经DNA包被的表面是高度亲水的。(参见例如Ladik etal.Nanoscape2010 7(1):19-23)。

本领域熟练的化学工作者可以使用涉及旋涂(spin coating)或蒸汽沉积的方法来控制并优化基底的疏水性。对于此应用，基底应当比含有核酸的特征更为疏水，并且其疏水性应当与油相当。对于某些应用，在寡核苷酸合成前，甚至可以在基底上形成具有差异疏水性的区域的空间图案。

可以通过使表面变为非极性而让表面变得疏水。这可以通过有机硅烷的键合遮蔽表面上的极性基团，如羟基，来加以实现。使用Agilent专有的化学来硅烷化Agilent基底表面。不过，可以使用已知的疏水涂层材料和化学来更进一步提高基底的疏水性。这些可以包括：甲基取代的烷基硅烷和氟化的烷基硅烷、二氧化钛、或其它非极性化学品。还有一类具有更高疏水性的超疏水性涂层材料，包括：氧化锰聚苯乙烯(MnO2/PS)、纳米复合氧化锌聚苯乙烯(ZnO/PS)、纳米复合沉积碳酸钙、碳纳米管结构和二氧化硅纳米涂层材料。凭借这样的化学，可以使基底变得亲油(和疏水)，以便被用作小水滴的转运介质的油所润湿。某些实施方案可以得益于超疏水性表面的使用。

合成过程中的一个步骤是从基底的表面切割寡核苷酸。这可以依靠可切割接头实现(参见例如LeProust et al.,见上文)。或者，可切割接头可以是光可切割接头，即可以被光切断的接头，光典型地是UV波长范围：300–350nm的光。可切割接头是DNA化学领域的技术人员已知的，有一些现在已商品化。一种常用的可切割接头是通过如下手段切割的：将基底暴露于氨气(NH₃)，典型地历时30分钟，以从基底解偶联寡核苷酸。然后暴露于氨气更长时间以将接头完全从合成的寡核苷酸解偶联。对于正常的寡核苷酸合成，在暴露于氨气后，用水性溶液淹没基底以除去寡核苷酸，该水性溶液将来自载玻片的所有寡核苷酸混合成单一合并物。

对于此应用，逐特征或逐小滴地从表面除去寡核苷酸，使每组分子与相邻的组保持分离。

冷凝

在某些实施方案中，通过在核苷酸特征的阵列的表面上冷凝形成水性小滴。在这些实施方案中，阵列封闭在环境受控的室中，其中精确控制表面温度和引入的气体的湿度。阵列表面上的寡核苷酸的阵列提供亲水性的区域。将水蒸汽导入装有载玻片的密封室中，然后水蒸汽优先在寡核苷酸所在的亲水性特征上冷凝。通过控制室的湿度、温度和压力以及独立控制基底自身的温度，可以精确控制冷凝的形成。亲水性寡核苷酸特征提供用于形成小水滴的成核位点。此过程可以通过自动图像系统监测和控制。通过几种可能的改进，可以减少不定位于特征的不想要的寄生小滴的形成。这些改进可以包括在基底表面上整合电阻涂层材料或电极，以优先加热特征之间的表面区域，或者在基底的下侧面整合热导性柱或孔的图案，这些柱或孔使得各特征相对于它们周围的区域得到冷却。在另一种方法中，将载玻片冷却到一定程度，使水能够在表面上冻结。已经发现此办法可降低特征间的寄生小滴的形成。

在一些实施方案中，在发生冷凝前从表面切割寡核苷酸，留下与表面共价结合的较短的寡核苷酸以维持其亲水特性，并且在其它实施方案中，在小滴形成后，利用可切割接头，如光可切割接头从表面释放寡聚物，在一些情况下改变其亲水性。

图2显示了在玻璃基底上的DNA特征表面上的水蒸汽冷凝。由于特征是亲水的，一开始水薄薄地散开在每个特征的整个表面上。一旦小水滴跨越特征的区域，由于每个特征周围的表面是疏水性的，进一步的冷凝会增加该特征的高度而不增加其接触面积。小滴的体积受限于接触角和特征边界处的基底表面能够支持的表面张力。由于切割下来的寡核苷酸应当留在它们被合成的特征附近或之内的表面上，小水滴应当能够吸收大量切割下来的寡核苷酸。

如果少量特征或一簇特征的位置彼此极其接近，而远离其他特征，那么那些小簇能在其表面发生接触时聚结。这对于组合独特特征的小群，例如以在同一小滴中组合不同寡核苷酸而言，是一种理想的机制。在此实施方案中，特征的小簇的空间分隔实质上小于特征组或特征簇之间的空间分隔。这可以通过将一些特征留白(即，无寡核苷酸合成)，使用特征的规则网格(grid)来实现。例如，可以使特征的某些行、列或对角线留白。或者，可以创建更复杂的特征图案，其中特征具有独特的寡核苷酸，例如，3、6、10或更多个特征的三角形簇，4、9、16或更多个特征的偏菱形或正方形图案或矩形图案，或(具有中心特征)或7、19、37…或更多个特征(通过以下公式规定：1+6n(n-1)/2)的蜂巢样式，或者对称性更低的图案也可以是同样有用的。这样，每个小滴的特征数目越高，产生的小滴的数目越低。这样，可以使用特征合并物来创建简单的特征样式，其中的几个在图3中呈现。

为了在切割构成特征的寡核苷酸后维持寡核苷酸特征的表面的亲水性，可切割接头可以位于与寡核苷酸合成的起始位置相距几个碱基，由此在每个特征的占地面(footprint)中的基底表面上留下短寡核苷酸序列(或疏水性单体)的床(bed)。这些短寡核苷酸序列中的每一个可以充当亲水性分子床(a hydrophilic bed of molecules)的一部分，该亲水性床充当液滴冷凝的成核位点。这些间隔物序列可以由具有最佳相关特性(可以包括合成产率和亲水性)的核苷酸的同聚体构成。寡核苷酸的亲水性元件不一定是天然的碱基。它可以是可以与足够亲水的寡核苷酸偶联的任何化学基团或修饰。在此方法中，特征(在寡核苷酸切割后)的亲水性可以通过改变接头和寡核苷酸前合成的碱基(化学基团)的数目来控制，这取决于寡核苷酸间的表面化学。

喷墨-小滴产生

冷凝方法的一种备选是使用喷墨将水性溶液的小滴直接沉积到每个寡核苷酸特征上。喷墨可以按照精确的图案快速射击小滴，并且在几分钟或甚至几秒内给整个载玻片或晶片覆盖小滴。这种小滴产生机构不像寡核苷酸打字机(writer)那样复杂，因为所有特征得到相同的试剂，并且没有浸没步骤。此装置的一种复杂之处是可能会需要控制湿度，以使得小滴维持其初始的大小，同时在整个沉积过程中，直至下一个步骤，没有显著的蒸发。另一种有效率的做法是将此机构与用于切割的氨气室集成，以尽量减少切割后的晶片操作。

此方法可提供在封装前对小滴引入额外试剂的自由。例如，如果想要省略基于氨的切割，那么可以使用另一种可切割接头——利用喷墨溶液中包含的试剂的可切割接头。还有，喷墨溶液中可以包含盐或缓冲液。此外，特定位点上可沉积的液体体积可以通过设计头部或者通过每个位点多次射击来加以控制。这意味着可以更容易地让小滴变得比特征大，并且涵盖多个特征。这种多特征能力(multi-feature capability)使那些小滴能够具有多个不同序列，每个序列服务于不同的目的。例如，特征可以是部分互补的，因而会形成双链双链体，这使得它们适合于与双链靶DNA连接。或者，一些特征可以充当引物，其它特征可充当条形码。

对于此多特征小滴实施方案，应当以一定方式将特征成簇排列，使得小滴会与其它排列成簇的小滴组合，从而仅有同一目标簇的多个特征会被用于该簇的超尺寸(oversized)小滴连接在一起。空隙(empty space)会防止小滴与非目标的特征的簇组合。例如，可以将小滴摆放成三角形三元组(triangular triplet)(给予标称的交错特征图案(interleaved feature pattern))，其中三个特征被单一小滴接触，并且该小滴与所有其它的三元组相隔至少一个空的特征行、列、或队(line of features)。较大的小滴比较小的小滴可能更易于操作和封装。此方法允许使用多特征簇，并且那些小滴可以在寡核苷酸组成上，或者在控制不同寡核苷酸的参比组合方面，具有更多的特征冗余性。

通过水性淹没(aqueous flooding)在阵列上产生小滴

可以在阵列上产生空间排列的小滴的阵列：用水性试剂淹没具有寡核苷酸的基底，洗脱试剂，把水性试剂留在寡核苷酸所在的亲水性区域上。随后，可以使用化学或光可切割接头从表面切割寡核苷酸，如下文进一步描述的。相同的图案可以通过将载玻片浸入水性试剂中实现。小滴的寿命关键性地依赖于小滴的大小(体积和面积)以及其环境的温度和湿度。它们持续的时间可以从几秒到无限长。通常，通过试剂洗脱如此形成的小滴相对于其直径而言是平坦的，这是弯月面的表面张力的动力学的结果。在形成后可以通过控制环境的湿度和温度控制和提高小滴体积。这样，可以通过冷却基底和/或添加水蒸汽或者冷却以冷凝蒸汽而使较小的小滴变大。当小滴在表面上形成时，数种参数影响它们的体积，最强的因素是疏水性区域的特征大小，但是也牵涉其它因素，可以利用这些来在形成期间优化小滴体积。这些额外的因素包括：水性介质的表面张力，介质中的化学组成，如分子的离子浓度或极性，介质的粘度，和弯月面移过特征时的速度。介质的化学组成对这些参数中的许多具有强的影响。可用于修改试剂的这些参数的作用剂包括但不限于：水、甘油、PEG(聚乙二醇)、盐、和表面活性剂。

图8(显示阵列表面上的空气中的小滴)和图9(显示阵列表面上的油中的小滴)中显示了通过用水性溶液将载玻片淹没并排水(flooding and draining)而产生的表面上的小滴的例子。

在阵列的表面上形成小滴后，也可以通过控制环境的湿度和温度使小滴稳定化。另外，可以改变它们的特性。例如，可以通过增加阵列表面上的冷凝速率来提高小滴的大小。并且，可以通过在表面上冷凝挥发油来稳定小滴，即使没有在油中完全浸没(completeemersion in the oil)。还有，可以向阵列上原位添加额外的试剂或样品以强化小滴的特性。例如，可以添加其它挥发性试剂以改变小滴的pH。或者，可以向小滴上射击额外的小滴，例如含有样品或试剂的额外的小滴，由此与表面上的小滴合并。

在含有聚合物的乳液的一些应用中，可以在初始载玻片或晶片上原位利用二维乳液。这些应用可以通过保持知晓哪个小滴含有哪些聚合化合物或化合物而受益。这为样品、细胞或细胞内容物(如通过杂交在表面上创建或存储的多核苷酸(RNA或DNA))的DNA条码化创造了条件。知晓哪个/些条形码在哪个位点，就可以把要记录和利用的信息与相同位点处的小滴组合的样品的其它性质关联，例如在下游数据分析中与样品或者在阵列上的特定位置处组合的细胞相关的表型信息。从基底的表面除去小滴有许多应用。在除去小滴并形成与可与源阵列分离的乳液的情况下，有大量的常规微流体方法可以用于利用这些高复杂性乳液。这一套丰富的微流体工具，有时称作“微流体逻辑”(microfluidic logic)，包括合并或融合小滴，合并或融合小滴与珠子，分选小滴，改变小滴周围的水性介质，形成双乳液、和最终破坏乳液以对其标记或条码化的组成实施批量操作等能力。

许多应用在小滴封装到油内之前，除了对表面附着的核苷酸外，需要各种试剂。这些试剂包括但不限于样品核酸、引物、酶、酶的辅因子和盐。对于通过冷凝增加小滴体积的实施方案，需要以比区室化反应所需浓度更大的浓度将这些试剂灌注(flood)到阵列上，使得其最终的经过提高的体积在必要的终浓度的范围内。在更大的反应物分子(诸如酶)的情况下，这些可以与短的核酸缀合，所述短的核酸与表面上的核酸杂交，并且把反应物保持在表面上，使反应物数目与它们要求的浓度相一致。

小滴的油灌注(Oleo-Flooding)

在形成小水滴后，可以对表面施加油性液体(即，非水性液体，与水不混溶，可以用作双相介质，用于携带小水滴作为乳液)以封装水性小滴。由于表面已经被制备为亲油性，油性液体容易在整个表面上薄薄地散开，或“润湿”表面。这描绘于图4，分三个阶段。显示了一个正在将油性分离流体沉积到基底上的移液管尖端。通过使用分布在整个表面上的多个尖端，或者通过移动一个或多个尖端跨过(across)基底，可以有利于整个表面的润湿。也可以倾斜基底以增强流体通过放置在室内的载玻片的流动。或者，可以通过朝向室内开放的孔来灌注室。或者，它也可以被旋涂，但是以足够低的速度，使得小水滴不被向心力移位。在我们的初步实验中，我们已经实验发现小滴对油灌注的稳健性令人惊讶。

从表面除去寡核苷酸小滴

有许多用于从表面除去寡核苷酸小滴的方法。这些包括：刮除(scraping)，通过液体剪切力的侧向移位，通过离心移位，小滴扩张，光切割，化学切割、声波和抽吸。下文更为详细讨论了上述的每一种方法。

通过刮刀(squeegee)物理刮除：理念上，从表面除去小滴的最简单的方法包括使用含有刀刃形状的疏水性材料的微刮刀，例如具有疏水性涂层的剃刀片，其沿着表面划或刮，它一边以倾斜角度移动穿过基底，一边释放小滴。此处的复杂性主要在于构建这样一个机械系统：在将刮刀划过其表面时使小滴保持浸没于液体中，而小滴没有可察觉的损失。在一些实施方案中，使用表面活性剂防止小滴在被迫彼此接触时聚并。

侧向位移：从表面除去小滴需要的物理力的量取决于油/水界面的表面能和小滴与小滴下的表面(特征占地面)间的界面处的表面能的差异。应用的力也可以与下述界面处的表面能相关：小滴和特征间表面(surface between features)之间的界面。为了简单，我们会假设载玻片的表面在疏水性上与油自身相当。在实践中，此方法可能需要特定的表面涂层材料。

若小滴/特征界面处的表面能相对较低，则简单的旋涡运动，或者液体的搅拌可足以从表面除去小滴。若它实质性更高，则可能需要更大的物理力。

可以这样施加力：用油填充室，以尽量减少流体运动，例如晃荡(sloshing)和表面波动，并且相对于流体侧向平移基底(或者反之)，如图5中描述。这应当通过突发或突然推动来实现。基底的突然侧向位移会拉扯小滴穿过围绕它的油性流体，从而产生剪切力。该力将与小滴的大小和流体的粘性成比例。此位移可以通过作动器(actuator)如电动机，螺线管，或压电换能器，或任何可平移基底的元件，或者通过由阻尼锤机构施加于基底的突然推动来实现，图5(a)。当基底在小滴下方移动，从具有高表面能(疏水性)的占地区到低表面能(疏水性)的间隙区时，流体的惰性应该会令小滴保持空间定位，图5(b)。由于间隙区将已被油“润湿”，小滴会完全被油包围，由此从基底释放，图5(c)。应当注意，提供的剪切力仅应满足从表面可靠地释放小滴所需，但是不应当过大而破碎小滴或使它们融合在一起。

一个相似但略微不同的实施方案是振荡流体或基底，振荡的频率实质上会把小滴摇游离(shake the droplets free)。另一个实施方案是使用流体运动把小滴从特征吹离，与使用风扇吹风将水吹离表面的方式类似。

离心：可以通过离心产生表面法向或侧向，或二者之间的任何位置的力。在此方法中，小滴上的力与两种流体的密度的差，以及液滴的体积成比例。离心机是常见的实验室设备，并且可以一次处理许多载玻片，使得方法变得低成本且有效。通过此方法，有必要在下述二者之间实现平衡：提供足够的力以释放小滴，同时保持加速度足够低以最小化或防止小滴聚并。

一种避免由于由离心机施加的力导致小滴聚并的手段是使高密度孔板以一定方式与每个载玻片相对，使得当每个小滴突然离开载玻片时落入其中一个孔中。只要每个小滴仅落入单一孔中，并且每个孔含有不超过一个小滴，就可避免融合。这些孔将构建为具有高度疏水性表面，使得在停止旋转后，小滴容易从孔中出来。此处的复杂性包括孔板中需要大量的孔，以及可能地，实现孔板和载玻片之间的对准(这可能是必需的)。这些高密度孔板应当是可重复使用的。

小滴扩展：在此方法中，通过蒸发或沸腾使得小滴扩展。有两种方法，可以单独或一起使用。一种方法包括加热水性小滴，另一种是在包含具有油层的基底的室中抽部分真空。在第一种方法中，通过优先加热水而不过度加热油的机制来加热小滴，而在第二种方法中，可以对含有乳液的室施加部分真空。在任一方法中，蒸发每个小滴中的一小部分的水性流体，从而扩展小滴的大小，使得它的浮力最终足以克服将它保持于表面的表面能。一旦小滴从表面被释放，它在油内上升，并且可以通过将表面上方的油保持相对较凉来使其冷却并冷凝。可以将室的上部区域冷却以便于产生必需的热梯度。

可以使用的两种迅速的热转移机构是调节到水吸收频率(如在微波炉中使用)的微波发生器(或Klystron)和红外激光(亦调节到水吸收波段)。这些方法的一种潜在的缺点在于若邻近的小滴扩展，则在小滴扩展过程中它们可能被迫接触，并可能导致小滴聚并。这可能限制载玻片上的特征的密度，并且因此限制可产生的小滴的数目。这可以通过使用激光加热机构来避免，如果将它用于空间寻址小滴而不加热邻近的小滴的话。此类激光束可以通过检流计、衍射元件、旋镜或DLP来操控，但是此种办法大大增加系统的复杂度。也可以通过使能源脉冲来短暂加热小滴。在另一种方法中，光束，如来自激光源，其以超过布鲁斯特角的角度从表面下方入射小滴，如此，仅加热小滴的底部1微米(the bottom micron)。

光切割：可以使用光可切割接头将寡核苷酸附着于表面，并且处理表面以使其在寡核苷酸合成前变为疏水，寡核苷酸的切割可以反转具有DNA的特征的亲水性质，使得一旦DNA寡核苷酸从表面解偶联，其恢复到更疏水的状态。若可以使此化学转化过程变得充分高效，则小滴对特征占地面不再具有亲和力，这样小滴就能够被释放到它周围的油性流体中。为了使此切割发生，可以对特征进行光学空间寻址，例如借助激光；或者可以通过泛光或定向照明，例如通过LED、UV灯或UV激光，将它暴露于光。表面的照明可以广泛遍及整个表面，或者可以依靠透镜，诸如显微镜物镜，在将光空间聚焦或者以图案投影到表面，这取决于需要切割哪些特征。最后，切割表面的极性会取决于在接头切割后保留于表面上的化学基团或聚合物的性质，以及所述基团是否可以被添加的化学试剂封闭、淬灭，或者与之起反应。若化学产生足够亲水的表面，则仅通过将整个载玻片淹没在或浸在水性溶液中即可以润湿特征，形成小滴。

类似地，一旦小滴在表面上已经形成并且在油中分离，可以操纵并利用亲水性基团的光化学切割，通过光切割改变基底表面的疏水性或亲油性，从表面释放小滴。在此情况下，特征的表面开始的时候是亲水的，以便形成小滴，然后通过除去亲水的或带电荷的基团，留下更为疏水的(或不带电荷的)残基，而使其变得疏水。

化学切割：化学可切割接头也是一种从表面除去小滴的有效方式。在一个实施方案中，可以应用化学试剂(如氨)切割接头，方式是将其掺入沉积到水性溶液上的水性溶液中。在此实施方案中，随着化学反应的进展，小滴对表面的附着越来越不牢固。此实施方案涉及使用在表面上留下疏水性残基的接头。在某个节点，可以通过任何方式，从轻微搅拌到更剧烈的手段，除去小滴，如上文描述。

在另一个实施方案中，切割接头的化学剂由浸没水性小滴的油性介质所携带，或者溶解于该油性介质中。在此情况中，由于特征被水性小滴保护起来，可以在切割步骤过程中搅拌或振动基底，来加速可切割接头和切割剂之间的反应速率。同样，一旦用亲水性表面被替换成疏水性表面，当足够大部分的接头被切断时，小滴会直接从表面分离。

杂交或疏水基团：在此方法中，将疏水基团附着于添加到水性样品或载体油中的寡核苷酸序列。此寡核苷酸序列与寡核苷酸切离到小滴中后保留于表面上的序列互补。寡聚物会以这样的方式在小滴和油之间的界面处聚集：它们的亲水性部分在水性小滴中，疏水性头部在油中。这些会扩散到表面，与表面上的寡聚物杂交，从而减少小滴和基底之间的接触面积，使小滴更容易除去。

声波或超声波：使用声换能器向小滴射击具有一定形状的(shaped)声波或超声波或脉冲，可以帮助小滴从表面除去。为此最好的工作方式可能是通过让小滴其共振频率之一附近建立谐振。由波诱导的振荡可以让油更多地侵入小滴和基底之间，最终从基底释放小滴。

抽吸：在另一个实施方案中，可以使用具有一组与小滴对齐的通道的头(head)从表面抽吸掉小滴。随着头移过载玻片，头内的每个通道交替遇到水性小滴和油小滴。头一边移动，一边抽吸在其路径中的任何东西，在通道或管道中交替形成油和水性液滴的小段(plug)。当水性小段移动到较宽的通道或管道时，会变为球状小滴，并且形成乳液。

图6中示意性描述了此方法。在此图中，抽吸头的前面具有一系列漏斗形的区域，它们让小滴集中在通道的中间。如图所示，正位移型抽吸器将小滴与用于乳液的载体流体一起吸到头中。一旦到了头中，小滴就流入小的微通道中。此方法的一个优点在于它使小滴以其原始顺序(如阵列上印刷的顺序)保持到微通道中。这种顺序保持在某些应用中是有用的。

光学镊子：在另一个实施方案中，可以使用光学镊子从载玻片的表面除去小滴。光学镊子这种手段可以用来使用高强度高斯激光束除去或控制液体内的显微介质目标，例如细胞。光学镊子通常可以在光束轴的横向上施加比沿着光束轴方向上更大的力，但由于光子压力，亦在光束传播方向上产生力。因此，可以有两种方式来使用此手段从表面除去小滴。使用横向方法时，可以将小滴从化学特征的较为亲水性的区域侧向拉扯到疏水性高得多(或超疏水)的相邻区域，在那里它会通过从表面移开并进入载体流体而得到较低的能量。或者，可以在传播方向上施加力，方法是通过将光束从基底下部引导到流体中并且温和地增加强度，或者通过将束腰(同时携带小滴的一部分)从表面移入表面上方的流体中。用于产生光学镊子的方法是本领域技术人员已知的(参考:K.C.Neuman and S.M.Blocka,“Optical Trapping”,Rev.Sci.Instrum.75,N0.9,(2004))。

电润湿：在又一个实施方案中，可以通过依靠电润湿从原表面吸引到第二表面来除去小滴。在此实施方案中，使第二表面(名义上与第一表面平行)与第一表面(其上附着有小滴)紧密接近，并且每个小滴(或小滴的一个子集)有一个对应的电极，电极被充电以创建电场梯度，该电场梯度将介质水性小滴吸引到此第二表面，并且将大多数小滴拉离第一表面。可以脉冲开启场以吸引小滴，然后将第二表面从第一表面拉开，场归零，从而小滴释放载体流体中。为了实现这点，将第二表面或者从第二表面伸出的电极成形为便于形成强场梯度的形状，并且包被绝缘层和超疏水涂层材料。所述表面或其电极可以成形为，例如，半球体，或者表面可以是平的，电极针从表面伸出，如描绘于图7中。后一种设计对于给定的施加电压可产生最大的场梯度。在一些实施方案中，针数比要除去的特征数少，使得在没有来自相邻电极的干扰的同时产生更大的场梯度成为可能。在这些实施方案中，一次从表面除去特征的多个子集(subsets)，连续进行直至除去全部。

已经采用电润湿，借助于与电极线的直接接触从基底除去油内的空水性小滴(参考：J.Hong and S.J.Lee“Detaching droplets in immiscible fluids from a solidsubstrate with the help of electrowetting”Royal Society of Chemistry,(2014)DOI:10.1039/c4lc01049c)。

在一些实施方案中，在浸没于载体流体中前，将水凝胶或藻酸盐沉积到基底上或者直接沉积到特征上。在这些实施方案中，可以依靠喷墨将藻酸盐(或水凝胶)沉积到特征上，随后沉积另一个具有钙溶液的小滴以聚合藻酸盐(或水凝胶)，之后添加载体流体。

对于一些应用，可以通过与阵列上化学合成的聚合化合物不同的手段将小滴条码化，以便于下游分类或鉴定。此条码化的实现可以通过在浸没到施加的油之前，向阵列上的每个化学小滴上沉积一个补充的条码化的小滴或条码化的珠子。通常，此条形码是光学条形码。这些光学条形码为在封装后和完成测定法前实现个别小滴的分离、分选或组合创造了条件。

通过本公开可实现的一种应用是复杂DNA结构的有序装配，例如在DNA折纸(DNAorigami)的构建中。应当可以通过将构建过程分成多个阶段，来增强复杂性或增加DNA结构的产生规模。此过程是这样工作的：首先将较小的组分组合成中间亚装配体(subassemblies)，接着将这些亚装配体组合成更大、更复杂的结构。通过将小滴——每个小滴包含少量的独特DNA组分——条码化，使得以有序的方式组合条码类似或条码独特的小滴(及其构成组分)成为可能，从而为形成更复杂的结构创造了条件。它还为使用一大组共同的组分，将独特的组分的阵列装配成多个独特的结构提供了可能性。

光学条形码的另一种潜在应用是用于合成基因、用于形成途径的多组基因、或更复杂的活生物体基因组机制或亚系统。在此应用中，可以将每个组分(其可以是基因的外显子或盒、基因、或基因组结构)独立条码化，并且在合成所有部分后，每个组分可以从复合乳液分离，以便使用各部分的任何组合形成更复杂的装配体。同样，可以分选这些中的每一个，并且组合成复杂的组合。

该乳液可以在多种应用中采用，包括单体型或定相测序、单细胞测序、多重基因合成或基因装配、和高通量测序。通过本文中使之能实现的规模放大，这些应用均可以实现前所未有的高复用水平。

在牵涉高通量筛选的应用中，每个小滴可以含有独特的化学模块，其可以是小分子、核酸或具有独特的基因组核酸构建体的细胞。在高通量筛选中，对这些化学模块进行测试以找到少数具有最佳特性者。在测试阶段结束时，基于表型测量或特性选择几个区室。此测试需要在原始的小滴在被选择后能鉴别出来，以鉴定原始元件的身份或该特定元件经历过的条件。在一些情况中，可以在分离最合适的区室后，通过化学分析，例如通过测序区室中的核酸，来确定每个元件的身份。参见例如，Xu et al.(PNAS,2009106(7):2289–2294)。

实施方案

公开的方面包括一种乳液，其包含：(a)多个小滴(droplets)，每个小滴含有单一聚合化合物或预定义的聚合化合物混合物，和(b)不能混溶的液体，其中：(i)每个小滴包含所述聚合化合物的至少100个分子；并且(ii)所述多个小滴不含有这些小滴中包含的聚合化合物的单体前体。在某些实施方案中，至少10％的小滴含有单一聚合化合物，并且每个小滴与所述10％的小滴中的其它小滴含有不同的聚合化合物。在某些实施方案中，至少10％的所述小滴含有聚合化合物的预定义的混合物，并且每个小滴含有与所述10％的小滴中的其它小滴不同的预定义的聚合化合物混合物(a different pre-defined mixture ofpolymeric compound)。在某些实施方案中，乳液包含至少10,000个小滴，每个小滴含有不同的聚合化合物或预定义的聚合化合物混合物。在某些实施方案中，聚合化合物是单链寡核苷酸。在某些实施方案中，至少10％的小滴各自含有预定义的单链寡核苷酸混合物，其中各寡核苷酸彼此部分互补，并且可以彼此杂交并连接以生成合成子(synthon)。在某些实施方案中，单链寡核苷酸是引物。

公开的方面包括生成乳液的方法，其包括：(a)获得基底表面上的聚合化合物的阵列，其中各聚合化合物经由可切割接头与所述基底结合，并且其中基底表面上含有各聚合化合物的区域相对于基底表面的其余部分是亲水的；(b)选择性水化含有各聚合化合物的区域以在基底的表面上产生离散的小滴，其中每个小滴含有单一聚合化合物或在基底上彼此相邻的聚合化合物的预定义的组合；并且(c)通过在水化步骤(b)之前、期间或之后切割所述可切割接头从基底的表面释放各聚合化合物。在某些实施方案中，聚合化合物是已经通过组合化学生成的合成制造的寡核苷酸、肽或有机分子。在某些实施方案中，步骤(a)包括在所述基底的表面上原位合成所述聚合化合物。在某些实施方案中，聚合化合物的密度为每μm²至少1000个分子。在某些实施方案中，区域在1μm²至1mm²的范围。在某些实施方案中，在基底的表面上存在至少1,000个含有聚合化合物的区域。在某些实施方案中，区域彼此以至少1μm的距离分开。在某些实施方案中，选择性水化如下完成：a)将阵列放置在具有受控湿度的环境中；b)将溶液印刷到含有聚合化合物的区域上；c)使阵列经历冻融循环；或者d)将阵列浸入溶液中，并且从不含所述化合物的区域排去溶液。在某些实施方案中，释放步骤(c)在选择性水化步骤(b)之前进行。在某些实施方案中，释放步骤(c)如下进行：将所述阵列暴露于氨气，从而切断将聚合化合物附着于基底的氨敏感性连接；或者将所述阵列暴露于光，从而切断将聚合化合物附着于基底的光可切割连接。在某些实施方案中，释放步骤(c)在选择性水化步骤(b)期间或之后进行。在某些实施方案中，释放步骤(c)如下进行：将含有切割剂的溶液印刷到含有所述化合物的区域上，从而切断将聚合化合物附着到基底的切割剂敏感性连接。在某些实施方案中，释放步骤(c)通过将阵列暴露于光来进行，其中所述光切断将聚合化合物附着于基底的光可切割连接。在某些实施方案中，释放步骤(c)如下进行：将阵列浸入含有切割剂的不能混溶的作用剂中，从而切断将聚合化合物附着于基底的切割剂敏感性连接。在某些实施方案中，如下进行收集：将不能混溶的液体施加于阵列的表面；并且在该不能混溶的液体中从基底的表面分离小滴。在某些实施方案中，分离通过如下进行：a)移动疏水性的刀刃穿过基底的表面；b)通过施加液体剪切力侧向移位(laterally displace)小滴；c)通过离心移位小滴；d)使小滴扩展；e)切割所述寡核苷酸，从而使所述区域变得更为疏水；f)用具有一定形状的声波或超声波或脉冲射击小滴；g)使用电场使小滴从基底的表面移开；h)利用通过光学镊子施加的力从基底的表面移位小滴；或i)使用具有与小滴对齐的一组通道的抽吸器从所述表面抽吸小滴。在某些实施方案中，该方法进一步包括：(d)在不能混溶的液体中收集小滴，从而产生含有多个离散小滴的乳液，每个小滴在溶液相中含有单一聚合化合物或在所述基底上彼此相邻的聚合化合物的组合。在某些实施方案中，如下所述进行收集：将不能混溶的液体施加于阵列的表面；并且在该不能混溶的液体中从基底的表面分离小滴。

Claims (25)

1.一种乳液，其包含：

(a)多个小滴，每个小滴含有单一聚合化合物或预定义的聚合化合物混合物，和

(b)不能混溶的液体，其中：

(i)每个所述小滴包含聚合化合物的至少100个分子；并且

(ii)所述小滴不含有其中所含的聚合化合物的单体前体。

2.权利要求1的乳液，其中至少10％的小滴含有单一聚合化合物，并且每个小滴含有与该10％的小滴中的其它小滴不同的聚合化合物。

3.前述权利要求中任一项的乳液，其中至少10％的小滴含有预定义的聚合化合物混合物，并且每个小滴含有与该10％的小滴中的其它小滴不同的预定义的聚合化合物混合物。

4.前述权利要求中任一项的乳液，其中乳液包含至少10,000个小滴，每个小滴含有不同的聚合化合物或预定义的聚合化合物混合物。

5.前述权利要求中任一项的乳液，其中聚合化合物是单链寡核苷酸。

6.前述权利要求中任一项的乳液，其中至少10％的小滴各自含有预定义的单链寡核苷酸混合物，其中各寡核苷酸彼此部分互补，并且可以彼此杂交并连接以生成合成子。

7.前述权利要求中任一项的乳液，其中单链寡核苷酸是引物。

8.一种生成乳液的方法，其包括：

(a)获得基底表面上的聚合化合物的阵列，其中聚合化合物经由可切割接头与基底结合，并且其中基底表面上含有所述聚合化合物的区域相对于基底表面的其余部分是亲水的；

(b)选择性水合含有所述聚合化合物的区域以在基底的表面上产生离散的小滴，其中每个小滴含有单一聚合化合物或在基底上彼此相邻的聚合化合物的预定义的组合；并且

(c)通过在水合步骤(b)之前、期间或之后切割可切割接头从基底的表面释放聚合化合物。

9.权利要求8的方法，其中聚合化合物是合成制造的寡核苷酸、肽或有机分子，已经通过组合化学生成。

10.权利要求9的方法，其中步骤(a)包括在基底的表面上原位合成聚合化合物。

11.权利要求8-10中任一项的方法，其中聚合化合物的密度为每μm²至少1000个分子。

12.权利要求8-11中任一项的方法，其中所述区域的范围在1μm²至1mm²。

13.权利要求8-12中任一项的方法，其中基底的表面上有至少1,000个含有所述聚合化合物的区域。

14.权利要求8-13中任一项的方法，其中所述区域彼此以至少1μm的距离分开。

15.权利要求8-14中任一项的方法，其中选择性水合如下进行：

a)将阵列放置在具有受控湿度的环境中；

b)将溶液印刷到含有所述聚合化合物的区域上；

c)使阵列经历冻融循环；或者

d)将阵列浸入溶液中，并且从不含所述化合物的区域排去溶液。

16.权利要求8-15中任一项的方法，其中释放步骤(c)在选择性水化步骤(b)之前进行。

17.权利要求16的方法，其中释放步骤(c)如下进行：

将所述阵列暴露于氨气，藉此切断将聚合化合物附着于基底的氨敏感性连接；或者

将所述阵列暴露于光，藉此切断将聚合化合物附着于基底的光可切割连接。

18.权利要求8-15中任一项的方法，其中释放步骤(c)在选择性水合步骤(b)期间或之后进行。

19.权利要求18的方法，其中释放步骤(c)如下进行：将含有切割剂的溶液印刷到含有所述化合物的区域上，从而切断将聚合化合物附着到基底的切割剂敏感性连接。

20.权利要求18的方法，释放步骤(c)通过将阵列暴露于光来进行，其中所述光切断将聚合化合物附着于基底的光可切割连接。

21.权利要求18的方法，释放步骤(c)如下进行：将阵列浸入含有切割剂的不能混溶的作用剂中，从而切断将聚合化合物附着于基底的切割剂敏感性连接。

22.权利要求8-21中任一项的方法，其中如下所述进行收集：

将不能混溶的液体施加于阵列的表面；并且

在该不能混溶的液体中从基底的表面分离小滴。

23.权利要求22的方法，其中分离如下进行：

a)移动疏水性的刀刃穿过基底的表面；

b)通过施加液体剪切力使小滴侧向移位；

c)通过离心移位小滴；

d)使小滴扩展；

e)切割所述寡核苷酸，从而使所述区域变得更为疏水；

f)用具有一定形状的声波或超声波或脉冲射击小滴；

g)利用电场使小滴从基底的表面移开；

h)利用通过光学镊子施加的力使小滴从基底的表面移位；或

i)使用具有与小滴对齐的一组通道的抽吸器从表面抽吸小滴。

24.权利要求8-23中任一项的方法，其进一步包括：(d)在不能混溶的液体中收集所述小滴，藉此产生含有离散的多个小滴的乳液，每个小滴在溶液相中含有单一聚合化合物或在所述基底上彼此相邻的聚合化合物的组合。

25.权利要求24的方法，其中收集如下所述进行：

将不能混溶的液体施加于阵列的表面；并且

在该不能混溶的液体中从基底的表面分离小滴。