CN106290866A - 牛乳头状瘤病毒13型抗体的间接elisa检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛乳头状瘤病毒13型抗体的间接ELISA检测方法，步骤包括：步骤1、构建重组表达质粒pET28a‑L1，以BPV13基因组为模板，针对BPV13衣壳蛋白L1基因序列设计特异性引物；通过PCR反应得到目的片段，对原核表达载体pET28a和目的片段同时双酶切，连接后得到重组表达质粒pET28a‑L1；步骤2、对目的蛋白进行表达及纯化；步骤3、建立BPV13抗体的间接ELISA检测体系，针对BPV13L1蛋白样本阴阳性临界值，进行判定。本发明的方法，步骤简单，准确率高。

Description

牛乳头状瘤病毒13型抗体的间接ELISA检测方法

技术领域

本发明属于动物病毒检测技术领域，涉及一种牛乳头状瘤病毒13型抗体的间接ELISA检测方法。

背景技术

牛乳头状瘤(bovine papillomatosis,BP)是由牛乳头状瘤病毒(BPV)引起肿瘤发生的慢性增生性疾病，在世界各地养牛场中均有流行，中国、日本、巴西、加拿大、澳大利亚、土耳其、英国、美国和印度均有报道。该病是奶牛的常见良性肿瘤病，多发生于体表、黏膜等，该病会损害动物皮革质量，降低动物体质。BPV可导致多种动物良性和恶性肿瘤病变，良性肿瘤在一般情况下可自行消退，但当环境因素和遗传因素协同作用时会导致癌变，进而导致动物死亡，最终造成肉类、奶业和皮革类行业严重的经济损失，且疾病发生于生殖器时会损伤公牛和母牛的生殖功能，降低生产性能，造成损失。

根据临床表现、流行病学、病理学观察等方式对牛乳头状瘤病不难作出初步的诊断；然而牛乳头状瘤除了发生在皮肤黏膜以外,还发生在消化道、膀胱等脏器，还有一些隐性感染的牛或非典型的病例，对于这些则缺乏有效的诊断方法，确诊必须借助实验室诊断。但由于BPV分型较多，对组织的特异性也有差异，因此，应用分子生物学技术对BPV进行型别鉴定是十分必要的。具体包括电镜、免疫荧光、血凝试验等检查方法，再结合临诊资料可得到确诊。但这些方法的缺点是操作繁琐、价格昂贵、灵敏性和特异性都不高。酶联免疫吸附试验(ELISA)因其操作方便，快速敏感、特异性强等优点现已被广泛应用于许多病原抗原或抗体的检测。

目前，对牛乳头状瘤的防治方法有疫苗预防、中药治疗、外科手术摘除、CO₂激光切除、烧烙治疗和瘤体液氮冷冻法来进行对牛乳头状瘤的预防及治疗的报道。现在已经研制出了针对BPV2和BPV4的疫苗，可以保护机体免受病毒感染，同时产生病毒中和抗体。然而，这些疫苗具有一定的特异性，只能使机体免受同种基因型的病毒感染。因此，急需一种能快速有效地检测和评价疫苗免疫后抗体水平的血清学诊断技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛乳头状瘤病毒13型抗体的间接ELISA检测方法，解决了现有技术在检测牛乳头状瘤病毒13的过程中，操作繁琐、检测成本高、灵敏性和特异性都不理想的问题。

本发明采用的技术方案是，一种牛乳头状瘤病毒13型抗体的间接ELISA检测方法，按照以下步骤实施：

步骤1、构建重组表达质粒pET28a-L1

以BPV13基因组为模板，针对BPV13衣壳蛋白L1基因序列设计特异性引物；通过PCR反应得到目的片段，对原核表达载体pET28a和目的片段同时双酶切，连接后得到重组表达质粒pET28a-L1；

步骤2、对目的蛋白进行表达及纯化；

步骤3、建立BPV13抗体的间接ELISA检测体系，针对BPV13 L1蛋白样本阴阳性临界值，进行判定，得到最终的检测结果。

本发明的有益效果是，以牛乳头状瘤病毒13型(bovine papillomavirus type13,BPV13)L1基因表达蛋白作为抗原，构建了重组表达质粒pET28a-L1，然后对目的蛋白进行表达及纯化，最后建立BPV13抗体的间接ELISA检测体系，针对BPV13 L1蛋白样本阴阳性临界值进行判定，得到最终的检测结果；该方法适用于大规模检测BPV13抗体的间接ELISA鉴别，能够为BPV13抗体的鉴别提供一种低成本、快捷的检测技术手段。

附图说明

图1是本发明方法中的L1基因PCR扩增电泳图；

图2是本发明方法中的重组表达质粒pET28a-L1双酶切鉴定电泳图；

图3是本发明方法中的His-L1融合蛋白可溶性分析电泳图；

图4是本发明方法中的His-L1融合蛋白表达纯化电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明的牛乳头状瘤病毒13型抗体的间接ELISA检测方法，按照以下步骤实施：

步骤1、构建重组表达质粒pET28a-L1

以BPV13基因组为模板，针对BPV13衣壳蛋白L1基因序列设计特异性引物，见表1，

表1、特异性引物的表达式

表1中，单行下划线部分为BamHⅠ和HindⅢ双酶切的酶切位点，波浪线下划线部分为2种引物5’端互补序列，双行下划线部分为突变后的碱基；

通过PCR反应得到目的片段，对原核表达载体pET28a和目的片段同时双酶切，连接后得到重组表达质粒pET28a-L1。

步骤2、对目的蛋白进行表达及纯化

将阳性重组大肠杆菌BL21(DE3)接种于含卡那霉素的LB液体培养基中进行IPTG诱导表达，IPTG浓度为1mM条件下，诱导6小时后，收集大量表达的阳性重组大肠杆菌BL21(DE3)并超声裂解，用8M尿素溶解包涵体并用滤膜过滤，采用镍离子亲和层析方法对表达的His-L1融合蛋白进行纯化，得到纯化的His-L1融合蛋白。

步骤3、建立BPV13抗体的间接ELISA检测体系

将纯化的His-L1融合蛋白作为包被抗原包被酶标板，确定His-L1融合蛋白包被浓度为92.5μg/mL；抗原包被条件为4℃过夜；使用5％脱脂奶粉封闭，封闭时间1小时；血清不稀释、作用时间90分钟；HRP-protein A IgG二抗的使用浓度为1：8000，作用时间30分钟；常温下，底物避光反应时间20分钟；

针对BPV13 L1蛋白样本阴阳性临界值，进行判定：

当样本OD450nm≥0.329时，判定为阳性；样本OD450nm＜0.264时，判定为阴性；介于二者之间者判为可疑，得到最终的检测结果。

在验证该ELISA检测方法的特异性时发现，BPV13不与IBRV、FMDV、BVDV阳性血清发生交叉反应，说明特异性较好。批内重复试验结果变异系数在1.734％～7.769％之间，说明同一样品在同一批试验中变异程度较小，具有良好的批内重复性。批间重复试验结果变异系数在1.589％～10.563％之间，表明同一样品在不同批次试验中变异程度较小，具有较好的重复性。

实施例

步骤1、牛乳头状瘤病毒13型L1基因的克隆和原核表达载体的构建

根据GenBanK中报道的BPV13病毒株全基因序列(海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室提交，登录号：KM258443)，利用DNAMAN软件设计引物，扩增L1基因的ORF区，为增加L1蛋白的表达量，对其密码子进行优化，再根据优化后的序列设计引物。本实施例用于扩增L1基因的特异性引物见上表1。

通过重叠延伸PCR扩增大小为1494bp的L1特异性目的基因，见图1，图1中从左到右标示分别是：M是指D2000DNA Marker，序号1是指L1基因PCR产物。

将回收纯化的L1基因和原核表达载体pET28a(+)同时进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切，用DNA胶回收试剂盒纯化回收L1基因和线性化载体，再将二者在4℃过夜连接，构建重组表达质粒pET28a-L1，酶切鉴定见图2，图2中从左到右标示分别是：M1是指λHindⅢDNAMarker，序号1是指重组质粒pET28a-L1，序号2是指重组质粒pET28a-L1经BamHⅠ和HindⅢ双酶切产物，M2是指D2000DNA Marker。

步骤2、His-L1融合蛋白的表达和纯化

将重组表达质粒pET28a-L1转化BL21(DE3)感受态细胞，挑取阳性重组菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、转速200r/分钟的条件下过夜振摇培养，扩大培养后，当菌液OD600达到0.5时，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达。离心收集大量表达的宿主菌，悬浮菌体沉淀，将含溶菌酶终浓度为0.1g/L的悬浮细菌置于冰浴中做超声破碎，超声3秒，间歇9秒，共超声5分钟，波幅30％；待超声菌液清亮时，4℃、转速12000r/分钟的条件下离心25分钟，分别收集上清和沉淀，取样进行SDS-PAGE电泳，确定表达产物是以可溶性形式或包涵体形式存在。

结果显示，His-L1融合蛋白存在于包涵体(沉淀)中，见图3，图3中从左到右标示分别是：M1是指蛋白质分子质量标准，序号1是指重组质粒pET28a-L1未诱导菌体表达产物，序号2是指重组质粒pET28a-L1诱导菌体表达产物，序号3是指表达产物超声波处理后上清，序号4是指表达产物超声波处理后沉淀。

收集的沉淀超声裂解后，用8M尿素溶解包涵体并用0.45μm滤膜过滤，用镍离子亲和层析纯化重组蛋白，通过SDS-PAGE鉴定，得重组蛋白大小为60kDa，见图4，图4中从左到右标示分别是：M1是指蛋白质分子质量标准，序号1是指重组质粒pET28a-L1未诱导菌体表达产物，序号2是指重组质粒pET28a-L1诱导菌体超声破菌后上清，序号3是指纯化产物。

步骤3、BPV13抗体检测间接ELISA最佳检测条件的确定以及特异性、敏感性和重复性实验

间接ELISA检测的基本操作程序包括以下几个小步骤：

1)包被：将纯化好的His-L1融合蛋白用包被液稀释成一定的浓度，包被在酶标板上，100μL/孔，4℃孵育过夜；

2)洗板：弃去包被液，用PBST洗涤液洗涤3次，每次3分钟，拍干；

3)封闭：加入含5％脱脂奶粉的封闭液，100μL/孔，在37℃封闭2小时；

4)待测样品：将待检血清稀释成一定浓度，每个样品重复两次，100μL/孔，同时每块酶标板设空白及阴阳性对照，37℃孵育1小时，洗涤方式同上；

5)酶标二抗：将辣根过氧化物酶标记的蛋白A(HRP-SPA)稀释成一定的浓度，100μL/孔，在37℃孵育1小时，洗涤方式同上；

6)显色：每孔加入100μL的TMB显色液，振荡摇匀，在37℃避光作用10分钟；

7)终止：每孔加入100μL的2mol/L硫酸终止液，进行终止反应；

8)读数：用酶标仪测定在450nm波长处的OD值。

以上8个小步骤是对前述的步骤3的细化补充。

验证：

1、采用棋盘滴定法选择抗原和血清的工作浓度

用包被液将纯化的重组蛋白抗原依次按照1：50、1：100、1：200、1：400、1：800五个浓度梯度进行稀释，每个稀释度100μL/孔包被，4℃过夜。洗涤拍干，用含5％脱脂奶粉封闭液封闭2小时。然后再洗涤拍干，将牛乳头状瘤病毒阴阳性血清分别作1：20、1：40、1：80、1：160倍稀释，与稀释前原血清五个稀释梯度组成方阵，每个抗原稀释度各加1孔阳性和阴性对照，100μL/孔，37℃反应1小时。洗涤拍干后，按照方阵加入1：5000稀释好的辣根过氧化物酶标记的蛋白A(HRP-SPA)作为二抗，100μL/孔，37℃反应1小时，洗涤拍干加入TMB显色液100μL/孔，摇匀，37℃避光显色10分钟，然后加入2mol/L H₂SO₄在100μL终止液终止反应，在酶联检测仪上读出OD450nm的值，结果见表2。

表2、重组蛋白抗原最适包被浓度与血清稀释倍数的确定

注：+表示阳性血清OD450nm值，-表示阴性血清OD450nm值。

2、最佳封闭时间的确定

将His-L1融合蛋白稀释到最佳抗原包被浓度包被酶标板，加入封闭液，37℃分别作用30、60、90、120分钟。加入过量的标准BPV阴阳性血清，37℃反应1小时，洗涤拍干后加入1：5000稀释的酶标二抗，37℃反应1小时，洗涤拍干后加入TMB底物反应液100μL/孔，显色10分钟，每孔加2mol/L H₂SO₄在100μL终止液终止反应。在酶联检测仪上读出OD450nm值，计算P/N值。将P/N值最大的一组作为封闭的最佳时间，结果见表3。

表3、最佳封闭时间

3、最佳血清作用时间的确定

根据前面确定的最佳条件，按照ELISA程序，加入标准BPV阴阳性血清。37℃分别作用30分钟、60分钟、90分钟、120分钟，进行ELISA检测。终止后测定OD450nm值，计算P/N值。将以P/N值最大的一组作为血清作用的最佳时间，结果见表4。

表4、待检血清不同反应时间的OD450nm值

4、最佳酶标二抗浓度的确定

根据前面确定的最佳条件，按照ELISA程序，辣根过氧化物酶标记的蛋白A(HRP-SPA)酶标二抗按照1：3000、1：5000、1：8000稀释，终止后测定OD450nm值，计算P/N值。将P/N值最大的一组作为酶标二抗的最佳作用浓度，结果见表5。

表5、酶标二抗最佳浓度的确定

5、最佳酶标二抗作用时间的确定

根据前面确定的最佳条件，按照ELISA程序加入酶标二抗。37℃分别作用30、60、90、120分钟进行ELISA检测。终止反应，测定OD450nm值，计算P/N值。将P/N值最大的一组作为酶标二抗的最佳作用时间，见表6。

表6、酶标二抗最佳作用时间的确定

6、最佳底物反应时间的确定

根据前面确定的最佳条件，按照ELISA程序，加入底物后，37℃分别作用5、10、15、20、25、30分钟。终止反应，测定OD450nm值，计算P/N值。将P/N值最大的一组作为底物的最佳作用时间，结果见表7。

表7、底物显色时间的确定

7、间接ELISA方法阴阳性临界值的确定

在最佳反应条件下，取14份阴性牛血清样品进行间接ELISA检测分析。按照ELISA操作程序进行测定，读取OD450nm值，计算出14份血清的OD450平均值X和标准差SD，根据统计学原理，OD450nm值≥X+3SD时判为阳性；OD450nm值＜X+2SD者判为阴性，介于二者之间者判为可疑。

结果显示，ELISA阴阳性临界值为0.329，OD450nm≥0.329为阳性：阴性临界值为0.264，OD450nm＜0.264时判为阴性。

8、特异性试验

按照摸索的重组蛋白浓度包被酶标板，分别用重组抗原与牛病毒性腹泻(BVD)阳性血清、牛传染性鼻气管炎(IBR)、A型口蹄疫(A-FMD)和O型口蹄疫(O-FMD)阳性血清进行ELISA检测，同时设BPV标准阴、阳性对照，确定重组抗原与其它常见牛病阳性血清是否发生交叉反应，结果见表8。

表8、特异性检测结果

9、重复性试验

(9.1)批内重复性试验

取同批次纯化的重组蛋白包被同一块酶标板，对已知的3份阳性血清和3份阴性血清样品进行检测，每份样品作3个重复。按已优化好的ELISA操作程序进行试验，测定OD450nm值。对结果进行统计学分析，计算变异系数并评价批内重复的试验效果，结果见表9。

表9、批内重复性试验

(9.2)批间重复性试验

用四批次的抗原包被酶标板，对已知的3份阳性血清和3份阴性血清样品进行检测。按已优化好的ELISA操作程序进行试验，测定OD450nm值。对结果进行统计学分析，计算变异系数并评价批间重复的试验效果，结果见表10。

表10、批间重复性试验

10、敏感性试验

将阳性血清做1：40、1：80、1：160、1：320、1：640、1：l 280、1：2560七个稀释度，按最佳反应条件进行ELISA反应，结果见表11。

表11、敏感性实验结果

Claims (5)

1.一种牛乳头状瘤病毒13型抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，按照以下步骤实施：

步骤1、构建重组表达质粒pET28a-L1

以BPV13基因组为模板，针对BPV13衣壳蛋白L1基因序列设计特异性引物；通过PCR反应得到目的片段，对原核表达载体pET28a和目的片段同时双酶切，连接后得到重组表达质粒pET28a-L1；

步骤2、对目的蛋白进行表达及纯化；

步骤3、建立BPV13抗体的间接ELISA检测体系，针对BPV13L1蛋白样本阴阳性临界值，进行判定，得到最终的检测结果。

2.根据权利要求1所述的牛乳头状瘤病毒13型抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述的步骤1中，特异性引物的表达式见表1，

表1、特异性引物的表达式

表1中，单行下划线部分为BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切的酶切位点，波浪线下划线部分为2种引物5’端互补序列，双行下划线部分为突变后的碱基。

3.根据权利要求1所述的牛乳头状瘤病毒13型抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述的步骤2中，对目的蛋白进行表达及纯化的具体步骤是：

将阳性重组大肠杆菌BL21接种于含卡那霉素的LB液体培养基中进行IPTG诱导表达，收集大量表达的阳性重组大肠杆菌BL21并超声裂解，用尿素溶解包涵体并用滤膜过滤，采用镍离子亲和层析方法对表达的His-L1融合蛋白进行纯化，得到纯化的His-L1融合蛋白。

4.根据权利要求1所述的牛乳头状瘤病毒13型抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述的步骤3中，建立BPV13抗体的间接ELISA检测体系的具体步骤是：

将纯化的His-L1融合蛋白作为包被抗原包被酶标板，确定His-L1融合蛋白包被浓度为92.5μg/mL；抗原包被条件为4℃过夜；使用5％脱脂奶粉封闭，封闭时间1小时；血清不稀释、作用时间90分钟；HRP-protein A IgG二抗的使用浓度为1：8000，作用时间30分钟；常温下，底物避光反应时间20分钟。

5.根据权利要求1所述的牛乳头状瘤病毒13型抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述的步骤3中，针对BPV13L1蛋白样本阴阳性临界值，判定标准是：

当样本OD450nm≥0.329时，判定为阳性；样本OD450nm＜0.264时，判定为阴性；介于二者之间者判为可疑。