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CN106537144A - 有核红血球的分选方法 - Google Patents

有核红血球的分选方法 Download PDF

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CN106537144A
CN106537144A CN201580039333.8A CN201580039333A CN106537144A CN 106537144 A CN106537144 A CN 106537144A CN 201580039333 A CN201580039333 A CN 201580039333A CN 106537144 A CN106537144 A CN 106537144A
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white blood
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石井靖幸
松原兼太
福井真郎
福井真一郎
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Fujifilm Corp
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Abstract

本发明提供一种能够可靠地从母血分离源自胎儿的有核红血球的有核红血球的分选方法。本发明的有核红血球的分选方法具有：候选细胞选择工序，根据细胞的形状选择有核红血球的候选细胞；白血球选择工序，设定包含候选细胞的搜索范围，选择搜索范围内的白血球；有核红血球确定工序，通过候选细胞与白血球之间的血红蛋白的分光特性的比较，确定候选细胞为有核红血球；及分选工序，通过有核红血球确定工序之后的有核红血球中包含的等位基因与在候选细胞选择工序中未被选择的白血球或在白血球选择工序中被选择的白血球中包含的等位基因的比较，将有核红血球分选为源自母体的有核红血球或者源自胎儿的有核红血球。

Description

有核红血球的分选方法
技术领域
本发明涉及一种有核红血球的分选方法，尤其涉及利用细胞的形状信息、光学信息及基因信息，确定妊娠母体的血液中的源自胎儿的有核红血球的有核红血球的分选方法。
背景技术
作为产前诊断，一直以来进行通过羊膜穿刺术来查看羊水中的胎儿细胞的染色体的羊水检查。然而，该方法中，作为重大问题被指出存在流产的可能性。
另一方面，最近得知胎儿细胞在妊娠母体(以下，还简称为“母体”)的血液中移动，该胎儿细胞与血液一同在母体中循环。因此，若能够利用母血以良好的再现性可靠地分析母血中的胎儿细胞的染色体的DNA(脱氧核糖核酸：deoxyribonucleic acid)，则能够实现流产可能性较低的安全的产前诊断。
然而，存在于母体的血液中的胎儿细胞(有核红血球)在母血数mL(1mL＝10-6m3)中仅存在1个左右。可靠地获取如此极少的胎儿细胞(有核红血球)对利用母血进行的产前诊断而言是非常重大的课题。
对这种课题，下述专利文献1中，记载有对有核红血球进行浓缩的方法，例如利用密度梯度离心分离去除血浆成分及母亲的红血球成分的技术。并且，非专利文献1、非专利文献2中，记载有利用如下技术获取母血中的作为胎儿细胞的有核红血球的内容，即，利用对白血球表面的蛋白质特异地免疫反应的抗体，通过磁力分离母亲的白血球的技术(MACS法：Magnetic activated cell sorting)、利用对胎儿血红蛋白的γ链特异地免疫反应的抗体与荧光色素分离胎儿的有核红血球的技术(FACS法：Fluorescence activated cellsorting)等。
这些方法是有助于增加血液中的源自胎儿的有核红血球的浓度来提高获取目标细胞的概率的技术。然而，源自胎儿的有核红血球的周围仍然存在源自母体的血液细胞，因此无法可靠地在短时间内获取到源自胎儿的有核红血球。
并且，公开有利用光学信息识别细胞种类来获取所需要的细胞的技术。例如，专利文献2中记载有如下方法，即，使老鼠胎儿血红蛋白抗体与涂布于载波片上的包含源自胎儿的有核红血球的血液反应，接着，使其与生物素共轭山羊抗老鼠抗体反应，添加ALP(Alkaline Phosphatase)共轭链霉亲和素，并添加载体蓝色基质，通过该方法从包含源自母体的有核红血球的母体细胞分离源自胎儿的有核红血球。专利文献3中记载有利用血红蛋白的最大吸収波长附近的415nm的波长的光来识别血细胞种类的装置。专利文献4中记载有进行利用生物组织的光学性质的生物信息分析的内容，并记载有利用氧化血红蛋白及还原血红蛋白的光吸收之差来检测组织的供氧状态的装置。专利文献5中记载有以将血液涂布于载波片，并根据形态识别胎儿细胞，分别仅采集胎儿细胞为目的的有核细胞搜索自动化装置。专利文献6中记载有用于分析样品内的生物化学物质、微生物、细胞等的生物化学检查装置。
以往技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2012/023298号公报
专利文献2：日本特表2002-514304号公报
专利文献3：日本特开昭58-115346号公报
专利文献4：日本特开2014-14485号公报
专利文献5：日本特开2004-248619号公报
专利文献6：日本特开2004-361158号公报
非专利文献
非专利文献1：Y.L.Zheng et.al.“Prenatal diagnosis from maternal blood:simultaneous immunophenotypingand FISH of fetal nucleated erythrocytesisolated by negative magnetic cell sorting”J Med.Genet.1993Dec；30(12):1051-1056
非专利文献2：Y.L.Zheng et.al.“Flow sorting of fetal erythroblastsusing intracytoplasmicanti-fetal haemoglobin:preliminary observations onmaternal samples”Prenat Diagn.1995Oct；15(10):897-905
发明的概要
发明要解决的技术课题
专利文献2～5中记载的发明作为能够分离有核红血球的技术而有效，但是专利文献2中，由于血红蛋白存在于细胞质，因此被细胞膜与外部隔开，无从得知源自胎儿的有核红血球是否以高效产生免疫反应。专利文献3中，在溶液中分离红血球与白血球，但未能充分进行分离，产生红血球与白血球的混入。专利文献4及专利文献5为利用细胞的形状、光学信息来分离细胞的技术，但并未记载分离源自母体及源自胎儿的源自不同个体的有核红血球的内容。因此，仍然存在可靠地分离源自胎儿的有核红血球的课题。并且，除了将有核红血球分离为源自胎儿的有核红血球的情况以外，有时还选择白血球作为有核红血球的候选细胞，因此需要从候选细胞分离红血球与白血球。
本发明是鉴于这种情况而完成的，其目的在于提供一种能够可靠地从母血分离源自胎儿的有核红血球的有核红血球的分选方法。
用于解决技术课题的手段
为了实现所述目的，本发明提供一种分选方法，其具有：候选细胞选择工序，根据细胞的形状选择有核红血球的候选细胞；白血球选择工序，设定包含候选细胞的搜索范围，选择搜索范围内的白血球；有核红血球确定工序，通过候选细胞与白血球之间的血红蛋白的分光特性的比较，确定候选细胞为有核红血球；及分选工序，通过有核红血球确定工序之后的有核红血球中包含的等位基因与在候选细胞选择工序中未被选择的白血球或在白血球选择工序中被选择的白血球中包含的等位基因的比较，将有核红血球分选为源自母体的有核红血球或者源自胎儿的有核红血球。
根据本发明的有核红血球的分选方法，通过选择有核红血球的候选细胞，将包含该有核红血球的候选细胞的范围设定为搜索范围，并搜索该搜索范围内的白血球，进行候选细胞与白血球的比较，由此能够进行候选细胞是否为有核红血球的判断。
以往，作为候选细胞，无法防止白血球的混入时，有时候选细胞全部为源自白血球的细胞。此时，确认基因信息，若确认到不存在有核红血球尤其是源自胎儿的有核红血球，则不得不再次从候选细胞的分选重新进行，低效且花费时间。
根据上述有核红血球的分选方法，通过有核红血球确定工序确定候选细胞为有核红血球，候选细胞中没有源自白血球的细胞的混入，因此能够更快且以更低的成本更可靠地在下一工序中确定源自胎儿的有核红血球。
并且，分选工序中，比较有核红血球确定工序之后的有核红血球与分选工序之前的工序中已知的白血球之间的等位基因。白血球为源自母体的血液成分，因此能够将具有与白血球不同的等位基因的有核红血球分选为源自胎儿的有核红血球，并将具有与白血球大致相同的等位基因的有核红血球分选为源自母体的有核红血球。
为了实现所述目的，本发明提供一种有核红血球的分选方法，其具有：候选细胞选择工序，根据细胞的形状选择有核红血球的候选细胞；白血球选择工序，设定包含候选细胞的搜索范围，选择搜索范围内的白血球；有核红血球确定工序，通过候选细胞与白血球之间的血红蛋白的分光特性的比较，确定候选细胞为有核红血球；及分选工序，通过确认是否存在有核红血球确定工序之后的有核红血球中包含的Y染色体，将有核红血球分选为源自母体的有核红血球或者源自胎儿的有核红血球。
根据本发明的有核红血球的分选方法，选择有核红血球的候选细胞，将包含该有核红血球的候选细胞的范围设定为搜索范围，搜索该搜索范围内的白血球，并进行候选细胞与白血球的比较，由此能够进行候选细胞是否为有核红血球的判断。
并且，胎儿为男婴时，分选工序中通过确认在有核红血球确定工序之后的有核红血球中的Y染色体的存在，能够分选为有核红血球为源自胎儿的有核红血球。
本发明的另一方式中，优选搜索范围为从候选细胞根据候选细胞的大小逐步地设定的范围，白血球选择工序中选择搜索范围内的白血球，根据所选择的白血球的数量扩大搜索范围。
该方式中规定设定搜索范围的方法，搜索范围能够根据候选细胞的大小逐步地设定。逐步地设定搜索范围，在最初设定的搜索范围内，当无法选择所希望的白血球的数量时，通过逐步地扩大搜索范围，能够使白血球的数量成为所希望的值。通过增加白血球的数量，能够对白血球的光学信息进行平均，因此能够对成为与所分选的有核红血球之间的差异的基准进行平均，从而能够抑制偏差。
本发明的另一方式中，优选搜索范围从与候选细胞的距离最近的白血球依次选择距离变远的白血球，是白血球的选择数量成为2个以上且20个以下的范围。
该方式规定设定搜索范围的另一方法，搜索范围能够从与候选细胞的距离最近的白血球依次选择。作为白血球的数量，为2个以上且20个以下。通过设为该范围，能够平均化白血球的光学信息，并且，白血球的数量越多越能够平均化光学信息，因此优选，但若数量变得过多，则白血球的测定花费时间，因此更优选设为3个以上且10个以下。
另外，“候选细胞至白血球的距离”是指候选细胞的中心与白血球的中心之间的距离或候选细胞的重心与白血球的重心之间的距离。
本发明的另一方式中，优选分光特性为选自400～650nm的光波长区域中包含的波长的至少1个单色光中的吸光度。
血红蛋白在400～650nm的光波长区域中示出光吸收，因此通过使用400～650nm的光波长区域中包含的波长中的吸光度，当候选细胞为有核红血球时，能够明确与白血球之间的吸光度的差异。因此，通过比较候选细胞与白血球，能够进行是否为有核红血球的判断。
本发明的另一方式中，优选候选细胞选择工序包括第1工序，所述第1工序中选择如下细胞，即，将细胞的细胞质的面积设为C，将细胞的细胞核的面积设为N时，细胞的细胞核的面积相对于细胞的细胞质的面积的比率满足(1)式(还称为式1)。
0.25＜N/C＜1.0 (1)
本发明的另一方式中，优选候选细胞选择工序包括第2工序，所述第2工序中选择如下细胞，即，将细胞的细胞核的面积设为N，将与细胞的细胞核外接的圆形的直径长度或椭圆形的长径长度设为L时，细胞核的面积相对于圆形的直径或椭圆形的长径的长度的平方的比率满足(2)式(还称为式2)。
0.65＜N/(L×L)＜0.785 (2)
上述方式通过候选细胞选择工序中的细胞的形状规定选择候选细胞的具体条件，(1)式规定细胞的细胞质与核的面积比率，(2)式规定核的圆形程度。具有上述(1)式及(2)式的条件的核的细胞为红血球的可能性较高，因此能够提高候选细胞为有核红血球的可能性。
发明效果
根据本发明的有核红血球的分选方法，根据细胞的形状选择成为有核红血球的候选的细胞，根据分光特性确定为红血球之后，根据基因信息将有核红血球分选为源自胎儿或源自母体。根据基因信息进行分选时，能够获取没有混入源自白血球的细胞的有核红血球，因此能够更快且以更低的成本更可靠地确定源自胎儿的有核红血球。
附图说明
图1是表示胎儿的染色体的检查方法的步骤的流程图。
图2是表示确定工序的步骤的流程图。
图3是表示候选细胞选择工序的步骤的流程图。
图4A是表示欲选择的细胞的形状的示意图。
图4B是表示欲排除的细胞的形状的示意图。
图5是说明根据白血球的数量设定搜索范围的方法的图。
图6是表示根据白血球的数量设定搜索范围的步骤的流程图。
图7是说明对白血球根据候选细胞的面积设定搜索范围的图。
图8是表示对白血球根据候选细胞的面积设定搜索范围的步骤的流程图。
图9是表示根据光学特性进行的有核红血球确定工序的步骤的流程图。
具体实施方式
以下，根据附图，对本发明所涉及的有核红血球的分选方法进行说明。另外，本说明书中，“～”以作为下限值及上限值包含记载于其前后的数值的含义使用。
[胎儿的染色体的检查方法]
作为本发明所涉及的有核红血球的分选方法，利用胎儿的染色体的检查方法进行说明。
图1是表示胎儿的染色体的检查方法的步骤的流程图。胎儿的染色体的检查方法具有：采集工序(步骤S12)，从妊娠母体采集母血；浓缩工序(步骤S14)，对母血中的有核红血球进行浓缩；确定工序(步骤S16)，从通过浓缩工序已浓缩有核红血球的母血中，根据细胞的形状及核的形状、血红蛋白的分光特性确定有核红血球；扩增工序(步骤S18)，至少扩增确定工序中确定的有核红血球的染色体的核酸；分选工序(步骤S20)，通过将通过扩增工序扩增的扩增产物的等位基因与源自母体的白血球进行比较，或通过确认是否存在通过扩增工序扩增的扩增产物的Y染色体，分选为源自母体的有核红血球或者源自胎儿的有核红血球；及决定工序(步骤S22)，通过所确定的扩增产物的量与母体的染色体或已知没有异常的胎儿的染色体的扩增产物的量之间的比较，决定是否存在源自胎儿的染色体的数量异常。本发明的有核红血球的分选方法包括确定工序(步骤S16)及分选工序(步骤S20)。
＜采集工序(步骤S12)＞
采集工序为采集作为血液试料的母血的工序。作为母血，优选不会造成侵入的妊娠母体的外周血。
母体的外周血中，除了源自母体的嗜酸性细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等白血球或无核的成熟红血球以外，还包含源自母体的有核红血球及源自胎儿的有核红血球。认为源自胎儿的有核红血球在妊娠之后从6周左右开始存在于母血中。进行产前诊断的本实施方式中，检查妊娠后6周左右以后的母体的外周血。
源自胎儿的有核红血球为通过胎盘而存在于母体的血液中的红血球前体。母体在妊娠期间，胎儿的红血球有可能有核。该红血球中存在染色体，因此能够以侵入性较低的方法获得源自胎儿的染色体及胎儿基因。认为该源自胎儿的有核红血球以在母血中的细胞的每106个中存在1个的比例存在，母体的外周血中的存在概率非常小。
＜浓缩工序(步骤S14)＞
接着，通过浓缩工序，对在采集工序中采集的母血中的有核红血球进行浓缩。浓缩工序优选通过密度梯度离心分离法进行。
〔密度梯度离心分离法〕
密度梯度离心分离法为根据血液中的成分的密度之差进行分离的方法，通过以夹着所分离的成分的密度值的方式选择第1介质及第2介质，能够在离心分离之后的第1介质与第2介质之间的界面聚集目标成分(本实施方式中，为源自胎儿的有核红血球)。并且，通过采集存在于该第1介质与第2介质之间的界面的组分，能够获得已浓缩有核红血球的血液。
具体而言，能够通过包括如下工序的方法进行有核红血球的浓缩：在离心管的底部注入第1介质的工序；冷却收集到第1介质的离心管的工序；在离心管内的已冷却的第1介质上层叠第2介质的工序；在离心管内的第2介质上层叠作为血液试料的母体的外周血的工序；对容纳于离心管的第1介质、第2介质及血液试料施以离心分离的工序；及从离心分离之后的第1介质与第2介质之间的层采集包含源自胎儿的有核红血球的组分的工序。
国际公开WO2012/023298号公报中记载有包含胎儿的有核红血球的母体的血液密度。根据该记载，所设想的源自胎儿的有核红血球的密度为1.065～1.095g/mL左右，母体的血细胞的密度为，红血球为1.070～1.120g/mL左右，嗜酸性粒细胞为1.090～1.110g/mL左右，中性粒细胞为1.075～1.100g/mL左右，嗜碱性粒细胞为1.070～1.080g/mL左右，淋巴细胞为1.060～1.080g/mL左右，单核细胞为1.060～1.070g/mL左右。关于密度数值，从以克每毫升[g/mL]表示的单位向SI单位系统的换算较为容易，1克每毫升[g/mL]为1000千克每立方米[kg/m3]。
关于所层叠的介质(第1介质及第2介质)的密度，为了分离密度为1.065～1.095g/mL左右的源自胎儿的有核红血球与母体中的其他血细胞成分而设定。源自胎儿的有核红血球的中心密度为1.080g/mL左右，因此制作夹着该密度的两个不同密度的介质并相邻层叠，由此能够在其界面收集所希望的源自胎儿的有核红血球。优选将第1介质的密度设为1.08g/mL以上且1.10g/mL以下，第2介质的密度设定为1.06g/mL以上且1.08g/mL以下。更优选第1介质的密度为1.08g/mL以上且1.09g/mL以下，第2介质的密度为1.065g/mL以上且1.08g/mL以下。作为具体例，通过将第1介质的密度设定为1.085g/mL，将第2介质的密度设定为1.075g/mL，能够从回收的所希望的组分中分离血浆成分及嗜酸性粒细胞、单核细胞。并且，还能够分离红血球、中性粒细胞、淋巴细胞的一部分。本发明中，只要能够实现本发明的效果，则并不限制第1介质与第2介质，两者可以是相同种类也可以是不同种类，但使用相同种类的介质是优选方式。
作为浓缩工序中使用的第1介质及第2介质，可使用用聚乙烯吡咯烷酮涂布的直径15～30nm的硅酸胶体粒子分散液即Percoll(注册商标)、富含于侧链的由蔗糖制成的中性的亲水性聚合物即基于多聚蔗糖与泛影酸钠的溶液即Histopaque(注册商标)等介质。本实施方式中，能够优选使用Percoll(注册商标)及Histopaque(注册商标)。Percoll(注册商标)市售有密度(比重)1.130的产品，能够通过稀释制备目标密度(比重)的介质。Histopaque(注册商标)能够利用市售的密度1.077的介质与密度1.119的介质将第1介质及第2介质制备为所希望的密度。
〔其他浓缩方法〕
作为对有核红血球进行浓缩的方法，除了上述的密度梯度离心分离法以外，还能够利用与作为通常的白血球抗原的CD45(CD:Cluster of Differentiation)(基于CD分类的单克隆抗体的分类编号)特异键合的抗体，利用磁力效果分离白血球，由此对有核红血球进行浓缩。
＜确定工序(步骤S16)＞
确定工序为从通过浓缩工序已浓缩有核红血球的母血中根据细胞的形状选择有核红血球的候选细胞，并确定该候选细胞为有核红血球的工序。
包含在浓缩工序中被浓缩的有核红血球的外周血中，除了有核红血球以外，还包含白血球等其他血液成分。其他血液成分能够通过浓缩工序从母血去除，但很难完全去除。并且，单核的白血球能够根据下述所示的(1)式、(2)式去除，但对该白血球也很难完全去除。因此，进行了分选为有核红血球的细胞的基因分析，但当为源自白血球的细胞时，需要从分析用标本的制作重新进行，分析的效率较低。因此，通过确定工序确定为有核红血球，由此防止这种情况，能够高效地进行之后的分析。
图2是表示确定工序的步骤的流程图。确定工序具有：候选细胞选择工序(步骤S32)，根据细胞的形状选择有核红血球的候选细胞；白血球选择工序(步骤S34)，选择成为在接下来的有核红血球确定工序中将候选细胞确定为有核红血球时的基准的白血球；及有核红血球确定工序(步骤S36)，通过候选细胞与白血球之间的分光特性的比较，确定候选细胞为有核红血球。
确定工序利用将包含在浓缩工序中被浓缩的有核红血球的外周血涂布于透明基板，优选涂布于载波片上来制作的分析用标本来进行确定。
(根据细胞的形状信息进行的分选)
《候选细胞选择工序(步骤S32)》
确定工序利用上述的分析用标本，首先根据细胞的形状信息(以下，还称为“细胞的形状”)分选成为有核红血球的候选的有核红血球的候选细胞。
作为根据细胞的形状进行的分选，能够举出核区域的面积相对于细胞质的面积的比例、核的圆形程度、核区域的面积、核的明度、核的变平方式等。其中，优选将具有满足核区域的面积相对于细胞质的面积的比例及核的圆形程度的条件的细胞分选为源自胎儿的有核红血球候选。细胞质的面积及核区域的面积为分析用标本的观察面中的面积。
图3是表示确定工序中的根据细胞的形状(核的形状)进行分选的候选细胞选择工序的一例的步骤的流程图。
根据细胞的形状进行的分选中，首先提取细胞(步骤S42)。利用二值化图像判断是否为细胞。利用规定的阈值，将利用白色光光源拍摄分析用标本来获得的图像的亮度信息生成为二值化图像，从所生成的二值化图像提取具有点状及岛状的连续区域的区域即提取被任意的闭合曲线包围的区域作为细胞。另外，二值化的图像可在实施Erosion·Dilation等形态学处理来调整连续区域的形状的基础上，求出大小。
接着，根据核的有无分选在步骤S42中提取的细胞(步骤S44)。核的有无根据细胞内是否存在核(点状物)来决定。对于核的有无的判断也能够利用二值化图像。作为细胞而提取的区域中存在具有小于作为细胞提取的区域面积的被任意的闭合曲线包围的区域时，能够提取该区域作为核。
接着，提取细胞的核的大小(点状及岛状的连续区域的大小)为1～5μm的细胞(步骤S46)。选择具有1～5μm大小的核的细胞有助于分选有核红血球。另外，“点状及岛状的连续区域的大小”能够使表示核的外形的闭合曲线近似于圆形或椭圆形，并设为近似于核的外形的圆形的直径或近似于核的外形的椭圆形的长径。
作为近似于核的外形的圆形的例子，可举出与表示核的外形的闭合曲线外接的圆形中直径最小的圆形。作为近似于核的外形的椭圆形的例子，可举出与表示核的外形的闭合曲线外接的椭圆形中长径最小的椭圆。提取近似于核的外形的圆形的直径或近似于核的外形的椭圆形的长径为1～5μm的细胞。
接着，根据核的形状分选细胞(步骤S48)。图4A是表示欲选择的细胞的形状的示意图，图4B是表示欲排除的细胞的形状的示意图。作为根据核的形状进行分选的具体例，对具有根据核区域的面积相对于细胞质的面积的比例进行分选的第1工序及根据核的圆形程度进行分选的第2工序的方法进行说明。作为第1工序，核区域的面积相对于细胞质的面积的比例满足下述(1)式时，细胞被选为有核红血球的候选细胞。将细胞的细胞质的面积设为C，将细胞的核的面积设为N时，具有N相对于C的比例超过0.25且小于1.0的核的细胞被选为有核红血球的候选细胞。
0.25＜(N/C)＜1.0 (1)
并且，作为第2工序，作为满足核的圆形程度的选择条件的情况，可举出满足下述(2)式的情况。将核的直径或核的长径设为L时，具有核的面积相对于核的直径或核的长径的平方的比例超过0.65且小于0.785的核的细胞被选为有核红血球的候选细胞。另外，作为核的直径或核的长径，能够通过与在步骤S44中求出核的大小的情况相同的方法求出。
0.65＜(N/(L×L))＜0.785 (2)
根据细胞的形状进行的分选中，通过在基于步骤S42～步骤S46的第1工序中进行粗筛，在基于步骤S48的第2工序中根据核的形状进行分选，能够减少通过图像处理进行分选的候选细胞的数量，能够有效地进行候选细胞的分选。
根据形状进行的分选需要满足步骤S42～步骤S48的所有条件。步骤S42～步骤S48的条件中，只要不满足其中一个条件，则不会被选为候选细胞。
作为利用细胞的形状信息分选成为源自胎儿的有核红血球候选的有核红血球的系统的结构例，可举出安装有光学显微镜、数码相机、载玻片用载物台、光传输系统、图像处理PC(personal computer)、控制PC、显示器的系统。光传输系统具备物镜与CCD(ChargeCoupled Device)相机，图像处理PC可举出具备进行数据分析、数据存储的处理系统的结构。控制PC可举出具备载玻片用载物台的位置控制或控制整体处理的控制系统的结构。
(根据光学特性进行的分选)
根据光学特性进行的分选能够利用源于红血球中包含的血红蛋白的分光特性。利用在候选细胞选择工序中选择的有核红血球的候选细胞与存在于该候选细胞的周围的白血球之间的分光特性的差异，确定候选细胞为有核红血球。例如，通过利用涂布于玻璃基板上的血液成分，利用有核红血球的候选细胞与存在于该候选细胞附近的白血球之间的分光特性的差异，确定候选细胞是否为有核红血球。
有核红血球与作为血液中的1种有核细胞的白血球的不同点在于有无血红蛋白。优选光学信息为源于血红蛋白的信息的方式，优选为源于选自400～650nm的光波长区域中包含的波长的至少1个单色光中的吸光度的差异的信息。有核红血球由于具有血红蛋白，因此在400～650nm的光波长区域中示出较高的吸收系数。白血球由于不具有血红蛋白，因此在这种波长区域中，吸收系数变低。其中，吸收系数是表示光入射到某一介质时，该介质吸收多少光的常数。
光波长区域进一步优选为400～450nm的光波长区域或525～580nm的光波长区域。关于这些光波长区域的吸收系数，由于存在血红蛋白，在有核红血球中示出较高的值，因此能够加大与白血球的细胞质的吸收系数之间的差。由此，能够明确有核红血球与白血球之差，精度良好地辨别是否为有核红血球。
并且，还能够在各光波长区域中以多个波长测定吸光度，并利用这些吸光度的平均值进行有核红血球的判別。通过根据吸光度的平均值进行分选，能够降低吸光度的测定值中包含的噪声的影响。
作为根据分光特性确定为有核红血球的方法，通过比较存在于有核红血球的候选细胞周围的白血球与候选细胞，决定候选细胞是否为有核红血球。例如，对白血球，以与有核红血球的候选细胞相同波长的单色光测定吸光度，求出候选细胞的吸光度相对于白血球的吸光度之比(候选细胞的吸光度/白血球的吸光度)。候选细胞为有核红血球时，示出较高的吸光度，因此吸光度的比变得大于“1”。并且，候选细胞为白血球时，候选细胞的吸光度变得与白血球的吸光度大致相等，因此吸光度的比接近“1”。因此，多个候选细胞中，测定吸光度的比，从数值较大的细胞对有可能是有核红血球的可能性进行排序来进行基因分析，由此能够提高进行基因分析的候选细胞为有核红血球的可能性。
《白血球选择工序(步骤S34)：白血球的选择方法》
能够通过以下方法进行白血球的选择。图5～8是说明选择白血球的方法的图，图5是说明根据白血球的数量设定搜索范围的方法的图，图6是表示根据白血球的数量设定搜索范围的步骤的流程图。并且，图7是说明根据候选细胞的面积设定搜索范围的方法的图，图8是表示根据候选细胞的面积设定搜索范围的步骤的流程图。
{根据白血球的数量设定搜索范围的方法}
图5、6是根据白血球的数量设定搜索范围的方法的说明图。首先，决定有核红血球的候选细胞30(图6的步骤S72)。如之前说明，有核红血球的候选细胞30能够通过候选细胞选择工序决定。接着，设定所搜索的白血球的数量(图6的步骤S74)。图5中说明将所搜索的白血球设为5个的情况。接着，以候选细胞30为中心选择白血球32，直至成为已设定的所搜索的白血球的数量(图6的步骤S76)。白血球32以候选细胞30的中心至白血球32的中心为止的距离D从近到远的顺序选择。
候选细胞30的中心能够设为使候选细胞30的平面形状近似于圆形时的圆形的中心。同样地，白血球32的中心能够设为使白血球32的平面形状近似于圆形时的圆形的中心。以下的说明中也相同。并且，可以按候选细胞30的重心至白血球32的重心为止的距离从近到远的顺序选择白血球。
另外，图5中，将白血球的选择数量设为5个来进行说明，但是白血球的选择数量优选为2个以上且20个以下。通过将白血球的选择数量设为上述范围，获取多个白血球的光学信息并进行平均，从而能够均匀地决定成为与候选细胞之间的差异的基准。并且，白血球的选择数量更优选设为3个以上且10个以下。白血球的数量越多，越能够平均化光学信息，因此优选，但若数量增多，则参考红血球的测定中花费时间，因此优选设为上述范围。
另外，作为所选择的白血球32，在候选细胞选择工序中选择具有核但不满足上述式(1)、(2)的细胞。血液中，作为具有核的细胞存在有核红血球与白血球，但通过选择不满足式(1)、(2)的细胞，能够提高白血球的可能性。
{根据候选细胞的面积设定搜索范围的方法}
图7、8是根据候选细胞的面积设定搜索范围的方法的说明图。该方法中，与根据白血球的数量设定搜索范围的方法相同，首先决定有核红血球的候选细胞30(图8的步骤S82)。接着，设定白血球32的搜索范围36(图8的步骤S84)。图7中，通过实线图示搜索范围36。图7所示的搜索范围36设为候选细胞30的100细胞量(10×10细胞量)。
关于搜索范围36，优选设为以有核红血球的候选细胞30为中心的1边为候选细胞30的10细胞量的正方形或直径为10细胞量的圆形。并且，优选预先逐步地设定搜索范围36，当搜索范围36内未观察到白血球时，逐渐扩大搜索范围36。例如，搜索范围36设为一边为候选细胞30的10细胞量的正方形或直径为10细胞量的圆形时，未观察到白血球32时，优选将搜索范围进一步扩大至1边为20细胞量的正方形或直径为20细胞量的圆形来决定白血球。
接着，搜索搜索范围36内的白血球32，选择白血球(图8的步骤S86)。选为白血球32的基准以白血球32的中心或重心是否进入到搜索范围36内来判断。并且，对于在此选择的白血球，也与根据白血球的数量设定搜索范围时相同，将具有核但不满足上述式(1)、(2)的细胞选为白血球32。
另外，对于白血球32的选择数量及搜索范围36的面积，并无特别限定，能够任意设定。
并且，作为选择白血球的方法，例示了图5及图6中图示的根据白血球的选择数量设定搜索范围来选择白血球的方法、图7及图8中图示的根据候选细胞的面积设定搜索范围来选择白血球的方法，但并不限定于此，还能够以组合这些的方法进行分选。例如，预先根据候选细胞的面积决定搜索范围，该范围内包含的白血球数超过预先设定的个数时，能够测定全部，也能够选择预先设定的个数来进行测定。作为选择方法，如上述，从候选细胞与白血球的中心彼此的距离较近或重心彼此的距离较近的细胞依次选择。并且，搜索范围内的白血球的数量少于预先设定的个数时，在判定出低于该个数的时点，扩大搜索范围，检测通过扩大而增加的面积中包含的白血球。优选反复进行该操作，直至获得预先确定的个数的白血球。
《有核红血球确定工序(步骤S36)》
图9是表示有核红血球确定工序的步骤的流程图。
选择白血球32之后，以所选择的波长对(1)有核红血球的候选细胞30、(2)白血球32、(3)候选细胞30及白血球32的周围34(图5、7中以虚线表示)测定吸光度(图9的步骤S92)。候选细胞30及白血球32的周围34在图5、7中为成为对象的候选细胞30及白血球32的9细胞量(3×3细胞量)的范围。另外，候选细胞30及白血球32的周围34内也存在白血球，因此周围34的吸光度的测定中，测定周围34内的白血球以外的区域的吸光度。
测定吸光度之后，从候选细胞30的吸光度减去候选细胞30的周围34的吸光度，由此求出(4)候选细胞30的吸光度的真值。并且，从白血球32的吸光度减去白血球的各个周围34的吸光度，由此求出(5)白血球的吸光度的真值(步骤S94)。
接着，求出候选细胞30的吸光度相对于白血球32的吸光度之比(步骤S96)。另外，选择多个白血球32时，将白血球32的吸光度设为各个白血球的吸光度的平均值。白血球中由于不存在血红蛋白，因此候选细胞30为有核红血球时，候选细胞30的吸光度变得高于白血球32的吸光度，吸光度之比变得大于“1”。并且，候选细胞30为白血球时，候选细胞30的吸光度变得与白血球32的吸光度大致相等，从而吸光度之比示出接近“1”的数值。因此，通过求出吸光度之比，能够辨别候选细胞30是否为有核红血球，能够确定是否为有核红血球(步骤S98)。
并且，求出吸光度之比，能够从吸光度之比大于“1”的候选细胞按有核红血球的可能性从高到低的顺序进行排序。通过从位次较高的候选细胞30确认基因信息，能够高效地进行有核红血球的确定、基因分析。
并且，上述中，对通过求出候选细胞30的吸光度与白血球32的吸光度之间的比例(比)，从而辨别候选细胞30是否为有核红血球的方法进行了说明，但还能够通过取候选细胞30的吸光度与白血球的吸光度之间的差值来辨别有核红血球。此时，能够取候选细胞30的吸光度与白血球的吸光度的差值，以该数值的绝对值较大的候选细胞30为有核红血球的可能性较高，该数值的绝对值较小的候选细胞为白血球的可能性较高的方式进行排序。
通过以上的方法，能够选择候选细胞并确定该候选细胞是否为有核红血球。
＜扩增工序(步骤S18)＞
扩增工序是对通过确定工序确定为有核红血球的细胞的染色体中包含的核酸进行扩增的工序。并且，接下来的分选工序(步骤S20)中，通过比较等位基因，决定有核红血球是源自胎儿的有核红血球还是源自母体的有核红血球时，优选对在候选细胞选择工序中未被选择的白血球或在白血球选择工序中被选择的白血球也进行染色体中包含的核酸的扩增。
通过确定工序确定为有核红血球的细胞利用显微操纵器从标本分离。自从标本分离来获取的细胞中提取DNA，进行全基因组扩增。全基因组扩增能够利用市售的套件进行。
作为本实施方式中利用的全基因组扩增法，利用如下基因组DNA，即，从所获取的细胞，通过经过作为通常方法的利用界面活性剂的细胞溶解、利用蛋白酶K等的蛋白质分解工序而从细胞溶出来获得。
作为全基因组扩增试剂，能够利用基于聚合酶连锁反应(PCR：polymerase chainreaction)的试剂Single cell WGA kit(New England Biolabs公司)、GenomePlex SingleCell Whole Genome Amplification kit(Sigma-Aldrich公司)，作为全基因组扩增法，能够使用MALBAC法(Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles)(记载于国际公开WO2012/166425A2号公报)。并且，同样能够利用基于链置换型DNA合成反应的试剂GenomiPhi(GENERAL ELECTRIC COMPANY)、REPLI-g(QIAGEN公司)。本实施方式中，优选利用Single cell WGA kit(New England Biolabs公司)。
通过全基因组扩增获得的DNA的扩增产物优选通过琼脂糖凝胶电泳确认有无扩增。进一步优选利用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司)对全基因组扩增产物进行提纯。
并且，优选利用NanoDrop(Thermo Fisher Scientific公司)、BioAnalyzer(Agilent公司)，对通过全基因组扩增获得的DNA的扩增产物的浓度进行测定。
优选在扩增工序中，对从在确定工序中确定为有核红血球的多个细胞获取的核酸进行扩增。本实施方式中，预先设想产前诊断的适用，因此需要分选源自胎儿的有核红血球。确定工序之后，不确定有核红血球是源自胎儿的有核红血球还是源自母体的有核红血球，因此优选对从多个有核红血球获取的核酸进行扩增，并在接下来的分选工序中进行分选。
＜分选工序(步骤S20)＞
分选工序是将通过确定工序确定的有核红血球分选为源自胎儿的有核红血球与源自母体的有核红血球的工序。
(基因分析)
〔基于等位基因的分析〕
通过扩增工序进行全基因组扩增之后，决定等位基因的序列，由此能够决定有核红血球是源自胎儿的有核红血球还是源自母体的有核红血球。
对确定为有核红血球，并通过聚合酶连锁反应扩增的DNA，且成为是源自胎儿的有核红血球还是源自母体的有核红血球的检查对象的染色体，通过定序器求出具有预先决定的100～150bp(base pair：基对)区域的序列的DNA的扩增产物的量。本实施方式中，成为检查对象的染色体优选为13号染色体。源自胎儿的有核红血球通常从父亲及母亲各继承1组染色体，除了性染色体以外，具有各2条染色体。通过分析这些1组染色体的等位基因，确认源自父亲的基因的存在，能够决定有核红血球是源自胎儿的有核红血球还是源自母体的有核红血球。
确认源自父亲的基因的存在时，对源自母亲的细胞也同时进行基因分析，存在源自母亲的细胞中不存在等位基因时，能够确认该等位基因为源自父亲的基因。确认到源自父亲的基因时，能够分选为该有核红血球为源自胎儿的有核红血球。对于源自母亲的细胞，对在候选细胞选择工序中未被选择的白血球或在白血球选择工序中被选择的存在于标本(载波片上)的白血球进行DNA分析。
所分析的等位基因优选分析单核苷酸多态性(SNP(SNPs)：Single NucleotidePolymorphism)或串联重复序列(STR：short tandem repeat)。
胎儿的基因从父母各继承一对基因，遗传信息以4种碱基化学物质的序列记录。人体中有约30亿个碱基，以1000～2000个中1个的比例，存在因人而异的序列部分，将此称为单核苷酸多态性。如果通过分析该单核苷酸多态性，并与作为源自母体的细胞的白血球进行比较，若能够在有核红血球中确认到单核苷酸多态性的序列，则能够分选为有核红血球为源自胎儿。
DNA中，某一DNA序列成为一个单位，具有该DNA排列串联而重复序列的区域，该重复区域为串联重复序列。胎儿从父亲及母亲继承串联重复序列，因此能够分选为具有与源自母体的白血球不同的串联重复序列的有核红血球为源自胎儿的有核红血球。
〔基于Y染色体的分析〕
胎儿为男婴时，通过扩增工序进行全基因组扩增之后，确认是否存在Y染色体，由此能够分选有核红血球是源自胎儿的有核红血球还是源自母体的有核红血球。
Y染色体仅存在于男性，源自母体的有核红血球中不存在。因此，胎儿为男婴时，若能够确认存在Y染色体，则能够分选为有核红血球为源自胎儿的有核红血球。
＜决定工序(步骤S22)＞
决定工序是比较通过分选工序分选的源自胎儿的有核红血球的DNA的扩增产物的量，由此决定是否存在源自胎儿的染色体的数量异常的工序。
作为决定是否存在源自胎儿的染色体的数量异常的基准(或者参考)，选择数量异常的检查对象染色体以外的染色体，通过定序器求出具有预先决定的100～150bp区域的序列的DNA的扩增产物的扩增量。作为成为基准的染色体(基准染色体)，从如下方式选择：从源自胎儿的有核红血球的染色体中选择数量异常的检查对象染色体以外的染色体的至少1个；或选择存在于鉴定为源自母体的有核红血球的细胞的染色体。本实施方式中，优选选择存在于鉴定为源自母体的有核红血球的细胞的染色体。
接着，根据数量异常的检查对象染色体的DNA的扩增产物的量与基准染色体的DNA的扩增产物的量之间的比例，决定源自胎儿的染色体是否存在数量异常。若胎儿为正常状态，则预测检查数量异常的源自胎儿的对象染色体的DNA的扩增产物的量与基准染色体的DNA的扩增产物的量大致成为1:1的量比。正常情况下为2条的染色体存在3条的三染色体性的数量异常的情况下，预测会成为1.0:1.5(或者2：3)的比。
并且，还能够在决定工序之前，预先求出以下结果分布：求出多个从多个妊娠母体采集的、源自胎儿的染色体的DNA的扩增产物的量与妊娠正常胎儿时的源自母体的染色体的DNA的扩增产物的量的比；求出多个源自胎儿的DNA的扩增产物的量与妊娠三染色体胎儿的母体的源自母亲的DNA的扩增产物的量的比，并预先在该两个分布不会重叠的区域设定截止值，比较该截止值与DNA的扩增产物的量之比，决定是否存在数量异常。此时，能够如下解释检查结果，即，若DNA的扩增产物的量之比为截止值以下，则胎儿为正常，若为截止值以上，则为三染色体的数量异常。
[实施例]
＜实施例1＞
以下举出实施例，对本发明进行更详细的说明。但是，本发明并不限定于该实施例。
(采集工序[外周血液试料的获取工序])
在7mL采血管中，作为抗凝剂添加10.5mg的EDTA(乙二胺四乙酸)的钠盐之后，获得母体志愿者的知情同意之后，在采血管内作为志愿者血获得了外周血7mL。之后，利用生理盐水稀释了血液。
(浓缩工序[有核红血球的浓缩工序])
使用Percoll液(注册商标)，制备密度1.070g/mL与密度1.095g/mL的液体，在离心管的底部添加密度1.095g/mL的液体2ml。接着，在密度1.095g/mL的液体上，缓慢叠加密度1.070g/mL的液体2mL，以避免界面紊乱。之后，在密度1.070g/mL的介质上，向离心管中缓慢添加上述中采集的血液的稀释液11mL。之后，以2000rpm(转速每分钟)进行20分钟的离心分离。之后，取出离心管，利用移液管采集沉积在密度1.070g/mL与密度1.090g/mL的液体之间的组分。用一只手保持第1玻璃基板，在其一端放置如此所采集的1滴血液的组分。用另一只手拿起另一玻璃基板(第2玻璃基板)，以30度的角度使第2玻璃基板的一端与第1玻璃基板接触，若使第2玻璃基板的接触下表面与血液的组分接触，则通过毛细管现象在被2张玻璃包围的空间扩散。接着，在保持角度的状态下，使第2玻璃基板向第1玻璃基板的放置血液的区域的相反区域的方向滑动，从而涂布于第1玻璃基板上。之后，进行1小时以上的送风来使其充分干燥。将该第1玻璃基板在迈格林华染色液中浸渍3分钟，并浸渍于磷酸缓冲液中清洗之后，在姬姆萨染色液(用磷酸缓冲液稀释来设为浓度3％)中浸渍10分钟。之后，用纯水清洗之后使其干燥。如此，制作了已染色的多张玻璃基板。
(确定工序)
＜候选细胞选择工序[根据细胞的形状进行分选的工序]＞
(根据细胞的形状进行分选的工序)
为了从涂布于玻璃基板上的浓缩处理之后的血液，分选成为源自胎儿的有核红血球候选的有核红血球，准备了以下:电动二维载物台(以下，记载为XY载物台。)；具备物镜、CCD相机的光学显微镜的测定系统；具备XY载物台控制部、控制垂直方向(以下，记载为Z方向)移动机构的Z方向控制部的控制部；及具备图像输入部与图像处理部及XY位置记录部的控制单元部。将如上述那样准备的、涂布于玻璃基板上的血液细胞放置于XY载物台，对焦于玻璃基板上并进行扫描，读入通过光学显微镜获得的图像，通过图像分析搜索作为目标细胞的有核红血球。
图像分析中，检测满足以下的式(1)、式(2)的条件的细胞，设定包含与分析对象的图像正交的二轴的坐标系，记录将二轴中的一个设为X轴并将二轴中的另一个设为Y轴时检测到的细胞的X方向的细胞位置及Y方向的位置。
0.25＜(N/C)＜1.0 (1)
0.65＜(N/(L×L))＜0.785 (2)
其中，C定义为进行图像分析的细胞的细胞质的面积(用于分析的图像中的表示细胞质的区域的面积)，N定义为进行图像分析的细胞的核的面积(分析图像中的表示细胞的核的区域的面积)，L定义为进行图像分析的细胞的核的长径或直径(使分析图像中的表示细胞的核的区域近似于椭圆形时的椭圆形的长径或使分析图像中的表示细胞的核的区域近似于圆形时的圆形的直径)，即，定义为与呈复杂的形状的细胞核外接的椭圆形的长径或圆形的直径。选择存在于满足这些(1)、(2)的载波片基板上的成为源自胎儿的有核红血球的候选的候选细胞。
＜白血球选择工序、有核红血球确定工序[根据光学特性分选有核红血球的工序]＞
对于根据形状信息选择的10个候选细胞，利用显微分光装置进行光学特性的分析。确定10个载波片基板上的有核红血球的候选细胞，对其中一个有核红血球，照射波长为415nm的单色光，测定吸光度1。接着，对位于该候选细胞的附近位置且核的形状不满足上述式(2)的白血球，按与该候选细胞的距离从近到远的顺序选择5个白血球，同样地对每个白血球照射波长为415nm的单色光，测定吸光度，求出其平均作为吸光度2。
通过相同的方法，对玻璃基板上的候选细胞中的剩余9个细胞也同样测定吸光度1，对位于各个候选细胞的附近位置的5个白血球测定吸光度，计算其平均值作为吸光度2。
根据该计算结果，求出吸光度1相对于吸光度2之比(吸光度1/吸光度2)，提取吸光度之比为1以上的细胞，其结果检测出明显为1以上的6个细胞。白血球中由于不存在血红蛋白，因此候选细胞为红血球时，通过求出吸光度之比，数值变高。因此，能够求出吸光度之比，将值明显为1以上的候选细胞确定为有核红血球。
(细胞分离工序)
使用显微操纵器回收上述工序中检测到的吸光度之比成为1以上的6个细胞。
(扩增工序[DNA扩增工序])
对使用显微操纵器回收的6个细胞，利用New England Biolabs公司制造的SingleCell WGA kit进行全基因组扩增，根据说明书的记载，将细胞中的微量DNA扩增为约100万倍。
(分选工序[源自母体或源自胎儿的确定工序])
对从各细胞扩增的全基因组扩增产物进行平分，利用其中一部分，利用ILLUMINA公司制造的基因组分析仪Miseq比较13号染色体的C1QTNF9B基因区域、PCDH9基因区域、BRCA2基因区域、MTRF1基因区域的SNP(SNP ID：rs3751355、rs1799955、rs2297555、rs9571740)，由此确认了6个细胞中有1个细胞具有不同的SNP信息。另外，用显微操纵器回收在白血球选择工序中选择的细胞，与确定为有核红血球的6个细胞同样地扩增DNA并调查了SNP，其结果确认到与5个细胞的SNP一致。通过以上，确认到确定为有核红血球的6个细胞中，1个细胞为源自胎儿的有核红血球，5个细胞为源自母体的有核红血球。
＜实施例2＞
从与在实施例1中采集的母体不同的母体采集外周血，与实施例1同样地在有核红血球分选工序中回收5个细胞，同样进行至扩增工序[DNA扩增工序]。之后，将从各细胞扩增的全基因组扩增产物进行平分，利用其中一半进行分选工序。
(分选工序)
利用在Y染色体的sex-determining factor(SRY)基因区域制作的PCR引物，利用Takara Bio Inc.制造的Multiplex PCR Assay Kit进行PCR，通过通常的琼脂糖凝胶电泳法确认有无Y染色体的PCR扩增物，其结果针对1个细胞检测到了源自Y染色体的信息。确认到该细胞源自胎儿，而且是男婴。其他4个细胞中未观察到源自Y染色体的信息，认为是源自母体的有核红血球。
符号说明
30-候选细胞，32-白血球，34-周围，36-搜索范围。

Claims (7)

1.一种有核红血球的分选方法，其具有：
候选细胞选择工序，根据细胞的形状选择有核红血球的候选细胞；
白血球选择工序，设定包含所述候选细胞的搜索范围，选择所述搜索范围内的白血球；
有核红血球确定工序，通过所述候选细胞与所述白血球之间的血红蛋白的分光特性的比较，确定所述候选细胞为有核红血球；及
分选工序，通过所述有核红血球确定工序之后的有核红血球中包含的等位基因与在所述候选细胞选择工序中未被选择的白血球或在所述白血球选择工序中被选择的白血球中包含的等位基因的比较，将所述有核红血球分选为源自母体的有核红血球或者源自胎儿的有核红血球。
2.一种有核红血球的分选方法，其具有：
候选细胞选择工序，根据细胞的形状选择有核红血球的候选细胞；
白血球选择工序，设定包含所述候选细胞的搜索范围，选择所述搜索范围内的白血球；
有核红血球确定工序，通过所述候选细胞与所述白血球之间的血红蛋白的分光特性的比较，确定所述候选细胞为有核红血球；及
分选工序，通过确认所述有核红血球确定工序之后的有核红血球中包含的Y染色体是否存在，将所述有核红血球分选为源自母体的有核红血球或者源自胎儿的有核红血球。
3.根据权利要求1或2所述的有核红血球的分选方法，其中，
所述搜索范围为从所述候选细胞根据所述候选细胞的大小阶段性地设定的范围，
所述白血球选择工序中选择所述搜索范围内的所述白血球，
根据所选择的白血球的数量扩大所述搜索范围。
4.根据权利要求1或2所述的有核红血球的分选方法，其中，
所述搜索范围从与所述候选细胞的距离最近的所述白血球起依次选择所述距离变远的所述白血球，
所述搜索范围是所述白血球的选择数量为2个以上且20个以下的范围。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的有核红血球的分选方法，其中，
所述分光特性为选自400～650nm的光波长区域中包含的波长的至少1个单色光处的吸光度。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的有核红血球的分选方法，其中，
所述候选细胞选择工序包括第1工序，所述第1工序中选择如下细胞，即，将所述细胞的细胞质的面积设为C，将所述细胞的细胞核的面积设为N时，所述细胞的细胞核的面积相对于所述细胞的细胞质的面积的比率满足式1：
0.25＜N/C＜1.0 式1。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的有核红血球的分选方法，其中，
所述候选细胞选择工序包括第2工序，所述第2工序中选择如下细胞，即，将所述细胞的细胞核的面积设为N，将与所述细胞的细胞核外接的圆形的直径长度或椭圆形的长径长度设为L时，所述细胞核的面积相对于所述圆形的长径的平方或所述椭圆形的长径长度的平方的比率满足式2：
0.65＜N/(L×L)＜0.785 式2。
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