CN107227378A - 检测拟态弧菌的rpa‑iac引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了引物对和内标扩增序列，所述引物对包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述内标扩增序列包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。本发明还提供了所述的引物对及内标扩增序列在制备检测或辅助检测拟态弧菌的产品中的应用；以及基于RPA‑IAC技术的检测拟态弧菌的方法。经实验证明，本发明的RPA‑IAC引物特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器和适用范围广，且基于该引物并配合扩增内标建立的拟态弧菌的RPA‑IAC检测方法灵敏、准确、简便和快速，对进出口相关货物及产品检疫具有指导意义。

Description

检测拟态弧菌的RPA-IAC引物及方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及检测拟态弧菌的方法、引物及试剂盒。

背景技术

拟态弧菌系革兰阴性弧菌，具有单鞭毛，有动力，与副溶血弧菌、霍乱弧菌一样属正常海洋菌丛，广泛存在于自然界河水、海水和海产品中。菌株在不含钠或仅含1％氯化钠的营养肉汤中生长良好，可自水生动物中分离出来。

在美国、北美、新西兰、孟加拉及非洲国家均有拟态弧菌致病报道，我国福建、北京、上海、江苏及浙江地区也有发病，多呈散发或暴发，一年四季均有发病，以夏季为多；潜伏期3～72h，平均24h；主要症状有腹泻、呕吐、腹痛，以及大便呈水样或粘液血便；发病年龄不限，但小儿少见。因此对拟态弧菌的检测在公共卫生上具有十分重要的意义。

目前，对拟态弧菌的检测仍主要依靠传统方法，即首先利用选择性培养基增菌，进而结合生化及血清学方法进行鉴定。传统方法检测结果准确，但是存在检测效率低、检测目标单一、灵敏度低且耗时长、操作繁琐等不足。为满足致病菌快速检测的要求，发展了酶联荧光免疫检测法(VIDAS-CHL)、酶免疫法(EIA)、聚合酶链式反应(PCR)、胶体金试纸条法、API生化鉴定试纸条法、环介导恒温扩增(LAMP)技术和实时荧光PCR等方法。其中，VIDAS-CHL法、EIA法、胶体金试纸法和API法均存在特异性差、灵敏度低等缺陷，而没有得到广泛应用；LAMP法，作为一种新兴的检测方法，尽管极大地提高了检测效率，又降低了检测成本，但是产生的假阳性率较高。PCR技术作为一种高度灵敏、快速简便的检测方法在诸多领域得到广泛应用，尤其在病原体检测方面取得了革命性的成果，成为核酸快速检测的一个金标准，并在此基础之上，又发展了DNA探针技术、实时荧光PCR技术和PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术等,而PCR引物的设计成为了制约该类检测方法成败的关键性因素，常规的PCR引物设计，不仅需要反复比对引物的特异性，而且需要优化引物的各项参数与反应条件，尤其是退火温度更是进行反复优化，以防止非特异性扩增，在这些条件的制约下选取的引物极易影响扩增的有效性和特异性。此外，荧光检测设备普遍售价偏高，也在一定程度上限制了这类检测方法的推广应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏、准确、简便和快速的基于RPA-IAC技术的检测拟态弧菌的方法，本发明还提供了用于该方法的特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器和适用范围广的RPA-IAC引物及内标扩增序列和对应的检测试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

本发明第一方面提供了引物对和内标扩增序列，所述引物对包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述内标扩增片段包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

本发明第二方面提供了所述的引物对和内标扩增序列在制备检测或辅助检测拟态弧菌的产品中的应用；

在一优选例中，所述制备检测或辅助检测拟态弧菌的产品包括：制备检测或辅助检测生物样品是否感染拟态弧菌的产品，以及制备检测或辅助检测病原菌为或候选为拟态弧菌的产品。

本发明第三方面提供了一种试剂盒，包括所述的引物对和包含有所述的内标扩增序列的质粒。

在一优选例中，所述的试剂盒还包括RPA恒温扩增试剂。

在一优选例中，所述RPA恒温扩增试剂包括来自TwistDX公司的RPA扩增试剂盒TwistAmp Basic kits所包含的试剂。

在一优选例中，还包括DNA提取试剂。

在一优选例中，所述DNA提取试剂包括来自天根生化科技有限公司的货号为DP432的动物基因组DNA提取试剂盒所包含的试剂。

在一优选例中，所述DNA提取试剂还包括来自天根生化科技有限公司货号为DP302的细菌基因组DNA提取试剂盒所包含的试剂。

在一优选例中，还包括阳性对照和阴性对照。

本发明第四方面提供了所述的试剂盒在检测或辅助检测拟态弧菌，或制备检测或辅助检测拟态弧菌的产品中的应用。

在一优选例中，所述检测或辅助检测拟态弧菌包括：检测或辅助检测生物样品是否感染拟态弧菌，以及检测或辅助检测病原菌是否为或候选为拟态弧菌。

在一优选例中，所述制备检测或辅助检测拟态弧菌的产品包括：制备检测或辅助检测生物样品是否感染拟态弧菌的产品，以及制备检测或辅助检测病原菌为或候选为拟态弧菌的产品。

本发明第五方面提供了一种检测或辅助检测拟态弧菌的RPA-IAC方法，包括使用所述的引物对和包含有所述的内标扩增序列的质粒或所述试剂盒的步骤。

在一优选例中，所述检测或辅助检测拟态弧菌包括：检测或辅助检测生物样品是否感染拟态弧菌，以及检测或辅助检测病原菌是否为或候选为拟态弧菌。

在一优选例中，所述的方法包括如下步骤：

1)RPA-IAC扩增

以生物样品或病原菌含有的DNA为模板与所述的引物对和包含有所述的内标扩增序列的质粒或所述试剂盒进行RPA-IAC扩增。

2)根据RPA-IAC扩增的结果判断生物样品是否感染拟态弧菌，或病原菌是否为或候选为拟态弧菌。

任选的，在步骤1)之前还包括在生物样品或病原菌中提取DNA的步骤。

在一优选例中，所述在生物样品或病原菌中提取DNA是采用天根生化科技有限公司的货号为DP432的动物基因组DNA提取试剂盒或天根生化科技有限公司货号为DP302的细菌基因组DNA提取试剂盒进行。

在一优选例中，所述RPA-IAC扩增的结果判断的标准为：

若所述RPA-IAC扩增得到的扩增产物仅有大小为467bp的目标基因片段，或同时拥有大小分别为334bp、467bp的内标扩增片段和目标基因片段，则判定为生物样品感染拟态弧菌，或病原菌为或候选为拟态弧菌；若所述RPA扩增得到的扩增产物只有大小为334bp的内标扩增片段，未含有大小为467bp的目标基因片段，则判定为生物样品未感染拟态弧菌，或病原菌不为或候选不为拟态弧菌；若所述RPA扩增得到的扩增产物未含有大小为334bp的内标扩增片段且未含有大小为467bp的目标基因片段，判定为反应为假阴性，需要重新进行检测。

在一优选例中，所述RPA-IAC扩增的反应体系如下：

含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管

再水化缓冲液 29.5μL

SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物各2μL，引物的终浓度均为0.4μmol/L

包含有SEQ ID NO：3所示的内标扩增序列的质粒1.83×10³copies

模板DNA 50ng

醋酸镁溶液 2.5μL，浓度为280mmol/L

去离子水 补足至50μL；

在一优选例中，所述RPA-IAC扩增的反应条件如下：所述RPA-IAC扩增的温度为37℃，时间为40min。

本发明第六方面提供了一种筛选拟态弧菌的系统，包括：

核酸提取装置，所述核酸提取装置用于提取所述生物样品或病原菌中的核酸样本；

RPA-IAC扩增装置，所述RPA-IAC扩增装置与所述核酸提取装置相连，适用于所述的引物对或所述试剂盒对所述核酸样本进行RPA-IAC扩增；

判断装置，所述判断装置与所述RPA-IAC扩增装置相连，以便基于RPA-IAC扩增的结果，判断所述生物样品是否感染拟态弧菌，或病原菌是否为或候选为拟态弧菌。

在一优选例中，所述RPA-IAC扩增的反应体系如下：

含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管

再水化缓冲液29.5μL

SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物各2μL，引物的终浓度均为0.4μmol/L

包含有SEQ ID NO：3所示的内标扩增序列的质粒1.83×10³copies

模板DNA 50ng

醋酸镁溶液 2.5μL，浓度为280mmol/L

去离子水 补足至50μL；

任选的，所述RPA-IAC扩增的反应条件如下：所述RPA-IAC扩增的温度为37℃，时间为40min。

本发明的生物样品为血液、细胞、组织等，或混杂了血液、细胞、组织等的食物等等；而病原菌则是一种纯菌种或至少二种以上的菌种的混合。

本发明涉及的“内标扩增片段”是添加到PCR反应体系中用以指示假阴性现象的一段人工构建DNA序列或者是一段致病菌的保守基因序列。扩增内标作用的主要原理是：将扩增内标添加到PCR反应体系中，使之与目的基因进行共同扩增，如果在反应体系中存在一些抑制因素，则扩增内标和目的基因的扩增反应都将受到抑制，从而达到指示PCR反应假阴性的目的。

本发明的有益效果包括：

(1)本发明针对拟态弧菌设计特异性RPA-IAC引物，建立了拟态弧菌RPA-IAC检测方法，可对拟态弧菌进行定性检测。

(2)本发明的扩增内标序列与拟态弧菌基因组和人类基因组均非同源，可在确保目标序列扩增效率的同时有效规避检测假阴性和操作人员个体核酸干扰检测的发生。

(3)本发明针对拟态弧菌仅设计了一对引物即可完成扩增，省去了复杂的引物设计过程；本发明的引物扩增只需要37℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；反应时间仅需40min，检测时间短；不像LAMP产物的弥散带，RPA-IAC扩增产物根据引物设计位点具有特定大小的条带，其结果易于判断。

(4)本发明的RPA-IAC扩增引物特异性好、灵敏度高且适用范围广。

(5)本发明建立的拟态弧菌RPA-IAC检测方法，灵敏、准确、简便和快速，对进出口相关货物及产品检验检疫具有指导意义。

附图说明

图1为本发明实施例4中RPA-IAC引物对的特异性试验电泳检测结果。其中M为marker DL1000，1：拟态弧菌；2：创伤弧菌；3：副溶血弧菌；4：河流弧菌；5：溶藻弧菌；6：霍乱弧菌；7：哈维氏弧菌；8：沙门氏菌；9：大肠杆菌；10：金黄色葡萄球菌；11：单增李斯特菌。

图2为本发明实施例5中RPA-IAC扩增的灵敏度试验电泳检测结果。其中M为markerDL1000，1-6：拟态弧菌模板量依次为100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng和0.001ng，扩增内标的用量均为1.83×10³copies。

图3为本发明实施例5中RPA扩增的灵敏度试验电泳检测结果。其中M为markerDL1000，1-6：拟态弧菌模板量依次为100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng和0.001ng。

具体实施方式

除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。

下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecularcloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例中使用的副溶血弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、哈维氏弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和单增李斯特菌均由汕头出入境检验检疫局提供。

实施例1

本实施例提供了RPA引物对和内标扩增序列及其应用。

RPA引物对的筛选方法为：针对拟态弧菌VMH基因(GenBank ID:CP016384.1)，设计了多条RPA引物并进行了大量筛选，综合其特异性、灵敏度、引物与引物之间的作用，以及所使用的各引物与RPA扩增试剂盒的适配性，最终筛选出特异性好、重复性好且灵敏度高的如下可检测拟态弧菌的RPA引物对：

VMH-F：5′-GAGATATTGGCATCTTTACAAAATGGACGA-3′(SEQ ID NO：1)；

VMH-R：5′-GATTGGCAATCAGAAGAAAGCCAATTACCCAG-3′(SEQ ID NO：2)；

内标扩增序列的设计和合成：为避免相近细菌的同源干扰和检测人员的个体核酸污染，经过综合分析考量和反复实验验证，以高度保守的猪种属特异性基因β-actin的部分核酸序列为基础，两端分别连接引物序列VMH-F和VMH-R，形成如下所示序列大小为334bp的内标扩增序列：

GAGATATTGGCATCTTTACAAAATGGACGAgttcgagaccttcaacaccccagccatgtacgtggccatccaggcggtgctgtccctgtacgcctctggccgcaccactggcatcgtgatggactccggagacggggtcacccacacggtgcccatctacgaggggtacgccctgccccacgccatcctgcgtctggacctggctggccgggacctgaccgactacctcatgaagatcctgacggagcggggctacagcttcaccaccacggccgagcgggagatcgtgcgggacatcaaggCTGGGTAATTGGCTTTCTTCTGATTGCCAATC(Seq ID NO：3)

上述Seq ID NO：3中，大写序列为添加的VMH-F的原始序列和VMH-R的反向互补序列，小写序列272bp来源于Genbank登录号为DQ452569.1且标题为Sus scrofa beta actin(ACTB)gene,partial cds中489-760的一段序列，并经过理论和实践的同源性验证。

上述RPA-IAC引物对和内标扩增序列的合成工作，均由上海生工生物技术有限公司完成。

在应用上，上述引物对和内标扩增序列可应用于制备检测或辅助检测拟态弧菌的产品，例如将内标扩增序列制备成含有此内标扩增序列的质粒，然后与引物对或其它结合起来成为检测或辅助检测拟态弧菌的产品，直接用来检测或辅助检测生物样品是否感染拟态弧菌。

实施例2

本实施例提供了一种试剂盒及其应用，所述试剂盒包括：

(1)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2(来自实施例1)，以及含有如SEQ ID NO：3所示内标扩增序列的质粒；

(2)DNA提取试剂；

(3)含冻干酶粉管；

(4)再水化缓冲液；

(5)醋酸镁溶液。

上述含冻干酶粉管、再水化缓冲液(Rehydration Buffer)和醋酸镁溶液(280mmol/L)为来自RPA扩增试剂盒TwistAmp Basic kits(TwistDX公司，货号为TABAS03KIT)中的试剂。

所述DNA提取试剂为来自货号为DP432的天根生化科技有限公司的动物基因组DNA提取试剂盒中的试剂和来自货号为DP302的天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒所包含的试剂。

所述含有如SEQ ID NO：3所示内标扩增序列的质粒的构建：将实施例1合成的内标扩增序列连接到通用载体PUC57上，得到含有如SEQ ID NO：3所示内标扩增序列的阳性质粒。

上述内标扩增序列质粒的构建：采用常规T4噬菌体DNA连接酶连接到通用载体PUC57，并制备成阳性质粒冻干粉。在本发明中此构建是由上海生工生物技术有限公司完成。按照拷贝数N copies/μL＝PCR片段的质量(g/μL)/(650g/mol×碱基数)×(6.02×10²³)计算，将阳性质粒干粉稀释至1.83×10³copies/μL。

利用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和上述含有如SEQ ID NO：3所示内标扩增序列的质粒针对拟态弧菌进行RPA-IAC扩增，得到的RPA-IAC目标基因扩增产物和扩增内标产物的大小分别为467bp、334bp。

实验证明，上述DNA提取试剂、含冻干酶粉管、再水化缓冲液、醋酸镁溶液，以及其与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和含有如SEQ ID NO：3所示内标扩增序列的质粒的联合使用，效果更加优越，具体表现在特异性强、重复性好、灵敏度高以及质控效果佳。

在应用上，上述试剂盒可应用于检测或辅助检测拟态弧菌上，例如检测或辅助检测生物样品是否感染拟态弧菌，或检测或辅助检测待测生物样品是否为或候选为拟态弧菌；还可以用来制备检测或辅助检测拟态弧菌的产品，例如制备检测或辅助检测生物样品是否感染拟态弧菌的产品，或制备检测或辅助检测病原菌为或候选为拟态弧菌的产品。

实施例3

本实施例提供了一种检测或辅助检测拟态弧菌的方法，例如检测或辅助检测生物样品是否感染拟态弧菌，或检测或辅助检测病原菌是否为或候选为拟态弧菌，该方法使用了实施例1的引物对或实施例2的试剂盒。

上述方法包括如下步骤：

步骤一：RPA-IAC扩增

以生物样品或病原菌的DNA为模板，添加实施例2中含有如SEQ ID NO：3所示内标扩增序列的质粒，采用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组成的引物对进行RPA-IAC扩增，得到RPA-IAC扩增产物，同时设置空白对照(模板为超纯水)。

RPA-IAC扩增体系的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管中加入再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL、上、下游引物(实施例1的VMH-F和VMH-R)各2μL(引物的终浓度均为0.4μmol/L)，含有如SEQ ID NO：3所示内标扩增序列的质粒1μL(1.83×10³copies)，模板DNA1ul(50ng)，最后再加入醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)，用去离子水补足至50μL。

RPA-IAC扩增反应条件：将上述RPA-IAC扩增体系充分混匀，置于37℃的金属浴上反应40min，得到RPA-IAC扩增产物。

步骤二：RPA-IAC扩增产物的电泳检测

RPA-IAC反应结束后，向上述扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀后12000rpm离心2min，取5μL上清液于1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果，并对RPA-IAC扩增产物进行测序(在建立方法过程中均进行了测序验证，本文不再赘述)。

所述RPA-IAC扩增的结果判断的标准为：

若所述RPA-IAC扩增得到的扩增产物仅有大小为467bp的目标基因片段，或同时拥有大小分别为334bp、467bp的内标扩增片段和目标基因片段，则判定为含有拟态弧菌，提示所述生物样品感染拟态弧菌，或病原菌为或候选为拟态弧菌；若所述RPA-IAC扩增得到的扩增产物只有大小为334bp的内标扩增片段，未含有大小为467bp的目标基因片段，则判定为不含有拟态弧菌，提示所述生物样品未感染拟态弧菌，或病原菌不为或候选不为拟态弧菌；若所述RPA-IAC扩增得到的扩增产物未含有大小为334bp的内标扩增片段且未含有大小为467bp的目标基因片段，判定为反应假阴性，提示需要重新进行检测。

如果待测植株或待测病原菌还未提取DNA，上述方法步骤(1)RPA-IAC扩增之前还可以包括使用动物基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司，货号为DP432)或细菌基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司，货号为DP302)按照试剂盒说明书对生物样品或待测病原菌中的DNA进行提取的步骤。

实施例4

本实施例对实施例1的引物对和内标扩增序列进行了有效性和特异性验证，所用的供试材料如下：副溶血弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、哈维氏弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和单增李斯特菌，这些菌株为购买并经严格验证的标准菌株，均保存在汕头出入境检验检疫局检验检疫技术中心。

步骤一：基因组DNA的提取

采用天根生化科技(北京)有限公司的货号为DP302的细菌基因组DNA提取试剂盒按照试剂盒说明书分别提取溶藻弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、哈维氏弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的基因组DNA。

步骤二：RPA-IAC扩增

采用各种基因组DNA模板：

组1以拟态弧菌的基因组DNA混合物为模板(阳性对照)。

组2以创伤弧菌的基因组DNA为模板。

组3以副溶血弧菌的基因组DNA为模板。

组4以河流弧菌的基因组DNA为模板。

组5以溶藻弧菌的基因组DNA为模板。

组6以霍乱弧菌的基因组DNA为模板。

组7以哈维氏弧菌的基因组DNA为模板。

组8以沙门氏菌的基因组DNA为模板。

组9以大肠杆菌的基因组DNA为模板。

组10以金黄色葡萄球菌的基因组DNA为模板

组11以单增李斯特菌的基因组DNA为模板。

分别以组1-组11为模板，进行RPA-IAC扩增，RPA-IAC扩增的方法同实施例3的步骤一。

步骤三：RPA-IAC扩增产物的电泳检测

RPA-IAC扩增产物的电泳检测的方法同实施例3的步骤二。

结果分析：

结果如图1所示，组1-组11分别对应泳道1-11，泳道1显示在334bp和467bp处均有扩增条带，根据实施例3的判断标准，为阳性，即顺利检出拟态弧菌，其余泳道2-泳道11显示只有在334bp处有扩增条带，根据实施例3的判断标准，这就排除了假阴性可能性，进一步提高了结果的可靠性。综上，上述阳性判定和阴性判定结果均准确且所有组的扩增内标均成功扩增，由此证明本发明实施例1的引物对和内标扩增序列具有有效性、高特异性和良指示性；进一步的，本发明基于引物对和内标扩增序列及试剂盒建立的检测或辅助检测拟态弧菌的方法能够准确的对拟态弧菌进行检测。

实施例5

本实施例对实施例1的引物对和内标扩增序列进行了灵敏度验证，并与不添加扩增内标(即不添加实施例2中含有如SEQ ID NO：3所示内标扩增序列的质粒)进行比较，所用的供试材料如下：拟态弧菌，此菌株为购买并经严格验证的标准菌株，保存于汕头出入境检验检疫局检验检疫技术中心。

步骤一：基因组DNA的提取

采用天根生化科技(北京)有限公司的货号为DP302的细菌基因组DNA提取试剂盒按照试剂盒说明书分别提取拟态弧菌的基因组DNA，并将得到的基因组DNA进行10倍梯度稀释，制备得到不同浓度的拟态弧菌的基因组DNA。

步骤二：RPA扩增和RPA-IAC扩增

采用不同浓度的拟态弧菌的基因组DNA作为模板：

组1：以100ng/μL的拟态弧菌基因组DNA(1μL)为模板。

组2：以10ng/μL的拟态弧菌基因组DNA(1μL)为模板。

组3：以1ng/μL的拟态弧菌基因组DNA(1μL)为模板。

组4：以0.1ng/μL的拟态弧菌基因组DNA(1μL)为模板。

组5：以0.01ng/μL的拟态弧菌基因组DNA(1μL)为模板。

组6：以0.001ng/μL的拟态弧菌基因组DNA(1μL)为模板。

分别以组1-组6为模板，分别进行RPA扩增及RPA-IAC扩增，RPA-IAC扩增的方法同实施例3的步骤一，RPA扩增与RPA-IAC扩增的区别为扩增体系里不添加实施例2中含有如SEQ ID NO：3所示内标扩增序列的质粒。

步骤三：RPA扩增产物和RPA-IAC扩增产物的电泳检测

二者扩增产物的电泳检测的方法同实施例3的步骤二。

结果分析：

RPA-IAC扩增的结果如图2所示，组1-4均在467bp处有条带且组2-6在334bp处有条带，这说明组1-6的结果均有效且组5-组6无假阴性可能性，同时也说明本发明实施例1的引物对具有较高的灵敏度，可检测出样品中仅含有0.1ng的微量DNA；RPA扩增的结果如图3所示，灵敏度结果同RPA-IAC扩增。综上可知添加扩增内标并没有降低检测的灵敏度。

对比例1

实际上，在寻求到本发明的引物对之前，尝试了本发明的包含有内标扩增序列的质粒(来自实施例2)与非常多的引物对组合，在本对比例中只摘取其中之若干进行阐述，其余不予赘述，具体为：

利用实施例1的引物对以及用Primer Premier 5.0软件设计并选取其中排分靠前的引物对，用实施例3建立的检测或辅助检测拟态弧菌的方法对50份出口海产品分别进行了检测，同时参考食品卫生微生物学检验国家标准(标准号：GB4789.7-2013)中对这50份海产品进行了拟态弧菌的分离和系统生化鉴定，灵敏度试验的取样和模板浓度梯度设置均按照实施例5进行，检测结果如表2所示。

表2

结果显示：鉴于存在包含有内标扩增序列的质粒的情况下本发明引物对的检测结果与参考标准和已公开的检测方法的检测结果完全一致，这说明本发明引物对组合特异性强、灵敏度高且重复性很好，而采用引物设计软件随机选取的若干种引物的组合则或多或少的存在特异性不强、灵敏度不高、重复性不好以及干扰扩增内标等各种缺陷。

对比例2

本对比例提供了不同的试剂与本发明的引物对(来自实施例1)、包含有内标扩增序列的质粒(来自实施例1)组合在一起检测拟态弧菌时的检测结果对比。

各种试剂与本发明的引物对和包含有内标扩增序列的质粒组合:

组合1：本发明引物对和包含有内标扩增序列的质粒+某市售动物基因组DNA提取试剂盒1+某市售RPA扩增试剂盒1

组合2：本发明引物对和包含有内标扩增序列的质粒+某市售动物基因组DNA提取试剂盒2+某市售RPA扩增试剂盒2

组合3：本发明引物对和包含有内标扩增序列的质粒+某市售动物基因组DNA提取试剂盒3+某市售RPA扩增试剂盒3

本发明组合：本发明引物对和包含有内标扩增序列的质粒+来自天根生化科技有限公司货号为DP432的动物基因组DNA提取试剂盒所包含的试剂+来自TwistDX公司的货号为TABAS03KIT的RPA扩增试剂盒TwistAmp Basic kits所包含的试剂。

利用上述本发明组合检测拟态弧菌时，其方法采用实施例3中的方法进行。灵敏度试验的取样和模板浓度梯度的设置均按照实施例5进行。

利用上述组合1、组合2和组合3检测拟态弧菌时，凡是用到市售试剂盒，均按照其试剂盒说明书进行操作进行，其余条件均同本发明组合。同时设标准已公开的对比方法(见对比例1)进行检测。

受检样品同对比例1中的50份出口海产品。

检测结果如表3所示。

表3

结果显示：本发明引物对、包含有内标扩增序列的质粒和各特定试剂的组合的检测结果与欧盟标准和已公开的检测方法的检测结果完全一致，这说明本发明引物对、内标扩增序列和各特定试剂的组合所组成的试剂盒具有特异性强、灵敏度高且重复性好的优势，而在存在内标扩增序列的情况下采用本发明引物对与其它随机选取的若干试剂的组合则或多或少的存在特异性不强、灵敏度不高和重复性不好的各种缺陷。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心；汕头出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 检测拟态弧菌的RPA-IAC引物及方法

<130> 17CN

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SEQ ID NO ：1

<400> 1

gagatattgg catctttaca aaatggacga 30

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SEQ ID NO ：2

<400> 2

gattggcaat cagaagaaag ccaattaccc ag 32

<210> 3

<211> 334

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SEQ ID NO ：3

<400> 3

gagatattgg catctttaca aaatggacga gttcgagacc ttcaacaccc cagccatgta 60

cgtggccatc caggcggtgc tgtccctgta cgcctctggc cgcaccactg gcatcgtgat 120

ggactccgga gacggggtca cccacacggt gcccatctac gaggggtacg ccctgcccca 180

cgccatcctg cgtctggacc tggctggccg ggacctgacc gactacctca tgaagatcct 240

gacggagcgg ggctacagct tcaccaccac ggccgagcgg gagatcgtgc gggacatcaa 300

ggctgggtaa ttggctttct tctgattgcc aatc 334

Claims (10)

1.引物对和内标扩增序列，其特征在于，所述引物对包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述内标扩增片段包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的引物对和内标扩增序列在制备检测或辅助检测拟态弧菌的产品中的应用；

任选的，所述制备检测或辅助检测拟态弧菌的产品包括：制备检测或辅助检测生物样品是否感染拟态弧菌的产品，以及制备检测或辅助检测病原菌为或候选为拟态弧菌的产品。

3.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对和包含有权利要求1所述的内标扩增序列的质粒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括RPA恒温扩增试剂；

任选的，所述RPA恒温扩增试剂包括来自TwistDX公司的RPA扩增试剂盒TwistAmpBasic kits所包含的试剂；

任选的，还包括DNA提取试剂；

任选的，所述DNA提取试剂包括来自天根生化科技有限公司的货号为DP432的动物基因组DNA提取试剂盒所包含的试剂；

任选的，所述DNA提取试剂还包括来自天根生化科技有限公司货号为DP302的细菌基因组DNA提取试剂盒所包含的试剂；

任选的，还包括阳性对照和阴性对照。

5.权利要求3或4所述的试剂盒在检测或辅助检测拟态弧菌，或制备检测或辅助检测拟态弧菌的产品中的应用；

任选的，所述检测或辅助检测拟态弧菌包括：检测或辅助检测生物样品是否感染拟态弧菌，以及检测或辅助检测病原菌是否为或候选为拟态弧菌；

任选的，所述制备检测或辅助检测拟态弧菌的产品包括：制备检测或辅助检测生物样品是否感染拟态弧菌的产品，以及制备检测或辅助检测病原菌为或候选为拟态弧菌的产品。

6.一种检测或辅助检测拟态弧菌的RPA-IAC方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的引物对和包含有权利要求1所述的内标扩增序列的质粒或权利要求3-4中任一项所述试剂盒的步骤；

任选的，所述检测或辅助检测拟态弧菌包括：检测或辅助检测生物样品是否感染拟态弧菌，以及检测或辅助检测病原菌是否为或候选为拟态弧菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)RPA-IAC扩增

以生物样品或病原菌含有的DNA为模板与权利要求1所述的引物对和包含有权利要求1所述的内标扩增序列的质粒或权利要求3-4中任一项所述试剂盒进行RPA-IAC扩增；

2)根据RPA-IAC扩增的结果判断生物样品是否感染拟态弧菌，或病原菌是否为或候选为拟态弧菌；

任选的，在步骤1)之前还包括在生物样品或病原菌中提取DNA的步骤；

任选的，所述在生物样品或病原菌中提取DNA是采用天根生化科技有限公司的货号为DP432的动物基因组DNA提取试剂盒或天根生化科技有限公司货号为DP302的细菌基因组DNA提取试剂盒进行；

任选的，所述RPA-IAC扩增的结果判断的标准为：

若所述RPA-IAC扩增得到的扩增产物仅有大小为467bp的目标基因片段，或同时拥有大小分别为334bp、467bp的内标扩增片段和目标基因片段，则判定为生物样品感染拟态弧菌，或病原菌为或候选为拟态弧菌；若所述RPA扩增得到的扩增产物只有大小为334bp的内标扩增片段，未含有大小为467bp的目标基因片段，则判定为生物样品未感染拟态弧菌，或病原菌不为或候选不为拟态弧菌；若所述RPA扩增得到的扩增产物未含有大小为334bp的内标扩增片段且未含有大小为467bp的目标基因片段，判定为反应为假阴性，需要重新进行检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述RPA-IAC扩增的反应体系如下：

任选的，所述RPA-IAC扩增的反应条件如下：所述RPA-IAC扩增的温度为37℃，时间为40min。

9.一种筛选拟态弧菌的系统，其特征在于，包括：

核酸提取装置，所述核酸提取装置用于提取所述生物样品或病原菌中的核酸样本；

RPA-IAC扩增装置，所述RPA-IAC扩增装置与所述核酸提取装置相连，适用于采用权利要求1所述的引物对或权利要求3-4中任一项所述试剂盒对所述核酸样本进行RPA-IAC扩增；

判断装置，所述判断装置与所述RPA-IAC扩增装置相连，以便基于RPA-IAC扩增的结果，判断所述生物样品是否感染拟态弧菌，或病原菌是否为或候选为拟态弧菌。

10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于：

所述RPA-IAC扩增的反应体系如下：

任选的，所述RPA-IAC扩增的反应条件如下：所述RPA-IAC扩增的温度为37℃，时间为40min。