CN107287134A - 一株假单胞菌及其双功能酶制剂的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株假单胞菌及其双功能酶制剂的制备方法与应用。一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO‑1菌株，2017年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.13960。本发明首次从POPs污染土壤中分离获得一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO‑1菌株，利用该菌株首次制备获得能够高效降解多氯联苯、阿特拉津的双功能酶制剂，尤其对在好氧条件下难降解的高氯代多氯联苯降解活性显著，这与现有已知的假单胞菌(Pseudomonas sp.)及其酶制剂的功能完全不同，具有大规模生产应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株假单胞菌及其双功能酶制剂的制备方法与应用，属于环境生物技术领域。
背景技术
持久性有机污染物(POPs)是环境中一类具有持久性、半挥发性、长距离迁移性、生物蓄积性和高毒性的有机污染物，分布广泛，对人体危害巨大。其中，工业化学品多氯联苯(PCBs)是首批被列入国际《斯德哥尔摩公约》的POPs，其氯化程度越高，毒性越大，越难分解。有机氯农药阿特拉津是一种半衰期长的三嗪类除草剂，因其可移动性强，对土壤、水生生态系统和饮用水源产生严重污染，已被学术界提名为新POPs物质。目前，已有POPs污染问题亟待解决，新的POPs污染事故仍不断发生，及时有效地治理和修复污染环境，对人类健康和经济发展至关重要。
微生物降解因其低耗、易于实现原位修复、环境安全和纯生态过程的显著优点，是公认的治理POPs污染的一种环保而有效的手段。好氧微生物能够把低氯PCBs(nCl<5)氧化为氯代苯甲酸，但很难降解高氯PCBs(nCl≥5)；厌氧生物过程将高氯PCBs还原成低氯PCBs，但不能破坏苯环结构。目前，微生物降解PCBs周期长、效率低，好氧条件下的高氯代PCBs高效降解未见报道。胡江等利用Arthrobacter sp.Ha1可在84h实现对阿特拉津的高效降解。然而，能够同时实现高效降解不同种类POPs的多功能酶在国内外尚属空白。鉴于土壤、水生生态系统污染并非单一污染因素造成，制备能够高效降解POPs的多功能酶，提高PCBs、有机氯农药的降解速率，对推进污染环境的大规模快速修复具有重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一株来源于POPs污染土壤的能降解多氯联苯、阿特拉津的假单胞菌及其双功能酶制剂的制备方法与应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO-1菌株，2017年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.13960。
上述假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO-1菌株采用如下方法筛选获得：
取POPs污染土壤浸出液，分别稀释至浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的5个浓度梯度。将稀释后的菌悬液涂布于含有多氯联苯和阿特拉津的固体培养基，每个浓度做两个平行，30℃培养1～3天。将生长较快、形态较为典型的细菌菌落挑出，然后经过3次平板划线分离纯化后，挑单菌落于无机盐液体培养基中，30℃、150转/分钟培养3天，取培养物1.5mL加入0.5mL甘油，混匀后于-80℃冰箱长期保存。用于涂布菌悬液的固体培养基为LB固体培养基，组分如下：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，水定容至1L，pH自然。用于单菌落培养的无机盐液体培养基组分如下：磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钠0.5g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.1g，氯化钠0.2g，硫酸铵1.0g，蛋白胨2.0g，水定容至1L，pH7.0。
将上述所得到的菌株，分别接种到含有多氯联苯和阿特拉津的无机盐液体培养基上，150转/分钟、30℃培养72h，观察菌液浑浊情况，同时取菌悬液进行600nm处的吸光值检测。依据上述指标选择产酶菌株。将在无机盐培养基中吸光值最高的菌株挑取到LB固体培养基上培养，并保种记为ECO-1。
假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO-1菌株，经测定，其16S rRNA的基因序列长度为1401bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过使用美国生物工程信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information,NCBI)BLASTN程序比对，本发明的菌株的16SrRNA的基因序列与NCBI注册的假单胞菌标准菌株(Pseudomonas)16S rRNA的基因序列具有较高的同源性。经比对，与标准菌株Pseudomonas putida ATCC 12633，Pseudomonasasplenii ATCC23835亲缘关系最近，相似度为99％，但是目前未见假单胞菌(Pseudomonassp.)能够降解多种POPs的报道。
上述16S rRNA基因测序的基本方法是：用细菌基因组提取试剂盒(天根)制备菌株的基因组DNA，以菌株的基因组DNA为模板，使用细菌16S rRNA基因的通用引物进行扩增，用胶回收试剂盒(天根)纯化PCR扩增产物，电泳验证后，由青岛擎科梓熙生物技术有限公司完成16S rRNA基因测序，将所得序列与美国国家生物信息中心(NCBI)收录的标准菌株的16SrRNA基因序列进行比对。
利用上述假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO-1菌株生产双功能酶制剂的方法，步骤如下：
(1)取假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO-1菌株划线于LB固体培养基上，28～37℃倒置活化培养1～2天，制得活化后菌株；
(2)取步骤(1)制得的活化后菌株接种至LB液体培养基中，在温度为28～37℃、转速为100～200转/分钟的条件下，摇床培养1～2天，制得种子液；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按1～10％的体积百分比接种于无机盐培养基中，在温度为28～37℃、转速为100～200转/分钟的条件下，扩大培养3～5天，制得假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO-1菌液；
(4)取步骤(3)制得的假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO-1菌液，在3000～10000转/分钟的条件下，离心2～10分钟，收集菌体，悬浮于10～30倍体积的pH6.0～8.0的磷酸缓冲液中，进行超声波细胞破碎，在4～25℃、3000～8000转/分钟的条件下，离心2～5分钟，收集上清液，制得双功能酶制剂。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的LB固体培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，水定容至1L，pH自然。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的LB液体培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水定容至1L，pH自然。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中的无机盐培养基，每升组分如下：
磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钠0.5g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.1g，氯化钠0.2g，硫酸铵1.0g，蛋白胨2.0g，联苯0.5g，阿特拉津0.025g，水定容至1L，pH7.0。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中的超声波细胞破碎，条件如下：
破碎时间/间隙时间为2秒/2秒，总时间17分钟，功率为165瓦。
上述双功能酶制剂在降解多氯联苯、阿特拉津中的应用。
上述应用，步骤如下：
取上述制得的双功能酶制剂，调整体系中多氯联苯浓度0.5～5mg/L和/或阿特拉津的浓度50～500mg/L，加入双功能酶制剂使体系中双功能酶制剂浓度为0.05～0.25g/L，在温度为20～37℃的条件下，反应3～24小时，即可。
有益效果
本发明首次从POPs污染土壤中分离获得一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO-1菌株，利用该菌株首次制备获得能够高效降解多氯联苯、阿特拉津的双功能酶制剂，尤其对在好氧条件下难降解的高氯代多氯联苯降解活性显著，这与现有已知的假单胞菌(Pseudomonas sp.)及其酶制剂的功能完全不同，具有大规模生产应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1
一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO-1菌株，2017年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.13960。
上述假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO-1菌株采用如下方法筛选获得：
取POPs污染土壤浸出液，分别稀释至浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的5个浓度梯度。将稀释后的菌悬液涂布于含有多氯联苯和阿特拉津的固体培养基，每个浓度做两个平行，30℃培养1～3天。将生长较快、形态较为典型的细菌菌落挑出，然后经过3次平板划线分离纯化后，挑单菌落于无机盐液体培养基中，30℃、150转/分钟培养3天，取培养物1.5mL加入0.5mL甘油，混匀后于-80℃冰箱长期保存。用于涂布菌悬液的固体培养基为LB固体培养基，组分如下：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，水定容至1L，pH自然。用于单菌落培养的无机盐液体培养基组分如下：磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钠0.5g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.1g，氯化钠0.2g，硫酸铵1.0g，蛋白胨2.0g，水定容至1L，pH7.0。
将上述所得到的菌株，分别接种到含有多氯联苯和阿特拉津的无机盐液体培养基上，150转/分钟、30℃培养72h，观察菌液浑浊情况，同时取菌悬液进行600nm处的吸光值检测。依据上述指标选择产酶菌株。将在无机盐培养基中吸光值最高的菌株挑取到LB固体培养基上培养，并保种记为ECO-1。
假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO-1菌株，经测定，其16S rRNA的基因序列长度为1401bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过使用美国生物工程信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information,NCBI)BLASTN程序比对，本发明的菌株的16SrRNA的基因序列与NCBI注册的假单胞菌标准菌株(Pseudomonas)16S rRNA的基因序列具有较高的同源性。经比对，与标准菌株Pseudomonas putida ATCC 12633，Pseudomonasasplenii ATCC23835亲缘关系最近，相似度为99％，但是目前未见假单胞菌(Pseudomonassp.)能够降解多种POPs的报道。
上述16S rRNA基因测序的基本方法是：用细菌基因组提取试剂盒(天根)制备菌株的基因组DNA，以菌株的基因组DNA为模板，使用细菌16S rRNA基因的通用引物进行扩增，用胶回收试剂盒(天根)纯化PCR扩增产物，电泳验证后，由青岛擎科梓熙生物技术有限公司完成16S rRNA基因测序，将所得序列与美国国家生物信息中心(NCBI)收录的标准菌株的16SrRNA基因序列进行比对。
实施例2
利用上述假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO-1菌株生产双功能酶制剂的方法，步骤如下：
(1)从-80℃冰箱划线假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO-1菌株于LB固体培养基上，28℃倒置培养1天；
所述LB固体培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，水定容至1L，pH自然；
(2)挑取ECO-1单菌落至LB液体培养基中，在温度为28℃、转速为200转/分钟的条件下，摇床培养1天，制得种子液；
所述LB液体培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水定容至1L，pH自然；
(3)将步骤(2)制得的种子液，按10％的体积百分比接种于无机盐培养基中，在温度为28℃、转速为200转/分钟的条件下，扩大培养5天，制得假单胞菌ECO-1菌液；
所述无机盐培养基，每升组分如下：
磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钠0.5g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.1g，氯化钠0.2g，硫酸铵1.0g，蛋白胨2.0g，联苯0.5g，阿特拉津0.025g，水定容至1L，pH7.0；
(4)取步骤(3)制得的假单胞菌ECO-1菌液，在3000转/分钟的条件下，离心10分钟，收集菌体，悬浮于30倍体积的pH7.0的磷酸缓冲液中，进行超声波细胞破碎，在4℃、3000转/分钟的条件下，离心2分钟，收集上清液，制得双功能酶制剂；
所述的超声波细胞破碎，条件如下：
破碎时间/间隙时间为2秒/2秒，总时间17分钟，功率为165瓦。
对比例
如实施例2所述的方法，不同之处在于，采用的菌株为Pseudomonas putida ATCC12633。
实验例1、双功能酶对多氯联苯降解能力的分析
将浓度25mg/L的五氯联苯PCB114底物、双功能酶、PBS缓冲液按1:5:19(体积比)的比例混合后，在30℃、pH7.0下反应12h，加入10mL正己烷萃取3次，取萃取液，用GC-MS法检测五氯联苯降解率，PCB114降解率可达65.7％。
对比例中菌株Pseudomonas putida ATCC 12633胞内酶、PBS缓冲液、浓度25mg/L的五氯联苯PCB114底物按5:19:1(体积比)的比例混合后，在30℃、pH7.0下反应12h，加入10mL正己烷萃取3次，取萃取液，用GC-MS法检测五氯联苯降解率，PCB114未被降解。
实验例、双功能酶对阿特拉津降解能力的分析
将浓度100mg/L的阿特拉津底物、双功能酶、PBS缓冲液按1:10:38(体积比)的比例混合后，在25℃、pH7.5下反应6h，加入10mL二氯甲烷萃取3次，取萃取液，用HPLC法检测阿特拉津降解率，降解率可达45％。
对比例中菌株Pseudomonas putida ATCC 12633胞内酶、PBS缓冲液、浓度100mg/L的阿特拉津底物按10:38:1(体积比)的比例混合后，在25℃、pH7.5下反应6h，加入10mL二氯甲烷萃取3次，取萃取液，用HPLC法检测阿特拉津降解率，降解率为7.3％。
结果显示，假单胞菌ECO-1菌株制备的双功能酶能够高效降解多氯联苯、阿特拉津，尤其对好氧条件下难降解的高氯代多氯联苯具有较高降解活性，在POPs污染治理与修复领域具有潜在的应用价值。对比例中与假单胞菌ECO-1同源性较高的假单胞菌标准菌株Pseudomonas putida ATCC 12633，其胞内酶在好氧条件下对高氯代多氯联苯不具有降解能力，对阿特拉津的降解率远远低于假单胞菌ECO-1菌株胞内酶。假单胞菌ECO-1菌株制备的双功能酶是能够同时实现高效降解不同种类POPs的多功能酶，这与现有已知的假单胞菌(Pseudomonas sp.)及其酶制剂的功能完全不同，具有大规模生产应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省科学院生态研究所
<120> 一株假单胞菌及其双功能酶制剂的制备方法与应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1401
<212> DNA
<213> Pseudomonas sp.
<400> 1
gtcctcccga ggttagacta gctacttctg gtgcacccac tcccatggtg tgacgggcgg 60
tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cgacattctg attcgcgatt actagcgatt 120
ccgacttcac gcagtcgagt tgcagactgc gatccggact acgatcggtt ttgtgagatt 180
agctccacct cgcggcttgg caaccctctg taccgaccat tgtagcacgt gtgtagccca 240
ggccgtaagg gccatgatga cttgacgtca tccccacctt cctccggttt gtcaccggca 300
gtctccttag agtgcccacc ataacgtgct ggtaactaag gacaagggtt gcgctcgtta 360
cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca gccatgcagc acctgtgtca 420
gagttcccga aggcaccaat ccatctctgg aaagttctct gcatgtcaag gcctggtaag 480
gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa 540
ttcatttgag ttttaacctt gcggccgtac tccccaggcg gtcaacttaa tgcgttagct 600
gcgccactaa aatctcaagg attccaacgg ctagttgaca tcgtttacgg cgtggactac 660
cagggtatct aatcctgttt gctccccacg ctttcgcacc tcagtgtcag tatcagtcca 720
ggtggtcgcc ttcgccactg gtgttccttc ctatatctac gcatttcacc gctacacagg 780
aaattccacc accctctacc gtactctagc ttgccagttt tggatgcagt tcccaggttg 840
agcccggggc tttcacatcc aacttaacaa accacctacg cgcgctttac gcccagtaat 900
tccgattaac gcttgcaccc tctgtattac cgcggctgct ggcacagagt tagccggtgc 960
ttattctgtc ggtaacgtca aaacactaac gtattaggtt aatgcccttc ctcccaactt 1020
aaagtgcttt acaatccgaa gaccttcttc acacacgcgg catggctgga tcaggctttc 1080
gcccattgtc caatattccc cactgctgcc tcccgtagga gtctggaccg tgtctcagtt 1140
ccagtgtgac tgatcatcct ctcagaccag ttacggatcg tcgccttggt gagccattac 1200
ctcaccaact agctaatccg acctaggctc atctgatagc gcaaggcccg aaggtcccct 1260
gctttctccc gtaggacgta tgcggtatta gcgttccttt cgaaacgttg tcccccacta 1320
ccaggcagat tcctaggcat tactcacccg tccgccgctg aatcgaagag caagctttct 1380
catccgctcg actgcaggta g 1401
Claims (8)
1.一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO-1菌株，2017年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.13960。
2.利用权利要求1所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO-1菌株生产双功能酶制剂的方法，步骤如下：
(1)取假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO-1菌株划线于LB固体培养基上，28～37℃倒置活化培养1～2天，制得活化后菌株；
(2)取步骤(1)制得的活化后菌株接种至LB液体培养基中，在温度为28～37℃、转速为100～200转/分钟的条件下，摇床培养1～2天，制得种子液；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按1～10％的体积百分比接种于无机盐培养基中，在温度为28～37℃、转速为100～200转/分钟的条件下，扩大培养3～5天，制得假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO-1菌液；
(4)取步骤(3)制得的假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO-1菌液，在3000～10000转/分钟的条件下，离心2～10分钟，收集菌体，悬浮于10～30倍体积的pH6.0～8.0的磷酸缓冲液中，进行超声波细胞破碎，在4～25℃、3000～8000转/分钟的条件下，离心2～5分钟，收集上清液，制得双功能酶制剂。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的LB固体培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，水定容至1L，pH自然。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的LB液体培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水定容至1L，pH自然。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的无机盐培养基，每升组分如下：
磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钠0.5g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.1g，氯化钠0.2g，硫酸铵1.0g，蛋白胨2.0g，联苯0.5g，阿特拉津0.025g，水定容至1L，pH7.0。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的超声波细胞破碎，条件如下：
破碎时间/间隙时间为2秒/2秒，总时间17分钟，功率为165瓦。
7.权利要求2所述方法制得的双功能酶制剂在降解多氯联苯、阿特拉津中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤如下：
取上述制得的双功能酶制剂，调整体系中多氯联苯浓度0.5～5mg/L和/或阿特拉津的浓度50～500mg/L，加入双功能酶制剂使体系中双功能酶制剂浓度为0.05～0.25g/L，在温度为20～37℃的条件下，反应3～24小时，即可。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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