CN107338240B - 对样品中目标核酸序列进行偏向扩增的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
提供对样品中相对于野生型形式具有突变的目标核酸序列进行偏向扩增的方法，包括：提供与目标核酸序列的野生型形式的至少一部分的正义链和/或反义链互补的单链封闭序列，封闭序列中包含一处或多处锁核酸置换；提供包含样品、封闭序列和根据目标序列设计的正向和反向引物的PCR反应体系并进行循环扩增反应，变性步骤包括：升温至足够高的温度，使封闭序列与样品中的核酸接触，随后降温至第一温度使封闭序列与目标核酸序列以及目标序列的野生型形式形成双链体，第一温度高于引物与模板的退火温度，随后升温至第二温度，第二温度比封闭序列与目标序列的野生型形式形成的双链体的熔解温度(Tm)低约1‑5℃，并且高于目标序列的野生型形式双链体的Tm。
Description
发明领域
本申请涉及分子生物学领域。具体而言，本申请涉及对样品中的目标核酸片段进行偏向扩增的方法、试剂盒、系统及其应用。
发明背景
基因突变，特别是点突变，是生物学领域中生理状态或病理状态下的常见现象。因此，对于基因突变的检测在很多领域中具有重要意义。
目前，对于检测基因突变，公认的金标准是Sanger测序法。但是，该方法要求样品中突变基因的丰度比较高，通常在20％以上才能够进行检测。因此，对于某些低频突变而言，直接应用测序法存在较大困难或难以实现。
因此，基因突变检测方法，特别是对于低频突变的检测方法亟需改进。本申请针对该需求提供了新的用于对核酸样品中的目标片段(特别是样品中的低频突变)进行偏向扩增的方法、试剂盒以及系统，从而为基因突变检测提供了基础。
发明概述
第一方面，本申请提供了用于对核酸样品中的目标片段进行偏向扩增的方法，目标片段相对于其野生型形式具有一处或多处突变，所述方法包括以下步骤：
(1)提供与所述目标核酸序列的野生型形式的至少一部分的正义链和/或反义链互补的单链封闭序列，其中所述封闭序列中包含一处或多处锁核酸置换；
(2)提供包含所述样品、封闭序列和根据所述目标序列设计的正向和反向引物的PCR反应体系并进行循环扩增反应，其中变性步骤包括：
升温至足够高的温度，使所述封闭序列与所述样品中的核酸接触，随后降温至第一温度使所述封闭序列与所述目标核酸序列以及目标序列的野生型形式形成双链体，其中所述第一温度高于所述引物与模板的退火温度，
随后升温至第二温度(即关键变性温度Tc)，所述第二温度比所述封闭序列与所述目标序列的野生型形式形成的双链体的熔解温度(Tm)低约1-5℃，并且高于目标序列的野生型形式双链体的Tm。
在一些实施方案中，方法还包括分离和纯化步骤(2)获得的扩增产物。
在一些实施方案中，目标片段包含约40-250个碱基。
在一些实施方案中，封闭序列包含约10％至约100％的锁核酸置换。
在一些实施方案中，锁核酸置换在封闭序列中为基本上均匀地分布。
在一些实施方案中，封闭序列的长度比目标片段短约20-40个碱基，且封闭序列的两端与步骤(2)使用的正向和反向引物分别有大约3-5个碱基的重叠。
在一些实施方案中，封闭序列在3’端包含防止所述封闭序列在PCR反应中进行延伸的化学修饰，例如磷酸化修饰、C3-间隔子修饰、C6-间隔子修饰。
第二方面，本申请提供了用于对核酸样品中的目标片段进行偏向扩增的试剂盒，目标片段相对于其野生型形式具有一处或多处突变，所述试剂盒包含与目标片段的野生型形式的至少一部分的正义链和/或反义链互补的单链封闭序列，其中封闭序列中包含一处或多处锁核酸置换。
在一些实施方案中，试剂盒还包含根据目标片段设计的正向和反向引物。
在一些实施方案中，目标片段包含约40-250个碱基。
在一些实施方案中，封闭序列包含约10％至约100％的锁核酸置换。
在一些实施方案中，锁核酸置换在封闭序列中为基本上均匀地分布。
在一些实施方案中，封闭序列的长度比目标片段短约20-40个碱基，且封闭序列的两端与步骤(2)使用的正向和反向引物分别有大约3-5个碱基的重叠。
在一些实施方案中，封闭序列在3’端包含防止所述封闭序列在PCR反应中进行延伸的化学修饰，例如磷酸化修饰、C3-间隔子修饰、C6-间隔子修饰。
第三方面，本申请提供了用于对核酸样品中的目标片段进行偏向扩增的系统，所述系统包括合成第一方面所述的封闭序列的装置以及实施第一方面所述的PCR扩增反应的可控温扩增装置。
第四方面，本申请提供了用于检测核酸样品中的目标片段中的突变的方法，所述方法包括鉴定根据第一方面所述的方法获得的扩增产物中的突变。
附图简要说明
图1显示TP53-第8外显子克隆用载体pUC57。
图2显示四条封闭序列的质谱鉴定结果。
图3显示3％琼脂糖电泳验证退火结果，其中泳道1-5为BS60-1、BS60-2、BS60-3、BS60-4以及RS60与RS60rc退火后的产物，泳道6为相应PCR产物PCR-60，泳道7-12分别为单链BS60-1、BS60-2、BS60-3、BS60-4、RS60以及RS60rc；泳道M为DNA Marker DL2000。
图4显示熔解曲线图，其中BS60-1、BS60-2、BS60-3、BS60-4、RS60分别表示四条封闭序列以及参考序列RS60分别它们的反向互补序列RS60rc退火所形成产物的熔解曲线；PCR-60则表示扩增得到的相应PCR产物PCR-60的熔解曲线。
图5显示不同突变体突变位点在不同封闭序列中对应的位置，图中有下划线的字母表示相应锁核酸单体。
图6显示不同单碱基错配对4条封闭序列及参考序列RS60 Tm值的影响。
图7显示偏向扩增的示意性流程图，图中封闭序列上的“*”代表锁核酸单体，3’端的“●”表示化学修饰。
图8显示不同Tc值下偏向扩增对纯野生型和纯突变型的扩增情况。
图9显示偏向扩增的扩增情况效果。
图10显示不同浓度封闭序列存在以及不同Tc值下，偏向扩增对同一样本(含有5％G818A突变)的富集情况。
图11显示不同Tc值下，偏向扩增对同一样本(含有3％C847T突变)的富集情况。
序列简要说明
SEQ ID NO:1为包含TP53基因第8外显子区的野生型序列的载体克隆序列。
SEQ ID NO:2和3分别为将野生型以及4个突变型TP53第8外显子克隆进大肠杆菌克隆载体pUC57中所用的正向和反向引物。
SEQ ID NO:4和5分别为实施例4中用于扩增87bp扩增子的正向和反向引物。
SEQ ID NO:6和7分别为实施例3中用于扩增60bp扩增子的正向和反向引物。
SEQ ID NO:8-12分别显示了RS60、BS60-1、BS60-2、BS60-3以及BS60-4的序列结构。
发明的详细描述
本申请的发明人考虑到本领域中低频基因突变检测难的问题，经过大量研究，开发出了一系列发明，从而实现了对包含低频突变的核酸分子进行偏向扩增，经过偏向扩增的核酸分子可用于后续多种检测方法，从而对低频基因突变进行鉴定。
为了进一步地展示本申请的特征和优势，以下对一些具体实施方案进行描述。应当理解，以下描述仅出于说明的目的，而并不是以任何方式加以限制。还应当理解，结合某一实施方案描述的技术特征也适用于其他实施方案，并且可以与结合其他实施方案描述的技术特征组合在一起，除非另作说明或者从上下文能够作出其他判断。
除非另外说明，本申请中的术语的含义与本领域技术人员通常理解的含义相同。
本文中给出的具体数值不仅可作为单独的数值理解，还应当认为提供了某一范围的端点值，并且可以相互组合提供其他范围。例如，当公开了比例为1％或5％时，也相应地公开了比例可以为1-5％。
本文所用的术语“约”(例如，在组分含量和反应参数中)以本领域技术人员通常能够理解的含义来解释。一般情况下，术语“约”可以理解为给定数值的正负5％范围内的任意数值，例如，约X可以代表95％X至105％X的范围中的任意数值。
第一方面，本申请提供了用于对核酸样品中的目标片段进行偏向扩增的方法，目标片段相对于其野生型形式具有一处或多处突变，所述方法包括以下步骤：
(1)提供与所述目标核酸序列的野生型形式的至少一部分的正义链和/或反义链互补的单链封闭序列，其中所述封闭序列中包含一处或多处锁核酸置换；
(2)提供包含所述样品、封闭序列和根据所述目标序列设计的正向和反向引物的PCR反应体系并进行循环扩增反应，其中变性步骤包括：
升温至足够高的温度，使所述封闭序列与所述样品中的核酸接触，随后降温至第一温度使所述封闭序列与所述目标核酸序列以及目标序列的野生型形式形成双链体，其中所述第一温度高于所述引物与模板的退火温度，
随后升温至第二温度(即关键变性温度Tc)，所述第二温度比所述封闭序列与所述目标序列的野生型形式形成的双链体的熔解温度(Tm)低约1-5℃，并且高于目标序列的野生型形式双链体的Tm。
本文所用的术语“核酸样品”指核酸分子的混合样品，包括，但不限于，从组织或细胞中提出的基因组核酸样品或cDNA核酸样品。
本文所用的术语“目标片段”是相对于“非目标片段”而言，目标片段指相对于其野生型形式具有一处或多处突变的核酸片段。例如，目标片段可以为基因编码区的片段以及其他功能区的片段，例如，启动子、内含子、增强子等。本领域技术人员应当理解，非目标片段可以包含未发生突变的目标片段，即，野生型形式。如上文所述，本申请的各项发明特别适合于“目标片段”在样品中比例(即，目标片段/(目标片段+目标片段野生型形式))较低的情况下。
在一些实施方案中，目标片段在样品中的比例为约1-5％，例如约1％、2％、3％、4％或5％等。本领域技术人员容易理解，本申请的各项发明同样适合于目标片段占核酸样品中全部核酸分子的比例更低于或高于上述范围或数值的情况。
本文所用的术语“偏向扩增”也可理解为“富集扩增”，指对于目标片段的扩增程度高于对非目标片段(例如，野生型目标片段)的扩增程度，从而将目标片段突出地展示于核酸样品中。例如，在某个核酸样品中，目标片段的原始比例为1％，非目标片段的原始比例为99％；经过“偏向扩增”后，目标片段的比例变为20％，而非目标片段的原始比例为80％，那么目标片段则得到了20倍的富集。
本文所用的术语“野生型”指某一核酸分子在天然情况下最常见的形式。通常，“野生型核酸”指未发生任何突变的核酸分子。
在一些实施方案中，目标片段包含约40-250个碱基，例如约40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250个碱基等，或上述值组成的任意范围。本领域技术人员还能够理解，目标片段也可以包含约更多或更少的碱基。
在步骤(1)中，提供与目标片段的野生型形式的至少一部分的正义链和/或反义链互补的单链封闭序列，其中封闭序列中包含一处或多处锁核酸置换。目标片段的野生型序列通常是能够获得的，因此，与其正义链和/或反义链互补的单链封闭序列的序列也是能够获得的。同时，在合成某一序列中引入锁核酸置换的技术也是已知的。
本文所用的术语“锁核酸置换”指用锁核酸单体替换原有的天然核苷酸单体。例如，对于序列“ACGG”而言，对第二位进行“锁核酸置换”指用锁核酸单体C*替换原始的C，置换后序列为“AC*GG”。
在一些实施方案中，封闭序列包含约10％至约100％的锁核酸置换。换言之，目标片段的野生型形式中约10％至100％碱基被替换为锁核酸单体。例如，所述比例可以为约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％等，或上述值组成的任意范围。本领域技术人员应当理解，由于某一核酸序列中所含的碱基数目是不定的，因此，上文所述的比例应当理解为大致的指导值而不一定为确切值。例如，对于包含63个碱基的核酸序列而言，其20％为12.6，那么锁核酸置换的数量可以理解为12，也可以理解为13；同样，其50％为31.5，那么锁核酸置换的数量可以理解为31，也可以理解为32。
在一些实施方案中，锁核酸置换在封闭序列中为基本上均匀地分布。本领域技术人员应当理解，“基本上”均匀的分布是指置换后的各个锁核酸碱基之间所间隔的未置换碱基的数量基本相同。在一些实施方案中，“基本上”均匀的分布是指置换后的各个锁核酸碱基之间所间隔的未置换碱基的数量最大变异不超过3个。例如，置换后的各个锁核酸碱基之间所间隔的未置换碱基的数量最少的为N，最多可以为N+1、N+2或N+3，或者可以全部为N。
在一些具体实施方案中，锁核酸置换被设计为每隔2-5个碱基存在一处锁核酸置换，例如，锁核酸置换的分布为每隔2、3、4或5个未置换碱基存在一个置换碱基。
在一些实施方案中，封闭序列的长度比目标片段短约20-40个碱基，且封闭序列的两端与步骤(2)使用的正向和反向引物分别有大约3-5个碱基的重叠。不希望被任何理论束缚，这样的实施方案在目标片段较短的情况下能够产生较高的效率。
在一些实施方案中，封闭序列在3’端包含防止所述封闭序列在PCR反应中进行延伸的化学修饰，例如磷酸化修饰、C3-间隔子修饰、C6-间隔子修饰。
在步骤(2)中，提供包含所述样品、封闭序列和根据所述目标序列设计的正向和反向引物的PCR反应体系并进行循环扩增反应。根据目标片段设计的PCR扩增反应中的正向和反向引物的方法，以及实施PCR扩增反应所需要的常规试剂是本领域技术人员所公知的。本领域技术人员能够理解，除了样品、封闭序列和引物之外，PCR反应体系还可以包括扩增反应所需的任意一种或多种试剂，例如DNA聚合酶、dNTP等。本领域技术人员还能够容易理解，PCR反应一般为多循环扩增(例如，20-40个循环)，并且每一循环通常包括变性、退火和延伸步骤。
本申请的PCR循环中的变性步骤包括两个阶段：
第一阶段，升温至足够高的温度，使封闭序列与核酸样品接触(此时核酸样品中的核酸双链能够开链)，随后降温至第一温度使封闭序列与目标核酸序列以及目标序列的野生型形式形成双链体，其中所述第一温度高于所述引物与模板的退火温度。本领域技术人员能够理解，在足够高的温度下(例如，95℃以上)，双链核酸会发生变性，分开为两条单链。因此，当单链封闭序列能够与解链的目标片段的正义链或反义链接触时，由于单链封闭序列与目标片段的正义链或反义链互补(取决于封闭序列是针对正义链还是反义链设计)，因此，构成了结合为双链(封闭/目标双链)的结构基础。并且，由于锁核酸置换的引入，封闭/目标双链的Tm值会高于目标/目标双链(即，原始目标片段的正义链和反义链形成的双链)的Tm值，因此，随着降温过程，封闭/目标双链会优先形成。将第一温度设定为高于引物与模板的退火温度可以避免或降低引物结合对上述过程的干扰。
在一些实施方案中，降温过程为自然降温。
在一些实施方案中，降温过程也可以为受控降温。
在一些实施方案中，封闭序列相对于目标片段是过量的。
第二阶段，升温至第二温度，所述第二温度比所述封闭序列与所述目标序列的野生型形式形成的双链体的熔解温度(Tm)低约1-5℃，并且高于目标序列的野生型形式双链体的Tm。本领域技术人员能够理解，由于目标片段相对于其野生型形式具有一处或多处突变，并且封闭序列与目标片段的野生型形式的正义链和/或反义链互补，因此，步骤(2)中形成的封闭/目标双链会包含错配；同时，由于核酸样品中还可能包含目标片段的野生型形式，那么步骤(2)中形成的封闭/野生型目标双链则不包含错配。本申请的发明人发现，上述“封闭/目标双链”的熔解温度(Tm)比“封闭/野生型目标双链”的熔解温度(Tm)具有较为明显的降低，通常为约1-5℃，例如约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5℃。因此，通过控制PCR反应中的变性温度，能够实现“封闭/目标双链”大量解链，而“封闭/野生型目标双链”解链程度较低，从而实现对目标片段的偏向扩增。此外，如上文所述，由于封闭序列与目标片段优先形成封闭/目标双链，因此体系中封闭/目标双链的量大大高于目标片段野生型形式双链体，这也使得“封闭/目标双链”解链作为主要的引物结合模板。
作为非限制性实例，步骤(2)可以如下实施：
首先，将PCR体系升温至足够高的温度(例如，95℃以上)，随后降温至明显高于引物与模板的退火温度的第一温度，再升温至第二温度，在第二温度下，封闭序列与目标片段之间形成的双链将优先打开；随后，降温至引物退火温度下进行退火；再升温至72℃进行延伸。
重复上述步骤30个循环后再于72℃延伸约3min后，结束整个PCR反应。
在一些实施方案中，上文所述的方法还包括分离和纯化步骤(2)获得的扩增产物。PCR扩增产物的分离和纯化技术是本领域技术人员所公知的。例如，可以通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物混合物进行分级，然后根据目标片段的长度对所在分子量处的条带进行核酸分离纯化。
第二方面，本申请提供了用于对核酸样品中的目标片段进行偏向扩增的试剂盒，目标片段相对于其野生型形式具有一处或多处突变，所述试剂盒包含与目标片段的野生型形式的至少一部分的正义链和/或反义链互补的单链封闭序列，其中封闭序列中包含一处或多处锁核酸置换。
在一些实施方案中，试剂盒还包含根据所述目标片段设计的正向和反向引物。
在一些实施方案中，目标片段包含约40-250个碱基。
在一些实施方案中，封闭序列包含约10％至约100％的锁核酸置换。
在一些实施方案中，锁核酸置换在封闭序列中为基本上均匀地分布。
在一些实施方案中，封闭序列的长度比目标片段短约20-40个碱基，且封闭序列的两端与步骤(2)使用的正向和反向引物分别有大约3-5个碱基的重叠。
在一些实施方案中，封闭序列在3’端包含防止所述封闭序列在PCR反应中进行延伸的化学修饰，例如磷酸化修饰、C3-间隔子修饰、C6-间隔子修饰。
第三方面，本申请提供了用于对核酸样品中的目标片段进行偏向扩增的系统，所述系统包括合成第一方面所述的封闭序列装置以及实施第一方面所述的PCR扩增反应的可控温扩增装置。用于在合成序列中定点引入锁核酸置换的设备是能够购买到的，并且目前已有的很多类型的PCR仪都可以用于第一方面所述的方法中，其中对于PCR设备的低要求性也是本申请的优势之一。
第四方面，本申请提供了用于检测核酸样品中的目标片段中的突变的方法，所述方法包括鉴定根据第一方面所述的方法获得的扩增产物中的突变。例如，如果目标片段中的突变性质未知的情况下，可以采用测序法，此时经过偏向扩增后，核酸样品中目标片段的比例已大幅度提高，能够满足测序的要求。例如，如果目标片段中的突变位置和突变形式已知的情况下，则可以采用探针杂交法，当然，也可以采用测序法。
应当理解，在不存在矛盾的情况下，第一方面所描述的技术特征和实施方案也适用于第二至第四方面。
还应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。
实施例
提供以下实施例进一步描述本申请，而并非加以任何限制。
实施例1.标准检测样本的建立
之前已有研究人员对TP53基因第8外显子区的突变检测进行过研究，在本研究中也选取了该检测对象来验证本申请的方案，TP53基因第8外显子区的野生型序列显示于SEQID NO:1。
5’-cttactgcctcttgcttctcttttcctatcctgagtag
caagaaaggggagcctcaccacgagct gcccccagggagcactaagcgaggtaagcaagcaggacaagaagcggtggaggagaccaagggtgcagttatgcctca-3’(SEQ ID NO:1)
上述序列为克隆进载体的野生型序列，其中下划线部分为TP53第8外显子的野生型序列，双下划线部分为下文实施例检测的扩增子区(87bp)。
具体而言，选择了4株细胞系，它们分别含有TP53第8外显子区的不同组成型突变，有关这4株细胞系的详细信息见表1。建立了这4株细胞系的培养方法，并且提取了它们的全基因组DNA。通过将它们的全基因组DNA按照一定的比例稀释到正常人类细胞的全基因组DNA去，已成功建立了一系列标准检测样本，这样建立的标准检测样本可以模拟临床检测样本。
表1细胞系及相关基因突变信息
在后续实验中，为了避免频繁地培养细胞以及提取全基因组DNA，将野生型以及上述4个突变型TP53第8外显子分别克隆进了大肠杆菌克隆载体pUC57中(图1)，所用的引物如下：
TP8-230F1:5’-CGGGATCCCTTACTGCCTCTTGCTTC-3’(SEQ ID NO:2)
TP8-230R1:5’-CTCGAGCTCTGAGGCATAACTGCACC-3’(SEQ ID NO:3)
划线部分显示的是酶切位点，选用的酶切位点分别为Sac I和BamH I。由此，可以通过提取上述几种突变型质粒，并将它们按不同比例稀释到野生型质粒中，能够方便地制备各种标准样品。
实施例2.封闭序列的设计与合成
根据上述四个突变所在的位置，设计了能否覆盖它们的参考序列RS60(ReferenceSequence，60个碱基)，该参考序列相当于本文所述的目标片段的野生型形式。在此基础上，进一步设计了4条不同的锁核酸序列作为封闭序列：BS60-1、BS60-2、BS60-3以及BS60-4(Blocking Sequence，60个碱基，编号1、2、3、4)，它们与RS60的碱基序列完全一致，但掺入了不同比例的锁核酸单体。RS60、BS60-1、BS60-2、BS60-3以及BS60-4如下：
RS60:
5’-CTCTGTGCGCCGGTCTCTCCCAGGACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCC-C3间隔子-3’(SEQ ID NO:8)
BS60-1:
5’-CTC*TGTGC*GCCGG*TCTCT*CCCAG*GACAG*GCACA*AACAC*GCACC*TCAAA*GCTGT*TCCGT*CC-C3间隔子-3’(4C*3G*2A*3T*)(SEQ ID NO:9)
BS60-2:
5’-CTC*TGTGCG*CCGGTC*TCTCCC*AGGACA*GGCACA*AACACG*CA CCT*CAAAGCT*GTTCCG*TCC-C3间隔子-3’(3C*3G*2A*2T*)(SEQ ID NO:10)
BS60-3:
5’-CTCTGTG*CGCCGGT*CTCTCCCA*GGACAGGCA*CAAACAC*GCAC CTCA*AAGCTGTT*CCGTCC-C3间隔子-3’(1C*1G*3A*2T*)(SEQ ID NO:11)
RS60-4:
5’-CT*CTGTG*CGC*CGGT*CTCT*CCCAG*GACA*GGCA*CAAA*CACG*CACCT*CAA*AGCT*GTTC*CGTC*C-C3间隔子-3’(3C*3G*4A*5T*)(SEQ ID NO:12)
上述序列中斜体带星号字母所示即为相应锁核酸单体。
通过固相合成法在ABI EXPEDITE 8909核酸合成仪上合成了上述设计的4条封闭序列，并通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对产物进行了分离，从PAGE胶上回收纯化得到了相应的寡核苷酸序列，进而对相关产品的分子量进行了质谱鉴定，质谱鉴定结果如图2所示。质谱鉴定结果显示：所测定的分子量与理论分子量基本一致，
此外，还合成了RS60以及RS60的反向互补序列RS60 rc(RS60 reversecompliment)。
实施例3.封闭序列熔解温度(Tm值)的测定
通过熔解曲线法测定了实施例2所合成的四条封闭序列的Tm值。
首先，将四条封闭序列以及参考序列RS60分别与它们的反向互补序列(RS60 rc)等摩尔混匀后置于沸水浴中，高温变性2min后，关闭电源，使样品的温度随着水温降低而逐渐降低至室温，从而实现退火，生成相应双链。为了验证退火效率，我们对上述退火产物进行了3％琼脂糖电泳，结果显示于图3。
如图3所示：5组退火产物均与相应PCR产物PCR-60(表示长为60bp，SEQ ID NO:6：5’-GGACGGAACAGCTTT-3’；SEQ ID NO:7：5’-CTCTGTGCGCCGGTC-3’)有着一致的条带，且与6条单链序列的条带位置明显不同，说明封闭序列、参考序列与它们的反向互补序列之间的退火成功。
接下来，通过熔解曲线实验测定了RS60以及这4条封闭序列的Tm值。实验在BioradCFX96型实时PCR仪上进行，实验结果显示于图4，如图4所示：RS60退火产物与相应PCR产物PCR-60的Tm值完全一致，再次说明了退火的成功。实验结果显示全部四条封闭序列的Tm值均较天然序列RS60明显要高(实验所测得的Tm值如表2所示)，并且随着封闭序列中所掺入LNA单体数量的增加，其Tm值也随之增加。
表2封闭序列与参考序列与反向互补序列退火的Tm
由此证实了：相对于天然寡核苷酸序列，锁核酸对其反向互补的DNA序列有着更强的亲和力。这也使得通过调整封闭序列中的锁核酸数量，使得关键变性温度Tc(低于封闭序列与靶标DNA之间的Tm值)略高于PCR产物的Tm值成为可能。
实施例4.单碱基突变对封闭序列Tm值的影响
在本实施例中，仍然通过熔解曲线法研究了不同单碱基突变对不同封闭序列以及参考序列RS60 Tm值的影响。首先，采用SEQ ID NO：4和5所示的引物(SEQ ID NO:4：5’-TGGTAATCTACTGGGACG-3’；SEQ ID NO:5：5’-CGGAGATTCTCTTCCTCT-3’)，对实施例1所述的野生型以及不同类型的突变基因进行了PCR扩增，扩增产物为87bp。
随后，通过将过量封闭序列与PCR产物混合后于高温变性后，再于70℃进行退火。实验采用4条不同的封闭序列以及包括野生型和4种突变型在内的五种PCR产物。这些封闭序列中LNA单体所处的位置以及突变基因中突变位点所处的位置如图5所示。
最后，对上述退火产物的熔解曲线进行了测定，实验结果如图6和表3所示。
表3不同的单碱基错配对封闭序列Tm值的影响
从图6和表3所示实验结果可以看出，对于这四条不同的封闭序列，四种不同的单碱基错配导致其Tm值下降了1.1-3.0℃，较天然序列RS60而言(同样四种不同的单碱基错配所引起的Tm值下降仅为0.2-0.8℃)，它们识别错配的能力有了明显提高。值得注意的是，通过以上熔解曲线分析Tm值结果能够发现，似乎单碱基突变引起Tm值的改变与封闭序列中含有LNA单体的数量，以及LNA单体相对于单碱基突变点的位置并无明显相关性。
上述实验证实了：相对于天然核酸，锁核酸有着更强的识别错配能力。
实施例5.偏向扩增平台的建立
根据上述实验结果，选择了封闭序列BS60-1来搭建本申请提出的偏向扩增平台，简要流程如图7所示。
1封闭序列优先抑制野生型模板的扩增
首先，以单独的野生型和突变型序列为模板，在高浓度(25nM)封闭序列BS60-1存在的条件下，对偏向扩增的关键变性温度(Critical denature Temperature，Tc)进行了梯度扩增，结果显示于图8。
从图8所示，随着关键变性温度Tc的降低，从第4泳道起，野生型已经看不到目的条带的扩增，而两个突变型都至少在第5泳道下都还可以看到清晰的目的条带。由此说明，在高浓度封闭序列BS60-1存在的条件下，偏向扩增对突变型的扩增效率明显优于对野生型的扩增效率。
2偏向扩增条件的优化
以含有G818A/(G818A+WT)＝5％的标准混合样本作为模板，在反应体系中添加不同浓度的封闭序列BS60-1的情况下，在不同Tc值条件下进行了偏向扩增。图9显示了典型的偏向扩增中梯度扩增的结果。结合测序结果，我们对不同条件下的富集效果进行了分析，结果如图10所示。从图10所显示的结果可以发现，随着封闭序列浓度的增加，最佳Tc值也随之增加，但最终的富集效果并没有随封闭序列浓度的增加而有明显改变。根据这一结果，我们选择了在中浓度(2.5nM)封闭序列BS60-1存在的条件下进行后续的偏向扩增条件优化。
接下来，我们以C847T/(C847T+WT)＝3％的标准混合样本为模板，在中浓度封闭序列BS60-1存在的条件下，对最佳Tc值进行了优化，结果显示于图11。
如图11所示，尽管G818A单碱基突变所导致的ΔTm最大，而C847T单碱基突变所导致的ΔTm最小(表3)，利用这两个突变分别进行优化所得到的最佳Tc值基本一致。
上述实验证实了本申请提出的偏向扩增平台的成功。
Claims (8)
1.对样品中目标核酸序列进行偏向扩增的方法，所述目标核酸序列相对于其野生型形式具有一处或多处突变，所述方法包括以下步骤：
(1)提供与所述目标核酸序列的野生型形式的至少一部分的正义链和/或反义链互补的单链封闭序列，其中所述封闭序列中包含一处或多处锁核酸置换；
(2)提供包含所述样品、封闭序列和根据所述目标序列设计的正向和反向引物的PCR反应体系并进行循环扩增反应，其中变性步骤包括：
升温至足够高的温度，使所述封闭序列与所述样品中的核酸接触，随后降温至第一温度使所述封闭序列与所述目标核酸序列以及目标序列的野生型形式形成双链体，其中所述第一温度高于所述引物与模板的退火温度，
随后升温至第二温度，所述第二温度比所述封闭序列与所述目标序列的野生型形式形成的双链体的熔解温度(Tm)低1-5℃，并且高于目标序列的野生型形式双链体的Tm；以及
(3)任选地，分离和纯化步骤(2)获得的扩增产物，
其中所述封闭序列包含10％至100％的锁核酸置换，并且置换后的各个锁核酸碱基之间所间隔的未置换碱基的数量最大变异不超过3个。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述目标序列包含40-250个核苷酸。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述封闭序列包含10％至30％的锁核酸置换。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述目标序列包含40-100个核苷酸。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述封闭序列的长度比所述目标序列短20-40个碱基，且所述封闭序列的两端与步骤(2)使用的正向和反向引物分别有3-5个碱基的重叠。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述封闭序列在3’端包含防止所述封闭序列在PCR反应中进行延伸的化学修饰。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述封闭序列在3’端包含磷酸化修饰、C3-间隔子修饰或C6-间隔子修饰。
8.用于对核酸样品中的目标片段进行偏向扩增的试剂盒，所述目标序列相对于其野生型形式具有一处或多处突变，所述试剂盒包含与所述目标序列的野生型形式的至少一部分的正义链和/或反义链互补的单链封闭序列，其中所述封闭序列中包含一处或多处锁核酸置换，其中所述封闭序列包含10％至100％的锁核酸置换，并且置换后的各个锁核酸碱基之间所间隔的未置换碱基的数量最大变异不超过3个。
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Patent Citations (2)
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