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CN107916243A - 用于处理重金属污染的微生物细胞和蛋白、相应的处理方法和试剂盒 - Google Patents

用于处理重金属污染的微生物细胞和蛋白、相应的处理方法和试剂盒 Download PDF

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CN107916243A CN201610884462.3A CN201610884462A CN107916243A CN 107916243 A CN107916243 A CN 107916243A CN 201610884462 A CN201610884462 A CN 201610884462A CN 107916243 A CN107916243 A CN 107916243A
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Abstract

本发明涉及用于处理重金属污染的微生物细胞和蛋白、利用该微生物细胞和蛋白处理重金属污染的方法及试剂盒。

Description

用于处理重金属污染的微生物细胞和蛋白、相应的处理方法 和试剂盒
技术领域
本发明涉及污染处理领域，具体而言，涉及用于处理重金属污染的微生物细胞和蛋白、利用该微生物细胞和蛋白处理重金属污染的方法及试剂盒。
背景技术
人类的采矿、冶炼、施肥等活动在自然水体中产生了大量重金属污染。水体中的Hg、Cd、Pb等重金属不仅对大部分生物都具有毒害作用，而且可能经由食物链富集，最终对人类健康造成危害。目前，对水体中的重金属元素的清理方式主要分为基于化学和生物的方法。其中，基于化学的清理方法包括化学沉淀、化学吸附、氧化还原、电解、离子交换、膜分离等，上述方法在不同程度上存在处理通量小、成本高以及易造成二次污染等问题。
基于生物的重金属吸附是近年来被普遍采用的方法，能够实现对环境友好，不产生二次污染的目标。微生物具有生长速度快，环境适应性好等优点，可以高效的净化重金属浓度较低的废水。国内外的研究表明，包括细菌、放线菌、霉菌、酵母和藻类在内的多种微生物都有能力对水溶液中微量的重金属离子进行富集。例如，褐藻可吸附Co2+，米曲霉可吸附Zn2+，酵母可吸附Cd2+，地衣芽孢杆菌可吸附Pb2+，藤黄微球菌可吸附Cu2+等。
自然界多样的微生物种群进化出多种能够对重金属进行吸附、解毒的蛋白。例如，广泛存在于铜绿假单胞菌、巨大芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等常见细菌中的MerR蛋白可以特异的吸附溶液中的Hg2+离子。同时，MerR所在的基因簇中的其它蛋白还具有解毒功能，可以将Hg2+转化为HgO，大大降低其毒性。除此之外，CadR、PbrR、CueR和ZntR分别能够吸附Cd2 +、Pb2+、Cu2+和Zn2+。因此，使用具有重金属吸附基因元件的微生物进行环境重金属污染净化具有重大潜力。
发明内容
在第一方面，本发明提供了一种用于处理重金属污染的微生物细胞，其中，所述微生物细胞表达重金属结合蛋白以及生物素结合蛋白；其中，所述重金属为选自于如下重金属中的一种或多种：镉、汞、铅以及砷。
在第二方面，本发明提供了一种用于处理重金属污染的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含重金属结合结构域以及生物素结合结构域；其中，所述重金属为选自于如下重金属中的一种或多种：镉、汞、铅以及砷。
在第三方面，本发明提供了一种用于处理重金属污染的试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述的微生物细胞或第二方面所述的融合蛋白，以及生物素化的固相材料；其中，所述重金属为选自于如下重金属中的一种或多种：镉、汞、铅以及砷。
在第四方面，本发明提供了一种用于处理样品中重金属污染的方法，所述方法包括：
(a)提供第一方面所述的微生物细胞或第二方面所述的融合蛋白；
(b)提供生物素化的固相材料；
(c)将步骤(a)提供的微生物细胞或融合蛋白以及步骤(b)提供的生物素化的固相材料与样品进行混合，从而捕获样品中的重金属离子，以及
(d)对步骤(b)的生物素化的固相材料进行回收；
其中，所述重金属为选自于如下重金属中的一种或多种：镉、汞、铅以及砷。
附图说明
图1为本发明原理示意图。(A)基于细胞的重金属处理方法。细胞能够表达定位于细胞膜外表面的重金属结合蛋白以及定位于细胞膜外表面的生物素结合蛋白，从而该细胞能够分别与重金属以及生物素(从而与生物素化的固相材料)结合。当存在重金属时，该细胞能够将重金属捕获至生物素化的固相材料。(B)基于蛋白的重金属处理方法。融合蛋白包含两个结构域，重金属结合结构域以及生物素结合结构域，从而能够分别与重金属以及生物素(从而与生物素化的固相材料)结合。当存在重金属时，该融合蛋白能够将重金属捕获至生物素化的固相材料。
图2为根据实施例2，生物素结合蛋白在微生物细胞表面的表达及与生物素的相互作用。(A)带有跨膜和膜定位结构域的多种生物素结合蛋白的结构。(B-D)分别为利用酶标仪读取、流式细胞术和荧光显微镜分析获得的表面表达(A)示出的各生物素结合蛋白的大肠杆菌与带有荧光的生物素(Biotin-Atto88)的结合的结果。(B)方框表示与mSA2相比，表达在细胞表面的野生型的链霉亲和素没有与生物素特异性结合的能力。(C)方框表示与eMA和SCD-E2相比，mSA2具有与生物素最强的特异性结合。误差棒为三次独立实验的标准偏差。(D)IPTG+表示诱导表达生物素结合蛋白，IPTG-表示未诱导。N表示不带有生物素结合结构域。
图3示出实施例2中表达不同生物素结合蛋白的大肠杆菌与生物素化磁珠结合的扫描电镜结果，在细胞表面不表达生物素结合蛋白的大肠杆菌(N)难以附着至生物素化的磁珠。在细胞表面表达生物素结合蛋白mSA2的大肠杆菌(mSA2)大量附着至生物素化的磁珠。在细胞表面表达链霉亲和素的大肠杆菌(链霉亲和素)少量附着至生物素化的磁珠。IPTG+表示诱导表达mSA2或链霉亲和素，IPTG-表示未诱导。
图4为根据实施例2，在大肠杆菌表面表达汞离子结合蛋白的构建体(A-C)以及对样品中汞离子的吸附(D)。(A)MerR的结构示意图，示出DNA结合结构域、汞离子结合结构域和连接序列。(B)模拟MerR的结构，设计汞离子结合蛋白的汞离子结合部分MBP(Hg)，该部分带有两个汞离子结合结构域。(C)汞离子结合蛋白的整体结构示意图，示出跨膜及膜定位结构域Lpp-OmpA以及MBP(Hg)的连接方式。(D)根据原子荧光光谱法测定的对汞离子的吸附。误差棒为三次独立实验的标准偏差。
图5为根据实施例3，SA-MBP(Hg)融合蛋白的设计(A)以及SDS-PAGE验证(B)。(A)SA-MBP(Hg)融合蛋白包含作为生物素结合结构域的链霉亲和素的生物素结合结构域(核心功能域)、作为重金属结合结构域的MBP(Hg)以及用于纯化的组氨酸标签，该MBP(Hg)的结构为如图4B所示。
图6为根据实施例3获得的SA-MBP(Hg)与磁珠相互作用的SDS-PAGE结果。
图7为根据原子荧光光谱法测定的实施例3获得的SA-MBP(Hg)对样品中的汞进行清除的效果。误差棒为三次独立实验的标准偏差。
图8为根据实施例4，SA-MBP(Cd)融合蛋白的设计(A-C)以及SA-MBP(Cd)与磁珠相互作用的SDS-PAGE结果(D)。(A)CadR的结构示意图，示出DNA结合结构域、镉离子结合结构域及随机序列。(B)模拟CadR的结构，设计镉离子结合结构域MBP(Cd)包含CadR的功能部分(镉离子结合结构域和随机序列)。(C)SA-MBP(Cd)融合蛋白的整体结构示意图，其包含作为生物素结合结构域的链霉亲和素的生物素结合结构域(核心功能域)、作为重金属结合结构域的MBP(Cd)以及用于纯化的组氨酸标签。
图9为根据电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定的实施例4获得的SA-MBP(Cd)对样品中的镉进行清除的效果。
图10为根据实施例5设计的分泌型SA-MBP(Hg)(A-C)及SDS-PAGE结果。(A)链霉亲和素(其核心功能域为第38-163位氨基酸)和分泌型SA-MBP(Hg)的结构示意图。所使用的多种分泌信号肽(SP)如(C)所示。MBP区域与实施例2的MBP(Hg)相同。(B)pBE-S-lacZ质粒示意图，示出分泌型SA-MBP(Hg)的插入位点。(D)分泌型SA-MBP(Hg)的SDS-PAGE结果。样品1-8分别为带有(C)的分泌信号肽1-8的SA-MBP(Hg)。
具体实施方式
本发明利用已知的能够结合镉(Cd)、汞(Hg)、铅(Pb)以及砷(As)的蛋白实现重金属的捕获，并通过生物素-生物素结合蛋白的相互作用，将捕获的重金属离子富集至固相材料，从而能够对样品中的重金属进行清除，对污染进行有效处理。
本发明采用了两种方式实现重金属结合蛋白(MBP)与生物素结合蛋白的配合：在同一微生物细胞中同时表达这两种蛋白，或者将重金属结合蛋白可操作地连接至生物素结合蛋白而作为融合蛋白。其中，由于在同一微生物细胞中可表达多种重金属结合蛋白，从而实现对样品中多种重金属离子的捕获，而不需要考虑当结构域过多时融合蛋白功能的影响，利用微生物细胞进行捕获的方式更具灵活性。然而，融合蛋白的方式不涉及向样品(例如环境样品)中投放转基因微生物，环境友好度和适用性更高。
本文使用的术语“可操作地连接”具有本领域公知的含义，是指两个结构域或片段之间的功能性连接。一般来说，可操作地连接意味着待连接的核酸序列是相邻接的，并且对于两个蛋白编码区域的相连而言是必要的、相邻接的且处于同一阅读框中。
不希望被理论所限地，虽然在本发明中，将重金属结合蛋白与生物素结合蛋白偶联，而将生物素缀合至用于收集的固相表面，也可设置为重金属结合蛋白与生物素偶联，而生物素结合蛋白缀合至用于收集的固相表面。例如，可通过本领域已知的方法和试剂盒将重金属结合蛋白生物素化(例如Chen等，2Nat.Methods 99(2005))，并使用可商购的缀合有生物素结合蛋白的固相材料(例如链霉亲和素琼脂糖树脂)完成本发明。或者，可利用生物素夹心法(例如Davis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：8155-60(2006))，即，固相表面与重金属结合蛋白均缀合有生物素，通过另外添加的生物素结合蛋白(例如链霉亲和素)将二者偶联。
在第一方面，本发明提供了一种用于处理重金属污染的微生物细胞，其中，所述微生物细胞表达重金属结合蛋白以及生物素结合蛋白；其中，所述重金属为选自于如下重金属中的一种或多种：镉、汞、铅以及砷。
本发明中的微生物细胞没有特别限制，例如可为细菌细胞、放线菌细胞、霉菌细胞、酵母细胞和藻类细胞。所述细菌特别地可为大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，但不限于此。
本领域已知的多种重金属结合蛋白(MBP)、该MBP的重金属结合结构域和功能如表1所示。上述重金属结合蛋白均可作为本发明的重金属结合蛋白。需要指出的是，表1所列举的重金属结合蛋白大部分为转录因子。由于本发明不涉及将重金属结合信号传导至下游通路，可仅使用上述重金属结合蛋白的重金属结合结构域，而不使用DNA结合结构域。本领域已知上述重金属结合蛋白的重金属结合结构域。本发明微生物细胞的重金属结合蛋白或本发明融合蛋白的重金属结合结构域可为本领域已知的MBP，或这些MBP的重金属结合结构域。另外，也可使用与上述蛋白具有80％以上一致性、优选90％、95％、99％以上一致性且具有重金属结合功能的蛋白。作为本发明的重金属结合蛋白包括但不限于表1所列举的这些。
表1：本领域已知的MBP及其重金属靶标
本发明使用的术语“生物素结合蛋白”指的是非共价结合至生物素或其类似物、衍生物的蛋白，也称为亲和素样蛋白(avidin-like protein)。通常，生物素结合蛋白包含生物素结合结构域。本文所使用的术语“生物素结合结构域”是指结合至生物素的多肽。尽管可将完整的生物素结合蛋白用作生物素结合结构域；然而也可仅使用蛋白中与生物素结合的部分。本领域已知的多种生物素结合蛋白及其生物素结合结构域如表2所示。
表2：本领域已知的生物素结合蛋白
考虑到四价或二价形式的生物素结合蛋白被固定在细胞表面时难以进行二聚化或四聚化，在使用二价形式的生物素结合蛋白时，将两个二价形式的生物素结合蛋白(例如rhizavidin)可操作地相连，以单肽链形式表达具有结合生物素功能的二聚体(即，表达单链二聚体)。在使用四价形式的生物素结合蛋白时，将两个或四个四价形式的生物素结合蛋白(例如链霉亲和素或卵亲和素)可操作地相连，以单肽链形式表达具有结合生物素功能的单链二聚体或四聚体。在一个实施方式中，可使用单链链霉亲和素二聚体SCD-E2。也可采用单体形式的生物素结合蛋白，例如eMA、mSA(或mSA2)。另外，也可仅使用上述生物素结合蛋白的生物素结合结构域，或者使用与上述生物素结合蛋白或生物素结合结构域具有80％以上一致性、优选90％、95％、99％以上一致性且具有生物素结合功能的蛋白。类似地，在使用二价形式的生物素结合蛋白的功能域(即，生物素结合结构域)时，将两个二价形式的生物素结合蛋白(例如rhizavidin)的生物素结合结构域可操作地相连，以单肽链形式表达具有结合生物素功能的二聚体。在使用四价形式的生物素结合蛋白的功能域(即，生物素结合结构域)时，将两个或四个四价形式的生物素结合蛋白(例如链霉亲和素)的生物素结合结构域可操作地相连，以单肽链形式表达具有结合生物素功能的二聚体或四聚体。
在一些实施方式中，重金属结合蛋白和/或生物素结合蛋白可进一步包含跨膜及膜定位结构域，从而将重金属结合蛋白和/或生物素结合蛋白展示在细胞外表面。本领域知晓通过在蛋白的N端或C端添加跨膜及膜定位结构域，对蛋白进行定位的方法。例如，在以枯草芽孢杆菌作为微生物细胞的实施方式中，跨膜及膜定位结构域可为CotB(SEQ ID NO：15)[15]。在以大肠杆菌作为微生物细胞的实施方式中，跨膜及膜定位结构域可为Lpp-OmpA融合蛋白(SEQ ID NO：16)或INP(SEQ ID NO：17)[16]。可将跨膜及膜定位结构域直接连接至重金属结合蛋白和/或生物素结合蛋白，或通过连接肽将跨膜及膜定位结构域可操作地连接至重金属结合蛋白和/或生物素结合蛋白。连接肽为柔性，不包含任何活性结构域，优选由甘氨酸和/或丝氨酸组成。事实上连接肽的长度对融合蛋白的影响极其有限，并可为任意长度，本领域技术人员能够作出适当选择。例如，连接肽的氨基酸序列可为GGGGSGGGGS、GVD、GVDG、GI或TR。
在一些实施方式中，重金属结合蛋白和/或生物素结合蛋白可进一步包含方便蛋白纯化的标签肽。本领域知晓在不影响蛋白功能的前提下，通过在蛋白的N端或C端添加标签肽，可方便蛋白纯化。所述标签肽例如但不限于六聚组氨酸标签、c-Myc标签、Halo标签、Flag标签等。上述标签为本领域所熟知，例如在WO2012/155007中描述。
在第二方面，本发明提供了一种用于处理重金属污染的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含重金属结合结构域以及生物素结合结构域；其中，所述重金属为选自于如下重金属中的一种或多种：镉、汞、铅以及砷。
本发明使用的术语“重金属结合结构域”指的是具有重金属结合活性的多肽，例如为表1所列出的MBP或其重金属结合结构域。另外，也可使用与上述蛋白或多肽具有80％以上一致性、优选90％、95％、99％以上一致性且具有重金属结合功能的蛋白或多肽。作为本发明的重金属结合结构域包括但不限于表1所列举的这些。
本发明使用的术语“生物素结合结构域”指的是具有生物素结合活性的多肽，例如生物素结合蛋白的全长或其具有生物素结合功能的部分。本发明的生物素结合结构域可为例如但不限于如下生物素结合蛋白或其生物素结合结构域：eMA、mSA、mSA2、rhizavidin、链霉亲和素以及卵亲和素，优选为mSA2。由于检测体系中融合蛋白可自由移动，无需通过单链形式使得亲和素样蛋白预先多聚化。然而，也可使用单链形式的链霉亲和素二聚体、单链形式的卵亲和素二聚体、单链形式的rhizavidin二聚体、单链形式的链霉亲和素四聚体、单链形式的卵亲和素四聚体。
就将重金属结合结构域可操作地连接至生物素结合结构域而言，只要不破坏两个结构域各自的功能，可将重金属结合结构域直接连接至生物素结合结构域的N端或C端，或使用连接肽将重金属结合结构域连接至生物素结合结构域的N端或C端。当存在多个重金属结合结构域时，在不影响功能的前提下，各重金属结合结构域以及生物素结合结构域的连接方式没有特别限制。连接肽为柔性，不包含任何活性结构域，优选由甘氨酸和/或丝氨酸组成。连接肽的长度几乎不对融合蛋白的功能产生影响，因此可为任意长度。例如，连接肽的氨基酸序列可为GGGGSGGGGS、GVD、GVDG、GI或TR。
在一些实施方式中，融合蛋白可进一步包含分泌信号肽，从而将融合蛋白分泌出微生物细胞外，避免可能形成包涵体而影响折叠。本领域知晓在不影响蛋白功能的前提下，通过在蛋白的N端添加分泌信号肽，将蛋白分泌出细胞的方法。例如，在以枯草芽孢杆菌作为表达宿主的实施方式中，分泌信号肽可为例如但不限于来自AmyA、AmyE、NprE、AprE以及SacB的信号肽。
在一些实施方式中，融合蛋白可进一步包含方便融合蛋白纯化的标签肽。本领域知晓在不影响蛋白功能的前提下，通过在蛋白的N端或C端添加标签肽，可方便蛋白纯化。所述标签肽例如但不限于六聚组氨酸标签、c-Myc标签、Halo标签、Flag标签等。上述标签为本领域所熟知，例如在WO2012/155007中描述。
在第三方面，本发明提供了一种用于处理重金属污染的试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述的微生物细胞或第二方面所述的融合蛋白，以及生物素化的固相材料；其中，所述重金属为选自于如下重金属中的一种或多种：镉、汞、铅以及砷。
本文所述的生物素化的固相材料可为共价连接生物素的任何固相材料。本领域所知晓的是，能够对生物素进行官能团化，并利用官能团化的生物素与带有氨基或羧基的表面进行酯化反应。例如利用N-羟基琥珀酰亚胺生物素与带有氨基或羧基的表面发生酯化反应，对固相表面进行生物素化修饰[17]。也可利用带有聚乙二醇修饰的生物素对固相表面进行修饰，使得修饰后的表面亲水性更强。所述固相材料例如但不限于玻璃、琼脂糖、聚苯乙烯及其他高分子材料。就这一点而言，带有游离的氨基或羧基、或者其表面带有能够被氨基或羧基修饰的游离基团(例如氨基)的任何固相材料都可以作为本发明的固相材料。或者，由于蛋白片段通常包含游离的氨基和/或羧基，所述固相材料可以是蛋白修饰的材料。
在一些实施方式中，可直接将生物素化的固相材料与经处理的样品分离(例如直接取出)，来回收被捕获的重金属离子。就这一点而言，生物素化的固相材料可为片状、块状或丝状形式。在固相材料为片状的实施方式中，其可具有大于1mm2的表面积。在固相材料为块状的实施方式中，其可具有大于1mm3的体积。在固相材料为丝状的实施方式中，其可具有大于1cm的长度。
在一些实施方式中，可通过离心的方式将生物素化的固相材料与经处理的样品分离，来回收被捕获的重金属离子。就这一点而言，生物素化的固相材料可为颗粒的形式，例如，生物素化的固相材料可为尺寸5μm至约1mm的颗粒。
在另一些实施方式中，可通过磁分离将生物素化的固相材料与经处理的样品分离，来回收被捕获的重金属离子。在该实施方式中，生物素化的固相材料可为生物素化的玻璃或高分子材料(例如琼脂糖或聚苯乙烯)磁珠。玻璃、琼脂糖或聚苯乙烯磁珠均为可商购的，例如海狸纳米(玻璃磁珠，货号70201-5；琼脂糖磁珠，货号70203-5)，ThermoFisher(聚苯乙烯磁珠，货号14307D)。优选地，所述磁珠具有1μm至100μm、优选10μm至80μm的尺寸。
不希望被理论所限地，由于生物素的疏水性以及生物素和磁珠连接环境所需的亲水性，在对磁珠进行生物素化时，加入生物素造成局部环境的疏水性有可能使得磁珠发生聚集，从而降低生物素化的效率。在优选的实施方式中，对磁珠进行生物素化时生物素与磁珠的质量比为(0.5-1):1(m/m)、优选3:4(m/m)，生物素化体系缓冲液的离子强度为0.5-3M、优选1M，表面活性剂优选为Tween-20或Triton X-100。
在第四方面，本发明提供了一种用于处理样品中重金属污染的方法，所述方法包括：
(a)提供第一方面所述的微生物细胞或第二方面所述的融合蛋白；
(b)提供生物素化的固相材料；
(c)将步骤(a)提供的微生物细胞或融合蛋白以及步骤(b)提供的生物素化的固相材料与样品进行混合，从而捕获样品中的重金属离子，以及
(d)对步骤(b)的生物素化的固相材料进行回收；
其中，所述重金属为选自于如下重金属中的一种或多种：镉、汞、铅以及砷。
在本发明中，待处理的样品可为任何来源，特别是来自环境的样品。所述来自环境的样品例如获得自或来自如下环境的样品：水(包括废水)、池塘、河流、水库、游泳池、土壤、食品加工和/或包装厂、农业地、水生养殖场(包括水培食品养殖场)、药物制造工厂、动物群设施，或上述环境源的任意组合。样品可为固体、液体或固液混合形式。
本发明的方法可利用取出的样品实施，在重金属污染处理后放回取样地，实现对环境的异位修复。或者，在直接回收或磁分离的实施方式中，可将步骤(a)和(b)提供的材料与样品原位混合，原位回收，从而对环境进行原位修复。在两种方式中，对被回收的重金属的处置/再利用都与本发明的回收步骤独立，因此本发明的方法能够方便地与后续的多种重金属处置方法进行对接。
本发明的微生物细胞、融合蛋白和生物素化的固相材料以及回收方法如本文其它部分所述。
本文所述各方面的实施方式可由如下编号的段落说明：
1.一种用于处理重金属污染的微生物细胞，其中，所述微生物细胞表达重金属结合蛋白以及生物素结合蛋白；其中，所述重金属为选自于如下重金属中的一种或多种：镉、汞、铅以及砷。
2.如段落1所述的微生物细胞，其中，所述微生物选自于由下列微生物所组成的组：细菌、放线菌、霉菌、酵母和藻类。
3.如段落2所述的微生物细胞，其中，所述细菌选自于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌和谷氨酸棒状杆菌。
4.如段落1-3中任一项所述的微生物细胞，其中，所述重金属结合蛋白选自于由如下蛋白所组成的组中的一种或多种：镉结合蛋白、汞结合蛋白、铅结合蛋白以及砷结合蛋白。
5.如段落4所述的微生物细胞，其中，所述重金属结合蛋白选自于如下蛋白中的一种或多种：MerR、Crs5、CadR、CmtR、PbrR、PbrR691以及ArsR。
6.如段落4所述的微生物细胞，其中，所述重金属结合蛋白选自于如下一种或多种蛋白的重金属结合结构域：MerR、Crs5、CadR、CmtR、PbrR、PbrR691以及ArsR。
7.如段落1-6中任一项所述的微生物细胞，其中，所述生物素结合蛋白选自于如下蛋白：eMA、mSA、mSA2、单链形式的链霉亲和素二聚体、单链形式的卵亲和素二聚体、单链形式的rhizavidin二聚体、单链形式的链霉亲和素四聚体、单链形式的卵亲和素四聚体；优选地，所述生物素结合蛋白为mSA2。
8.如段落1-6中任一项所述的微生物细胞，其中，所述生物素结合蛋白选自于：单链形式的链霉亲和素生物素结合结构域二聚体、单链形式的卵亲和素生物素结合结构域二聚体、单链形式的rhizavidin生物素结合结构域二聚体、单链形式的链霉亲和素生物素结合结构域四聚体、单链形式的卵亲和素生物素结合结构域四聚体；优选地，所述生物素结合蛋白为mSA2的生物素结合结构域。
9.如段落1-8中任一项所述的微生物细胞，其中，所述重金属结合蛋白和/或所述生物素结合蛋白进一步包含跨膜及膜定位结构域；优选地，通过连接肽将所述重金属结合蛋白和/或所述生物素结合蛋白与跨膜及膜定位结构域相连。
10.如段落1-9中任一项所述的微生物细胞，其中，所述重金属结合蛋白和/或所述生物素结合蛋白进一步包含标签肽，所述标签肽位于所述重金属结合蛋白和/或所述生物素结合蛋白的N端或C端；优选地，所述标签肽为选自于由如下标签肽所组成的组中的一种或多种：六聚组氨酸标签、c-Myc标签、Halo标签、Flag标签。
11.一种用于处理重金属污染的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含重金属结合结构域以及生物素结合结构域；其中，所述重金属为选自于如下重金属中的一种或多种：镉、汞、铅以及砷。
12.如段落11所述的融合蛋白，其中，所述重金属结合结构域选自于由如下重金属结合蛋白所组成的组中的一种或多种：镉结合蛋白、汞结合蛋白、铅结合蛋白以及砷结合蛋白。
13.如段落12所述的融合蛋白，其中，所述重金属结合结构域选自于如下蛋白中的一种或多种：MerR、Crs5、CadR、CmtR、PbrR、PbrR691以及ArsR。
14.如段落12所述的融合蛋白，其中，所述重金属结合结构域选自于如下一种或多种蛋白的重金属结合结构域：MerR、Crs5、CadR、CmtR、PbrR、PbrR691以及ArsR。
15.如段落11-14中任一项所述的融合蛋白，其中，所述生物素结合结构域选自于如下蛋白或其生物素结合结构域：eMA、mSA、mSA2、链霉亲和素、卵亲和素以及rhizavidin；优选地，所述生物素结合蛋白为链霉亲和素或链霉亲和素的生物素结合结构域。
16.如段落11-14中任一项所述的融合蛋白，其中，所述生物素结合结构域选自于：单链形式的链霉亲和素二聚体、单链形式的卵亲和素二聚体、单链形式的rhizavidin二聚体、单链形式的链霉亲和素四聚体、单链形式的卵亲和素四聚体；单链形式的链霉亲和素生物素结合结构域二聚体、单链形式的卵亲和素生物素结合结构域二聚体、单链形式的rhizavidin生物素结合结构域二聚体、单链形式的链霉亲和素生物素结合结构域四聚体、单链形式的卵亲和素生物素结合结构域四聚体结构域。
17.如段落11-16中任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白进一步包含将所述重金属结合结构域连接至所述生物素结合结构域的连接肽。
18.如段落11-17中任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白进一步包含分泌信号肽；优选地，所述分泌信号肽位于所述融合蛋白的N端。
19.如段落11-18中任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白进一步包含标签肽，所述标签肽位于所述融合蛋白的N端或C端；优选地，所述标签肽为选自于由如下标签肽所组成的组中的一种或多种：六聚组氨酸标签、c-Myc标签、Halo标签、Flag标签。
20.一种用于处理重金属污染的试剂盒，所述试剂盒包含如段落1-10中任一项所述的微生物细胞或如段落11-19中任一项所述的融合蛋白，以及生物素化的固相材料；其中，所述重金属为选自于如下重金属中的一种或多种：镉、汞、铅以及砷。
21.如段落20所述的试剂盒，其中，所述固相材料为表面带有氨基或羧基、或者带有能够被氨基或羧基修饰的基团(例如羟基)，从而能够与生物素共价连接以形成生物素化的固相材料的材料；优选地，所述固相材料为玻璃、琼脂糖、聚苯乙烯或表面修饰有蛋白的材料。
22.如段落21所述的试剂盒，其中，所述生物素化的固相材料为片状材料，优选地，所述片状材料具有大于1mm2的表面积。
23.如段落21所述的试剂盒，其中，所述生物素化的固相材料为块状材料，优选地，所述块状材料具有大于1mm3的体积。
24.如段落21所述的试剂盒，其中，所述生物素化的固相材料为丝状材料，优选地，所述丝状材料具有大于1cm的长度。
25.如段落21所述的试剂盒，其中，所述生物素化的固相材料为颗粒形式，优选地，所述颗粒具有5μm至1mm的尺寸。
26.如段落21所述的试剂盒，其中，所述生物素化的固相材料为磁珠形式，优选地，所述磁珠为玻璃磁珠、琼脂糖磁珠或聚苯乙烯磁珠，更优选为琼脂糖磁珠；优选地，所述磁珠具有1μm至100μm、优选10μm至80μm的尺寸。
27.如段落26所述的试剂盒，其中，对所述磁珠进行生物素化时，生物素与所述磁珠的质量比为(0.5-1):1(m/m)、优选3:4(m/m)；优选地，生物素化体系缓冲液的离子强度为0.5-3M、优选1M；优选地，生物素化体系包含表面活性剂，所述表面活性剂优选为Tween-20或Triton X-100。
28.一种用于处理样品中重金属污染的方法，所述方法包括：
(a)提供如段落1-10中任一项所述的微生物细胞或如段落11-19中任一项所述的融合蛋白；
(b)提供生物素化的固相材料；
(c)将步骤(a)提供的所述微生物细胞或所述融合蛋白以及步骤(b)提供的生物素化的固相材料与样品进行混合，从而捕获样品中的重金属离子，以及
(d)对步骤(b)的生物素化的固相材料进行回收；
其中，所述重金属为选自于如下重金属中的一种或多种：镉、汞、铅以及砷。
29.如段落28所述的方法，其中，步骤(b)中的所述固相材料为表面带有氨基或羧基、或者带有能够被氨基或羧基修饰的基团(例如羟基)，从而能够与生物素共价连接以形成生物素化的固相材料的材料；优选地，所述固相材料为玻璃、琼脂糖、聚苯乙烯或表面修饰有蛋白的材料。
30.如段落29所述的方法，其中，步骤(d)中的所述回收为直接回收。
31.如段落30所述的方法，其中，步骤(b)中的所述生物素化的固相材料为片状材料，优选地，所述片状材料具有大于1mm2的表面积。
32.如段落30所述的方法，其中，步骤(b)中的所述生物素化的固相材料为块状材料，优选地，所述块状材料具有大于1mm3的体积。
33.如段落30所述的方法，其中，步骤(b)中的所述生物素化的固相材料为丝状材料，优选地，所述丝状材料具有大于1cm的长度。
34.如段落29所述的方法，其中，步骤(d)中的所述回收为通过离心回收，且步骤(b)中的所述生物素化的固相材料为颗粒形式，优选地，所述颗粒具有5μm至1mm的尺寸。
35.如段落29所述的方法，其中，步骤(d)中的所述回收为磁分离，且步骤(b)中的所述生物素化的固相材料为磁珠形式，优选地，所述磁珠为玻璃磁珠、琼脂糖磁珠或聚苯乙烯磁珠，更优选为琼脂糖磁珠；优选地，所述磁珠具有1μm至100μm、优选10μm至80μm的尺寸。
36.如段落35所述的方法，其中，对所述磁珠进行生物素化时，生物素与所述磁珠的质量比为(0.5-1):1(m/m)、优选3:4(m/m)；优选地，生物素化体系缓冲液的离子强度为0.5-3M、优选1M；优选地，生物素化体系包含表面活性剂，所述表面活性剂优选为Tween-20或Triton X-100。
37.如段落28-36中任一项所述的方法，其中，所述样品为来自环境的样品，特别是获得自或来自如下环境的样品：水(包括废水)、池塘、河流、水库、游泳池、土壤、食品加工和/或包装厂、农业地、水生养殖场(包括水培食品养殖场)、药物制造工厂、动物群设施，或上述环境源的任意组合；所述样品为固体、液体或固液混合形式。
实施例
实施例1制备生物素化的磁珠
1.试剂
本实施例使用的磁珠分别为玻璃磁珠(直径2μm，海狸纳米，货号70201-5)以及琼脂糖磁珠(直径30μm至150μm，海狸纳米，货号70203-5)。
生物素储液：将生物素溶解于二甲基亚砜(DMSO)，终浓度为50mg/ml。
MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲液：0.1M MES溶于水，使用NaOH调节pH至5.0。
1×PBS缓冲液：
NaCl：7.9g(北京化工厂，纯度≥99.5％，pH：5.0～8.0)；KCl：0.2g(北京化工厂，纯度≥99.5％，pH：5.0～8.0)；
KH2PO4：0.24g(北京化工厂，纯度≥99.5％，pH：4.2～4.5)；
K2HPO4：1.8g(北京化工厂，纯度≥99.0％，pH：8.9～9.4)，
溶于800ml蒸馏水中，最后加蒸馏水定容至1L，用HCl(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)调节溶液的pH值至7.4。
高盐PBS-T溶液：1×PBS缓冲液中加入1M NaCl，并加入0.1％Tween-20或TritonX-100。
高盐TBS-T溶液：10mM的Tris-HCl缓冲液中加入1M NaCl，并加入0.1％Tween-20或Triton X-100。
除另有说明，本实施例所使用的试剂购自SIGMA。
2.方法
(a)将0.15ml DMSO、0.15ml生物素储液加入至预冷的2.7ml MES缓冲液中，剧烈震荡至混合液澄清，得到含有10％DMSO、生物素浓度为2.5mg/ml(～10mM)的MES溶液。
(b)将30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)加入至3ml步骤(a)得到的溶液中，获得EDC浓度为1wt％的溶液。
(c)取1ml浓度为10mg/ml的磁珠，使用磁力架吸附后去除上清液，使用预冷的MES溶液清洗3次。
(d)用3ml步骤(b)的溶液重悬磁珠，在冰上震荡孵育2小时(每20分钟剧烈震荡减少磁珠聚集)。
(e)孵育完成后使用磁力架吸附磁珠，去除上清液，使用高盐PBS-T溶液清洗3次，并重悬磁珠于该溶液，最终体积为1ml，4℃保存。
所获得的磁珠的终浓度为10mg/ml。
实施例2制备能够清除汞离子污染的微生物细胞
1.试剂和培养基
Luria-Bertani(LB)液体培养基：
蛋白胨(Fisher Scientific) 10g/L；
NaCl(Fisher Scientific) 10g/L；
酵母粉(Fisher Scientific) 5g/L。
121℃高压灭菌20min。
LB固体培养基：
与LB液体培养基的配方相同，添加1.5％琼脂粉。
氯霉素(Acros)：溶于LB培养基，终浓度20μg/ml。
氨苄青霉素(Acros)：溶于LB培养基，终浓度25μg/ml。
异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)(USB Corporation)储液浓度1M，终浓度为100μM。
1M Tris-HCl缓冲液：
Tris base：121.14g(American Bioanalytical#AB14042)；溶于800ml蒸馏水中，最后加蒸馏水定容至1L，用HCl(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)调节溶液的pH值至8.0，制成100倍浓度的储液。使用时将储液稀释100倍即可。
质粒构建、菌株培养和维持、诱导中均使用LB液体和固体培养基。
限制性内切酶、T4多核苷酸激酶和T4DNA连接酶购自New England Biolabs(Frankfurt，Germany)。引物和单链DNA片段(寡核苷酸)购自BGI(北京基因组所)。使用分光光度计ND-2000(Peqlab,Erlangen,Germany)检测DNA浓度。
2.构建用于在细胞表面表达生物素结合蛋白的质粒和菌株
全部质粒构建利用大肠杆菌DH5α菌株(TransGen Biotech)作为克隆菌株。使用大肠杆菌DH5α菌株(TransGen Biotech)和BL21(DE3)菌株(TransGen Biotech)作为实验菌株。
构建RGP载体(SEQ ID NO：18)用于程序化的DNA组装。RGP载体中整合有pTac启动子、p15A复制子以及组成型过表达的LacI和AmpR；另外，两个Bsal位点位于lacZα片段的侧翼，从而在消化后从质粒上移除识别位点。借助Golden Gate克隆方法，将LacZα片段替换为感兴趣的生物素结合蛋白，从而构建RGP系列质粒。
构建表达4种不同的生物素结合蛋白(图2A)的质粒，具体地，以RGP载体为克隆载体，使用Golden Gate克隆方法分别组装图2A中的4种融合蛋白。其中，链霉亲和素(四价亲和素样蛋白)的序列为SEQ ID NO：19。eMA(单价亲和素样蛋白)的序列为SEQ ID NO：20。mSA2(单价亲和素样蛋白)的序列为SEQ ID NO：21。SCD-E2为单链形式的链霉亲和素二聚体，序列为SEQ ID NO：22。分别在这些生物素结合蛋白的N端添加内膜定位结构域Lpp和跨膜肽OmpA(Lpp-OmpA)。Lpp-OmpA的序列为SEQ ID NO：23，从而将其定位于细胞表面。-T-R-为-Thr-Arg-连接序列。
将质粒转化至表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆。
3.表面表达生物素结合蛋白的微生物细胞与生物素的相互作用
将过夜培养的种子液使用LB稀释100倍，培养3小时(37℃、225rpm)至OD600～0.6，加入0.1mM的IPTG诱导蛋白表达，使用相同条件再培养4小时。将1.5ml培养物离心(4000rpm，2min)并收集细胞，弃上清。使用1ml的PBS缓冲液重悬细胞，取200μl至96孔板，加入4μl的Biotin-atto488(0.5mM，Sigma，货号30574-1MG-F)，孵育1h(37℃，1000rpm)；随后使用PBS清洗细胞3次。
通过三种方法检验生物素与所构建的微生物细胞的相互作用：
流式细胞仪(BDTM LSR II)/酶标仪(BioTek,SynergyMx Multi-Mode MicroplateReader)：将细胞稀释100倍，在488nm激发波长、525nm检测波长下检测细胞带有的绿色荧光。荧光显微镜(Zeiss AXIO IMAGER A2)：将细胞固定于涂覆于载玻片的琼脂糖，使用荧光显微镜FITC通道观察拍照，激发波长490nm，检测波长520nm。
酶标仪和流式细胞仪检测显示，细胞表面表达的野生型链霉亲和素不与生物素特异性结合，这是由于链霉亲和素需要四聚化后才能与生物素相结合，而以Lpp-OmpA融合蛋白的方式表达在细胞表面的链霉亲和素难以自由的形成四聚体。两种单体亲和素eMA、mSA2以及单肽链的二聚体亲和素SCD-E2与生物素的结合更强，mSA2的结合效果最好(图2B-2C)。图2D的荧光显微照片表明，表面表达mSA2的细胞与生物素-Atto488特异结合并呈现较强的荧光。
4.表面表达生物素结合蛋白的微生物细胞与生物素化磁珠的相互作用
将过夜培养的种子液使用LB稀释100倍，培养3小时(37℃、225rpm)至OD600～0.6，加入0.1mM的IPTG诱导蛋白表达，使用相同条件再培养4小时。将1.5ml培养物离心(4000rpm，2min)并收集细胞，弃上清。使用1ml的PBS缓冲液重悬细胞，取200μl至96孔板，加入20μl实施例1制备的生物素化的磁珠(浓度：10mg/ml)，孵育1h(37℃，1000rpm)；使用磁力架吸附磁珠，去除上清液，并使用缓冲溶液清洗磁珠3次，制备扫描电子显微镜(SEM)样品[18]并观察拍照。
如图3的SEM图像显示，表面表达mSA2的细胞能够有效吸附于磁珠表面，而表面表达单体链霉亲合素的细胞由于不能四聚化，难以有效地吸附于磁珠表面。
5.构建用于在细胞表面表达重金属结合蛋白的质粒和菌株
全部质粒构建利用大肠杆菌DH5α菌株(TransGen Biotech)作为克隆菌株。使用大肠杆菌DH5α菌株(TransGen Biotech)和BL21(DE3)菌株(TransGen Biotech)作为作为实验菌株。
构建pSB1C3-pT7(SEQ ID NO：24)载体用于程序化的DNA组装。pSB1C3质粒为Biobrick标准质粒，整合有pMB1复制子和CmR抗性基因。pSB1C3-pT7在pSB1C3基础上组装了T7启动子，并且，与RGP载体类似，其侧翼带有两个BsaI位点的LacZα片段用于使用GoldenGate克隆方法组装pSB1C3-pT7系列质粒。
设计能够吸附汞离子并在细胞表面定位的Lpp-OmpA-MBP(Hg)融合蛋白。根据野生型MerR的结构，设计重金属结合蛋白MBP(Hg)。野生型MerR的序列及结构如SEQ ID NO：1和图4A所示。由于在本发明中不涉及Hg造成该转录因子的变构，无需使用DNA结合结构域。本实施例所使用的重金属结合部分如图4B所示，截取MerR蛋白的汞离子结合结构域和与其相连的连接序列作为汞离子结合模块，将两个该模块串联得到MBP(Hg)(SEQ ID NO：25)。另外，通过在MBP(Hg)的N端添加Lpp-OmpA使得该蛋白能够定位于细胞外表面。-G-I-为-Gly-Ile-连接序列，-G-V-D-为-Gly-Val-Asp-连接序列(图4C)。
使用Golden Gate克隆方法将Lpp-OmpA-MBP(Hg)融合蛋白插入到pSB1C3-pT7载体中。将质粒转化至表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆。
6.表面表达MBP(Hg)的微生物细胞对汞离子的吸附
将过夜培养的种子液使用LB稀释100倍，培养3小时(37℃、225rpm)至OD600～0.6，加入0.1mM的IPTG诱导蛋白表达，使用相同条件再培养4小时。将1.5ml培养物离心(4000rpm，2min)并收集细胞，弃上清。使用500μl的高盐TBS-T缓冲液重悬细胞，向其中分别加入硝酸汞标准溶液，使汞离子终浓度为10μM和100μM，37℃振荡孵育1h(1000rpm)；离心(4000rpm，2min)去除细胞，将上清液稀释100倍后检测汞浓度。
重金属离子浓度测定工作由北京新奥环标公司完成，使用原子荧光光谱法测定汞离子浓度，使用ICP-MS法测定镉和铅离子的浓度。
如图4D所示，在初始汞离子浓度为10μM或100μM时，表面表达MBP(Hg)的细胞均可以吸附溶液中的汞离子，使溶液中的剩余汞离子浓度大幅降低。
7.构建同时表达MBP(Hg)和生物素结合蛋白的细胞
分别将上述带有Lpp-OmpA-MBP(Hg)的pSB1C3-pT7质粒和带有Lpp-OmpA-mSA2的RGP质粒共同转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得同时具有重金属吸附能力和与生物素化磁珠结合能力的微生物细胞。
实施例3制备能够清除汞离子污染的融合蛋白SA-MBP(Hg)
1.试剂和培养基
实施例3所使用的培养基和缓冲液如实施例2第一部分所述。
蛋白提取和复性用试剂如下[19]。
2.SA-MBP(Hg)融合蛋白的构建
全部质粒构建利用大肠杆菌DH5α菌株(TransGen Biotech)作为克隆菌株。使用大肠杆菌BL21(DE3)菌株(TransGen Biotech)作为实验菌株。
如图5A所示，将链霉亲和素(SEQ ID NO：20)的C端与实施例2所述的MBP(Hg)(图4B，SEQ ID NO：25)的N端连接起来构建SA-MBP(Hg)融合蛋白，其分子量约为26kD。连接肽为柔性，不包含任何活性结构域，其序列为GVDG。将SA-MBP(Hg)插入pET28a(+)载体(Novagen，货号69864-3)多克隆位点的NcoI酶切位点。
将质粒转化至表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆。
将过夜培养的种子液使用LB培养基稀释100倍至总体积为1L，培养3小时(37℃、225rpm)至OD600～0.6，加入0.1mM的IPTG诱导蛋白表达，使用相同条件再培养6小时。离心，弃上清，收集细菌。用30ml左右1×PBS悬浮，超声裂解(超声6s，间隔12s，99次，300W左右)至液体澄清；10000rpm离心10min，弃上清，沉淀用洗涤缓冲液重悬，继续10000rpm离心10min，弃上清；重复一次，用重悬缓冲液重悬，10000rpm离心10min。称量沉淀重量，根据沉淀质量加入复溶缓冲液(盐酸胍或尿素)溶解，使沉淀浓度为30mg/ml。保持4℃搅拌过夜。12000rpm离心10min，将上清加入透析袋，在重折叠缓冲液中4℃过夜透析。12000rpm离心10min除去透析袋中的沉淀，收集上清，采用孔径为10kD的蛋白超滤浓缩管(Millipore，货号UFC901096)将溶剂更换为蛋白储存缓冲液。使用BCA法测定蛋白浓度，加入50％甘油，-80℃保存。如图5B所示，样品4为复性后的SA-MBP(Hg)，条带大小正确，且杂蛋白量很少，不再需要使用His-tag进行镍柱纯化。与样品2相比，样品4中的蛋白仅占不到20％(目测)，说明SA-MBP(Hg)蛋白的大部分不能正确复性，出现在沉淀中与预期符合。样品2中的蛋白与样品3中的蛋白种类类似，说明被复溶缓冲液溶解的蛋白中大部分蛋白在重折叠中不能正确复性，留在了沉淀部分，重折叠缓冲液具有特异性复性SA和SA-MBP(Hg)的能力；
根据浓缩后的蛋白浓度(4.4mg/ml)推算，使用本方法，1L菌液大约可以产出复性后的SA-MBP约3mg。
3.SA-MBP(Hg)融合蛋白与磁珠的结合
将纯化的SA-MBP(Hg)用含有1M NaCl的高盐PBS-T稀释20倍至0.1mg/ml。将400μl蛋白与实施例1制备的40μl琼脂糖磁珠(平均直径为65μm)混合，在37℃、1000rpm震荡孵育1小时。使用磁力架吸附磁珠，取出上清液，随后高盐PBS-T清洗磁珠三次，加入10μl上样缓冲液，煮沸5min，取上清液。对上清液进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色。用不带有生物素的对照琼脂糖磁珠实施相同的步骤。
如图6所示，生物素化的磁珠与SA-MBP(Hg)混合孵育后，上清液中不再能够检测到蛋白，这表明SA-MBP(Hg)可以与生物素化的磁珠结合，其亲和素样部分具有生物活性。而磁珠煮沸后的上清液中可以检出蛋白，而不带有生物素的对照磁珠与SA-MBP(Hg)混合孵育后，上清液中依然可以检测到与加入量类似的蛋白，表明SA-MBP(Hg)不能被未生物素化的磁珠结合。另外，SA-MBP(Hg)蛋白不能与对照磁珠结合说明其不是以包涵体的形式存在，而是需要生物素结合蛋白-生物素特异性反应才能结合。
4.SA-MBP(Hg)融合蛋白对汞离子的吸附
将纯化的SA-MBP(Hg)加入至高盐TBS-T缓冲溶液中(终浓度为0.1mg/ml)，加入硝酸汞标准溶液混合，总体积为500μl，汞离子终浓度为1μM和10μM，37℃振荡孵育1h。稀释至10ml，使用孔径为10kD的蛋白超滤浓缩管(Millipore，货号UFC901096)过滤SA-MBP(Hg)蛋白，取滤出液稀释至50ml，利用与实施例2相同的方法检测汞离子浓度。如图7所示，在初始汞离子浓度为1μM或10μM时，SA-MBP(Hg)蛋白均可以吸附溶液中的汞离子，使溶液中的剩余汞离子浓度大幅降低。
实施例4制备能够清除镉离子污染的融合蛋白SA-MBP(Cd)
实施例4所使用的试剂和培养基与实施例3相同。
1.SA-MBP(Cd)融合蛋白的构建
全部质粒构建利用大肠杆菌DH5α菌株(TransGen Biotech)作为克隆菌株。使用大肠杆菌BL21(DE3)菌株(TransGen Biotech)作为实验菌株。
根据野生型CadR的结构(SEQ ID NO：3，图8A)，设计能够吸附镉离子的MBP(Cd)蛋白(SEQ ID NO：26，图8B)。MBP(Cd)蛋白截取CadR蛋白的镉离子结合结构域和与其相连的随机序列作为镉离子结合模块。
如图8C所示，将链霉亲和素(SEQ ID NO：20)的C端与生物素结合蛋白MBP(Cd)的N端连接起来构建SA-MBP(Cd)融合蛋白，其分子量约为22kD。连接肽为柔性，不包含任何活性结构域，序列为GVDG。将SA-MBP(Cd)插入pET28a(+)载体(Novagen，货号69864-3)多克隆位点的NcoI酶切位点。
SA-MBP(Cd)融合蛋白的表达、提取和复性方法与实施例3(2)中相同。
2.SA-MBP(Cd)融合蛋白与磁珠的结合
SA-MBP(Cd)融合蛋白与磁珠的结合测试方法与实施例3(3)中相同。
如图8D所示，生物素化的磁珠与SA-MBP(Cd)混合孵育后，上清液中不再能够检测到蛋白，这表明SA-MBP(Cd)可以与生物素化的磁珠结合，其亲和素样部分具有生物活性。而磁珠煮沸后的上清液中可以检出蛋白，而不带有生物素的对照磁珠与SA-MBP(Cd)混合孵育后，上清液中依然可以检测到与加入量类似的蛋白，表明SA-MBP(Cd)不能被未生物素化的磁珠结合。另外，SA-MBP(Cd)蛋白不能与对照磁珠结合说明其不是以包涵体的形式存在，而是需要生物素结合蛋白-生物素特异性反应才能结合。
3.SA-MBP(Cd)融合蛋白对镉离子的吸附
将纯化的SA-MBP(Cd)加入至高盐TBS-T缓冲溶液中(终浓度为0.1mg/ml)，加入硝酸镉标准溶液混合，总体积为500μl，镉离子终浓度为0.1μM、1μM和10μM，37℃振荡孵育1h。稀释至10ml，使用孔径为10kD的蛋白超滤浓缩管(Millipore，货号UFC901096)过滤SA-MBP(Cd)蛋白，取滤出液，测试镉离子浓度。如图9所示，在初始镉离子浓度为0.1μM，1μM或10μM时，SA-MBP(Cd)蛋白均可以吸附溶液中的镉离子，使溶液中的剩余镉离子浓度大幅降低。
实施例5制备能够分泌出细胞外的SA-MBP(Hg)蛋白
鉴于SA-MBP(Hg)在微生物体内容易错误折叠形成包涵体，为了提高蛋白产量，考虑通过在融合蛋白的N端添加分泌信号肽，将融合蛋白分泌出细胞外。
全部质粒构建利用大肠杆菌DH5α菌株(TransGen Biotech)作为克隆菌株。使用枯草芽孢杆菌分泌蛋白表达体系[TaKaRa，货号3380]中包含的枯草芽孢杆菌RIK1285菌株作为表达菌株。基于该体系中包含的pBE-S载体构建pBE-S-LacZ质粒(图10B，SEQ ID NO：27)。具体而言，将侧翼带有BsaI位点的LacZα序列插入pBE-S载体的pAprE启动子与His-tag之间，用于使用Golden Gate克隆方法构建pBE-S系列质粒。构建完成的pBE-S系列质粒能够在枯草芽孢杆菌在中表达SA-MBP(Hg)，并可以使用His-tag抗体通过Western印迹进行蛋白表达的检测。
为了筛选能够将在枯草芽孢杆菌中表达的SA-MBP(Hg)分泌到细胞外的信号肽，选取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的AmyE、NprE、AprE和SacB基因的信号肽序列以及解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的AmyA、NprE、AprE和SacB基因的信号肽序列(图10C)。使用Golden Gate克隆方法将8种不同的信号肽分别置于SA-MBP(Hg)的N端，插入到pBE-S-LacZ载体中，构建pBE-S系列质粒。
将37℃，200rpm震荡过夜培养的枯草芽孢杆菌种子液使用LB培养基稀释100倍至100ml，使用原条件继续培养48小时，10000rpm离心10min取上清液，丢弃细胞沉淀。使用孔径为10kD的蛋白超滤浓缩管(Millipore，货号UFC901096)过滤SA-MBP(Hg)蛋白，将上清液浓缩100倍至1ml，取10μl加入2μl上样缓冲液(6×)煮沸5min，进行Western印迹，使用His-tag抗体检测上清液中存在的SA-MBP(Hg)蛋白。
如图10D所示，带有枯草芽孢杆菌AmyE基因的信号肽的2号样品和带有解淀粉芽孢杆菌SacB基因的信号肽的7号样品能够在正确大小(26kD)的位置检测到条带，且100倍浓缩液中的条带强度有明显增加。2号和7号信号肽能够引导细胞内表达的SA-MBP(Hg)分泌到细胞外。
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Claims (9)

1.一种用于处理重金属污染的微生物细胞，其中，所述微生物细胞表达重金属结合蛋白以及生物素结合蛋白；其中，所述重金属为选自于如下重金属中的一种或多种：镉、汞、铅以及砷。
2.如权利要求1所述的微生物细胞，所述微生物细胞具有如下的一种或多种特征：
所述微生物选自于由下列微生物所组成的组：细菌、放线菌、霉菌、酵母和藻类；优选地，所述细菌选自于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌和谷氨酸棒状杆菌；
所述重金属结合蛋白选自于由如下蛋白所组成的组中的一种或多种：镉结合蛋白、汞结合蛋白、铅结合蛋白以及砷结合蛋白；优选地，所述重金属结合蛋白选自于如下蛋白中的一种或多种：MerR、Crs5、CadR、CmtR、PbrR、PbrR691以及ArsR；或者，所述重金属结合蛋白选自于如下一种或多种蛋白的重金属结合结构域：MerR、Crs5、CadR、CmtR、PbrR、PbrR691以及ArsR；
所述生物素结合蛋白选自于如下蛋白：eMA、mSA、mSA2、单链形式的链霉亲和素二聚体、单链形式的卵亲和素二聚体、单链形式的rhizavidin二聚体、单链形式的链霉亲和素四聚体、单链形式的卵亲和素四聚体；优选地，所述生物素结合蛋白为mSA2；或者，所述生物素结合蛋白选自于：单链形式的链霉亲和素生物素结合结构域二聚体、单链形式的卵亲和素生物素结合结构域二聚体、单链形式的rhizavidin生物素结合结构域二聚体、单链形式的链霉亲和素生物素结合结构域四聚体、单链形式的卵亲和素生物素结合结构域四聚体；优选地，所述生物素结合蛋白为mSA2的生物素结合结构域。
优选地，所述重金属结合蛋白和/或所述生物素结合蛋白进一步包含跨膜及膜定位结构域；优选地，通过连接肽将所述重金属结合蛋白和/或所述生物素结合蛋白与跨膜及膜定位结构域相连；以及
所述重金属结合蛋白和/或所述生物素结合蛋白进一步包含标签肽，所述标签肽位于所述重金属结合蛋白和/或所述生物素结合蛋白的N端或C端；优选地，所述标签肽为选自于由如下标签肽所组成的组中的一种或多种：六聚组氨酸标签、c-Myc标签、Halo标签、Flag标签。
3.一种用于处理重金属污染的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含重金属结合结构域以及生物素结合结构域；其中，所述重金属为选自于如下重金属中的一种或多种：镉、汞、铅以及砷。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，所述融合蛋白具有如下的一种或多种特征：
所述重金属结合结构域选自于由如下重金属结合蛋白所组成的组中的一种或多种：镉结合蛋白、汞结合蛋白、铅结合蛋白以及砷结合蛋白；优选地，所述重金属结合结构域选自于如下蛋白中的一种或多种：MerR、Crs5、CadR、CmtR、PbrR、PbrR691以及ArsR；或者，所述重金属结合结构域选自于如下一种或多种蛋白的重金属结合结构域：MerR、Crs5、CadR、CmtR、PbrR、PbrR691以及ArsR；
所述生物素结合结构域选自于如下蛋白或其生物素结合结构域：eMA、mSA、mSA2、链霉亲和素、卵亲和素以及rhizavidin；优选地，所述生物素结合结构域为链霉亲和素或链霉亲和素的生物素结合结构域；或者，所述生物素结合结构域选自于：单链形式的链霉亲和素二聚体、单链形式的卵亲和素二聚体、单链形式的rhizavidin二聚体、单链形式的链霉亲和素四聚体、单链形式的卵亲和素四聚体；单链形式的链霉亲和素生物素结合结构域二聚体、单链形式的卵亲和素生物素结合结构域二聚体、单链形式的rhizavidin生物素结合结构域二聚体、单链形式的链霉亲和素生物素结合结构域四聚体、单链形式的卵亲和素生物素结合结构域四聚体结构域；
所述融合蛋白进一步包含将所述重金属结合结构域连接至所述生物素结合结构域的连接肽；
所述融合蛋白进一步包含分泌信号肽；优选地，所述分泌信号肽位于所述融合蛋白的N端；以及
所述融合蛋白进一步包含标签肽，所述标签肽位于所述融合蛋白的N端或C端；优选地，所述标签肽为选自于由如下标签肽所组成的组中的一种或多种：六聚组氨酸标签、c-Myc标签、Halo标签、Flag标签。
5.一种用于处理重金属污染的试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1或2所述的微生物细胞或如权利要求3或4所述的融合蛋白，以及生物素化的固相材料；其中，所述重金属为选自于如下重金属中的一种或多种：镉、汞、铅以及砷。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其中，所述试剂盒具有如下的一种或多种特征：
所述固相材料为表面带有氨基或羧基、或者带有能够被氨基或羧基修饰的基团(例如羟基)，从而能够与生物素共价连接以形成生物素化的固相材料的材料；优选地，所述固相材料为玻璃、琼脂糖、聚苯乙烯或表面修饰有蛋白的材料；
所述生物素化的固相材料为片状材料，优选地，所述片状材料具有大于1mm2的表面积；
所述生物素化的固相材料为块状材料，优选地，所述块状材料具有大于1mm3的体积；
所述生物素化的固相材料为丝状材料，优选地，所述丝状材料具有大于1cm的长度；
所述生物素化的固相材料为颗粒形式，优选地，所述颗粒具有5μm至1mm的尺寸；以及
所述生物素化的固相材料为磁珠形式，优选地，所述磁珠为玻璃磁珠、琼脂糖磁珠或聚苯乙烯磁珠，更优选为琼脂糖磁珠；优选地，所述磁珠具有1μm至100μm、优选10μm至80μm的尺寸；优选地，对所述磁珠进行生物素化时，生物素与所述磁珠的质量比为(0.5-1):1(m/m)、优选3:4(m/m)；优选地，生物素化体系缓冲液的离子强度为0.5-3M、优选1M；优选地，生物素化体系包含表面活性剂，所述表面活性剂优选为Tween-20或Triton X-100。
7.一种用于处理样品中重金属污染的方法，所述方法包括：
(a)提供如权利要求1或2所述的微生物细胞或如权利要求3或4所述的融合蛋白；
(b)提供生物素化的固相材料；
(c)将步骤(a)提供的所述微生物细胞或所述融合蛋白以及步骤(b)提供的所述生物素化的固相材料与样品进行混合，从而捕获样品中的重金属离子，以及
(d)对步骤(b)的所述生物素化的固相材料进行回收；
其中，所述重金属为选自于如下重金属中的一种或多种：镉、汞、铅以及砷。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述方法具有如下的一种或多种特征：
步骤(b)中的所述固相材料为表面带有氨基或羧基、或者带有能够被氨基或羧基修饰的基团(例如羟基)，从而能够与生物素共价连接以形成生物素化的固相材料的材料；优选地，所述固相材料为玻璃、琼脂糖、聚苯乙烯或表面修饰有蛋白的材料；
优选地，步骤(d)中的所述回收为直接回收；步骤(b)中的所述生物素化的固相材料为片状材料，优选地，所述片状材料具有大于1mm2的表面积；或者，步骤(b)中的所述生物素化的固相材料为块状材料，优选地，所述块状材料具有大于1mm3的体积；或者，步骤(b)中的所述生物素化的固相材料为丝状材料，优选地，所述丝状材料具有大于1cm的长度；
优选地，步骤(d)中的所述回收为通过离心回收，且步骤(b)中的所述生物素化的固相材料为颗粒形式，优选地，所述颗粒具有5μm至1mm的尺寸；或者
优选地，步骤(d)中的所述回收为磁分离，且步骤(b)中的所述生物素化的固相材料为磁珠形式，优选地，所述磁珠为玻璃磁珠、琼脂糖磁珠或聚苯乙烯磁珠，更优选为琼脂糖磁珠；优选地，所述磁珠具有1μm至100μm、优选10μm至80μm的尺寸；优选地，对所述磁珠进行生物素化时，生物素与所述磁珠的质量比为(0.5-1):1(m/m)、优选3:4(m/m)；优选地，生物素化体系缓冲液的离子强度为0.5-3M、优选1M；优选地，生物素化体系包含表面活性剂，所述表面活性剂优选为Tween-20或Triton X-100。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中，所述样品为来自环境的样品，特别是获得自或来自如下环境的样品：水(包括废水)、池塘、河流、水库、游泳池、土壤、食品加工和/或包装厂、农业地、水生养殖场(包括水培食品养殖场)、药物制造工厂、动物群设施，或上述环境源的任意组合；所述样品为固体、液体或固液混合形式。
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