CN108060227B - 一种检测pah基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种检测pah基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108060227B CN108060227B CN201810154162.9A CN201810154162A CN108060227B CN 108060227 B CN108060227 B CN 108060227B CN 201810154162 A CN201810154162 A CN 201810154162A CN 108060227 B CN108060227 B CN 108060227B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- seq
- intron
- pah gene
- sequencing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 101150036331 pah gene Proteins 0.000 title claims abstract description 120
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 title claims abstract description 36
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 46
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims abstract description 37
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 15
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 82
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 57
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 31
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 30
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 18
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 18
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 9
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 8
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 5
- 102100030569 Nuclear receptor corepressor 2 Human genes 0.000 claims description 5
- 101710153660 Nuclear receptor corepressor 2 Proteins 0.000 claims description 5
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 claims description 5
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 claims description 5
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 claims description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 238000007671 third-generation sequencing Methods 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 23
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 7
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 abstract description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 45
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 22
- 108010069013 Phenylalanine Hydroxylase Proteins 0.000 description 21
- 102100038223 Phenylalanine-4-hydroxylase Human genes 0.000 description 13
- 201000011252 Phenylketonuria Diseases 0.000 description 12
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 11
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 208000016245 inborn errors of metabolism Diseases 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 238000009609 prenatal screening Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101100190273 Homo sapiens PAH gene Proteins 0.000 description 1
- 201000006347 Intellectual Disability Diseases 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000022877 amino acid metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000009223 counseling Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000003936 denaturing gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003935 denaturing gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测PAH基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法，用于PCR特异性扩增检测PAH基因突变的引物组，该组PCR引物共9对，分别如下：用于扩增PAH基因外显子1上游外侧序列（位于基因5’端）到内含子2的引物，其正向引物如SEQ ID NO:1所示，反向引物如SEQ ID NO:2所示；用于扩增PAH基因内含子2上游（5’端）到内含子2下游（3’端）的引物，其正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:4所示等。本发明实现PAH基因全覆盖，所检测的序列长度达88171bp，有助于内含子内变异和结构变异的检测，可提高致病突变的检出率，而且操作更为简单，成本低，另外每个扩增片段与相邻片段均有重叠区，可用于片段拼接和单体型构建。
Description
技术领域
本发明涉及PAH基因技术领域，特别涉及一种检测PAH基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法。
背景技术
苯丙氨酸羟化酶缺乏症（phenylalanine hydroxylase deficiency,PAHD）是常见的氨基酸代谢病，PAHD的发病是由于苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase,PAH）突变导致酶活性降低或丧失，使苯丙氨酸代谢异常。未经治疗的PAHD患儿由于体内过量的苯丙氨酸和旁路代谢产物的神经毒性作用可造成严重的智力障碍和症状性癫痫。如果能得到早期诊断和治疗，则神经损伤则可不发生，智力正常。随着临床诊治的发展，PAHD已成为可治疗、可预防的疾病。由于患儿在早期不出现症状，PAH基因突变分析是PAHD的确诊方法。同时，对患者进行PAH基因检测也有助于其直系亲属遗传咨询，并为再次生育产前检测提供依据。PAH基因位于人染色体位置12q23.2，全长约90kb，含13个外显子，编码区长度为1359bp，编码452个氨基酸的多肽链并进一步折叠构成苯丙氨酸羟化酶蛋白。目前报道的PAH基因突变种类多，约有800多种，大部分为错义突变，其余还包括剪切突变、无义突变和小的缺失/插入突变，涉及整个基因，具有高度遗传异质性，存在显著的地区和人种差异。同时，国内外学者均有报道PAH基因突变部分存在跨越外显子和/或内含子的大片段缺失或重复突变。目前采用PCR扩增外显子及侧翼有限区域序列结合DNA测序的方法可明确90%左右的患者，仍有10%左右的患者不能明确病因，因此亟需能够特异性检测PAH全长基因的检测方法。自1986年DiLella等人使用片段克隆-Sanger核苷酸测序方法检测出人类PAH基因的第一个致病突变之后，国内外出现越来越多分子检测技术用于PAH基因的突变检测。已报道的基因检测方法有聚合酶链反应-等位基因特异性寡核苷酸链杂交（Polymerase chainreaction--allele specific oligonucleotides, PCR-ASO）、聚合酶链反应-变性凝胶梯度电泳（PCR-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE）、聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-Single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP）、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP）、聚合酶链反应-变性高效液相色谱（PCR-denaturing high-performance liquidchromatography, PCR-DHPLC）、聚合酶链反应-高分辨率熔解曲线分析（PCR-highresolution melting,PCR-HRM）等，有着操作简单经济适用等特点，但其缺点是仅能检出有限的特定突变型或无法明确突变的具体位置和类型。目前，Sanger测序方法是临床应用于PAH基因突变检测的主要方法。2006年张志等（经典型苯丙酮尿症基因全长外显子的突变检测和分析，《中国优生与遗传杂志》，2006年，第14卷第5期，14-16页）建立了对PAH基因外显子PCR扩增产物Sanger测序的方法。2007年宋昉等（中国北方地区苯丙氨酸羟化酶基因的突变构成，《中华医学遗传学杂志》，2007年，第24卷第3期，241-246页）使用张志等人建立的分析方法对230例苯丙酮尿症患儿PAH基因全部外显子及其侧翼内含子序列进行了Sanger测序检测。
针对PAH基因突变检测，已有多项专利公开报道。CN1335408A（2002年）公布了适合于早期诊断和产前筛查苯丙酮尿症的PAH基因突变诊断专用DNA芯片，但该方法仅对40种PAH基因突变进行检测。CN1696308A（2005年）也公布了适合于早期诊断和产前筛查苯丙酮尿症的PAH基因突变诊断专用DNA芯片，但该方法仅对6种PAH基因突变进行检测。CN101481741A（2009年）公布了利用特异性扩增PAH基因的第4、5、6、7、10、11和12号外显子及其侧翼内含子序列的PCR引物，再结合Sanger测序法、酶促错配切割等方法检测13种PAH基因突变。CN101570787A（2009年）也公布了一种用于产前快速诊断的复合芯片，但该方法仅对5种PAH基因突变进行检测。CN101899518A（2010年）公布了一种检测苯丙酮尿症PAH基因7个热点突变位点的试剂盒及其PCR扩增方法，因其产物的特异性非常高，可直接观察凝胶电泳的产物条带的有无来判断PAH基因相应突变位点的基因型。CN101693921A（2010年）公布了一种针对口腔拭子DNA，利用特异性PCR扩增PAH基因第7号和第12号外显子，再经Sanger测序技术检测这两个外显子的突变情况。CN201376967Y（2010年）公布了用于产前快速诊断的复合芯片，但该方法仅对5种PAH基因突变进行检测。CN102533992A（2012年）公布了一种对苯丙氨酸羟化酶基因进行测序的方法，即同时对PAH基因的第1至13号外显子的目标区域进行特异性PCR扩增，其PCR产物用于构建测序文库，再进行高通量测序。CN202671546U（2013年）公布了一种苯丙酮尿症致病基因突变检测试剂盒，即利用特异性PCR引物扩增PAH基因的13个外显子，再使用Sanger测序进行突变分析。CN103436616A（2013年）公布了一种同时检测中国人群苯丙酮尿症PAH基因12个突变热点的试剂盒，适合于群体性筛查。CN104031990A（2014年）公布了一种苯丙酮尿症PAH基因检测试剂盒，主要检测PAH基因的13个常见突变位点。CN103509865A（2014年）公布了一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测PAH基因突变的方法，主要可检测PAH基因第3、6、7、11和12号外显子的序列是否存在异常，但无法检出具体的基因型。CN104232770A（2014年）公布了一种苯丙酮尿症基因检测试剂盒，该试剂盒利用多重连接检测反应技术快速检测PAH基因7个位点的基因型。CN105177160A（2015年）公布了一种检测多种新生儿遗传代谢病致病基因突变的引物及试剂盒，对22种常见新生儿遗传代谢病相关40个致病基因（包含PAH基因）的外显子及外显子内含子结合区域的序列进行特异性引物多重PCR，而后进行二代测序和分析，给出检测基因的突变信息。CN105755109A（2016）公布了一种新的苯丙酮尿症基因筛查和诊断体系及试剂盒，利用PCR技术、DNA连接技术和毛细管电泳技术所构建的体系，对41个较常见的PAH基因突变位点进行检测。PAH基因外显子总长度为4122bp（参考基因组为GRCh37/hg19），而内含子总长度却高达76597bp（参考基因组为GRCh37/hg19），上述报道技术只针对突变位点进行检测，或检测PAH基因外显子序列和少部分位于外显子侧翼的内含子序列，而不能针对PAH基因全部内含子序列进行检测，本领域仍需要一种能够检测PAH基因全长的基因检测方法，即该方法不仅能够检测全部外显子序列，还能检测全部内含子序列。
在过去10年里，测序技术发展很快，出现了Illumina双端测序和Ion Torrent 半导体测序为代表的第二代测序技术，及以PacBio SMRT测序为代表的第三代测序技术。Illumina双端测序使用簇生成和边合成边测序的方法来实现快速、准确的测序。这一过程在将DNA碱基加入核酸链的同时对其进行识别。每个碱基在加入不断延伸的链的同时发出独特的荧光信号，这些信号可以被用来确定DNA序列的顺序。Ion Torrent半导体测序是基于半导体芯片的新一代革命性测序技术，该技术使用了一种布满小孔的高密度半导体芯片，一个小孔就是一个测序反应池。当DNA聚合酶把4种dNTP中的一种聚合到延伸中的DNA链上时，会释放一个氢离子，反应池中的pH值会发生变化，位于池下的离子感受器感受到此信号，把化学信号直接转化为数字信号，从而读出DNA序列。PacBio SMRT测序也是基于边合成边测序的原理，这项技术的核心在于使用了零级波导技术（Zero-Mode Waveguide,ZMW)，每个ZMW固定一个DNA聚合酶和一条DNA模板，被荧光标记磷酸集团的核苷酸在聚合酶活性位点上与模板链结合（每种脱氧核苷酸被不用颜色的染料标记），被激发出荧光，在荧光脉冲结束后，被标记的磷酸集团被切割并释放。聚合酶转移到下一个位置，下一个脱氧核苷酸连接到位点上开始释放荧光脉冲，进行下一个循环，实现测序。PacBio SMRT测序的特点有读长超长、GC偏向性小、准确性高等特点，可以直接对接长链PCR（long-range PCR,LR-PCR）产物进行测序，而不需要片段化处理和再次PCR扩增。由于PAH基因全部外显子和全部内含子加在一起总长度80719bp（参考基因组为GRCh37/hg19）,传统Sanger测序要完成该基因全长序列测序，工作量极大，且费用极高，而采用高通量测序技术可以同时对PAH基因全长进行测序，可以缩短检测周期，降低工作量和检测成本。
因此，发明一种检测PAH基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法来解决上述问题很有必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测PAH基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种检测PAH基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法，用于PCR特异性扩增检测PAH基因突变的引物组，该组PCR引物共9对，分别如下：
用于扩增PAH基因外显子1上游外侧序列（位于基因5’端）到内含子2的引物，其正向引物如SEQ ID NO:1所示，反向引物如SEQ ID NO:2所示；
用于扩增PAH基因内含子2上游（5’端）到内含子2下游（3’端）的引物，其正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:4所示；
用于扩增PAH基因内含子2到内含子3的引物，其正向引物如SEQ ID NO:5所示，反向引物如SEQ ID NO:6所示；
用于扩增PAH基因内含子3上游（内含子5’端）到内含子3下游（内含子3’端）的引物，其正向引物如SEQ ID NO:7所示，反向引物如SEQ ID NO:8所示；
用于扩增PAH基因内含子3到内含子4的引物，其正向引物如SEQ ID NO:9所示，反向引物如SEQ ID NO:10所示；
用于扩增PAH基因内含子4到内含子5的引物，其正向引物如SEQ ID NO:11所示，反向引物如SEQ ID NO:12所示；
用于扩增PAH基因内含子5到内含子7的引物，其正向引物如SEQ ID NO:13所示，反向引物如SEQ ID NO:14所示；
用于扩增PAH基因内含子5到内含子11的引物，其正向引物如SEQ ID NO:15所示，反向引物如SEQ ID NO:16所示；
用于扩增PAH基因内含子9到外显子13下游外侧序列（位于基因3’端）的引物，其正向引物如SEQ ID NO:17所示，反向引物如SEQ ID NO:18所示。
用于PCR特异性扩增检测PAH基因突变的试剂盒，包含引物组中的一对或多对引物。
优选的，所述用于PCR特异性扩增检测PAH基因突变的试剂盒还包含一种或多种试剂，利用所述引物进行长链PCR“long-range PCR,LR-PCR”反应的试剂；利用所述引物进行长片段PCR反应的试剂DNA聚合酶、缓冲液和dNTP混合物；用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂。
优选的，所述试剂盒包含下述试剂，PCR引物组中的一对或多对引物、10×GeneAmpHigh Fidelity PCR缓冲液、10mmol/LdNTP、5mol/L甜菜碱、DMSO和5U/μL聚合酶混合物。
优选的，在总体积为50µl的PCR反应体系中含有下述组分：每种PCR引物各1μl，引物的浓度为10μmol/L；10×GeneAmp High Fidelity PCR缓冲液5μl，10mmol/L，dNTP2μl，10μmol/L正、反向引物各1μl，5mol/L甜菜碱5μl，DMSO2.5μl，5U/μl聚合酶混合物1μl，50ng/μl基因组DNA2μl，水30.5μl。
一种检测PAH基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法，包括以下步骤：
（1）应用人基因组DNA作为模板，使用权利要求1的引物组，在适于扩增目的核酸的条件下，采用LR-PCR技术对PAH基因进行扩增，其中每一对引物由正向引物和反向引物构成。
（2）对扩增的9个长片段产物，进行纯化回收；
（3）将纯化的9个PCR产物进行混合，并进行定量，得到1个人基因组DNA样品的PCR产物文库；
（4）对得到PCR产物文库进行DNA片段化处理；其中所述DNA片段化方法包括化学打断方法和物理打断方法，其中所述化学方法包括转座酶法和传统酶切方法，所述物理方法包括超声打断方法或机械打断方法，将打断的PCR产物文库应用接头标签技术构建1个测序文库，对不同的基因组DNA样品可以通过添加不同的文库接头Barcode Adapter来区分各自的测序文库，也可对PCR产物文库不进行片段化处理，直接建单一SMRTBell文库；
（5）将得到的多个测序文库进行混合，根据文库测序类型不同，选用不同的测序平台进行测序，包括Illumina双端测序、Ion Torrent半导体测序和PacBio SMRT长读长测序等，获得PCR产物文库的测序数据；
（6）基于标签Barcode序列区分不同的基因组DNA样品，通过生物信息学分析将单个样品测序获得的DNA序列片段比对到参考PAH基因上，进行SNVs和Indels提取，并进行结构性变异的分析，排除多态性变异获得该DNA样品的PAH基因突变信息。
优选的，应用人基因组DNA作为模板，选取PAH基因并设计9对PCR引物，采用LR-PCR技术对PAH基因进行扩增，扩增的区域包括PAH基因全部外显子和全部内含子序列，及部分外显子1上游外侧序列和外显子13下游外侧序列，外显子1上游外侧序列位于基因5’端，外显子13下游外侧序列位于基因3’端，另外每个扩增片段与相邻扩增片段均有重叠区，可用于片段拼接和单体型构建，并可用于检测出大的结构变异，主要指基因缺失突变和基因重复突变；
对扩增的9个长片段产物，进行纯化回收，将纯化的9个PCR产物进行混合，并进行定量，得到1个受检DNA样品的PCR产物文库，对应1个受检基因组DNA样品；
对得到的PCR产物文库构建测序文库，包括Illumina双端测序文库、Ion Torrent半导体测序文库和SMRTBell文库，在对应的测序平台上进行测序，获得测序数据后，进行生物信息学分析，获得PAH基因全长变异信息。
本发明的技术效果和优点：本发明利用PAH基因的序列信息特异性设计出9对PCR引物，扩增片段长度在11846bp至12890bp之间，9个扩增片段的平均长度12481bp，均为超过11kb的长片段，普通的PCR反应体系和条件很难成功，而在本发明的优化PCR反应体系和条件下，采用9个PCR反应可以扩增获得PAH基因全部外显子序列和所有内含子序列，与其它目标区域捕获技术相比（如芯片捕获技术和Ampliseq技术），该方法能实现PAH基因全覆盖，所检测的序列长度达88171bp，有助于内含子内变异和结构变异的检测，可提高致病突变的检出率，而且操作更为简单，成本低，另外每个扩增片段与相邻片段均有重叠区，可用于片段拼接和单体型构建。
本发明首次实现了PAH基因长链PCR扩增和Illumina双端测序结合使用，并且首次将PAH基因全长测序应用于苯丙氨酸羟化酶缺乏症基因检测研究中，本发明通过设计了一组简化的引物，基于LR-PCR技术实现了PAH基因全序列的靶向扩增，扩增的PCR产物直接转座酶法一步完成DNA片段化、末端修复和接头连接反应步骤，与芯片捕获技术相比显著降低了起始DNA的需求量，大大简化了实验操作，缩短了测序文库构建时间，为苯丙氨酸羟化酶缺乏症基因检测提供了新的技术方法。
附图说明
图1为基因长链PCR（LR-PCR）的扩增结果示意图。
图2为测序文库的Agilent 2200 TapeStation System分析结果的示意图。
图3为PAH基因Illumina MiSeq测序的覆盖深度和覆盖率图。
图4为Illumina MiSeq测序结果中两个PAH致病突变的IGV视图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明涉及一种检测PAH基因突变方法，所述方法利用PAH基因的序列信息设计9对PCR引物，应用长链PCR（long-range PCR,LR-PCR）技术靶向扩增整个PAH基因，覆盖总长度为88171bp的基因组序列，即染色体12基因组位置103227356至103315526之间的序列（参考基因组为GRCh37/hg19），该区域包含PAH基因全部外显子序列（总长度为4122bp）和全部内含子序列（总长度76597bp），另外每个扩增片段与相邻片段均有重叠区，可用于片段拼接和单体型构建，扩增产物片段化后建库，应用Illumina基因测序仪或Ion Torrent 半导体测序仪进行高通量测序，或者扩增产物纯化、混合后直接建单一SMRTBell文库，应用PacBioRSII测序仪进行测序，测序数据经过生物信息学分析获得PAH基因突变信息。
本发明提供了一种用于特异性PCR扩增PAH基因的引物组，优选的PCR引物如表1所示，该PCR引物组共9对，相邻扩增片段相互重叠区域约3kb左右，该组9对引物分别如下：用于扩增PAH基因外显子1上游外侧序列（位于基因5’端）到内含子2的引物，正向引物如SEQID NO:1所示，反向引物如SEQ ID NO:2所示；用于扩增PAH基因内含子2上游（5’端）到内含子2下游（3’端）的引物，正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:4所示；用于扩增PAH基因内含子2到内含子3的引物，正向引物如SEQ ID NO:5所示，反向引物如SEQ IDNO:6所示；用于扩增PAH基因内含子3上游（内含子5’端）到内含子3下游（内含子3’端）的引物，正向引物如SEQ ID NO:7所示，反向引物如SEQ ID NO:8所示；用于扩增PAH基因内含子3到内含子4的引物，正向引物如SEQ ID NO:9所示，反向引物如SEQ ID NO:10所示；用于扩增PAH基因内含子4到内含子5的引物，正向引物如SEQ ID NO:11所示，反向引物如SEQ ID NO:12所示；用于扩增PAH基因内含子5到内含子7的引物，正向引物如SEQ ID NO:13所示，反向引物如SEQ ID NO:14所示；用于扩增PAH基因内含子5到内含子11的引物，正向引物如SEQID NO:15所示，反向引物如SEQ ID NO:16所示；用于扩增PAH基因内含子9到外显子13下游外侧序列（位于基因3’端）的引物，正向引物如SEQ ID NO:17所示，反向引物如SEQ ID NO:18所示，引物SEQ ID NO:1和引物SEQ ID NO:2扩增片段1长度为12594bp，引物SEQ ID NO:3和引物SEQ ID NO:4扩增片段2长度为12764bp，引物SEQ ID NO:5和引物SEQ ID NO:6扩增片段3长度为12067bp，引物SEQ ID NO:7和引物SEQ ID NO:8扩增片段4长度为12890bp，引物SEQ ID NO:9和引物SEQ ID NO:10扩增片段5长度为11846bp，引物SEQ ID NO:11和引物SEQ ID NO:12扩增片段6长度为12027bp，引物SEQ ID NO:13和引物SEQ ID NO:14扩增片段7长度为12825bp，引物SEQ ID NO:15和引物SEQ ID NO:16扩增片段8长度为12553bp，引物SEQ ID NO:17和引物SEQ ID NO:18扩增片段9长度为12764bp，9个片段总共扩增88171bp的基因组区域，覆盖PAH基因全部外显子（外显子覆盖率100%）和全部内含子序列（内含子覆盖率100%），及外显子1上游外侧4145bp长度序列和外显子13下游外侧3307bp长度序列。
本发明还提供了一种用于特异性PCR扩增检测PAH基因突变的试剂盒，包含上述的引物组中的一对或多对引物，该试剂盒中还可以包含以下一种或多种试剂：利用所述引物进行长片段PCR反应的试剂；优选其中所述利用所述引物进行长片段PCR反应的试剂DNA聚合酶、缓冲液和dNTP混合物；用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂，上述试剂具体可以是10×GeneAmp High Fidelity PCR缓冲液；10mmol/L dNTP；5mol/L甜菜碱；DMSO；5U/μl聚合酶混合物，在总体积为50µl的PCR反应体系中含有下述组分：10×GeneAmp High Fidelity PCR缓冲液5μl，10mmol/LdNTP2μl，10μmol/L正、反向引物各1μl，5mol/L甜菜碱5μl，DMSO2.5μl，5U/μl聚合酶混合物1μl，50ng/μl基因组DNA2μl，水30.5μl。
本发明的PCR引物组或试剂盒具有检测PAH基因突变的用途，以及在苯丙氨酸羟化酶缺乏症基因检测中的用途。
本发明还提供了一种用于体外检测PAH基因突变的方法，包括以下步骤：（1）应用人基因组DNA作为模板，使用本发明9对引物组成的引物组，在适于扩增目的核酸的条件下，采用LR-PCR技术对PAH基因进行扩增；（2）对扩增的9个长片段产物，进行纯化回收；（3）将纯化的9个PCR产物进行混合，并进行定量，得到1个人基因组DNA样品的PCR产物文库；（4）对得到的PCR产物文库，进行高通量测序文库构建；（5）将得到的多个测序文库进行混合，根据文库类型不同，选用不同的测序平台进行测序；（6）通过生物信息学分析将单个样品测序获得的DNA序列片段比对到参考PAH基因上，进行SNVs和Indels提取，并进行结构变异的分析，排除多态性变异获得该样品PAH基因突变信息。
本发明的检测PAH基因突变的方法，优选包括下述步骤：（1）应用基因组DNA作为模板，选取PAH基因并设计9对PCR引物，采用LR-PCR技术对PAH基因进行扩增，PCR反应体系包含0.5M甜菜碱和5%DMSO，PCR反应条件采用2步法PCR；（2）对扩增的9个长片段产物，进行纯化回收，并进行定量；（3）将纯化的9个PCR产物进行等比例混合，并进行定量，得到1个人基因组DNA样品的PCR产物文库；（4）对于1个PCR产物文库，使用转座酶法一步完成DNA片段化、末端修复和接头连接反应，在打断后片段的两端加上Index1标签序列和Index2标签序列，以构建每个PCR产物文库的上机测序文库；其中Index1标签序列和Index2标签序列所包含的标签不同；不同PCR产物文库使用的标签彼此不同，以区分不同基因组DNA样品；对每个测序文库进行质检和定量；（5）将多个测序文库（标签可区分）等量混合加载在Flow Cell芯片上，在Illumina基因测序仪（Illumina Miseq测序仪，Illumina NextSeq500测序仪或Illumina HiSeq X Ten测序仪）上进行双端边合成边测序；（6）基于标签序列区分不同的基因组DNA样品，通过识别序列结果中的标签序列进行拆分，建立每个基因组DNA样品对应的测序结果数据，通过生物信息学分析将单个样品测序获得的DNA序列片段比对到参考PAH基因上，进行SNVs和Indels提取，并进行结构变异的分析，排除多态性变异获得该样品PAH基因突变信息。
本发明的检测方法中，所述DNA片段化方法包括化学打断方法和物理打断方法，其中所述化学方法包括传统酶切方法和新型转座酶法，所述物理打断方法包括超声打断方法或机械打断方法，所述DNA打断后，获得长度400bp-600bp的片段，所述纯化回收方法包括但不限于磁珠回收，也可以是电泳割胶回收。
本发明的检测方法中，所述测序技术包括但不限于Illumina测序技术，也可以是其它二代测序技术；也可以是三代测序技术，例如PacBio RSII测序仪和PacBio Sequel测序仪；对于不同的测序仪采用不同的建库方法。
实施例1
基因组DNA提取：采集受检者外周血2ml，置于EDTA抗凝管中，取EDTA抗凝外周血标本0.2ml，按全血DNA提取试剂盒说明书提取DNA，DNA浓度用Qubit2.0进行分析，提取的基因组DNA准备做下一步PCR模板用，本次研究共对5个基因DNA样品进行检测，其中1个基因DNA样品存在已知致病突变位点，4个为正常人基因组DNA。
实施例2
LR-PCR扩增：根据PAH基因序列，设计合成9对PAH基因特异性引物，采用GeneAmpHigh Fidelity PCR System进行LR-PCR，共扩增9个大片段序列，分别为1、2、3、4、5、6、7、8和9，引物序列和扩增产物大小如表1所示，采用GeneAmp High Fidelity PCR System，设定反应条件在Veriti 96-well Thermal Cycler PCR仪上进行LR-PCR，PCR反应总体积为50µl，包括10× GeneAmp High Fidelity PCR缓冲液5μl，10mmol/L dNTP 2μl，10 μmol/L正、反向引物各1μl，5mol/L甜菜碱5μl，DMSO 2.5μl，5U/μL聚合酶混合物1μl，50ng/μl基因组DNA2μl，水30.5μl，PCR循环参数：98℃变性1min；98℃10sec，68℃13min，共30个循环，最后72℃延伸15min，PCR反应在Veriti 96-well Thermal Cycler PCR仪上完成。
表1，扩增PAH基因的LR-PCR引物:
注：F为正向引物（上游引物），R为反向引物（下游引物），表中的PCR引物序列依次为：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18。
LR-PCR完成后，取3µlPCR产物经0.6%的琼脂糖凝胶电泳检测，图1显示了9个扩增片段大小和理论值一致，并且目标条带很清晰，没有非特异性扩增，说明选择的LR-PCR反应体系和条件合适。
实施例3
LR-PCR产物纯化和定量：通过磁珠法纯化LR-PCR产物，采用Qubit 2.0荧光光度计对每个基因组DNA样品的第1~9号纯化后产物进行DNA浓度定量，5个基因组DNA样品总共45个LR-PCR扩增产物的浓度检测结果如下：
DNA浓度检测（Qubit 2.0）
由于9个扩增片段的长度大小基本一致，将同一基因组DNA样品所对应的9个PCR产物按等质量进行混合，并采用Agencourt AMPure XP磁珠（美国Beckman Coulter公司）进行浓缩富集，用Qubit 2.0荧光光度计进行定量。
实施例4
文库构建：文库构建采用TruePrepTM DNA Library Prep Kit V2（中国Vazyme公司）进行制备，具体操作步骤如下：
1、转座酶法的DNA片段化、末端修复和接头连接反应：
1）将于室温解冻5×TTBL溶液，上下颠倒混匀后备用；
2）于灭菌PCR管中依次加入下列试剂：
| 试剂 | 体积 | 终浓度/量 |
| 纯化后的混合PCR产物 | 3μl(10ng/µl) | 30ng |
| 5×TTBL | 10µl | 1× |
| TTE Mix V50 | 5µl | - |
| ddH2O | 32µl | - |
| 总体积 | 50µl |
3）将混合液轻轻吹打20次充分混匀；
4）快速离心机离心；
5）将PCR管置于Veriti 96-well Thermal Cycler PCR仪（美国ABI公司）上，设置如下反应程序：
| 热盖 | 105℃ |
| 55℃ | 10 Min |
| 10℃ | Hold |
2、片段化产物使用Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化：
1）将50μl片段化产物转移至新的1.5mL低吸附离心管中，涡旋震荡混匀AgencourtAMPure XP磁珠并吸取50μl移至于1.5mL低吸附离心管中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育5分钟；
2）将低吸附离心管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清（约5分钟）小心移除上清；
3）保持离心管始终处于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，置于室温下孵育30秒后小心移除上清；
4）重复步骤3，总计漂洗两次；
5）保持离心管始终处于磁力架中，开盖空气干燥10分钟；
6）将离心管从磁力架中取出，加入26μl灭菌超纯水洗脱，使用移液器轻轻吹打充分混匀，将离心管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清（约5分钟）小心吸取24μl上清液至的PCR管中。
3、PCR富集及连接标签序列;
1）将上述灭菌PCR管置于冰浴中，依次添加各反应组分：
| 试剂 | 体积 | 终浓度 |
| 上一步骤的产物 | 24µl | - |
| 5×TAB | 10µl | 1× |
| PPM | 5µl | - |
| N503*（标签引物） | 5µl | - |
| N705*（标签引物） | 5µl | - |
| TAE | 1µl | - |
| 总体积 | 50µl |
*TruePrepTM Index Kit V2 for Illumina (Vazyme #TD202)中提供8种N5XX和12种N7XX，可根据样品数量和Index选择策略自行选择；
2）使用移液器轻轻吹打充分混匀，将PCR管置于PCR仪中进行如下反应：
4、扩增产物长度分选和纯化;
1）涡旋震荡混匀Agencourt AMPure XP磁珠并吸取35µl体积至上述50µlPCR产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育5分钟；
2）将反应管短暂离心并置于96孔磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清（约5分钟）小心转移上清至新的1.5ml低吸附离心管中，丢弃磁珠；
3）涡旋震荡混匀Agencourt AMPure XP磁珠并吸取7.5µl体积至上述离心管中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育5分钟；
4）将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清（约5分钟）小心移除上清；
5）保持离心管始终处于磁力架中，加入200µl新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒后小心移除上清；
6）重复步骤5，总计漂洗两次；
7）保持离心管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠10分钟；
8）将离心管从磁力架中取出，加入22µl灭菌超纯水洗脱，使用移液器轻轻吹打充分混匀，将离心管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清（约5分钟）小心吸取20µl上清至新的灭菌离心管中，于-20℃保存。
5、测序文库质量检测;
1）Qubit 2.0检测DNA浓度；
2）运用Agilent 2200 TapeStation System对测序文库进行定性和定量分析，图2为测序文库分析结果的示意图，显示片段大小分布范围，主峰位置为484bp。
实施例5
Illumina MiSeq测序仪上机测序：按照Illumina MiSeq测序仪的标准操作程序进行2x300PE、Index等相关参数的设置后，仪器自动进行测序Flow Cell芯片上的DNA簇生成、边合成边测序，具体测序文库加载到Flow Cell芯片上，文库两端的接头序列与Flow Cell芯片基底上的寡核苷酸序列互补，固定的每条片段都经过桥式PCR扩增形成一个簇，测序时采用可逆性的末端边合成边测序反应，即在碱基延伸过程中，每个循环反应只能延伸一个正确互补的碱基，根据不同的荧光信号确认碱基种类，经过几百次循环后，读取核酸序列。
实施例6
结果分析：测序结果是一系列DNA读序（reads），采用MiSeq Reporter (MSR)软件通过识别序列结果中的标签序列，建立各标签对应基因组DNA样品测序结果的数据，同时过滤去除接头序列和低质量数据，通过BWA(Burrows-Wheeler Aligner)将测序读序比对到参照序列上，采用GATK进行SNVs和Indels提取，并进行结构变异分析，排除多态性变异后获得该样品PAH基因突变信息，对获得的BAM文件应用Integrative Genomics Viewer（IGV)软件进行比对读序的可视化分析，图3为PAH基因Illumina MiSeq测序的覆盖深度和覆盖率示意图，PAH基因88kb的检测范围中大部分区域测序深度可达1000×以上，最低测序深度96×，所有外显子和所有内含子的覆盖率为100%，说明该方法可以实现PAH基因的全覆盖测序，图4为两个PAH致病突变的IGV视图，显示PAH基因c.1223G>A突变和c.116_118delTCT突变，判断该基因组DNA样品的PAH基因型为c.1223G>A/c.116_118delTCT，该检测结果采用Sanger测序验证，结果一致。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京市妇幼保健院
<120> 一种检测PAH基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ggtattacct ggactgtggg accatgttga a 31
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ctcggctgtg acagtcgctc agaca 25
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ggtttcctca gccagattcc ttccgagta 29
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gagagcacag caaatccaag aaccgagaat g 31
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
attcctggta acttctctgc ctggtgtctt c 31
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
cttgaacctg ctgtcagact cgcctct 27
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
aaagtacaga gagttcccag gtctttcatc cc 32
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
cttcccgcct tgtcacctac actcctc 27
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
aggagataag acacttgcca gttacacaac ga 32
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
cccttctctc ttccttcaca tccagcaatc a 31
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
gcctccctaa agccttcctc ctgtctc 27
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
gcagcactat tcacgatagc acagacatgg 30
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
gattaactaa ctgatgtgcc gaaggtcatg tagc 34
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
cagtgctgct cttctgttag tctggaggt 29
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
ctgctaacct aacctgcgtt ctgctgtg 28
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
atgttccatg cctgtcatcc atcactgata aga 33
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
tagccacatt gcctgtcctg gaagttga 28
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
gggatcacca gagcagtctc ctgaaagatg 30
Claims (5)
1.一种检测PAH基因突变的扩增引物组，其特征在于，所述扩增引物组共9对引物，分别如下：
用于扩增PAH基因外显子1上游外侧序列到内含子2的引物，其正向引物如SEQ ID NO:1所示，反向引物如SEQ ID NO:2所示；
用于扩增PAH基因内含子2上游到内含子2下游的引物，其正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:4所示；
用于扩增PAH基因内含子2到内含子3的引物，其正向引物如SEQ ID NO:5所示，反向引物如SEQ ID NO:6所示；
用于扩增PAH基因内含子3上游到内含子3下游的引物，其正向引物如SEQ ID NO:7所示，反向引物如SEQ ID NO:8所示；
用于扩增PAH基因内含子3到内含子4的引物，其正向引物如SEQ ID NO:9所示，反向引物如SEQ ID NO:10所示；
用于扩增PAH基因内含子4到内含子5的引物，其正向引物如SEQ ID NO:11所示，反向引物如SEQ ID NO:12所示；
用于扩增PAH基因内含子5到内含子7的引物，其正向引物如SEQ ID NO:13所示，反向引物如SEQ ID NO:14所示；
用于扩增PAH基因内含子5到内含子11的引物，其正向引物如SEQ ID NO:15所示，反向引物如SEQ ID NO:16所示；
用于扩增PAH基因内含子9到外显子13下游外侧序列的引物，其正向引物如SEQ ID NO:17所示，反向引物如SEQ ID NO:18所示。
2.一种检测PAH基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1所述的扩增引物组，还包括利用所述的扩增引物组进行长链PCR反应的试剂，用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂；所述长链PCR反应的试剂包括利用所述的扩增引物组进行长片段 PCR反应的DNA聚合酶、缓冲液和dNTP混合物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含10×高保真 PCR缓冲液、10mmol/L dNTP、5mol/L 甜菜碱、DMSO和5U/μL 聚合酶混合物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：在总体积为50µL的PCR反应体系中含有下述组分： 10×高保真 PCR缓冲液 5μL，10mmol/L的dNTP 2μL，10μmol/L的正、反向引物各1μL，5mol/L的甜菜碱5μL，DMSO 2.5μL，5U/μL的聚合酶混合物1μL，50ng/μL的基因组 DNA 2μL，水30.5μL。
5.一种检测PAH基因突变的非疾病诊断目的的检测方法，包括以下步骤：
（1）应用人基因组DNA作为模板，使用权利要求1的扩增引物组，在适于扩增目的核酸的条件下，采用长链PCR技术对PAH基因进行扩增，其中每一对引物由正向引物和反向引物构成；
（2）对扩增的9个长片段产物，进行纯化回收；
（3）将纯化的9个PCR产物进行混合，并进行定量，得到1个人基因组DNA样品的PCR产物文库；
（4）对得到PCR产物文库进行DNA片段化处理：其中所述DNA片段化的方法包括化学打断方法和物理打断方法，其中所述化学打断方法包括转座酶法或限制性内切酶法，所述物理打断方法包括机械打断方法，将打断的PCR产物文库应用接头标签技术构建1个测序文库，对不同的基因组DNA样品通过添加不同的文库接头Barcode Adapter来区分各自的测序文库；
或者对PCR产物文库不进行片段化处理，直接建单一SMRTBell文库；
（5）将得到的多个测序文库进行混合，根据文库测序类型不同，选用不同的测序平台进行测序：所述测序平台包括Illumina双端测序、Ion Torrent半导体测序和PacBio SMRT长读长测序，获得PCR产物文库的测序数据；
（6）基于标签Barcode序列区分不同的基因组DNA样品，通过生物信息学分析将单个样品测序获得的DNA序列片段比对到参考PAH基因上，进行SNVs和Indels提取，并进行结构性变异的分析，排除多态性变异获得该DNA样品的PAH基因突变信息。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810154162.9A CN108060227B (zh) | 2018-02-22 | 2018-02-22 | 一种检测pah基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810154162.9A CN108060227B (zh) | 2018-02-22 | 2018-02-22 | 一种检测pah基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108060227A CN108060227A (zh) | 2018-05-22 |
| CN108060227B true CN108060227B (zh) | 2022-03-08 |
Family
ID=62134532
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810154162.9A Active CN108060227B (zh) | 2018-02-22 | 2018-02-22 | 一种检测pah基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108060227B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111378653A (zh) * | 2018-12-29 | 2020-07-07 | 北京希望组生物科技有限公司 | Sca基因突变检测的引物、试剂盒及方法 |
| CN111286533B (zh) * | 2019-06-27 | 2023-04-28 | 北京嘉宝仁和医疗科技股份有限公司 | Pah基因多重pcr引物及其应用 |
| CN111524552B (zh) * | 2020-04-24 | 2021-05-11 | 深圳市儒翰基因科技有限公司 | 简化基因组测序文库构建分析方法、检测设备及存储介质 |
| CN113186265A (zh) * | 2021-02-19 | 2021-07-30 | 苏州大学附属第二医院 | 一种用于检测CYP2D6基因多态性变异的Long-range PCR方法及试剂盒 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104232761A (zh) * | 2014-08-27 | 2014-12-24 | 武汉凯吉盈科技有限公司 | 基因全片段快速测序方法 |
| CN104789664A (zh) * | 2015-04-02 | 2015-07-22 | 安诺优达基因科技(北京)有限公司 | 用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组、方法及试剂盒 |
| CN104975081A (zh) * | 2015-06-01 | 2015-10-14 | 南京市妇幼保健院 | 检测pkd1基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法 |
| CN105886605A (zh) * | 2015-03-05 | 2016-08-24 | 南京市妇幼保健院 | Pkd2基因突变检测的扩增引物及检测方法 |
| CN106544431A (zh) * | 2016-10-28 | 2017-03-29 | 林巍 | 高苯丙氨酸血症相关基因外显子突变的测序文库构建方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20160281166A1 (en) * | 2015-03-23 | 2016-09-29 | Parabase Genomics, Inc. | Methods and systems for screening diseases in subjects |
-
2018
- 2018-02-22 CN CN201810154162.9A patent/CN108060227B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104232761A (zh) * | 2014-08-27 | 2014-12-24 | 武汉凯吉盈科技有限公司 | 基因全片段快速测序方法 |
| CN105886605A (zh) * | 2015-03-05 | 2016-08-24 | 南京市妇幼保健院 | Pkd2基因突变检测的扩增引物及检测方法 |
| CN104789664A (zh) * | 2015-04-02 | 2015-07-22 | 安诺优达基因科技(北京)有限公司 | 用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组、方法及试剂盒 |
| CN104975081A (zh) * | 2015-06-01 | 2015-10-14 | 南京市妇幼保健院 | 检测pkd1基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法 |
| CN106544431A (zh) * | 2016-10-28 | 2017-03-29 | 林巍 | 高苯丙氨酸血症相关基因外显子突变的测序文库构建方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Identification of exonic deletions in the PAH gene causing phenylketonuria by MLPA analysis;Lourdes R.Desviat等;《Clinica Chimica Acta》;20060512;第373卷(第1-2期);第164页摘要，第165页左栏第3段 * |
| Large heterozygous deletion masquerading as homozygous missense mutation: a pitfall in diagnostic mutation analysis;J Zschocke等;《Case Reports》;19990822;第22卷(第6期);第687页摘要 * |
| Long-range PCR in next-generation sequencing: comparison of six enzymes and evaluation on the MiSeq sequencer;Haiying Jia等;《Comparative Study》;20140718;第4卷;第1-6页 * |
| Mutation analysis of PAH gene and characterization of a recurrent deletion mutation in Korean patients with phenylketonuria;Yong Wha Lee等;《Exp Mol Med.》;20091031;第40卷(第5期);第533页右栏第1-2段，第535页表1，第536页左栏第2段，第537页右栏第2段，图3 * |
| Reflex: intramolecular barcoding of long-range PCR products for sequencing multiple pooled DNAs;James A. Casbon等;《Nucleic Acids Res. 》;20130410;第41卷(第10期);第2-3页方法部分 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108060227A (zh) | 2018-05-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yin et al. | Challenges in the application of NGS in the clinical laboratory | |
| US12139760B2 (en) | Methods for determining fraction of fetal nucleic acids in maternal samples | |
| CN103534591B (zh) | 通过测序分析进行的非侵入性胎儿遗传筛选 | |
| DK2513339T3 (en) | PROCEDURE FOR DETERMINING FRACTION OF Fetal NUCLEIC ACID IN MATERNAL SAMPLES | |
| JP7379418B2 (ja) | 腫瘍のディープシークエンシングプロファイリング | |
| CN106591441B (zh) | 基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测探针、方法、芯片及应用 | |
| CN108060227B (zh) | 一种检测pah基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法 | |
| WO2016049878A1 (zh) | 一种基于snp分型的亲子鉴定方法及应用 | |
| KR20200007035A (ko) | 자간전증에 특이적인 순환 rna 시그니처 | |
| US20150065358A1 (en) | Method for verifying bioassay samples | |
| CN113278611A (zh) | 捕获测序探针及其用途 | |
| CN106995851B (zh) | 扩增pkd1外显子超长片段的pcr引物、检测pkd1基因突变的试剂盒及应用 | |
| AU2023356065A1 (en) | Non-invasive methods of assessing transplant rejection in pregnant transplant recipients | |
| WO1999061659A1 (en) | A novel str marker system for dna fingerprinting | |
| AU2023356080A1 (en) | Methods for determination and monitoring of xenotransplant rejection by measuring nucleic acids or proteins derived from the xenotransplant | |
| CN106906220B (zh) | 一种突变的col4a5基因及其应用 | |
| CN113604540B (zh) | 一种利用血液循环肿瘤dna快速构建rrbs测序文库的方法 | |
| Valencia et al. | Next generation sequencing technologies in medical genetics | |
| JP6959312B2 (ja) | 主要組織適合遺伝子複合体一塩基多型 | |
| CN116463408A (zh) | 一种abo基因扩增引物、扩增体系、扩增方法、测序文库构建方法及测序方法 | |
| CN117248030A (zh) | 一种基于单细胞全基因组扩增的pkd1变异分子检测方法和应用 | |
| CN116376918A (zh) | Scn5a突变基因、引物、试剂盒、检测方法及用途 | |
| CN115851905A (zh) | 检测耳聋相关基因108个多态性位点突变的引物组及方法 | |
| US20210115435A1 (en) | Error-proof nucleic acid library construction method | |
| CN113234822A (zh) | 一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |