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CN108187064B - 一种类弹性蛋白-抗EGFR纳米抗体-iRGD的双靶向融合蛋白阿霉素偶联体的制法和用途 - Google Patents

一种类弹性蛋白-抗EGFR纳米抗体-iRGD的双靶向融合蛋白阿霉素偶联体的制法和用途 Download PDF

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CN108187064B CN201711215533.1A CN201711215533A CN108187064B CN 108187064 B CN108187064 B CN 108187064B CN 201711215533 A CN201711215533 A CN 201711215533A CN 108187064 B CN108187064 B CN 108187064B
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Abstract

本发明公开了一种基于类弹性蛋白的双靶向融合蛋白，即类弹性蛋白‑抗EGFR纳米抗体‑iRGD的双靶向融合蛋白，是基于基因重组技术构建含ELP、抗EGFR纳米抗体、iRGD基因的重组质粒，并在大肠杆菌中表达纯化的双靶向融合蛋白。它可以偶联药物阿霉素，形成ELP‑抗EGFR‑iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体。ELP‑抗EGFR‑iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体的水合粒径在5nm左右，主要以分子状态存在，显示了良好的阿霉素缓释功能和对肿瘤细胞的靶向功能。本发明公开了ELP‑抗EGFR‑iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体的制法。

Description

一种类弹性蛋白-抗EGFR纳米抗体-iRGD的双靶向融合蛋白阿 霉素偶联体的制法和用途
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及用于肿瘤治疗的酸敏感的双靶向抗体药物偶联体的制备。
背景技术
近年来，我国患癌人数呈现不断增加的趋势，癌症的多样化，恶性化以及难治愈性都对治疗技术的发展提出了很高的要求。目前最有效的肿瘤治疗方法仍然是化疗，但化疗药物一般是小分子药物，在体内循环时间较短。要想获得良好的治疗效果，常常需要多次化疗，伴随着较大的毒副作用。因此化疗对患者的伤害性比较大。其中，阿霉素(DOX)是一种广谱的抗肿瘤药物。它具有强烈的细胞毒性作用，作用机理主要是通过嵌入DNA而限制核酸的合成。它的分子量只有543.52Da，能被肾脏迅速的代谢，在体内循环时间很短，因而在肿瘤的富集量就比较低。要想达到良好的肿瘤治疗效果就必须加大注射剂量，而加大剂量就伴随着毒副作用的增加。阿霉素分子中含有酮键和氨基，都可以被用来进一步修饰。将阿霉素负载在纳米载体上，通过纳米载体的增强渗透滞留(EPR)效应来增加阿霉素在肿瘤的富集量，降低阿霉素对其他器官的毒副作用是一种常用的方法，但纳米载体容易被肝摄取，造成比较大的肝毒性。
随着科学技术的进步和医疗手段的不断发展，免疫疗法也取得了很大的进步。但是免疫疗法的适应性比较差，不如化疗药物多数具备广谱性。同时，免疫药物的制备比较繁琐，成本比较高，所以价格也比较高。不能适用于大多数人群。随着基因工程和免疫研究的发展，研究人员发现大部分的恶性肿瘤都会过表达表皮生长因子受体(EGFR)。EGFR是一种酪氨酸蛋白激酶受体，分子量在170kDa左右。现在已上市的EGFR抗体有西妥昔单抗、帕尼单抗等。虽然单克隆抗体对抗原的结合能力比较强，在肿瘤治疗方面也取得了一定的成功。但是其具大的尺寸限制了抗体在肿瘤中的渗透和获得更佳的治疗效果。同时复杂的制备过程和后期的人源化改造步骤繁琐，成本较高。纳米抗体也就是单域抗体，是目前为止自然存在的最小的抗原结合片段。纳米抗体又称为单域抗体是骆驼源的重链可变区，尺寸较小，在纳米级，分子量大约在15kDa左右，渗透性较完整抗体好。纳米抗体不含Fc段，也就减少了免疫反应，不需要后期的人源化改造步骤。同时纳米抗体可以很容易的通过基因重组技术在大肠杆菌中进行大量表达，进一步降低成本。肿瘤细胞因为其生长迅速，营养物质需求过大常会导致一些细胞表面的受体的过表达，比如整合素、铸铁蛋白受体等。抗体以及靶向细胞表面受体的活性蛋白分子都是用于肿瘤靶向治疗的良好选择。
本发明中，我们制备的双靶向融合蛋白药物偶联体是将不同特异性的蛋白融合在一起，再与化疗药物偶联的方法，其优势包括⑴改善小分子化疗药物的水溶性和稳定性，提高体内循环时间；⑵降低脱靶行为的发生；⑶将药物更多的输送到肿瘤部位，提高药物在肿瘤的富集量；⑷降低化疗药物的毒副作用，提高药物的注射剂量，提高抗肿瘤治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于类弹性蛋白的对EGFR和整合素双靶向的融合蛋白，其中靶向基团分别采用抗EGFR的纳米抗体和iRGD短肽。
本发明所述的类弹性蛋白，是由48个VPGXG五肽构成的重复序列，其中X为K：V：F＝1：2：1(V、P、G、K、F均是氨基酸的缩写)。
本发明的另一目的在于提供一种基于类弹性蛋白含抗EGFR纳米抗体和iRGD的双靶向融合蛋白与阿霉素的偶联体及其制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种类弹性蛋白—抗EGFR-iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体，是通过分子生物学手段和基因重组技术构建质粒并在大肠杆菌中表达得到的，通过点击化学将药物阿霉素偶联形成ELP-抗EGFR-iRGD-DOX双靶向融合蛋白阿霉素偶联体，其具有如下结构：
Figure BDA0001485466620000031
一种制备上述类弹性蛋白—抗EGFR-iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体的方法，它包括如下步骤：
步骤1、类弹性蛋白基因的构建：
采用递归定向连接的方法将基因合成的类弹性蛋白的单体基因连接在一起构建目标大小的基因序列，将含类弹性蛋白单体基因的pUC19质粒分别用BglI酶切和PflM、BglI双酶切，分别用PCR纯化试剂盒进行纯化，用T4连接酶将单双酶切产物按3:7的比例在16℃下连接过夜，取全部连接液热击到TOP10感受态中，涂布X-gal氨苄平板，过夜培养，进行蓝白筛选，挑取阳性克隆的白色菌落于5mL摇管中37℃，210rpm培养12h，使用质粒提取试剂盒提取质粒，进行核酸电泳验证和DNA测序验证，重复上述单双酶切步骤，直到得到理想的序列长度，即具有12个重复单体基因的序列；
将基因合成的含类弹性蛋白基因的质粒用BglI和PflM双酶切，酶切体系为20μL：BglI酶1μL、PflM酶2μL、酶切缓冲液5μL和质粒43μL；酶切体系保持37℃下三小时，然后将反应体系进行琼脂糖凝胶电泳，割胶纯化得到双酶切的类弹性蛋白基因片段；
步骤2、含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒的构建
利用合成的含Hind III和EcoR I酶切位点的引物对P1和P2对含抗EGFR-iRGD基因的pET-28a质粒进行PCR反应，扩增得到抗EGFR-iRGD基因；PCR体系为50μL，其中：ddH2O 22μL、模板1μL、引物P1 1μL、引物P2 1μL和Extaq酶25μL，)PCR反应条件是:95℃5min、(95℃30s；55℃30s；72℃1min)*30个循环和72℃5min，4℃保持，将反应完的混合物用PCR纯化试剂盒进行纯化，得到抗EGFR-iRGD基因片段，将得到的抗EGFR-iRGD基因和空白pET-25b的质粒分别用Hind III和EcoR I酶进行双酶切，然后用PCR纯化试剂盒分别纯化，接着在T4连接酶的作用下在16℃下过夜连接，即得到含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒；
步骤3、类弹性蛋白抗EGFR-iRGD重组基因的构建和扩增
首先将含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒进行SfiI单酶切，使用PCR纯化试剂盒进行纯化；接着将5μL BglI和PflM双酶切的类弹性蛋白基因与5μL SfiI单酶切的含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒在T4连接酶的作用下于16℃过夜连接；将10μL的连接液全部与TOP10感受态细胞共混进行热击转化，涂布于氨苄抗性的TB平板上，过夜生长；挑取阳性克隆单菌落于5mL氨苄抗性的TB摇管中，37℃，210rpm培养12h；使用质粒提取试剂盒进行质粒抽提，即得到含类弹性蛋白抗EGFR-iRGD重组基因的pET-25b质粒；
步骤4、类弹性蛋白抗EGFR-iRGD融合蛋白的表达
将含类弹性蛋白抗EGFR-iRGD融合蛋白基因的质粒通过热击的方法转入表达菌株BL21中，涂布于氨苄抗性的TB平板上，37℃过夜培养后挑取阳性克隆转入5mL摇管中37℃，210rpm继续培养8-12小时，按1％的接种量将摇管中培养过夜的菌液接种到200mL摇瓶中，添加氨苄抗生素的条件下培养至OD600＝0.6，加入终浓度是1mM的IPTG，37℃，210rpm诱导表达4h，8000g，4℃离心收菌；
步骤5、类弹性蛋白抗EGFR-iRGD融合蛋白的纯化
将步骤4得到的沉菌重悬在10mL结合缓冲液(500mM氯化钠，20mM PBS,pH＝7.4，5mM咪唑)，在冰水浴中进行超声破碎，超声条件为400W，工作2s间歇5s，共超声30min；超声裂解物于4℃，12000g离心，去沉淀，取上清过0.22μm的滤膜两次，上AKTA Purifier900FPLC系统使用5mL His Trap柱纯化；洗脱缓冲液为500mM氯化钠，20mM PBS(pH＝7.4),800mM咪唑，洗脱条件是0-30％洗脱缓冲液，20个柱体积，线性洗脱，检测波长是紫外280nm，收集目的蛋白，透析除去咪唑等小分子，并置换于反应缓冲中；
步骤6、2-羧乙基2’-吡啶基二硫化物的制备
3.75g 2,2’-联吡啶二硫化物溶于10mL乙醇中，加入0.4mL的乙酸，剧烈搅拌使其溶解，将0.9g的3-巯基丙酸溶解在5mL乙醇中，缓慢滴加入上述溶液中，室温反应20h，旋蒸除去溶剂，粗产物溶解在少量二氯甲烷/乙醇的混合溶剂中，通过氧化铝柱子进行纯化，以含4％乙酸的二氯甲烷乙醇混合溶剂为洗脱剂进行产物洗脱；
步骤7、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼的制备
将100mg 2-羧乙基-2’-吡啶基二硫化物溶于20mL无水二氯甲烷中，加入50mg二环己基碳二亚胺和60mg N-羟基琥珀酰亚胺，冰水浴反应30min，将80mg肼基甲酸叔丁酯溶于5mL无水二氯甲烷中，加入到上述反应液中，撤去冰水浴，室温反应过夜，待反应完成后，旋干溶剂，得到3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼的粗产物，过硅胶柱进行纯化，洗脱剂为1％甲醇-二氯甲烷(v/v)；
步骤8、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼阿霉素的制备
将50mg盐酸阿霉素溶于20mL无水甲醇中，加入20mg的3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼和少量的三氟乙酸，室温避光搅拌，反应过夜，反应完成后，将溶剂旋干，重溶于少量甲醇，在乙腈中沉淀，离心收集沉淀，真空烘箱干燥，即得产物3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼阿霉素；
步骤9、类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体的制备
将步骤5制备得到的类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD融合蛋白置换到pH＝6.5的反应缓冲液中，取100mg NHS-PEG-MAL加入10mL融合蛋白水溶液中，4℃反应8h，通过凝胶色谱柱分离反应混合物，得到PEG修饰的类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD，再将上述产物置换至pH＝7.2的缓冲中，加入5mg步骤8得到的阿霉素衍生物和100μmol的TCEP，4℃反应过夜，超滤浓缩，使用凝胶渗透色谱分离纯化，得到产物类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体。
上述的制备方法，步骤6所述的二氯甲烷/乙醇混合溶剂是二氯甲烷:乙醇＝3:2(v/v)的混合溶剂。
上述的类弹性蛋白—抗EGFR-iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的类弹性蛋白—抗EGFR-iRGD双靶向融合蛋白的制备方法简单，可在分子水平上改善融合蛋白的水溶性和精确控制分子量。
本发明制备的类弹性蛋白—抗EGFR-iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体，有良好的水溶性和稳定性，同时在能在酸性环境中敏感，释放药物阿霉素。
附图说明
图1是类弹性蛋白的双靶向融合蛋白药物偶联体ELP-抗EGFR-iRGD-DOX的合成示意图。
图2是类弹性蛋白的双靶向融合蛋白ELP-抗EGFR-iRGD的SDS-PAGE图。
图3是类弹性蛋白的双靶向融合蛋白药物偶联体ELP-抗EGFR-iRGD-DOX的DLS结果。
图4是类弹性蛋白的双靶向融合蛋白药物偶联体ELP-抗EGFR-iRGD-DOX的体外释放曲线图。
图5是类弹性蛋白的双靶向融合蛋白药物偶联体ELP-抗EGFR-iRGD-DOX的体外细胞毒性测试结果。
图6是类弹性蛋白的双靶向融合蛋白药物偶联体ELP-抗EGFR-iRGD-DOX的体外细胞摄取实验结果。
图7是类弹性蛋白的重复单体基因序列。
图8是类弹性蛋白的基因序列。
图9是类弹性蛋白基因的构建示意图。
图10抗EGFR-iRGD的基因序列。
图11是含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒的示意图。
图12是类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD的基因序列。
图13是含类弹性蛋白双靶向融合蛋白基因的pET-25b质粒的示意图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但是这些实例并不限制本发明的保护范围。
实施例1：类弹性蛋白基因的构建
采用递归定向连接的方法将基因合成的类弹性蛋白的单体基因连接在一起构建目标大小的基因序列。将含类弹性蛋白单体基因的pUC19质粒分别用BglI酶切和PflM I、BglI双酶切，分别用PCR纯化试剂盒进行纯化。用T4连接酶将单双酶切产物按3:7的比例在16℃下连接过夜。取全部连接液热击到TOP10感受态中，涂布X-gal氨苄平板，过夜培养，进行蓝白筛选，挑取阳性克隆的白色菌落于5mL摇管中37℃，210rpm培养12h，使用质粒提取试剂盒提质粒，进行核酸电泳验证和DNA测序验证。重复上述单双酶切步骤，直到得到理想的序列长度，即具有12个重复单体基因的序列，重复单体基因的序列见图7。
将含类弹性蛋白基因的pUC19质粒用Bgl I和PflM I双酶切。酶切体系为50μL：BglI酶1μL、PflM I酶1μL、酶切缓冲液5μL、质粒43μL。酶切体系保持37℃下三小时，然后将反应体系进行琼脂糖凝胶电泳，割胶使用试剂盒纯化得到双酶切的类弹性蛋白基因片段，基因序列见图8。
双酶切的类弹性蛋白片段通过琼脂糖凝胶核酸电泳进行验证，与标准DNA Maker进行对比，条带出现在750bp左右。
类弹性蛋白基因的构建示意图见图9。
实施例2：含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒的构建
利用合成的含Hind III和EcoR I酶切位点的引物对P1和P2对含抗EGFR-iRGD基因的pET-28a质粒进行PCR反应，扩增得到抗EGFR-iRGD基因。PCR体系为50μL(ddH2O 22μL、模板1μL、P1 1μL、P2 1μL、Extaq酶25μL)。PCR反应条件是:95℃5min，(95℃30s；55℃30s；72℃1min)*30个循环；72℃5min；4℃保持。将反应完的混合物用PCR纯化试剂盒进行纯化，得到抗EGFR-iRGD基因片段。将得到的抗EGFR-iRGD基因和空白pET-25b的质粒分别用Hind III和EcoR I酶进行双酶切。然后用PCR纯化试剂盒分别纯化，接着在T4连接酶的作用下在16℃下过夜连接，即得到含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒。
通过PCR反应得到抗EGFR-iRGD基因片段采用琼脂糖凝胶核酸电泳进行验证，条带大小在750bp左右，含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒通过氨苄抗性的平板进行筛选阳性克隆和扩增，序列首先经过双酶切验证，最终通过DNA测序验证，抗EGFR-iRGD的基因序列见图10。
含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒的示意图见图11。
实施例3：类弹性蛋白抗EGFR-iRGD重组基因的构建和扩增
首先将含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒进行SfiI单酶切，使用PCR纯化试剂盒进行纯化。接着将5μL Bgl I和PflM I双酶切的类弹性蛋白基因与5μL Sfi I单酶切的含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒在T4连接酶的作用下于16℃过夜连接。将10μL的连接液全部与TOP10感受态细胞共混进行热击转化，涂布于氨苄抗性的TB平板上，过夜生长。挑取阳性克隆单菌落于5mL氨苄抗性的TB摇管中，37℃，210rpm培养12h。使用质粒提取试剂盒进行质粒抽提，即得到含类弹性蛋白抗EGFR-iRGD重组基因的pET-25b质粒。
含类弹性蛋白抗EGFR-iRGD重组基因的pET-25b质粒的序列首先经过双酶切、琼脂糖核酸电泳验证，最终经DNA测序验证，类弹性蛋白抗EGFR-iRGD的基因序列见图12。
含类弹性蛋白抗EGFR-iRGD重组基因的pET-25b质粒的示意图见图13。
实施例4：类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD融合蛋白的表达
将含类弹性蛋白抗EGFR-iRGD融合蛋白基因的质粒通过热击的方法转入表达菌株BL21中，涂布于氨苄抗性的TB平板上，37℃过夜培养后挑取阳性克隆转入5mL摇管中37℃，210rpm继续培养8-12小时，按1％的接种量将摇管中培养过夜的菌液接种到200mL摇瓶中，添加氨苄抗生素的条件下培养至OD600＝0.6，加入终浓度是1mM的IPTG，37℃，210rpm诱导表达4h，8000g，4℃离心收菌。
实施例5：类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD融合蛋白的纯化
将实施例4中得到的沉菌重悬在10mL结合缓冲液(500mM氯化钠，20mM PBS,pH＝7.4，5mM咪唑)，在冰水浴中进行超声破碎，超声条件为400W，工作2s间歇5s，共超声30min。超声裂解物于4℃，12000g离心，去沉淀，取上清过0.22μm的滤膜两次，上AKTAPurifier900FPLC系统使用5mL His Trap柱纯化。洗脱缓冲液为500mM氯化钠，20mM PBS(pH＝7.4),800mM咪唑，洗脱条件是0-30％洗脱缓冲液，20个柱体积，线性洗脱，检测波长是紫外280nm，收集目的蛋白，透析除去咪唑等小分子，并置换于反应缓冲中。
类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD融合蛋白的纯度和分子量主要通过12％SDS-PAGE进行表征。纯度在95％以上，分子量在40kDa左右。
实施例6：2-羧乙基2’-吡啶基二硫化物的制备
3.75g 2,2’-联吡啶二硫化物溶于10mL乙醇中，加入0.4mL的乙酸，剧烈搅拌使其溶解。将0.9g的3-巯基丙酸溶解在5mL乙醇中，缓慢滴加入上述溶液中，室温反应20h。旋蒸除去溶剂，粗产物溶解在少量的混合溶剂(二氯甲烷：乙醇＝3:2，v/v)中，通过氧化铝柱子进行纯化，产物用洗脱剂为含4％乙酸的二氯甲烷乙醇混合溶剂进行洗脱。
产物2-羧乙基2’-吡啶基二硫化物的结构表征数据如下:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝2.85(t，2H)，3.07(t，2H)，7.23(ddd，1H)，7.75(d，1H)，7.8(td，1H)，8.49(d，1H)。
其结构如下：
Figure BDA0001485466620000081
实施例7：3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼的制备
100mg 2-羧乙基2’-吡啶基二硫化物溶于20mL的无水二氯甲烷中，加入50mg二环己基碳二亚胺和60mg N-羟基琥珀酰亚胺，冰水浴反应30min。80mg肼基甲酸叔丁酯溶于5mL无水二氯甲烷中，加入到上述反应液中，撤去冰水浴，室温反应过夜。待反应完成后，旋干溶剂，得到3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼甲酸叔丁酯粗产物，过硅胶柱进行纯化，洗脱剂为1％甲醇-二氯甲烷(v/v)。50mg 3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼甲酸叔丁酯溶于10mL二氯甲烷，加入10mL三氟乙酸，室温搅拌过夜，旋去溶剂，乙醚沉淀，得到3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼。
产物3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼的结构表征数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝10.98(s,1H，),10.12-10.54(s,2H),8.49-7.14(m,4H),2.80(t,2H),3.06(t,2H)。
其结构如下：
Figure BDA0001485466620000091
实施例8：阿霉素13-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰]腙盐酸盐的制备
将50mg盐酸阿霉素溶于20mL无水甲醇中，加入20mg的3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼和少量的三氟乙酸，室温避光搅拌，反应过夜。反应完成后，将溶剂旋干，重溶于少量甲醇，在乙腈中沉淀。离心收集沉淀，真空烘箱干燥，即得产物。
产物阿霉素13-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰]腙盐酸盐的结构表征数据如下：1HNMR(400MHz,acetone-d6):δ＝1.25(s,3H),1.77(m,1H),2.06(m,1H),2.30(m,1H),2.53(d,1H,),2.89-3.18(m,6H),3.71(m,1H),3.85(m,1H),3.97(m,1H),4.07(s,3H),4.78(s,2H),5.21(m,1H),5.58(t,1H,),7.12(m,1H),7.64(d,1H,),7.75(m,2H),7.90(t,1H,),7.98(d,1H,),8.37(d,IH,),10.50(s,1H),10.52(s,1H),14.19(bs,1H)。
其结构如下：
Figure BDA0001485466620000101
实施例9：类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体的制备
将实施例5制备得到的类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD融合蛋白置换到pH＝6.5的反应缓冲液中。取100mg NHS-PEG-MAL加入10mL融合蛋白水溶液中，4℃反应8h，通过凝胶色谱柱分离反应混合物，得到PEG修饰的类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD。再将上述产物置换至pH＝7.2的缓冲中，加入5mg阿霉素13-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰]腙盐酸盐和100μmol的TCEP，4℃反应过夜。超滤浓缩，使用凝胶渗透色谱分离纯化，得到产物类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体。超滤浓缩后置于冰箱中保存。
实施例10：类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体的紫外吸收光谱测定
取实施例9中制得的3mL类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体置于石英皿中，使用紫外吸收光谱仪测定其紫外吸收光谱，在495nm左右有明显的阿霉素吸收峰，证明阿霉素被成功的偶联到融合蛋白上。
实施例11：类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体的水合粒径的测定
取实施例9中制得的3mL类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体采用动态光散射方法，即DLS测定其水合粒径。如图3所示，类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体的水合粒径为5nm左右，表明类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体基本以分子状态存在，没有任何的聚集。
实施例12：类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体的体外释放情况
取实施例9中制得的类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体，每1mL装入一个透析袋(截留分子量为7kDa)中，然后将透析袋分别浸没在5mL 0.1M pH＝5.3、6.5和7.4的PBS中，在37℃，100rpm的摇床中进行体外释放释放。每隔一定时间取出5mL的缓冲液，同时加入5mL新鲜的缓冲液。使用荧光光谱仪测定每个样品中的阿霉素的浓度，根据阿霉素的标准曲线计算出每个样品中的阿霉素含量，并根据透析袋中的总量算出阿霉素的释放百分比率，结果如图4所示，可以看出类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体在酸性环境中释放较快，具有酸敏感性质，同时随着时间，稳定释放。
实施例13：类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体的体外细胞毒性测试
选取人宫颈癌细胞Hela细胞，取实施例9中制得的类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体按一定的浓度梯度与细胞共培养，采用MTT法测定类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体对Hela细胞的细胞毒性，同时设置裸药阿霉素的对照组。结果如图5所示，类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体对Hela细胞有毒性，且有浓度依赖性，同时毒性比裸药更强一些，这可能主要是因为抗EGFR纳米抗体本身也具有抗EGFR高表达细胞增殖的作用，在与化疗药物联合使用的时候，效果更好。
实施例14：类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体的体外细胞摄取实验
选取EGFR高表达的人宫颈癌细胞Hela细胞为实验细胞株，实验使用六孔板，每孔细胞密度为1*105，提前加入盖玻片。取200μL的类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体与细胞在37℃下，共培养4h。取出盖玻片，PBS冲洗三次，用4％多聚甲醛固定10min，PBS洗三次，用染核试剂进行染核，PBS冲洗三次。至于载玻片上，用激光共聚焦观察。如图6所示，细胞质中有大量的红色荧光，表明大量的类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体能靶向Hela细胞的EGFR从而进入细胞。另一方面，细胞核中也有部分红色荧光，说明部分阿霉素已经释放并且进入细胞核中。
序 列 表
<110> 南京大学
<120> 一种类弹性蛋白-抗EGFR纳米抗体-iRGD的双靶向融合蛋白阿霉素偶联体及其制法和用途
<160> 4
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 60
<210> 2
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 60
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 120
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 180
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 240
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 300
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 360
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 420
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 480
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 540
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 600
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 660
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 720
<210> 3
<211> 486
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
CAGGTAAAGC TGGAGGAGTC TGGGGGAGGA TTGGTGCAGG CTGGGGACTC TCTGAGAGTC 60
TCCTGTGCAG CCTCTGGACG CGACTTCAGT GATTATGTCA TGGGCTGGTT CCGCCAGGCT 120
CCAGGGAAGG AGCGTGAGTT TGTAGCAGCT ATTAGCAGGA ATGGTCTTAC GACTCGCTAT 180
GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ATTTACCATC TCCAGAGACA ATGACAAAAA CATGGTGTAC 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ACCTGAGGAC ACGGCCGTTT ATTACTGTGC AGTAAATTCG 300
GCCGGGACAT ACGTTAGTCC CCGCTCGAGA GAGTATGACT ACTGGGGCCA GGGGACCCAG 360
GTCACCGTCT CCTCAGGATC CGAACAAAAA CTGATCAGCG AAGAAGATCT GAACGGTGGA 420
GGCGGTTCAG GCGGAGGTGG CTCTGGCGGT GGCGGATCGT GCCGTGGTGA CAAAGGTCCG 480
GACTGC 486
<210> 4
<211> 1242
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 60
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 120
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 180
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 240
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 300
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 360
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 420
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 480
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 540
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 600
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 660
GTGGGCGTAC CGGGTAAAGG TGTTCCTGGC GTGGGTGTTC CGGGTTTCGG CGTGCCGGGC 720
TGGCCGGGTG GAGGCGGTTC AGGCGGAGGT GGCTCTCAGG TAAAGCTGGA GGAGTCTGGG 780
GGAGGATTGG TGCAGGCTGG GGACTCTCTG AGAGTCTCCT GTGCAGCCTC TGGACGCGAC 840
TTCAGTGATT ATGTCATGGG CTGGTTCCGC CAGGCTCCAG GGAAGGAGCG TGAGTTTGTA 900
GCAGCTATTA GCAGGAATGG TCTTACGACT CGCTATGCAG ACTCCGTGAA GGGCCGATTT 960
ACCATCTCCA GAGACAATGA CAAAAACATG GTGTACCTGC AAATGAACAG CCTGAAACCT 1020
GAGGACACGG CCGTTTATTA CTGTGCAGTA AATTCGGCCG GGACATACGT TAGTCCCCGC 1080
TCGAGAGAGT ATGACTACTG GGGCCAGGGG ACCCAGGTCA CCGTCTCCTC AGGATCCGAA 1140
CAAAAACTGA TCAGCGAAGA AGATCTGAAC GGTGGAGGCG GTTCAGGCGG AGGTGGCTCT 1200
GGCGGTGGCG GATCGTGCCG TGGTGACAAA GGTCCGGACT GC 1242

Claims (4)

1.一种类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体，其特征是：它是通过分子生物学手段和基因重组技术构建质粒并在大肠杆菌中表达得到的，通过点击化学将药物阿霉素偶联形成ELP-anti-EGFR-iRGD-DOX双靶向融合蛋白阿霉素偶联体，其具有如下结构：
Figure FDA0002963541770000011
所述融合蛋白基因序列如SEQ ID No：4所示。
2.一种制备权利要求1所述类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体的方法，其特征是：包括如下步骤：
步骤1、类弹性蛋白基因的构建：
采用递归定向连接的方法将基因合成的类弹性蛋白的单体基因连接在一起构建目标大小的基因序列，将含类弹性蛋白单体基因的pUC19质粒分别用BglI酶切和PflM、BglI双酶切，分别用PCR纯化试剂盒进行纯化，用T4连接酶将单双酶切产物按3∶7的比例在16℃下连接过夜，取全部连接液热击到TOP10感受态中，涂布X-gal氨苄平板，过夜培养，进行蓝白筛选，挑取阳性克隆的白色菌落于5mL摇管中37℃，210rpm培养12h，使用质粒提取试剂盒提取质粒，进行核酸电泳验证和DNA测序验证，重复上述单双酶切步骤，直到得到理想的序列长度，即具有12个重复单体基因的序列；
将基因合成的含类弹性蛋白基因的质粒用BglI和PflM双酶切，酶切体系为20μL：BglI酶1μL、PflM酶2μL、酶切缓冲液5μL和质粒43μL；酶切体系保持37℃下三小时，然后将反应体系进行琼脂糖凝胶电泳，割胶纯化得到双酶切的类弹性蛋白基因片段；
步骤2、含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒的构建
利用合成的含Hind III和EcoR I酶切位点的引物对P1和P2对含抗EGFR-iRGD基因的pET-28a质粒进行PCR反应，扩增得到抗EGFR-iRGD基因；PCR体系为50μL，其中：ddH2O 22μL、模板1μL、P1 1μL、P2 1μL和Extaq酶25μL，PCR反应条件是：95℃5min、(95℃30s；55℃30s；72℃1min)×30个循环和72℃5min，4℃保持，将反应完的混合物用PCR纯化试剂盒进行纯化，得到抗EGFR-iRGD基因片段，将得到的抗EGFR-iRGD基因和空白pET-25b的质粒分别用HindIII和EcoR I酶进行双酶切，然后用PCR纯化试剂盒分别纯化，接着在T4连接酶的作用下在16℃下过夜连接，即得到含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒；
步骤3、类弹性蛋白抗EGFR-iRGD重组基因的构建和扩增
首先将含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒进行SfiI单酶切，使用PCR纯化试剂盒进行纯化；接着将5μL BglI和PflM双酶切的类弹性蛋白基因与5μL SfiI单酶切的含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒在T4连接酶的作用下于16℃过夜连接；将10μL的连接液全部与TOP10感受态细胞共混进行热击转化，涂布于氨苄抗性的TB平板上，过夜生长；挑取阳性克隆单菌落于5mL氨苄抗性的TB摇管中，37℃，210rpm培养12h；使用质粒提取试剂盒进行质粒抽提，即得到含类弹性蛋白抗EGFR-iRGD重组基因的pET-25b质粒；
步骤4、类弹性蛋白抗EGFR-iRGD融合蛋白的表达
将含类弹性蛋白抗EGFR-iRGD融合蛋白基因的质粒通过热击的方法转入表达菌株BL21中，涂布于氨苄抗性的TB平板上，37℃过夜培养后挑取阳性克隆转入5mL摇管中37℃，210rpm继续培养8-12小时，按1％的接种量将摇管中培养过夜的菌液接种到200mL摇瓶中，添加氨苄抗生素的条件下培养至OD600＝0.6，加入终浓度是1mM的IPTG，37℃，210rpm诱导表达4h，8000g，4℃离心收菌；
步骤5、类弹性蛋白抗EGFR-iRGD融合蛋白的纯化
将步骤4得到的沉菌重悬在10mL结合缓冲液：500mM氯化钠，20mM PBS，pH＝7.4，5mM咪唑，在冰水浴中进行超声破碎，超声条件为400W，工作2s间歇5s，共超声30min；超声裂解物于4℃，12000g离心，去沉淀，取上清过0.22μm的滤膜两次，上AKTA Purifier900FPLC系统使用5mL His Trap柱纯化；洗脱缓冲液为500mM氯化钠，20mM PBS，pH＝7.4，800mM咪唑，洗脱条件是0-30％洗脱缓冲液，20个柱体积，线性洗脱，检测波长是紫外280nm，收集目的蛋白，透析除去咪唑等小分子，并置换于反应缓冲液中；
步骤6、2-羧乙基2’-吡啶基二硫化物的制备
3.75g 2，2’-联吡啶二硫化物溶于10mL乙醇中，加入0.4mL的乙酸，剧烈搅拌使其溶解，得到溶液1，将0.9g的3-巯基丙酸溶解在5mL乙醇中，缓慢滴加入溶液1中，室温反应20h，旋蒸除去溶剂，粗产物溶解在少量二氯甲烷/乙醇的混合溶剂中，通过氧化铝柱子进行纯化，以含4％乙酸的二氯甲烷乙醇混合溶剂为洗脱剂进行产物洗脱；
步骤7、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼的制备
将100mg 2-羧乙基-2’-吡啶基二硫化物溶于20mL无水二氯甲烷中，加入50mg二环己基碳二亚胺和60mg N-羟基琥珀酰亚胺，得到反应液1，冰水浴反应30min，将80mg肼基甲酸叔丁酯溶于5mL无水二氯甲烷中，加入到反应液1中，撤去冰水浴，室温反应过夜，待反应完成后，旋干溶剂，得到3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼的粗产物，过硅胶柱进行纯化，洗脱剂为1％甲醇-二氯甲烷；
步骤8、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼阿霉素的制备
将50mg盐酸阿霉素溶于20mL无水甲醇中，加入20mg的3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼和少量的三氟乙酸，室温避光搅拌，反应过夜，反应完成后，将溶剂旋干，重溶于少量甲醇，在乙腈中沉淀，离心收集沉淀，真空烘箱干燥，即得产物3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼阿霉素；
步骤9、类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体的制备
将步骤5制备得到的类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD融合蛋白置换到pH＝6.5的反应缓冲液中，取100mg NHS-PEG-MAL加入10mL融合蛋白水溶液中，4℃反应8h，通过凝胶色谱柱分离反应混合物，得到PEG修饰的类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD，再将上述产物置换至pH＝7.2的缓冲液中，加入5mg步骤8得到的阿霉素衍生物和100μmol的TCEP，4℃反应过夜，超滤浓缩，使用凝胶渗透色谱分离纯化，得到产物类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD阿霉素偶联体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是：步骤6所述的二氯甲烷/乙醇混合溶剂是二氯甲烷∶乙醇＝3∶2的混合溶剂。
4.根据权利要求1所述的类弹性蛋白-抗EGFR-iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体在制备抗肿瘤药物中的应用。
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