CN108239664B - 一种制备4-羟基-l-苏氨酸的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生化技术领域，公开了一种固定化酶串联法制备4‑羟基‑L‑苏氨酸的工艺。本发明利用L‑苏氨酸致活酶耦合L‑苏氨酸醛缩酶至完全转化，采用Adk和PaP或其融合蛋白酶与廉价的多聚磷酸适时循环再生ATP，反应过程简单、操作方便、产品质量稳定，较好的实现了原料的连续转化以及辅酶ATP的再生，配合稳定的固定化酶，能循环利用多次，从而大大的降低了生产成本。本发明工艺有效的避免了化学合成技术里的多步基团保护、手性拆分等繁琐过程，同时也避免了微生物发酵所带来的代谢物、蛋白等杂质对后期产品纯化的影响，非常适合工业化大规模生产。

Description

一种制备4-羟基-L-苏氨酸的工艺

技术领域

本发明涉及生化技术领域，具体涉及一种制备4-羟基-L-苏氨酸的工艺。

背景技术

4-羟基-L-苏氨酸是一种羟基化的氨基酸，分子式为C₄H₉NO₄，分子量为135。L-苏氨酸是一种必需的氨基酸，主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。而羟基化的苏氨酸在自然界不多，主要存在于假单胞菌(pseudomonas)生物体内。不少文献报道羟基化的氨基酸也可以被广泛用作食品、饲料添加剂，治疗糖尿病的有效成分，以及一些化学工业品的起始原料；因此廉价、批量生产此类化合物为其推广应用打好基础。

4-羟基-L-苏氨酸的合成主要有化学合成法、氧化酶合成法、生物发酵法等，工业上常用的化学合成法利用甘油醛或者D-甘露糖醇经过多步保护、功能化以及手性拆分制备，合成工艺繁琐、最终收率低、环境污染大(化学路线I，II)；少量文献报道利用特定氧化酶直接羟基化L-苏氨酸生成4-羟基-L-苏氨酸，但是该方法由于氧化酶自身结构的不稳定、活性中心铁(Fe^II)循环再生的复杂性以及高产物浓度对酶活性的抑制作用等缺陷而严重的制约其放大应用；个别文献也报道了利用绿脓杆菌(pseudomonas andropogonis)代谢天门冬氨酸生产4-羟基-L-苏氨酸，但是该方法由于产率太低还仅局限于理论研究，而菌种的系统改良优化以达到工业生产的需要必将耗费大量的时间与资源(化学路线III)。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种制备4-羟基-L-苏氨酸的工艺，使得所述工艺利用多酶连续、协同催化以廉价的原料在极短的路线里高收率的转化生成特定产物4-羟基-L-苏氨酸，同时实现原料的连续转化以及辅酶ATP的再生，避免化学合成技术里的多步基团保护、手性拆分等繁琐过程。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种制备4-羟基-L-苏氨酸的工艺，包括：

步骤1、羟基乙醛与甘氨酸在L-苏氨酸醛缩酶的催化下生成4-羟基-L-苏氨酸；

步骤2、步骤1中的4-羟基-L-苏氨酸在ATP、苏氨酸致活酶的催化下生成4-羟基磷酸-L-苏氨酸和ADP；

步骤3、步骤2中的ADP在多聚磷酸、腺苷酸激酶与多聚磷酸-AMP磷酸转移酶的催化下生成ATP，重新进入到步骤2中；步骤2中的4-羟基磷酸-L-苏氨酸与钠盐生成4-羟基磷酸-L-苏氨酸钠，然后在焦磷酸水解酶的催化下生成4-羟基-L-苏氨酸。

针对现有4-羟基-L-苏氨酸制备工艺普遍繁琐复杂和工业化应用效率低下的问题，本发明采用L-苏氨酸醛缩酶、苏氨酸致活酶、腺苷酸激酶与多聚磷酸-AMP磷酸转移酶共同制备4-羟基-L-苏氨酸，并实现了原料的连续转化以及辅酶ATP的再生。

本发明所述工艺的反应路线图见图1，本发明采用L-苏氨酸醛缩酶(EC4.1.2.5,TA)能催化羟基乙醛与甘氨酸缩合生成4-羟基-L-苏氨酸及其非对应异构体；采用苏氨酸致活酶(EC 2.7.1.-,TK)能选择性磷酸化4-羟基-L-苏氨酸至4-羟基磷酸-L-苏氨酸，有效的拖动前一步缩合反应至完全。与此同时，采用腺苷酸激酶(EC 2.7.4.3，Adk)与多聚磷酸-AMP磷酸转移酶(EC 2.7.4.-，Pap)可以在反应体系中高效的利用便宜的多聚磷酸循环再生三磷酸腺苷ATP，这既可以有效的控制反应体系内ATP的用量以及降低高浓度二磷酸腺苷ADP对酶催化剂的抑制作用，从而提高收率、降低成本；最后利用焦磷酸水解酶(EC3.6.1.1，IPH)处理4-羟基磷酸-L-苏氨酸，最终纯化产物4-羟基磷酸-L-苏氨酸。

为了利于反应的进行，在步骤1中，本发明通过加入吡哆醛磷酸盐来更好地实现L-苏氨酸醛缩酶的催化反应，即羟基乙醛与甘氨酸在L-苏氨酸醛缩酶以及吡哆醛磷酸盐的催化下生成4-羟基-L-苏氨酸；吡哆醛磷酸盐优选为吡哆醛磷酸盐钠。

同样基于促进反应更好地进行的考虑，步骤2为：步骤1中4-羟基-L-苏氨酸在ATP、苏氨酸致活酶、Mg²⁺和K⁺的催化下生成4-羟基磷酸-L-苏氨酸和ADP。其中，所述Mg²⁺和K⁺由能够释放游离的Mg²⁺和K⁺的无机盐提供，例如氯化镁、氯化钾、硝酸镁、硝酸钾、硫酸镁、硫酸钾等等。

作为优选，在本发明步骤3中，4-羟基磷酸-L-苏氨酸转变为4-羟基磷酸-L-苏氨酸钠，再经酶解生成4-羟基-L-苏氨酸的过程，可按照如下方式进行：

将步骤2中4-羟基磷酸-L-苏氨酸以钡盐形式沉淀，然后重新溶解于Tris-盐酸缓冲液，加入无机钠盐反应，过滤除去钡盐沉淀，获得4-羟基磷酸-L-苏氨酸钠；4-羟基磷酸-L-苏氨酸钠在焦磷酸水解酶的催化下生成4-羟基-L-苏氨酸。在该步骤中，不仅能够实现反应进程，而且还可以在反应的同时增加对4-羟基磷酸-L-苏氨酸的纯化操作，使整个反应更加高效简便，也便于后续的纯化操作。

其中，所述4-羟基磷酸-L-苏氨酸以钡盐形式沉淀的方式为通过加入草酸钡等可溶性钡盐形成4-羟基磷酸-L-苏氨酸钡沉淀，然后再次添加能够和钡反应形成沉淀的无机钠盐，生成4-羟基磷酸-L-苏氨酸钠。添加能够和钡反应形成沉淀的无机钠盐可根据化学领域中常规的钡盐沉淀，如BaSO₄、BaCO₃、BaSO₃、BaSiO₃、Ba₃(PO4)₂、BaF₂，对应选择Na₂SO₄、Na₃PO₄、Na₂CO₃、Na₂SO₃、Na₂SiO₃、NaF。

在本发明具体实施方式中，本发明对于腺苷酸激酶(EC 2.7.4.3，Adk)与多聚磷酸-AMP磷酸转移酶(EC 2.7.4.-，Pap)采用融合手段，形成ATP再生融合酶Adk-PaP，即通过两个酶的基因组装然后在细胞中表达出一个包含两个酶的融合酶，同时具有Adk和PaP的功能。

在本发明工艺中，所有反应优选采用Tris-盐酸缓冲液为反应溶剂，反应pH值为6.0-8.5。其中，Tris-盐酸缓冲液优选采用25mM、pH7.0-7.5的Tris-盐酸缓冲液。

在本发明工艺中，所述多聚磷酸优选采用25聚、0.1M磷酸的多聚磷酸。

基于固定化酶的技术，本发明还提出了将所述L-苏氨酸醛缩酶、苏氨酸致活酶、腺苷酸激酶与多聚磷酸-AMP磷酸转移酶(包括融合酶Adk-PaP)固定在载体上形成固定化酶进行反应。固定化酶后，本发明所述工艺可以对参与反应的固定化酶进行回收重新利用，再次使用的固定化酶酶活仍保持较高水平。

此外，按照本发明所述工艺进行4-羟基-L-苏氨酸的制备，最终能够达到近80％的高收率，并且在纯化上也较为简便。

由以上技术方案可知，本发明利用L-苏氨酸致活酶耦合L-苏氨酸醛缩酶至完全转化，采用Adk和PaP或其融合蛋白酶与廉价的多聚磷酸适时循环再生ATP，反应过程简单、操作方便、产品质量稳定，较好的实现了原料的连续转化以及辅酶ATP的再生，配合稳定的固定化酶，能循环利用多次，从而大大的降低了生产成本。本发明工艺有效的避免了化学合成技术里的多步基团保护、手性拆分等繁琐过程，同时也避免了微生物发酵所带来的代谢物、蛋白等杂质对后期产品纯化的影响，非常适合工业化大规模生产。

附图说明

图1所示为本发明所述工艺的反应路线图；

图2所示为鉴定4-羟基磷酸-L-苏氨酸的核磁氢谱¹H-NMR；

图3所示为鉴定4-羟基磷酸-L-苏氨酸的核磁磷谱³¹P-NMR；

图4所示为鉴定4-羟基-L-苏氨酸的核磁氢谱¹H-NMR；

图5所示为鉴定4-羟基-L-苏氨酸的核磁碳谱³¹C-NMR。

具体实施方式

本发明公开了一种制备4-羟基-L-苏氨酸的工艺，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的工艺已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的工艺进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明所述工艺的步骤旨在清楚的描述核心的反应路线，并不限制整个反应采用一步法还是多步法进行，例如本发明所述工艺的步骤1和步骤2，以及步骤3的生成ATP部分，可一次性将所有反应原料投入进行。

在具体实施方式中，本发明采用融合酶Adk-PaP来进行反应。所采用的L-苏氨酸醛缩酶、苏氨酸致活酶、腺苷酸激酶、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、焦磷酸水解酶均有其对应的EC编号，具体的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1-5所示，融合酶Adk-PaP的序列为通过连接短肽连接的SEQ ID NO:3-4序列，即SEQ ID NO:3序列+连接短肽+SEQ ID NO:4序列,；在本发明具体实施方式中，所述连接短肽序列如SEQ ID NO:6所示，同时也可使用融合酶领域中常用的其他连接短肽。

本发明所采用的各酶可以根据序列进行人工合成，也可以通过各自的编码基因构建重组质粒进行细胞转化，例如：

以提取的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株(购于通用生物)DNA与钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator ATCC-17699D)染色体(购于ATCC公司)为模板，通过PCR扩增出TA,TK以及IPH基因片段，然后通过相应酶切(如BamhI和XhoI、NdeI和XhoI)连接到pET28a质粒上(购于生物风)，其中ATP再生酶Adk-PaP编码基因直接从通用生物公司购买并亚克隆在pET28a质粒上。四段基因序列进而转入E.coli BL21(DE3)菌株(通用生物)，确认正确的菌落培养到含50uM卡拉霉素的LB培养液中；当细胞增长至对数期后加入0.2mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达4小时，最后然后收集、破碎细胞，高速离心清液在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确认蛋白表达。确认蛋白表达的种子培养基也可以接入到10L培养发酵罐里生长至对数期后用0.5mM IPTG诱导表达6小时，收集湿细胞200g。LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。

醛缩酶(TA)、致活酶(TK)、焦磷酸水解酶(IPH)细胞破碎清液先逐步加入60％饱和的硫酸铵沉淀析出，然后将固体缓慢溶解到25mM pH8.0的Tris缓冲液中，经G25尺寸排阻柱脱盐(购于Sigma)后再利用DEAE Seplite FF(西安蓝晓公司)阴离子交换柱分离得到初纯化TA、TK、IPH酶。

在500ml融合酶Adk-PaP细胞破碎清液里加入100ml0.5M pH 7.0的磷酸钠溶液，然后逐步加入二甲氧基乙烷直到蛋白沉淀完全，获得纯化后的融合酶Adk-PaP。

本发明各酶在进行固定化时，可参照本领域常规的固定化酶制备方式，在本发明具体实施方式中，本发明按照如下方法进行：

1、醛缩酶(TA)、致活酶(TK)、焦磷酸水解酶(IPH)

1000U纯化酶溶解在1L 100mM pH 8.0的磷酸钾溶液中，随后加入60mM苯氧乙酸以及200克LX-1000EP环氧树脂至缓冲液，室温搅拌24小时后过滤出固定化酶，最后用清水以及100mM pH 8.0磷酸缓冲液各洗涤两次后低温干燥待用。固定化醛缩酶(TA)、致活酶(TK)、焦磷酸水解酶(IPH)具有液体酶20-50％的活性。

2、融合酶Adk-PaP

纯化后的融合酶Adk-PaP加入80ml25％戊二醛水溶液，混合溶液在4℃轻微搅拌16小时过滤制得Adk-PaP酶沉淀交联固体CLEAs；为提高交联酶机械强度，500ml四甲氧硅烷甲醇溶液滴入500ml搅拌的CLEAs磷酸溶液直至澄清，室温静止6小时后过滤固定化Adk-PaP酶。该固定化Adk-PaP酶具有液体酶65％的活性。

依照本发明工艺的反应路线，各反应物质的用量可以根据实际情况调整，为了最大效率化，本发明提供了如下各反应物质的摩尔比：

羟基乙醛:甘氨酸:吡哆醛磷酸盐:三磷酸腺苷:多聚磷酸:醛缩酶(TA，可固定化):苏氨酸致活酶(TK，可固定化):ATP循环再生酶(Adk-PaP，可固定化)＝(100000-1000000):(100000-1000000):(5,000-20,000):(10,000-100,000):(100000-1000000):(6-60):(8-80):(10-100)；

4-羟基磷酸-L-苏氨酸钠:焦磷酸水解酶(可固定化)＝(100000-1000000):(5-200)；

其中，所述各酶的酶活优选采用1000-50000U的酶，为了平衡效率和和成本，可进一步优选采用1000-20000U，更进一步采用1000-10000U或1000-5000U；在具体实施方式中，本发明固定化醛缩酶(TA)为2000U，固定化苏氨酸致活酶(TK)为2500U，固定化融合酶Adk-PaP为3000U，固定化焦磷酸水解酶为1000U。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：本发明所述工艺

在5L 25mM pH7.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中先后加入30克羟基乙醛(0.1M),37.5克甘氨酸(0.1M)、670毫克吡哆醛磷酸盐钠(0.5mM)、2.5克三磷酸腺苷ATP(1mM)、51克多聚磷酸(Sigma，25聚，0.1M磷酸)、23.5克氯化镁(50mM)、9.3克氯化钾(25mM)；待pH值调节到7.5后，2000U固定化醛缩酶(TA)、2500U固定化4-羟基-L-苏氨酸致活酶(TK)以及3000U固定化ATP循环再生酶(Adk-PaP)相继加入反应体系开始反应，反应室温搅拌6小时后取溶液用间萘二酚方法定量检测残余羟基乙醛，结果表明反应完全(活性单位U代表每分钟转化1μM底物所需要的酶量)。采用核磁共振对产物进行鉴定，结果见图2和图3，核磁结果显示，目标产物为4-羟基磷酸-L-苏氨酸。

过滤反应液回收利用固定化酶，在滤液中加入127.5克草酸钡(0.5mol)沉淀4-羟基磷酸-L-苏氨酸及其它含磷酸杂质。随后将析出固体溶解在pH1.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液中，加入71克无水硫酸钠(0.5mol)析出不溶性硫酸钡；过滤除去固体，将过滤液pH调到7.0后上样D201阴离子树酯交换柱(晶祥化工)分离，用梯度碳酸氢氨水溶液洗脱得纯化4-羟基磷酸-L-苏氨酸钠。最后G25尺寸排阻柱脱盐得到99克4-羟基磷酸-L-苏氨酸钠白色粉末，收率达84％。固定化酶回收12次后保留60％原始活性。

将50克4-羟基磷酸-L-苏氨酸钠溶解在1L 25mM pH7.0三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液,随后加入1.9克氯化镁、1000U固定化焦磷酸水解酶室温混合搅拌三小时，过滤回收固定化酶，滤液上样D201阴离子树酯交换柱，产物为4-羟基-L-苏氨酸为上样流出液。产品浓缩除盐后得到26克白色泡沫状固体，收率78％，核磁鉴定结果见图4和图5。固定化焦磷酸水解酶回收利用10次活性保留80％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 深圳瑞德林生物技术有限公司

<120> 一种制备4-羟基-L-苏氨酸的工艺

<130> S17P2078

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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355

<210> 2

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<212> PRT

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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Lys Ala Arg Glu Ser Thr Pro His Lys Arg Phe Lys Ile Thr Glu Glu

405 410 415

Asp Trp Arg Asn Arg Asp Lys Trp Asp Asp Tyr Leu Lys Ala Ala Ala

420 425 430

Asp Met Phe Ala His Thr Asp Thr Ser Tyr Ala Pro Trp Tyr Ile Ile

435 440 445

Ser Thr Asn Asp Lys Gln Gln Ala Arg Ile Glu Val Leu Arg Ala Ile

450 455 460

Leu Lys Gln Leu Lys Ala Asp Arg Asp Thr Asp

465 470 475

<210> 5

<211> 176

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ser Leu Leu Asn Val Pro Ala Gly Lys Glu Leu Pro Glu Asp Ile

1 5 10 15

Tyr Val Val Ile Glu Ile Pro Ala Asn Ala Asp Pro Ile Lys Tyr Glu

20 25 30

Ile Asp Lys Asp Thr Gly Ala Leu Phe Val Asp Arg Phe Met Ser Thr

35 40 45

Ala Met Phe Tyr Pro Cys Asn Tyr Gly Tyr Ile Asn His Thr Leu Ser

50 55 60

Leu Asp Gly Asp Pro Val Asp Val Leu Val Pro Thr Pro Tyr Pro Leu

65 70 75 80

Gln Pro Gly Ser Val Ile Arg Cys Arg Pro Val Gly Val Leu Lys Met

85 90 95

Thr Asp Glu Ala Gly Glu Asp Ala Lys Leu Val Ala Val Pro His Thr

100 105 110

Lys Leu Ser Lys Glu Tyr Asp His Ile Lys Asp Val Asn Asp Leu Pro

115 120 125

Glu Leu Leu Lys Ala Gln Ile Ala His Phe Phe Glu His Tyr Lys Asp

130 135 140

Leu Glu Lys Gly Lys Trp Val Lys Val Glu Gly Trp Asp Asn Ala Glu

145 150 155 160

Ala Ala Lys Ala Glu Ile Ile Ala Ser Phe Glu Arg Ala Ala Lys Lys

165 170 175

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser

1 5

Claims (8)

1.一种制备4-羟基-L-苏氨酸的工艺，其特征在于，包括：

步骤1、羟基乙醛与甘氨酸在L-苏氨酸醛缩酶的催化下生成4-羟基-L-苏氨酸；

步骤2、步骤1中的4-羟基-L-苏氨酸在ATP、苏氨酸致活酶的催化下生成4-羟基磷酸-L-苏氨酸和ADP；

步骤3、步骤2中的ADP在多聚磷酸、腺苷酸激酶与多聚磷酸-AMP磷酸转移酶的催化下生成ATP，重新进入到步骤2中；步骤2中的4-羟基磷酸-L-苏氨酸与钠盐生成4-羟基磷酸-L-苏氨酸钠，然后在焦磷酸水解酶的催化下生成4-羟基-L-苏氨酸；

其中，腺苷酸激酶与多聚磷酸-AMP磷酸转移酶以融合酶形式参与反应，所采用的L-苏氨酸醛缩酶、苏氨酸致活酶、腺苷酸激酶、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、焦磷酸水解酶的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1-5所示，融合酶Adk-PaP的序列为通过连接短肽连接的SEQ IDNO:3-4序列。

2.根据权利要求1所述工艺，其特征在于，步骤1为：

羟基乙醛与甘氨酸在L-苏氨酸醛缩酶以及吡哆醛磷酸盐的催化下生成4-羟基-L-苏氨酸。

3.根据权利要求1所述工艺，所述步骤1-3以Tris-盐酸缓冲液为反应溶剂。

4.根据权利要求1所述工艺，所述步骤1-3在pH值6.0-8.5下反应。

5.根据权利要求1所述工艺，其特征在于，步骤2为：

步骤1中4-羟基-L-苏氨酸在ATP、苏氨酸致活酶、Mg²⁺和K⁺的催化下生成4-羟基磷酸-L-苏氨酸和ADP。

6.根据权利要求5所述工艺，其特征在于，所述Mg²⁺和K⁺由无机盐提供。

7.根据权利要求1所述工艺，其特征在于，步骤3为：

步骤2中ADP在多聚磷酸、腺苷酸激酶与多聚磷酸-AMP磷酸转移酶催化下生成ATP，重新进入到步骤2中；

将步骤2中4-羟基磷酸-L-苏氨酸以钡盐形式沉淀，然后重新溶解于Tris-盐酸缓冲液，加入无机钠盐反应，过滤除去钡盐沉淀，获得4-羟基磷酸-L-苏氨酸钠；4-羟基磷酸-L-苏氨酸钠在焦磷酸水解酶的催化下生成4-羟基-L-苏氨酸。

8.根据权利要求1所述工艺，其特征在于，所述L-苏氨酸醛缩酶、苏氨酸致活酶、腺苷酸激酶与多聚磷酸-AMP磷酸转移酶为固定化酶。

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