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CN108251353B - 一种人胚胎体外培养液及培养系统 - Google Patents

一种人胚胎体外培养液及培养系统 Download PDF

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CN108251353B CN201810059073.6A CN201810059073A CN108251353B CN 108251353 B CN108251353 B CN 108251353B CN 201810059073 A CN201810059073 A CN 201810059073A CN 108251353 B CN108251353 B CN 108251353B
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Abstract

本发明提供了一种人胚胎体外培养液及其制备方法，属于人类辅助生殖领域。所述培养液主要包括：硫酸庆大霉素0.01～0.05g/L，酚红0.005～0.01g/L，乙二胺四乙酸二钠0～0.01mM/L，氯化钠90～116mM/L，氯化钾2.5～10.0mM/L，二水氯化钙0～1.8mM/L，磷酸二氢钾0～7.16mM/L，二水硫酸镁0.2～1.51M/L，碳酸氢钠20～25mM/L，丙酮酸钠0.1～7.27mM/L，乳酸钠0～20mM/L，葡萄糖0～3.25mM/L，柠檬酸钠0～1.0mM/L，丙胺酰谷氨酰胺0～1.0mM/L，肌醇0～2.7mM/L，牛磺酸0.05～5mM/L，人血清蛋白5g/L，以及必需氨基酸和非必需氨基酸。

Description

一种人胚胎体外培养液及培养系统
技术领域
本发明属于人类辅助生殖领域，具体涉及一种胚胎细胞体外培养技术，包括一种能支持人类早期胚胎发育至囊胚的培养液及其培养装置的培养系统。
背景技术
人类第一例体外受精(IVF)婴儿诞生于1978年，从此辅助生殖蓬勃发展，相继诞生卵子单精子注射(ICSI)，植入前遗传学诊断(PGD)，卵子或胚胎冻存等技术，极大地促进了辅助生殖业的发展。
胚胎培养液为植入前胚胎提供了发育所需营养，为临床所需特定时期胚胎移植(ET)或进行植入前遗传学诊断(PGD)等操作提供了体外环境，是辅助生殖领域临床或实验研究中不可或缺的试剂。目前国内的培养系统普遍存在以下缺陷：(1)多采用序贯培养液，培养过程需中途换液；(2)国内大部分采购进口试剂，价格高采购周期长；(3)培养全过程胚胎皿底平放，无支撑胚胎生长发育的微环境；为此，必需有一套新的培养系统解决上述问题。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于人胚胎细胞体外培养的一贯式培养液，所述培养液包括以下成分：抑菌成份硫酸庆大霉素0.01～0.05g/L；pH指示剂酚红0.005～0.01g/L；离子螯合剂乙二胺四乙酸二钠(EDTA)0～0.01mM/L；营养成份氯化钠90～116mM/L，氯化钾2.5～10.0mM/L，二水氯化钙0～1.8mM/L，磷酸二氢钾0～7.16mM/L，二水硫酸镁0.2～1.51M/L，碳酸氢钠20～25mM/L，丙酮酸钠0.1～7.27mM/L，乳酸钠0～20mM/L，葡萄糖0～3.25mM/L，柠檬酸钠0～1.0mM/L，丙胺酰谷氨酰胺0～1.0mM/L，肌醇0～2.7mM/L，牛磺酸0.05～5mM/L，人血清蛋白5g/L，必需氨基酸1.43～3.11％(m/m)，非必需氨基酸0.37～0.72％(m/m)。
其中，本发明所述必需氨基酸为选自L-精氨酸，L-胱氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸，L-缬氨酸的一种或几种。
其中，本发明所述的非必需氨基酸为选自L-丙氨酸，L-天冬氨酸，L-天门氨酸，L-谷氨酸，L-甘氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸的一种或几种。
本发明所述的培养液，其配制所用的溶剂为超纯水，其pH值为7.3±0.1，渗透压为257～273mOsm/kg。
本发明的另一个目的是提供一种制备所述人胚胎细胞体外培养液的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)以超纯水为溶剂，分别按比例加入本发明所述的氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、二水氯化钙、二水硫酸镁、乙二胺四乙酸二钠，必需氨基酸和非必需氨基酸、葡萄糖、肌醇、柠檬酸钠、牛磺酸、丙酮酸钠、乳酸钠配成基础液A；
(2)向基础液A中按比例加入本发明所述的硫酸庆大霉素、酚红，最后加入碳酸氢钠，配成基础液B；
(3)上述基础液B放入5％二氧化碳，5％氧气及90％氮气的培养箱内平衡过夜后在超净台内用真空过滤泵经0.2μm过滤膜过滤得到原液；
(4)调节上述原液pH值7.3±0.1，渗透压257～273mOsm/kg，加入人血清白蛋白并混匀，在超净台内分装、封口，包装后得到成品，并4℃保存。
进一步地，本发明所述人胚胎体外培养液的制备方法还包括在配制所述培养液前，将配制所用到的器具高温灭菌并烘干备用的步骤。以及配制全过程在符合行业要求的洁净车间中进行。
本发明的又一个目的是提供一种培养人胚胎细胞的体外培养系统，所述体外培养系统包括本发明所述的人胚胎细胞体外培养液以及放置所述培养液的培养装置。其中所述培养装置优选细胞培养皿。本发明所述的培养装置最优选中国专利号为ZL201621262089.X中所述的培养皿。其中，专利号为ZL201621262089.X的实用新型是本申请人的在先研究成果。其中所述培养皿的底部设有培养区，所述培养区包括第一培养区和第二培养区，所述第一培养区设有第一培养孔，所述第二培养区设有第二培养孔，所述第一培养孔为尖头孔，所述第二培养孔的底部为平底，所述第二培养孔的口部内径大于底部内径。其中，所述第二培养孔是用于第0-1天培养胚胎是否发育正常，第一培养孔是真正培养胚胎的地方，用于第1-5天的培养，采用此技术方案，将胚胎放入培养孔中进行培养，在培养皿中加入本发明所述的培养液进行液滴培养，每个胚胎在培养过程中释放一些生物因子进入培养皿中，彼此作用，起到促进生长的作用。
本发明的有益效果是:1、解决了我国目前辅助生殖中胚胎培养试剂长期依赖进口的难题，并克服了试剂从国外进口时长时间运输造成的影响；2、支持胚胎从受精卵到囊胚阶段的各时期胚胎体外培养，克服了胚胎培养过程中需中途换培养液的问题，减少了操作步骤，进而降低了对胚胎发育的影响，大大提高了胚胎细胞的培养效果。
附图说明
图1是本发明优选培养皿的示意图。
其中，1是培养皿；2是第一培养区；3是第二培养区；4是细胞冲洗凸台；21是第一培养孔；31是第二培养孔。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步对本发明进行说明，不能理解为是对本发明的限制，实施例中使用的材料、试剂，仪器设备如无特殊说明，均可从商业途径得到。
【实施例1】胚胎培养液配方及制备方法：
A、培养液配方：
Figure GDA0002703377000000031
Figure GDA0002703377000000041
B、配制方法：
a、将配制所用到的器具高温灭菌并烘干备用，配制全过程在符合要求的洁净车间中进行；
b、加称量好的超纯水，再分别加入经准确称量的配方表中各组配方的氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、二水氯化钙、二水硫酸镁、乙二胺四乙酸二钠,必需氨基酸和非必需氨基酸、葡萄糖、肌醇、柠檬酸钠、牛磺酸、丙酮酸钠、乳酸钠，启动搅拌器直至固体物质完成溶解，配成基础液A；
c、上述基础液A中分别加入经准确称量的配方表中各组配方的硫酸庆大霉素、酚红，最后加入碳酸氢钠，启动搅拌器直至固体物质完成溶解，配成基础液B；
e、上述基础液B放入5％二氧化碳，5％氧气及90％氮气的培养箱内平衡过夜后在超净台内用真空过滤泵将上述液体经0.2μm过滤膜过滤，得到原液；
f、调节原液pH值7.3±0.1，渗透压257～273mOsm/kg,加入人血清白蛋白并混匀，在超净台内分装封口、包装，包装后得到成品，4℃保存。
【实施例2】胚胎培养液的检测
pH值检测
取适量待测样品用pH计测量三次，取所得三个数据的平均值为结果，在7.3±0.1视为合格。
渗透压检测
渗透压仪校正后，取50μl待测样品到测试管中开始测试，当数值稳定后读出数据，按以上方法测出3个数据，取平均值为结果，在257～273mOsm/kg视为合格。
细菌内毒素检测
根据中华人民共和国药典2015版要求，用鲎试剂凝胶法进行检测，结果≤0.25EU/ml视为合格。
细胞毒性
按GB/T 16886.5的规定进行检测，细胞毒性分数不应超过1分。
致敏检测
按GB/T 16886.10的规定进行检测，应无致敏反应。
无菌试验
根据中华人民共和国药典2015版要要求，运用薄膜过滤法，待测样品经滤膜过滤后直接接种培养基培养14天，每天观察结果，应无菌。
皮肉刺激
按GB/T 16886.10的规定进行检测，应无皮内刺激反应。
热原
根据中华人民共和国药典2015版要求，应无热原反应。
小鼠胚胎体外培养试验
(1)小鼠超数排卵
选取4～6周龄B6D2品系小鼠10IU/只注射PMSG，48h后10IU/只注射hCG，注射完hCG后即与同品系具有交配能力的雄鼠交配。
(2)准备胚胎体外培养皿
取无菌35mm皿，用待测样品做数滴50μl液滴作为测试组培养滴，用含70IU/ml内毒素的M16培养液做数滴50μl液滴作为阳性对照组，用普通M16培养液做数滴50μl液滴作为阴性对照组，表面覆盖培养用矿物油，放5％CO2，5％O2，90％N2，饱和湿度的培养箱中过夜平衡。
(3)受精卵收集
合笼后第二天早上检栓，见栓母鼠选取后处死，取其输卵管放于预热至37℃M2操作液中，将输卵管壶腹部膨大处刺破，收集絮状受精卵团至37℃透明质酸酶滴中消化颗粒细胞，待颗粒细胞完全脱落后将受精卵转移到37℃M2中清洗数次，挑取受精胚胎待用。
(4)胚胎培养
上述胚胎随机平均分三组，每组不少于50枚，一组放于测试组中培养，一组放于阳性对照级培养，一组放于阴性对照组培养，培养皿放于5％CO2，5％O2，90％N2，饱和湿度的培养箱中培养96h。
(5)测试结果
培养96h后记录各组囊胚数
可接受标准：a、阳性对照组囊胚数统计学上显著低于阴性对照组囊胚数
b、阴性对照组囊胚数≥80％
(6)检测结果
Figure GDA0002703377000000061
使用体发明的胚胎培养效率对比：
Figure GDA0002703377000000071
Figure GDA0002703377000000081
Figure GDA0002703377000000091

Claims (8)

1.一种人胚胎细胞体外培养液，所述培养液包括抑菌成份硫酸庆大霉素0.05g/L；pH指示剂酚红0.01g/L；离子螯合剂乙二胺四乙酸二钠0.01mM/L；营养成份氯化钠103.46mM/L，氯化钾5.88mM/L，磷酸二氢钾3.26mM/L，二水氯化钙0.98mM/L，二水硫酸镁0.87M/L，碳酸氢钠22.75mM/L，丙酮酸钠3.34mM/L，乳酸钠5mM/L，葡萄糖0.2mM/L，柠檬酸钠0.48mM/L，丙胺酰谷氨酰胺0.55mM/L，精氨酸0.48mM/L，胱氨酸0.02mM/L，异亮氨酸0.35mM/L，亮氨酸0.4mM/L，赖氨酸0.1mM/L，蛋氨酸0.14mM/L，苯丙氨酸0.1mM/L，苏氨酸0.09mM/L，色氨酸0.25mM/L，酪氨酸0.1mM/L，缬氨酸0.3mM/L，丙氨酸0.07mM/L，天冬氨酸0.03mM/L，谷氨酸0.07mM/L，甘氨酸0.1mM/L，脯氨酸0.07mM/L，丝氨酸0.07mM/L，肌醇1.49mM/L，牛磺酸2.28mM/L，人血清白蛋白5g/L。
2.如权利要求1所述的培养液，其中配制所述培养液所用的溶剂为超纯水。
3.一种制备如权利要求1所述的一种人胚胎细胞体外培养液的方法，包括以下步骤：
(1)以超纯水为溶剂，分别按比例加入所述的氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、二水氯化钙、二水硫酸镁、乙二胺四乙酸二钠，必需氨基酸和非必需氨基酸、葡萄糖、肌醇、柠檬酸钠、牛磺酸、丙酮酸钠、乳酸钠配成基础液A；
(2)向基础液A中按比例加入所述的硫酸庆大霉素、酚红，最后加入碳酸氢钠，配成基础液B；
(3)上述基础液B放入5％二氧化碳，5％氧气及90％氮气的培养箱内平衡过夜后在超净台内用真空过滤泵经0.2μm过滤膜过滤得到原液；
(4)调节上述原液pH值7.3±0.1，渗透压257～273mOsm/kg，加入人血清白蛋白并混匀，在超净台内分装、封口，包装后得到成品，并4℃保存。
4.如权利要求3所述的方法，还包括在配制所述培养液前，将配制所用到的器具高温灭菌并烘干备用的步骤。
5.一种培养人胚胎的体外培养系统，所述体外培养系统包括权利要求1所述的人胚胎体外培养液以及放置所述培养液的培养装置。
6.如权利要求5所述的体外培养系统，其中所述培养装置为培养皿。
7.如权利要求6所述的体外培养系统，其中所述培养皿的底部设有培养区，所述培养区包括第一培养区和第二培养区，所述第一培养区设有第一培养孔，所述第二培养区设有第二培养孔，所述第一培养孔为尖头孔，所述第二培养孔的底部为平底，所述第二培养孔的口部内径大于底部内径。
8.如权利要求7所述的体外培养系统，其中所述第二培养孔是用于第0-1天的胚胎培养，第一培养孔用于第1-5天的胚胎培养。
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