CN108410870B

CN108410870B - 马克斯克鲁维酵母启动子、分泌信号肽及其制备与应用

Info

Publication number: CN108410870B
Application number: CN201810153537.XA
Authority: CN
Inventors: 吕红; 余垚; 周峻岗
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2018-02-22
Filing date: 2018-02-22
Publication date: 2021-11-19
Anticipated expiration: 2038-02-22
Also published as: CN108410870A

Abstract

本发明公开了一种优化的马克斯克鲁维酵母启动子，其至少包括：a)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或b)如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或c)如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。还公开了一种优化的马克斯克鲁维酵母分泌信号肽，其至少包括如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，以及一种优化的组合体，其至少包括如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。本发明还公开了含有上述马克斯克鲁维酵母启动子和/或分泌信号肽的重组表达载体、基因工程菌及其制备方法与应用。本技术方案可显著提升马克斯克鲁维酵母高效重组表达外源蛋白的能力，为推动马克斯克鲁维酵母表达系统在工业蛋白制造领域的应用奠定了基础。

Description

马克斯克鲁维酵母启动子、分泌信号肽及其制备与应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种优化的马克斯克鲁维酵母启动子、分泌信号肽及其组合体、含有该马克斯克鲁维酵母启动子和/或分泌信号肽的重组表达载体、基因工程菌及其制备方法与应用。

背景技术

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus，下文简称KM)是同宗配合的半子囊菌酵母，位于酵母科克鲁维属。KM通常在酸奶，马乳酒，奶酪，牛奶，以及甘蔗叶子中出现。KM是一种被普遍认可的食品级的酵母。它已经通过了FDA的GRAS认证，欧盟的QPS认证，还被中国卫计委批准为新食品原料。由于其安全性高，KM在生产食用、饲用和药用蛋白领域具有得天独厚的优势。但是KM目前缺乏高效的表达元件和配套的表达载体，限制了KM表达系统的发展。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种优化的马克斯克鲁维酵母启动子、分泌信号肽及其组合体、含有该马克斯克鲁维酵母启动子和/或分泌信号肽的重组表达载体、基因工程菌及其制备方法与应用。其具体技术方案如下：

本发明在第一方面提供了一种优化的马克斯克鲁维酵母启动子，其核苷酸序列至少包括：

a)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或

b)如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

c)如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

本发明在第二方面提供了一种优化的马克斯克鲁维酵母分泌信号肽，其核苷酸序列至少包括如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；其氨基酸序列至少包括如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列。

本发明在第三方面提供了一种优化的马克斯克鲁维酵母启动子和分泌信号肽的组合体，其核苷酸序列至少包括如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。

本发明在第四方面提供了一种重组表达载体，其包含本发明在第一方面提供的马克斯克鲁维酵母启动子和/或本发明在第二方面提供的马克斯克鲁维酵母分泌信号肽。

优选地，上述重组表达载体还包含马克斯克鲁维酵母自主复制序列、马克斯克鲁维酵母菊粉酶终止子基因序列和营养缺陷筛选标记基因序列。

更优选地，上述营养缺陷筛选标记基因序列选自URA3基因、HIS3基因和ADE2基因中的一种或几种。

最优选地，上述营养缺陷筛选标记基因序列为URA3基因。

在较优实施例中，上述重组表达载体的核苷酸序列至少包括：

a)、如SEQ ID No.22所示的核苷酸序列；或

b)、如SEQ ID No.23所示的核苷酸序列。

本发明在第五方面提供了一种基因工程菌，其包含本发明在第一方面提供的马克斯克鲁维酵母启动子和/或本发明在第二方面提供的马克斯克鲁维酵母分泌信号肽。

本发明还提供了一种基因工程菌，其包含本发明在第四方面提供的重组表达载体。

优选地，上述基因工程菌的宿主菌为酵母。

更优选地，酵母至少包括马克斯克鲁维酵母属酵母、乳酸克鲁维酵母属酵母或酿酒酵母属酵母。

本发明在第六方面提供了上述马克斯克鲁维酵母启动子的应用，其用于提高外源蛋白的表达。

优选地，外源蛋白为阿魏酸酯酶。

本发明在第七方面提供了上述马克斯克鲁维酵母分泌信号肽的应用，其用于提高重组蛋白从胞内分泌到胞外的效率。

本发明在第八方面提供了上述马克斯克鲁维酵母启动子和分泌信号肽的组合体的应用，其用于提高外源蛋白的表达，同时提高重组蛋白从胞内分泌到胞外的效率。

本发明在第九方面提供了上述马克斯克鲁维酵母启动子的制备方法，马克斯克鲁维酵母启动子通过在马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子基础上进行核苷酸突变或删除而构建，至少包括：

a)、将马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子的核苷酸序列中的-351位胸腺嘧啶脱氧核苷酸突变为腺嘌呤脱氧核苷酸；或

b)、去除马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子-8bp到-115bp之间的106个核苷酸碱基；或

c)、包含步骤a)与步骤b)的组合突变。

在较优实施例中，上述制备方法具体包括以下步骤：

步骤1、以马克斯克鲁维酵母菌FIM-1的基因组为模板，利用核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示的引物INU-F1和核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的引物INU-R1PCR扩增菊粉酶基因；在反应体系中添加Taq酶，对PCR扩增产物进行加A，获得目的片段；回收目的片段，与pMD18-T载体进行连接，得到含有马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子的质粒pMD18-T-INU；

步骤2、以质粒pMD18-T-INU为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的引物INUΔ-F1和核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的引物INUΔ-R1将菊粉酶基因79-1668bp的序列去除，同时在菊粉酶基因的78bp之后和终止密码子之间引入多克隆位点，得到质粒pMD18-T-P_INU-SP-MCS-T_INU；

步骤3、以质粒pMD18-T-P_INU-SP-MCS-T_INU为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的引物INU-F2和核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的引物INU-R2扩增P_INU-SP-MCS-TINU片段；

步骤4、以pUKD载体为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.14所示的引物pUKD-F1和核苷酸序列如SEQ ID No.15所示的引物pUKD-R1将pKS和KD序列之间的EcoRI位点去除，得到质粒pUKDΔE；利用EcoRI对质粒PUKDΔE进行酶切，回收酶切产物；

步骤5、将步骤3中的P_INU-SP-MCS-T_INU片段与步骤4中的酶切产物连接，得到质粒pUKDN132；

步骤6、以质粒pUKDN132为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的引物T(-351)A-F和核苷酸序列如SEQ ID No.17所示的引物T(-351)A-R将菊粉酶基因起始密码子上游351位的胸腺嘧啶脱氧核苷酸突变为腺嘌呤脱氧核苷酸，得到质粒pUKDN132-T(-351)A，包含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或

步骤7、以质粒pUKDN132为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.18所示的引物UTRΔA-F和核苷酸序列如SEQ ID No.19所示的引物UTRΔA-R将菊粉酶基因起始密码子上游8bp到上游115bp之间的序列去除，得到质粒pUKDN132-UTRΔA，包含如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

步骤8、以步骤6中得到的质粒pUKDN132-T(-351)A为模板，利用核苷酸序列如SEQID No.18所示的引物UTRΔA-F和核苷酸序列如SEQ ID No.19所示的引物UTRΔA-R将菊粉酶基因起始密码子上游8bp到上游115bp之间的序列去除，得到质粒pUKDN132-T(-351)A+UTRΔA，包含如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

优选地，上述步骤1中，马克斯克鲁维酵母菌FIM-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10621。

优选地，上述步骤2中，多克隆位点至少包括SmaI、SpeI和NotI的位点。

本发明在第十方面提供了上述马克斯克鲁维酵母分泌信号肽的制备方法，该制备方法至少包括将菊粉酶基因第29位的胞嘧啶脱氧核苷酸突变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸。

在较优实施例中，上述制备方法具体包括以下步骤：以质粒pUKDN132为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.20所示的引物P10L-F和核苷酸序列如SEQ ID No.21所示的引物P10L-R将菊粉酶基因第29位的胞嘧啶脱氧核苷酸突变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸，使菊粉酶信号肽第10位的脯氨酸变为亮氨酸。

优选地，质粒pUKDN132根据本发明在第九方面提供的步骤1-5制备得到。

本发明在第十一方面提供了上述马克斯克鲁维酵母启动子和分泌信号肽的组合体的制备方法，其包括以下步骤：以质粒pUKDN132-T(-351)A为模板，利用核苷酸序列如SEQID No.20所示的引物P10L-F和核苷酸序列如SEQ ID No.21所示的引物P10L-R将菊粉酶基因第29位的胞嘧啶脱氧核苷酸突变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸，使菊粉酶信号肽第10位的脯氨酸变为亮氨酸。

优选地，质粒pUKDN132-T(-351)A根据本发明在第九方面提供的步骤1-6制备得到。

本发明在第十二方面提供了上述重组表达载体的制备方法，其包括以下步骤：

步骤6、以质粒pUKDN132为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的引物T(-351)A-F和核苷酸序列如SEQ ID No.17所示的引物T(-351)A-R将菊粉酶基因起始密码子上游351位的胸腺嘧啶脱氧核苷酸突变为腺嘌呤脱氧核苷酸，得到质粒pUKDN132-T(-351)A，包含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

步骤7、以步骤6中得到的质粒pUKDN132-T(-351)A为模板，利用核苷酸序列如SEQID No.18所示的引物UTRΔA-F和核苷酸序列如SEQ ID No.19所示的引物UTRΔA-R将菊粉酶基因起始密码子上游8bp到上游115bp之间的序列去除，得到质粒pUKDN132-T(-351)A+UTRΔA，核苷酸序列如SEQ ID No.22所示；或

步骤8、以步骤6中得到的质粒pUKDN132-T(-351)A为模板，利用核苷酸序列如SEQID No.20所示的引物P10L-F和核苷酸序列如SEQ ID No.21所示的引物P10L-R将菊粉酶基因第29位的胞嘧啶脱氧核苷酸突变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸，得到质粒pUKDN132-T(-351)A+P10L,核苷酸序列如SEQ ID No.23所示。

本发明提供的技术方案可显著提升马克斯克鲁维酵母高效重组表达外源蛋白的能力，为推动马克斯克鲁维酵母表达系统在工业蛋白制造领域的应用奠定了基础。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。所以凡是不脱离本发明所公开的原理下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1示出了本发明较优实施例中含有菊粉酶基因启动子和信号肽的重组表达载体pUKDN132的示意图；

图2示出了本发明较优实施例中描述的T(-351)A、UTRΔA和P10L突变在菊粉酶基因启动子和信号肽中的位置；

图3示出了本发明较优实施例中描述的T(-351)A、UTRΔA和P10L突变及其组合对于阿魏酸酯酶的分泌表达的影响：在pUKDN132载体上，野生型或突变的菊粉酶启动子和信号肽驱动阿魏酸酯酶的表达；含有野生型载体pUKDN132-EstE的转化子的发酵上清中的阿魏酸酯酶的酶活被定义为1，柱状表示平均值±S.D(n＝4)；

图4示出了本发明较优实施例中描述的T(-351)A、UTRΔA突变对于mRNA水平的影响：pUKDN132-EstE、pUKDN132-T(-351)A-EstE和pUKDN132-UTRΔA-EstE转化子中的EstEmRNA相对于18s rDNA的含量被测定；含有野生型质粒pUKDN132-EstE(WT)的转化子中的EstE mRNA的相对含量被定义为1，柱状表示平均值±S.D(n＝4)。

图5示出了本发明较优实施例中描述的P10L突变对于阿魏酸酯酶分泌表达的影响；含有pUKDN132-EstE-His₆和pUKDN132的转化子在YD培养基中培养；在指定的时间点收集上清和细胞；用Western检测上清和细胞裂解液中EstE-His₆的含量，组蛋白H3被作为内参。

具体实施方式

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

实施例1、含有马克斯克鲁维酵母菊粉酶基因启动子和信号肽的重组表达载体的构建

按照酵母基因组DNA提取试剂盒(Solarbio，D1900)说明书的方法，抽提马克斯克鲁维酵母菌FIM-1的基因组。该马克斯克鲁维酵母菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10621(保藏单位代码：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年3月13日，检测结果：存活，分类命名：马克斯克鲁维酵母Kluyveromycesmarxianus)。

以FIM-1的基因组为模板，利用引物INU-F1(序列如SEQ ID No.7所示)和INU-R1(序列如SEQ ID No.8所示)扩增菊粉酶基因，包括菊粉酶基因启动子(起始于起始密码子上游1136bp)菊粉酶基因(1671bp)和菊粉酶基因终止子(842bp)。PCR的过程参照PhantaSuper Fidelity DNA Polymerase的产品说明进行(Vazyme,货号P505-d1/d2/d3)。PCR完成后，在反应体系添加1μL Taq酶(Takara,R001Q)，72℃反应20min，对PCR产物进行加A。通过琼脂糖电泳分析PCR扩增产物，获得了3649bp的目的片段。按照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工，货号B518131-0050)的说明书操作，对PCR产物进行回收。将PCR产物与pMD18-T载体(Takara,6011)进行连接，连接方法参见产品说明书。获得的质粒被命名为pMD18-T-INU。

按照QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent,200523)说明书的方法，以pMD18-T-INU为模板，利用引物INUΔ-F1(序列如SEQ ID No.9所示)和INUΔ-R1(序列如SEQ ID No.10所示)将菊粉酶基因的79-1668bp的序列去除，同时在菊粉酶基因的78bp之后和终止密码子(TGA)之间引入多克隆位点。该多克隆位点包括了SmaI,SpeI和NotI的位点。获得的质粒被命名为pMD18-T-P_INU-SP-MCS-T_INU。

以pMD18-T-P_INU-SP-MCS-T_INU为模板，利用引物INU-F2(序列如SEQ ID No.11所示)和INU-R2(序列如SEQ ID No.12所示)扩增P_INU-SP-MCS-T_INU片段。该片段含有菊粉酶基因的启动子(从起始密码子上游1136bp开始，到起始密码子上游1bp)(序列如SEQ ID No.13所示)，菊粉酶基因的1-78bp(含有编码信号肽的序列)，多克隆位点和菊粉酶终止子(842bp)。PCR反应采用Phanta Super Fidelity DNA Polymerase。通过琼脂糖电泳分析PCR扩增产物，获得了2150bp的P_INU-SP-MCS-T_INU片段。利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对P_INU-SP-MCS-T_INU片段进行回收。

按照QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit的使用说明，以pUKD载体(Appl Microbiol Biotechnol(2003)62:387–391)为模板，利用引物pUKD-F1(序列如SEQID No.14所示)和pUKD-R1(序列如SEQ ID No.15所示)将pKS序列(大肠杆菌复制序列和氨苄抗性基因)和KD序列(酵母自主复制序列)之间的EcoRI位点去除，获得质粒为pUKDΔE。利用E_coRI对pUKDΔE进行酶切，利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对酶切产物进行回收。

利用Gibson Assembly无痕连接系统(NEB公司，货号E2611S/L)，将PINU-SP-MCS-TINU片段与pUKDΔE的E_coRI酶切产物连接。获得的载体为pUKDN132，如图1所示。

实施例2、对马克斯克鲁维酵母菊粉酶基因启动子和信号肽的优化

按照QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit的使用说明，以pUKDN132为模板，利用引物T(-351)A-F(序列如SEQ ID No.16所示)和引物T(-351)A-R(序列如SEQID No.17所示)在菊粉酶的启动子中引入突变，将起始密码子上游的351位的T突变为A，该突变位于潜在转录因子的结合位点中，如图2所示，获得的载体被命名为pUKDN132-T(-351)A。

按照QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit的使用说明，以pUKDN132为模板，利用引物UTRΔA-F(序列如SEQ ID No.18所示)和引物UTRΔA-R(序列如SEQ IDNo.19所示)将起始密码子上游8bp到上游115bp之间的序列去除，该序列位于菊粉酶基因的5’UTR中，如图2所示，获得的载体被命名为pUKDN132-UTRΔA。

按照QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit的使用说明，以pUKDN132为模板，利用引物P10L-F(序列如SEQ ID No.20所示)和引物P10L-R(序列如SEQ ID No.21所示)将菊粉酶基因的第29位的C改为T，该突变使菊粉酶信号肽的第10位的脯氨酸变为亮氨酸。获得的载体被命名为pUKDN132-P10L。

按照QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit的使用说明，以pUKDN132-T(-351)A为模板，利用引物UTRΔA-F(序列如SEQ ID No.18所示)和引物UTRΔA-R(序列如SEQ ID No.19所示)将起始密码子上游8bp到上游115bp之间的序列去除，该序列位于菊粉酶基因的5’UTR中，如图2所示。获得的载体被命名为pUKDN132-T(-351)A+UTRΔA,该载体序列如SEQ IDNo.22所示。

按照QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit的使用说明，以pUKDN132-T(-351)A为模板，利用引物P10L-F(序列如SEQ ID No.20所示)和引物P10L-R(序列如SEQID No.21所示)将菊粉酶基因的第29位的C改为T，该突变使菊粉酶信号肽的第10位的脯氨酸变为亮氨酸。获得的载体被命名为pUKDN132-T(-351)A+P10L,该载体序列如SEQ IDNo.23所示。

实施例3、利用马克斯克鲁维酵母菊粉酶基因突变的启动子和信号肽实现阿魏酸酯酶的分泌表达

利用SpeI和NotI对实验室保存的pUKDN112-EstE(专利申请号201711086961.9)进行酶切。利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对754bp的酶切产物回收。该片段含有EstE基因的编码序列。

利用SpeI和NotI对pUKDN132,pUKDN132-T(-351)A,pUKDN132-UTRΔA,pUKDN132-P10L,pUKDN132-T(-351)A+UTRΔA和pUKDN132-T(-351)A+P10L分别进行酶切，利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对酶切产物回收。按照DNA ligation Kit Ver.2.1(Takara,6022)说明书操作，将pUKDN132、pUKDN132-T(-351)A、pUKDN132-UTRΔA、pUKDN132-P10L、pUKDN132-T(-351)A+UTRΔA和pUKDN132-T(-351)A+P10L的酶切产物分别与EstE的酶切产物进行连接。获得的质粒命名为pUKDN132-EstE、pUKDN132-T(-351)A-EstE、pUKDN132-UTRΔA-EstE、pUKDN132-P10L-EstE、pUKDN132-T(-351)A+UTRΔA-EstE和pUKDN132-T(-351)A+P10L-EstE。

本发明采用的酵母表达宿主菌株来源于马克斯克鲁维酵母菌Fim-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10621(保藏单位代码：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年3月13日，检测结果：存活，分类命名：马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus)，通过同源重组的方法敲出除URA3基因，并利用含有5-氟乳清酸(1.5g/L)的YPD筛选获得尿嘧啶缺陷的表达宿主菌，被命名为马克斯克鲁维酵母Fim-1ura3Δ。采用醋酸锂转化法(World Journal of Microbiology&Biotechnology 16:653-654,2000)，将pUKDN132-EstE、pUKDN132-T(-351)A-EstE、pUKDN132-UTRΔA-EstE、pUKDN132-P10L-EstE、pUKDN132-T(-351)A+UTRΔA-EstE和pUKDN132-T(-351)A+P10L-EstE分别转入Fim-1ura3Δ中。将转化后的产物涂布于SD平板(0.67％无氨基酸酵母氮源、2％葡萄糖、2％琼脂)，将平板放置30℃恒温培养箱培养，培养2-4天直至克隆形成。

从每组转化中挑选4个不同的克隆，接种于装有50ml的YD培养基(2％酵母抽提物，4％葡萄糖)中，30℃、220rpm培养72h后收集上清，进行阿魏酸酯酶的酶活测定。测定方法和酶活定义参照专利进行(专利申请号201711086961.9)。pUKDN132-T(-351)A-EstE转化子的上清酶活是野生型质粒pUKDN132-EstE酶活的2.4倍，pUKDN132-UTRΔA-EstE转化子的上清酶活是野生型质粒的2.1倍，pUKDN132-P10L-EstE转化子的上清酶活是野生型质粒的5.1倍。该结果说明本发明的菊粉酶启动子和信号肽的突变可以有效提升菊粉酶启动子和信号肽驱动的分泌表达能力。

组合了T(-351)A和UTRΔA突变的pUKDN132-T(-351)A+UTRΔA-EstE的酶活是野生型质粒的3.5倍，高于单独的T(-351)A和UTRΔA突变体的酶活，表明这两个突变对酶活的提升有叠加效应。组合了T(-351)A和P10L突变的pUKDN132-T(-351)A+P10L-EstE的酶活是野生型质粒的5.9倍，高于单独的T(-351)A和P10L突变体的酶活，表明这两个突变对酶活的提升也有叠加效应。

实施例4、T(-351)A和UTRΔA突变对mRNA水平的影响

从pUKDN132-EstE、pUKDN132-T(-351)A-EstE和pUKDN132-UTRΔA-EstE的转化子中分别挑取4个克隆，接种于3mL SD培养液(0.67％无氨基酸酵母氮源、2％葡萄糖)中,30℃、220rpm培养过夜。将过夜菌稀释接种于50ml的YD培养基中，使起始OD₆₀₀为0.2。30℃、220rpm培养9h后收集细胞。按照ZR Fungal/Bacterial RNA MiniPrep说明书(Zymoresearch公司，R2014)的方法，抽提总RNA。按照PrimeScript RT(Takara公司，RR037A)说明书的方法，将RNA反转录成cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqII(Takara公司，RR820A)说明书的方法，利用LightCycler 480II Real-Time PCR系统(罗氏)进行定量PCR分析。扩增EstE基因的引物为EstE-F(序列如SEQ ID No.24所示)和引物EstE-R(序列如SEQID No.25所示)。扩增内参18s rDNA的引物为18S-F(序列如SEQ ID No.26所示)和引物18S-R(序列如SEQ ID No.27所示)。通过计算EstE mRNA与18s rDNA的比值来计算EstE mRNA的相对含量。将pUKDN132-EstE转化子中EstE mRNA的相对含量定义为1，则pUKDN132-T(-351)A转化子中EstE mRNA的相对含量为2.0，pUKDN132-UTRΔA-EstE的转化子中EstE mRNA的相对含量为22。该结果说明本发明的T(-351)A和UTRΔA突变可以显著提高所驱动的基因的mRNA水平。

实施例5、P10L突变对于蛋白分泌的影响

按照QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit的使用说明，以pUKDN132-EstE和pUKDN132-P10L-EstE为模板，利用引物HIS6-F(序列如SEQ ID No.28所示)和引物HIS6-R(序列如SEQ ID No.29所示)在EstE基因的N端添加编码His₆标签的序列。获得的载体被分别被命名为pUKDN132-EstE-His₆和pUKDN132-P10L-EstE-His₆。

按照实施例3的方法，将pUKDN132-EstE-His₆和pUKDN132-P10L-EstE-His₆转入Fim-1ura3Δ。将pUKDN132-EstE-His₆和pUKDN132-P10L-EstE-His₆转化子接种于3mL SD培养液中,30℃、220rpm培养过夜。将过夜菌稀释接种于50ml的YD培养基中，使起始OD₆₀₀为0.2。30℃、220rpm培养9h、24h、48h和72h后收集细胞和上清。用Western检测上清和细胞裂解液中的EstE-His₆，抗体为anti-His₆(Abmart公司，M30111)。同时检测细胞裂解液中的组蛋白H3作为对照，抗体为anti-H3.1(Abmart公司，P30266)。Western的方法按照“分子克隆实验指南”的说明进行。如图5所示，pUKDN132-P10L-EstE-His₆转化子上清中的EstE-His₆的含量明显多于pUKDN132-EstE-His₆。与此相一致的是，pUKDN132-P10L-EstE-His₆转化子的细胞裂解液中的EstE-His₆的含量明显少于pUKDN132-EstE-His₆。该结果说明P10L突变可以有效促进EstE蛋白的分泌。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 马克斯克鲁维酵母启动子、分泌信号肽及其制备与应用

<130> 2018

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1136

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

cacaaacaca aacacaaaca caaaaacgct aaattatgca cacaagggcc ggcggggctg 60

ccggaaaaaa aaagggaaaa atacacagac gagcgcgcac agatggggtt accactgcaa 120

gttacaagtt gcaagttgca cgctggaatc agaattggaa tcagaattgg aattggaatt 180

agaattagaa ttaaacttgg ggtagccacg ggaacgggat aactcaggaa tcgctcgcag 240

gcgtctccgt ctaggcaatc ccaaggtaag cctaggcact cccacagggg aaagaacggt 300

tgaaggcaaa gtagtgctaa caattggtaa cgaatggtaa caagtgtgtc cgtctccacc 360

tgacatttgc tagagctggg gattccacat tcttgtgctc tgaattctca aaccgaaatg 420

gggcgttgtt accccaggta tccggttgta gttggcactg gggatggaaa aaaatgatgt 480

tgatgttgag ttagttgggt tgagtcaatt agtgcgtgaa agtatcacca cttttgtcat 540

ccggcgtttc tgtgcgaatc acacacacac acacagttta ttggagcact tgtttctggc 600

gtattcgtaa ttgttctgcg gtgcggttct gtgtgcattt ttcctggggt gtctgccgca 660

cctactcatc acccacgccg tgggtttgag ccatggcgga ggtacgactg actggctgcc 720

tgcctgcctg actgactgcc tgactgcagg aaaagagggt ttcgaaggaa aaacttttcc 780

tgtgtaaatc cggccgtgcg ccgctgctcc aaaatccacc ttcatgagaa ggagtttgaa 840

aaaacaaaaa aattcacata taaaaagcgt atctcgagat ctcaaagtct cccttgaatc 900

gtgtttgcca gttgtaactc atcctttatt cttctattct atctctctct ttccttcccc 960

taatcagcaa ttaaatccgg ggtaaggaag aattactact gtgtgtaacg gttatatttc 1020

gttttttatt ttttttttcc attgccatag agaaagaaaa aaaaaaaaaa gagagtttgt 1080

gaagatcttc cattcgaatc ccataagtga cacatttaat tttttttttg ttagat 1136

<210> 2

<211> 1028

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

cacaaacaca aacacaaaca caaaaacgct aaattatgca cacaagggcc ggcggggctg 60

ccggaaaaaa aaagggaaaa atacacagac gagcgcgcac agatggggtt accactgcaa 120

gttacaagtt gcaagttgca cgctggaatc agaattggaa tcagaattgg aattggaatt 180

agaattagaa ttaaacttgg ggtagccacg ggaacgggat aactcaggaa tcgctcgcag 240

gcgtctccgt ctaggcaatc ccaaggtaag cctaggcact cccacagggg aaagaacggt 300

tgaaggcaaa gtagtgctaa caattggtaa cgaatggtaa caagtgtgtc cgtctccacc 360

tgacatttgc tagagctggg gattccacat tcttgtgctc tgaattctca aaccgaaatg 420

gggcgttgtt accccaggta tccggttgta gttggcactg gggatggaaa aaaatgatgt 480

tgatgttgag ttagttgggt tgagtcaatt agtgcgtgaa agtatcacca cttttgtcat 540

ccggcgtttc tgtgcgaatc acacacacac acacagttta ttggagcact tgtttctggc 600

gtattcgtaa ttgttctgcg gtgcggttct gtgtgcattt ttcctggggt gtctgccgca 660

cctactcatc acccacgccg tgggtttgag ccatggcgga ggtacgactg actggctgcc 720

tgcctgcctg actgactgcc tgactgcagg aaaagagggt ttcgaaggaa aaacttttcc 780

tgtgttaatc cggccgtgcg ccgctgctcc aaaatccacc ttcatgagaa ggagtttgaa 840

aaaacaaaaa aattcacata taaaaagcgt atctcgagat ctcaaagtct cccttgaatc 900

gtgtttgcca gttgtaactc atcctttatt cttctattct atctctctct ttccttcccc 960

taatcagcaa ttaaatccgg ggtaaggaag aattactact gtgtgtaacg gttatatttc 1020

ggttagat 1028

<210> 3

<211> 1028

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cacaaacaca aacacaaaca caaaaacgct aaattatgca cacaagggcc ggcggggctg 60

ccggaaaaaa aaagggaaaa atacacagac gagcgcgcac agatggggtt accactgcaa 120

gttacaagtt gcaagttgca cgctggaatc agaattggaa tcagaattgg aattggaatt 180

agaattagaa ttaaacttgg ggtagccacg ggaacgggat aactcaggaa tcgctcgcag 240

gcgtctccgt ctaggcaatc ccaaggtaag cctaggcact cccacagggg aaagaacggt 300

tgaaggcaaa gtagtgctaa caattggtaa cgaatggtaa caagtgtgtc cgtctccacc 360

tgacatttgc tagagctggg gattccacat tcttgtgctc tgaattctca aaccgaaatg 420

gggcgttgtt accccaggta tccggttgta gttggcactg gggatggaaa aaaatgatgt 480

tgatgttgag ttagttgggt tgagtcaatt agtgcgtgaa agtatcacca cttttgtcat 540

ccggcgtttc tgtgcgaatc acacacacac acacagttta ttggagcact tgtttctggc 600

gtattcgtaa ttgttctgcg gtgcggttct gtgtgcattt ttcctggggt gtctgccgca 660

cctactcatc acccacgccg tgggtttgag ccatggcgga ggtacgactg actggctgcc 720

tgcctgcctg actgactgcc tgactgcagg aaaagagggt ttcgaaggaa aaacttttcc 780

tgtgtaaatc cggccgtgcg ccgctgctcc aaaatccacc ttcatgagaa ggagtttgaa 840

aaaacaaaaa aattcacata taaaaagcgt atctcgagat ctcaaagtct cccttgaatc 900

gtgtttgcca gttgtaactc atcctttatt cttctattct atctctctct ttccttcccc 960

taatcagcaa ttaaatccgg ggtaaggaag aattactact gtgtgtaacg gttatatttc 1020

ggttagat 1028

<210> 4

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atgaagttag catactccct cttgcttcta ttggcaggag tcagtgcttc agtgatcaat 60

tacaagagag acggtgac 78

<210> 5

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 5

Met Lys Leu Ala Tyr Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ala Gly Val Ser Ala

1 5 10 15

Ser Val Ile Asn Tyr Lys Arg Asp Gly Asp

20 25

<210> 6

<211> 1214

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

cacaaacaca aacacaaaca caaaaacgct aaattatgca cacaagggcc ggcggggctg 60

ccggaaaaaa aaagggaaaa atacacagac gagcgcgcac agatggggtt accactgcaa 120

gttacaagtt gcaagttgca cgctggaatc agaattggaa tcagaattgg aattggaatt 180

agaattagaa ttaaacttgg ggtagccacg ggaacgggat aactcaggaa tcgctcgcag 240

gcgtctccgt ctaggcaatc ccaaggtaag cctaggcact cccacagggg aaagaacggt 300

tgaaggcaaa gtagtgctaa caattggtaa cgaatggtaa caagtgtgtc cgtctccacc 360

tgacatttgc tagagctggg gattccacat tcttgtgctc tgaattctca aaccgaaatg 420

gggcgttgtt accccaggta tccggttgta gttggcactg gggatggaaa aaaatgatgt 480

tgatgttgag ttagttgggt tgagtcaatt agtgcgtgaa agtatcacca cttttgtcat 540

ccggcgtttc tgtgcgaatc acacacacac acacagttta ttggagcact tgtttctggc 600

gtattcgtaa ttgttctgcg gtgcggttct gtgtgcattt ttcctggggt gtctgccgca 660

cctactcatc acccacgccg tgggtttgag ccatggcgga ggtacgactg actggctgcc 720

tgcctgcctg actgactgcc tgactgcagg aaaagagggt ttcgaaggaa aaacttttcc 780

tgtgtaaatc cggccgtgcg ccgctgctcc aaaatccacc ttcatgagaa ggagtttgaa 840

aaaacaaaaa aattcacata taaaaagcgt atctcgagat ctcaaagtct cccttgaatc 900

gtgtttgcca gttgtaactc atcctttatt cttctattct atctctctct ttccttcccc 960

taatcagcaa ttaaatccgg ggtaaggaag aattactact gtgtgtaacg gttatatttc 1020

gttttttatt ttttttttcc attgccatag agaaagaaaa aaaaaaaaaa gagagtttgt 1080

gaagatcttc cattcgaatc ccataagtga cacatttaat tttttttttg ttagatatga 1140

agttagcata ctccctcttg cttctattgg caggagtcag tgcttcagtg atcaattaca 1200

agagagacgg tgac 1214

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

cacaaacaca aacacaaaca caaaaacg 28

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

tagaatgttg gtcagatgtg atgtacacc 29

<210> 9

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

ggagtcagtg cttcagtgat caattacaag agagacggtg accccgggac tagtgcggcc 60

gcttaaggcc gcaagctttg atctgatctg cttactttac taacgac 107

<210> 10

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

gtcgttagta aagtaagcag atcagatcaa agcttgcggc cttaagcggc cgcactagtc 60

ccggggtcac cgtctctctt gtaattgatc actgaagcac tgactcc 107

<210> 11

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

tgccgattcg cacgctgcaa ccgcggcaca aacacaaaca caaacacaaa aacgc 55

<210> 12

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

atggtctttc caatcagaat tcgaccgatc ctagaatgtt ggtcagatgt gatg 54

<210> 13

<211> 1136

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

cacaaacaca aacacaaaca caaaaacgct aaattatgca cacaagggcc ggcggggctg 60

ccggaaaaaa aaagggaaaa atacacagac gagcgcgcac agatggggtt accactgcaa 120

gttacaagtt gcaagttgca cgctggaatc agaattggaa tcagaattgg aattggaatt 180

agaattagaa ttaaacttgg ggtagccacg ggaacgggat aactcaggaa tcgctcgcag 240

gcgtctccgt ctaggcaatc ccaaggtaag cctaggcact cccacagggg aaagaacggt 300

tgaaggcaaa gtagtgctaa caattggtaa cgaatggtaa caagtgtgtc cgtctccacc 360

tgacatttgc tagagctggg gattccacat tcttgtgctc tgaattctca aaccgaaatg 420

gggcgttgtt accccaggta tccggttgta gttggcactg gggatggaaa aaaatgatgt 480

tgatgttgag ttagttgggt tgagtcaatt agtgcgtgaa agtatcacca cttttgtcat 540

ccggcgtttc tgtgcgaatc acacacacac acacagttta ttggagcact tgtttctggc 600

gtattcgtaa ttgttctgcg gtgcggttct gtgtgcattt ttcctggggt gtctgccgca 660

cctactcatc acccacgccg tgggtttgag ccatggcgga ggtacgactg actggctgcc 720

tgcctgcctg actgactgcc tgactgcagg aaaagagggt ttcgaaggaa aaacttttcc 780

tgtgttaatc cggccgtgcg ccgctgctcc aaaatccacc ttcatgagaa ggagtttgaa 840

aaaacaaaaa aattcacata taaaaagcgt atctcgagat ctcaaagtct cccttgaatc 900

gtgtttgcca gttgtaactc atcctttatt cttctattct atctctctct ttccttcccc 960

taatcagcaa ttaaatccgg ggtaaggaag aattactact gtgtgtaacg gttatatttc 1020

gttttttatt ttttttttcc attgccatag agaaagaaaa aaaaaaaaaa gagagtttgt 1080

gaagatcttc cattcgaatc ccataagtga cacatttaat tttttttttg ttagat 1136

<210> 14

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtgc caagcttgca tgcatcacta atgaaaagca 60

tacgacgcc 69

<210> 15

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

ggcgtcgtat gcttttcatt agtgatgcat gcaagcttgg cactggccgt cgttttacaa 60

cgtcgtgac 69

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

aaacttttcc tgtgtaaatc cggccgtgcg 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

cgcacggccg gatttacaca ggaaaagttt 30

<210> 18

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

gaattactac tgtgtgtaac ggttatattt cggttagata tgaagttagc atactccctc 60

ttg 63

<210> 19

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

caagagggag tatgctaact tcatatctaa ccgaaatata accgttacac acagtagtaa 60

ttc 63

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

agcatactcc ctcttgcttc tattggcagg agtcagtgct 40

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

agcactgact cctgccaata gaagcaagag ggagtatgct 40

<210> 22

<211> 11280

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

cgtaatcatg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa 60

catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac 120

attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca 180

ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc 240

ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 300

aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 360

aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 420

gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 480

gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 540

tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 600

ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 660

ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 720

tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 780

tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 840

ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 900

aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 960

ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 1020

tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 1080

atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 1140

aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat 1200

ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac 1260

tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg 1320

ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag 1380

tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt 1440

aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt 1500

gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt 1560

tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt 1620

cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct 1680

tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt 1740

ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac 1800

cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa 1860

actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa 1920

ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca 1980

aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct 2040

ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 2100

atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc 2160

tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag 2220

gccctttcgt ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc 2280

ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc 2340

gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt 2400

actgagagtg caccataaaa ttgtaaacgt taatattttg ttaaaattcg cgttaaattt 2460

ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc cttataaatc 2520

aaaagaatag cccgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt 2580

aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact 2640

acgtgaacca tcacccaaat caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg 2700

gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag 2760

aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac 2820

gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg cgtactatgg 2880

ttgctttgac gtatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc 2940

aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct 3000

tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg 3060

ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgccaagct tgcatgcatc 3120

actaatgaaa agcatacgac gcctgcgtct gacatgcact cattctgaag aagattctgg 3180

gcgcgtttcg ttctcgtttt cctctgtata ttgtactctg gtggacaatt tgaacataac 3240

gtctttcacc tcgccattct caataatggg ttccaattct atccaggtag cggttaattg 3300

acggtgctta agccgtatgc tcactctaac gctaccgttg tccaaacaac ggaccccttt 3360

gtgacgggtg taagacccat catgaagtaa aacatctcta acggtatgga aaagagtggt 3420

acggtcaagt ttcctggcac gagtcaattt tccctcttcg tgtagatcag aggctatata 3480

catgccgagg tattcgatca ctctacgatg acggtctgtt agctcaacaa cttcttctaa 3540

atgctccata accgtaacgt aagaagcata actgtcaata ctgaagtcat cccagtttat 3600

tggtgctcct gttgaacagt catccactat atgttcgaat agcccaggat cacgaggagg 3660

tcctacaaac ggatacggta cagtcttctt tttatagtct gcaaattcta gaatagcatt 3720

ttttatccaa tagtgtcgaa tcgtcctggc cgttctaccg ataaaggatc caatgtgatt 3780

attagctcca ctacacgata tgttaagttt gatcgatgtc ttgttaacaa acgctaaact 3840

caagttcggc atttccaaca gcgagaagaa atcatcaatt ccatcggcta tctcttgata 3900

agtcattaga tcatatacct tctcgggatg tcgttgagtt actttatgac tagaaatctt 3960

caggttatca tcaacgtaat tgttctccaa tagctctgga gagggacata acaatacttt 4020

gattttttcc atggcctgga cttgtttccg taggaaatac ttgttctttt gtagacgttc 4080

catgatgagt ttgtatacct ctgctggaga tatccattct agatctttga tataagtttg 4140

gtatggtaaa gagttgattt tgtaggacac gtaaatctgc gctagataag tacattgtgc 4200

aaatgcctct ggtacttcgt aagacccatg ctgcgtaatt atagtattat tgagtggatc 4260

ataagcgttg tactcgtttt tgaatttaaa actgtctaat aaggccctgt aaatctctct 4320

gacttgttgt acacctttct gctcttcggg actgagatcg gatagcaatg gagcagcagt 4380

ttctgagctt tctgatgggg ctgacatggc agatgcctat tcaatgctgc cttttgtttg 4440

ggaggttatg aaatgcatct gtttacattg tatgtaatac ccttactagg caatgttata 4500

agcaaaaatc ctttgatcac atggaatatc actttatacg tgttgaaata tgcaaaaaaa 4560

cagtccccct gagctcaggg ggtggtttac gcttttgagg ctcagcagcg cgaattctct 4620

cttggggctg aagtgaaatt taaaaaagtc gcttgaggct cagccggaat tataaaacat 4680

cacctgagtc ttgagagcgc tttcactcac ctgaggctca gctgaaattt caaaaagtca 4740

cttgagccca gaaggagtgt ttcaccccct gaggctataa cgttcgttat tttaatacct 4800

aaataaacaa aaatatatgg tacaggaacg cgaggcaacg cgccgataca gggtcaatgg 4860

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gtctcccttg aatcgtgttt gccagttgta actcatcctt tattcttcta ttctatctct 8820

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ttccgaactc attttcgcat ctgaaactaa ttctcgaaac ctttaacatc aaacaattga 9420

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<210> 23

<211> 11388

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

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ctcctcgcga gataaaggtt tattagaagg atccttcaaa acatatattt cactgcccaa 5340

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acaaactcta ttttacaatc acgtttattc aaccattcta catccaataa ccaaaatgcc 7740

catgtacctc tcagcgaagt ccaacggtac tgtccaatat tctcattaaa tagtctttca 7800

tctatatatc agaaggtaat tataattaga gatttcgaat cattaccgtg ccgattcgca 7860

cgctgcaacc gcggcacaaa cacaaacaca aacacaaaaa cgctaaatta tgcacacaag 7920

ggccggcggg gctgccggaa aaaaaaaggg aaaaatacac agacgagcgc gcacagatgg 7980

ggttaccact gcaagttaca agttgcaagt tgcacgctgg aatcagaatt ggaatcagaa 8040

ttggaattgg aattagaatt agaattaaac ttggggtagc cacgggaacg ggataactca 8100

ggaatcgctc gcaggcgtct ccgtctaggc aatcccaagg taagcctagg cactcccaca 8160

ggggaaagaa cggttgaagg caaagtagtg ctaacaattg gtaacgaatg gtaacaagtg 8220

tgtccgtctc cacctgacat ttgctagagc tggggattcc acattcttgt gctctgaatt 8280

ctcaaaccga aatggggcgt tgttacccca ggtatccggt tgtagttggc actggggatg 8340

gaaaaaaatg atgttgatgt tgagttagtt gggttgagtc aattagtgcg tgaaagtatc 8400

accacttttg tcatccggcg tttctgtgcg aatcacacac acacacacag tttattggag 8460

cacttgtttc tggcgtattc gtaattgttc tgcggtgcgg ttctgtgtgc atttttcctg 8520

gggtgtctgc cgcacctact catcacccac gccgtgggtt tgagccatgg cggaggtacg 8580

actgactggc tgcctgcctg cctgactgac tgcctgactg caggaaaaga gggtttcgaa 8640

ggaaaaactt ttcctgtgta aatccggccg tgcgccgctg ctccaaaatc caccttcatg 8700

agaaggagtt tgaaaaaaca aaaaaattca catataaaaa gcgtatctcg agatctcaaa 8760

gtctcccttg aatcgtgttt gccagttgta actcatcctt tattcttcta ttctatctct 8820

ctctttcctt cccctaatca gcaattaaat ccggggtaag gaagaattac tactgtgtgt 8880

aacggttata tttcgttttt tatttttttt ttccattgcc atagagaaag aaaaaaaaaa 8940

aaaagagagt ttgtgaagat cttccattcg aatcccataa gtgacacatt taattttttt 9000

tttgttagat atgaagttag catactccct cttgcttcta ttggcaggag tcagtgcttc 9060

agtgatcaat tacaagagag acggtgaccc cgggactagt gcggccgctt aaggccgcaa 9120

gctttgatct gatctgctta ctttactaac gacaaaaaaa aatcaaaaaa aaaaaaacaa 9180

tcagtccttc tcttcttacg atatgatatg attaaatgat gctatgaaat catcttcttc 9240

ttaactttct taaatcttac gcgtcactta ctctatatac ccgtttagct ttgcctggtc 9300

acagcgacat tttatataag tgtacgtatt ttcttttttt ttttaaaaat ttctattcta 9360

accttagaaa agtgcccttt aaaccagctg tcctggcact atatctttat catgtgccgg 9420

tcgctttccc tttccgtttc ccttttcctt tcaattggtg gcctggaatt ccgaactcat 9480

tttcgcatct gaaactaatt ctcgaaacct ttaacatcaa acaattgaaa agatcatcat 9540

caccagaaat aagaaaaaga tcaacacaac agctaataac agtacgaaag aaagatcgct 9600

cgagtgaaaa ggcagccaag aaaggtcatt cgatttgggt ctagactgat tatagacata 9660

ccaattgcac tcagtaagaa aatgagtttc aaatttgacg atgacggtgt ggtaaaagaa 9720

tttcacggca acaccatcat atgccatatt cctcaacaaa ccgaattctt caacaaattg 9780

ttggacttct accgttttgc gaaacgactt tccttctacg acaagatcac cctacttcct 9840

ccttcaagct accacgttac gatcatgaat tgctgccacg aacacgatcg ttctgagggc 9900

cactggccca aaggaatcga tccggacaca agcatgctgc ggtgtacatc acatctgacc 9960

aacattctag gatcggtcga attctgattg gaaagaccat tctgctttac ttttagagca 10020

tcttggtctt ctgagctcat tatacctcaa tcaaaactga aattaggtgc ctgtcacggc 10080

tcttttttta ctgtaccttt gacttccttt cttatttcca aggatgctca tcacaatacg 10140

cttctagatc tattatgcat tataattaat agttgtagct acaaaaggta aaagaaagtc 10200

cggggcaggc aacaatagaa atcggcaaaa aaaactacag aaatactaag agcttcttcc 10260

ccattcagtc atcgcatttc gaaacaagag gggaatggct ctggctaggg aactaaccac 10320

catcgactga ctctatgcac taaccacgtg actacatata tgtgatcgtt tttaacattt 10380

ttcaaaggct gtgtgtctgg ctgtttccat taattttcac tgattaagca gtcatattga 10440

atctgagctc atcaccaaca agaaattcta ccgtaaaagt gtaaaagttc gtttaaatca 10500

tttgtaaact ggaacagcaa gaggaagtat catcagctag ccccataaac taatcaaagg 10560

aggatgtcga ctaagagtta ctcggaaaga gcagctgctc atagaagtcc agttgctgcc 10620

aagcttttaa acttgatgga agagaagaag tcaaacttat gtgcttctct tgatgttcgt 10680

aaaacagcag agttgttaag attagttgag gttttgggtc catatatctg tctattgaag 10740

acacatgtag atatcttgga ggatttcagc tttgagaata ccattgtgcc gttgaagcaa 10800

ttagcagaga aacacaagtt tttgatattt gaagacagga agtttgccga cattgggaac 10860

actgttaaat tacaatacac gtctggtgta taccgtatcg ccgaatggtc tgatatcacc 10920

aatgcacacg gtgtgactgg tgcgggcatt gttgctggtt tgaagcaagg tgccgaggaa 10980

gttacaaaag aacctagagg gttgttaatg cttgccgagt tatcgtccaa ggggtctcta 11040

gcgcacggtg aatacactcg tgggaccgtg gaaattgcca agagtgataa ggactttgtt 11100

attggattta ttgctcaaaa cgatatgggt ggaagagaag agggctacga ttggttgatc 11160

atgacgccag gtgttggtct tgatgacaaa ggtgatgctt tgggacaaca atacagaact 11220

gtggatgaag ttgttgccgg tggatcagac atcattattg ttggtagagg tcttttcgca 11280

aagggaagag atcctgtagt ggaaggtgag agatacagaa aggcgggatg ggacgcttac 11340

ttgaagagag taggcagatc cgcttaagag gggtaccgag ctcgaatt 11388

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

agagcgacgg caagtttgag ga 22

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

cagcaggtga tagtggaatg agtg 24

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

tagttggtgg agtgatttgt ctgc 24

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 27

ctcgctggct ccgtcagtgt ag 22

<210> 28

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 28

atgcttgagc agattgctaa acaccatcat caccaccatt aagcggccgc ttaaggccgc 60

aa 62

<210> 29

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 29

ttgcggcctt aagcggccgc ttaatggtgg tgatgatggt gtttagcaat ctgctcaagc 60

at 62

Claims

1.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含马克斯克鲁维酵母启动子和马克斯克鲁维酵母分泌信号肽；所述重组表达载体还包含马克斯克鲁维酵母自主复制序列、马克斯克鲁维酵母菊粉酶终止子基因序列和营养缺陷筛选标记基因序列；所述重组表达载体的核苷酸序列至少包括：

a)、如SEQ ID No.22所示的核苷酸序列；或

b)、如SEQ ID No.23所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体还包含与所述马克斯克鲁维酵母启动子可操作地连接的目的基因。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述目的基因为阿魏酸酯酶基因。

4.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包含根据权利要求1-3中任何一项所述的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主菌为酵母。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述酵母至少包括马克斯克鲁维酵母属酵母、乳酸克鲁维酵母属酵母或酿酒酵母属酵母。

7.根据权利要求1所述的重组表达载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1、以马克斯克鲁维酵母菌FIM-1的基因组为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的引物INU-F1和核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的引物INU-R1 PCR扩增菊粉酶基因；在反应体系中添加Taq酶，对PCR扩增产物进行加A，获得目的片段；回收所述目的片段，与pMD18-T载体进行连接，得到含有马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子的质粒pMD18-T-INU；所述马克斯克鲁维酵母菌FIM-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10621；

步骤2、以所述质粒pMD18-T-INU为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的引物INUΔ-F1和核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的引物INUΔ-R1将菊粉酶基因79-1668bp的序列去除，同时在菊粉酶基因的78bp之后和终止密码子之间引入多克隆位点，得到质粒pMD18-T-P_INU-SP-MCS-T_INU；

步骤3、以所述质粒pMD18-T-P_INU-SP-MCS-T_INU为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的引物INU-F2和核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的引物INU-R2扩增P_INU-SP-MCS-T_INU片段；

步骤4、以pUKD载体为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.14所示的引物pUKD-F1和核苷酸序列如SEQ ID No.15所示的引物pUKD-R1将pKS和KD序列之间的EcoRI位点去除，得到质粒pUKDΔE；利用EcoRI对所述质粒PUKDΔE进行酶切，回收酶切产物；

步骤5、将步骤3中的所述P_INU-SP-MCS-T_INU片段与步骤4中的所述酶切产物连接，得到质粒pUKDN132；

步骤6、以所述质粒pUKDN132为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的引物T(-351)A-F和核苷酸序列如SEQ ID No.17所示的引物T(-351)A-R将菊粉酶基因起始密码子上游351位的胸腺嘧啶脱氧核苷酸突变为腺嘌呤脱氧核苷酸，得到质粒pUKDN132-T(-351)A，包含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

步骤7、以步骤6中得到的所述质粒pUKDN132-T(-351)A为模板，利用核苷酸序列如SEQID No.18所示的引物UTRΔA-F和核苷酸序列如SEQ ID No.19所示的引物UTRΔA-R将菊粉酶基因起始密码子上游8bp到上游115bp之间的序列去除，得到质粒pUKDN132-T(-351)A+UTRΔA，核苷酸序列如SEQ ID No.22所示；或

步骤8、以步骤6中得到的所述质粒pUKDN132-T(-351)A为模板，利用核苷酸序列如SEQID No.20所示的引物P10L-F和核苷酸序列如SEQ ID No.21所示的引物P10L-R将菊粉酶基因第29位的胞嘧啶脱氧核苷酸突变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸，得到质粒pUKDN132-T(-351)A+P10L,核苷酸序列如SEQ ID No.23所示。