CN108431049A

CN108431049A - Lps提取工艺

Info

Publication number: CN108431049A
Application number: CN201680074765.7A
Authority: CN
Inventors: J.A.柯恩; C.法伦伯格
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2015-12-22
Filing date: 2016-12-21
Publication date: 2018-08-21
Anticipated expiration: 2036-12-21
Also published as: US11186652B2; WO2017109733A3; BR112018012791B1; JP2018538415A; CN108431049B; BR112018012791A2; MX2018007814A; EP3394109A2; US20200102405A1; WO2017109733A2; JP6995045B2; CA3009111A1

Abstract

提供从革兰氏阴性菌细胞提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括在包含盐、水、醇和另外的有机溶剂的LPS提取溶液中从革兰氏阴性菌细胞提取LPS的步骤。也提供提取的LPS的组合物和应用。

Description

LPS提取工艺

发明领域

本发明涉及用于生产单磷酰脂质A(MPL)的脂多糖(LPS)的提取领域。

背景

LPS是革兰氏阴性菌的外膜的外部小叶(external leaflet)的主要的表面分子，并且仅仅存在于所述外部小叶中。LPS阻止通过血清补体和吞噬细胞的细菌的破坏，并且牵涉用于群集(colonization)的粘附。LPS是大小大约为10,000道尔顿的一组结构相关的复杂分子，并且由三个共价连接区域组成(如图1所示)：

(i) 在外部区域的O-特异性多糖链(O-抗原)

(ii) 核心寡糖中心区域

(iii) 脂质A - 充当疏水性锚状物(anchor)的最里面的区域，其包括运载长链脂肪酸的葡糖胺二糖单元。

LPS提取的技术包括Galanos方法，其牵涉用苯酚、氯仿和石油醚的混合物(PCP)提取LPS，然后蒸发氯仿和石油醚，添加丙酮和水以沉淀LPS，并且通过离心或过滤回收LPS(Galanos et al., Eur. J. Biochem. 9: 245 (1969))。Chen方法牵涉用氯仿和甲醇的混合物(CM)提取LPS，然后是一系列的甲醇沉淀步骤以去除磷脂(Chen et al., J. ofInfectious Diseases, 128 (Supplement 1):S43-S51 (1973))。Galanos方法不适合商业生产LPS，因为其不适于大规模生产并且使用引起健康和安全担忧的溶剂混合物(例如，苯酚：氯仿：石油醚)。Chen方法导致富含LPS和磷脂的CM相，其通常需要多个沉淀步骤以获得足够纯度的LPS用于在免疫刺激应用中应用，诸如，例如用作疫苗佐剂。

WO02/078637公开了使用革兰氏阴性菌(特别是明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)R595)的深度粗糙(deep rough)突变体菌株用于生产LPS和3D-MPL的方法，其包括下列步骤：用包含脂肪族醇诸如乙醇的溶液提取细胞，由此生产具有减少的磷脂含量的细胞；和用包含氯仿和甲醇的溶液提取具有减少的磷脂含量的细胞，由此产生在氯仿和甲醇(CM)中的LPS的溶液。取决于用于生产细菌的生长培养基和发酵工艺(补料分批、分批发酵等)，WO02/078637的方法得到每单位干细胞质量2%至12%的收率。需要用于实现更高效力(通过回收的全部可用LPS的百分数测量)的大规模LPS提取的改进方法。

WO2011/144645公开了除了醇和另外的有机溶剂外，在LPS提取步骤中应用水。回收了大体上60%的全部可用LPS。与在LPS提取步骤中缺乏水的等价工艺相比，应用水的方法导致更有效的LPS回收。与应用缺乏水的等价溶液的工艺相比，通过应用包含水的提取溶液从革兰氏阴性菌提取LPS，该工艺在更短时间具有可靠性地产生更多的LPS。虽然如此，寻求用于实现更高效力的大规模LPS提取的改进方法。

发明概述

本文提供以更大的效力和减少的可变性用于提取LPS的组合物和方法。在一个方面，提供LPS提取溶液，其包含盐、水、醇和另外的有机溶剂。在一个方面，提供脂多糖(LPS)提取溶液，其包含盐、水、醇和另外的有机溶剂。

在一个方面，提供包含盐、水、醇和另外的有机溶剂的LPS提取溶液，其用于在从革兰氏阴性菌细胞提取LPS中应用。

在一个方面，提供包含盐、水、醇和另外的有机溶剂的LPS提取溶液在用于从革兰氏阴性菌细胞提取LPS的方法中的应用。

在一个方面，提供从革兰氏阴性菌细胞提取LPS的方法，其包括在包含盐、水、醇和另外的有机溶剂的LPS提取溶液中从革兰氏阴性菌细胞提取LPS的步骤。

在一个方面，提供LPS提取溶液，其包含：NaOAc，其中NaOAc的浓度是2 mM至30 mM；0.1% (v/v)至3% (v/v)水；20% (v/v)至45% (v/v)甲醇；和50% (v/v) 至X% (v/v)氯仿，其中X = 100 – [% (v/v)醇 + % (v/v) 水]。在一个方面，提供LPS 提取溶液，其包含10 mMNaOAc、66% (v/v)氯仿、33% (v/v)甲醇和1% (v/v)水。

在一个方面，提供从革兰氏阴性菌细胞提取LPS的方法，其包括下列步骤：用85%(v/v)乙醇的溶液洗涤革兰氏阴性菌细胞；用90% (v/v)乙醇的溶液再次洗涤革兰氏阴性菌细胞；用甲醇的溶液洗涤革兰氏阴性菌细胞；在权利要求1至16的LPS提取溶液中从革兰氏阴性菌细胞提取LPS；和从LPS提取溶液中蒸发醇和氯仿。

附图简述

图1(页1/6)显示LPS分子的三个共价连接区域：(i)在外部区域的O-特异性多糖链(O-抗原)；(ii)核心寡糖中心区域；和(iii)脂质A。

图2(页2/6)显示通过突变体明尼苏达沙门氏菌(S. minnesota)R595生产的截短的LPS，并且指出相对于全长LPS的截短的位置。

图3A(图3A；页3/6)提供显示提取方案的第一部分的流程图。将细胞肉汤与EtOH在提取容器中组合，然后通过带有陶瓷膜的切向流过滤(TFF)过滤。渗余物包含在约70%乙醇中的细胞悬浮液。将EtOH加入渗余物，然后使其接受热、搅拌和通过TFF的浓缩。渗余物包含在85-88%EtOH中的细胞悬浮液。将EtOH和H₂O加入渗余物，接受热、通过TFF的浓缩。渗余物包含在88-90%EtOH中的细胞悬浮液。然后在TFF的渗滤模式下将渗余物中的EtOH替换为MeOH。得到的渗余物包含在MeOH中的细胞悬浮液。

图3B(图3B；页4/6)提供显示提取方案的第二部分的流程图。将水中的乙酸钠溶液加入渗余物，然后加入氯仿，给出10 mM NaOAc、1% (v/v)水、66%(v/v) CHCl₃、33%(v/v)MeOH的浓度。将其在51℃加热(回流)1小时，然后接受通过TFF的浓缩。在容器中收集包含氯仿-甲醇提取物的渗透物。使其接受通过溶剂蒸发的浓缩以排除非水性溶剂。在溶剂蒸发期间加入水以生产在水中分散的粗 LPS 提取物。

图4(页5/6)对氯仿:甲醇提取的钠添加对氯仿:甲醇提取物收率的影响。结果来自小试规模研究。加入NaCl或NaOAc实施的提取包含0.5%至1.4%水。

图5(页6/6)示例对氯仿:甲醇提取的1%水和10 mM NaOAc对氯仿:甲醇提取物收率的影响。结果来自两个不同时间周期期间(2012和2015)实施的生产规模试验。

发明详述

提取组合物

本文提供用于提取LPS的组合物和方法，其用于改进的LPS提取效力。术语“提取效力”意味着回收的全部可用LPS的百分数。提取效力可以通过回收的全部可用LPS的百分数或通过LPS收率测量。如本文应用的术语“LPS收率”意味着作为干燥细菌细胞重量(DCW)的百分数获得的LPS的量。例如，当对在相同条件下生长的细菌细胞应用本方法和其它方法时，相比于通过其它方法产生的LPS收率，本方法导致更高的LPS收率。

在一个方面，LPS提取溶液是大规模的。通过大规模意味着等于或大于7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000 mL的提取体积。在特定方面，大规模意味着等于或大于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、10、15、20 L的提取体积。通过“LPS提取溶液”意味着在LPS提取步骤中应用的组合物/混合物，其中从细菌的膜直接提取LPS。在一个方面，提供LPS提取溶液，其包含盐、水、醇和另外的有机溶剂，并且用于本文其它处公开的方法。本发明的LPS提取溶液是单相提取组合物。通过“单相”意味着液体形成单一同质液体而非其中液体不能混溶的混合物；单相包括悬浮液。

术语“盐”是本领域技术人员公知的。合适的盐是具有包括钠、锂和钾的单价阳离子的那些。虽然不希望被理论束缚，本申请人假设LPS提取溶液中的单价阳离子替换二价阳离子(即，主要是Ca⁺⁺和Mg⁺⁺)，由此使外膜中的LPS不稳定。用于在本发明中应用的合适的盐包括NaOAc、NaCl、乙酸钾(KCH₃COO)(下文称为“KOAc”)、KCl、乙酸锂和氯化锂。

在一个方面，本发明LPS提取溶液中的盐浓度大于或等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30 mM。在一个方面，本发明LPS提取溶液中的盐浓度大于或等于2 mM和小于或等于30、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3 mM。在一个方面，本发明LPS提取溶液中的盐浓度是2、3、4、5、6、7、8、9、10 mM至10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500 mM，包含2、3、4、5、6、7、8、9、10 mM和10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500 mM在内（inclusive）。例如，本发明LPS提取溶液中的盐浓度可以是2 mM至30 mM，包含2 mM和30mM在内。在本发明的一个特别的实施方式中，LPS提取溶液中的盐浓度是5 mM至15 mM盐。在一个方面，本发明的LPS提取溶液特别包含约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30 mM盐。在一个方面，盐的浓度是10 mM。

术语“水”(H₂O)是本领域技术人员公知的。该术语包括纯的和基本上纯的水(H₂O)(包括通过蒸馏、去离子、离子交换处理或反渗透获得的水)，以及包含少量杂质的水，因为本领域技术人员清楚水通常包含一些杂质。水杂质是本领域技术人员公知的并且包括无机离子、有机分子、微粒、胶体、溶解的气体、微生物及其副产物。在一个特别的方面，水是无菌的，因为其基本上没有任何活的微生物。在一个进一步的方面，水是过滤了的。

术语“水”还包括去离子水。去离子水是本领域技术人员公知的术语，但是简言之，去离子水是其中除去基本上所有矿物离子的水。可以通过电导率测量去离子的水平，并且在一个特别的实施方案中，去离子水具有1微西门子(µsiemen)/cm的最大电导率。本发明的水不必须与LPS提取溶液的其它组分分开添加。例如，LPS提取溶液中的水可以源自包含醇和水二者的醇溶液、或包含盐和水的盐溶液、或醇和盐溶液二者。因此，技术人员仅需要混合醇、盐溶液和另外的有机溶剂来提供包含盐、醇、水和另外的有机溶剂的LPS溶液。

LPS提取溶液中水的合适的量是0.1至3.5%(v/v)的范围，包含0.1和3.5% (v/v)在内，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3或3.4 % (v/v)。在一个方面，本发明的LPS提取溶液可包含0.4%至3.5%水(v/v)。特别地，本发明LPS提取溶液中水的量是1% (v/v)，即0.8至1.2% (v/v)。

本发明的LPS提取溶液包含醇。如本文所用的术语“醇”被定义为任何非环状的有机化合物，其中羟基(-OH)与烷基或取代的烷基基团的碳原子连接，特别是短链(1-4个碳)单官能化醇，包括甲醇、乙醇和丙醇。为了阐明，本发明不包括芳香族不饱和醇，例如苯酚(环状醇)，并且因此提供了包含水、醇和另外的有机溶剂的LPS提取溶液，其中醇不是芳香族不饱和醇，例如苯酚。

本发明的LPS提取溶液中醇的百分数可以为约20%至约45%，并且在本发明的一个特别的实施方案中，LPS提取溶液包含25% (v/v)至40% (v/v)醇。本发明的LPS提取溶液特别包含约26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、35、36、37、38、39% (v/v)醇。用于LPS提取溶液的合适的醇包括甲醇、乙醇、异丙醇和丁醇。醇的选择可取决于许多因素，所述因素包括特定LPS提取溶液中的特定有机溶剂，因为某些醇不溶于某些有机溶剂，或通过蒸发去除的容易性。例如，甲醇由于其低沸点易于通过蒸发去除，并且可应用Bligh-Dyer液-液相分离去除，因为大多数甲醇分配到水相中。

本发明的LPS提取溶液包含除醇之外的有机溶剂。术语“有机溶剂”是本领域公知的。有机溶剂是含碳化学品，其能够将固体、液体或气体溶质溶解成溶液。合适的有机溶剂可以选自下组：氯仿、链烷(alkane)、甲苯和石油醚。氯仿是本领域技术人员公知的并且由化学式CHCl₃表示。

在一个方面，提供LPS提取溶液，其包含盐和醇、水和氯仿。氯仿的合适的百分数可以由此计算：% 氯仿 (v/v) = 100 – (%醇 + % 水)。在一个实施方式中，LPS提取溶液包含50%至80% (v/v)。在本发明的一个特别的实施方式中，LPS提取溶液包含55% (v/v)至75%(v/v)氯仿。在本发明的一个特别的实施方式中，LPS提取溶液包含60% (v/v)至70% (v/v)氯仿。本发明的LPS提取溶液除醇之外特别包含约52、53、55、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80 % (v/v)氯仿。

在一个方面，提供LPS提取溶液，其包含：盐；0.1% (v/v)至3% (v/v)水；20% (v/v)至45% (v/v)醇；和50% (v/v)至X% (v/v)的另外的有机溶剂，其中 X = 100 – [% (v/v)醇+ % (v/v) 水]；和其中盐的浓度是2 mM至500 mM。在前述一个方面，盐浓度是3 mM至50mM，诸如 4 mM 至30 mM，特别是 5 mM至20 mM。在前述一个方面，盐是单价盐。在前述一个方面，盐选自NaOAc、NaCl、KOAc和KCl。在前述一个方面，盐是NaOAc。在前述一个方面，醇是甲醇。在前述一个方面，另外的有机溶剂是氯仿。

在一个方面，提供LPS提取溶液，其包含：NaOAc、0.1% (v/v)至3% (v/v)水、20%(v/v)至45% (v/v) 甲醇、和50% (v/v)至X% (v/v) 氯仿，其中 X = 100 – [% (v/v)醇 +% (v/v) 水]，和其中NaOAc的浓度是2 mM至30 mM。在前述一个方面，NaOAc浓度是3 mM至50mM, 诸如 4 mM 至30 mM，特别是5 mM至20 mM。

在一个方面，提供LPS提取溶液，其包含：NaOAc、1% (v/v)水、33% (v/v)甲醇、和66% (v/v)氯仿，其中NaOAc的浓度是10 mM。

在一个方面，提供LPS提取溶液，其基本上由NaOAc、1% (v/v)水、33% (v/v)甲醇和66% (v/v)氯仿组成，其中NaOAc的浓度是10 mM。

LPS提取溶液的应用

在一个方面，如本文所述的LPS提取溶液用于从革兰氏阴性菌细胞提取LPS。这样的细菌细胞可通过细菌细胞培养获得。

LPS可得自革兰氏阴性菌细胞，包括但不限于沙门氏菌属（Salmonella）或埃希氏菌属（Escherichia），例如沙门氏菌属或埃希氏菌属的深度粗糙突变体细菌菌株。在1966年从亲本（光滑）菌株的培养物分离了明尼苏达沙门氏菌突变体R595(Luderitz et al. 1966Ann. N. Y. Acad. Sci. 133:349-374)。通过一组噬菌体(a panel of phage)筛选所选菌落对溶菌作用的易感性，并且仅选择表现出窄范围敏感性(仅对一种或两种噬菌体易感)的那些菌落用于进一步研究。该努力导致分离出在LPS生物合成中有缺陷的、并且称为明尼苏达沙门氏菌R595的深度粗糙突变体菌株。

与其它LPS相比，由明尼苏达沙门氏菌R595生产的那些是截短的并且具有相对简单的结构(参见图2)，因为它们：

(i) 不含有O-特异性区域-对从野生型光滑表型到突变体粗糙表型的转变负责并且导致毒力损失的特征

(ii) 核心区域非常短-该特征增加菌株对多种化学品的易感性，以及

(iii) 脂质A部分被至多7个脂肪酸高度酰化。

本发明的方法中使用的细菌细胞可为沙门氏菌属或埃希氏菌属的深度粗糙突变体细菌菌株的细菌细胞。通过术语“深度粗糙突变体细菌菌株”意味着具有深度粗糙表型的革兰氏阴性菌的菌株。深度粗糙表型是其中与脂质A连接的多糖部分仅由2-酮-3-脱氧-D-甘露辛酮糖酸(2-keto-3-deoxy-D-mannooctulonic acid)(KDO)的2-3个残基组成的一种表型。特别地，深度粗糙突变体细菌菌株选自沙门氏菌属。如果深度粗糙突变体细菌菌株选自沙门氏菌属，则其可为明尼苏达沙门氏菌物种，特别是明尼苏达沙门氏菌R595菌株。可以使用其它深度粗糙突变体细菌菌株，诸如空肠弯曲菌(Compylobacter jejuni) (Kanipeset al. 2004 Infection and Immunity 72:2452-2455)、大肠杆菌(E. coli) K12菌株CS2429 (Klena et al. 2005 J. Bact. 187:1710-1715)、大肠杆菌D31m4 (Qureshi et al.1988 J. Biol. Chem. 263:11971-11976)、大肠杆菌菌株F515 (Wiese et al. 1997Biochemistry 36:10311-10319)和奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)菌株R45 (Wieseet al. 1997 Biochemistry 36:10311-10319)。

提取方法和提取的LPS组合物

在一个方面，提供如本文其它处描述的LPS提取溶液在用于从革兰氏阴性菌细胞提取LPS的方法中的应用。在该方法的一个方面，革兰氏阴性菌细胞是沙门氏菌属或埃希氏菌属的深度粗糙突变体细菌菌株的细胞。在该方法的一个方面，革兰氏阴性菌细胞是大肠杆菌的细胞。在该方法的一个方面，革兰氏阴性菌细胞是明尼苏达沙门氏菌的细胞。

在一个方面，提供用于从革兰氏阴性菌细胞提取LPS的方法，其包括在包含盐、水、醇和另外的有机溶剂的LPS提取溶液中从革兰氏阴性菌细胞提取LPS的步骤。通过“LPS提取”或“从细菌细胞提取LPS”意味着从细菌外膜直接去除LPS。

在一个方面，在35℃至65℃的温度实施在LPS提取溶液中的LPS的提取。在一个方面，在45℃至55℃的温度实施在LPS提取溶液中的LPS的提取。在一个方面，在45℃至57℃、46℃至56℃、47℃至55℃、48℃至54℃、49℃至53℃或50℃至52℃的温度实施在LPS提取溶液中的LPS的提取。在一个方面，在51℃的回流温度实施在LPS提取溶液中的LPS的提取。通过“回流温度”意图处于接受加热的溶剂混合物的沸点或接近该沸点的温度。

在该方法的一个方面，实施在LPS提取溶液中的LPS提取的步骤0.1至4小时。在一个方面，实施在LPS提取溶液中的LPS提取的步骤0.5至2小时。在一个方面，实施在LPS提取溶液中的LPS提取的步骤1小时。

在该方法的一个方面，在LPS提取溶液中的LPS提取的步骤之前是用乙醇的溶液洗涤革兰氏阴性菌细胞的步骤。在该方法的一个方面，在在LPS提取溶液中从革兰氏阴性菌细胞提取LPS的步骤之前，用乙醇的溶液洗涤革兰氏阴性菌细胞的步骤之后是用乙醇洗涤革兰氏阴性菌细胞的第二步骤。通过“洗涤”意图不需要的组分的乙醇提取的工艺。

在提取步骤之前用乙醇洗涤可减少在LPS提取步骤中与LPS共提取的磷脂的量，并且因此洗涤能够减少LPS提取中杂质的量。因此，提供从细菌细胞提取LPS的方法，其包括下列步骤：

(i) 用乙醇的溶液洗涤革兰氏阴性菌细胞；

(ii) 用乙醇再次洗涤革兰氏阴性菌细胞；和

(iii) 在包含盐、水、醇和另外的溶剂的LPS提取溶液中从革兰氏阴性菌细胞提取LPS。

在该方法的一个方面，在步骤(i)和/或步骤(ii)中用75%至95% 乙醇 (v/v)的溶液洗涤革兰氏阴性菌细胞。在该方法的一个方面，在85% (v/v) 乙醇的溶液中洗涤步骤(i)中的革兰氏阴性菌细胞。在该方法的一个方面，用90% (v/v) 乙醇的溶液在步骤(ii)中洗涤革兰氏阴性菌细胞。

在该方法的一个方面，在在LPS提取溶液中从革兰氏阴性菌细胞提取LPS的步骤之前，用乙醇的溶液洗涤革兰氏阴性菌细胞的步骤之后是用甲醇的溶液洗涤革兰氏阴性菌细胞的步骤。

因此，提供从革兰氏阴性菌细胞提取LPS的方法，其包括下列步骤：

(i) 用乙醇的溶液洗涤革兰氏阴性菌细胞；

(ii) 用乙醇再次洗涤革兰氏阴性菌细胞；

(iii) 用甲醇洗涤革兰氏阴性菌细胞；和

(iv) 在包含盐、水、醇和另外的有机溶剂的LPS提取溶液中从革兰氏阴性菌细胞提取LPS。

因此，在一个方面，通过本文的方法生产提取的LPS组合物。在另一个方面，与来自现有技术方法的收率相比，应用本文的方法每单位质量干燥细胞生产的LPS的收率实质上被改进。例如，来自分批发酵的LPS的收率增加约45%。如果应用仅1%水(无盐)，收率轻微增加(约5-10%)。参见图4和5。

在该方法的一个方面，在LPS提取溶液中从革兰氏阴性菌细胞提取LPS的步骤之后是从LPS提取溶液蒸发水、醇和氯仿的步骤。在一个方面，在蒸发步骤期间执行连续的水添加以生产作为在水中分散的固体的LPS(“水分散的LPS”)。在另一个方面，完成水的蒸发以产生干燥的LPS残渣。在任一情况下，包含通过这些步骤生产的LPS的组合物被考虑为“提取的LPS组合物”。因此，提供从革兰氏阴性菌细胞提取LPS的方法，其包括下列步骤：

(i) 用乙醇的溶液洗涤革兰氏阴性菌细胞；

(ii) 用乙醇的溶液再次洗涤革兰氏阴性菌细胞；

(iii) 用甲醇的溶液洗涤革兰氏阴性菌细胞；

(iv) 在包含盐、水、醇和另外的有机溶剂的LPS提取溶液中从革兰氏阴性菌细胞提取LPS；和

(v) 从LPS提取溶液蒸发醇和氯仿。

在一个方面，通过TFF执行用乙醇的溶液洗涤的步骤，其中弃去渗透物；应用渗滤模式 TFF执行用甲醇的溶液洗涤的步骤；和应用TFF执行提取LPS的步骤，其中弃去渗余物。可应用一个可选的方面，其中洗涤步骤之后是离心和回收团块(pellet)的步骤，并且提取LPS的步骤之后是离心的步骤，之后是回收上清液的步骤。在一个进一步可选的方面，通过死端过滤执行用乙醇和甲醇的溶液洗涤的步骤，其中弃去渗透物；和应用死端过滤执行提取LPS的步骤，其中弃去渗余物。本领域技术人员将理解，可以在一个步骤中应用TFF，连同在另一步骤中应用离心或死端过滤。

(i) 用乙醇的溶液洗涤革兰氏阴性菌细胞和实施TFF以生产渗余物；

(ii) 使(i)的渗余物接受用乙醇的溶液洗涤革兰氏阴性菌细胞和实施TFF以生产渗余物的第二步骤；

(iii) 使(ii)的渗余物接受通过渗滤模式TFF用甲醇的溶液洗涤革兰氏阴性菌细胞以生产包含革兰氏阴性菌细胞的液体甲醇体积的步骤；

(iv) 向步骤(iii)的包含革兰氏阴性菌细胞的液体甲醇体积加入含水盐溶液和另外的有机溶剂，以生产包含盐、水、醇和另外的有机溶剂的LPS提取溶液；和

(v) 实施TFF以生产包含从革兰氏阴性菌细胞提取的LPS的渗透物；和

(vi) 使步骤(iv)的渗透物接受从LPS提取中蒸发醇和氯仿的步骤。

在一个方面，本文的方法灭活微生物。因此，在一个方面，根据本文方法生产的提取的LPS组合物不含活的微生物。在另一个方面，本文的方法去除天然细胞LPS中通常存在的大部分磷脂。因此，在一个进一步的方面，就缺乏大部分磷脂而言天然细胞LPS不同于通过本文方法生产的提取的LPS组合物。

在该方法的一个方面，使提取的LPS组合物接受相继的酸水解和碱水解的步骤以形成3D-MPL组合物。在一个方面，提供通过本文其它处公开的方法生产的3D-MPL组合物。

可在从细菌细胞提取LPS基本上完成之后的任意点随后去除在本文公开的LPS提取方法期间利用的盐。因此，在一个方面，提供包含盐和提取的LPS的组合物。在一个进一步的方面，提供包含盐和3D-MPL的组合物。

本文公开的产品是免疫原性的。因此，在一个方面，提供包含通过本文方法生产的提取的LPS组合物的免疫原性组合物。在一个方面，提供包含本文生产的3D-MPL组合物的免疫原性组合物。在一个方面，包含3D-MPL的免疫原性组合物进一步包含选自(a)免疫刺激物和(b)抗原的一个或多个组分。

因此，提供本文其它处描述的3D-MPL组合物在用于制备免疫原性组合物的方法中的应用。在一个方面，制备的方法包括将本文公开的3D-MPL与选自(a)免疫刺激物和(b)抗原的一个或多个组分组合的步骤。因此，在一个方面，本文公开的方法包括下列步骤：

(i) 在包含盐、水、醇和另外的有机溶剂的LPS提取溶液中从革兰氏阴性菌细胞提取LPS以生产提取的LPS组合物；

(ii) 使提取的LPS组合物接受相继的酸水解和碱水解以形成3D-MPL组合物;

(iii) 将本文公开的3D-MPL与选自(a)免疫刺激物和(b)抗原的一个或多个组分组合，由此生产免疫原性组合物。

术语

为了促进本公开内容的各个方面的评论，提供术语的下列解释。额外的术语和解释可以在本公开内容的上下文中提供。

除非有另外的解释，本文应用的所有技术和科学术语具有本公开内容所属领域普通技术人员所通常理解的相同含义。分子生物学中普通术语的定义可见于BenjaminLewin, Genes V, 由Oxford University Press出版, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, 由BlackwellScience Ltd.出版, 1994 (ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A. Meyers (ed.),Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, 由VCHPublishers, Inc.出版, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)。

单数术语“一（a）”、“一（an）”和“该（the）”包含复数指代物，除非上下文另外明确指定。类似地，词语“或”意图包括“和”，除非上下文另外明确指定。术语“多个”指两个或更多个。进一步要理解的是，对核酸或多肽给定的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值都是大概的，并且提供用于描述。此外，关于温度、物质诸如组合物的百分比、浓度或水平给定的数值限制意图是大概的。因此，在指示温度是15℃至25℃的情况下，意图将温度理解为大约(或“”或“约（~）”)15℃至大约(或“”或“约（~）”)25℃。同样，浓度指示为至少(例如)200 pg意图将浓度理解为至少大约(或“”或“约（~）”)200 pg。

虽然在本公开内容的实践或测试中可以应用与本文描述的那些类似或等价的方法和材料，下文描述了合适的方法和材料。术语“包含（comprises）”意味着“含有（includes）”。因此，除非上下文另外要求，词语“包含（comprises）”和变形诸如“包含（comprise）”和“包含（comprising）”将被理解为隐含包括所陈述的化合物或组合物(例如核酸、多肽或抗原)或步骤、或化合物或步骤的组，而不排除任何其它化合物、组合物、步骤或它们的组。缩写“例如（e.g.）”来自拉丁文例如（exempli gratia），并在本文中用于指示非限定性实例。因此，缩写“例如（e.g.）”与术语“例如（for example）”同义。

实施例

实施例1. 应用盐加入增加的LPS提取的证明–以小试规模

在4个250 mL离心瓶中离心来自明尼苏达沙门氏菌R595的分批发酵的一升发酵肉汤。然后如下实施用净化水的两次漂洗：将团块重悬浮于200 mL净化水中，合并（pool into）在单个离心瓶中，离心，弃去上清液，重悬浮于200 mL净化水中，离心和弃去上清液。

实施两次乙醇提取以去除磷脂杂质：将细胞重悬浮于60 mL的95%试剂醇(+5% 水)并且然后在50℃在培养箱中搅拌45分钟。然后将细胞离心和弃去上清液。将细胞重悬浮于60 mL的90%试剂醇(+10%水)并且然后在50℃在培养箱中搅拌45分钟。然后将细胞离心和弃去上清液。然后用100 mL的甲醇漂洗细胞两次(通过重悬浮和离心)。

将细胞团块重悬浮于一定体积的甲醇(例如18 mL)中并将甲醇浆体分配到100 mL圆底烧瓶中(例如，5.5 mL分配到4个烧瓶中的每一个)，然后应用其评价用各种LPS提取溶液的提取。此外，将测量体积的甲醇浆体(例如3.1 mL)转移到配衡玻璃离心管；然后离心该管，弃去上清液，将团块重悬浮于小体积的净化水，并且然后将管冷冻和冻干。然后重量分析地确定干燥的细胞的质量。这一质量提供用于LPS的收率计算的基础，所述LPS用各种LPS提取溶液获得。

向含有5.5 mL的甲醇浆体的每一100 mL烧瓶加入氯化钠或乙酸钠的含水原液的体积和/或净化水的体积，然后是16 mL体积的氯仿。加入的钠溶液和水的体积导致范围为0至30 mM的钠浓度和0.0%至1.4%的水浓度。在回流温度加热烧瓶，伴随搅拌大约16小时。然后用烧结玻璃布氏漏斗过滤细胞浆体；用30 mL氯仿:甲醇4:1 (v/v)漂洗每一烧瓶和过滤器。实施旋转蒸发以从滤液蒸发溶剂(包含CM 4:1漂洗)。然后，实施Bligh和Dyer液体-液体提取以去除盐和使得能够重量分析确定粗 LPS 提取物的收率。

来自如本实施例所述实施的小试规模提取的结果总结于图4中。

实施例2. 用乙醇提取以去除磷脂杂质–以生产规模

细胞肉汤 + EtOH，在提取容器中 → 用陶瓷膜过滤 (TFF) → 渗余物 (=在约70% 乙醇中的细胞悬浮液)

渗余物 + EtOH → 热 → 搅拌 → 通过TFF浓缩 → 渗余物 (=在85-88% EtOH中的细胞悬浮液)

渗余物 + EtOH + H₂O + 热 → 通过TFF浓缩 → 渗余物 (=在88-90% EtOH中的细胞悬浮液)

渗余物 → 在TFF的渗滤模式下EtOH被MeOH替代 → 渗余物 (=在MeOH中的细胞悬浮液)

将含有大约1600克干细胞质量的大约34 L的浓缩的明尼苏达沙门氏菌R595细胞(从分批发酵收获，其中应用切向流过滤以用净化水浓缩和渗滤细胞)和77 L的试剂醇装入带有搅拌器和温度控制的200 L夹套式不锈钢容器。然后用装配有0.2 µm孔径大小、3.5 mm 通道直径和0.25 m²总过滤面积的19通道圆柱形Kerasep™ 陶瓷膜的切向流过滤(TFF)单元将这一混合物浓缩至36 L。弃去渗透物。

用试剂醇(45 L)稀释渗余物至大约86% v/v乙醇的浓度。将这一混合物加热至50℃并在这一温度搅拌60分钟。然后通过TFF将混合物浓缩至19 L。弃去渗透物。

将试剂醇(76 L)和净化水(8.5 L)加入渗余物以稀释细胞至在89% v/v乙醇中大约102 L。将这一混合物加热至50℃并在这一温度搅拌60分钟。然后通过TFF将混合物浓缩至19 L。弃去渗透物。

实施一系列的7次甲醇漂洗，每一漂洗由加入19 L甲醇、然后通过TFF浓缩至大约17 L组成。弃去渗透物。

通过乙醇洗涤和甲醇漂洗后渗透物的分析已确定，去除了大约15%的干细胞质量。通过薄层色谱的分析显示，被消除的质量由不含脂多糖(其在保留的细胞中保持)的疏水杂质(磷脂)组成(数据未显示)。

实施例3. 不进行盐加入的 LPS的提取–以生产规模

渗余物 + CHCl₃ + 热 → 通过TFF浓缩 → 渗透物 (=氯仿-甲醇提取物(CME))，在收集容器中。

如实施例2所述用乙醇洗涤和甲醇漂洗之后，将50 L的CHCl₃加入渗余物。为了提取LPS，然后在50℃加热混合物16小时。然后通过TFF浓缩混合物至大约13 L，和将渗透物引至不锈钢收集容器。向渗余物加入氯仿(20 L)和甲醇(8 L)并将混合物再次浓缩至大约13L，和将渗透物引至收集容器。

在50 L Buchi R-250EX旋转蒸发仪中浓缩收集的渗透物至大约一升。将这一体积转移到两个2 L圆底烧瓶(应用额外的氯仿来漂洗和完成转移)。然后应用Buchi R-215旋转蒸发仪完成溶剂蒸发。将烧瓶置于压力<1000毫托（mTorr）的真空室中最少10小时，导致残余溶剂的去除。在2 L烧瓶中回收的质量是粗 LPS 提取物，也称为氯仿:甲醇提取物(CME)。

通过本实施例的方法获得的CME收率在图5中表示，由标记为“无Na /无H₂O”的条（bar）指示。

实施例 4. 应用盐加入的LPS的提取–以生产规模

渗余物 + H₂O + NaOAc +CHCl₃ + 热 → 通过TFF浓缩 → 渗透物 (=氯仿-甲醇提取物 (CME))，在收集容器中 → 通过溶剂蒸发浓缩以消除非-H₂O 溶剂→ 在溶剂蒸发期间加入H₂O → 分散于水中的CME (粗 LPS 提取物)。

如实施例2所述用乙醇洗涤和甲醇漂洗之后，将1.0 M NaOAc和CHCl₃ 加入渗余物，给出10 mM NaOAc、1% (v/v) 水、66%(v/v) CHCl₃、33%(v/v) MeOH的浓度。为了提取LPS，然后在50℃加热混合物1小时。然后通过TFF浓缩混合物至大约13 L，和将渗透物引至不锈钢收集容器。将氯仿(20 L)和甲醇(8 L)加入渗余物并将混合物再次浓缩至大约13 L，和将渗透物引至收集容器。重复用氯仿和甲醇的这一漂洗以得到LPS的更完全回收。

将收集的渗透物在50 L Buchi R-250EX旋转蒸发仪中浓缩至大约一升。加入1.5L净化水并将混合物再次浓缩至一升。然后实施1.5的水的第二次加入和浓缩至1 L。这导致分散在水中的粗 LPS的回收。将这一浆体转移到烧瓶，应用额外的水来完成转移。为了确定收率，通过液体-液体提取处理分散的粗 LPS的样品以去除盐；将有机相干燥和重量分析地确定质量。

通过本实施例的方法获得的收率在图5中表示，由标记为“10 mM NaOAc / 1%H₂O”的条指示。对于在2012年生产的两个分批（batch），平均收率比对于不进行盐加入生产的38个分批获得的平均值高47%(依照实施例2的方法)。对于在2015年生产的一个分批，收率比对于不进行盐加入生产的21个分批获得的平均值高64%(依照实施例2的方法)。对于加入1%水但无盐的在2012年生产的两个分批，平均收率比不进行水和盐加入生产的分批的平均值高7%。

Claims

1.脂多糖(LPS)提取溶液，其包含：

(i) 选自NaOAc、NaCl、KOAc和KCl的盐；

(ii) 水；

(iii) 醇；和

(iv) 另外的有机溶剂；

所述提取溶液用于从革兰氏阴性菌细胞提取LPS，其中所述LPS提取溶液的体积等于或大于选自0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、10、15和20 L的体积。

2.权利要求1的LPS提取溶液用于从革兰氏阴性菌细胞提取LPS的应用，其中所述LPS提取溶液的体积等于或大于选自0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、10、15和20 L的体积。

3.从革兰氏阴性菌细胞提取LPS的方法，其包括应用权利要求1的提取溶液从革兰氏阴性菌细胞提取LPS的步骤，其中所述LPS提取溶液的体积等于或大于选自0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、10、15和20 L的体积。

4.权利要求1至3的LPS提取溶液，其中所述盐是NaOAc。

5.权利要求1至4的LPS提取溶液，其中所述盐浓度大于或等于2 mM和小于或等于30mM。

6.权利要求1至5的LPS提取溶液，其中所述另外的有机溶剂是氯仿。

7.权利要求1至6的LPS提取溶液，其中所述LPS提取溶液中水的量是大于或等于0.1%(v/v)和小于或等于3% (v/v)。

8.权利要求1至7的LPS提取溶液，其中所述醇是甲醇。

9.从革兰氏阴性菌细胞提取LPS的方法，其包括下列步骤：

(i) 用85% (v/v)乙醇的溶液洗涤革兰氏阴性菌细胞；

(ii) 用90% (v/v)乙醇的溶液再次洗涤革兰氏阴性菌细胞；

(iii) 用甲醇的溶液洗涤革兰氏阴性菌细胞；

(iv) 在权利要求1至8的LPS提取溶液中从革兰氏阴性菌细胞提取LPS；和

(v) 从所述LPS提取溶液蒸发醇和氯仿。

10.通过权利要求2的应用或权利要求3或9的方法生产的提取的LPS组合物，其进一步包含盐。

11.权利要求10的方法，其进一步包括使提取的LPS组合物接受酸水解以生产MPL和使MPL接受碱水解以形成3D-MPL组合物的步骤。

12.通过权利要求11的方法生产的3D-MPL组合物，其进一步包含盐。