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CN108451968A - 寡核苷酸功能化的纳米颗粒的递送 - Google Patents

寡核苷酸功能化的纳米颗粒的递送 Download PDF

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CN108451968A
CN108451968A CN201810171435.0A CN201810171435A CN108451968A CN 108451968 A CN108451968 A CN 108451968A CN 201810171435 A CN201810171435 A CN 201810171435A CN 108451968 A CN108451968 A CN 108451968A
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CN
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target
gene
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nanoparticles
oligonucleotide
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Application number
CN201810171435.0A
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查德·A·米尔金
艾米·S·保勒
大卫·A·吉拉约翰
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Original Assignee
Northwestern University
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Publication date
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Abstract

本发明公开了寡核苷酸功能化的纳米颗粒的递送。本发明涉及用于递送寡核苷酸功能化的纳米颗粒的组合物和方法。

Description

寡核苷酸功能化的纳米颗粒的递送
分案说明
本申请是申请日为2013年3月15日、国家申请号为201080023986.4、发明名称 为“寡核苷酸功能化的纳米颗粒的递送”的发明专利申请的分案申请。
交叉参考相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2009年6月17日提交的第61/187,759号美国临时申请的利益，并且是于2010年1月8日提交的第12/684,836号美国申请(其根据 35U.S.C.§119(e)要求于2009年1月8日提交的第61/143,293号美国临时申请和于 2009年4月15日提交的第61/169,384号美国临时申请的利益)的部分连续，全部所述 申请的公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及抑制细菌蛋白质产生的寡核苷酸修饰的纳米颗粒(ON-NP)和方法。本发明还涉及递送寡核苷酸功能化的纳米颗粒的组合物和方法。
背景技术
将遗传物质引入细胞和组织以控制基因表达已深远地影响了牵涉基因途径和功能 的研究，并且为治疗应用提供了希望。遗传水平方法具有大部分药物所不可获得的固有特异性。siRNA大有希望成为潜在治疗工具并且目前正处于临床试验中，其靶向广 泛的临床问题，包括癌症。基因沉默具有比小分子抑制剂高得多的高性价比，并且导 致以比所述小分子抑制剂更高的潜在特异性下调蛋白质的表达和功能。特别地，siRNA 治疗可靶向基因的单点突变，而小分子疗法迄今为止不能精确地区分突变体与正常基 因产物。鉴于通过热点突变的鉴定、直接的基因测序或对基因扩增的测定确定每一种 黑素瘤的特定基因改变的能力，因此可为每一种黑素瘤赋予特定的遗传标签。虽然siRNA可被许多细胞摄入，但只有具有突变的基因或激活的信号传导蛋白的细胞才被 靶向基因疗法影响，从而允许使在黑素瘤中发信号的途径正常化而不会不利地影响正 常细胞。
与许多蛋白质的递送一样，核酸在胃肠道中的降解和较低的生物利用度是siRNA的口服递送的主要障碍。即使对于静脉内递送，常规siRNA被血清因子快速降解，从 而不能到达其靶。核酸的局部施用为抑制损伤皮肤中的基因(例如但不限于，治疗皮肤 中的转移灶)和经皮肤递送至内靶提供了巨大的治疗有利方面。施用是无痛的并且容易 控制，并且皮肤是高度可进入的。表皮中的有效物理障碍主要位于表皮的最外面区域 —角质层，其次位于更深处的表皮。该表皮屏障阻止大量水分丢失(由内向外)和防止 环境物质(包括核酸)的进入(由外向内)。机械方法例如超声、激光和注射已被用来促进 穿过小鼠角质层并且驱动siRNA进入皮肤，但需要专门设备，限制了递送的区域并且 潜在地损害皮肤。这些挑战强调对用于递送抑制核酸的容易施用的经皮系统的需要， 该经皮系统能够穿过角质层。
皮肤病的直接靶向是基因抑制疗法的理想模型。然而，体外抑制基因的商购可得的材料仅获得微小成功，至多，将遗传物质递送进入原代培养细胞例如角质细胞(KC) 和黑素细胞。此外，皮肤的外层用作常规阻止核酸和蛋白质渗入皮肤并且从真皮进入 循环的解剖学屏障[Prausnitz等人，Nat Biotechnol 26:1261-1268(2008)]。因此，穿过该 层以转移足量的寡核苷酸一直以来是个挑战。
皮肤是身体的最大器官，包括3层：表皮、真皮和皮下组织。表皮是皮肤的最外 层。表皮的厚度在不同类型的皮肤中可变化。眼睑上的皮肤最薄为0.05mm，掌和足 底上的皮肤最厚，为1.5mm。表皮包括4个主要的分化逐渐加大的细胞层。从底层至 顶层被称为：
·基底层
·棘皮层
·颗粒层
·角质层
底层基底层具有形状如圆柱的细胞。在该层中，细胞分裂并且将已形成的细胞推入更高层。当细胞迁入更高层时，它们变平，变得更成熟并且最终“死亡”，以及脱落。 表皮的最顶层角质层由会脱落的扁平皮肤细胞组成；其花费约4周的时间从基底层的 细胞到达角质层并且随后脱落。
发明内容
本公开内容提供了用于递送寡核苷酸功能化的纳米颗粒的组合物和方法。
在某些实施方案中，本公开内容提供了包含寡核苷酸功能化的纳米颗粒(ON-NP)和皮肤媒介物的皮肤组合物。
本公开内容还提供了皮肤递送寡核苷酸功能化的纳米颗粒的方法，其包括给有此需要的患者的皮肤施用包含寡核苷酸功能化的纳米颗粒和皮肤媒介物的组合物的步 骤。
在一个方面，寡核苷酸功能化的纳米颗粒的递送是经皮肤的。在另一个方面，寡核苷酸功能化的纳米颗粒的递送是局部的。在另一个方面，寡核苷酸功能化的纳米颗 粒的递送是局部施用后至表皮和真皮的递送。
在某些实施方案中，表皮媒介物包含软膏。在某些方面，软膏是阿夸福(Aquaphor)。
在另一个实施方案中，提供了调节基因表达的方法，其包括步骤：在其中寡核苷酸功能化的纳米颗粒与靶杂交并且调节基因表达的条件下给皮肤施用治疗有效量的包 含寡核苷酸功能化的纳米颗粒的组合物。
在某些方面，靶是多核苷酸。在相关方面，多核苷酸是RNA。在某些方面，靶是 多肽。
在本公开内容的其他实施方案中，组合物的施用改善皮肤病。
在多个实施方案中，皮肤病选自癌症、遗传病、衰老、炎症、感染和外形缺陷(cosmetic disfigurement)。
在某些方面，癌症选自鳞状细胞癌、基底细胞癌、乳腺癌和黑素瘤。
在其他实施方案中，靶是由选自Ras、IκBα、hedgehog、B-Raf、Akt和细胞周期 蛋白D的基因表达的基因产物。
在某些方面，遗传病选自单纯性大疱性表皮松解、大疱性鱼鳞病(bullousichthyosis)、先天性厚甲症(pachyonychia congenita)、面皮肤骨骼综合征(Costellosyndrome)和结节性硬化症。在其他方面，靶是包含突变的基因产物，所述基因产物由 选自K5、K14、K1、K10、H-Ras和m-Tor的基因表达。
在某些实施方案中，衰老病症选自UV-损伤和早衰。在某些方面，靶是由选自基 质金属蛋白酶-1和progerin的基因编码的基因产物。
在某些实施方案中，炎症因银屑病而引起。在某些方面，靶是白细胞介素-23。
在一个实施方案中，病毒感染导致疣。在某些方面，靶是E6/E7。
在其他实施方案中，外形缺陷选自脂溢性角化病、表皮痣和色素痣。在多个方面，靶是包含突变的基因产物，所述基因产物由选自FGFR3、K10和B-Raf的基因表达。
附图说明
图1描绘了寡核苷酸金纳米颗粒(Au-NP)缀合物阻断启动子复合物结构(A)和全mRNA转录物结构(B)形成的方案。
图2描绘了在缀合物处理后大肠杆菌(E.coli)的电子显微镜图像。
图3描绘了使用纳米颗粒抑制细菌荧光素酶表达的结果的概要。无义表示在大肠杆菌基因组或转染的质粒上无互补区的序列。反义表示靶向荧光素酶的序列。相对荧 光素酶活性显示为标准化成海肾表达的条块内的百分比。
图4描绘了双链体侵入方案。A)双链体(双链体末端上的荧光素和邻近的dabcyl)被纳米颗粒侵入，从而释放荧光信号的示意图。B)显示在短(20个碱基对)双链体和长 (40个碱基对)双链体(灰色框表示无义序列，黑色框表示反义序列)中因双链体侵入而 不断增加的荧光的结果。
图5描绘在施用后24小时内约25nM siRNA-金纳米颗粒渗入表皮、真皮和皮下 组织。A)小鼠皮肤中siRNA-Au NP的共聚焦成像。左图框＝Cy3。明亮色为角质层(外 皮层)，其可因致密的颗粒积累和自发荧光而发出明亮荧光；毛发(在囊内纵切面中看 到的)也发出强烈的荧光；中间图框＝细胞核的DAPI染色；右图框＝重叠图像。图像显 示荧光siRNA-AuNP在约100％的表皮细胞中的摄入。B)间充质组织(+)下面的脂细胞 (箭头)和成纤维细胞也几乎全体摄入荧光颗粒。Bar＝20μm。
图6描绘在用siRNA-Au NP处理4周后C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J小鼠中 GFP的敲低。
具体实施方式
本文中公开了可局部或经皮肤施用以进行全身递送的纳米颗粒递送系统。在某些实施方案中，该系统利用被密集地裹在纳米颗粒(siRNA-NP)的表面上的siRNA双链 体。此类缀合物展示许多独特的性质，包括但不限于：在生物条件下寡核苷酸壳的保 留，从而导致单一试剂能够同时转染和基因调控。寡核苷酸-NP(ON-NP)能够容易地横 穿细胞膜而无需加入有毒的转染试剂。重要地，这些结构不仅仅用作用于核酸递送的 媒介物，而且在细胞内保留缀合结构。荧光光谱研究显示硫代寡核苷酸在细胞内化后 仍然结合NP，从而允许利用纳米材料的组合特性。由ON-NP展示的另一个性质是它 们在生理环境中的非凡稳定性。与其他纳米材料和基因转染试剂不同，寡核苷酸-NP 在生物相关条件下可被容易地操作。此类生物相关条件包括高盐和低盐浓度、极端pH 和温度的波动。ON-NP的另外特性是它们对核酸酶降解的抗性。由于内切和外切核酸 酶存在于生物液体中并且用于破坏外来遗传物质，所以用于增加核酸的酶稳定性的方 法至为重要。虽然提高核酸的酶稳定性的先前策略依赖于化学修饰，但寡核苷酸-NP 的增强的抗性是独特的，因为其基于纳米颗粒表面的密集功能化。该环境在纳米颗粒 表面附近内产生更高的局部电介质，从而提供高亲和力靶识别和对酶促降解的抗性。 由ON-NP展示的其他性质是它们进入多种细胞类型(包括“难以转染的”原代细胞)而无 需使用辅助试剂的能力。ON-NP的另一个性质是它们不存在明显毒性。此类纳米缀合 物具有独特的大小、电荷和表面功能性，特性来源于寡核苷酸与NP的组合。对此类 独特材料的初步毒理学筛选在动物模型中未显示在高剂量下的急性毒性。
本文中公开了ON-NP的局部施用是将选择性基因抑制递送至损伤的皮肤、淋巴结或进入循环以经皮肤递送至内靶的新型方法。在一个实施方案中，通过将ON-NP直接 递送至损伤的皮肤，使寡核苷酸-NP浓度在最大肿瘤负荷的位置上最大化，同时使潜 在副作用减至最小。
在一个方面，本公开内容提供抗生素组合物和其使用方法。在一个方面，抗生素组合物包含经修饰而包含寡核苷酸的纳米颗粒，其中寡核苷酸与原核生物基因的靶非 编码序列充分互补，以便寡核苷酸可在允许杂交的条件下与靶序列杂交。通过该杂交， 抗生素组合物抑制靶原核细胞的生长。在靶细胞中，在某些方面，杂交抑制由靶序列 编码的功能性蛋白质的表达。在多个方面，由靶向序列编码的原核生物蛋白的转录、 翻译或两者被抑制。公开内容还提供了利用本文中公开的抗生素组合物抑制靶原核生 物基因产物在细胞中产生的方法，其包括将细胞与抗生素组合物接触的步骤，其中与 组合物的纳米颗粒结合的寡核苷酸在允许杂交的条件下与细菌基因的靶非编码序列充 分互补，并且其中杂交导致由靶基因编码的功能性原核生物基因产物的抑制。本领域 技术人员应理解，靶原核生物序列的转录或翻译或转录和翻译导致由靶原核生物序列 编码的功能性蛋白的产生的抑制。
寡核苷酸功能化的纳米颗粒与靶原核生物序列的杂交形成如本文中定义的“复合物”。如本文中所使用的，“复合物”是双链(或双链体)复合物或三链(或三链体)复合物。 在本文中涉及三链体复合物和双链体复合物抑制靶细菌原核生物核酸(prokaryotic acid)的翻译或转录。
如本文中所使用的，“非编码序列”具有本领域内接受的意义。通常，非编码序列描述了不包含用于翻译由基因编码的蛋白质的密码子的多核苷酸序列。在某些方面， 非编码序列是染色体的。在某些方面，非编码序列是染色体外的。在一个方面，非编 码序列与基因的编码序列的全部或部分互补。非编码序列包括表达的调控元件例如启 动子、增强子和沉默子。非编码序列的实例是5'非编码序列和3'非编码序列。“5'非编 码序列”是指位于编码序列的5'(上游)的多核苷酸序列。5'非编码序列可存在于起始密 码子的完全加工的mRNA上游中并且可影响初始转录物至mRNA的加工、mRNA稳 定性或翻译效率。“3'非编码序列”是指位于编码序列的3'(下游)的核苷酸序列并且包 括多腺苷酸化信号序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的信号的其他序列。多 腺苷酸化信号通常特征在于其影响添加多聚腺苷酸序列至mRNA前体的3'末端的能 力。
在一个实施方案中，非编码序列包括启动子。“启动子”是指导结构基因的转录的多核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5'非编码序列，靠近结构基因的转录起始位 点。在启动转录中起作用的启动子内的序列元件的特征通常在于共有核苷酸序列。此 类启动子元件包括RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列、分化特异性元件 [DSEs；McGehee等人，Mol.Endocrinol.7:551(1993)]、环AMP应答元件(CRE)、血 清应答元件[SREs；Treisman，Seminars in Cancer Biol.1:47(1990)]、糖皮质激素应答元 件(GRE)和其他转录因子例如CRE/ATF[O'Reilly等人，J.Biol.Chem.267:19938(1992)]、 AP2[Ye等人，J.Biol.Chem.269:25728(1994)]、SP1、cAMP应答元件结合蛋白[CREB； Loeken，GeneExpr.3:253(1993)]和八聚体因子[通常参见，Watson等人编辑，Molecular Biology ofthe Gene，第4版(The Benjamin/Cummings Publishing Company，Inc.1987)， 以及Lemaigre和Rousseau，Biochem.J.303:1(1994)]的结合位点。如果启动子是诱导 型启动子，那么转录速率响应诱导剂而增加。相反地，如果启动子是组成型启动子， 那么转录速率不受诱导剂调控。阻抑型启动子也是已知的。“核心启动子”包含启动子 功能所需的必需核苷酸序列，包括TATA盒和转录起始点。根据该定义，核心启动子 在可提高活性或赋予组织特异性活性的特定序列不存在的情况下可以具有或可以不具 有可检测的活性。
在另一个实施方案中，非编码序列包括调控元件。“调控元件”是调节核心启动子的活性的多核苷酸序列。例如，调控元件可包含与细胞因子结合，从而使得能够在特 定的原核生物中专有地或优先地转录的多核苷酸序列。
在另一个实施方案中，非编码序列包含增强子。“增强子”是无论增强子相对转录起始位点的距离或定向如何都可提高转录效率的一种调控元件。
此处要指出，如本说明书和所附权利要求中所使用的，除非另外明确地指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。
将要指出的是术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用并且具有本领域 中接受的意义。
还要指出的是术语“连接”、“缀合”、“修饰”和“功能化”在本文中也可互换使用并且 是指寡核苷酸与纳米颗粒的结合。
“杂交”意指核酸的2条或3条链之间按照沃尔森-克里克DNA互补、Hoogstein 结合或本领域内已知的其他序列特异性结合的法则通过氢键的相互作用。杂交可在本 领域已知的不同严格条件下进行。
术语“寡核苷酸功能化的纳米颗粒”和“纳米缀合物”在本文中可互换使用。
如本文中所使用的，解链温度或“Tm”是杂交的两个特定核酸离解50％时所处的温度。
如本文中所使用的，术语“皮肤的”意指皮肤或与皮肤相关，并且在本文中可与“皮的”互换使用。如本文中所使用的，“经皮肤”意指穿过皮肤至皮下组织并且通常 进入全身血管或淋巴循环。如本文中所使用的术语“局部”意指属于皮肤。因此，当 局部施用组合物时，将其施用至皮肤。然而，本领域技术人员将理解，术语“局部”不 一定指组合物将保留的地方，而是指如何施用其。
在多个实施方案中，预期本公开内容的组合物和方法靶向皮肤的不同深度，这取决于例如但不限于，具体的目的靶。在多个实施方案中，本公开内容的组合物靶向表 皮。在某些实施方案中，本公开内容的组合物靶向真皮。在其他实施方案中，本公开 内容的组合物经皮肤迁移并且到达皮下组织、全身性脉管系统或淋巴循环。
影响本公开内容的组合物和方法的穿透深度的因素包括但不限于纳米颗粒的大小 和纳米颗粒表面上的功能化寡核苷酸密度。这些方面在下文中进行了更详细的描述。因此，在某些方面，本公开内容涉及寡核苷酸功能化的纳米颗粒本身推进本公开内容 的组合物可行进的深度。在某些方面，组合物中的媒介物推进本公开内容可行进的深 度。在其他方面，媒介物与寡核苷酸功能化的纳米颗粒一起的组合推进本公开内容的 组合物可行进的深度。
黑素瘤代表具有不同的致癌突变和基因组扩增的模式的一组异质肿瘤。从前期病变(例如色素痣)进展至黑素瘤被认为遵循具有导致信号传导途径的活化的遗传改变的 分步途径。最常见的是RAS/RAF/MEK/ERK途径的活化(约60％的黑素瘤已激活BRAF 突变和25％NRAS突变)。日光照射的位置最常见地显示BRAF突变，然而不太常见的 粘膜或肢端位置极少显示BRAF突变。
超过95％的BRAF突变[Dhomen等人，Hematol Oncol Clin North Am 23，529-545，ix(2009)]是用缬氨酸置换谷氨酸(V600E)并且使BRAF活化增加至500倍的点突变(T1799A)。该突变在小鼠模型中导致活动过强的黑素细胞ERK信号传导和外植肿瘤的 生长因子依赖性增殖[Wellbrock等人，Cancer Res.64(7):2338-42(2004)]。
然而单独的BRAF/ERK途径的活化不能解释黑素瘤转化。事实上，转移性黑素瘤 倾向于具有超过1个基因的改变[Goel等人，Oncogene 28:2289-2298(2009)](参见表A， 下文中)，除了BRAF/ERK活化外，最常见地导致磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶 B(AKT)途径(约70％的散发性黑素瘤(sporadic melanomas))的活化[Cheung等人，Cancer Res 68:3429-3439(2008)]。组成型PI3K/AKT活化在BRAF V600E突变介导的黑素瘤 的发展中的至关重要的作用现已在体外和小鼠研究中得到证明。经常发现BRAF突变 与PTEN丧失/失活(约30％的细胞系和至少58％的黑素瘤转移灶)(Birck等人，2000) 或激活AKT3突变(43-50％的黑素瘤)[Davies等人，Br J Cancer 99:1265-1268(2008)； Lin等人，Cancer Res68:664-673(2008)；Stahl等人，Cancer Res 64:7002-7010(2004)；Tsao等人，J InvestDermatol 122:337-341(2004)]组合。
表A.所选择的黑素细胞和黑素瘤细胞的基因型
抗生素组合物
在某些实施方案中，本公开内容提供了包含寡核苷酸修饰的纳米颗粒和媒介物的抗生素组合物，其中所述寡核苷酸与原核生物基因的靶非编码序列充分互补，所述寡 核苷酸将在允许杂交的条件下与所述靶序列杂交。在多个实施方案中，配制抗生素组 合物用于以治疗有效量给有此需要的哺乳动物施用以治疗原核细胞感染。在某些方面， 哺乳动物是人。
在多个实施方案中，涉及寡核苷酸修饰的纳米颗粒与原核生物基因的杂交抑制(或 阻止)原核细胞的生长。因此，涉及寡核苷酸修饰的纳米颗粒与原核生物基因的杂交在其中原核生物为细菌的方面导致抑菌或杀菌效应。在其中杂交在体内发生的方面，与 在不存在与寡核苷酸修饰的纳米颗粒的接触的情况下原核细胞的生长相比较，原核细 胞的生长被抑制约5％。在多个方面，与在不存在与寡核苷酸修饰的纳米颗粒的接触 的情况下原核细胞的生长相比较，原核细胞的生长被抑制约10％、约15％、约20％、 约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、 约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约1/2、约2/3、约3/4、约4/5、 约5/6、约6/7、约7/8、约8/9、约9/10、约19/20、约49/50或更多。
在其中杂交在体外发生的方面，与在不存在与寡核苷酸修饰的纳米颗粒的接触的情况下原核细胞的生长相比较，原核细胞的生长被抑制约5％。在多个方面，与在不 存在与寡核苷酸修饰的纳米颗粒的接触的情况下原核细胞的生长相比较，原核细胞的 生长被抑制约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、 约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、 约95％、约1/2、约2/3、约3/4、约4/5、约5/6、约6/7、约7/8、约8/9、约9/10、约 19/20、约49/50或更多。
无论抑制是体内还是体外的，本领域技术人员都可利用常规技术测定原核细胞生长的抑制水平。例如，通过获得一组样品(例如，在体内抑制的情况下体液或在体外抑 制的情况下液体培养物样品)进行原核细胞的数目的直接定量，其中在一段时间内收集 样品，在允许生长的固体培养基上培养样品，然后计数所获得的能够生长的原核细胞 的数目。更迟时间点上原核细胞的数目对更早时间点上原核细胞的数目产生原核细胞 生长的百分比抑制。
在某些实施方案中，寡核苷酸修饰的纳米颗粒与原核生物基因的杂交抑制由原核生物基因编码的功能性原核生物蛋白质的表达。如本文中所使用的“功能性原核生物 蛋白质”是指由原核生物基因编码的全长野生型蛋白质。在一个方面，与未与寡核苷 酸修饰的纳米颗粒接触的细胞相比较，功能性原核生物蛋白质的表达被抑制约5％。 在多个方面，与未与寡核苷酸修饰的纳米颗粒接触的细胞相比较，功能性原核生物蛋 白质的表达被抑制约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、 约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、 约90％、约95％、约1/2、约2/3、约3/4、约4/5、约5/6、约6/7、约7/8、约8/9、约 9/10、约19/20、约49/50或更多。换句话说，所提供的方法包括导致靶基因产物的表 达的任何程度的抑制的方法。
在相关方面，寡核苷酸修饰的纳米颗粒与原核生物基因的杂交抑制了原核细胞生长所必需的功能性蛋白质的表达。在一个方面，原核细胞生长所必需的功能性原核生 物蛋白质的表达与未与寡核苷酸修饰的纳米颗粒接触的细胞相比较被抑制约5％。在 多个方面，与未与寡核苷酸修饰的纳米颗粒接触的细胞相比较，原核细胞生长所必需 的功能性原核生物蛋白质的表达被抑制约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、 约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、 约80％、约85％、约90％、约95％、约1/2、约2/3、约3/4、约4/5、约5/6、约6/7、 约7/8、约8/9、约9/10、约19/20、约49/50或更多。
生长所必需的原核生物蛋白质包括但不限于革兰氏阴性基因产物、革兰氏阳性基因产物、细胞周期基因产物、参与DNA修复的基因产物、细胞分裂基因产物、参与 蛋白质合成的基因产物、细菌回旋酶和酰基载体基因产物。这些种类在下文中将详细 论述。
本公开内容还涉及抗生素组合，其中与原核生物基因的靶非编码序列的杂交导致具有改变的活性的由原核生物基因编码的蛋白质的表达。在一个方面，由原核生物基 因编码的蛋白质的活性与未与寡核苷酸修饰的纳米颗粒接触的原核细胞中所述蛋白质 的活性相比较降低约5％。在多个方面，原核生物蛋白质的活性与未与寡核苷酸修饰 的纳米颗粒接触的原核细胞中所述蛋白质的活性相比较被抑制约10％、约15％、约 20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约 65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约 98％、约99％或约100％。在另一个方面，由原核生物基因编码的蛋白质的活性与未与 寡核苷酸修饰的纳米颗粒接触的原核细胞中所述蛋白质的活性相比较增加约5％。在 多个方面，原核生物蛋白质的活性与未与寡核苷酸修饰的纳米颗粒接触的原核细胞中 所述蛋白质的活性相比较增加约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、 约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、 约85％、约90％、约95％、约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约 7倍、约8倍、约9倍、约19倍、约49倍或更多倍。
原核细胞中蛋白质的活性作为几个参数的函数增加或降低，所述参数包括但不限于连接至纳米颗粒的寡核苷酸的序列、被靶向的原核生物基因(和由所述基因编码的蛋 白质)以及纳米颗粒的大小。
在多个实施方案中，预期本公开内容的抗生素组合物抑制原核生物基因的转录。在某些实施方案中，预期本公开内容的抗生素组合物抑制原核生物基因的翻译。
在某些实施方案中，抗生素组合物与赋予对抗生素的抗性的原核生物基因的靶非编码序列杂交。此类基因对于本领域技术人员来说是已知的并且论述于例如Liu等人，Nucleic Acids Research 37:D443–D447，2009(通过引用整体并入本文)中。在某些方面，抗生素组合物与赋予对抗生素的抗性的原核生物基因的靶非编码序列的杂交导致增加 原核生物对抗生素的易感性。在一个方面，原核生物对抗生素的易感性与未与抗生素 组合物接触的原核生物的易感性相比较增加约5％。在多个方面，原核生物对抗生素 的易感性与未与抗生素组合物接触的原核生物的易感性相比较增加约10％、约15％、 约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、 约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约1倍、约2倍、 约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约19倍、约49倍或 更多倍。对抗生素的相对易感性可由本领域技术人员使用如本文中所描述的常规技术 来测定。
与抗生素的联合治疗
在某些实施方案中，配制包含寡核苷酸修饰的纳米颗粒缀合物的抗生素组合物以与抗生素试剂各自以治疗有效量组合施用。
如本文中所使用的术语“抗生素试剂”意指具有抑制细菌或其他微生物的生长或杀伤它们的能力的一组化学物质中的任一种，主要用于治疗感染性疾病。参见，例如， 美国专利7,638,557(通过引用整体并入本文)。抗生素试剂的实例包括但不限于青霉素 G、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氨苄西林、阿莫西林、 替卡西林、羧苄西林、美洛西林、阿洛西林、哌拉西林、亚胺培南、氨曲南、头孢噻 吩、头孢克洛、头孢西丁、头孢呋辛、头孢尼西、头孢美唑、头孢替坦、头孢丙烯、 氯碳头孢、头孢他美、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢 吡肟、头孢克肟、头孢泊肟、头孢磺啶、氟罗沙星、萘啶酸、诺氟沙星、环丙沙星、 氧氟沙星、依诺沙星、洛美沙星、西诺沙星、多西环素、米诺环素、四环素、阿米卡 星、庆大霉素、卡那霉素、奈替米星、妥布霉素、链霉素、阿奇霉素、克拉霉素、红 霉素、依托红霉素、琥乙红霉素、葡庚糖酸红霉素、乳糖酸红霉素、硬脂酸红霉素、万古霉素、替考拉宁、氯霉素、克林霉素、甲氧苄啶、磺胺甲噁唑、呋喃妥因、利福 平、莫匹罗星、甲硝唑、头孢氨苄、罗红霉素、Co-amoxiclavuanate、哌拉西林与他唑 巴坦的组合；以及其各种盐、酸、碱和其他衍生物。抗菌性抗生素试剂包括但不限于 青霉素类，头孢菌素类、碳头孢烯类、头霉素类、碳青霉烯类、单环内酰胺类 (monobactams)、氨基糖苷类、糖肽类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类和氟喹诺酮 类(fluoroquinolones)。
剂量给药和药物组合物
如本文中所使用的，术语“治疗有效量”是指足以治疗、改善或预防已鉴定的疾病或状态或展示可检测的治疗、预防或抑制效应的组合物的量。可通过例如临床状态的 改善、症状的减轻或通过本文中描述的测定来检测效应。受试者的精确有效量将取决 于受试者的体重、大小和健康；状态的性质和程度；以及被选择用于施用的抗生素组 合物或组合物的组合。用于给定状况的治疗有效量可通过在临床医生的技能和判断内 的常规实验来确定。
可将本文中描述的组合物与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂一起配制于药物组合物中。可通过允许治疗原核生物感染或状态的任何途径施用化合物或组合物。 如本文中所描述的，提供了包含ON-NP和媒介物的本公开内容的组合物，其用于局部 施用。施用的另外途径是口服施用。此外，可使用任何标准施用途径(包括胃肠外例如 静脉内、腹膜内、肺内、皮下或肌内、鞘内、经皮肤、经直肠、经口、经鼻或通过吸 入)将化合物或组合物递送至患者。还可从本文中描述的试剂制备缓释制剂以在胃肠道 中获得与体液接触的活性剂的受控释放，和在血浆中提供基本上恒定且有效的活性剂 水平。为此目的可将晶体形式埋植在生物可降解聚合物、水溶性聚合物或两者的混合 物以及任选地适当的表面活性剂的聚合物基质中。埋植在本说明书中可意指将微颗粒 掺入聚合物的基质。也可通过经由已知的分散剂或乳剂包被技术封装分散的微颗粒或 乳化的微滴来获得控释制剂。
施用可采取单次剂量施用的形式，可在一段时间内以分次剂量或以连续释放制剂或施用方法(例如，泵)来施用实施方案的化合物。然而，给受试者施用实施方案的化 合物，应当选择所施用的化合物的量和所选择的施用途径以允许有效地治疗疾病状态。
在实施方案中，取决于施用的具体模式和剂型，可用药学上可接受的赋形剂例如载体、溶剂、稳定剂、佐剂、稀释剂等配制药物组合物。通常应当配制药物组合物以 获得生理上相容的pH，并且药物组合物可在约3的pH至约11的pH，优选约pH 3 至约pH 7的范围内变化，这取决于施用的制剂和途径。在可选的实施方案中，可以优 选地将pH调整至约pH5.0至约pH 8的范围。更具体地，药物组合物在多个方面包含 治疗或预防有效量的本文中描述的至少一种组合物和一种或多种药学上可接受的赋形 剂。如本文中所描述的，药物组合物可任选地包含本文中描述的化合物的组合。
术语“药学上可接受的赋形剂”是指用于药物试剂(例如本文中描述的化合物)的施 用的赋形剂。所述术语是指可被施用而无异常毒性的任何药用赋形剂。
药学上可接受的赋形剂部分由待施用的具体组合物以及由用于施用组合物的具体 方法来确定。因此，存在多种药物组合物的适当制剂(参见，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences)。
适当的赋形剂可以是载体分子，其包括大的缓慢代谢的大分子例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和灭活的病毒颗粒。其他示例性赋形 剂包括抗氧化剂(例如，抗坏血酸)、螯合剂(例如，EDTA)、碳水化合物(例如，糊精、 羟基烷基纤维素和/或羟基烷基甲基纤维素)、硬脂酸、液体(例如，油、水、盐水、甘 油和/或乙醇)、湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。脂质体也包括在药学上可接受的赋 形剂的定义中。
此外，药物组合物可以以无菌可注射剂的形式存在，例如无菌可注射水性乳剂或油状混悬液。该乳剂或混悬液可由本领域技术人员使用适当的分散剂或湿润剂和悬浮 剂来配制。无菌注射剂也可以是无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射液 或混悬液，例如1,2-丙烷-二醇中的溶液。
还可将无菌注射剂制备为冻干的粉剂。在可使用的可接受的溶剂当中有水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发性油可用作溶剂或悬浮介质。为此目的， 可使用任何无刺激性的不挥发性油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯类。此外，脂肪 酸(例如，油酸)同样可用于可注射剂的制备。
原核生物蛋白质的抑制
在某些方面，本公开内容提供了靶向特定核酸的方法。任何类型的原核生物核酸可被靶向，并且可将所述方法例如用于抑制功能性原核生物基因产物的产生。可被本 发明的方法靶向的核酸的实例包括但不限于基因和原核生物RNA或DNA。
对于原核生物靶核酸，在多个方面，核酸是从基因组DNA转录的RNA。
从例如在其中发现靶原核生物或对于其期望抑制原核生物蛋白质的个体的体液样 品，或在于其中发现靶原核生物或对于其期望抑制原核生物蛋白质的个体中利用本领域内公知的成像技术体内测定抑制的程度。可选地，通过定量与在较早时间点存在于 细胞培养物或生物中的原核生物的量相比较保留在细胞培养物或生物中的原核生物的 量来体内测定抑制的程度。
在其中形成三链体复合物的实施方案中，预期将突变引入原核生物基因组。在此类实施方案中，寡核苷酸修饰的纳米颗粒缀合物包含突变并且三链体复合物的形成引 发了连接至纳米颗粒的寡核苷酸与原核生物基因组的链之间的重组事件。
寡核苷酸的杂交和设计
本公开内容的寡核苷酸，当与靶多核苷酸序列杂交时，具有至少约45℃，通常约50℃至60℃的Tm，虽然Tm可以更高例如65℃。在其中靶为原核生物多核苷酸的方面， 在下文中考虑原核生物靶多核苷酸序列和原核生物mRNA靶多核苷酸序列的选择。
在一个实施方案中，设计本发明的寡核苷酸用以在生理条件下与靶寡核苷酸杂交， Tm显著高于37℃，例如至少45℃以及在某些方面，约60℃-80℃。设计寡核苷酸以使 其对核酸具有高结合亲和力以及在一个方面，与靶寡核苷酸序列100％互补，或其可 包含错配。提供了方法，其中寡核苷酸与靶寡核苷酸具有大于95％的互补性，与靶寡 核苷酸具有大于90％的互补性，与靶寡核苷酸具有大于80％的互补性，与靶寡核苷酸 具有大于75％的互补性，与靶寡核苷酸具有大于70％的互补性，与靶寡核苷酸具有大 于65％的互补性，与靶寡核苷酸具有大于60％的互补性，与靶寡核苷酸具有大于55％ 的互补性或与靶寡核苷酸具有大于50％的互补性。
应理解，本领域技术人员可容易地确定寡核苷酸修饰的纳米颗粒缀合物的适当的靶以及使用本领域内已知的技术设计和合成寡核苷酸。可通过获得例如目的靶核酸的 序列(例如，来自GenBank)，然后利用例如MacVector 6.0程序、ClustalW算法、BLOSUM 30矩阵和缺省参数(其包括开放缺口罚分10和延伸缺口罚分5.0)将其与其他核酸序列 对齐以进行核酸比对来进行鉴定靶。
使用本公开内容的方法，任何必需原核生物基因被考虑为靶基因。如上所述，可使用多种方法包括由Gerdes针对大肠杆菌所描述的方法[Gerdes等人，J Bacteriol. 185(19):5673-84，2003]确定任何原核生物种类的必需原核生物基因。许多必需基因在 整个细菌界是保守的，从而在靶选择中提供了另外的指导。可利用可容易获得的生物 信息学资源例如由美国国家生物技术信息中心(NCBI)维持的生物信息学资源来鉴定靶 基因序列。可获得大量微生物种类的完整参照基因序列和已鉴定的必需细菌基因的序 列。在一个方面也可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得菌株。可使用适合于任何 给定的种的培养基和条件建立简单细胞培养方法来测定寡核苷酸修饰的纳米颗粒缀合 物的抗菌活性。
随后在用于治疗人感染之前，在动物模型或兽医学动物中测试显示最佳活性的寡核苷酸修饰的纳米颗粒缀合物。
治疗靶
细胞分裂的靶序列和细胞周期靶蛋白
设计本公开内容的寡核苷酸以使其与编码必需原核生物基因的原核生物核酸的序 列杂交。示例性基因包括但不限于细胞分裂所需的基因、细胞周期蛋白、或脂质生物 合成或核酸复制所需的基因。一旦确定基因的必需性，任何必需细菌基因可以为靶。 确定生物中哪个基因是必需的一个方法是使用如[Gerdes等人，J Bacteriol.185(19): 5673-84，2003，通过引用整体并入本文]所描述的遗传足迹技术。在该报导中，620个 大肠杆菌基因被鉴定为对于在强健的需氧生长所需的培养条件下生长是必需的，3,126 个基因被鉴定为非必需的。进化背景分析显示数量可观的必需大肠杆菌基因在整个细 菌界中是保守的，特别是用于至关重要的细胞过程例如DNA复制、细胞分裂和蛋白 质合成的基因的亚组。
在多个方面，本公开内容提供了寡核苷酸，其为有效地稳定且特异性结合编码必需细菌蛋白质的靶序列的核酸序列，其通常包括下列序列：(1)特异于给定的细菌种类 的特定菌株例如与食物中毒相关的大肠杆菌菌株例如O157:H7的序列(参见美国专利 申请号20080194463的表1，通过引用整体并入本文)；(2)两种或更多种细菌共有的序 列；(3)两个相关的细菌属(即，相似的系统发生来源的细菌)共有的序列；(4)通常在革 兰氏阴性细胞中保守的序列；(5)通常在革兰氏阳性细胞中保守的序列；或(6)编码必 需细菌蛋白质的核酸序列的共有序列。
通常，用于利用本公开内容的方法调节基因表达的靶包括在活跃的原核生物生长或复制过程中表达的原核生物核酸，例如从细胞分裂和细胞壁合成(分裂细胞壁或dcw) 基因簇的基因，包括但不限于zipA、sulA、secA、dicA、dicB、dicC、dicF、ftsA、ftsI、 ftsN、ftsK、ftsL、ftsQ、ftsW、ftsZ、murC、murD、murE、murF、murg、minC、minD、 minE、mraY、mraW、mraZ、seqA和ddlB转录的mRNA序列。关于大肠杆菌的细菌 细胞分裂和细胞周期的一般综述，分别参见[Bramhill，Annu Rev Cell Dev Biol.13: 395-424，1997]和[Donachie，AnnuRev Microbiol.47:199-230，1993]，将两者通过引 用并入本文。其他靶包括参与脂质生物合成(例如acpP)和复制(例如gyrA)的基因。
大肠杆菌的细胞分裂牵涉所有3层细胞被膜(胞质膜、坚硬的肽聚糖层和外膜)的协同内陷。隔膜的缢缩将细胞分隔成两个区室并且使复制的DNA分离。至少9种必 需基因产物参与了该过程：ftsZ、ftsA、ftsQ、ftsL、ftsI、ftsN、ftsK、ftsW和zipA[Hale 等人，JBacteriol.181(1):167-76，1999]。涉及的蛋白质靶是下文中论述的3个靶，特 别是下文中论述的GyrA和AcpP靶。
FtsZ(大肠杆菌中最早的必需细胞分裂基因之一)是可溶性微管蛋白样GTP酶，其在细菌细胞的分裂位置上形成膜结合的环。该环据认为驱动细胞缢缩，并且似乎影响 细胞壁内陷。FtsZ直接与大肠杆菌中称为zipA的新型整合内膜蛋白(介导大肠杆菌的 细胞分裂的中隔环结构的主要成分)结合[Lutkenhaus等人，Annu Rev Biochem.66: 93-116，1997]。
GyrA是指细菌回旋酶的亚基A和从而为其基因。细菌回旋酶是控制细胞中DNA 的超螺旋水平并且为DNA复制所需的细菌DNA拓扑异构酶之一。
AcpP编码酰基载体蛋白(脂质生物合成中的必需辅因子)。脂肪酸生物合成途径需要热稳定性辅因子酰基载体蛋白结合该途径中的中间体。
对于这3种蛋白中的每一个，美国专利申请号20080194463的表1提供了示例性 细菌序列，所述序列包含针对许多重要病原菌的每一种的靶序列。基因序列来源于每 一个菌株的GenBank参照全基因组序列。
原核生物16S核糖体RNA的靶序列
在一个实施方案中，设计本发明的寡核苷酸以使其在生理条件下与编码细菌16SrRNA核酸序列的序列杂交，Tm显著高于37℃，例如至少45℃，优选60℃-80℃。
更具体地，寡核苷酸具有有效地稳定且特异性结合靶16S rRNA基因序列的序列，其通常具有如下特征中的一个或多个：(1)在16s rRNA的双链序列中发现的序列，例 如，16S rRNA序列的肽基转移酶中心、α-八叠球菌环和mRNA结合序列；(2)在细菌 16s rRNA的单链序列中发现的序列；(3)特异于给定的细菌种类的特定菌株(即与食物 中毒相关的大肠杆菌的菌株)相关的序列；(4)特异于细菌的特定种类的序列；(5)两个 或更多个细菌种类共有的序列；(6)两个相关的细菌属(即，相似系统发生来源的细菌属) 共有的序列；(7)通常在革兰氏阴性细菌16S rRNA序列中保守的序列；(6)通常在革 兰氏阳性细菌16S rRNA序列中保守的序列；或(7)细菌16S rRNA序列的共有序列。
在美国专利No.6,677,153(通过引用整体并入本文)的表1中提供了示例性细菌和相关的16S rRNA序列的GenBank登录号。
大肠杆菌(E.coli)是革兰氏阴性细菌，其是胃肠道的正常菌群的部分。存在数百个 大肠杆菌菌株，其大部分是无害的并且生活在健康人和动物的胃肠道中。目前，存在 4类公认的致泻性大肠杆菌(“EEC组”)，其引起人的胃肠炎。在这些菌株当中有肠病 原(EPEC)菌株和其毒力机制与典型的大肠杆菌肠毒素类的分泌相关的菌株。大肠杆菌 的此类菌株可引起多种疾病，包括与胃肠道和泌尿道的感染相关的疾病、败血病、肺 炎和脑膜炎。抗生素对某些菌株是无效的并且不一定预防感染的复发。
例如，大肠杆菌菌株0157:H7据估计每年在美国引起10,000至20,000例感染(美国国家疾病控制与预防中心)。出血性大肠炎是由大肠杆菌O157:H7引发的急性病。学 龄前儿童和老人处于发生严重的并发症的最大风险中。大肠杆菌菌株0157:H7最近被 报导为食用太平洋西北部的快餐店的未煮熟的汉堡包的4名儿童的死亡原因[参见，例 如，Jackson等人，Epidemiol.Infect.120(1):17-20，1998]。
致泻性大肠杆菌菌株的示例性序列包括GenBank登录号X97542、AF074613、Y11275和AJ007716。
鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)是引起在临床上范围从局部胃肠道感染、胃 肠炎(腹泻、腹部绞痛和发烧)至为严重全身性疾病的肠热病(包括伤寒)的各种状态的革 兰氏阴性细菌。沙门局属感染也引起显著的家畜损失。
作为革兰氏阴性杆菌的典型特征，沙门菌属某些种的细胞壁包含在细胞裂解后释放并且可用作内毒素的复杂脂多糖(LPS)结构，其促成生物体的毒力。
由于沙门菌属存活在未完全煮熟的肉类和畜产品中，因此污染的食物是非伤寒沙门菌感染的主要传播方式。除了许多其他驯养和野生动物外，最常见的动物来源是鸡、 火鸡、猪和牛。由沙门菌属某些种引起的伤寒和其他肠热病的流行病学与被人粪便污 染的水相关。
用于伤寒的疫苗是可获得的并且是部分有效的；然而，还没有针对非伤寒沙门菌感染的疫苗。非伤寒沙门菌病通过卫生屠宰条例以及食物的充分蒸煮和冷藏来进行控 制。抗生素是治疗全身性疾病所必需的，并且氨苄青霉素的使用已获得一定的成功。 然而，在利用过量抗生素治疗的患者、在胃手术后利用免疫抑制药治疗的患者中，以 及在溶血性贫血、白血病、淋巴瘤或AIDS患者中，沙门菌感染仍然是个医学问题。
假单胞菌属某些种(Pseudomonas spp.)是能动的革兰氏阴性杆菌，其在临床上是很 重要的，因为它们抗大多数抗生素，并且是医院获得性(医院的)感染的主要原因。感 染最常见于免疫受损个体、烧伤受害者、呼吸器上的个体、具有留置导管的个体、IV 麻醉剂使用者和患有慢性肺病(例如，囊性纤维化)的个体中。虽然感染在健康个体中 是罕见的，但其可在任何位置发生并且导致泌尿道感染、败血病、肺炎、咽头炎和许 多其他问题，并且治疗通常失败，伴随更大的死亡率。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是具有单极运动性的革兰氏阴性需氧杆状 细菌。条件性人致病菌—铜绿假单胞菌也是条件性植物致病菌。与其他假单胞菌一样， 铜绿假单胞菌分泌多种色素。铜绿假单胞菌的最终临床鉴定可包括鉴定绿脓菌素和荧光素的产生以及生物体在42℃下生长的能力。铜绿假单胞菌也能够在柴油和航空燃料 中生长，其因此而被称为烃利用微生物(或“HUM虫”)，造成微生物腐蚀。
霍乱弧菌(Vibrio cholera)是革兰氏阴性杆菌，其感染人并且引起霍乱，通过恶劣卫 生传播的疾病，导致污染水供应。霍乱弧菌可寄居在人小肠中，其在小肠中产生破坏横穿粘膜层的离子转运，从而引起腹泻和失水的毒素。感染了霍乱弧菌的个体需要用 含有电解质的溶液静脉内或经口再水合(rehydration)。疾病通常是自限性的；然而，死 亡可因脱水和必需电解质的丢失而发生。已证明抗生素例如四环素缩短病程，并且口 服疫苗目前正在开发中。
淋病奈瑟球菌(neisseria gonorrhoeae)是革兰氏阴性球菌，其是常见性传播疾病—淋 病的病原体。淋病奈瑟球菌可改变其表面抗原，从而阻止针对再感染的免疫的发展。 在美国每年报导将近750,000例淋病，每年估计另有750,000例未报导的病例，大多数存在于青少年和年轻成年人中。氨苄青霉素、阿莫西林或某些类型的青霉素过去常被 推荐用于治疗淋病。然而，抗青霉素淋病的发病率日益增加，通过注射给药的新型抗 生素例如头孢曲松或壮观霉素现用于治疗大多数淋球菌感染。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是革兰氏阳性球菌，其通常寄居在人鼻子 中并且有时发现于皮肤上。葡萄球菌可引起血流感染、肺炎和医院交叉感染。金黄色葡萄球菌可引起严重食物中毒，许多菌株在食物中生长并且产生外毒素。葡萄球菌对 普通抗生素例如万古霉素的抗性已在美国出现并且扩大为社区和医院环境中的主要公 共卫生挑战。最近，也在日本鉴定了抗万古霉素金黄色葡萄球菌分离株。
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是革兰氏阳性细菌，其是肺结核、有时 残疾性和致命性疾病的病原体。肺结核在全球正在上升并且是死于单一感染性疾病的 第一大原因(当前每年300万人的死亡率)。其影响人体的数个器官(包括脑、肾和骨)，然而，肺结核最常见地影响肺。
在美国，约1000万个体感染了结核分枝杆菌，如由阳性皮肤测试所表明的，每年约26,000例活动性疾病的新病例。肺结核(TB)病例的增加与具有活动感染的人的 HIV/AIDS、无家可归、药物滥用及迁入相关。药物敏感性TB的当前治疗计划包括服 用两种或四种药(例如，异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇或链霉素)进行6至9 个月的时期，因为所有TB病菌不能被单种药物消灭。此外，结核分枝杆菌的抗药性 菌株和多抗药性菌株的观察正在上升。
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)(H.pylori)是微量需氧的、革兰氏阴性的、缓慢生 长的有鞭毛生物，其具有螺旋或S形形态，感染胃壁。幽门螺杆菌是与慢性浅表性胃炎、消化性溃疡病和导致胃腺癌的慢性萎缩性胃炎相关的人胃病原体。幽门螺杆菌是 人中最常见的慢性细菌感染之一并且在90％以上的具有活动性胃炎的患者中被发现。 目前的治疗包括利用铋、甲硝唑和四环素或阿莫西林的三联药物疗法(triple drug therapy)，其在大多数情况下根除幽门螺杆菌。三联疗法的问题包括患者的顺从性、副 作用和甲硝唑抗性。显示希望的二联疗法的可选方案是阿莫西林加甲硝唑或奥美拉唑 加阿莫西林。
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是革兰氏阳性球菌并且是细菌性肺炎以及 中耳感染(中耳炎)和脑膜炎的最常见原因之一。在美国每年肺炎球菌疾病占约50,000 例菌血症；3,000例脑膜炎；100,000-135,000例住院；和700万例中耳炎。肺炎球菌 感染每年在美国引起据估计40,000例死亡。小于2岁的儿童、超过65岁的成年人和 具有基础医学状态(包括例如充血性心脏病、糖尿病、肺气肿、肝病、镰刀状细胞、HIV) 的任何年龄的人以及生活在特殊环境(例如医护疗养所和长期护理设施)中的人处于感 染的高风险中的人。
抗药肺炎链球菌菌株在美国已变得常见，许多抗青霉素的肺炎球菌也抗其他抗微生物药例如红霉素或甲氧苄啶-磺胺甲噁唑。
苍白密螺旋体(Treponema pallidum)是引起梅毒的螺旋菌(spirochete)。苍白密螺旋 体是引起梅毒、雅司病和非性病性地方性梅毒或品他病的唯一病原体。苍白密螺旋体不能在体外生长并且在哺乳动物细胞不存在的情况下复制。初始感染在感染的位置引 起溃疡；然而，细菌移动至整个身体，随时间的过去破坏许多器官。在其晚期，未治 疗的梅毒，虽然不会传播，但可引起严重心脏畸形、精神障碍、失明、其他神经病学 问题和死亡。
梅毒通常通过注射施用青霉素来治疗。其他抗生素可获得用于对青霉素过敏或对常用量的青霉素无反应的患者。在梅毒的所有分期中，恰当的治疗将治愈疾病，但在 晚期梅毒中，已对身体器官产生的损害不能逆转。
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)在美国是最常见的细菌性传播疾病并且据估计 每年发生400万例新病例。最高感染率在15至19岁之间。衣原体是非淋菌性尿道炎(NGU)、宫颈炎、细菌性阴道炎和盆腔炎性疾病(PID)的主要原因。衣原体感染可具有 非常轻的症状或根本无症状；然而，如果不治疗，衣原体感染可导致对生殖器官(特别 是在妇女中)的严重损害。抗生素例如阿奇霉素、红霉素、氧氟沙星、阿莫西林或多西 环素通常被开处方来治疗衣原体感染。
汉赛巴尔通体(Bartonella henselae)猫抓热(Cat Scratch Fever)(CSF)或猫抓病(cat scratch disease)(CSD)是通过暴露于猫获得的人疾病，其由原来称为亨氏罗卡利马氏体 菌(Rochalimaea henselae)但目前称为汉赛巴尔通体的革兰氏阴性杆菌引起。症状包括 发热和淋巴结肿大并且CSF在人中通常是相对良性的自限性疾病，然而，汉赛巴尔通 体产生的感染可在免疫受损的人中产生不同的临床症状，包括菌血症引起的急性热性疾病、杆菌性血管瘤病、紫癜肝病、杆菌性脾炎(bacillary splenitis)和其他慢性病表现例如AIDS脑病。利用抗生素例如多西环素、红霉素、利福平、青霉素、庆大霉素、 头孢曲松、环丙沙星和阿奇霉素治疗所述疾病。
流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)(H.influenza)是革兰氏阴性细菌的家族；其6 个种类是已知的，大多数流感嗜血菌相关疾病由B型或“HIB”引起。在HIB的疫苗 被开发出来之前，HIB是中耳炎、窦感染、支气管炎的常见原因、脑膜炎的最常见原 因以及在肺炎、脓毒性关节炎(关节感染)、蜂窝织炎(软组织的感染)和心包炎(包围心 脏的膜的感染)的情况下频繁犯病的最常见原因。流感嗜血菌B型细菌遍布人中并且通 常生活在咽喉和鼻中而不引起疾病。5岁以下未接种的儿童处于患HIB疾病的风险中。 脑膜炎和由流感嗜血菌感染引起的其他严重感染可导致脑损伤或死亡。
痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)(Shigella dys.)是革兰氏阴性杆菌，其引起痢疾。在 结肠中，细菌进入粘膜细胞并且在粘膜细胞内分裂，从而导致广泛的炎症反应。志贺 菌感染可引起严重腹泻，这可导致脱水并且对于非常年幼、非常年老或慢性疾病可能是非常危险的。痢疾志贺菌形成有效力的毒素(志贺毒素)，其具有细胞毒性、肠毒性、 神经毒性并且用作蛋白质合成的抑制剂。对抗生素例如氨苄青霉素和TMP-SMX的抗 性已产生，然而利用更新更贵的抗生素例如环丙沙星、诺氟沙星和依诺沙星的治疗仍 然有效。
李斯特菌属(Listeria)是在人和动物粪便中发现的革兰氏阳性的能运动的细菌的 属。单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)引起这样的疾病如李斯特菌病、脑 膜脑炎和脑膜炎。该生物是由食物传播病原体导致的死亡(特别是在孕妇、新生儿、老人和免疫受损个体中)的最主要原因之一。可在环境例如腐烂植物质、污水、水和土壤 中发现其，并且其可在极端的温度和盐浓度下存活，从而使其成为极其危险的食物传 播的病原体，特别是在未重新加热的食物上。细菌可从肠中感染的位置扩散至中枢神 经系统和胎儿-胎盘单元。脑膜炎、胃肠炎和败血病可因感染而引起。在牛和绵羊中， 李斯特菌属感染引起脑炎和自然流产。
奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)是与大肠杆菌具有远缘关系的肠革兰氏阴性共生 生物。其通常寄居在人尿道中，但为作为插入导管的个体的泌尿道感染的第一大原因的条件致病菌。奇异变形杆菌具有两个罕见特征：1)其具有非常快速的运动性，这使 其本身表现为在培养平板上的群游现象；和2)其产生尿素酶，这赋予其降解尿素并且 在泌尿生殖道中存活的能力。
鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)是瘟疫(淋巴腺鼠疫和肺鼠疫)(已在全世界杀死数百 万人的毁灭性疾病)的病原体。所述生物可在大面积感染过程中通过感染的跳蚤叮咬从 大鼠传播给人或通过空气在人之间传播。鼠疫耶尔森菌是只需极少数量就可引发疾病 的极端病原性生物，并且如果不治疗通常是致命的。该生物是肠侵染性的，并且可在 全身性播散至整个宿主之前在巨噬细胞中存活和繁殖。
炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)也称为炭疽。当人与被污染的动物接触时他们被 感染。炭疽不因人与人之间的接触而传播。该疾病的3种形式反映了感染的位置，其包括影响皮肤的(皮肤)、影响肺的(肺)和影响肠的形式。如果不治疗，肺和肠感染通常 是致命的。孢子被巨噬细胞摄入并且开始内化进入吞噬溶酶体(膜状区室)，然后开始 萌发。一旦感染的巨噬细胞裂解，细菌被释放进入血流，然后它们开始快速繁殖，扩 散到整个循环和淋巴系统，这是导致感染性休克、呼吸性窘迫和器官衰竭的过程。该 病原体的孢子已被用作恐怖武器。
鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)是革兰氏阴性的需氧细菌，其引起马鼻 疽，主要在马、骡和驴中发生的感染性疾病。其极少与人感染相关并且更常见地见于驯养动物中。该生物与类鼻疽伯霍尔德杆菌(B.pseudomallei)相似并且区别在于是无运动的。所述病原体为宿主适应性的并且未见于其宿主外部环境中。如果不用抗生素治 疗，马鼻疽通常是致命的，并且传播可通过空气，或更常见地当与感染的动物接触时 发生。快速发作肺炎、菌血症(所述生物通过血液传播)、脓疱和死亡在感染过程中是 常见结果。毒力机制还不十分清楚，虽然与来自鼠伤寒沙门菌的分泌系统相似的III 型分泌系统是必需的。不存在被认为具有作为生物恐怖试剂的该潜在危险生物的疫苗。 该生物的基因组与相关类鼻疽伯霍尔德杆菌(Bukholderia pseudomallei)(在下文中)相比 较携带大量插入序列和大量可在细胞表面蛋白质的抗原变异中起作用的简单序列重 复。
类鼻疽伯霍尔德杆菌(Burkholderia pseudomallei)是革兰氏阴性细菌，其引起人和动 物的类鼻疽(meliodosis)。类鼻疽是在亚洲、泰国和澳大利亚的某些部分发现的疾病。 类鼻疽伯霍尔德杆菌通常是土壤生物，但由于条件致病菌可在易感个体例如患糖尿病的个体中引起疾病，因此已将其从水稻田和潮湿的热带土壤回收。该生物可存在于细 胞内，并且引起肺炎和菌血症(细菌通过血流传播)。潜伏期可以特别长，发病前感染 可达数十年，治疗可能要使用抗生素数月之久，复发是常见现象。细胞间传播可通过 在细胞的一极诱导肌动蛋白聚合(从而允许移动通过细胞质并且从细胞到细胞)来发 生。该生物携带许多小序列重复，其可促进抗原变异，与对于鼻疽伯克霍尔德氏菌(B. mallei)基因组发现的类似。
洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)是由至少7个不同亚种组成的革兰氏阴性 细菌，其包括多噬伯克霍尔德菌(Burkholderia multivorans)、越南伯克霍尔德菌(Burkholderia vietnamiensis)、Burkholderia stabilis、新洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)和Burkholderia ambifaria。洋葱伯霍尔德杆菌是重要的人病原体，其最常 见地在患有基础肺病(例如囊性纤维化或免疫问题(例如(慢性肉芽肿病))的人中引起肺 炎。洋葱伯霍尔德杆菌通常发现于水和土壤中并且在潮湿的环境中可存活很长的时期。 人之间的传播已有记录；因此，针对囊性纤维化患者的许多医院、诊所和营地(camp) 已制定严格隔离制度来预防洋葱伯霍尔德杆菌。具有细菌的个体在隔离区比在未限制 传播的地方通常得到更好的治疗。这是因为洋葱伯霍尔德杆菌感染可导致肺功能的快 速衰落，从而导致死亡。洋葱伯霍尔德杆菌的诊断包括从痰培养物分离细菌。治疗非 常困难，因为洋葱伯霍尔德杆菌天然抗许多普通抗生素，包括氨基糖苷类(例如妥布霉 素)和多粘菌素B。治疗通常包括多种抗生素并且可包括头孢他啶、多西环素、哌拉西 林、氯霉素和复方磺胺甲噁唑。
土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)最初以瘟疫样疾病的病原体闻名，20世 纪初Edward Francis发现其影响加利福尼亚州图莱里县(Tulare County)的松鼠。该生物 现具有它的同名物。所述疾病称为土拉菌病并且在整个记录的历史中一直闻名。该生物可通过感染的肉或通过浮粒从感染的蜱或斑虻传播给人，因而是潜在的生物恐怖剂。 其为水生生物，并且可被发现生活在原生动物内，与对于军团病杆菌(Legionella)观察 的相似。其具有高感染率，并且可侵入吞噬细胞和非吞噬细胞，从而快速繁殖。一旦 在巨噬细胞内，该生物可逃离吞噬体并且生活在细胞溶胶中。
兽医应用
家畜的胃肠道中健康微生物区系对于健康和相应的相关食品产量是至关重要的。与人一样，健康动物的胃肠道包含许多种细菌(即，大肠杆菌、铜绿假单胞菌和沙门菌 属某些种)，所述细菌彼此生活在生态平衡中。该平衡被饮食、应激或响应抗生素或其 他治疗性治疗扰乱，从而在动物中导致通常由细菌例如沙门菌属、弯曲杆菌属、肠球 菌鼠(Enterococci)、土拉菌病(Tularemia)和大肠杆菌引起的细菌病。这些动物中的细菌 感染通常使得必需进行治疗性干预，这导致了治疗花费，而且还通常与生产力的降低 相关。
因此，常规地使用抗生素治疗的家畜以维持胃肠道中区系的平衡。该方法的不利方面是产生抗生素抗性细菌和在所产生的用于人消费的食品中携带此类抗生素和抗药菌。
用于改善皮肤病的靶
在本公开内容的某些实施方案中，考虑施用本文中公开的包含ON-NP的组合物，该组合物调节靶基因的表达。在多个实施方案中，施用组合物以改善皮肤病。
在某些方面，待改善的皮肤病包括但不限于过度增生性障碍、肿瘤性疾病、遗传病、衰老、炎症、感染和外形缺陷。在其他方面，皮肤病包括但不限于癌症。在其他 方面，癌症包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌、黑素瘤和乳腺癌。在相关方面， 被本公开内容的组合物靶向的基因产物包括但不限于Ras、IκBα、hedgehog、B-Raf、Akt和细胞周期蛋白D。
在某些实施方案中，施用本公开内容的组合物以改善遗传病，包括但不限于单纯性大疱性表皮松解、大疱性鱼鳞病、先天性厚甲症、面皮肤骨骼综合征和结节性硬化 症。在某些方面，通过施用的组合物靶向的基因产物是包含突变的基因产物、由基因(包 括但不限于K5、K14、K1、K10、H-Ras、N-Ras、K-Ras、NF-kB、Akt、B-raf、ERK、 Mek1、Mek2和m-Tor)表达的基因产物。
在某些实施方案中，施用本公开内容的组合物以改善衰老疾病，包括但不限于UV-损伤和早衰。在某些方面，通过施用的组合物靶向的基因产物包括但不限于基质金属 蛋白酶-1和progerin。
在其他实施方案中，施用本公开内容的组合物以改善炎症性疾病，包括但不限于特应性皮炎和银屑病。在某些方面，通过施用的组合物靶向的基因产物包括但不限于 白细胞介素-23。在多个方面，通过施用的组合物靶向的基因产物包括但不限于IL1-α、 IL1-β、IL6、TNF-α、白血病抑制因子(LIF)、IFN-γ、制癌蛋白(oncostatin)M(OSM)、 睫状神经营养因子(CNTF)、TGF-β、GM-CSF、IL-11、IL-12、IL-17、IL-18、IL-8。
在其他实施方案中，施用本公开内容的组合物以改善感染。在某些方面，感染是病毒感染。在某些方面，感染是如本文中公开的细菌感染。在其中感染是病毒感染的 方面，预期病毒感染导致疣。在这些方面，通过施用的组合物靶向的基因产物包括但 不限于E6/E7。
在某些实施方案中，施用本公开内容的组合物以改善外形缺陷，包括但不限于脂溢性角化病、表皮痣和色素痣。在某些方面，通过施用的组合物靶向的基因产物是包 含突变的基因产物、由基因表达的基因产物，包括但不限于FGFR3、K10和B-Raf。
媒介物
在某些实施方案中，本公开内容的ON-NP组合物和方法包括媒介物。如本文中所使用的，“媒介物”是与寡核苷酸功能化的纳米颗粒结合的基底化合物(base compound)。
本公开内容的组合物和方法所使用的媒介物对于本领域技术人员来说是已知的，包括但不限于软膏、乳膏、洗液、凝胶、泡沫、缓冲液或水。在某些实施方案中，媒 介物包含一种或多种其他物质，包括但不限于水杨酸、α-羟酸类或增强穿过角质层的 渗透的尿素。
在多个方面，被考虑用于本公开内容的组合物和方法的媒介物包括但不限于 愈合软膏、A+D、聚乙二醇(PEG)、甘油、矿物油、凡士林特别护理乳膏(VaselineIntensive Care cream)(包含矿物油和甘油)、石油胶(petroleum jelly)、DML(包含矿脂(petrolatum)、甘油和PEG 20)、DML(包含矿脂、甘油和PEG 100)、Eucerin增湿霜、Cetaphil(包含矿脂、甘油和PEG 30)、Cetaphil、CeraVe(包含矿脂和甘油)、CeraVe(包 含甘油、EDTA和胆固醇)、Jergens(包含矿脂、甘油和矿物油)和Nivea(包含矿脂、甘 油和矿物油)。本领域技术人员从上述目录可理解其他媒介物也可用于本公开内容的组 合物和方法。
如本文中所使用的软膏是油包水的制剂。本文中使用的乳膏是水包油的制剂。通常，洗液具有比乳膏或软膏更多的水；凝胶包含醇，泡沫是通过将气泡捕获在液体中 而形成的物质。本领域技术人员理解这些术语。
纳米颗粒
提供了经功能化而具有与其连接的多核苷酸的纳米颗粒。纳米颗粒的大小、形状和化学组成促成了所获得的多核苷酸功能化的纳米颗粒的性质。这些性质包括例如光 学性质、光电性质、电化学性质、电子性质、在不同溶液中的稳定性、磁性质以及孔 和通道大小变化。涉及具有不同大小、形状和化学组成的纳米颗粒的混合物以及具有 一致大小、形状和化学组成的纳米颗粒的用途和从而性质的混合。适当的颗粒的实例 包括但不限于聚集的颗粒、各向同性(例如球状颗粒)、各向异性颗粒(例如非球状杆体、 四面体和/或棱柱)以及核心-壳颗粒例如美国专利No.7,238,472和国际申请公布No. WO 2003/08539(所述专利和申请的公开内容通过引用整体并入本文)中描述的颗粒。
在一个实施方案中，纳米颗粒是金属的，并且在多个方面，纳米颗粒是胶体金。 因此，在多个实施方案中，本发明的纳米颗粒包括金属(包括例如但不限于，银、金、 铂、铝、钯、铜、钴、铟、镍或任何其他易于纳米颗粒形成的金属)、半导体(包括例 如但不限于，CdSe、CdS和用ZnS包被的CdS或CdSe)和磁性(例如，铁磁)胶体材料。
同样地，如美国专利公布No.2003/0147966中所描述的，本发明的纳米颗粒包括商购可得的纳米颗粒以及合成的，例如从溶液中渐进成核(例如，通过胶体反应)或通 过多种物理和化学气相沉积法例如溅射淀积(sputter deposition)产生的纳米颗粒。参见， 例如，HaVashi，Vac.Sci.Technol.A5(4):1375-84(1987)；Hayashi，Physics Today， 44-60(1987)；MRS Bulletin，1990年1月，16-47。如在美国专利公布2003/0147966 中所进一步描述的，涉及的纳米颗粒可选地使用本领域内已知的方法利用HAuCl4和 柠檬酸还原剂来产生。参见，例如，Marinakos等人，Adv.Mater.11:34-37(1999)； Marinakos等人，Chem.Mater.10:1214-19(1998)；Enustun&Turkevich，J.Am.Chem.Soc. 85:3317(1963)。
在某些实施方案中，纳米颗粒的大小与其渗透皮肤的能力相关。通常，纳米颗粒的直径越小，进入或穿过皮肤的渗透越深。在一个方面，纳米颗粒的直径允许ON-NP 穿过皮肤并且进入血液以获得ON-NP的全身性递送。在另一个方面，纳米颗粒的直径 阻止ON-NP穿过皮肤并且ON-NP被保留在皮肤的表面。在多个方面，本领域技术人 员理解，可调整纳米颗粒的大小以获得所需的施用的ON-NP的渗透深度。
纳米颗粒在平均直径上可在约1nm至约250nm，在平均直径上可在约1nm至约240nm、在平均直径上约1nm至约230nm、在平均直径上可在约1nm至约220nm、 在平均直径上可在约1nm至约210nm、在平均直径上可在约1nm至约200nm、在 平均直径上可在约1nm至约190nm、在平均直径上可在约1nm至约180nm、在平 均直径上可在约1nm至约170nm、在平均直径上可在约1nm至约160nm、在平均 直径上可在约1nm至约150nm、在平均直径上可在约1nm至约140nm、在平均直 径上可在约1nm至约130nm、在平均直径上可在约1nm至约120nm、在平均直径 上可在约1nm至约110nm、在平均直径上可在约1nm至约100nm、在平均直径上 可在约1nm至约90nm、在平均直径上可在约1nm至约80nm、在平均直径上可在 约1nm至约70nm、在平均直径上可在约1nm至约60nm、在平均直径上可在约1nm 至约50nm、在平均直径上可在约1nm至约40nm、在平均直径上可在约1nm至约 30nm或约1nm至约20nm、在平均直径上可在约1nm至约10nm的大小范围内变 化。在其他方面，纳米颗粒的大小为约5nm至约150nm(平均直径)、约5至约50nm、 约10至约30nm、约10至150nm、约10至约100nm或约10至约50nm。纳米颗粒 的大小为约5nm至约150nm(平均直径)、约30至约100nm、约40至约80nm。方法 中使用的纳米颗粒的大小可按它们的特定用途或应用的需要而变化。大小的变化有利 地用于优化纳米颗粒的某些物理特征，例如，光学性质或可如本文中所述功能化的表 面积的量。
寡核苷酸
本文中所使用的术语"核苷酸"或其复数形式可与本文中论述的和另外本领域内已 知的修饰形式互换使用。在某些情况下，本领域使用术语“核碱基”，其包括天然存在 的核苷酸和非天然存在的核苷酸(包括经修饰的核苷酸)。因此，核苷酸或核碱基意指 天然存在的核碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。非 天然存在的核碱基包括例如但不限于，黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、 7-去氮黄嘌呤、7-去氮鸟嘌呤、N4,N4-乙醇胞嘧啶(ethanocytosin)、N',N'-乙醇代-2,6-二 氨基嘌呤，5-甲基胞嘧啶(mC)、5-(C3—C6)-炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、 假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷和Benner等人， 美国专利5,432,272和Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann，1997，Nucleic Acids Research，第25卷:第4429-4443页中描述的“非天然存在的”核碱基。术语“核碱基” 同样地不仅包括已知的嘌呤和嘧啶杂环，而且还包括杂环类似物和其互变异构体。其 他天然和非天然存在的核碱基包括美国专利No.3,687,808(Merigan等人)中，Sanghvi 的Antisense Research andApplication，编者S.T.Crooke和B.Lebleu，CRC Press，1993 的第15章中，Englisch等人，1991，Angewandte Chemie，国际板，30:613-722(特别 参见第622和623页)，和在ConciseEncyclopedia of Polymer Science and Engineering， J.I.Kroschwitz编辑，JohnWiley&Sons，1990，第858-859页，Cook，Anti-Cancer Drug Design 1991，6，585-607中，将其各自通过引用整体并入本文)中公开的核碱基。在多 个方面，多核苷酸还包括一个或多个“核苷碱基(nucleosidic bases)”或“碱基单位”，其为 一类非天然存在的核苷酸，包括功能可如核碱基一样的化合物例如杂环化合物，包括 某些在最传统意义上不是核碱基但用作核苷碱基的“通用碱基”。通用碱基包括3-硝基 吡咯，任选地取代的吲哚类(例如，5-硝基吲哚)和任选地取代的次黄嘌呤。其他所需通 用引物包括吡咯、二唑或三唑类衍生物，包括本领域内已知的那些通用碱基。
经修饰的核苷酸描述于EP 1 072 679和WO 97/12896(其公开内容通过引用并入本 文)中。经修饰的核碱基包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤 和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5- 卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶 氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、 8-硫代、8-硫烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(特别是5-溴)、5- 三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌 呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-去氮鸟嘌呤和7-去氮腺嘌呤以 及3-去氮鸟嘌呤和3-去氮腺嘌呤。其他经修饰的碱基包括三环嘧啶类例如吩噁嗪胞苷 (1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并恶嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪 -2(3H)-酮)、G钳(G-clamp)例如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并 [5,4-b][1,4]苯并恶嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞 苷(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。经修饰的碱基还可包括其中嘌呤或嘧啶 碱基被其他杂环替代的碱基，例如7-去氮-腺嘌呤、7-去氮鸟苷、2-氮基吡啶和2-吡啶 酮替代的碱基。其他核碱基包括美国专利No.3,687,808中公开的核碱基，The Concise Encyclopedia Of PolymerScience And Engineering，第858-859页，Kroschwitz，J.I.编 辑，John Wiley&Sons，1990中公开的核碱基，Englisch等人，1991，Angewandte Chemie， 国际版，30:613中公开的核碱基和Sanghvi，Y.S.，第15章，Antisense Research and Applications，第289-302页，Crooke，S.T和Lebleu，B.编辑，CRC Press，1993中公 开的核碱基。此类碱基中的某些碱基用于增强结合亲和力并且包括5-取代的嘧啶类、 6-氮杂嘧啶类以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤类，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基 尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞嘧啶取代增加核酸双链体稳定性0.6-1.2℃， 并且在某些方面与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合。参见，美国专利No.3,687,808、 4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121，5,596,091；5,614,617； 5,645,985；5,830,653；5,763,588；6,005,096；5,750,692和5,681,941，所述专利的公开 内容通过引用并入本文。
用于制备预定序列的多核苷酸的方法是公知的。参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，1989)和F.Eckstein(编辑)Oligonucleotides and Analogues，第1版.(Oxford University Press，New York，1991)。固相合成法对于多聚核糖核苷酸类和多聚脱氧核糖核酸类(合成DNA的公知方法也用 于合成RNA)是优选的。还可酶促制备多聚核糖苷酸。同样地，可将天然存在的核碱 基掺入多核苷酸。参见，例如，美国专利7,223,833；Katz，J.Am.Chem.Soc.， 74:2238(1951)；Yamane等人，J.Am.Chem.Soc.，83:2599(1961)；Kosturko等人， Biochemistry，13:3949(1974)；Thomas，J.Am.Chem.Soc.，76:6032(1954)；Zhang等 人，J.Am.Chem.Soc.，127:74-75(2005)；和Zimmermann等人，J.Am.Chem.Soc.， 124:13684-13685(2002)。
提供了利用多核苷酸或其经修饰的形式和本文中定义的结构域功能化的纳米颗粒 通常包含在长度上约5个核苷酸至约100个核苷酸的多核苷酸。更具体地，用多核苷 酸(在长度上为约5至约90个核苷酸，在长度上约5至约80个核苷酸，在长度上约5 至约70个核苷酸，在长度上约5至约60个核苷酸，在长度上约5至约50个核苷酸， 约5至约45个核苷酸，在长度上约5至约40个核苷酸，在长度上约5至约35个核苷 酸，在长度上约5至约30个核苷酸，在长度上约5至约25个核苷酸，在长度上约5 至约20个核苷酸，在长度上约5至约15个核苷酸，在长度上约5至约10个核苷酸) 和在长度上处于明确公开的大小中间的所有多核苷酸修饰功能化纳米颗粒至所述多核 苷酸能够获得所需结果的程度。因此，涉及在长度上具有5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、 69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个核苷酸的多核苷 酸。
在某些方面，提供了具有与其连接的寡核苷酸的纳米颗粒，其中还包含影响纳米颗粒被细胞摄入的效率的结构域的寡核苷酸与纳米颗粒结合。因此，所述结构域提高 或降低效率。如本文中所使用的，“效率”是指纳米颗粒被摄入细胞中/被细胞摄入的数 目或速率。因为纳米颗粒进入和退出细胞的过程是动态过程，因此可通过摄入更多纳 米颗粒或通过保留进入细胞的那些纳米颗粒更长的时期来增加效率。类似地，可通过 摄入更少的纳米颗粒或通过保留进入细胞的那些纳米颗粒更短的时期来减少效率。
在某些方面，结构域与寡核苷酸邻接/同线并且相对于纳米颗粒位于远端。在某些方面，结构域与寡核苷酸邻接/同线并且相对于纳米颗粒位于远端。术语“近端”和“远 端”是指相对于寡核苷酸的中间点的位置。在某些方面，结构域位于寡核苷酸内的内 部区域。在其他方面，结构域位于连接至纳米颗粒的第二寡核苷酸上。因此，在某些 实施方案中，涉及将结构域作为与寡核苷酸分离的实体连接至纳米颗粒。
还预期，在某些实施方案中，寡核苷酸包含超过1个结构域，位于本文中描述的 任何位置。
在某些实施方案中，结构域提高细胞对寡核苷酸功能化的纳米颗粒的摄入效率。在某些方面，结构域包含胸苷残基(polyT)或尿苷残基(polyU)的序列。在其他方面， polyT或polyU序列包含两个胸苷或尿苷。在多个方面，polyT或polyU序列包含3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、 约90、约95、约100、约125、约150、约175、约200、约250、约300、约350、约 400、约450、约500或更多个胸苷或尿苷残基。
在某些实施方案中，预期用寡核苷酸和结构域功能化的纳米颗粒被细胞以比用相同寡核苷酸功能化但不存在结构域的纳米颗粒更高的效率摄入。在某些方面，用寡核 苷酸和结构域功能化的纳米颗粒被细胞以比用相同寡核苷酸功能化但不存在结构域的 纳米颗粒高1％的效率摄入。在多个方面，用寡核苷酸和结构域功能化的纳米颗粒被 细胞以比用相同寡核苷酸功能化但不存在结构域的纳米颗粒高2％、3％、4％、5％、 6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、 20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、 33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、 46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、 59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、 72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％、约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、 约9倍、约19倍、约29倍、约39倍、约49倍、约99倍或更高的效率摄入。
在某些实施方案中，结构域降低细胞对寡核苷酸功能化的纳米颗粒的摄入效率。在某些方面，结构域包含由两个磷酸酯组成的聚磷酸酯聚合物(C3残基)。在多个方面， C3残基包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、约55、约60、约65、约70、约75、 约80、约85、约90、约95、约100、约125、约150、约175、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500或更多个磷酸酯。
在某些实施方案中，预期用寡核苷酸和结构域功能化的纳米颗粒被细胞以比用相同寡核苷酸功能化但不存在结构域的纳米颗粒更低的效率摄入。在某些方面，用寡核 苷酸和结构域功能化的纳米颗粒被细胞以比用相同寡核苷酸功能化但不存在结构域的 纳米颗粒低1％的效率摄入。在多个方面，用寡核苷酸和结构域功能化的纳米颗粒被 细胞以比用相同寡核苷酸功能化但不存在结构域的纳米颗粒低2％、3％、4％、5％、 6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、 20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、 33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、 46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、 59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、 72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％、约1/2、约2/3、约3/4、约4/5、约5/6、约6/7、约7/8、约8/9、约9/10、 约19/20、约29/30、约39/40、约49/50、约99/100或更低的效率摄入。
涉及与纳米颗粒连接的多核苷酸包括调节从靶多核苷酸表达的基因产物的表达的 多核苷酸。本公开内容涉及的多核苷酸包括如下文中定义的DNA、RNA和其修饰形 式。因此，在多个方面但不限于，涉及与靶多核苷酸杂交并且引发靶多核苷酸的转录 或翻译的减少的多核苷酸、与双链多核苷酸杂交并且抑制转录的形成三链体的多核苷 酸和与靶多核苷酸杂交并且抑制翻译的核酶。
在多个方面，如果靶向特定多核苷酸，那么单一功能化的寡核苷酸-纳米颗粒组合物具有结合多拷贝相同转录物的能力。在一个方面，提供了用相同多核苷酸(即每一个 多核苷酸具有相同长度和相同序列)功能化的纳米颗粒。在其他方面，用两种或更多种 不相同的多核苷酸(即，连接的多核苷酸的至少之一与至少一种其他连接的多核苷酸相 异在于其具有不同的长度和/或不同的序列)功能化纳米颗粒。在其中将不同多核苷酸 与纳米颗粒连接的方面，这些不同的多核苷酸结合相同单个靶多核苷酸(但在不同的位 置上)，或结合编码不同基因产物的不同靶多核苷酸。
经修饰的寡核苷酸
如上所论述的，考虑将经修饰的寡核苷酸用于功能化纳米颗粒。在多个方面，完全或部分修饰纳米颗粒上功能化的寡核苷酸。因此，在多个方面，用“非天然存在的” 基团代替多核苷酸中核苷酸单位的一个或多个或全部糖和/或一个或多个或全部核苷 酸间连接。
在一个方面，本实施方案涉及肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，用包含酰胺的主 链代替多核苷酸的糖-主链。参见，例如美国专利5,539,082；5,714,331和5,719,262和Nielsen等人，Science，1991，254，1497-1500，所述专利的公开内容通过引用并入本 文。
核苷酸与涉及用于公开的多核苷酸的非天然核苷酸之间的其他连接包括美国专利 No.4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053； 5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747和5,700,920；美国专利公布 No.20040219565；国际专利公布No.WO 98/39352和WO 99/14226；Mesmaeker等人，Current Opinion in Structural Biology 5:343-355(1995)以及Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann，Nucleic Acids Research，25:4429-4443(1997)(其公开内容通过引用并入本文) 中所述的连接。
寡核苷酸的具体实例包括包含经修饰的主链或非天然核苷间连接的寡核苷酸。具有经修饰的主链的寡核苷酸包括在主链上保留磷原子的主链和在主链上不具有磷原子 的主链。在它们的核苷间主链上不具有磷原子的经修饰的寡核苷酸被认为在“寡核苷 酸”的含义内。
包含磷原子的经修饰的寡核苷酸主链包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3'-烯基膦 酸酯、5'-烯基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基磷酰胺和氨 基烷基磷酰胺、硫代磷酰胺、硫代烷基磷酰胺)、具有正常3'-5'连接的硫代烷基磷酸三 酯、硒代磷酸酯和硼代磷酸酯、此类物质的2'-5'连接类似物，以及具有反向极性的此 类物质，其中一个或多个核苷酸间连接为3'至3'、5'至5'或2'至2'连接。还包括的是具 有反向极性的多核苷酸，其在3'最末的核苷酸间连接上包含单个3'至3'连接，即可以 是无碱基的(核苷酸丢失或在其位置上具有羟基)的单个反向核苷残基。还包括盐、混 合盐和游离酸形式。
教导上述含磷连接的制备的代表性美国专利包括美国专利No.3,687,808； 4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302； 5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925； 5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599； 5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050，所述专利的公开内容通过引 用并入本文。
不包含磷原子的经修饰的多核苷酸主链具有通过短链烷基或环烷基核苷间连接，混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连 接形成的主链。此类主链包括具有吗啉代连接的主链；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和 砜主链；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)主链；亚甲基甲酰基和硫代甲 酰基主链；核糖酰基(riboacetyl)主链；包含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚 胺基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺胺主链；酰胺主链；和具有混合的N、O、S和 CH2组成部分的其他主链。在其他实施方案中，提供了具有硫代磷酸酯主链的多核苷 酸和具有杂原子主链的寡核苷酸(包括美国专利No.5,489,677和5,602,240中所描述的 —CH2—NH—O—CH2—、—CH2—N(CH3)—O—CH2—、—CH2—O—N(CH3)—CH2—、 —CH2—N(CH3)—N(CH3)—CH2—和—O—N(CH3)—CH2—CH2—)。参见例如，美国专 利No.5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562； 5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225； 5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070； 5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，所述专利的公开 内容通过引用整体并入本文。
在多种形式中，寡核苷酸中两个连续单体之间的连接由2至4个，理想地3个选自—CH2—、—O—、—S—、—NRH—、>C＝O、>C＝NRH、>C＝S、—Si(R")2—、—SO—、 —S(O)2—、—P(O)2—、—PO(BH3)—、—P(O,S)—、—P(S)2—、—PO(R")—、—PO(OCH3) —和—PO(NHRH)—的基团/原子组成，其中RH选自氢和C1-4-烷基，并且R"选自C1-6- 烷基和苯基。此类连接的示例性实例为—CH2—CH2—CH2—、—CH2—CO—CH2—、 —CH2—CHOH—CH2—、—O—CH2—O—、—O—CH2—CH2—、—O—CH2—CH＝(当 用作与随后的单体的连接时，包括R5)、—CH2—CH2—O—、—NRH—CH2—CH2—、 —CH2—CH2—NRH—、—CH2—NRH—CH2—、—O—CH2—CH2—NRH—、 —NRH—CO—O—、—NRH—CO—NRH—、—NRH—CS—NRH—、 —NRH—C(＝NRH)—NRH—、—NRH—CO—CH2—NRH—O—CO—O—、 —O—CO—CH2—O—、—O—CH2—CO—O—、—CH2—CO—NRH—、 —O—CO—NRH—、—NRH—CO—CH2—、—O—CH2—CO—NRH—、 —O—CH2—CH2—NRH—、—CH＝N—O—、—CH2—NRH—O—、—CH2—O—N＝(当 用作与随后的单体的连接时，包括R5)、—CH2—O—NRH—、—CO—NRH—CH2—、 —CH2—NRH—O—、—CH2—NRH—CO—、—O—NRH—CH2—、—O—NRH、 —O—CH2—S—、—S—CH2—O—、—CH2—CH2—S—、—O—CH2—CH2—S—、 —S—CH2—CH＝(当用作与随后的单体的连接时，包括R5)、—S—CH2—CH2—、 —S—CH2—CH2—-O—、—S—CH2—CH2—S—、—CH2—S—CH2—、 —CH2—SO—CH2—、—CH2—SO2—CH2—、—O—SO—O—、—O—S(O)2—O—、 —O—S(O)2—CH2—、—O—S(O)2—NRH—、—NRH—S(O)2—CH2—； —O—S(O)2—CH2—、—O—P(O)2—O—、—O—P(O,S)—O—、—O—P(S)2—O—、 —S—P(O)2—O—、—S—P(O,S)—O—、—S—P(S)2—O—、—O—P(O)2—S—、 —O—P(O,S)—S—、—O—P(S)2—S—、—S—P(O)2—S—、—S—P(O,S)—S—、 —S—P(S)2—S—、—O—PO(R")—O—、—O—PO(OCH3)—O—、—O—PO(OCH2CH3)—O—、—O—PO(O CH2CH2S—R)—O—、—O—PO(BH3)—O—、 —O—PO(NHRN)—O—、—O—P(O)2—NRH H—、—NRH—P(O)2—O—、 —O—P(O,NRH)—O—、—CH2—P(O)2—O—、—O—P(O)2—CH2—和 —O—Si(R")2—O—；在所述连接当中包括—CH2—CO—NRH—、—CH2—NRH—O—、 —S—CH2—O—、—O—P(O)2—O—O—P(-O,S)—O—、—O—P(S)2—O—、 —NRHP(O)2—O—、—O—P(O,NRH)—O—、—O—PO(R")—O—、—O—PO(CH3)—O— 和—O—PO(NHRN)—O—(其中RH选自氢和C1-4-烷基，并且R"选自C1-6-烷基和苯 基)。其他示例性实例示于Mesmaeker等人，1995，Current Opinion in Structural Biology，5:343-355以及Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann，1997，Nucleic Acids Research，第25卷:pp 4429-4443中。
多核苷酸的其他修饰形式详细地描述于美国专利申请No.20040219565中，所述申请的公开内容通过引用整体并入本文。
经修饰的多核苷酸还可包含一个或多个取代的糖部分。在某些方面，多核苷酸在2'位置包含如下之一:OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基； 或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是被取代或未被取代的C1至C10烷基 或C2至C10烯基和炔基。其他实施方案包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、 O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m为 1至约10。其他多核苷酸在2'位置下包含如下之一：C1至C10低级烷基、取代的低级 烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、 Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环 烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、 嵌入剂、改善多核苷酸的药代动力学性质的基团或改善多核苷酸的药效性质的基团和 其他具有相似性质的取代基。在一个方面，修饰包括2'-甲氧基乙基(2'-O-CH2CH2OCH3， 也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等人，1995，Helv.Chim.Acta，78:486-504) 即，烷氧基烷氧基。其他修饰包括2'-二甲基氨基氧乙氧基即O(CH2)2ON(CH3)2基团， 也称为2'-DMAOE，和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域内也称为2'-O-二甲基-氨 基-乙氧基-乙基或2'-DMAEOE)，即2'-O—CH2—O—CH2—N(CH3)2。
其他修饰包括2'-甲氧基(2'-O—CH3)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)、2'-烯丙基(2'-CH2—CH＝CH2)、2'-O-烯丙基(2'-O—CH2—CH＝CH2)和2'-氟(2'-F)。2'-修饰可存在于阿拉伯糖基(上)位置或核糖基(下)位置中。在一个方面，2'-阿拉伯糖基修饰为2'-F。也可在多核苷酸的其他位置上，例如在3'末端核苷酸上的糖的3'位置上或2'-5'连接的 多核苷酸中以及5'末端核苷酸的5'位置上产生相似的修饰。多核苷酸还可具有糖部分 例如代替戊呋喃糖基糖的环丁基部分。参见，例如，美国专利No.4,981,957；5,118,800； 5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811； 5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873； 5,670,633；5,792,747和5,700,920，所述专利的公开内容通过引用整体并入本文。
在一个方面，糖的修饰包括其中2'-羟基连接至糖环的3'或4'碳原子从而形成双环 糖部分的锁核酸(LNA)。在某些方面，连接是桥连2'氧原子和4'碳原子的亚甲基 (—CH2—)，其中n为1或2。LNA和其制备描述于WO 98/39352和WO 99/14226中， 将其公开内容通过引用并入本文。
多肽
如本文中所使用的，术语“多肽”是指天然来源的、合成产生的或重组产生的肽、蛋白质、氨基酸的聚合物、激素、病毒和抗体。
在某些实施方案中，本公开内容的组合物调节靶多肽的活性。因此，在多个方面，用适体功能化纳米颗粒。如本文中所使用的，“适体”是结合特定靶分子的寡核苷酸或 肽分子。因此，在某些实施方案中，寡核苷酸功能化的纳米颗粒结合靶多肽并且调节 其活性。
在一个方面，靶多肽的活性与未与寡核苷酸功能化的纳米颗粒接触的细胞相比较被抑制约5％。在多个方面，靶多肽的表达与未与寡核苷酸功能化的纳米颗粒接触的 细胞相比较被抑制约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、 约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、 约90％、约95％、99％或更多。换句话说，所提供的方法包括导致靶多肽的活性的任 何程度的抑制的方法。
表面密度
可调整NP表面上的寡核苷酸密度以进行给定的应用。例如，Seferos等人[NanoLett.，9(1):308–311，2009]的工作显示NP表面上的DNA密度影响其被核酸酶降解的 速度。该密度修饰用于例如但不限于基于NP的药物递送系统，其中药物和ON-NP进 入细胞，并且ON以受控的速率降解。
在多个方面，如本文中提供的纳米颗粒在纳米颗粒的表面上具有足以导致纳米颗粒之间和单个纳米颗粒上多核苷酸链之间的协作行为的多核苷酸的堆积密度。在另一 个方面，纳米颗粒之间的协作行为增加多核苷酸对核酸酶降解的抗性。在另一个方面， 细胞对纳米颗粒的摄入受到与纳米颗粒结合的多核苷酸的密度影响。如 PCT/US2008/65366(通过引用整体并入本文)中所描述的，纳米颗粒表面上的更高的多 核苷酸密度与增加的细胞对纳米颗粒的摄入相关。
在某些实施方案中，NP表面上的寡核苷酸表面密度与其渗入皮肤的能力相关。通常地，ON-NP表面上的表面密度越高，进入或通过皮肤的渗透越深。在某些方面，表 面密度允许ON-NP穿过皮肤并且进入血液以获得ON-NP的全身性递送。在另一个方 面，表面密度阻止ON-NP穿过皮肤并且ON-NP保留在皮肤表面。在多个方面，本领 域技术人员理解，可调整纳米颗粒表面上的寡核苷酸表面密度以获得所需的施用的 ON-NP的渗透深度。
可凭经验确定足以使纳米颗粒稳定的表面密度和获得其以进行纳米颗粒与多核苷 酸的所需组合所必需的条件。通常，至少2pmol/cm2的表面密度足以提供稳定的纳米 颗粒-寡核苷酸组合物。在某些方面，表面密度为至少15pmol/cm2。还提供了其中以 至少2pmol/cm2、至少3pmol/cm2、至少4pmol/cm2、至少5pmol/cm2、至少6pmol/cm2、 至少7pmol/cm2、至少8pmol/cm2、至少9pmol/cm2、至少10pmol/cm2、至少约15 pmol/cm2、至少约20pmol/cm2、至少约25pmol/cm2、至少约30pmol/cm2、至少约35 pmol/cm2、至少约40pmol/cm2、至少约45pmol/cm2、至少约50pmol/cm2、至少约55 pmol/cm2、至少约60pmol/cm2、至少约65pmol/cm2、至少约70pmol/cm2、至少约75 pmol/cm2、至少约80pmol/cm2、至少约85pmol/cm2、至少约90pmol/cm2、至少约95 pmol/cm2、至少约100pmol/cm2、至少约125pmol/cm2、至少约150pmol/cm2、至少约 175pmol/cm2、至少约200pmol/cm2、至少约250pmol/cm2、至少约300pmol/cm2、至 少约350pmol/cm2、至少约400pmol/cm2、至少约450pmol/cm2、至少约500pmol/cm2、 至少约550pmol/cm2、至少约600pmol/cm2、至少约650pmol/cm2、至少约700pmol/cm2、 至少约750pmol/cm2、至少约800pmol/cm2、至少约850pmol/cm2、至少约900pmol/cm2、 至少约950pmol/cm2、至少约1000pmol/cm2或更高的表面密度将多核苷酸连接至纳米 颗粒的方法。
寡核苷酸至纳粒颗粒的连接
被考虑用于方法的寡核苷酸包括通过任何方法与纳米颗粒连接的寡核苷酸。无论籍以将寡核苷酸与纳米颗粒连接的方法如何，在多个方面，通过5'连接、3'连接、某 些类型的内部连接或此类连接的任意组合来获得连接。
连接的方法对于本领域技术人员来说是已知的并且描述于美国公布2009/0209629 中，将其通过引用整体并入本文。将RNA连接至纳米颗粒的方法通常描述于 PCT/US2009/65822中，将其通过引用整体并入本文。因此，在某些实施方案中，本公 开内容预期与纳米颗粒连接的多核苷酸是RNA。
在某些方面，提供了具有与其连接的寡核苷酸纳米颗粒，其中还包含结构域的寡核苷酸与纳米颗粒结合。在某些方面，结构域是多聚胸苷(polythymidine)序列。在其他 方面，结构域是磷酸酯聚合物(C3残基)。
在某些实施方案中，与纳米颗粒连接的寡核苷酸是DNA。当将DNA与纳米颗粒 连接时，所述DNA由与多核苷酸的靶序列充分互补的序列组成，以便与纳米颗粒连 接的DNA寡核苷酸与靶多核苷酸的杂交发生，从而将靶多核苷酸结合至纳米颗粒。 在多个方面，DNA是单链或双链的，只要双链分子也包含与靶多核苷酸的单链序列杂 交的单链序列。在某些方面，在纳米颗粒上功能化的寡核苷酸的杂交可与双链靶多核 苷酸形成三链体结构。在另一个方面，三链体结构可通过纳米颗粒上功能化的双链寡 核苷酸与单链靶多核苷酸杂交形成。
间隔区
在某些方面，涉及功能化的纳米颗粒，所述纳米颗粒包括其中将寡核苷酸和结构域通过间隔区与纳米颗粒连接的纳米颗粒。如本文中所使用的“间隔区”意指本身不 参与调节基因表达但用于增加纳米颗粒与功能性寡核苷酸之间的距离或当以多个拷贝 与纳米颗粒连接时，增加个体寡核苷酸之间的距离的部分。因此，间隔区预期位于串 联的个体寡核苷酸之间，无论寡核苷酸具有相同序列还是具有不同序列。在其中将结 构域直接连接至纳米颗粒的本发明的方面，任何地通过间隔区将结构域功能化至纳米 颗粒。在其中将串联的结构域被功能化至纳米颗粒的方面，间隔区任选地在串联结构 的一些或全部结构域单位之间。在一个方面，间隔区(当存在时)是有机部分。在另一 个方面，间隔区是聚合物，包括但不限于水溶性聚合物、核酸、多肽、寡聚糖、碳水 化合物、脂质、乙二醇或其组合。
在某些方面，多核苷酸具有间隔区，其与纳米颗粒通过该间隔区共价连接。此类多核苷酸是如上所述的相同多核苷酸。由于间隔区与纳米颗粒结合，因此多核苷酸与 纳米颗粒的表面相隔并且更易于接近以与其靶杂交。在其中间隔区是多核苷酸的情况 下，在多个实施方案中间隔区的长度为至少约10个核苷酸、10-30个核苷酸或甚至大 于30个核苷酸。间隔区可具有不干扰多核苷酸与纳米颗粒或靶多核苷酸结合的能力的 任何序列。间隔区不应当具有彼此互补或与寡核苷酸的序列互补的序列，但可以与靶 多核苷酸完全或部分互补。在某些方面，多核苷酸间隔区的碱基全为腺嘌呤、全为胸 腺嘧啶、全为胞嘧啶、全为鸟嘌呤、全为尿嘧啶或全为某些其他经修饰的碱基。
实施例
实施例1
纳米颗粒的制备
利用公布的方法[G.Frens，Nature Physical Science.1973，241，20]制备柠檬酸稳 定的金纳米颗粒(1-250nm)。虽然在本实施例中使用13和5nm的大小，但其他实施例 可包括大小为1nm至500nm的纳米颗粒。简而言之，通过用回流水中的柠檬酸处理 来还原四氯金酸。粒度和分散性可使用透射电子显微镜检查和uv/vis分光光度法来确 认。使用标准固相亚磷酰胺法[Pon，R.T.Solid-phase supports for oligonucleotidesynthesis.Methods in Molecular Biology(Totowa，NJ，United States)(1993)，20(Protocols for Oligonucleotides and Analogs)，465-496]合成硫醇盐化寡核苷酸。然后以3nmol寡 核苷酸/mL 10nM胶体的浓度将巯基修饰寡核苷酸加入至13±1和5nm胶体金并且 振荡过夜。12小时后，向混合物中加入十二烷基硫酸钠(SDS)溶液(10％)以获得0.1％SDS浓度，向混合物中加入磷酸盐缓冲液(0.1M；pH＝7.4)以获得0.01的磷酸盐浓度， 然后向混合物中加入氯化钠溶液(2.0M)以获得0.1M的氯化钠浓度。随后在8小时的 时期内将6个等分部分的氯化钠溶液(2.0M)加入至混合物中以获得0.3M的终氯化钠 浓度，并且振荡过夜以完成功能化过程。将溶液离心(13,000rpm，20分钟)，然后重新 悬浮于无菌磷酸缓冲盐水中3次，以产生纯化的缀合物。
实施例2
寡核苷酸修饰的纳米颗粒缀合物法
本实施例中寡核苷酸设计包括两个可能的作用机制。第一，使用可优先与氨苄青霉素抗性(AmpR)基因β-内酰胺酶的启动子位点的有义链杂交的公布的质粒序列来设 计序列。这可通过利用缀合物与细菌基因组中的AmpR的启动子序列的优先杂交(由更 有利的结合常数和/或颗粒的细胞内浓度赋予的)来使细菌对氨苄青霉素敏感。这可阻 止启动子复合物结合其靶位点并且阻止mRNA转录物(Amp抗性基因)的转录，从而使 细菌对氨苄青霉素敏感。所使用的序列为5'-AT TGT CTC ATG AGC GGA TAC ATA TTT GAA AAA AAA AAA A-SH-3'(SEQ ID NO:1)和5'-AT TGT CTC ATG AGC GGA TAC AAA AAA AAA A-SH-3'(SEQ IDNO:2)。
第二策略利用经设计与AmpR基因的内部区域杂交的序列。在这种情况下，这可 阻止完全mRNA转录物的完成。该策略的下游效应是阻止功能性mRNA转录物(Amp 抗性基因)的完全转录，从而使细菌对氨苄青霉素敏感。对于该策略，选择有义链来与 靶双链体DNA杂交。该有义链的序列为5'-ACT TTT AAA GTT CTG CTA TAA AAA AAA AA-SH-3'(SEQ ID NO:3)。两个策略的方案示于图1中。可选地，可利用常规反 义策略来结合mRNA和阻止蛋白质产生，从而使细菌对抗生素敏感。
按照公布的方法(Promega和Invitrogen)使用含氨苄青霉素的质粒(psiCHECK 2，Promega或pScreen-iT，Invitrogen)转化JM109大肠感菌感受态细胞并且将其培养在含 抗生素(Amp)的平板上。选择单个菌落，将其在具有氨苄青霉素的液体培养基中培养12小时。将该培养物用于形成冷冻(10％甘油)原液以在随后实验中使用。
在解冻大肠杆菌的原液后，如下文中所述，将少量体积培养在具有或不具有氨苄青霉素的液体培养基中，和接种于相应的LB板上。在一个实例中，将5μL冷冻细菌 液体培养基在1mL具有30nM颗粒的LB液体培养基中培养5.5小时。接种来自该1mL 中的100μL并且培养过夜。使用透射电子显微镜检查确认细菌进入(图2)。
在用纳米颗粒处理数小时后，将少量体积的细菌接种于氨苄青霉素阳性或氨苄青霉素阴性平板上。将细菌在这些平板上再培养另外12小时，估计在各条件下生长的菌 落的数目。结果概述于下文表1中。使用该策略观察到66％的细菌生长抑制。条件的 常规最优化预期产生100％的成功细菌敏化。
表1
方案：5μL细菌液体培养基于1mL的具有30nM颗粒的液体培养基中培养3.5小 时。接种100μL并且培养过夜。
方案：5μL细菌液体培养基于1mL的具有30nM颗粒的液体培养基中培养5.5小 时。接种100μL并且培养过夜。
实施例3
寡核苷酸修饰的纳米颗粒缀合物实现转录敲低
使用另外的策略检查质粒来源的荧光素酶基因的转录敲低。该模型用于通过区分荧光素酶敲低与编码海肾表达的质粒上的分离区域来证明位点选择性基因敲低。为了 测定该效应，使用双荧光素酶报告系统(Promega)。用于该模型的策略是阻断荧光素酶 基因的完全mRNA转录物的形成。这导致与海肾相关的荧光素酶信号的减少。用于该 策略的序列为5'-CCC GAG CAA CGC AAA CGC AAA AAA AAA AA-SH-3'(SEQ ID NO:4)。可选地，可使用与上文中使用的策略相似的策略阻断启动子复合物结合其靶 位点。在该实施例中，使用5nm颗粒。12小时后，使用300nM浓度的颗粒所获得的 敲低为59％(p值＝0.0004)。这些结果论证了在转录水平上实现基因调控的另一个方法。 数据的概括示于图3中。
实施例4
寡核苷酸修饰的纳米颗粒缀合物阻断转录
作为此类缀合物通过与双链基因组DNA杂交阻断转录和随后蛋白质产生的能力的范例，进行体外转录测定法。在包含编码荧光素酶基因的双链质粒DNA的体外转 录反应物(Promega)中加入寡核苷酸功能化的金纳米颗粒。寡核苷酸序列靶向荧光素酶 的有义链，从而可以只阻断转录但不阻断翻译。作为对照，也以相同的方式使用用非 互补序列功能化的纳米颗粒缀合物。使转录反应继续进行并且使用商业试剂盒 (Promega)测量荧光素酶的活性。在包含靶向荧光素酶基因的纳米缀合物的样品中，与 包含具有非互补序列的纳米颗粒缀合物的对照反应相比较，观察到荧光素酶活性的显 著降低(>75％)。
此外，为了阐明敲低的基本原理，在缓冲液中进行实验以检查形成的双链体的寡核苷酸金纳米颗粒缀合物侵入。方案和所获得的数据示于图4(A和B)中。颗粒可结合 预形成的双链体A(三链体形成)。可选地，颗粒可以通过其对于靶序列的更高的结合 常数置换形成的双链体。随后以13,000RPM离心颗粒，在PBS中洗涤3次，然后用 KCN氧化。测量结合的链的荧光。不受理论束缚，假定这导致荧光素加帽的寡核苷酸 (反义链)的释放和荧光信号的增加。在加入纳米颗粒之前，形成具有猝灭剂(dabcyl， 有义链)和荧光基团(荧光素，反义链)的双链体。在一系列浓度上，可看到该策略的序 列特异性。
实施例5
无体外毒性的基因抑制
已显示DNA-Au NP和siRNA-Au NP在体外抑制多个细胞的基因功能。例如，针 对存活素的siRNA-Au NP导致T-24和HT-1376膀胱癌细胞的细胞死亡。此外， siRNA-Au NP在单次处理后在培养中4天的时间内逐渐降低HeLa细胞中荧光素酶的 表达，然而荧光素酶的表达在利用常规siRNA处理后4天回复至基线水平[Giljohann 等人，J Am Chem Soc 131:2072-2073(2009)]。在进行基因沉默所需的浓度上未观察到 细胞毒性，并且免疫介导的效应显示低于常规核酸的所述效应。还已显示利用寡核苷 酸-Au NP对超过一个基因的同时抑制；向培养的角质细胞(KC)同时加入针对神经节苷 脂生物合成的两个酶(GM2/GD2合酶和GD3合酶)的DNA-Au NP在起始后3天导致 GM3底物在角质细胞膜上的积累，反义阻断后可见膜表达持续至少1周。
为了检查对此类纳米颗粒的细胞反应，比较13nm柠檬酸稳定的金纳米颗粒与寡核苷酸-修饰的颗粒。虽然柠檬酸稳定的颗粒诱导HeLa细胞的基因表达谱的显著变化 (127个基因被上调或下调)，但杂乱siRNA或DNA功能化的纳米颗粒未显示基因表达 谱的显著变化。
实施例6
在局部施用后经皮肤递送纳米颗粒缀合物
利用DNA-Au NP或siRNA-Au NP的研究显示原代人角质细胞在2小时内以约 100％的效率摄入DNA-Au NP和siRNA-Au NP。使用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS) 测量金颗粒摄入[Giljohann等人，Nano Lett 7:3818-3821(2007)]，发现培养的角质细胞 对DNA-AuNP的摄入是任何其他细胞的摄入的至少10倍，以及siRNA-Au NP至KC 内的摄入达到其他细胞类型的20倍。例如，在低钙介质中将50pM siRNA-Au NPs与 KC一起温育6小时导致约6x105个NP/细胞的摄入，远高于对于常规siRNA的细胞 摄入。
鉴定了确保容易混合、在施用位点上保留以及纳米颗粒的稳定性(如通过纳米颗粒 的特征性红色的持久性确定的)的用于局部递送的一组潜在的软膏、乳膏和洗液。Cy5-标记的有义DNA-Au NP软膏(阿夸福中的DNA-Au NP)至小鼠背部皮肤的施用 显示在单次施用后2小时内穿过角质层至表皮的渗透，6-8小时内至上真皮的渗透， 以及24和48小时遍及真皮的广泛分布。所显示的荧光的持久性与金纳米颗粒在组织 中的持久性(如通过ICP-MS测量的)密切相关。类似地，Cy3-修饰的siRNA-Au NP软 膏被快速摄入穿过小鼠皮肤，从而显示在施用后24小时内至表皮基底、穿过真皮和进 入皮下组织的优良渗透(图5A，B)。这些研究显示纳米颗粒渗入角质层，穿过表皮并 且利用其脉管系统到达真皮。
局部施用未显示毒性的证据。对C57BL/6小鼠的背部皮肤施用15nM杂乱 siRNA-AuNP 1个月未观察到全身性或皮肤临床变化。与对照(施用媒介物或未处理的) 相比较，金颗粒积累在黑素瘤转移的位置：皮肤、淋巴结、肺中最明显，其次肝和肾。 组织学切片未显示炎症、细胞凋亡的证据或皮肤的增殖/厚度的改变。在初步毒理学研 究中，每天利用局部施用的杂乱siRNA-Au NP以范围为50nM变化至500nM(每组， n＝5)的剂量处理小鼠1次，进行10天。检测皮肤、淋巴结、肝、GI道和粪便中的金 颗粒，这些器官中逐渐增加的浓度与施用的纳米颗粒的浓度成比例。
实施例7
局部施用的siRNA-Au NP抑制基因表达
在使用局部方法靶向基因表达的研究中，在遍在表达转基因的小鼠 (C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J)中靶向绿色荧光蛋白(GFP)。以15nM浓度利用阿夸 福媒介物局部施用针对GFP的siRNA-Au NP。每周连续处理小鼠3次，进行4周，小 鼠背部的一半用抗-GFPsiRNA-Au NP处理并且另一半用杂乱siRNA-Au NP处理。在 分离处理的皮肤后，利用荧光测定法比较对照与用抗-GFP siRNA-Au NP处理的背部之 间的GFP水平。如通过荧光测量的，在被处理的小鼠(n＝5)中，该方案导致GFP表达 下降43％(p<0.0036)(图6)。从一半用杂乱(对照)siRNA-Au NP处理的小鼠皮肤看到的 约12％的敲低反映了抗-GFP siRNA-Au NP的全身性摄入。
实施例8
作为治疗靶的转移性黑素瘤
通过不同基因型的人黑素瘤细胞系(例如，SK-MEL-28、1205Lu、A375P、C8161 和WM3211细胞系)和人黑素瘤组织的研究，已发现转移细胞可与非转移性黑素瘤细 胞和正常黑素细胞的区别在于神经节苷脂GM3的独特的脱乙酰基形式。脱-N-乙酰基 GM3不仅是在抗原上独特的标记，而且还驱动细胞的迁移和侵入[Liu J de-N-acetyl GM3promotesmelanoma cell migration and invasion via urokinase plasminogen activatorreceptor signaling-dependent matrix metalloproteinase-2activation.Cancer Res(2009)]。利 用外植体小鼠模型的研究已证实了脱-N-乙酰基GM3在抑制小鼠中转移性细胞系至肺 和肝的转移的扩散中的价值。在这些研究过程中，在具有SK-MEL-28和1205Lu的外植体模型(两种BRAF V600E/PTEN丧失模型)中研究皮肤和转移性黑素瘤的建立时程。 在这些模型中，通过总体、显微和RT-PCR评估，106个细胞的皮下接种在接种后数周 内在大多数小鼠中导致皮肤肿瘤和至肺和肝的转移。还研究了siRNA-Au NP渗透进入 黑素瘤细胞并且抑制存活素的表达的能力。通过使用SK-MEL 28黑素瘤细胞系，显示 了siRNA Au-NP降低存活素mRNA水平91％，如利用定量性逆转录酶-聚合酶链式反 应(qRT-PCR)测量的。
实施例9
利用组合的体外方法靶向牵涉转移性黑素瘤的已知基因的多功能siRNA-Au NP
检查多功能纳米颗粒遗传靶向黑素瘤中的信号传导途径的能力。设计缀合物并且证明其以组合方式靶向多个突变。为了同时调节多个基因，使用参比法(ratio-metricapproach)最优化功能化的缀合物。
已知多个信号传导途径在转移性黑素瘤中上调，特别是BRAF/ERK和AKT3信号 传导。使用组合方法靶向常见BRAF突变和活化的AKT3。此外，在各实验中，将由 BRAF V600E和AKT3siRNA-Au NP产生的敲低结果与非互补对照siRNA-Au NP的结 果相比较。这确定了基因敲低的特异性并且允许评估缀合物毒性。
确定用于独立地靶向这两个黑素瘤靶的最佳策略。首先，设计siRNA缀合物用以靶向BRAF中的T1799A(V600E)突变。利用siRNA设计算法或通过从文献[Sharma等 人，Cancer Res 65:2412-2421(2005)]选择来设计至少3个序列/靶。单个地评估BRAF 缀合物以确定在BrafVE Ptenlox小鼠细胞系、3个含有人BRAF V600E的细胞系 (A375P；SK-MEL-28；1205Lu)和作为阴性对照的正常黑素细胞(ScienCell Research Labs，Carlsbad，CA)和只显示野生型BRAF的C8161转移性黑素瘤细胞系中用于基因 敲低的最佳浓度(参见表A)。
设计第二序列以靶向AKT3[Sharma等人，Clin Cancer Res 15:1674-1685(2009)]， 并且在含3BRAF V600E的细胞系、也具有AKT活化的C8161系和作为对照的正常人黑素细胞中测试所述第二序列。在4-HT存在(和，作为对照，无4-HT)的情况下培 养来自转基因小鼠品系的细胞以诱导BrafVE表达。在细胞收获后在siRNA-Au NP处 理后特定的时间点上使用qRT-PCR和Western印迹分析以测定人和小鼠BRAF V600E 和AKT3的mRNA和蛋白质表达的水平[Dankort等人，Nat Genet 41:544-552(2009)； Dankort等人，Genes Dev21:379-384(2007)]。为了确认敲低的特异性，利用qRT-PCR 和免疫印迹法[Stahl等人，Cancer Res 64:7002-7010(2004)]评估siRNA-Au NP处理对 野生型BRAF、CRAF、AKT1和AKT2的效应。所述技术还允许靶向频率不太高的突 变，所述突变在例如NRAS(例如，Q61L)和c-KIT中导致增加的ERK活化。
由于金颗粒用作用于分子连接的支架，因此检查同时靶向BRAF V600E和AKT3 的组合方法的使用。以不同比率向纳米颗粒加入靶向各突变的siRNA双链体。通过利 用控制缀合物的化学计量的能力，精确地影响siRNA至细胞的递送，从而允许当各靶 的量被精细调谐时观察敲低和细胞反应。
实施例10
信号传导途径的改变和细胞功能的评估
如所描述的[Sun等人，J Invest Dermatol 119:107-117(2002)；Wang等人，JInvest Dermatol 126:2687-2696(2006)；Wang等人，J Biol Chem 276:44504-44511(2001)；Wang 等人，J Biol Chem 278:25591-25599(2003)]比较对所选择的单个功能和多功能 siRNA-Au NP的信号传导和细胞生物学行为的效应。BRAF V600E/AKT3siRNA-Au NP抑制ERK磷酸化以及AKT表达和磷酸化。这通过利用针对pERK、ERK、pAKT 和AKT的抗体的免疫印迹来确认。鉴于BRAF/ERK和AKT信号传导在增加的黑素瘤 细胞增殖和存活中的至关重要的作用，作为敲低的结果，黑素瘤细胞功能的显著改变 在体外发生。利用评估PARP切割的免疫印迹法和通过钙磷脂结合蛋白V流动研究测 定细胞凋亡的诱导。通过测定Bim(通过BRAF活化诱导的)、BCL-2(通过AKT活化诱 导的)和BAD(通过AKT活化抑制的)的蛋白质表达仔细分析BRAF V600E抑制和 AKT3抑制的相关作用。利用杂乱序列的对照中诱导的细胞凋亡的不存在确保细胞凋 亡因有意的靶向而非siRNA-Au NP毒性而引起。通过细胞计数和WST-1[(4-[3-(4-碘苯 基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑]-1,3-苯二磺酸酯)]测定法评估增殖，并且利用免疫印迹 法评估细胞周期蛋白D1表达。黑素瘤细胞表达促成血管生成(特别地IL-8和VEGF) 和侵入(特别地MMP-2)的因子[Liu J等人，de-N-acetyl GM3promotesmelanoma cell migration and invasion via urokinase plasminogen activatorreceptor signaling-dependent matrix metalloproteinase-2activation.Cancer Res(2009)]。通过免疫印迹细胞提取物和上 清液评估肿瘤VEGF、Hif-1α和MMP-2的表达；为了评估MMP-2功能，如之前所描 述的[Liu J等人，de-N-acetyl GM3promotes melanoma cellmigration and invasion via urokinase plasminogen activator receptorsignaling-dependent matrix metalloproteinase-2 activation.Cancer Res(2009)；Wang等人，J Biol Chem 278:25591-25599(2003)]进行培 养物上清液的功能酶谱法测定。利用ELISA[Crawford等人，Mol Cancer Ther 7: 492-499(2008)]评估细胞上清液中IL-8的表达。使用基质胶侵袭小室(Matrigel Invasion Chamber)[Wang等人，J Biol Chem278:25591-25599(2003)]进行细胞侵入测定法。
多功能siRNA-AuNP提供了靶向可选择的基因突变(例如在WM1366细胞系中)或 向靶向BRAF V600E和AKT3的多功能siRNA-Au NP中添加另外的靶向siRNA的可 能。从而涉及利用每一种细胞系的遗传图谱以及它们的已知基因突变靶向3个或更多 个基因的能力(表A)。例如，SK-MEL-28和1205Lu细胞都具有特定的CDK4点突变； 虽然这些突变似乎不影响对BRAF抑制的反应，但其他靶向允许研究这些突变的功能 效应。类似地，SK-MEL-28和1205Lu具有被靶向用以研究它们在转移性黑素瘤转化 和进展中的意义的p53(SK-MEL-28)和CDKN2A(1205Lu)中的另外的标签突变 (signature mutation)。这两种细胞系都已广泛地用于体内异种移植模型。
实施例11
用经皮肤和静脉内递送于siRAN纳米颗粒的条件、安全性和生物分布
在具有免疫能力的小鼠中比较静脉内和经皮肤施用的杂乱siRNA-Au NP的递送、清除和毒性。此外，评估缀合物的毒性和药代动力学特征。同样地如上文中所述，在 渗透穿过人皮肤方面优化多功能纳米颗粒。
通过经皮肤递送全身性递送siRNA-Au NP，并且通过金颗粒的沉积来跟踪它们的命运。利用先前描述的ICP-MS[Giljohann等人，Nano Lett 7:3818-3821(2007)]测量器 官中金颗粒的水平。在此类研究中，每一个siRNA-Au NP处理组中研究6只小鼠，对 于每一个参数在2只小鼠中施用媒介物作为对照。在生物分布研究中，递送被聚焦在 肝、肺、皮肤和淋巴结(在利用局部施用的研究中黑素瘤转移的最常见位置和siRNA-Au NP所到达的位置)上。也监控肾、脾、肾上腺以及GI道(具有潜在毒性的位置)和脑(人 中难以到达的转移的偶发位置)。在这些研究中施用500nM siRNA-Au NP，因为该浓 度通过经皮肤递送很好地到达内靶。
经皮肤递送
在施用(图5)和递送金颗粒至皮肤、淋巴结、肺、肝和肾后，甚至在施用仅15nM 的单功能siRNA-Au NP后24小时内，已显示25nM荧光基团缀合的siRNA-Au NP被 表皮、真皮和皮下细胞的广泛摄入。在7-8周龄(在该年龄上在转基因小鼠黑素瘤模型 中开始处理)的具有免疫能力的C57BL/6中进行研究。
关于单次施用的递送、清除和毒性
进行利用多功能siRNA-Au NP的时程实验以测定：1)经皮肤渗透的时程和效率；2)至内脏器官的递送效率；3)单次施用后的清除；和4)刺激或毒性的潜能。处理小鼠 一次，随后在从处理后2小时至7周的8个时间点对小鼠实施无痛致死术。在这些研 究中，比较早期时间点(即2、4、24和72小时)上的siRNA-Au NP的分布以确保渗透 穿过皮肤，递送至器官和清除。在局部处理的小鼠中，将皮肤的处理位置分成三等分 用于组织学分析来确保毒性的不存在，用于ICP-MS以定量金颗粒的浓度和用于在 -80℃下贮藏(例如，用于以后的ELISA测定)。将用于ICP-MS的皮肤切片短暂暴露于 60℃的水以使表皮与血管化的真皮分离，从而测定表皮相对真皮/皮下递送。在处死时， 利用ICP-MS评估器官(如上文中指出的)和远处皮肤的金含量，并且获取每一个器官的 一部分进行组织学评估(参见下文)。
通过重复施用进行积累
鉴于在提议的实验中重复(而不只是单次施用)处理小鼠，因此也利用每周处理2-3 次(基于单次施用后金颗粒在皮肤中的保留)的小鼠进行这些研究，进行10天、4周和 7周以定量金颗粒的积累。
毒性评估
每隔一天称取小鼠体重以及观察可见的皮肤变化或行为变化。为了测试不良反应， 在器官水平上进行组织学和免疫组织化学评估。具体地，确定所有组织中和皮肤中坏死和炎症的存在，表皮成熟的改变和黑皮病(色素倾倒(pigment dumping))的存在。如果看到皮肤或内脏萎缩的证据，那么通过检测Ki67在免疫组织化学上评估细胞增殖。在 组织免疫化学上确认可疑的细胞凋亡的存在(ApopTag In Situ Apoptosis Detection)[Lannutti等人，Cancer Res.57(23):5277-80(1997)]。如果在处理的皮肤中看 到表皮细胞凋亡，鉴于皮肤是先天性免疫器官并且能够表达促细胞凋亡细胞因子，那 么在siRNA-AuNP皮肤相对对照处理的皮肤中进行TNF-α表达的ELISA测定。
在结束前对所有动物的心脏穿刺获得血液。在单次剂量研究中，必要时冷冻血清以用于日后分析。分析来自处理10天或更长时间的小鼠的血液的血细胞计数、天冬氨 酸氨基转移酶(肝功能)和肌酸酐水平(肾功能)(Charles River Labs)。
人皮肤中的经皮肤递送
通过使用来自腹壁成形术的正常人皮肤，利用Franz扩散池进行体外实验来测试siRNA-Au NP穿过人皮肤的能力。此类Franz扩散池过去数十年来一直是测试通过人 皮肤的流动的金标准。它们是温度和湿度可控的以匹配人体内条件和重要地，提供模 拟皮肤的渗透压梯度。利用ICP-MS将金颗粒穿过人皮肤的运输定量为渗透的标记， 因为siRNA和金颗粒保持缀合。在将角质层/表皮与真皮分离后获得重建的皮肤。在解 剖显微镜下可视地验证重建的皮肤样品的完整性。为了进一步验证组织是完整的，在 前30分钟收集受体液体样品(假定如果组织是完整的，那么在前30分钟内收集的样品 中不能检测到金)。在将皮肤置于Franz扩散池后，施用siRNA-Au NP(始于500nM并 且逐渐降至低至100pM)，以阿夸福作为对照。以至少一式三份进行研究，进行至少 三次。这些研究显示通过人表皮的流量—随时间的过去通过cm2的皮肤表面的药物量 (ng/cm2/小时)。在6小时和24小时结束时，切碎皮肤，提取金颗粒进行ICP-MS测量 来测量组织中的残留Au NP。
实施例12
小鼠模型的建立
如先前所述[Dankort等人，Nat Genet 41:544-552(2009)]，通过在6周龄时连续3天给左和右胁腹区域局部施用5mM 4-HT的DMSO溶液来诱导黑素瘤。这些高度色 素沉着的黑素瘤最早在作为高度色素沉着的肿瘤的转基因模型中施用4-HT后7-10天 出现[Dankort等人，Nat Genet 41:544-552(2009)]。在产生小鼠模型的研究中，单独的 溶液施用用作对照。为了模拟人疾病(其中直至至少皮肤肿瘤开始可被检测到时才开始 治疗)，直至黑素瘤可见或可触知时(具有至少5mm2的最小面积)在两个小鼠模型中停 止治疗的起始。
寻找剂量的研究
在50nM与500nM之间的3个剂量的每一个剂量上测试8只小鼠。寻找剂量的 研究中的对照包括杂乱siRNA和单独的阿夸福。在治疗起始后第7周杀死小鼠以进行 尸体剖检。给原发性黑素瘤和任何皮肤转移灶照相并且利用测径器在每一次处理时测 量体积。记录可见的或可触知的皮肤转移灶的数目。计数(借助于它们的暗褐色颜色) 肺、肝、淋巴结、肾和脑的转移灶总数，并且利用贯穿每一个器官的多个切片在组织 学上检查器官的微小转移灶的证据。微小转移灶可用显微镜容易地看到，但必要时， 使用Fontana-Masson染色进一步突显色素沉着。将最有效地减少转移而无任何毒性证 据的剂量用于随后的研究。
转移灶发展的时程和其通过siRNA-Au NP治疗产生的改变
使用基于先前研究的剂量和频率给小鼠施用siRNA-Au NP、杂乱siRNA-Au NP或对照媒介物(局部阿夸福)。在治疗开始后第1、3、5和7周杀死成组的小鼠(每组8只)， 如上所述总体地和在组织学上评估内脏转移。
siRNA-Au NP的作用机制
分开原发性肿瘤以进行常规组织学和免疫组织化学研究、免疫印迹分析和qPCR。这些研究中的对照是来自用杂乱siRNA-Au NP或媒介物处理的小鼠的肿瘤和正常/未 处理的皮肤(例如，来自转基因小鼠的上背部的皮肤)。检查下列方面：i)利用Ki67染 色检查肿瘤细胞增殖；ii)利用抗-CD31抗体检查肿瘤旁血管分布；iii)利用TUNEL测 定法或caspase3染色检查肿瘤细胞的细胞凋亡；iv)利用先前描述的引物使用qPCR检 查转基因模型中BrafVE、野生型Braf和Akt3的表达的直接抑制[Dankort等人，Nat Genet 41:544-552(2009)；Sharma等人，Clin Cancer Res 15:1674-1685(2009)；Sharma 等人，Cancer Res66:8200-8209(2006)；Sharma等人，Cancer Res 65:2412-2421(2005)]； 和v)总Braf；Craf；p-Akt/总Akt以及p-ERK1/2/总ERK1/2的蛋白质表达的变化。利 用免疫印迹法在来自肿瘤样品的提取的蛋白质中测定血管生成和侵入的标记(VEGF、 MMP-2和Hif-1)。在siRNA-Au NP的最后施用后2小时杀死时进行基线眼球后出血和 心脏穿刺来利用ELISA评估IL-8水平[Crawford等人，Mol Cancer Ther 7: 492-499(2008)]。在具有免疫能力的转基因模型中，也评估Braf和/或Akt3活化的抑 制是否影响免疫应答和促进细胞毒性T细胞功能。这些研究比较来自未处理或杂乱 siRNA-Au NP处理的小鼠的细胞与BrafVE Akt3siRNA-AuNP-处理的转基因小鼠。通 过使用免疫组织化学，计数肿瘤切片中Foxp3+(调节性T细胞)和CTLA4+/CD152(细 胞毒性CD8+T细胞)的数目。为了确保抗体的可视化，使用AEC色原(红色)。从皮肤 肿瘤[Lin等人，J Immunol 182:6095-6104(2009)]和从在治疗起始后第1、4和7周杀死 的小鼠提取肿瘤浸润淋巴细胞。在用针对CD4、CD25、Foxp3、CD8和CTLA4的荧 光染料缀合的抗体染色后将细胞经历FACS分析。
siRNA抑制的持久性
在独立的研究中，用siRNA-Au NP处理小鼠7周以控制原发性肿瘤生长和转移。 使一半的小鼠(n＝12)中断治疗。在2、4、8和12周后杀死未处理的小鼠和连续处理的 同期组。每周测量原发性黑素瘤2次，结束时计数内脏转移灶。此外，定量皮肤和内 脏肿瘤中的Au-NP以确定它们的清除是否与肿瘤抑制的逆转相关。
存活的延长
在20-25天的时候[Dankort等人，Nat Genet 41:544-552(2009)](例如，当肿瘤在其 最大直径上达到2cm，或小鼠处于病态，例如显示食欲不振，在1周内体重减轻20％ 或在连续2周内体重减轻10％，异常呼吸或表示疼痛的姿势)，需要对转基因小鼠实施 无痛致死术。在上述评估siRNA-Au NP的效应的研究中，在达到10周的时间点上杀 死小鼠。继续处理小鼠并且将其与未处理的和杂乱siRNA-Au NP-处理的小鼠进行比较 以进行长达3个月的存活研究。使用Kaplan-Meier存活曲线对小鼠存活率作图。
毒性的评估
每隔一天称取小鼠的体量并且观察改变的行为或食欲的证据。利用常规组织病理学染色针对组织毒性(例如，细胞凋亡或炎症)的证据评估肝和肾组织，并且按照本领 域内已知的方法进行针对骨髓、肝和肾功能的筛查血液研究。如果怀疑毒性的证据， 那么再进行免疫组织化学评估(例如TUNEL和Ki67)。在通过心脏穿刺获得的血清中 评估siRNA-诱导的脱靶效应以进行全基因组阵列(Affymetrix)。以至少一式三份对来自 暴露于BrafVEAkt 3siRNA-Au NP至少7周的小鼠的样品和它们的对照进行基因阵列 研究；将样品建库，并且如果检测到脱靶效应，对具有更短暴露的小鼠进行阵列。
统计分析
使用双尾学生t检验(P<0.05时，显著)评估合成缀合物敲低基因和影响蛋白质表达 的能力。使用非参数Mann-Whitney U-检验和PRISM软件测定表皮的黑素瘤的大小以 及肺和肝转移灶的数目。利用存活曲线的时序检验测定存活研究的显著性。
虽然已根据多个实施方案和实施例描述了本发明，但应理解变化和改进可被本领域技术人员想到。因此，应当只将出现在权利要求中的这些限制置于本发明中。
序列表
<110> 西北大学
<120> 寡核苷酸功能化的纳米颗粒的递送
<130> IP40-180157
<150> US 61/169,384
<151> 2009-04-15
<150> US 61/187,759
<151> 2009-06-17
<150> US 12/684,836
<151> 2010-01-08
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature

Claims (25)

1.一种皮肤递送寡核苷酸功能化的纳米颗粒的方法，其包括步骤：
给有此需要的患者的皮肤施用治疗有效量的包含寡核苷酸功能化的纳米颗粒和皮肤媒介物的组合物。
2.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸功能化的纳米颗粒的递送是经皮肤的。
3.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸功能化的纳米颗粒的递送是局部的。
4.权利要求1的方法，所述皮肤媒介物包含软膏。
5.权利要求4的方法，其中所述软膏是阿夸福。
6.一种调节基因表达的方法，其包括步骤：
在其中所述寡核苷酸功能化的纳米颗粒与靶杂交并且调节基因表达的条件下给皮肤施用治疗有效量的包含寡核苷酸功能化的纳米颗粒的组合物。
7.权利要求6的方法，其中所述靶是多肽。
8.权利要求6的方法，其中所述靶是多核苷酸。
9.权利要求8的方法，其中所述多核苷酸是RNA。
10.权利要求1或6的方法，其中所述组合物的施用改善皮肤病。
11.权利要求10的方法，其中所述皮肤病选自癌症、遗传病、衰老、炎症、感染和外形缺陷。
12.权利要求11的方法，其中所述癌症选自鳞状细胞癌、基底细胞癌、乳腺癌和黑素瘤。
13.权利要求12的方法，其中所述靶是由选自Ras、IκBα、hedgehog、B-Raf、Akt和细胞周期蛋白D的基因表达的基因产物。
14.权利要求11的方法，其中所述遗传病选自单纯性大疱性表皮松解、大疱性鱼鳞病、先天性厚甲症、面皮肤骨骼综合征和结节性硬化症。
15.权利要求14的方法，其中所述靶是包含突变的基因产物，所述基因产物由选自K5、K14、K1、K10、H-Ras和m-Tor的基因表达。
16.权利要求11的方法，其中所述衰老病症选自UV-损伤和早衰。
17.权利要求16的方法，其中所述靶是由选自基质金属蛋白酶-1和progerin的基因表达的基因产物。
18.权利要求11的方法，其中所述炎症因银屑病而引起。
19.权利要求18的方法，其中所述靶是白细胞介素-23。
20.权利要求11的方法，其中所述病毒感染导致疣。
21.权利要求20的方法，其中所述靶是E6/E7。
22.权利要求11的方法，其中所述外形缺陷选自脂溢性角化病、表皮痣和色素痣。
23.权利要求22的方法，其中所述靶是包含突变的基因产物，所述基因产物由选自FGFR3、K10和B-Raf的基因表达。
24.一种包含寡核苷酸功能化的纳米颗粒和皮肤媒介物的皮肤组合物。
25.权利要求1-23的任一项的方法，其使用权利要求24的组合物。
CN201810171435.0A 2009-04-15 2010-03-15 寡核苷酸功能化的纳米颗粒的递送 Pending CN108451968A (zh)

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US61/187,759 2009-06-17
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