CN108497261A - 一种利用菌株发酵去除生物原料中黄曲霉毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于生物发酵技术领域，具体涉及一种利用特定菌株发酵去除生物原料中黄曲霉毒素的方法。所述特定菌株为黄孢原毛平革菌和/或杂色云芝，所述生物原料为以碳素为主成分的生物质废料和/或以氮素为主成分的生物质废料；具体包括：生物原料预处理、菌株发酵，制备发酵液、规模发酵处理或快速发酵降解黄曲霉毒素等步骤。总体而言，本申请所提供的发酵方法，操作处理过程较为便捷，降解黄曲霉毒素效果较为明显，且处理成本较低，可较好为食品安全、人体健康奠定基础，具有较好的实用价值和推广应用意义。
Description
技术领域
本申请属于生物发酵技术领域，具体涉及一种利用特定菌株发酵去除生物原料中黄曲霉毒素的方法。
背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)主要是由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等多种真菌产生的具有极强的致癌、致突变和致畸性的一类剧毒性代谢产物。黄曲霉毒素无色、无嗅、无味，其分子结构中含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)，前者为基本毒素结构，后者与致癌有关。现已分离出的黄曲霉毒素达18种，对热稳定，耐高温黄曲霉毒素B1毒素（AFB1）在268～269℃时才分解；加入强碱和5%次氯酸钠可完全破坏；但在酸性条件下稳定，在pH值1～3的强酸性溶液中稍有分解。黄曲霉毒素可溶于氯仿、丙酮、甲醇、乙醇等多种有机溶剂中，但不溶于己烷、石油醚、水与乙醚。
由于储存不当或其他原因，一些食品或饲料原料（如花生、玉米、大豆、小麦、花生饼（粕）、豆粕、棉粕、菜籽粕等）常会受到黄曲霉和寄生曲霉的感染，进而使得原料中含有较高含量的黄曲霉毒素，其黄曲霉毒素含量甚至可以高达50~80μg/kg。研究表明，家禽对黄曲霉毒素最敏感，其次是仔猪和母猪，而幼畜对黄曲霉毒素的敏感度又高于成年家畜。在动物生产中，一旦日粮（如玉米、豆粕等）被黄曲霉毒素污染，轻则导致动物体增重降低，饲料转化率下降，重则诱发肿瘤和癌症，甚至死亡，从而造成严重的经济损失。同时研究成果也表明，食物中黄曲霉毒素与肝细胞癌变 (Liver Cell Cancer，LCC) 呈正相关性，长时间食用含低浓度黄曲霉毒素的食物被认为是导致肝癌胃癌，肠癌等疾病的主要原因。而受黄曲霉毒素污染的原料进入饲料生产或食用菌生产领域，最终导致黄曲霉毒素进入饲料或食品循环，是影响食品安全、危害人类健康的一个重要途径和原因。
由于黄曲霉毒素污染范围较广且毒性较强，因此各国都提出了黄曲霉毒素的最高限量标准，中国规定了AFB1的含量为20μg/kg，欧盟规定农产品中AFT(B1+B2+G1+G2)的最高限量为4μg/kg，美国规定农产品中AFT(B1+B2+G1+G2)的最高限量为15μg/kg（刘银坤，1990；Moss, 2002）。因此防止霉变和去除霉变饲料或肥料原料中的黄曲霉毒素是饲料或肥料生产中必要的环节，也是保障食品安全的基本措施之一。
目前市场上常用的降解饲料或食品原料中黄曲霉毒素的方法主要有：1、生物法，即细菌、放线菌和酵母菌等微生物的直接降解和吸附等；2、物理法，即紫外光照射技术、268℃以上高温、吸附剂吸附脱毒等；3、化学法，即应用碱处理、氧化处理等。总体而言，这些方法虽然能够一定程度上去除原料中的黄曲霉毒素，但都存在一些问题，如成本高、二次污染、效果不佳等，因此仍需对生物原料中黄曲霉毒素的去除问题探讨新的方法。
发明内容
本申请目的在于提供一种利用特定菌株发酵去除生物原料中黄曲霉素的方法，从而为食品原料或饲料原料等生物原料的安全可靠奠定基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种利用特定菌株发酵去除生物原料中黄曲霉素的方法，所述特定菌株为黄孢原毛平革菌(Phanerochete chrysosporium)和/或杂色云芝 (Coridus versicolor)，所述生物原料为以碳素为主成分的生物质废料（玉米秸秆、玉米芯、麸皮、花生秧等）和/或以氮素为主成分的生物质废料（花生饼（粕）、豆粕、棉粕、菜籽粕等）；具体步骤如下：
（一）生物原料预处理
（1.1）首先，将生物原料适当粉碎预处理，针对不同类型的生物原料，具体预处理方式可参考如下：将玉米秸秆、花生秧秆切成0.5~3厘米再进行使用，将玉米芯粉碎至5~20目后再使用，而针对花生饼（粕）、豆粕、棉粕、菜籽粕、花生壳等清洗、除尘后可直接使用；
（1.2）其次，调节碳氮比（也可不调节，直接进行后续的发酵处理），调节预处理后生物原料碳氮比大约为C:N=1:0.1~0.5；调节时，具体可通过混入氮素肥料（如尿素、碳铵等）等形式进行调节，也可参考如下方式：
将待处理的受黄曲霉毒素污染的碳素为主成分的生物质废料（玉米秸秆、玉米芯、麸皮、花生秧等），与没有受黄曲霉毒素污染的氮素为主成分的生物质废料（花生饼（粕）、豆粕、棉粕、菜籽粕等）按质量比1:0.1~0.5的比例进行混合；
或者，将待处理的受黄曲霉毒素污染的氮素为主成分的生物质废料（花生饼（粕）、豆粕、棉粕、菜籽粕等），与没有受黄曲霉毒素污染的碳素为主成分的生物质废料（玉米秸秆、玉米芯、麸皮、花生秧等）按质量比0.1~0.5: 1的比例进行混合；
（1.3）最后，向碳氮比调节后生物原料中加水，搅拌均匀，调整物料含水率为35~65%（质量比）作为待发酵处理物料备用；
（二）菌株发酵，制备发酵液
将黄孢原毛平革菌(Phanerochete chrysosporium)和杂色云芝 (Coridus versicolor)分别发酵处理；
发酵培养黄孢原毛平革菌时，培养温度为37～39℃，该菌属粉状孢子状态，具体培养方式可参考如下：平板扩大培养后，液体培养基内，按每100mL接种6环（接种环）黄孢原毛平革菌孢子计，培养8~10d（例如9d）左右）；
培养基可参考设计如下：
黄孢原毛平革菌培养基：葡萄糖10g/L，酒石酸铵2mmol/L，pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液10mmol/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2·2H2O 0.1g/L，VB1 1mg/L，黎芦醇3mmol/L，微量元素混合液7mL/L，吐温80 1 g/L；
所述微量元素混合液组成如下：
氨基乙酸7.8×10-3mol/L，MgSO4·7H2O 1.2×10-2mol/L，
MnSO4·H2O 2.9×10-3mol/L，NaCl 1.7×10-2mol/L，
FeSO4·7H2O 3.59×10-4mol/L，CoCl2 7.75×10-4mol/L，
CaCl2·2H2O 9.0×10-4mol/L，ZnSO4·7H2O 3.48×10-4mol/L，
CuSO4·5H2O 4×10-5mol/L，KAl(SO4)2·12H2O 2.1×10-5mol/L，
HBO3 1.6×10-4mol/L，NaMnO4 4.1×10-5mol/L；
发酵培养杂色云芝时，培养温度为28～30℃，该菌属丝状真菌，具体培养方式可参考如下：平板扩大培养后，液体培养基内，每100mL接6个杂色云芝菌塞，150rpm振荡培养8~10d（例如9d）左右；
培养基可参考设计如下：
杂色云芝培养基：葡萄糖2g/L，酒石酸铵12mmol/L，pH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液10mmol/L，KH2PO4 1.47×10-2mol/L，MgSO4·7H2O 2.03×10-3mol/L，CaCl2·2H2O 6.8×10- 4mol/L，VB1 2.97×10-6mol/L，微量元素混合液7mL/L，吐温80 1g/L；
所述微量元素混合液组成同上；
（三）发酵降解黄曲霉毒素
利用步骤（二）中的发酵液对步骤（一）的待发酵处理物料进行规模发酵处理或快速发酵降解处理，具体而言：
规模发酵处理：将步骤（二）中发酵液，按5~20%的总接种量（质量比）（即，接种一种发酵培养液或两种发酵培养液时，总的接种量为5~20%），接种到步骤（一）的待发酵处理物料，混合均匀后，自然堆积发酵培养8~15天（应用黄孢原毛平革菌菌种发酵时，发酵温度控制在30~40℃左右；应用杂色云芝菌发酵时，发酵温度控制在28~32℃左右；两种菌株共同应用时，发酵温度控制在30~35℃，优选控制在32℃左右；不论采用哪种菌株发酵，环境湿度均控制在70~85%的相对湿度条件下），即可有效降解生物原料中的黄曲霉毒素；
快速发酵处理：将步骤（二）中发酵液与生物原料按1mL:0.1~1.5g比例，混合搅拌，在40℃~55℃、pH=4.0~5.0条件下发酵处理50~80h；然后过滤或离心，去除多余水分后，所收获物料即为黄曲霉毒素降解后无害生物原料。
本申请中所采用特定菌株为黄孢原毛平革菌(Phanerochete chrysosporium)和/或杂色云芝 (Coridus versicolor)，其均为白腐真菌。初步研究表明，其发酵产物中均含有能够分解木质素的酶类，包括木质素过氧化物酶、锰依赖过氧化物酶和少量漆酶，而利用这些酶类即可高效降解、去除生物原料中的黄曲霉毒素，最终实现污染原料的无害化的处理。另一方面，这些菌株的发酵培养液中也会产生一定的纤维素酶、木聚糖酶等，能够在一定程度上降解培养物料中的大分子物质如纤维素、半纤维素、淀粉等，从而利于后期的原料转化和利用。
总体而言，本申请所提供的发酵方法，操作处理过程较为便捷，降解黄曲霉毒素效果较为明显，且处理成本较低，可较好为食品安全、人体健康奠定基础，具有较好的实用价值和推广应用意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分实验物料情况简要介绍说明如下。
黄孢原毛平革菌(Phanerochete chrysosporium)、杂色云芝 (Coridus versicolor)，均属于白腐真菌，下述实施例中所用菌株均由中国农科院上海食用菌所惠赠，但本发明的实施并不依赖特定菌株。
实施例1
本实施例主要制备降解黄曲霉毒素用黄孢原毛平革菌发酵液和杂色云芝发酵液，具体过程简要介绍如下。
（1）黄孢原毛平革菌发酵液
黄孢原毛平革菌发酵用培养基：葡萄糖10g/L，酒石酸铵2mmol/L，pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液10mmol/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2·2H2O 0.1g/L，VB1 1mg/L，黎芦醇3mmol/L，微量元素混合液7mL/L，吐温80 1 g/L；
所述微量元素混合液组成如下：
氨基乙酸7.8×10-3mol/L，MgSO4·7H2O 1.2×10-2mol/L，
MnSO4·H2O 2.9×10-3mol/L，NaCl 1.7×10-2mol/L，
FeSO4·7H2O 3.59×10-4mol/L，CoCl2 7.75×10-4mol/L，
CaCl2·2H2O 9.0×10-4mol/L，ZnSO4·7H2O 3.48×10-4mol/L，
CuSO4·5H2O 4×10-5mol/L，KAl(SO4)2·12H2O 2.1×10-5mol/L，
HBO3 1.6×10-4mol/L，NaMnO4 4.1×10-5mol/L；
发酵培养时，按每100mL接6环（接种环）黄孢原毛平革菌孢子，37～39℃，静止培养9d，得黄孢原毛平革菌菌悬液（发酵液）备用。
（2）杂色云芝发酵液
杂色云芝培养基：葡萄糖2g/L，酒石酸铵12mmol/L，pH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液10mmol/L，KH2PO4 1.47×10-2mol/L，MgSO4·7H2O 2.03×10-3mol/L，CaCl2·2H2O 6.8×10- 4mol/L，VB1 2.97×10-6mol/L，微量元素混合液7mL/L，吐温80 1g/L；
所述微量元素混合液组成同上；
发酵培养时，按每100mL接6个杂色云芝菌菌塞，28～30℃，150rpm振荡培养7d，得杂色云芝菌悬液（发酵液）备用。
实施例2
本实施例针对的生物原料为污染黄曲霉毒素的玉米芯，具体发酵降解处理时，过程如下：
（一）生物原料预处理，并调节碳氮比
（1.1）首先，将生物原料玉米芯（黄曲霉毒素污染）粉碎至10目左右备用；
（1.2）其次，将待处理的受黄曲霉毒素污染的玉米芯，与没有污染黄曲霉毒素的豆粕按1:0.2（质量比）混合均匀；
（1.3）最后，向碳氮比调节后生物原料中加水，搅拌均匀，调整物料含水率为55%（质量比）左右，作为待发酵处理物料备用。
（二）发酵降解黄曲霉毒素
规模发酵处理：将实施例1中黄孢原毛平革菌发酵液，按10%接种量（质量比），接种到步骤（一）的待发酵处理物料，混合均匀后，自然堆积发酵培养15天（温度控制在35~40℃，湿度均控制在70~85%的相对湿度）左右。
发酵完成后，对生物原料中黄曲霉毒素含量进行测定，结果表明，黄曲霉毒素含量已由发酵前的69.8μg/Kg降低为16.7μg/Kg，降低效果明显。
实施例3
本实施例针对的生物原料为污染黄曲霉毒素的豆粕，具体发酵降解处理时，其过程大体同实施例2，仅调整部分参数如下：
步骤（一）中，以污染黄曲霉毒素的豆粕与没有污染黄曲霉毒素的麸皮按0.2:1（质量比）、并调整含水率为50%（质量比）的混合物料，作为待发酵处理物料；
步骤（二）中，利用实施例1中杂色云芝发酵液、按13%接种量（质量比），自然堆积培养15天发酵处理。
发酵完成后，对生物原料中黄曲霉毒素含量进行测定，结果表明，黄曲霉毒素含量已由发酵前的60.7μg/Kg降低为10.6μg/Kg，降低效果明显。
实施例4
本实施例针对的生物原料为污染黄曲霉毒素的玉米秸秆，具体发酵降解处理时，其过程大体同实施例2，仅调整部分参数如下：
步骤（一）中，将污染黄曲霉毒素的玉米秸秆切成0.5~3厘米后，与没有污染黄曲霉毒素的花生粕按1:0.2（质量比）混合后，调节物料含水率在55%（质量比）左右，作为待发酵处理物料；
步骤（二）中，同时利用实施例1中黄孢原毛平革菌发酵液和杂色云芝发酵液，按10%总接种量（黄孢原毛平革菌发酵液接种量为5%，杂色云芝发酵液接种量为5%），自然堆积培养15天发酵处理。
发酵完成后，对生物原料中黄曲霉毒素含量进行测定，结果表明，黄曲霉毒素含量已由发酵前的79.7μg/Kg降低为15.7μg/Kg，降低效果明显。
实施例5
本实施例针对的生物原料为污染黄曲霉毒素的花生壳，与实施例2不同，具体发酵处理时，采用快速发酵处理方式进行处理，具体而言：
将实施例1所制备黄孢原毛平革菌发酵液与污染黄曲霉毒素的花生壳，按1mL：0.5g的比例，混合搅拌后，在45℃、pH=4.5条件下作用72h；过滤去除多余水分即为黄曲霉毒素降解后无害生物原料。
对生物原料中黄曲霉毒素含量进行测定，结果表明，黄曲霉毒素含量已由发酵前的65.5μg/Kg降低为18.8μg/Kg，降低效果明显。
实施例6
本实施例针对的生物原料为污染黄曲霉毒素的大豆，与实施例5类似，同样采用快速发酵处理方式进行处理，具体而言：
将实施例1所制备黄孢原毛平革菌发酵液与污染黄曲霉毒素的大豆，按1mL：1g的比例，混合搅拌后，在45℃、pH=4.8条件下作用72h；过滤去除多余水分即为黄曲霉毒素降解后无害生物原料。
对生物原料中黄曲霉毒素含量进行测定，结果表明，黄曲霉毒素含量已由发酵前的72.2μg/Kg降低为16.7μg/Kg，降低效果明显。
实施例7
本实施例针对的生物原料为污染黄曲霉毒素的花生粕，与实施例5类似，同样采用快速发酵处理方式进行处理，具体而言：
将实施例1所制备黄孢原毛平革菌发酵液与污染黄曲霉毒素的花生粕，按1mL：1g的比例，混合搅拌后，在50℃、pH=4.5条件下作用68h；过滤去除多余水分即为黄曲霉毒素降解后无害生物原料。
对生物原料中黄曲霉毒素含量进行测定，结果表明，黄曲霉毒素含量已由发酵前的73.6μg/Kg降低为15.1μg/Kg，降低效果明显。
综合上述实施例可以看出，当面对大量黄曲霉毒素污染的生物原料需要降解时，可以采用规模发酵方式进行处理，而当需要处理生物原料量较少或者处理时间较短时，可采用快速发酵方式处理，但不管哪种方式，均能取得较好的降解黄曲霉毒素的效果。
Claims (5)
1.一种利用特定菌株发酵去除生物原料中黄曲霉素的方法，其特征在于，所述特定菌株为黄孢原毛平革菌和/或杂色云芝，所述生物原料为以碳素为主成分的生物质废料和/或以氮素为主成分的生物质废料；具体步骤如下：
（一）生物原料预处理
首先，将生物原料预处理；
其次，调节碳氮比为C:N=1:0.1~0.5；
最后，向碳氮比调节后生物原料中加水，搅拌均匀，调整物料含水率为35~65%作为待发酵处理物料备用；
（二）菌株发酵，制备发酵液
将黄孢原毛平革菌和杂色云芝分别发酵处理；
发酵培养黄孢原毛平革菌时，培养温度为37～39℃；
发酵培养杂色云芝时，培养温度为28～30℃；
（三）发酵降解黄曲霉毒素
利用步骤（二）中的发酵液对步骤（一）的待发酵处理物料进行规模发酵处理或快速发酵降解处理，具体而言：
规模发酵处理：将步骤（二）中发酵液，按5~20%的总接种量，接种到步骤（一）的待发酵处理物料，混合均匀后，自然堆积发酵培养8~15天，即可有效降解生物原料中的黄曲霉毒素；
快速发酵处理：将步骤（二）中发酵液与生物原料按1mL:0.1~1.5g比例，混合搅拌，在40℃~55℃、pH=4.0~5.0条件下发酵处理50~80h；所收获物料即为黄曲霉毒素降解后无害生物原料。
2.如权利要求1所述利用特定菌株发酵去除生物原料中黄曲霉素的方法，其特征在于，所述生物原料为以碳素为主成分的生物质废料为：玉米秸秆、玉米芯、麸皮、花生秧中一种或几种任意比例混合物；
所述氮素为主成分的生物质废料为：花生饼、豆粕、棉粕、菜籽粕中一种或几种任意比例混合物。
3.如权利要求2所述利用特定菌株发酵去除生物原料中黄曲霉素的方法，其特征在于，步骤（一）中，所述预处理方式为：将玉米秸秆、花生秧秆切成0.5~3厘米再进行使用，将玉米芯粉碎至5~20目后再使用，针对花生饼、豆粕、棉粕、菜籽粕、花生壳，清洗、除尘后直接使用。
4.如权利要求2所述利用特定菌株发酵去除生物原料中黄曲霉素的方法，其特征在于，步骤（一）中，调节碳氮比的具体调节方式为：通过混入氮素肥料进行调节，或者按照如下方式调节：
将待处理的受黄曲霉毒素污染的碳素为主成分的生物质废料，与没有受黄曲霉毒素污染的氮素为主成分的生物质废料按质量比1:0.1~0.5的比例进行混合；
或者，将待处理的受黄曲霉毒素污染的氮素为主成分的生物质废料，与没有受黄曲霉毒素污染的碳素为主成分的生物质废料按质量比0.1~0.5: 1的比例进行混合。
5.如权利要求1所述利用特定菌株发酵去除生物原料中黄曲霉素的方法，其特征在于，步骤（二）中，发酵培养时，培养基配方设计如下：
黄孢原毛平革菌培养基：葡萄糖10g/L，酒石酸铵2mmol/L，pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液10mmol/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2·2H2O 0.1g/L，VB1 1mg/L，黎芦醇3mmol/L，微量元素混合液7mL/L，吐温80 1 g/L；
杂色云芝培养基：葡萄糖2g/L，酒石酸铵12mmol/L，pH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液10mmol/L，KH2PO4 1.47×10-2mol/L，MgSO4·7H2O 2.03×10-3mol/L，CaCl2·2H2O 6.8×10- 4mol/L，VB1 2.97×10-6mol/L，微量元素混合液7mL/L，吐温80 1g/L；
所述微量元素混合液组成如下：
氨基乙酸7.8×10-3mol/L，MgSO4·7H2O 1.2×10-2mol/L，
MnSO4·H2O 2.9×10-3mol/L，NaCl 1.7×10-2mol/L，
FeSO4·7H2O 3.59×10-4mol/L，CoCl2 7.75×10-4mol/L，
CaCl2·2H2O 9.0×10-4mol/L，ZnSO4·7H2O 3.48×10-4mol/L，
CuSO4·5H2O 4×10-5mol/L，KAl(SO4)2·12H2O 2.1×10-5mol/L，
HBO3 1.6×10-4mol/L，NaMnO4 4.1×10-5mol/L。
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| CN115428887A (zh) * | 2022-10-26 | 2022-12-06 | 中科检测技术服务(嘉兴)有限公司 | 一种粮食或其副产物中真菌毒素的生物降解方法 |
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